JPH02458A - 発酵法によるｌ―イソロイシンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、スレオニンデアミナーゼ遺伝子が組み込まれ
ている組換えＤＮＡ、改組換えＤＮＡを有するスレオニ
ン生産菌を用いるＬ−イソロイシンの製造法ＰＣ関する
ものである。

〔従来の技術〕

発酵法によＦＩＬ、−イソロイシンを製造しＩうとする
場合、野性味は殆んど菌体外にＬ−イソロイシン全生産
しないので、野性味に人工的に突然変異を生起せしめて
Ｌ−イソロイシン生前能を付与する方法がとられてｈる
。Ｌ−イソロイシン生産能を有する人工変異株としては
、ブレビバクテリウム４又はコリネバクテリウム属、又
はセラチア属のし一イソロイシンの７）タコ９ニストに
耐性金回する変異株等が従来より知られている。その内
容はＬ−イソロイシン生産に関与する牛イ＃索であると
ころのスレオニンデアミナーゼが末端生産物であるし一
インロイシ／およびＬ−イソロイシンの７）タゴニスト
によるフィードバック阻害を受はニ〈〈なった変異株を
用いるものである。

ところが、上記のし一イソロイシン生産菌の限界は、ス
レオニンデアミナーゼ全コードする遺伝子がｒノ五当り
１個であることで、いかにフィトバック阻害を解除して
も酵素自身の最大活性には自ずから限界がある。

更に、従来のし一イソロイシン生産菌は、Ｌ−４ンＣｌ
イシンの前駆体であるし一スレオニン（Ｑ　生産供給を
微生物自体のもつ１セツトのＲ云子鮮から生成される酵
素群に依存しており、前述しｔスレオニンデアミナーゼ
と同様の限界を有している。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、Ｌ−イソロイシンの生合成系の代謝調節機構
の人為的制御もしくは打破によって成立している従来の
Ｌ−イソロイシン生産方法の限界のひとつである生合成
系酵素の分子数の制限、即ち、遺伝子数の制限という欠
点を解決する方法を提示するものである。

具体的には、Ｌ−イソロイシン生合成系のキイ酵素であ
るスレオニンデアミナーゼの遺伝子数の増強全目的とし
、更にその結果起るであろうＬ−イソロイシンの前駆体
でらるＬ−スレオニンの需要増に対しては、Ｌ−スレオ
ニンの生合成系に関する酵素の遺伝子数が増強され、Ｌ
−スレオニンの生産力が向上している微生物を活用する
。即ち、両生合成系の遺伝子数がともに増加した微生物
を育成して、Ｌ−イソロイシン全製造する方法を明らか
にするものである。

〔問題点が解決しようとする手段〕

本発明者らは、上記問題点について鋭意検討の結果、エ
シェリヒアｉａｍより得次スレオニンデアミナーゼをコ
ードするＤＮＡ断片を組み込んだ自律増殖可能なグラス
きド又はファージをエシェリヒア　コリ属細菌又はコリ
ネホルムのグルタミン酸生産菌（グレピパクテリクム・
ラクトファーメンタムなど）に保有せしめる事によって
得られるし一イソロイシン生産能を有する微生物を培養
することにより、従来の発醪法よりも高い収率でＬ−イ
ソロイシンを生産できることを見い出し友。

スレオニンデアミナーゼ遺伝子を含ムＤＮ人断片は、エ
シェリヒア　コリ細菌の染色体ＤＮＡより得る事ができ
る。このようにスレオニンデアミナーゼ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片等遺伝情報を担り友ＤＮＡｆ：与えるものをＤ
ＮＡ供与菌と称する。

ＤＮＡ供与菌としては、イソロイシン７）タゴニスト耐
’Ｌｆｔどの変異を付与することにより、Ｌ−イソロイ
シンまたは七の前駆体の生合成活性が高まっ几ような変
異株を用いれば更によい。イソロイシン７）タゴニスト
の例としては、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸、ア
ミノヘキシルイソ吉草酸、イソロイシンハイドロキサメ
ート、グリシル−Ｌ−ロイシン等があるａまた、ここで
いうイソロイシンの前駆体としては、スレオニン、２ケ
ト酪酸、２アセト２ヒドロキシ酪酸、２．３ジヒドロキ
シ３メチル吉草酸、２ケト３メチル吉草酸などをさす。

スレオニンデアミナーゼ遺伝子を得るＫｒｉ、ＤＮＡ供
与菌より染色体ＤＮＡを分離後、適当にこれを切断し、
得られ几染色体ＤＮＡ断片を適当なプラスミド″１次は
、ファージベクターに挿入し友後。

