ES2673582T3

ES2673582T3 - Método de generación de L-lisina por medio de bacterias fermentadoras que poseen un gen de aconitasa y/o un elemento regulador modificado

Info

Publication number: ES2673582T3
Application number: ES14748825.8T
Authority: ES
Inventors: Jiyin MA; Tingyi WEN; Jinlong Chen; Yong Liang; Shuwen Liu; Aiying WEI; Lipeng YANG; Rui REN; Gang Meng; Chunguang ZHAO; Yun Zhang; Xiuling SHANG; Xiaowei Guo
Original assignee: NINGXIA EPPEN BIOTECH CO Ltd
Current assignee: NINGXIA EPPEN BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2013-02-08
Filing date: 2014-01-07
Publication date: 2018-06-22
Anticipated expiration: 2034-01-07
Also published as: RU2015134995A; CA2900580C; DK2824186T3; KR102127181B1; EP2824186B1; EP2824186A4; EP2824186A1; US20160002684A1; JP6335196B2; JP2016506737A; KR20150115009A; CA2900580A1; WO2014121669A1; RU2015134995A3

Abstract

Un método para producir L-lisina mediante fermentación o para aumentar el rendimiento de fermentación de la Llisina, que comprende las etapas de: (1) modificar un gen de aconitasa y/o un elemento regulador de este en un cromosoma de una bacteria productora de L-lisina, de modo que la actividad y/o la cantidad de expresión de la aconitasa de la bacteria se reduce, pero no se elimina; y (2) producir L-lisina mediante fermentación con la bacteria obtenida mediante la modificación de la etapa (1), en el que la modificación del gen de aconitasa y/o un elemento regulador de este incluye: (i) una sustitución del codón de inicio de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 del gen de aconitasa en el cromosoma de una Escherichia coli productora de L-lisina por GTG; (ii) una sustitución de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:4 de un promotor del gen de aconitasa en el cromosoma de una Escherichia coli productora de L-lisina por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3; (iii) una sustitución de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:6 de un promotor del gen de aconitasa en el cromosoma de una Corynebacterium glutamicum o Corynebacterium pekinense productora de L-lisina por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:5; (iv) una deleción de 90 nucleótidos antes del codón de fin en la secuencia de nucleótidos del gen de aconitasa de SEQ ID NO:1 en el cromosoma de una Escherichia coli productora de L-lisina; o (v) una adición en la secuencia de nucleótidos de un represor de la transcripción (SEQ ID NO:7) del gen de aconitasa, preferiblemente una adición de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:8 y 7 en tándem.

Description

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DESCRIPCION

Método de generación de L-lisina por medio de bacterias fermentadoras que poseen un gen de aconitasa y/o un elemento regulador modificado

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de la fermentación de aminoácidos y, específicamente, se refiere a un método para producir L-lisina mediante fermentación y a métodos y usos derivados del método, así como a bacterias empleadas en estos métodos y usos.

Técnica anterior

La producción de L-lisina mediante fermentación con bacterias productoras de L-lisina (por ejemplo, E. coli del género Escherichia y bacterias del género Corynebacterium) se ha utilizado mucho en la industria. Estas bacterias pueden aislarse a partir del entorno natural y/o pueden obtenerse mediante mutagénesis o modificación genética. La técnica anterior se centra en modificaciones genéticas de genes, tales como pnt, dap, ppc y similares, y no ha tomado en cuenta los elementos reguladores de los genes que codifican una aconitasa (por ejemplo, aconitasa A de Escherichia coli, una aconitasa de Corynebacterium glutamicum o Corynebacterium pekinense) para la producción de L-lisina. Por ejemplo, Mitsuhashi et al., 2006, analizan la alteración de la malato:quinona oxidorreductasa, el documento US5766925 analiza la modificación del gen que codifica la aspartoquinasa, y el documento US 2002/0072099 analiza los genes que codifican sucC y sucD para aumentar la producción de L-lisina. Además, la técnica anterior analiza el aumento de la actividad de la acetohidroxiácido sintasa para aumentar la producción de la biosíntesis de valina en Corynebacterium glutamicum (Ruklisha et al., 2007).

