CN110577958B

CN110577958B - 核酸、重组质粒、转化株、乙酰胆碱酯酶及其制备方法

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Publication number: CN110577958B
Application number: CN201810596450.XA
Authority: CN
Inventors: 魏嘉锋; 曾志正; 黄秀珍; 宋济民
Original assignee: Wubangtu Intelligent Life Co ltd
Current assignee: Wubangtu Intelligent Life Co ltd
Priority date: 2018-06-11
Filing date: 2018-06-11
Publication date: 2023-08-15
Anticipated expiration: 2038-06-11
Also published as: CN110577958A

Abstract

本发明涉及一种核酸、诱导型重组质粒、转化株、无糖基化乙酰胆碱酯酶及无糖基化乙酰胆碱酯酶的制备方法。所述核酸为编码乙酰胆碱酯酶融合蛋白。所述诱导型重组质粒为包含前述编码乙酰胆碱酯酶融合蛋白的核酸。所述转化株为将所述诱导型重组质粒转化于大肠杆菌(Escherichia coli)宿主细胞中而得。所述无糖基化乙酰胆碱酯酶的制备方法，为利用前述转化株进行液态培养，当液态培养物达到预设菌体浓度时，于液态培养物中加入诱导物，以诱导前述诱导型重组质粒表达乙酰胆碱酯酶，并可经由纯化后得到高活性无糖基化乙酰胆碱酯酶。

Description

核酸、重组质粒、转化株、乙酰胆碱酯酶及其制备方法

【技术领域】

本发明涉及一种核酸、诱导型重组质粒、转化株、乙酰胆碱酯酶以及乙酰胆碱酯酶的制备方法。特别是涉及编码乙酰胆碱酯酶融合蛋白的核酸、适用于大肠杆菌的诱导型重组质粒、生产无糖基化乙酰胆碱酯酶的转化株、无糖基化乙酰胆碱酯酶以及无糖基化乙酰胆碱酯酶的制备方法。

【背景技术】

乙酰胆碱酯酶(Ac etylcholinesteras e；简称为AChE，EC 3.1.1.7)是一种通过水解作用降解神经传导物质-乙酰胆碱使其分解成为胆碱和乙酸的酶。乙酰胆碱酯酶在生物体中经后修饰为糖蛋白，主要位于动物的神经系统突触神经元细胞膜上。乙酰胆碱酯酶的作用为分解乙酰胆碱以终止神经传导，分解后产生的胆碱可以被重新利用合成新的乙酰胆碱分子。然而，当乙酰胆碱酯酶的活性区域与抗胆碱激性物质(包括有机磷剂与氨基甲酸盐类的杀虫剂)结合，则无法分解乙酰胆碱，造成神经传导的紊乱。

由于敏感性家蝇的乙酰胆碱酯酶对于有机磷剂与氨基甲酸盐类农药极为敏感，且其酶活性易于检测，因此农业试验利用萃取自敏感性家蝇脑部的乙酰胆碱酯酶开发一种生化检验法(Chiu et al.,1991)，其可用来检测蔬果有机磷剂及氨基甲酸盐两类杀虫剂残留累计毒性。并自1985年起于产地及市场同步设置快速检测站，建立农药残毒监测工作网。

除了由生物体中直接萃取乙酰胆碱酯酶，近年来因分子生物学及基因工程的进步，亦有许多文献尝试以昆虫细胞、酵母菌、大肠杆菌等不同的宿主细胞表达重组乙酰胆碱酯酶。依据2012年发表的文献数据指出，利用昆虫细胞和酵母菌虽可以成功表达生产重组乙酰胆碱酯酶，但重组乙酰胆碱酯酶的产量不高且酶活性尚可。而以昆虫细胞和酵母菌作为宿主细胞所生产的重组乙酰胆碱酯酶因具有蛋白后修饰作用，与从生物体来源的乙酰胆碱酯酶一样具有糖基化(glyco sylation)。甚至以酵母菌作为宿主细胞所生产的重组乙酰胆碱酯酶因过度糖基化后修饰，而造成重组乙酰胆碱酯酶的活性不佳。另外，先前文献亦有尝试以大肠杆菌作为宿主细胞生产无糖基化(nonglyc o syl ated)乙酰胆碱酯酶(Donget al.,2012)，但前述文献无法得到稳定有活性的乙酰胆碱酯酶。