この組換えゲラスミｒをエシェリヒア　コリのスレオニ
ンデアミナーゼ欠損株に導入し、スレオニンデアミナー
ゼ生産能を獲得した形質転換株を採取すればよい。

スレオニンデアミナーゼ遺伝子をエシェリヒアコリ菌体
、内で自律複製できるベクタープラスミドま九はファー
ジ上に挿入してエシェリヒア　フリＤＮＡ受容菌に導入
すれば、Ｌ−イソロイシン生産能の向上した株を得るこ
とができる。

スレオニンデアミナーゼ遺伝子として、野性型のものを
用いることができるし、更に変異株の遺伝子を用いるこ
ともできる。変異株遺伝子としては、Ｌ−イソロイシン
によるフィードバック阻害の程度が軽減され几スレオニ
ンデアミナーゼをコードするように変異され友ものが特
に好ましい。

変異型の遺伝子を得るには、ＤＮＡ供与菌を変異処理し
てもよいが、スレオニンデアミナーゼ遺伝子ｔベクター
プラスミドに挿入後、得られた組換えＤＮＡをＤＮＡ受
容菌に導入し得られた形Ｊ：ｉ転換株を変異処理し次男
が変異型遺伝子が得られる可能性が高い。更に、上記ｍ
ｐえＤＮＡ自体を生体外で変異処理すれば、変異型遺伝
子が得られる効率が最も高い。

Ｌ−イソロイシンによるフィードバック阻害の程度がよ
り軽減されたスレオニンデアミナーゼをコードず、る変
異型遺伝子を選別する方法は、ＤＮＡ供与−及び上記組
換えＤＮＡが導入された形質転換株のいずれの場合も、
また組換えＤＮＡを変異処理し几ときは、変異処理し次
組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入して形５に転換株を
得几後、Ｌ−イソロイシンの７）タゴニストに耐性を獲
得し７ｔ　ＤＮＡ供与菌又トま形′ｊ！ｉ転換株を選別
すればよい。

７）タゴニストに耐性？ｌ！得し吏ＤＮＡ供与菌又は形
質転換株がＬ−インロイシ／によるフィードバック１君
害の程度がより軽減さｎｌこスレオニンデアミナー＋Ｊ
をコードする實異型遣云子を有するものであることｆｃ
確認するためには、Ｌ−イソロイシンの７）タゴニスト
に耐性全獲（ユしたＤＮＡ供与１又ｌゴ形質転換株より
適宜酵素層を訓製し、Ｌ−スレオニアｆ基質として植々
の濃度のＬ−イソロイシ／の存在下に上記酵素液による
２ケト酪酸の生成量を測定する６高揚度のし一イソロイ
シンの存在下でも２ケト酪酸の生成活性が旨い酵素液が
Ｌ−イソロイシンによるフィードバック阻害の程度がエ
リｑ減されたスレオニンデアミナーゼを含πする。

ＤＮＡ供与菌、形質転換株又は組換えＤＮＡに変異全厚
えるには、Ｎ−メチル−Ｎ−二トローＮ−二トロソグア
ニジン又は亜硫酸等の変異誘起剤にＤＮＡ供与菌、形質
転換株又は組換えＤＮＡを晒すかあるいはＪ）ＮＡ供与
菌、形質転換株又は組換えＤＮＡにＸ線、紫外線、γ線
等を照射する等の方法がある。

尚、このような遺伝子に変異を与える方法は。

スレオニンｒ７きナーゼ以外のいかなる遺伝子について
も効率よい変異方法として利用できる。また宿主がエシ
ェリヒア　コリ以外の例えばコリネホルム・グルタミン
酸生産菌、バチルス・ズブチリス等であっても、上記の
遺伝子に変異を与える方法は、利用できる。

ま九、スレオニア　ｆ　７　？ナーゼ遣云子のプロモー
ターオペレーターとして、宿主菌野性型のものを用いる
こともできるし、更にプロモーターオペレーターのｇ、
真珠由来のものを用いることもできる。また更に、すで
に他種遺伝子を効率良く発現することが知らｎでいる強
力なプロモーター？使用する事も可能である。１比、プ
ロモーターオペレーターＤＮＡｔ−ｔ、他生物由来もし
くは化学的に合成され友ものであってもよい。また、プ
ラスミド上で得らｎた変異型スレオニンデアミナーゼは
、再びイａ主染色体へ導入することも可能であって、ま
九他の生物由来もしくは化学的疋合成され九遺伝子の場
合も同様の操作を行うことができる。