La aconitasa es una enzima del ciclo de los ácidos tricarboxílicos que cataliza reacciones químicas en dos etapas: la transformación del ácido cítrico en ácido aconítico, y la transformación del ácido aconítico en ácido isocítrico. En la conocida bacteria Escherichia, el gen acnA, cuya secuencia de nucleótidos se muestra en SEQ ID NO:1, codifica la aconitasa A. Sin embargo, quizá debido a que su metabolito está muy lejano del producto final de L-lisina, así como por sus muchas y complejas ramificaciones del metabolismo de los intermedios, no se ha sugerido su papel en la fermentación de la L-lisina. No existen informes acerca de los efectos de una aconitasa procedente de otras bacterias productoras de L-lisina, tales como Corynebacterium glutamicum y similares, sobre la fermentación de la L- lisina. Las aconitasas descritas en documentos, tales como las patentes chinas CN1289368A y CN101631871A, se refieren a la fermentación del ácido L-glutámico y no indican ningún efecto sobre la fermentación de la L-lisina.

Después de largas investigaciones y prácticas, y en especial debido a la suerte, los inventores han descubierto, de modo fortuito, que una modificación de un gen de aconitasa y un elemento regulador de este conduce a un aumento en el rendimiento de la L-lisina.

Además, en la técnica anterior, la cantidad de expresión y/o la actividad enzimática aumentan por medio del aumento en el número de copias y la introducción de una mutación dirigida a sitio de un gen de enzima útil, o una actividad enzimática y/o una cantidad de expresión se eliminan por medio de la inactivación de un gen de una enzima perjudicial. Sin embargo, los inventores han descubierto que un gen de aconitasa y un elemento regulador de este son diferentes de los que aparecen en la técnica anterior y no pueden ser simplemente aumentados o inactivados. En especial, la eliminación de la expresión del gen acnA por la inactivación provoca un crecimiento lento de las bacterias y dificulta su uso práctico, de modo que se inventó un nuevo método para modificar un gen de aconitasa y/o un elemento regulador de este para aumentar el rendimiento de la L-lisina.

Además, el método no interfiere con los sitios de modificación en los cromosomas de una gran cantidad de bacterias productoras de L-lisina modificadas según la técnica anterior, para aumentar aún más el efecto y ser útil para producir, de modo práctico, L-lisina empleando una gran diversidad de bacterias.

Descripción de la invención

El problema que resuelve la invención es proporcionar un nuevo método para producir L-lisina mediante fermentación y métodos relacionados, que incluyen un método para aumentar el rendimiento de fermentación de la L-lisina comparado con una bacteria no modificada, el uso de una bacteria modificada para producir L-lisina mediante fermentación, el uso de una bacteria modificada para aumentar el rendimiento de fermentación de la L- lisina comparado con una bacteria no modificada y/o un método para modificar una bacteria. Además, la descripción también proporciona un polinucleótido, un vector y/o una bacteria empleados en los métodos mencionados anteriormente.

De modo específico, en un primer aspecto, la invención proporciona un método para producir L-lisina mediante fermentación, que comprende las etapas de:

(1) modificar un gen de aconitasa y/o un elemento regulador de este en un cromosoma de una bacteria, de modo que la actividad y/o la cantidad de expresión de la aconitasa de la bacteria se reduce, pero no se elimina; y

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(2) producir L-lisina mediante fermentación con la bacteria obtenida mediante la modificación de la etapa (1), en el que la modificación del gen de aconitasa y/o un elemento regulador de este incluye:

(i) una sustitución de GTG en el codón de inicio de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 del gen de aconitasa en el cromosoma de una Escherichia coli productora de L-lisina por GTG;

(ii) una sustitución de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:4 de un promotor del gen de aconitasa en el

cromosoma de una Escherichia coli productora de L-lisina por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3;

(iii) una sustitución de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:6 de un promotor del gen de aconitasa en el

cromosoma de una Corynebacterium glutamicum o Corynebacterium pekinense productora de L-lisina por la

secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:5;

(iv) una deleción de 90 nucleótidos antes del codón de fin en la secuencia de nucleótidos del gen de aconitasa de SEQ ID NO:1 en el cromosoma de una Escherichia coli productora de L-lisina; o

(v) una adición en la secuencia de nucleótidos de un represor de la transcripción (SEQ ID NO:7) del gen de aconitasa, preferiblemente una adición de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:8 y 7 en tándem.