有鉴于此，本发明的一个目的是提供一种分离的核酸，其序列如S EQ ID NO.1所示，为编码一乙酰胆碱酯酶融合蛋白。

本发明的另一目的是提供一种诱导型重组质粒，包含依序排列的如S EQ ID NO.2所示的诱导型表达组件、如S EQ ID NO.3所示的启动子、如SEQ ID NO.1所示的核酸及如SEQ ID NO.4所示的抗生素抗性基因。

依据前述的诱导型重组质粒，可更包含如SEQ ID NO.5所示的一标签，其连接于如S EQ ID NO.1所示的核酸的3’端。

本发明的又一目的是提供一种转化株，包含宿主细胞和诱导型重组质粒。所述宿主细胞为大肠杆菌(Esch erich ia co li)。所述诱导型重组质粒包含依序排列的如S EQID NO.2所示的诱导型表达组件、如S EQ ID NO.3所示的启动子、如S EQ ID NO.1所示的核酸及如S EQ ID NO.4所示的抗生素抗性基因。

依据前述的转化株，所述大肠杆菌可为氧化态大肠杆菌。较佳地，可为AD494(DE3)菌株或Orig ami(DE3)菌株。

本发明的又一目的是提供一种无糖基化乙酰胆碱酯酶的制备方法，包含提供液态培养物、进行诱导步骤、进行分离步骤以及进行纯化步骤。所述液态培养物包含前段所述的转化株。所述诱导步骤为培养所述转化株至菌体浓度的光学密度值达0.5至0.7时，于诱导温度下加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导一诱导时间，使所述诱导型重组质粒表达乙酰胆碱酯酶融合蛋白，所述诱导温度为4℃至16℃或30℃，当诱导温度为4℃至16℃时诱导时间为2天至6天，当诱导温度为30℃时该诱导时间为7小时至12小时。所述分离步骤为将转化株自液态培养物分离。所述纯化步骤为破坏转化株的细胞后，以一纯化方式纯化无糖基化乙酰胆碱酯酶，其中纯化方式为经由Ni⁺-NTA纯化或利用浓度为8M的尿素纯化。

本发明的再一目的是提供一种无糖基化乙酰胆碱酯酶，其为依前段所述的无糖基化乙酰胆碱酯酶的制备方法所制得，其具有水解乙酰胆碱的活性。

因此，本发明所提供的核酸、诱导型重组质粒、转化株、无糖基化乙酰胆碱酯酶以及无糖基化乙酰胆碱酯酶的制备方法，可以利用生产成本较低且易操作的大肠杆菌作为宿主细胞，大量制备无糖基化乙酰胆碱酯酶，且所制备的无糖基化乙酰胆碱酯酶具有高水解乙酰胆碱的活性，可进一步应用于农药检测。

上述发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。

【附图说明】

为让本发明之上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式之说明如下:

图1绘示本发明一实施方式的诱导型重组质粒之构建示意图；

图2绘示本发明另一实施方式的无糖基化乙酰胆碱酯酶的制备方法的步骤流程图；以及

图3为经本发明的无糖基化乙酰胆碱酯酶的制备方法所制得的无糖基化乙酰胆碱酯酶的蛋白质电泳分析图。

【具体实施方式】

本说明书揭露内容提出一种新颖的核酸、诱导型重组质粒、转化株以及无糖基化乙酰胆碱酯酶的制备方法。其为通过生物信息、蛋白分析以及全基因合成方式，将敏感性家蝇(SRS)的乙酰胆碱酯酶基因优化，并于乙酰胆碱酯酶基因的5’端接上融合序列后，得到编码乙酰胆碱酯酶融合蛋白的核酸。再经由遗传工程技术构建包含前述编码乙酰胆碱酯酶融合蛋白的核酸的诱导型重组质粒、将前述诱导型重组质粒转至大肠杆菌(Escherich ia coli)而得的转化株，以及利用前述转化株的无糖基化乙酰胆碱酯酶的制备方法。可以利用生产成本较低且易操作的大肠杆菌作为宿主细胞，以诱导的方式大量生产无糖基化乙酰胆碱酯酶，且所制备的无糖基化乙酰胆碱酯酶具有高活性，可进一步应用于农药检测。