更に、Ｌ−イソロイシンの前駆体であるし一スレオニン
を培地に添加することにより、Ｌ−イソロイシン全増産
させることも可能であり、ま定、Ｌ−スレオニンの生産
を増強するようなプラスミドもしくはファージ１例えば
、スレオニンオイロンｆ：帯同するプラスミドもしくは
ファージと野性型もしくは変異型のスレオニンデアミナ
ーゼ遺伝子を帯同するプラスミドもしくはファージトラ
同−ｍ抱内に共存でせることも宵月である。

〔実施例〕

以下、実施例に基づき、本発明の詳細な説明する。

実施例１ （１）　　染色体Ｊ）ＮＡ　ノｖ４製 Ｅ、　ｃｏｉｌ　ＫＩ２　’ｆｒ　１００　ｍｌのＭ９
カデミノ酸培地（グルコース５１　、　ＮＨＣＬ　１１
　、　Ｎａ□ＨＰＯ４６１１゜ＫＨ２ＰＯ４３１、Ｍｇ
ＳＯ４”７Ｈ２０２４７Ｑ　、　ＮａＣ４Ｏ，５ｇ　。

カザミノ酸５１１ＪＫ含む）に植菌し、３７℃で約３時
間振盪培養金行い、対数増殖期の菌体金集めた。この菌
体１９をり／チーム・ＳＤＳで溶菌させたのちフェノー
ル法により染色体ＤＮＡ　’ｉ抽出精製し最終的に１０
１に９のＤＮＡ全得念。

（２）　　ベクターＤＮＡのＥＪＲ製 くフタ−としてｐＢＲ３２２（４３６３ｂｐ　）を用い
、そのＤＮＡを常法に従い調製した。

（３）染色体ＤＮＡのベクターへの挿入（１）で得友染
色体ＤＮ人１０μｇと（２）で得たベクターＤＮＡ　１
μＩを制限エンドヌクレアーゼＣ１ａ　Ｉで完全に切断
し、両者をＴ　４　ＤＮＡライｒ−スで結合しｔｏ（４
）　　スレオニンデアミナーゼ遺伝子のクローニングス
レオニンデアミナーゼ活性全欠損しているＥ、　ｃｏｉ
ｌ　Ｋ１２　ＡＪ　１２３４９　（ＦＥＲＭ　Ｐ−９５
７４）（Ｌ−イソロイシン要求株として作成しｆｃ）を
受容菌として用いｆｃ６ 形質転険法としては、ＣｈＣｔ２処理による方法を用い
ｔ０形ｆｆ！を転換体として７）ピシリン抵抗性でかつ
、イソロイシン非要求性金持った株を１採得７ｔ、これ
全ＡＪ　１２３５１　（ＦＥＲＭ　Ｐ−９５７６）と命
名し友。

（５）　　形質転換株のプラスミド解析上述のＡＪ　１
２３５１　（ＦＩＲＭ　Ｐ−９５７６）株よりリゾチー
ム・ＳＯ８により溶菌液を得、グクスミドｏＮＡｔａ几
。アガロースダル電気泳動によりプラスミドＤＮ人を分
析し九ところ、ｐＢＲ３２２より大きなプラスミドであ
り几。Ｃｔａｌ　により切断したところ、２．３ｋｂの
ＤＮＡ断片が挿入されている事が明らかとなり次。この
プラスミドをｐＩＬＶＡ　１と命名Ｌｆ。

（６）再形質転換 （５）で得られ次プラスミドを再びＥ、　ａｏｌｉ　Ｋ
１２ＡＪ　１２３４９　（ＰｇＲＭ　Ｐ−９５７４）に
形質転換し念。７）ピシリン耐性で選択した形質転換体
は全てＬ−イソロイシンの要求性をも失っていた。よっ
て、上述の２．３ｋｂのＤＮＡ断片上にスレオニンデア
ミナーゼ遺伝子が存在している事が明らかである。

（７）形質転換株のスレオニンデアミナーゼ活性被検株
をＭ９培地５０ｍ１で、３７℃、１６時間培養した菌体
から超音波処理により溶菌液全ｖ４製し、これを３２．
ＯＯＯｘｇ、２０分間遠心して上溝を得几。この上清全
粗酵素液として用い、１０ｍＭトリス塩ｒＩＩ塩、８Ｑ
　ｒｎＭ　Ｌ−スレオニンを含む反応液中で酵素反応を
行い、生じｔ２−ケト酪酸を２．４ジニトロフエールヒ
ドクゾンで発色させて波長５７０　ｎｍで定量した。表
−１にその測定結果を示す。この結果、　　ｐＩＬＶＡ
−ＩＫスレオニンデアミナーゼ遺伝子がクローン化され
た事が明らかとなり友。