El término "modificación" empleado en la presente significa un cambio de un objeto que debe modificarse y que produce cierto efecto. Las técnicas de modificación de un gen o de un elemento regulador en un cromosoma incluyen, pero no se limitan a mutagénesis, mutación dirigida a sitio y/o recombinación homóloga, preferiblemente las dos últimas. La modificación de un gen o un elemento regulador en un cromosoma es una adición, una deleción o una sustitución de uno o más nucleótidos en la secuencia de nucleótidos del gen o del elemento regulador. Estas técnicas se describen a fondo en documentos de la biología molecular y de la microbiología, y muchas están disponibles en el mercado. En las realizaciones de la descripción, la modificación puede realizarse según el principio de la recombinación homóloga empleando el plásmido pKOV disponible en el mercado en Addgene o empleando el plásmido pK18mobsacS, de modo que un gen de aconitasa no modificado y/o un elemento regulador de este en un cromosoma bacteriano se modifica para convertirse en un nuevo gen de aconitasa y/o un elemento regulador de este, y la cantidad de expresión y/o la actividad enzimática de la aconitasa en la bacteria modificada se reduce, pero no se elimina. Por tanto, preferiblemente la modificación empleada en la presente es una modificación mediante recombinación homóloga.

Después de largas investigaciones, los inventores han descubierto que, en Escherichia coli, en bacterias del género Corynebacterium y similares, la eliminación de la expresión de una aconitasa empleando técnicas tales como la inactivación de un gen, provoca el crecimiento lento de las bacterias e incluso no se producen aminoácidos. Por tanto, la modificación de la invención reduce, pero no elimina la cantidad de expresión de la aconitasa de la bacteria obtenida mediante la modificación, comparado con la bacteria sin la modificación. Preferiblemente, la cantidad de expresión de la aconitasa A de la bacteria obtenida mediante la modificación se reduce en 20%-95%, más preferiblemente en 50%-90%, por ejemplo, en 65%, 70% o 80%.

Por consiguiente, la descripción también proporciona otros usos o métodos. Por ejemplo, en un segundo aspecto, la invención proporciona un método para aumentar el rendimiento de fermentación de la L-lisina, que comprende las etapas de:

(2) producir L-lisina mediante fermentación con la bacteria obtenida mediante la modificación de la etapa (1).

La L-lisina es un metabolito importante de las bacterias, y la mayoría de las bacterias pueden generar una cantidad mayor o menor de L-lisina. Aunque las bacterias productoras de L-lisina con un bajo rendimiento no son adecuadas para producir L-lisina de modo eficaz y barato, los métodos de la invención pueden provocar un aumento en la L- lisina y pueden emplearse en un área que no se vea afectada por el coste. Sin duda, una bacteria preferida empleada en la presente es una bacteria productora de L-lisina con alto rendimiento, y su rendimiento puede aumentar aún más empleando los métodos de la invención. Además, en los métodos o usos de la invención, excepto por la modificación en el gen de aconitasa y/o un elemento regulador de este en un cromosoma de una bacteria, no se realizan más modificaciones. Por ejemplo, un gen de aconitasa en un cromosoma bacteriano puede no modificarse, mientras que un elemento regulador del gen de aconitasa sí se modifica, y viceversa. Por ejemplo, puede modificarse solo uno de un gen de aconitasa y un elemento regulador de este en un cromosoma de una bacteria, en especial una bacteria productora de L-lisina con alto rendimiento.

Por ejemplo, en un tercer aspecto, la descripción proporciona el uso de una bacteria obtenida mediante una modificación para producir L-lisina mediante fermentación, en el que la modificación consiste en modificar un gen de aconitasa y/o un elemento regulador de este en un cromosoma de una bacteria, y la actividad enzimática y/o la cantidad de expresión de la aconitasa de la bacteria obtenida mediante la modificación se reduce, pero no se elimina.

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La bacteria obtenida mediante la modificación puede emplearse sola, con otras bacterias productoras de L-lisina, o con otros medios para producir L-lisina mediante fermentación. A menos que se indique lo contrario (por ejemplo, sin que aparezca la definición de "obtenida mediante la modificación"), el término "bacteria" empleado en la presente significa una bacteria no modificada o una bacteria sin la modificación, un gen de aconitasa y un elemento regulador localizado alrededor del locus del gen en un cromosoma, que son un gen de aconitasa y un elemento regulador que no presentan la disminución de la actividad enzimática y/o la cantidad de expresión de la aconitasa, por ejemplo, un gen de aconitasa y un elemento regulador de una bacteria de tipo salvaje.

