CN107698674A - 一种淀粉样多肽的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种淀粉样多肽的纯化方法，包括淀粉样多肽的溶解、反相色谱柱分析和反相制备色谱柱吸附及洗脱收集的步骤。所述溶解的步骤包括将淀粉样多肽溶于水和乙腈混合溶剂得到淀粉样多肽溶液；所述反相色谱柱分析的步骤包括将所述淀粉样多肽溶液接反相色谱分析柱进行梯度检测，得到分析图谱；所述反相制备色谱柱吸附及洗脱收集包括根据所述分析图谱设置制备色谱柱的制备梯度以及将淀粉样多肽溶液接制备色谱柱进行进样吸附并洗脱收集的步骤。纯化过程中解决了容易聚合以及聚合后的样品在制备柱中扩散不好洗脱的问题，且冻干产品不需要另外的解聚处理。

Description

一种淀粉样多肽的纯化方法
技术领域
本发明涉及多肽技术领域，尤其涉及淀粉样多肽的纯化方法。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)，即俗称的老年性痴呆，是一种中枢神经系统变性病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，是老年期痴呆最常见的一种类型。主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。AD的病因及发病机制尚未阐明，目前比较公认的为淀粉样蛋白级联学说，该学说认为AD患者可能是由于淀粉样蛋白前体基因和早老素基因等的突变，导致Aβ((β-淀粉样蛋白)异常分泌和产生过多导致大量Aβ在脑组织内沉积，对周围的突触和神经元具有毒性作用，可破坏突触膜，最终引起神经细胞死亡。Aβ沉积导致AD的其他病理变化，是AD发病的核心环节。减少Aβ的形成，抑制Aβ的沉积，是预防和治疗AD的根本途径。因此，如何预防Aβ的聚合以及得到Aβ较高纯度的单体具有十分重大的作用，对阿尔茨海默病多肽(Peptide)的预防和治疗可以做出重要的贡献。
淀粉样多肽纯化比较困难，是由于多肽本身的性质决定的，在室温下就很容易聚合。目前对淀粉样多肽的制备方法报道很少，一般对Aβ加热溶解，采用高效液相制备，但该方法无可避免的会导致在纯化过程中Aβ已经聚合。纯化冻干的Aβ还需要解聚处理。过程比较繁琐，成本消耗较高。而且在纯化过程中有可能导致样品在制备柱中扩散，导致峰型较宽，分离效果差，得率偏低。
有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种淀粉样多肽的纯化方法，使其更具有产业上的利用价值。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种克服现有生产工艺的不足、解决了淀粉样多肽在纯化过程中容易聚合的问题的淀粉样多肽的纯化方法。
本发明的淀粉样多肽的纯化方法，包括淀粉样多肽的溶解、反相色谱柱分析和反相制备色谱柱吸附及洗脱收集的步骤。
进一步的，所述溶解的步骤包括将淀粉样多肽溶于溶剂中得到淀粉样多肽溶液。
当作为反相色谱柱分析的梯度检测时，溶解后得到的淀粉样多肽溶液过滤后进行粗品分析检测。
当作为反相制备色谱柱吸附及洗脱收集时，溶解后得到的淀粉样多肽溶液用水稀释到合适的比例，进行进样吸附并洗脱收集。
进一步的，所述反相色谱柱分析的步骤包括将所述淀粉样多肽溶液接反相色谱分析柱进行梯度检测，得到分析图谱。
反相梯度检测分析条件为：
流动相：A液：0.05％-0.2％三氟乙酸的水溶液；B液：乙腈；
分析柱：Kromasil 100-5C18-MS 5um 4.6*250mm；
时间：0-20min；
流速：1mL/min；
A：B为：95-99：1-5到1-5：95-99；
波长：200-240nm。
进一步的，所述反相制备色谱柱吸附及洗脱收集包括以下步骤：
(1)根据所述分析图谱设置制备色谱柱的制备梯度。
(2)将淀粉样多肽溶液接制备色谱柱进行进样吸附并洗脱收集。
(3)收集洗脱出来的所有峰进行质谱确认及产品纯度检测。
反相制备条件为：
流动相：A液0.05％-0.2％三氟乙酸的水溶液，B液异丙醇；
时间：0-25min；
流速：20.00mL/min；
A：B为：95-65：5-35到5-35：65-95；
波长：200-240nm。
产品纯度检测条件为：
色谱柱为C18柱，柱子型号为Innoval ODS-2 5μm 4.6*250mm，
流动相：A液：浓度为0.1-0.2％三氟乙酸水溶液，B液：乙腈；
时间：0-20min；
流速：1.00mL/min；
A：B为：90-70：10-30到10-30：70-90；
波长：200-240nm；
进样量：20μL。
进一步的，所述淀粉样多肽为Aβ1-42、Aβ1-40、Aβ42-1以及淀粉样多肽Aβ1-42的衍生物，并分别具有如下的氨基酸序列：
人源Aβ1-42的氨基酸序列为：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA；
鼠源Aβ1-42的氨基酸序列为：
DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA；