（８）　　組換えプラスミド中のスレオニンデアミナー
ゼ遺伝子のコードするスレオニンデアミナーゼのＬ−イ
ソロイシンによるフィードバック阻害の解除 ＜４７でりａ−ニングし几スレオニンデアミナーゼ遺伝
子は、フィードバック阻害が解除されていない野性様の
ものであったので、フィードバック阻害の解除を以下の
方法で行った。

（１）　　スレオニンデアミナーゼ遺伝子を含ム２．３
ｋｂのＤＮＡ断片を持つプラスミドｐＩＬＶＡ　ｌを保
持するＴ２．　ｅｏｌｊ　Ｋ１２　ＡＪ　１２３５１（
ＦＥＲＭ　Ｐ−９５７６）をｌｏ！ＩＬｌのＬ−プロス
（バクトトリグトｙｌＯｊ’＋イーストエキストラクト
５　ＪＦ　＋　ＮＡＣ２５１＊グルコースｌｙをｌｌに
含む。ｐ）１７．２　）で培養し、対数増殖期の菌体を
得、遠心により集菌して１／ＩＱ彊の１０ｍＭトリス−
１０ｍＭ　？　Ｏン酸緩衝液（ｐＨ５，２）Ｉ／ＣＭ濁
し友。２００５ｍ１／ＭｌのＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニシンを３７℃で３０分作用させ遠心
により集菌し、Ｌ−プロス１０ｍ１Ｋ再懸濁し、３７℃
で１６時間培養した。培養後、前記（２）で述べ元方法
によりプラスミドＤＮＡ１取得し、Ｅ。

ａｏｌｌＫ１２＾Ｊ　１２３４９（１ｉ’ｌＪＭ　Ｐ−
９５７４）に形質転換し几、７）ピシリン耐性の形質転
換体を１０−グリシル−Ｌ−ロイシンと７）ピシリンを
含むＭ９培地にレプリカレ、７）ピシリン耐性かつグリ
シル−Ｌ−ロイシン耐性の株を２６株得た。

このうちの１株の持つプラスミドをｐＩＬＶＡＳ−１と
名付け、前記（２）で述べ次男法によりｐＩＬＶＡＳ−
ｌＤＮＡ　ｉ得皮。このプラスミドｆ　Ｅ、　ｃｏｌｌ
　Ｋｌ　２ＡＪ　１２３４９　（ＦＩＲＭ　Ｐ−９５７
４）　ｌ’ｃ再形質転換し、得られ友７）ピシリン耐性
コロニーのうち、１００株についてグリシル−し−ロイ
シン耐性ヲ調べたところ。

これらはいずれも抵抗性を獲得してい７ｔ、この菌株１
ｋＡＪ　１２３５２　（ＦＥＲＭ　Ｐ−９５７７）と命
名する。従って。

組換えプラスミドｐＩＬＶＡｓ−１は、グリシル−し−
ロイシン耐性が付与され九スレオニンデアミナーゼ遺伝
子をもつ事が明らかとなつ几。次に、先九述べ几方法に
より、スレオニンデアミナーゼ活性をＬ−イソロイシン
存在下で測定した。結果を表−２に示す。

表−２ 菌株 Ｌ−イソロイシンなし　Ｌ−イソロイシンｌｒｎＭＡＪ
　１２３５１（Ｆ’ＥＲＭ　Ｐ−９５７６）　　　　１
００　％　　　　　　　　ＯＳＡＪ　１２３５２（ＦＥ
ＲＭ　Ｐ−９５７７）　　　　１００％　　　　　１２
０チ表−２の結果、ｐｌＬＶＡｓ−１上のスレオニンデ
アミナーゼ遺伝子がコードするスレオニンデアミナーゼ
遺伝子ｔｉＬ−イソロイシンによるフィードバック阻害
が解除されており、この方法によりプラスミド上の遺伝
子の改良がなされたと認められる。

（９）　　スレオニンデアミナーゼ遺伝子の転写量の増
加（８）テ得ら′ｒＬｆｔ、　ｐＩＬＶＡｓ　−１ノ２
．３ｋｂ　Ｃ１ｈ　ｌ　７　ラｆメントの両端に合成り
ａｍＨＩ　’Ｊ　７カー全導入し、ｐＡＣＹＣ１８４（
文献：　Ｃｈａｎｇ、Ａ、Ｃ，Ｙ、、　Ｃｏｈｅｎ、Ｓ
、Ｃ，。