Por ejemplo, en un cuarto aspecto, la descripción proporciona el uso de una bacteria obtenida mediante una modificación para aumentar el rendimiento de fermentación de la L-lisina, en el que la modificación consiste en modificar un gen de aconitasa y/o un elemento regulador de este en un cromosoma de una bacteria, y la actividad enzimática y/o la cantidad de expresión de la aconitasa de la bacteria obtenida mediante la modificación se reduce, pero no se elimina.

Tal como se emplea en la presente, la bacteria puede ser una bacteria productora de L-lisina, por ejemplo, una bacteria del género Escherichia o Corynebacterium. En un aspecto preferible, la bacteria puede ser una bacteria del género Escherichia, más preferiblemente Escherichia coli, por ejemplo, cepas filiales de Escherichia coli K-12, que incluyen cepas derivadas de la cepa W3110. En otro aspecto preferible, la bacteria puede ser una bacteria del género Corynebacterium, más preferiblemente Corynebacterium glutamicum o Corynebacterium pekinense. Debido a que pocos documentos de la técnica anterior sugieren un papel de un gen de aconitasa y/o un elemento regulador de este procedente de una bacteria en la producción/fermentación de la L-lisina y se centran en loci tales como pnt, dap, ppc y similares, para modificar los genes en los cromosomas, no existen informes acerca de una modificación de un gen de aconitasa y/o un elemento regulador de este en bacterias productoras de L-lisina (en especial, bacterias del género Escherichia o Corynebacterium, por ejemplo, E. coli, Corynebacterium glutamicum o Corynebacterium pekinense) en la técnica anterior y, por tanto, las bacterias productoras de L-lisina sustancialmente poseen genes de aconitasa y sus elementos reguladores de tipo salvaje.. Por tanto, pueden ser modificadas empleando los métodos de la invención para aumentar el rendimiento de fermentación de la L-lisina. En las realizaciones de la invención, todas las bacterias productoras de L-lisina con alto o bajo rendimiento pueden modificarse empleando los métodos de la invención para aumentar el rendimiento de fermentación de la L-lisina.

Sustancialmente, en un quinto aspecto, la descripción proporciona un método para modificar una bacteria, que comprende la etapa de modificar un gen de aconitasa y/o un elemento regulador de este en un cromosoma de una bacteria, de modo que la actividad y/o la cantidad de expresión de la aconitasa de la bacteria obtenida mediante la modificación se reduce, pero no se elimina.

La bacteria obtenida mediante el método del quinto aspecto de la descripción puede emplearse para producir o generar L-lisina mediante fermentación. Por tanto, en un sexto aspecto, la descripción proporciona una bacteria obtenida mediante el método del quinto aspecto de la descripción.

Según los experimentos de los inventores, muchas secuencias de nucleótidos de genes de aconitasa (acnA) procedentes de bacterias del género Escherichia (por ejemplo, E. coli) se muestran en SEQ ID NO:1, mientras que muchas secuencias de nucleótidos de genes de aconitasa procedentes de bacterias del género Corynebacterium (por ejemplo, Corynebacterium glutamicum o Corynebacterium pekinense) se muestran en SEQ ID nO:2. La modificación de estos genes de aconitasa para reducir, pero no eliminar, la actividad enzimática y/o la expresión de las aconitasas en las bacterias modificadas puede aumentar el rendimiento de fermentación de la L-lisina. Por tanto, en la invención, la secuencia de nucleótidos del gen de aconitasa se muestra en SEQ ID NO:1 o 2. Para otras bacterias, pueden obtenerse las secuencias de nucleótidos de genes de aconitasa de las bacterias mediante técnicas tales como secuenciación y comparando identidades de secuencias para la modificación de los métodos de la invención.

En la descripción, la etapa preferible de modificar un gen de aconitasa en un cromosoma de una bacteria es una adición, una deleción o una sustitución de uno o más nucleótidos en la secuencia de nucleótidos del gen de aconitasa, con la condición de que la actividad enzimática y/o la cantidad de expresión de la aconitasa procedente de la bacteria modifica se reduzca, pero no se elimine.

