CN116042753A - 一种玉米浆菌体蛋白复合水解液的制备方法及l-异亮氨酸的制备方法 - Google Patents
一种玉米浆菌体蛋白复合水解液的制备方法及l-异亮氨酸的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种玉米浆菌体蛋白复合水解液的制备方法以及L‑异亮氨酸的制备方法，其中，将玉米浆作为原料，经产苏氨酸的大肠杆菌发酵后制得玉米浆菌体蛋白复合水解液，将其作为L‑异亮氨酸发酵的有机氮源。玉米浆经过大肠杆菌发酵后，玉米浆中蛋白、氨基酸和多肽利用率升高，可以克服玉米浆品质波动；降低乳酸含量，减少对微生物的发酵抑制；玉米浆经过大肠杆菌发酵后产生微量的L‑苏氨酸，作为L‑异亮氨酸合成的前体物质，促进L‑异亮氨酸的积累，从而提高产酸率。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及玉米浆处理方法及在异亮氨酸生产中的应用。
背景技术
L-异亮氨酸作为必需氨基酸之一，具有多种生物学功能，在食品、医药、饲料等行业具有广泛应用，主要以微生物发酵法获得。目前L-异亮氨酸生产中，为降低生产成本，通常向发酵液中添加部分玉米浆作为有机氮源。玉米浆作为玉米淀粉制备的副产物，含有丰富蛋白质、多糖、维生素等其他营养物质，在亚硫酸浸渍玉米时，易受玉米品质来源的影响引起玉米浆稳定性差，同时也会因乳酸菌的作用产生乳酸，引起酸度增加，不利于氨基酸发酵。
CN109536541A公开了一种玉米浆的预处理方法，对玉米浆进行酶水解预处理，将其中的蛋白质分子降解为多肽及游离氨基酸，使微生物更容易利用，应用水解后的玉米浆提高了柠檬酸的产率，同时也降低了柠檬酸发酵过程中的泡沫量。
CN102373247B公开了一种玉米浆制备方法，将玉米浆与盐溶液进行混合，析出玉米浆中的蛋白质并使其变性，仅利用分离后得到的液相玉米浆溶液，用于赖氨酸生产，避免了因玉米浆中蛋白质含量过高而引起的对微生物发酵生产造成的不良影响，从而显著提高了赖氨酸的产率。
玉米浆虽然作为廉价的氮源，被广泛应用生物发酵技术领域，但目前以玉米浆作为关键氮源的发酵工艺仍存在缺点，易受玉米浆生产工艺和原料的影响，导致每批次玉米浆品质不同，进而影响发酵实验结果的稳定性。
发明内容
本发明的是为解决玉米浆品质波动影响问题，提高发酵效率，并结合L-异亮氨酸生物合成代谢途径，提供了一种更适用于制备L-异亮氨酸的玉米浆菌体蛋白复合水解液的方法。
为此，本发明的技术方案如下：
方案一：一种玉米浆菌体蛋白复合水解液的制备方法，所述方法采用玉米浆做为原料，将产苏氨酸的大肠杆菌作为发酵物，将所述玉米浆发酵之后获得玉米浆菌体蛋白复合水解液。
进一步地，优选方法为：
(1)取玉米浆加入发酵罐中，得到玉米浆培养液；
(2)将产L-苏氨酸的大肠杆菌种子液以20-30％的接种量接入到所述得到的玉米浆培养液中进行发酵培养，得到L-苏氨酸发酵混合液；
(3)向所述得到的L-苏氨酸发酵混合液中添加0.3％-1％蛋白酶进行水解处理，得到玉米浆菌体蛋白复合水解液。
进一步地，所述步骤(1)的一种优选方法为：
取玉米浆加入发酵罐中，按照1：(25-50)的体积比向玉米浆中加入水，并加入3-10g/L葡萄糖和0.2-1g/L硫酸镁，然后采用氢氧化钠中和剂调节混合液的pH值至区间[5.0,5.5]，控制发酵灌内部温度维持在121℃持续20分钟，完成高温灭菌，得到玉米浆培养液。
进一步地，所述步骤(2)的一种优选方法为：
将产L-苏氨酸的大肠杆菌种子液以20-30％的接种量接入到所述得到的玉米浆培养液中进行培养，培养条件为：温度37℃，溶氧≥30％，200-600转/分钟，压力0.05Mpa，培养过程中通过氨水自控维持发酵罐内pH值在区间[7.0，7.2]，培养4至6h，然后将培养温度提升至90℃再维持15分钟灭活菌体，得到L-苏氨酸发酵混合液。