本说明书中所述的「氧化态大肠杆菌」指缺乏硫氧还蛋白还原酶基因(Thioredoxin reductas e,trxB)的大肠杆菌菌株，其能于细胞质中形成二硫键，使所表达的重组蛋白保留并折叠成正确构型。

本发明前述所称的「诱导型」在此指导入宿主细胞的质粒，其启动子为诱导型表达重组蛋白。诱导型表达系统需于特定诱导条件下才能诱发外源基因表达，可避免持续表达具细胞毒性的蛋白质所引起的伤害。在本发明一例示中，本发明适合的转化株为诱导型表达系统，且适合的特定诱导条件可包括但不限于预设菌体浓度。

兹以下列具体试验例进一步示范说明本发明，用以有利于本发明所属技术领域通常知识者，可在不需过度解读的情形下完整利用并实践本发明，而不应将这些试验例视为对本发明范围的限制，但用于说明如何实施本发明的材料及方法。

[试验例]

一、本发明的核酸、诱导型重组质粒以及转化株

为了得到本发明的分离的核酸，将敏感性家蝇(SRS)的乙酰胆碱酯酶氨基酸序列，去除信号肽(signal peptide)和跨膜(transmembrane)的疏水性区域后，再依据大肠杆菌密码子偏好情况优化编码乙酰胆碱酯酶的核酸序列，乙酰胆碱酯酶基因的5’端接上S-tag融合序列，得到如S EQ ID NO.1所示序列的核酸，其编码乙酰胆碱酯酶融合蛋白。于乙酰胆碱酯酶的N端融合S-tag(Lys-Glu-Thr-Al a-Al a-Ala-Lys-Phe-Glu-Arg-Gln-His-Met-Asp-S er)，可增加乙酰胆碱酯酶于大肠杆菌表达后的水溶性。

再将如S EQ ID NO.1所示序列的核酸构建至诱导型表达载体中以得到本发明的诱导型重组质粒。本发明的诱导型重组质粒，包含依序排列的如SEQ ID NO.2所示的诱导型表达组件、如S EQ ID NO.3所示的启动子、如S EQ ID NO.1所示的核酸及如SEQ ID NO.4所示的抗生素抗性基因。本发明的诱导型重组质粒可更包含如SEQ ID NO.5所示的标签，其为连接于如S EQ ID NO.1所示的核酸的3’端。请参照图1，其绘示本发明的诱导型重组质粒(实施例)的构建示意图。详细地说，设计限制酶切位点将如S EQ ID NO.1所示序列的核酸构建至pET29 a表达载体中，并于乙酰胆碱酯酶基因的3’端接上6个组氨酸(Hi s)的组氨酸标签(his-tag)作为纯化之用。所得到的诱导型重组质粒包含依序排列的如S EQ ID NO.2所示的lacl基因、如S EQ ID NO.3所示的T 7启动子、如S EQ ID NO.1所示的编码乙酰胆碱酯酶融合蛋白(ache)的核酸、如S EQ ID NO.5所示的组氨酸标签及如SEQ ID NO.4所示的抗卡纳霉素基因(Kan^r)。本发明的诱导型重组质粒可持续表达LacI作为诱导型重组质粒乳糖操纵子的抑制物，以调控目标基因乙酰胆碱酯酶融合蛋白的表达，当加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPT G)时，乙酰胆碱酯酶融合蛋白才会表达。

再将构建好的诱导型重组质粒转化至大肠杆菌中以得到本发明的转化株，转化的方式可以包含但不限定以氯化钙处理等化学方式或电穿孔等物理方式进行。所转化的大肠杆菌可为氧化态大肠杆菌，较佳地，可为AD494(D E3)菌株或Origami(DE3)菌株。

因家蝇来源的乙酰胆碱酯酶存在3个以上之二硫键，为确认本发明的转化株于表达乙酰胆碱酯酶融合蛋白时二硫键的键结是否正确，使所表达的乙酰胆碱酯酶能正确折叠。于本试验例中另将本发明的诱导型重组质粒转化至还原态大肠杆菌中作为比较，所转化还原态大肠杆菌的菌株为B L21(D E3)。此外，本试验另构建了于乙酰胆碱酯酶基因的5’端不具有融合蛋白序列的诱导型重组质粒作为比较例1，以及乙酰胆碱酯酶基因的5’端具有TRX融合蛋白序列的诱导型重组质粒作为比较例2。比较例1的诱导型重组质粒和比较例2的诱导型重组质粒与实施例的诱导型重组质粒，差异仅在于乙酰胆碱酯酶基因的5’端融合蛋白序列，其余部分相同。并再分别将比较例1的诱导型重组质粒和比较例2的诱导型重组质粒转化至氧化态大肠杆菌中，以得到比较例1的转化株和比较例2的转化株，所转化氧化态大肠杆菌的菌株为B L21(D E3)。