Ｊ、Ｂａｃｔｓ＋ｒＪｓｌ、１３４　　１１４１（１９
７８）　　の　ＢａｍＨＩ　ｆイトに導入し７ｔ、挿入
方向を異にするプラスミド１に２種得た。

コレラッグラス？　）’　ｐＩＬＶＡＳ−Ｙｌもしくは
ｐＩＬＶＡｓ−Ｙ２　’ｉｉ−保持し７ｔ　Ｅ、　ｃｏ
ｉｌ　Ｋ１２株（７）　スＬ／　オニ／デアミナーゼ活
性を前記（７）の方法で測定し友。

結果を表−３に示す。

表−３ ＾Ｊ１２３５２（Ｆ餠ｆｆｌ　Ｐ−９５７７）　　　　
　　　　　１１５Ｅ、　　ｃｏｉｌ　　Ｋ１２（ｐｌＬ
ｖＡｓ−Ｙｌ）　　　　　　　　　　１　２５０Ｌ　　
ｃａｌｌ　　Ｋ１２（ｐＩＬＶＡｓ−Ｙ２）　　　　　
　　　　　　１　０８表−３の結果からｐＩＬＶＡｓ−
Ｙｌ上のスレオニンデアミナーゼ遺伝子はｐＡＣＹｏ　
１８４上のテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター
により強く発現している事が確認された。ま几ｐＡＣＹ
Ｃ１８４の系統のプラスミドはｐＢＲ３２２及び、それ
由来のプラスミドと共存させる事が可能なのでスレオニ
ンオペロン′１ｔｐＢＲ３２２に組込んだプラスミドと
共存させる事ができると期待され、Ｌ−イソロイシンの
生産量向上が期待できる。

α１　宿主染色体への変異型スレオニンデアミナーゼ遺
伝子の導入 Ｌ−イソロイシンの生産のためにプラスミド上だけでは
なく染色体上にも前記（８）で得友フイードパクク阻害
の解除され几遺伝子を以下の方法で導入した。

（１）　　Ｅ、　ｃｏｌｌ　Ｋ１２　ＭＭ３８３　（ｐ
ｏｔＡ”　）株へのプラスミドの導入 ＭＭ３８３は、ｐＢＲ３２２，ｐＡｃＹｃ１８４等のプ
ラスミド保持に必要なｐｏｔＡ遺伝子の温度感受性変異
株である。この株に常法によってプラスミドｐＩＬＶ人
５−Ｙｌ　ｅ導入し、３０℃でクロラムフェニコール耐
性株を得元。

形質転換株を３０℃で培養後、４２ｃでクロラムフェニ
コール耐性株を選択した。これらは全てプラスミドを失
ってい九ので染色体上に変異型スレオニンデアミナーゼ
遺伝子が組み込まれたものと思わｔ″Ｌ７ｔ６５ｊ！際
、全ての株がグリシル−Ｌ−ロイシンに耐性であっ友。

組換え体をクロラムフェニコール非存在下で４２℃で培
養した。対数増殖期の初期にクロラムフェニコールを加
えて更［３０分培養した。この時少数存在するクロラム
フェニコール感受性株は増殖を停止するが、生存してい
る。その後に７）ピシリンを加えて増殖を続けているク
ロラムフェニコール耐性株を殺し友。増殖を停止してい
るクロラムフェニコール感受性株は、７ンピシリンの影
響を受けにくいので、この過程でクロラムフェニコール
感受性株を効率良く濃縮する事ができる。

レグリカ法によりクロラムフェニコール耐性を失っ几株
ｔ−１００株選び、それらのグリシル−Ｌ−ロイシン耐
性度を調べ九ところ、５２株が耐性であっ几ので、これ
らのうち１株より常法に従いＰｌ、７ア、−ジ溶菌液を
得た。

（ｉ＋　　前記中で得られたＰ１ファーゾとスレオニン
生産菌ＡＪ　１１３３２（ＦＩＲＭ　Ｐ−４８９８）　
　より調製したＰ１ファーゾ溶菌液から、ＡＪ　１２３
５０（ＦＥＲＭ　Ｐ　−９５７５）（ｍ＠を一、　ｔｒ
ｐ　、　Ａ）［Ｖｒ、　ＧＬ’、　Ｖａｔ’　）　ｔ−
得た。