进一步地，所述步骤(3)的一种优选方法为：
向L-苏氨酸发酵混合液中添加0.3％-1％的蛋白酶进行菌体蛋白水解处理，所述蛋白酶的反应条件为pH 7.0，温度37℃，水解时间4h后，控制混合液温度升温至60℃再维持20分钟灭酶活性，得到玉米浆菌体蛋白复合水解液。
方案二：一种L-异亮氨酸的制备方法，所述方法采用本发明方案一所述方法获得的玉米浆菌体蛋白复合水解液作为有机氮源。
进一步地，所述方法中，使用的发酵培养基包含有玉米浆菌体蛋白复合水解液，还包含有葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸铵、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、VB1和VH，所述发酵培养基的pH值为7.2-7.4。
进一步地，所述方法的优选方法为：
(1)采用L-异亮氨酸生产菌种谷氨酸棒状杆菌制备获得谷氨酸棒状杆菌一级种子液；
(2)将谷氨酸棒状杆菌一级种子液接种至种子培养基中获得二级种子液；
(3)将二级种子液接种至发酵培养基中，发酵控制方法为采用氨水自动控制不锈钢发酵罐内pH，维pH在区间[7.2，7.4]，控制罐内压力0.05-0.12MPa、温度30℃-33℃、转速200-600转/分钟的条件下培养，培养过程中恒速补加已经高温灭菌的葡萄糖溶液，维持发酵罐内糖浓度为10g/L，直至发酵结束，即得L-异亮氨酸发酵液。
进一步，所述步骤(2)种子培养基的优选方案为：其包含玉米浆40g/L、葡萄糖30g/L、酵母粉9g/L、氯化钠10g/L和硫酸镁3g/L。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下突出优点及独特性：
本发明以玉米浆为原料，经产苏氨酸的大肠杆菌发酵后制得玉米浆菌体蛋白复合水解液，作为L-异亮氨酸发酵的有机氮源。现有技术在制备玉米浆发酵液产L-异亮氨酸时，没有使用大肠杆菌作为发酵物的，本申请则首次采用了大肠杆菌作为玉米浆发酵的发酵物，属于克服现有技术偏见的发明创造。
本发明的发酵过程简单，处理条件温和，无需强酸水解处理，降低对设备腐蚀性，提高了设备的使用寿命，降低了生产成本。本发明将大肠杆菌作为发酵物，在发酵过程中产生的酶，可以有效的分解玉米浆中蛋白质，产生小分子蛋白、氨基酸、多肽等小分子物质，提高对玉米浆的利用率。
L-异亮氨酸合成途径较为复杂，为天冬氨酸族氨基酸，L-苏氨酸为前体物质，经过多步流程反应，最终形成L-异亮氨酸。采用本发明所述方法制作的玉米浆菌体蛋白复合水解液作为氮源生产L-异亮氨酸，不仅提高了玉米浆中蛋白、多肽、氨基酸等物质利用率，同时经大肠杆菌发酵后，乳酸含量降低、减少了乳酸抑制谷氨酸棒状杆菌发酵现象。此外，玉米浆经过大肠杆菌发酵后产生微量的L-苏氨酸，作为L-异亮氨酸合成的前体物质，促进L-异亮氨酸的积累，从而提高产酸率。
具体实施方式
本发明使用的产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌保藏编号为CGMCC No.12153，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年3月1日，分类命名：谷氨酸棒杆菌 Corynebacterium glutamicum。产L苏氨酸的大肠杆菌保藏编号为CGMCCNo.16144，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年7月23日，分类命名：大肠埃希氏菌 Escherichia coli。
实施例1