Aβ1-40的氨基酸序列为：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV；
Aβ42-1的氨基酸序列为：
AIVVGGVMLGIIAGKNSGVDEAFFVLKQHHVEYGSDHRFEAD；
淀粉样多肽Aβ1-42的衍生物：
FITC-Aβ1-42：
FITC-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA。
生物素标记的Aβ1-42：
Biotin-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA。
进一步的，所述溶剂为水、乙腈、六氟异丙醇、异丙醇、DMSO和甲酸中的一种或几种。
当作为反相色谱柱分析的梯度检测时，溶解淀粉样多肽的溶剂优选水-乙腈混合液。
乙腈的体积占水的体积的百分比为30％-50％。
当作为反相制备色谱柱吸附及洗脱收集时，溶解淀粉样多肽的溶剂优选六氟异丙醇或异丙醇，淀粉样多肽的浓度为1-20mg/ml，加水稀释后，六氟异丙醇或异丙醇的浓度为30％-50％。
进一步的，所述梯度检测的检测器为紫外检测器，且检测波长200-240nm。
进一步的，所述反相制备色谱柱为C4柱、C8柱和C18柱中的一种或几种。
进一步的，所述反相制备色谱柱的流速为5-100ml/min。
进一步的，所述淀粉样多肽溶液接制备色谱柱进行进样吸附并洗脱收集前在20-35℃下放置8-24h。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
1、本发明提供了一种用反相色谱系统纯化淀粉样多肽的简便方法，在容易聚合肽纯化中能够得到广泛的应用，解决了纯化过程中容易聚合、粗品聚合以及聚合后的样品在制备柱中扩散不好洗脱的问题，且冻干产品不需要另外的解聚处理；
2、降低了样品在反相柱中的扩散，提高了产品的收率，生产周期缩短，降低了能耗，降低了生产成本，能够一步实现产品的纯化，快速，简便，高效温和，缩短操作时间和可操作性，通过高效液相纯化，能够直接、简便地得到纯度为95％的淀粉样多肽单体；
3、能够直接、简便地从研发规模放大到生产容量。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是本发明的实施例1中Aβ1-42的粗品分析图；
图2是本发明的实施例1中Aβ1-42的制备图；
图3是本发明的实施例1中Aβ1-42纯品的质谱分析图；
图4是本发明的实施例1中Aβ1-42纯品的液相分析图；
图5是本发明的实施例2中Aβ1-42的粗品分析图；
图6是本发明的实施例2中Aβ1-42的制备图；
图7是本发明的实施例2中Aβ1-42纯品的质谱分析图
图8是本发明的实施例2中Aβ1-42纯品的液相分析图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实例1：
将1mgAβ1-42检测样品的溶解于水和乙腈混合溶剂中(v：v＝7:3)，使用C18柱Kromasil 100-5C18-MS 5um 4.6*250mm进行梯度检测分析。反相分析条件为：流动相A液0.05％-0.2％三氟乙酸的水溶液，B液乙腈；时间：0-20min；流速：1.00mL/min；A：B为：99:1到5:95；波长：220nm。分析结果如图1所示，表明该流动相适合Aβ1-42的分，粗品中的峰能够得到分离,粗品中杂质较多。
Aβ1-42样品的溶解并处理：50mg Aβ1-42粗品用30mL六氟异丙醇溶解，20℃下放置8h，加水稀释使六氟异丙醇浓度为30％。溶液混合完全后，用0.45μm有机相滤膜过滤后等待上样制备。
色谱条件为创新通恒公司的LC3000I高效液相色谱仪；流动相：浓度为0.05-0.2％三氟乙酸水溶液(A液)和异丙醇(B液)；0到25min，A:B由90:10到10:90；流速20mL/min；波长220nm；色谱柱为Haobo D-C4 30*250mm，10μm。将Aβ1-42溶液接制备色谱柱进行进样吸附并洗脱收集。制备如图2所示，表明上述流动相和梯度适合Aβ1-42的制备分离，目标峰出峰时间为24.224min，峰型比较好。
样品容易聚合扩散，在制备柱中不好洗脱，相比于C18制备柱，选择C4制备柱，Aβ1-42更容易洗脱。选择较宽的梯度也有利于Aβ1-42的洗脱。异丙醇较乙腈洗脱能力更强，制备峰型会更好。
收集洗脱出来的所有峰进行质谱确认及反相色谱检测纯度。质谱如图3所示，表明收集到的洗脱峰为目标峰，质谱正确(Aβ1-42分子量为4514.14)；反相色谱检测如图4所示，表明：经纯化后Aβ1-42的纯度为95.35％，该方法能够得到纯度比较高的产品。
反相检测条件：检测柱为Innoval ODS-2 5μm 4.6*250mm；流动相A液0.05％-0.2％三氟乙酸的水溶液，B液乙腈；时间：0-20min；流速：1.00mL/min；A：B为：70:30到20:80；波长：220nm。
将Aβ1-42样品冻干，称取质量，计算收率，收率为43.2％。
实例2：