将前述所得到的转化株分别以50mL的LB培养基摇瓶培养至OD₆₀₀＝0.6时，加入0.5mM的IPTG于37℃下诱导2小时后，再经由Ni⁺-NTA纯化无糖基化乙酰胆碱酯酶，并以Ellman’s method测试所制备的无糖基化乙酰胆碱酯酶活性。

请参照下表一，为本发明的诱导型重组质粒于不同大肠杆菌菌株表达所制备的无糖基化乙酰胆碱酯酶的活性比较。以及本发明的诱导型重组质粒与比较例的诱导型重组质粒所制备的无糖基化乙酰胆碱酯酶的活性比较。

表一

大肠杆菌菌株	诱导型重组质粒	诱导温度	诱导时间	比活性(U/mg)
					还原态	实施例	37℃	2小时	1
氧化态	实施例	37℃	2小时	17
					氧化态	比较例1	37℃	2小时	3
氧化态	比较例2	37℃	2小时	4

表一的结果显示，本发明的诱导型重组质粒于一般还原态大肠杆菌菌株所表达的无糖基化乙酰胆碱酯酶活性极低(1U/mg)，而于氧化态大肠杆菌菌株中表达，能促使无糖基化乙酰胆碱酯酶形成正确的二硫键，使所制备的无糖基化乙酰胆碱酯酶活性达到17U/mg，显示氧化态大肠杆菌对于后续所表达无糖基化乙酰胆碱酯酶活性的重要性。此外，本发明的诱导型重组质粒于乙酰胆碱酯酶N端加入S-tag，使所制备的无糖基化乙酰胆碱酯酶活性可达到17U/mg，比较乙酰胆碱酯酶N端不带有其它融合蛋白序列的比较例1，其所制备的无糖基化乙酰胆碱酯酶活性仅有3U/mg；以及乙酰胆碱酯酶N端另外加上TRX融合蛋白序列的比较例2，其所制备的无糖基化乙酰胆碱酯酶活性亦仅有4U/mg。显示本发明的核酸所编码的乙酰胆碱酯酶融合蛋白，对于后续收成的无糖基化乙酰胆碱酯酶活性差别，于乙酰胆碱酯酶的N端加入S-tag可使后续制备方法获得较高活性的无糖基化乙酰胆碱酯酶。

二、本发明的无糖基化乙酰胆碱酯酶的制备方法

请参照图2，绘示本发明的无糖基化乙酰胆碱酯酶的制备方法100的步骤流程图。图2中，无糖基化乙酰胆碱酯酶的制备方法100包含步骤110、步骤120、步骤130与步骤140。

步骤110是提供液态培养物，其中液态培养物中包含本发明的转化株。

步骤120是进行诱导步骤，为培养所述转化株至菌体浓度的光学密度值达0.5至0.7时，于诱导温度下加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导一诱导时间，使所述诱导型重组质粒表达乙酰胆碱酯酶融合蛋白。其中所述诱导温度可大于0℃小于等于30℃。较佳地，诱导温度为4℃至10℃。所述诱导时间可为7小时至150小时。较佳地，诱导时间为48小时至96小时。

步骤130是进行分离步骤，将转化株自液态培养物分离。在诱导步骤完成后，因转化株中已充满表达后的乙酰胆碱酯酶融合蛋白，因此将转化株自液态培养物分离后，即可于转化株中获得无糖基化乙酰胆碱酯酶，所述无糖基化乙酰胆碱酯酶的氨基酸序列如SEQID NO.6所示。而分离方式可为过滤方式、离心方式或上述方式之组合。