(1)大肠杆菌种子液制备：将L-苏氨酸生产菌种大肠杆菌，接种到500mL装液体积100mL的摇瓶培养基中，摇瓶培养基中含有葡萄糖5g/L、玉米浆20g/L、硫酸镁3g/L和磷酸二氢钾2g/L，培养温度37℃，培养环境pH 7.0条件下，摇床转速200转/分钟，培养7h，测得摇瓶内液体OD562nm值为20左右，获得种子液。
(2)玉米浆培养液制备：按照1:50的体积比向玉米浆中加入水、10g/L葡萄糖和0.5g/L硫酸镁，采用氢氧化钠中和剂调节混合液的pH至5.5，维持温度在121℃、20分钟实现高温灭菌，得到玉米浆培养液。
(3)将100mL大肠杆菌种子液接种到装液5L的不锈钢发酵罐中，其发酵培养基成分为(2)中所述的玉米浆培养液。控制所述不锈钢发酵罐中的温度在37℃，不锈钢发酵罐内溶解氧≥30％，调节不锈钢发酵罐转速为200-600转/分钟，控制发酵罐内部压力为0.05MPa，风量为0.2-1m3/h，培养4h后，将罐内温度升温至90℃维持15分钟灭活菌体，得到L-苏氨酸发酵混合液。
(4)玉米浆菌体蛋白复合水解液制备：向L-苏氨酸发酵混合液中添加0.5％的蛋白酶进行菌体蛋白水解处理，蛋白酶水解条件为pH7.0，温度37℃；水解时间4h后，控制混合液温度升温至60℃再维持20分钟灭酶活性，得到玉米浆菌体蛋白复合水解液。
(5)谷氨酸棒状杆菌一级种子液制备：将L-异亮氨酸生产菌种谷氨酸棒状杆菌，接种到250mL装液体积80mL的茄子瓶固体斜面培养基中，在培养温度32℃，pH 7.0条件下，培养24h，用200mL生理盐水洗脱打散，获得一级种子液。
(6)将200mL的一级种子液接种到装液3L的不锈钢发酵罐中，其种子培养基含有玉米浆40g/L、葡萄糖30g/L、酵母粉9g/L、氯化钠10g/L和硫酸镁3g/L，控制所述不锈钢发酵罐内部温度在32℃，调节不锈钢发酵罐转速为200-600转/分钟，控制不锈钢发酵罐内部溶解氧≥30％，控制不锈钢发酵罐内部压力为0.05-0.1MPa，风量为0.2-1m3/h，培养至成熟，获得二级种子液。
(7)将成熟的二级种子液，按照接种量15％，接种至含有玉米浆菌体蛋白复合水解液30g/L，葡萄糖50g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁1g/L，硫酸亚铁15mg/L，硫酸锰15mg/L，VB1 0.006g/L，VH 0.008g/L的发酵培养基中。此发酵培养基初始总氮3.2g/L，氨基氮2.7g/L，氨基氮/总氮比例为84％。
(8)发酵控制方法，采用25％氨水自动控制不锈钢发酵罐内的pH，维持pH在7.2，控制不锈钢发酵罐内压力为0.05-0.12MPa，控制不锈钢发酵罐内温度为32℃，调节不锈钢发酵罐内转速为200-600转/分钟，不锈钢发酵罐内溶解氧控制在20-30％，恒速补加已经高温灭菌的葡萄糖溶液，维持发酵罐内糖浓度为10g/L，直至发酵结束。发酵结束时间为50h，即得L-异亮氨酸发酵液。经含量检测和转化率计算，L-异亮氨酸为49.1g/L，转化率18.99％。
本实施例中转化率的计算公式为：(异亮氨酸产量×体积)/(发酵底糖+补加糖)×100％。
实施例2
(1)大肠杆菌种子液制备：将L-苏氨酸生产菌种大肠杆菌，接种到500mL装液体积100mL的摇瓶培养基中，摇瓶培养基中含有葡萄糖5g/L、玉米浆20g/L、硫酸镁3g/L和磷酸二氢钾2g/L，培养温度37℃，培养环境pH 7.0条件下，摇床转速160-200转/分钟，培养6h，测得摇瓶内液体OD562nm值为18左右，获得种子液。
(2)玉米浆培养液制备：按照1:25的体积比向玉米浆中加入水、10g/L葡萄糖、0.5g/L硫酸镁，采用氢氧化钠中和剂调节混合液pH至5.5，维持温度在121℃、20分钟实现高温灭菌后，得到玉米浆培养液。