Según la experiencia de los inventores, aunque habitualmente es difícil aumentar la actividad y/o la cantidad de expresión de una enzima bacteriana porque la bacteria ha ido evolucionando a lo largo de mucho tiempo y los sitios de modificación para el aumento deben investigarse cada uno en concreto, la investigación para la disminución de la actividad y/o de la cantidad de expresión de la enzima es mucho más fácil. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos extraída de los dominios de una enzima puede mutarse. En la descripción, la etapa preferible de modificar un gen de aconitasa en un cromosoma de una bacteria puede ser la sustitución de uno o más nucleótidos en la secuencia de nucleótidos del gen de aconitasa. Para la invención, la sustitución es en el codón de inicio del gen de aconitasa y es una sustitución de GTG. Puede realizarse en Escherichia coli. Además, en la descripción, la etapa preferible de modificar un gen de aconitasa en un cromosoma de una bacteria puede ser la deleción de uno o más nucleótidos en la secuencia de nucleótidos del gen de aconitasa. Para la invención, la deleción es una deleción de 90 nucleótidos antes del codón de fin en la secuencia de nucleótidos del gen de aconitasa. Puede realizarse en Escherichia coli.

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Tal como se emplea en la presente, un elemento regulador significa un polinucleótido localizado cadena arriba o cadena abajo de un gen (por ejemplo, un gen de aconitasa) que regula la transcripción y/o la expresión del gen para producir un efecto en la cantidad de expresión del gen. Puede incluir secuencias codificadoras y no codificadoras. Un elemento regulador puede ser un promotor, un potenciador, un represor u otro polinucleótido relacionado con el control de la transcripción y/o de la expresión. Un elemento regulador preferido puede ser un promotor. En la invención, la secuencia de nucleótidos del promotor se muestra en SEQ ID NO:4 o 6. Un elemento regulador preferido también puede ser un represor, por ejemplo, un represor de la transcripción. En la invención, la secuencia de nucleótidos del represor de la transcripción se muestra en SEQ ID NO:7. Mediante la modificación de un promotor y/o un represor, se reduce, pero no se elimina, una actividad enzimática y/o una cantidad de expresión de una aconitasa en una bacteria modificada.

En la descripción, la etapa preferible de modificar un elemento regulador de un gen de aconitasa en un cromosoma de una bacteria es una adición, una deleción o una sustitución de uno o más nucleótidos en la secuencia de nucleótidos del elemento regulador del gen de aconitasa, con la condición de que la actividad enzimática y/o la cantidad de expresión de la aconitasa procedente de la bacteria modifica se reduzca, pero no se elimine.

Según la experiencia de los inventores, aunque habitualmente es difícil aumentar la actividad de transcripción de un promotor o potenciador de una bacteria porque la bacteria ha ido evolucionando a lo largo de mucho tiempo y los sitios de modificación para el aumento deben investigarse cada uno en concreto, la investigación para la disminución de la actividad de transcripción del promotor o potenciador es mucho más fácil. Por ejemplo, pueden añadirse una o varias secuencias de nucleótidos para aumentar la distancia entre un promotor y el codón de inicio de un gen, o el promotor original puede sustituirse por un promotor con una actividad de transcripción débil. En la descripción, la etapa preferible de modificar un elemento regulador de un gen de aconitasa en un cromosoma de una bacteria puede ser la sustitución de uno o más nucleótidos en un promotor del gen de aconitasa. Para la invención, la sustitución por un promotor con una actividad de transcripción débil es una sustitución con la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:3 o 5.

Además, en la descripción, la etapa preferible de modificar un elemento regulador de un gen de aconitasa en un cromosoma de una bacteria puede ser la adición de la secuencia de nucleótidos de un represor de la transcripción para el gen de aconitasa, por ejemplo, la adición de la secuencia de nucleótidos de un nuevo represor de la transcripción o el aumento del número de copias de la secuencia de nucleótidos de un represor de la transcripción original. Un represor de la transcripción puede añadirse detrás de un promotor (en especial un promotor con una fuerte actividad de transcripción) para aumentar su cantidad de expresión e inhibir la transcripción de un gen de aconitasa con mayor eficacia. En la invención, se añade la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:8 y 7 en tándem.

Además, la descripción también proporciona productos intermedios, tales como un polinucleótido y/o vector empleado en los métodos mencionados anteriormente. Por ejemplo, en un séptimo aspecto, la descripción proporciona un polinucleótido, cuya secuencia de nucleótidos se selecciona de:

(a) la secuencia de nucleótidos obtenida mediante una sustitución (preferiblemente de GTG) en el codón de inicio de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:1;

(b) la secuencia de nucleótidos obtenida mediante una deleción (preferiblemente de 1-120 nucleótidos, más preferiblemente de 1-90 nucleótidos, lo más preferiblemente de 90 nucleótidos) en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:1 o 2, por ejemplo, una deleción de 90 nucleótidos antes del codón de fin en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:1 o 2; y

(c) la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:8 y 7 en tándem.