步骤140是进行纯化步骤，破坏转化株的细胞后，以一纯化方式纯化无糖基化乙酰胆碱酯酶。所述纯化方式可为利用一层析柱纯化无糖基化乙酰胆碱酯酶，或可为利用浓度为3M至8M的尿素纯化无糖基化乙酰胆碱酯酶，所述的层析柱可为Ni⁺-NTA。而转化株的细胞可利用物理法或化学法破坏，例如使用研磨、压力、超音波震荡等机械力进行破坏；利用反复冷冻解冻的温度变化，使转化株体内的水于冷冻时变成固态结晶，而破坏其细胞膜等结构；利用盐浓度不同导致渗透压差异使转化株涨破；或使用药剂或酶分解转化株的细胞膜。

2.1.小量制备本发明的无糖基化乙酰胆碱酯酶

本试验先利用摇瓶方式小量培养本发明的转化株，初步测试无糖基化乙酰胆碱酯酶的诱导表现条件，以得到无糖基化乙酰胆碱酯酶的最适诱导温度与最佳诱导时间。

试验时将本发明的转化株以50mL的LB培养基摇瓶培养至OD₆₀₀＝0.6时，加入0.5mM的IPT G，并分别于下表二所列的诱导温度和诱导时间进行诱导步骤，待诱导步骤完成后，将转化株以离心的方式与液态培养物分离，并破坏转化株的细胞后将其分为可溶性蛋白(so lub le fraction)及不可溶的内涵体(inclusion b ody)。可溶性蛋白的部分以Ni⁺-NTA纯化无糖基化乙酰胆碱酯酶，不可溶的内涵体以8M尿素纯化无糖基化乙酰胆碱酯酶。并以Ellman’smetho d测试所制备的无糖基化乙酰胆碱酯酶活性。

请参照下表二，为以不同的诱导条件下所制备的无糖基化乙酰胆碱酯酶活性。

表二

表二的结果显示，于30℃培养诱导7小时或12小时后，将破坏转化株的细胞后分为可溶性蛋白及不可溶的内涵体，可溶性部分经由纯化后可得到无糖基化乙酰胆碱酯酶的活性分别为191U/mg(7小时)及684U/mg(12小时)，而从内涵体经由8M尿素方式变性回复的无糖基化乙酰胆碱酯酶活性则分别为30U/mg(7小时)及35U/mg(12小时)。此外，以非一般常用的低温方式(16℃以下，4℃以上)作诱导，于100小时后纯化可溶的蛋白部分，可得到活性高达2000U/mg的无糖基化乙酰胆碱酯酶，可见在低温长时间下有助于此酶多个二硫键以正确的方式结合，蛋白得以正确折叠展现无糖基化乙酰胆碱酯酶活性。比较前人研究以酵母菌制备的糖基化乙酰胆碱酯酶活性约为50U/mg(T an et al.,2011)，活性高出许多。

2.2.发酵槽高密度制备本发明的无糖基化乙酰胆碱酯酶

本试验进一步测试本发明的无糖基化乙酰胆碱酯酶的制备方法于发酵槽高密度的条件下，所制备的无糖基化乙酰胆碱酯酶的活性和产量。

将本发明的转化株从-80℃菌株保存瓶中以接种环直接沾取划于LB ag ar(ampicillin)盘上，于37℃培养1天。以接种环挑取1-2个菌落养于200mL LB的三角瓶，于37℃震荡培养24小时。再于发酵槽中以液态培养基加入1/20的隔夜菌液37℃培养至生长对数中期(mid-lo gphas e)，降低温度至30℃以下，加入0.5mM的IPT G诱导产生无糖基化乙酰胆碱酯酶。再将转化株以离心的方式与液态培养物分离，并破坏转化株的细胞后，以Ni⁺-NTA管柱纯化透析后可得到高活性的无糖基化乙酰胆碱酯酶。

请参照图3，为经本发明的无糖基化乙酰胆碱酯酶的制备方法所制得的无糖基化乙酰胆碱酯酶的蛋白质电泳分析图，其中Lys ate表示破菌后上清液的可溶性总蛋白，F T表示未与Ni⁺-NTA结合而流出的蛋白，Wash表示纯化过程中以10mM的咪唑(imidazo le)冲洗出的蛋白，Purifi ed表示纯化后的蛋白质。箭头所指之处为无糖基化乙酰胆碱酯酶，结果显示本发明的转化株以及无糖基化乙酰胆碱酯酶的制备方法亦适用于发酵槽高密度的条件下大量制备无糖基化乙酰胆碱酯酶。