(3)将100mL大肠杆菌种子液接种到装液5L的不锈钢发酵罐中，其发酵培养基成分为(2)中所述的玉米浆培养液。控制所述不锈钢发酵罐中的温度在37℃，调节不锈钢发酵罐转速为200-600转/分钟，控制不锈钢发酵罐内溶解氧≥30％，控制不锈钢发酵罐内压力为0.05-0.1MPa，风量为0.2-1m3/h，培养6h后，将罐内温度升温至90℃维持15分钟灭活菌体，得到L-苏氨酸发酵混合液。
(4)玉米浆菌体蛋白复合水解液制备：向L-苏氨酸发酵混合液中添加1％的蛋白酶进行菌体蛋白水解处理，蛋白酶水解条件为pH7.0，温度37℃，水解时间4h后，控制混合液温度升至60℃再维持20分钟灭酶活性，得到玉米浆菌体蛋白复合水解液。
(5)谷氨酸棒状杆菌一级种子液制备：将L-异亮氨酸生产菌种谷氨酸棒状杆菌，接种到250mL装液体积80mL的茄子瓶固体斜面培养基中，在培养温度32℃，pH 6.0条件下，培养36h，用200mL生理盐水洗脱打散，获得一级种子液。
(6)将200mL的一级种子液接种到装液3L的不锈钢发酵罐中，其种子培养基含有玉米浆45g/L、葡萄糖30g/L、酵母粉6g/L、氯化钠10g/L和硫酸镁3g/L，控制不锈钢发酵罐内部温度在32℃，调节不锈钢发酵罐内转速为200-600转/分钟，控制不锈钢发酵罐溶解氧≥30％，控制不锈钢发酵罐压力为0.05-0.1MPa，风量为0.2-1m3/h，培养至成熟，获得二级种子液。
(7)将成熟的二级种子液，按照接种量15％，接种至含有玉米浆菌体蛋白复合水解液25g/L，葡萄糖50g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸铵6g/L，硫酸镁2g/L，硫酸亚铁10mg/L，硫酸锰10mg/L，VB1 0.002g/L，VH 0.004g/L的发酵培养基中。此发酵培养基初始总氮3g/L，氨基氮2.5g/L，氨基氮/总氮比例为83％。
(8)发酵控制方法，采用25％氨水自动控制不锈钢发酵罐内的pH，维持pH为7.4，不锈钢发酵罐内压力控制在0.05-0.12MPa，控制不锈钢发酵罐内部温度在31℃，调节不锈钢发酵罐转速为200-600转/分钟，调节不锈钢发酵罐溶解氧20-30％，恒速补加已经高温灭菌的葡萄糖溶液，维持发酵罐内糖浓度为15g/L，直至发酵结束。发酵结束时间为50h，即得L-异亮氨酸发酵液。经含量检测和转化率计算，L-异亮氨酸为49.7g/L，转化率19.1％。
本实施例中转化率的计算公式为：(异亮氨酸产量×体积)/(发酵底糖+补加糖)×100％。
实施例3
(1)大肠杆菌种子液制备：将L-苏氨酸生产菌种大肠杆菌，接种到500mL装液体积100mL的摇瓶培养基中，摇瓶培养基中含有葡萄糖5g/L、玉米浆20g/L、硫酸镁3g/L和磷酸二氢钾2g/L，培养温度37℃，培养环境pH 7.0条件下，摇床转速为160-200转/分钟，培养7h，测得OD562nm为20左右，获得种子液。
(2)玉米浆培养液制备：按照1:50的体积比向玉米浆中加入水、10g/L葡萄糖和0.5g/L硫酸镁，采用氢氧化钠中和剂调节混合液的pH至5.5，维持温度在121℃、20分钟实现高温灭菌，得到玉米浆培养液。
(3)将100mL大肠杆菌种子液接种到装液5L的不锈钢发酵罐中，其发酵培养基成分为(2)中所述的玉米浆培养液。控制所述不锈钢发酵罐中的温度在37℃，调节不锈钢发酵罐内转速至200-600转/分钟，控制不锈钢发酵罐内溶解氧≥30％，控制不锈钢发酵罐内压力0.05-0.1MPa，风量0.2-1m3/h，培养5h后，将不锈钢发酵罐内温度升温至90℃维持15分钟灭活菌体，得到L-苏氨酸发酵混合液。