αη　各形質転換株のＬ−イソロイシン生産能（１０で
得られたＡＪ　１２３５０　ＣＦＥＲＭ　Ｐ−９５７５
）　Ｋ　（９）で得うレｆｃｐｌＬＶＡｓ−Ｙｌ　トス
レオニンオペロンを持つｐＡＪ２９４　（％開昭５５−
１３１３９７に記載のＡＪ　１１３３４　（ＦＩＲＭ　
Ｐ−４９００）のプラスミド）を導入した。形質転換体
は７）ピシリ／、クロ２ムフエニコール耐性で選択した
。こｊ、をＡＪ　１２３５３　（Ｆ’ｌｉＲＭＰ−９５
７８）と命名する。

プラスミドを持九ない人Ｊ　１２３５０　（ＦＩＪＭ　
Ｐ−９５７５）全対バαとして、Ｌ−イソロイシン生産
培地（３チグルコース、１％（ＮＨ４）２Ｓｏ４１０．
２チＫｌ（２ＰＯ４ｅＯ，Ｉ　Ｔｏ　ＭｇＳＯ４４Ｈ２
０＋　２　ｐｐｍ　Ｆｅ　ｆｆ１）イオｙ　、　２　ｐ
ｐｍＭｎＱＯイオン、　１　ｐｉ／ｒｄｆイアミンー塩
酸塩、１００μ１ｉｌｔｎｌ　Ｌ−メチオニン、　３０
０　ｔｔｌ／ｒｎｌＬ　−）リグトファン）　２０１ｎ
ｌｆｔ５００ｒｎｌの肩付フラスコに入れたものに、被
検菌株を植えつけ、３０℃にて７２時間振盪培養し友。

培養後、遠心上清中のＬ−イソロイシンを液体クロマト
グラフィーにより定量した。また、培養時に前駆体とし
てＬ−スレオニンを１チ添加した結果も合わせ、表−４
に示した。

叛−４ 菌　　　株 Ｌ−イソロイシンＣｎ？／ｄｔ　） ＡＪ１２３５０（Ｆ庫爛Ｐ−９５７５）　　　　　　　
　　　　８ＡＪ１２３５３（ＦＥＲＭ　Ｐ−９５７８）
　　　　　　　　　　３８実施例２ （１）スレオニンデアミナーゼ遺伝子のサブクローニン
グ ７）ピシリン耐性とクロラムフェニコール耐性とをマー
カーに持ち、Ｅ、　ｅｏｌｉとルビバクテリウム属細菌
の両方で複製可能なシャトルベクターｐＤＲ１１２０（
１０ｋｂ　）と、実施例１の（９）で得られたｐＩＬＶ
ＡＳ−Ｙｌとをそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、
両切断物をＴ　４　ＤＮＡリガーゼで結合してＥ、ｃｏ
目に１２　ＡＪ　１２３４９　（ＦＥＲＭ　Ｐ−９５７
４）を形質転換した。

７）ピシリン耐性かつクロラムフェニコール耐性で、Ｌ
−イソロイシンの要求性を失った形質転換体を選択して
プラスミドＤＮＡを調製し、　Ｂａｍ）ｔＩで切断して
解析を行ったところ、ｐＤＲ１１２０に２．３　ｋｂの
Ｂ　ａｍＨＩ断片が挿入されていることが明らかとなっ
た。このシラスミドをｐＤＲＩＡ４と命名した。

ｐＤＲＩＡ４を用いて再びＥ、ｃｏｌＩ　Ｋ１２　ＡＪ
　１２３４９　（ＦＥＲＭｐ−９５７４）　ｅ形質転換
して、７）ピシリン耐性かつクロラムフェニコール耐性
の形質転換体を選択すると、それらは全てＬ−イソロイ
シンの要求性ｋ　失ッテイｆｃ。従ッテ、ｐ　ＤＲＩ　
Ａ４には、ｐＪＬＶＡｓ−Ｙｌ由来のスレオニンデアミ
ナーゼ遺伝子がクローン化されていることが明らかとな
った。

（２）組み換えプラスミドのブレビバクｆｌＪウム・フ
ラバムへの導入 （１）で得られたｐＤＲＬＡ４で、グレピパクテリウム
・フラバムＡＪ　１５１０　及ヒ、グレビパクテリヮム
・フラパＡＫＭし、Ｌ−スレオニンの生産性を有する菌
株ＴＢ−１を形質転換し、クロラムフェニコール耐性形
質転換体を選択しｆｃ０形／ＪＩｔ転換法は、特開Ｖｇ
６１−１４９０８２に記載さ扛ているプトログラスト法
によった。