本试验例进一步于发酵槽中，于16℃以下的低温条件进行诱导，并分别在第2天、第4天、第6天收集液态培养物，再将转化株以离心的方式与液态培养物分离，并破坏转化株的细胞后，以Ni⁺-NTA管柱纯化无糖基化乙酰胆碱酯酶，以Ellman’s metho d测试所制备的无糖基化乙酰胆碱酯酶活性。

请参照下表三，为于低温条件下以不同诱导时间进行诱导步骤，所制备的无糖基化乙酰胆碱酯酶活性。

表三

表三的结果显示，诱导时间为6天所制备的无糖基化乙酰胆碱酯酶的比活性较高，但于诱导时间为4天所制备的无糖基化乙酰胆碱酯酶的产量较高，若以产量的角度考虑，进行诱导步骤后的第4天为收集样品的最佳时间点。

三、本发明所制得的无糖基化乙酰胆碱酯酶的农药抑制率测试

本试验进一步将纯化后的高活性无糖基化乙酰胆碱酯酶(重组AChE)与纳乃得(Methomyl)、陶斯松(Chlorpyri fo s)及美文松(Mivenpho s)等农药进行抑制率测试，并且与现有家蝇萃取生产的糖基化乙酰胆碱酯酶(野生型AChE)作比较，以确认以本发明的无糖基化乙酰胆碱酯酶之制备方法于所制备的无糖基化乙酰胆碱酯酶确实可用于农药检测。

请参照下表四，为本发明所制备的无糖基化乙酰胆碱酯酶对于不同农药的抑制率。

表四

表四的结果显示，本发明所制备的无糖基化乙酰胆碱酯酶与萃取自家蝇的糖基化乙酰胆碱酯酶对于纳乃得和陶斯松具有相当的抑制率，且本发明所制备的无糖基化乙酰胆碱酯酶对于美文松更具敏感性，显示本发明所制备的无糖基化乙酰胆碱酯酶对农药为高敏感性，显示其可应用于农药检测的潜力。

综上所述，本发明所提供的核酸、诱导型重组质粒、转化株、无糖基化乙酰胆碱酯酶以及无糖基化乙酰胆碱酯酶的制备方法，可以利用生产成本较低且易操作的大肠杆菌作为宿主细胞，大量制备无糖基化乙酰胆碱酯酶，所制备的无糖基化乙酰胆碱酯酶具有高水解乙酰胆碱的活性，且对于农药亦具有高敏感性，因此具有应用于农药检测的潜力。

然本发明已以实施方式揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求所界定者为准。

<110> 吾帮土智慧生活有限公司

<120> 核酸、重组质粒、转化株、乙酰胆碱酯酶及其制备方法

<160> 6

<210> 1

<211> 1824

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> 编码乙酰胆碱酯酶融合蛋白的核酸

<400> 1

atgaaagaaa ccgctgctgc taaattcgaa cgccagcaca tggacagccc agatccgatg 60

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<210> 2

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> lacl基因

<400> 2

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gttgggcgcc atctccttgc atgcaccatt ccttgcggcg gcggtgctca acggcctcaa 420