(4)玉米浆菌体蛋白复合水解液制备：向L-苏氨酸发酵混合液中添加0.5％的蛋白酶进行菌体蛋白水解处理，蛋白酶水解条件为pH7.0，温度37℃，水解时间4h后，将混合液温度升温至60℃再维持20分钟灭酶活性，得到玉米浆菌体蛋白复合水解液。
(5)谷氨酸棒状杆菌一级种子液制备：将L-异亮氨酸生产菌种谷氨酸棒状杆菌，接种到250mL装液体积80mL的茄子瓶固体斜面培养基中，在培养温度32℃，pH 7.0条件下，培养36h，用200mL生理盐水洗脱打散，获得一级种子液。
(6)将200mL的一级种子液接种到装液3L的不锈钢发酵罐中，其种子培养基含有玉米浆50g/L、葡萄糖30g/L、酵母粉8g/L、氯化钠10g/L和硫酸镁2.5g/L，控制不锈钢发酵罐内部温度在32℃，调节不锈钢发酵罐内转速至200-600转/分钟，控制不锈钢发酵罐内溶解氧≥30％，调节不锈钢发酵罐压力为0.05-0.1MPa，风量0.2-1m3/h，培养至成熟，获得二级种子液。
(7)将成熟的二级种子液，按照接种量15％，接种至含有玉米浆菌体蛋白复合水解液40g/L,葡萄糖50g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，硫酸铵5.5g/L，硫酸镁2.5g/L，硫酸亚铁15mg/L，硫酸锰15mg/L，VB1 0.005g/L，VH 0.005g/L的发酵培养基中。此发酵培养基初始总氮3.4g/L，氨基氮2.67g/L，氨基氮/总氮比例为78.5％。
(8)发酵控制方法，采用25％氨水自动控制不锈钢发酵罐内的pH，维持pH为7.2，控制不锈钢发酵罐内压力为0.05-0.12MPa，控制不锈钢发酵罐内温度在32℃，调节不锈钢发酵罐内转速为200-600转/分钟，控制不锈钢发酵罐内溶解氧为20-30％，恒速补加已经高温灭菌的葡萄糖溶液，维持发酵罐内糖浓度为10g/L，直至发酵结束。发酵结束时间为50h，即得L-异亮氨酸发酵液。经含量检测和转化率计算，L-异亮氨酸为51.8g/L，转化率20.01％。
本实施例中转化率的计算公式为：(异亮氨酸产量×体积)/(发酵底糖+补加糖)×100％
实施例4
(1)大肠杆菌种子液制备：将L-苏氨酸生产菌种大肠杆菌，接种到500mL装液体积100mL的摇瓶培养基中，摇瓶培养基中含有葡萄糖5g/L、玉米浆20g/L、硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾2g/L，培养温度37℃，培养环境pH 7.0条件下，摇床转速160转/分钟，培养7h，测得OD(562nm)值为20左右，获得种子液。
(2)玉米浆培养液制备：按照1:40的体积比向玉米浆中加入水、10g/L葡萄糖和0.5g/L硫酸镁，采用氢氧化钠中和剂调节混合液的pH至5.5，维持温度在121℃、20分钟实现高温灭菌后，得到玉米浆培养液。
(3)将100mL大肠杆菌种子液接种到装液5L的不锈钢发酵罐中，其发酵培养基成分为(2)中所述的玉米浆培养液。控制所述不锈钢发酵罐中的温度在37℃，调节不锈钢发酵罐内转速至200-600转/分钟，调节不锈钢发酵罐内溶解氧≥30％，控制不锈钢发酵罐内压力为0.05-0.1MPa，风量0.2-1m3/h，培养5h后，将不锈钢发酵罐内温度升温至90℃维持15分钟灭活菌体，得到L-苏氨酸发酵混合液。
(4)玉米浆菌体蛋白复合水解液制备：向L-苏氨酸发酵混合液中添加0.8％的蛋白酶进行菌体蛋白水解处理，蛋白酶水解条件为pH7.0，温度37℃，水解时间4h后，控制混合液温度升至60℃维持20分钟灭酶活性，得到玉米浆菌体蛋白复合水解液。
(5)谷氨酸棒状杆菌一级种子液制备：将L-异亮氨酸生产菌种谷氨酸棒状杆菌，接种到250mL装液体积80mL的茄子瓶固体斜面培养基中，在培养温度32℃，pH 7.0条件下，培养24h，用200mL生理盐水洗脱打散，获得一级种子液。