得られた形質転換体をそれぞれＡＪ　１２３５８（ＦＥ
ＲＭ　”７）−９７６４）、ＡＪ　１２３５９（ＦＥＲ
Ｍ　７）　−（ＶＴＡ夕　　　）と命名した。

（３）形ｔｉ転換林のスレオニンデアミナーゼ活性と、
そのし−イソロイシンによるフィードバック阻鈎 グルコース１００　、Ｓ’　、　　（ＮＨ４）２８０４
４５１、ＫＨ２））０４１１　、　ＭｇＳＯ４’７Ｈ２
０１９％ＦｅＳＯ４１０Ｉ！９、ＭｎＳＯ４１０’９、
ビタミンＢ、０．３！、ピオチン０゜１■、豆端縮有機
態怒累１５０ダを１ｊ中に含む培地で、形質転換株ＡＪ
　１２３５Ｂ　（ＦＥＲＭ　１’−’？’ｌ１４　　　
　）と、対照としてＡＪ　１５１０４　＜２）に記載し
た方法によってｐＤＲｌ　１２０１１′形質転換した株
及びＡＪ　１５１０とを、３１．５℃、１２時間培養し
た後、実施例１の（７）に記載した方法でスレオニンデ
アミナーゼの活性を測定し、また、同活性のし一イソロ
イシンによる阻害金側足した。結果を衣−５及び表−６
に示す。

衣 困 休 ＡＪ　　１５１０ ＡＪ　　１５１０／ｐＤＲ１１２０ ＡＪ　　１５１０／ｐＤＲＩＡ４ （ＡＪ　　１２３５８） ΔＡ３７０／’％’−ｉ日／′ｍ１ｎ ８４．５ ８８．２ ４３８．８ 表 人Ｊ　　１５１０／ｐＤＲ１１２０ ＡＪ　１５１０／ｐＤＲＩＡ４ （ＡＪ　　１２３５８） １００％ １００％ ２４％ ７３チ （４ン形質転換林での、前駆体からＬ−イソロイシンへ
の転換 形質転換株ＡＪ　１２３５８　（ＦＥＲＭ″７）−’？
７δ４　　　）と、対照としてＡＪ　１５１０　Ｋ（２
）に記載した方法によってｐＤＲ１１２０イ形質転換し
た株及びＡＪ　１５１０とを、（３）に記載した培地に
Ｌ−ホモセリン１０１１／ｌ　又はＬ−スレオニン１０
９／ｌ　ｋ添加した培地で、３１．５℃、４８時間培養
した後、遠心上清中のＬ−イソロイシンの蓄積を測定し
た。結果を餞−７に示す。

表　−７ ＡＪ　　１５１０／ｐＤＲ１１２０ ０，７ ０、ｉ ＡＪ　　１５１０／’ＰＤＲＩＡ４ （ＡＪ　　１２３５８） ７．５ ７．５ （５）形質転換株のＬ−イソロイシン生成形質転換法人
Ｊ、　１２３５８　（ＦＥＲＭ　　各ｑ’７１４）及び
ＡＪ　１２３５９　（Ｆ酵財　ｙ−ｑｑ６タ　　　）と
、対照として人Ｊ　１５１０及びＴＢ　−１％（２）に
記載した方法によッテｐＤＲ１１２０−Ｃ”形質転換し
文法と、ＡＪ　１５１０及びＴＢ　−１とを、（３）に
記載した培地で、グルコース全完全て消費するまで培養
し、線心上溝中のし一イソロイシンの蓄積を液体クロマ
トグラフィーで副足し友０Ｍ来を表−８に示す。

弄　−８ ＡＪ　　１５１０ ＡＪ　　１５１０／ｐＤＲ１１２０ ＴＢ　　−１ ２１，０ ＴＢ　−１／ｐＤＲ１１２０ １８，０ 次−８の粕来より、ｐＤＲＩＡ４の尋人によってブレビ
バクテリウム・フラバムにおけるＬ−イソロイシンの生
産性か、顕著に増大することが明らかとなった。