cctactactg ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gagatcccgg 480

acaccatcga atggcgcaaa acctttcgcg gtatggcatg atagcgcccg gaagagagtc 540

aattcagggt ggtgaatgtg aaaccagtaa cgttatacga tgtcgcagag tatgccggtg 600

tctcttatca gaccgtttcc cgcgtggtga accaggccag ccacgtttct gcgaaaacgc 660

gggaaaaagt ggaagcggcg atggcggagc tgaattacat tcccaaccgc gtggcacaac 720

aactggcggg caaacagtcg ttgctgattg gcgttgccac ctccagtctg gccctgcacg 780

cgccgtcgca aattgtcgcg gcgattaaat ctcgcgccga tcaactgggt gccagcgtgg 840

tggtgtcgat ggtagaacga agcggcgtcg aagcctgtaa agcggcggtg cacaatcttc 900

tcgcgcaacg cgtcagtggg ctgatcatta actatccgct ggatgaccag gatgccattg 960

ctgtggaagc tgcctgcact aatgttccgg cgttatttct tgatgtctct gaccagacac 1020

ccatcaacag tattattttc tcccatgaag acggtacgcg actgggcgtg gagcatctgg 1080

tcgcattggg tcaccagcaa atcgcgctgt tagcgggccc attaagttct gtctcggcgc 1140

gtctgcgtct ggctggctgg cataaatatc tcactcgcaa tcaaattcag ccgatagcgg 1200

aacgggaagg cgactggagt gccatgtccg gttttcaaca aaccatgcaa atgctgaatg 1260

agggcatcgt tcccactgcg atgctggttg ccaacgatca gatggcgctg ggcgcaatgc 1320

gcgccattac cgagtccggg ctgcgcgttg gtgcggacat ctcggtagtg ggatacgacg 1380

ataccgaaga cagctcatgt tatatcccgc cgttaaccac catcaaacag gattttcgcc 1440

tgctggggca aaccagcgtg gaccgcttgc tgcaactctc tcagggccag gcggtgaagg 1500

gcaatcagct gttgcccgtc tcactggtga aaagaaaaac caccctggcg cccaatacgc 1560

aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc 1620

gactggaaag cgggcagtga 1640

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> T7启动子

<400> 3

cctatagtga gtcgtatta 19

<210> 4

<211> 816

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> 抗卡纳霉素基因(Kanr)

<400> 4

atgagccata ttcaacggga aacgtcttgc tctaggccgc gattaaattc caacatggat 60

gctgatttat atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc 120

tatcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc 180

gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct 240

cttccgacca tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg 300

atccccggga aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt 360

gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct 420

tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg 480

gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa 540

gaaatgcata aacttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca 600

cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc 660

ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct 720

ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa 780

ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt ttctaa 816

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> 组氨酸标签

<400> 5

caccaccacc accaccac 18

<210> 6

<211> 589

<212> PRT

<213> Musca domestica

<223> 无糖基化乙酰胆碱酯酶的氨基酸序列

<400> 6

Met Thr Asp His Leu Thr Val Gln Thr Thr Ser Gly Pro Val Arg Gly

1 5 10 15

Arg Ser Val Thr Val Gln Gly Arg Asp Val His Val Phe Thr Gly Ile

20 25 30

Pro Tyr Ala Lys Pro Pro Val Asp Asp Leu Arg Phe Arg Lys Pro Val

35 40 45

Pro Ala Glu Pro Trp His Gly Val Leu Asp Ala Thr Arg Leu Pro Ala

50 55 60

Thr Cys Val Gln Glu Arg Tyr Glu Tyr Phe Pro Gly Phe Ser Gly Glu

65 70 75 80

Glu Ile Trp Asn Pro Asn Thr Asn Val Ser Glu Asp Cys Leu Phe Met

85 90 95

Asn Ile Trp Ala Pro Ala Lys Ala Arg Leu Arg His Gly Arg Gly Thr

100 105 110

Asn Gly Gly Glu His Ser Ser Lys Thr Asp Gln Asp His Leu Ile His

115 120 125

Ser Ala Thr Pro Gln Asn Thr Thr Asn Gly Leu Pro Ile Leu Ile Trp

130 135 140

Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Met Thr Gly Ser Ala Thr Leu Asp Ile Tyr

145 150 155 160

Asn Ala Glu Ile Met Ser Ala Val Gly Asn Val Ile Val Ala Ser Phe

165 170 175

Gln Tyr Arg Val Gly Ala Phe Gly Phe Leu His Leu Ser Pro Val Met

180 185 190

Pro Gly Phe Glu Glu Glu Ala Pro Gly Asn Val Gly Leu Trp Asp Gln

195 200 205

Ala Leu Ala Leu Arg Trp Leu Lys Glu Asn Ala Arg Ala Phe Gly Gly

210 215 220

Asn Pro Glu Trp Met Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ser Ser Ser