将1mgAβ1-42检测样品的溶解于水和乙腈混合溶剂中(v：v＝7:3)，使用C18柱Kromasil 100-5C18-MS 5um 4.6*250mm进行梯度检测分析。反相分析条件为：流动相A液0.05％-0.2％三氟乙酸的水溶液，B液乙腈；时间：0-20min；流速：1.00mL/min；A：B为：95:5到5:95；波长：220nm。分析结果如图1所示，表明该流动相适合Aβ1-42的分析，粗品中的峰能够得到很好的分离。
Aβ1-42样品的溶解并处理：100mg Aβ1-42粗品用50mL六氟异丙醇溶解，室温下放置16h，加水稀释使六氟异丙醇浓度为40％。溶液混合完全后，用0.45μm有机相滤膜过滤后等待上样制备。
色谱条件为创新通恒公司的LC3000I高效液相色谱仪；流动相：浓度为0.05-0.2％三氟乙酸水溶液(A液)和异丙醇(B液)；0到25分钟，A:B由75:25到10:90；流速20mL/min；波长220nm；色谱柱为Haobo D-C4 30*250mm，10μm。将Aβ1-42溶液接制备色谱柱进行进样吸附并洗脱收集。制备如图6所示，表明上述流动相和梯度适合Aβ1-42的制备分离，目标峰出峰时间为15.049min，峰型比较好。
收集洗脱出来的所有峰进行质谱确认及反相色谱检测纯度，质谱如图7所示，表明收集到的洗脱峰为目标峰(Aβ1-42分子量为4514.14)，质谱正确；反相色谱检测如图8所示，表明：纯化后Aβ1-42的纯度为95.02％，该方法能够得到纯度比较高的产品。
反相检测条件：检测柱为Innoval ODS-2 5μm 4.6*250mm；流动相A液0.05％-0.2％三氟乙酸的水溶液，B液乙腈；时间：0-20min；流速：1.00mL/min；A：B为：70:30到20:80；波长：220nm。
将Aβ1-42样品冻干，称取质量，计算收率，收率为41.1％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种淀粉样多肽的纯化方法，其特征在于：包括淀粉样多肽的溶解、反相色谱柱分析和反相制备色谱柱吸附及洗脱收集的步骤。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述溶解的步骤包括将淀粉样多肽溶于溶剂中得到淀粉样多肽溶液。
3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于：所述反相色谱柱分析的步骤包括将所述淀粉样多肽溶液接反相色谱分析柱进行梯度检测，得到分析图谱。
4.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于：所述反相制备色谱柱吸附及洗脱收集包括以下步骤：
(1)根据所述分析图谱设置制备色谱柱的制备梯度；
(2)将淀粉样多肽溶液接制备色谱柱进行进样吸附并洗脱收集。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述淀粉样多肽为Aβ1-42、Aβ1-40、Aβ42-1以及淀粉样多肽Aβ1-42的衍生物，并分别具有如下的氨基酸序列：
Aβ1-42的氨基酸序列为：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA；
Aβ1-42的氨基酸序列为：
DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA；
Aβ1-40的氨基酸序列为：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV；
Aβ42-1的氨基酸序列为：
AIVVGGVMLGIIAGKNSGVDEAFFVLKQHHVEYGSDHRFEAD；
淀粉样多肽Aβ1-42的衍生物：
FITC-Aβ1-42：
FITC-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA。
生物素标记的Aβ1-42：
Biotin-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA。
6.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于：所述溶剂为水、乙腈、六氟异丙醇、异丙醇、DMSO和甲酸中的一种或几种。
7.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于：所述梯度检测的检测器为紫外检测器，且检测波长200-240nm。
8.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于：所述反相制备色谱柱为C4柱、C8柱和C18柱中的一种或几种。
9.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于：所述反相制备色谱柱的流速为5-100ml/min。
10.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于：所述淀粉样多肽溶液接制备色谱柱进行进样吸附并洗脱收集前在20-35℃下放置8-24h。
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