〔発明の幼木〕

以上述べた如く、本発明は、ＤＮＡ組換え技術を利用す
ることにより、Ｌ−イソロイシンの生産性を向上させた
もので、工莱化か大いに期待されるものでおる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）スレオニンデアミナーゼ遺伝子を組み込んだ自律
   増殖可能なプラスミド又はファージ。 （２）スレオニンデアミナーゼ遺伝子がＥ．ｃｏｌｉ由
   来の遺伝子である特許請求の範囲第（１）項記載のプラ
   スミド又はファージ。 （３）スレオニンデアミナーゼ遺伝子が野性型遺伝子で
   ある特許請求の範囲第（１）項記載のプラスミド又はフ
   ァージ。 （４）スレオニンデアミナーゼ遺伝子が変異遺伝子であ
   って、フィードバック阻害が解除されている遺伝子であ
   る特許請求の範囲第（１）項記載のプラスミド又はファ
   ージ。 （５）スレオニンデアミナーゼ遺伝子が本来の、もしく
   は他遺伝子のプロモーター支配下にある遺伝子である特
   許請求の範囲第（１）項記載のプラスミド又はファージ
   。 （６）スレオニンデアミナーゼ遺伝子が本来の、もしく
   は他遺伝子のテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモータ
   ー支配下にある遺伝子である特許請求の範囲第（１）項
   記載のプラスミド又はファージ。 （７）特許請求の範囲第（１）項から第（６）項記載の
   プラスミド又はファージを保有する微生物。 （８）微生物がＥ．ｃｏｌｉである特許請求の範囲第（
   ７）項記載の微生物。 （９）微生物がスレオニンを生産するＥ．ｃｏｌｉであ
   る特許請求の範囲第（７）項記載の微生物。 （１０）微生物がイソロイシン及びバリンの生合成系の
   リプレッションが解除されたＥ．ｃｏｌｉである特許請
   求の範囲第（７）項記載の微生物。 （１１）微生物がコリネホルムのグルタミン酸生産菌で
   ある特許請求の範囲第（７）項記載の微生物。 （１２）微生物がスレオニンを生産するコリネホルムの
   グルタミン酸生産菌である特許請求の範囲第（７）項記
   載の微生物。 （１３）微生物がブレビバクテリウムである特許請求の
   範囲第（７）項記載の微生物。 （１４）微生物がブレビバクテリウム・ラクトファーメ
   ンタムである特許請求の範囲第（７）項記載の微生物。 （１５）微生物がブレビバクテリウム・フラバムである
   特許請求の範囲第（７）項記載の微生物。 （１６）微生物がコリネバクテリウム・グルタミクムで
   ある特許請求の範囲第（７）項記載の微生物。 （１７）微生物がスレオニンを生産するブレビバクテリ
   ウムである特許請求の範囲第（７）項記載の微生物。 （１８）微生物がスレオニンを生産するブレビバクテリ
   ウム・ラクトファーメンタムである特許請求の範囲第（
   ７）項記載の微生物。 （１９）微生物がスレオニンを生産するブレビバクテリ
   ウム・フラバムである特許請求の範囲第（７）項記載の
   微生物。 （２０）微生物がスレオニンを生産するコリネバクテリ
   ウム・グルタミクムである特許請求の範囲第（７）項記
   載の微生物。 （２１）プラスミド上のスレオニンデアミナーゼ遺伝子
   を染色体上に転移させた微生物。（２２）微生物がＥ．
   ｃｏｌｉである特許請求の範囲第（２１）項記載の微生
   物。 （２３）微生物がブレビバクテリウム・ラクトファーメ
   ンタムである特許請求の範囲第（２１）項記載の微生物
   。 （２４）微生物がブレビバクテリウム・フラバムである
   特許請求の範囲第（２１）項記載の微生物。 （２５）微生物がコリネバクテリウム・グルタミクムで
   ある特許請求の範囲第（２１）項記載の微生物。 （２６）微生物がＬ−スレオニンの生産能を高めるよう
   なプラスミドもしくはファージを保有している特許請求
   の範囲第（７）項又は／及び第（２１）項記載の微生物
   。 （２７）プラスミドがＥ．ｃｏｌｉのスレオニンオペロ
   ンを帯同している特許請求の範囲第（２６）項記載の微
   生物。 （２８）プラスミドが特許請求の範囲第（１）項記載の
   プラスミドと共存可能である特許請求の範囲第（２６）
   項及び第（２７）項に記載されているプラスミド。 （２９）特許請求の範囲第（７）項から第（２６）項ま
   での菌株を培養し、培養液からＬ−イソロイシンを単離
   することを特徴とするＬ−イソロイシンの製造法。 （３０）特許請求の範囲第（７）項から第（２６）項ま
   での微生物をスレオニンを含有する培地で培養し、培養
   液からＬ−イソロイシンを単離することを特徴とするＬ
   −イソロイシンの製造法。