(6)将200mL的一级种子液接种到装液3L的不锈钢发酵罐中，其种子培养基含有玉米浆50g/L、葡萄糖30g/L、酵母粉7g/L、氯化钠10g/L和硫酸镁2.5g/L，控制不锈钢发酵罐内部温度在32℃，调节不锈钢发酵罐内转速至200-600转/分钟，调节不锈钢发酵罐内溶解氧≥30％，控制不锈钢发酵罐内压力为0.05-0.1MPa，风量0.2-1m3/h，培养至成熟，获得二级种子液。
(7)将成熟的二级种子液，按照接种量15％，接种至含有玉米浆菌体蛋白复合水解液35g/L，葡萄糖70g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁4g/L，硫酸亚铁15mg/L，硫酸锰15mg/L，VB1 0.001g/L，VH 0.001g/L的发酵培养基中，此发酵培养基初始总氮3.3g/L，氨基氮2.8g/L，氨基氮/总氮比例为84.8％。
(8)发酵控制方法，采用25％氨水自动控制不锈钢发酵罐内的pH，维持pH为7.2，控制不锈钢发酵罐内压力在0.05-0.12MPa，控制不锈钢发酵罐内温度在32℃，调节不锈钢发酵罐内转速至200-600转/分钟，控制不锈钢发酵罐内溶解氧为20-30％，恒速补加已经高温灭菌的葡萄糖溶液，维持发酵罐内糖浓度为10g/L，直至发酵结束。发酵结束时间为50h，即得L-异亮氨酸发酵液。经含量检测和转化率计算，L-异亮氨酸为49.2g/L，转化率19.5％。
本实施例中转化率的计算公式为：(异亮氨酸产量×体积)/(发酵底糖+补加糖)×100％
实施例1-4中，从氮源含量以及L-异亮氨酸含量、转化率可以看出本申请中的技术方案可以使玉米浆的品质趋于稳定。
对比例5
对比例为运用常规技术手段制备L-异亮氨酸发酵液的方法，可以看出，氨基氮/总氮比例、L-异亮氨酸含量以及转化率都显著低于采用本申请中技术方案所得到的结果。
(1)谷氨酸棒状杆菌一级种子液制备：将L-异亮氨酸生产菌种谷氨酸棒状杆菌，接种到250mL装液体积80mL的茄子瓶固体斜面培养基中，在培养温度32℃，培养环境pH 7.0条件下，培养24h，用200mL生理盐水洗脱打散，获得一级种子液。
(2)将200mL的一级种子液接种到装液3L的不锈钢发酵罐中，其种子培养基含有玉米浆50g/L、葡萄糖30g/L、酵母粉7g/L、氯化钠10g/L、硫酸镁2.5g/L，控制所述不锈钢发酵罐中的温度在32℃，调节不锈钢发酵罐内转速至200-600转/分钟，调节不锈钢发酵罐溶解氧≥30％，调节不锈钢发酵罐内压力0.05-0.1MPa，风量0.2-1m3/h，培养至成熟，获得二级种子液。
(3)将成熟的二级种子液，按照接种量15％，接种至含有玉米浆22g/L,葡萄糖70g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁4g/L，硫酸亚铁15mg/L，硫酸锰15mg/L，VB10.001g/L，VH 0.001g/L，苏氨酸0.4g/L的发酵培养基中。此发酵培养基初始总氮3.5g/L，氨基氮2g/L，氨基氮/总氮比例为57％。
(4)发酵控制方法，采用25％氨水自动控制不锈钢发酵罐内的PH，维持pH为7.2，控制不锈钢发酵罐内压力在0.05-0.12MPa，控制不锈钢发酵罐内温度在32℃，调剂不锈钢发酵罐内转速在200-600转/分钟，控制不锈钢发酵罐内溶解氧为20-30％，恒速补加已经高温灭菌的葡萄糖溶液，维持发酵罐内糖浓度为15g/L，直至发酵结束。发酵结束时间为50h，即得L-异亮氨酸发酵液。经含量检测和转化率计算，L-异亮氨酸为45g/L，转化率15.7％。本实施例中转化率的计算公式为：(异亮氨酸产量×体积)/(发酵底糖+补加糖)×100％。
Claims (9)