225 230 235 240

Val Asn Ala Gln Leu Met Ser Pro Val Thr Arg Gly Leu Val Lys Arg

245 250 255

Gly Met Met Gln Ser Gly Thr Met Asn Ala Pro Trp Ser His Met Thr

260 265 270

Ser Glu Lys Ala Val Glu Ile Gly Lys Ala Leu Val Asn Asp Cys Asn

275 280 285

Cys Asn Ala Ser Leu Leu Pro Glu Asn Pro Gln Ala Val Met Ala Cys

290 295 300

Met Arg Gln Val Asp Ala Lys Thr Ile Ser Val Gln Gln Trp Asn Ser

305 310 315 320

Tyr Ser Gly Ile Leu Ser Phe Pro Ser Ala Pro Thr Ile Asp Gly Ala

325 330 335

Phe Leu Pro Ala Asp Pro Met Thr Leu Leu Lys Thr Ala Asp Leu Ser

340 345 350

Gly Tyr Asp Ile Leu Ile Gly Asn Val Lys Asp Glu Gly Thr Tyr Phe

355 360 365

Leu Leu Tyr Asp Phe Ile Asp Tyr Phe Asp Lys Asp Asp Ala Thr Ser

370 375 380

Leu Pro Arg Asp Lys Tyr Leu Glu Ile Met Asn Asn Ile Phe Gln Lys

385 390 395 400

Ala Ser Gln Ala Glu Arg Glu Ala Ile Ile Phe Gln Tyr Thr Ser Trp

405 410 415

Glu Gly Asn Pro Gly Tyr Gln Asn Gln Gln Gln Ile Gly Arg Ala Val

420 425 430

Gly Asp His Phe Phe Thr Cys Pro Thr Asn Glu Tyr Ala Gln Ala Leu

435 440 445

Ala Glu Arg Gly Ala Ser Val His Tyr Tyr Tyr Phe Thr His Arg Thr

450 455 460

Ser Thr Ser Leu Trp Gly Glu Trp Met Gly Val Leu His Gly Asp Glu

465 470 475 480

Ile Glu Tyr Phe Phe Gly Gln Pro Leu Asn Asn Ser Leu Gln Tyr Arg

485 490 495

Pro Val Glu Arg Glu Leu Gly Lys Arg Met Leu Asn Ser Val Ile Glu

500 505 510

Phe Ala Lys Ser Gly Asn Pro Ala Val Asp Gly Glu Glu Trp Pro Asn

515 520 525

Phe Ser Lys Glu Asp Pro Val Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Asp Glu Lys

530 535 540

Ile Glu Lys Leu Gln Arg Gly Pro Leu Ala Lys Arg Cys Ser Phe Trp

545 550 555 560

Asn Asp Tyr Leu Pro Lys Val Arg Ser Trp Ile Gly Ser Glu Cys Glu

565 570 575

Asn Lys Ser Ser Thr Ser Ala Ser Ala Ala Ile Tyr Glu

580 585

Claims

1.一种分离的核酸，其特征在于，序列如SEQ ID NO.1所示，其编码一乙酰胆碱酯酶融合蛋白。

2.一种诱导型重组质粒，其特征在于，包含依序排列的如SEQ ID NO.2所示的一诱导型表达组件、如SEQ ID NO.3所示的一启动子、如SEQ ID NO.1所示的一核酸及如SEQ ID NO.4所示的一抗生素抗性基因。

3.如权利要求2所述的诱导型重组质粒，更包含一如SEQ ID NO.5所示的一标签，其连接于如SEQ ID NO.1所示的该核酸的3’端。

4.一种转化株，其特征在于，包含：

一宿主细胞，其中该宿主细胞为一大肠杆菌(Escherichia coli)；以及

如权利要求2所述的诱导型重组质粒。

5.如权利要求4所述的转化株，其中该大肠杆菌为一氧化态大肠杆菌。

6.如权利要求5所述的转化株，其中该氧化态大肠杆菌为AD494(DE3)菌株或Origami(DE3)菌株。

7.一种无糖基化乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于，包含：

提供一液态培养物，其中该液态培养物包含如权利要求4至6任一项所述的转化株；

进行一诱导步骤，培养该转化株至菌体浓度的光学密度值达0.5至0.7时，于一诱导温度下加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导一诱导时间，使该诱导型重组质粒表达乙酰胆碱酯酶融合蛋白，其中该诱导温度为4℃至16℃或30℃，当诱导温度为4℃至16℃时该诱导时间为2天至6天，当诱导温度为30℃时该诱导时间为7小时至12小时；

进行一分离步骤，将该转化株自该液态培养物分离；以及

进行一纯化步骤，破坏该转化株的细胞后，以一纯化方式纯化该无糖基化乙酰胆碱酯酶，其中该纯化方式为经由Ni⁺-NTA纯化或利用浓度为8M的尿素纯化。

8.一种根据权利要求7的制备方法制得的无糖基化乙酰胆碱酯酶，其特征在于，具有水解乙酰胆碱的活性。