1.一种玉米浆菌体蛋白复合水解液的制备方法，其特征在于，所述方法采用玉米浆做为原料，将产苏氨酸的大肠杆菌作为发酵物，将所述玉米浆发酵之后获得玉米浆菌体蛋白复合水解液。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)取玉米浆加入发酵罐中，得到玉米浆培养液；
(2)将产L-苏氨酸的大肠杆菌种子液以20-30％的接种量接入到所述得到的玉米浆培养液中进行发酵培养，得到L-苏氨酸发酵混合液；
(3)向所述得到的L-苏氨酸发酵混合液中添加0.3％-1％蛋白酶进行水解处理，得到玉米浆菌体蛋白复合水解液。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)进一步包括：
取玉米浆加入发酵罐中，按照1：(25-50)的体积比向玉米浆中加入水，并加入3-10g/L葡萄糖和0.2-1g/L硫酸镁，然后采用氢氧化钠中和剂调节混合液的pH值至区间[5.0,5.5]，将发酵罐内部温度维持在121℃持续20分钟，完成高温灭菌，得到玉米浆培养液。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)进一步包括：
将产L-苏氨酸的大肠杆菌种子液以20-30％的接种量接入到所述得到的玉米浆培养液中进行培养，培养条件为：温度37℃，溶氧≥30％，200-600转/分钟，压力0.05Mpa，培养过程中通过氨水自控维持发酵罐内pH值在区间[7.0,7.2]，培养4至6h，然后将培养温度提升至90℃再维持15分钟灭活菌体，得到L-苏氨酸发酵混合液。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)进一步包括：
向L-苏氨酸发酵混合液中添加0.3％-1％的蛋白酶进行菌体蛋白水解处理，所述蛋白酶的反应条件为pH 7.0，温度37℃，水解时间4h后，控制混合液温度升温至60℃再维持20分钟灭酶活性，得到玉米浆菌体蛋白复合水解液。
6.一种L-异亮氨酸的制备方法，其特征在于，所述方法采用权利要求1至4任意一项权利要求所述的方法获得的玉米浆菌体蛋白复合水解液作为有机氮源。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法中，使用的发酵培养基包含有玉米浆菌体蛋白复合水解液，还包含有葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸铵、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、VB1和VH，所述发酵培养基的pH为7.2-7.4。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法为：
(1)采用L-异亮氨酸生产菌种谷氨酸棒状杆菌制备获得谷氨酸棒状杆菌一级种子液；
(2)将谷氨酸棒状杆菌一级种子液接种至种子培养基中获得二级种子液；
(3)将二级种子液接种至权利要求7所述的发酵培养基中，发酵控制方法为采用氨水自动控制发酵罐内pH，维pH在区间[7.2,7.4]，培养条件：罐内压力0.05-0.12MPa、温度30℃-33℃、转速200-600转/分钟，培养过程中恒速补加已经高温灭菌的葡萄糖溶液，维持发酵罐内糖浓度为10g/L，直至发酵结束，即得L-异亮氨酸发酵液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述种子培养基包含：玉米浆40g/L、葡萄糖30g/L、酵母粉9g/L、氯化钠10g/L和硫酸镁3g/L。
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