En un octavo aspecto, la descripción proporciona un vector que comprende el polinucleótido del séptimo aspecto de la descripción.

En un noveno aspecto, la descripción proporciona un uso del polinucleótido del séptimo aspecto de la descripción y/o el vector del octavo aspecto de la descripción en el método o el uso del primer, segundo, tercer y/o cuarto aspecto de la descripción. Es decir, en los métodos o usos del primer, segundo, tercer y/o cuarto aspecto de la descripción, se emplea el polinucleótido del séptimo aspecto de la descripción y/o el vector del octavo aspecto de la descripción.

En un décimo aspecto, la descripción proporciona un uso del polinucleótido del séptimo aspecto de la descripción y/o el vector del octavo aspecto de la descripción en la preparación de la bacteria del quinto aspecto de la descripción. Es decir, en el proceso de preparación de la bacteria del quinto aspecto de la descripción, se emplea el polinucleótido del séptimo aspecto de la descripción y/o el vector del octavo aspecto de la descripción.

Los efectos beneficiosos de la descripción incluyen las nuevas técnicas que se han inventado y probado para aumentar el rendimiento de fermentación de la L-lisina cuando se emplean bacterias productoras de L-lisina con alto y bajo rendimiento, y no se interfiere en los sitios de modificación en los cromosomas de una gran cantidad de bacterias productoras de L-lisina con alto rendimiento modificadas según la técnica anterior, para aumentar aún más

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el rendimiento, ser útiles para producir de modo práctico L-lisina mediante la fermentación de las bacterias, y ser fáciles de popularizar.

Para entender mejor la invención, esta se describirá a continuación con mayor detalle haciendo referencia a ejemplos específicos. Debe advertirse que los ejemplos solo ejemplifican la invención. Según la descripción de la invención, diversas modificaciones y alteraciones de la invención son obvias para los expertos en la técnica.

Ejemplos

Las realizaciones de la invención se ejemplifican mediante los siguientes ejemplos. A menos que se indique lo contrario, las técnicas empleadas en los ejemplos son muy conocidas por los expertos en la técnica y emplean dispositivos y reactivos disponibles en el mercado (véase Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edición), Science Press, Microbiology Experiments (4a edición), Higher Education Press, y las instrucciones de los fabricantes de los dispositivos y reactivos).

Ejemplo 1: Sustitución del codón de inicio ATG de la aconitasa por GTG

El cromosoma genómico de la cepa de tipo salvaje de Escherichia coli, E. coli K12 W3110 (disponible en el mercado en Biological Resource Center, National Institute of Technology and Evaluation (NITE Biological Resource Center, NBRC)), se extrajo como molde para la amplificación por PCR empleando los cebadores P1/P2 y P3/P4, respectivamente. Se obtuvieron dos fragmentos de ADN de 510 pb y 620 pb y se denominaron los fragmentos Up1 y Downl, respectivamente. El proceso de la amplificación por PCR se muestra como sigue: desnaturalización durante 30 s (segundos) a 94 °C, reasociación durante 30 s (segundos) a 52 °C, extensión durante 30 s (segundos) a 72 °C, y realización de 30 ciclos. Las secuencias de los cebadores se muestran como sigue:

P1: 5'-CGCGGATCCGGAGTCGTCACCATTATGCC-3'

P2: 5'-TCTCGTAGGGTTGACGACACAGCTCCTCCTTAATGACAGG-3'

P3: 5'-CCTGTCATTAAGGAGGAGCTGTGTCGTCAACCCTACGAGA-3'

P4: 5'-ATTGCGGCCGCTCCATTCACCGTCCTGCAAT-3'

Los dos fragmentos de ADN se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa para la amplificación por PCR de solapamiento empleando los cebadores P1/P4. aproximadamente 1200 pb y se denominó el fragmento Up-Down1. El proceso de muestra como sigue: desnaturalización durante 30 s (segundos) a 94 °C, reasociación °C, extensión durante 60 s (segundos) a 72 °C, y realización de 30 ciclos.

El fragmento Up-Down1 purificado mediante electroforesis en gel de agarosa y el plásmido pKOV (disponible en el mercado en Addgene) se digirieron respectivamente con Bam HI/Not I. Los productos de la digestión se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se acoplaron para producir un vector pKOV-Up-Down1 para la posterior transformación. Se determinó que el vector pKOV-Up-Down1, mediante la secuenciación del vector en una empresa de secuenciación, poseía la mutación puntual correcta (A-G) en el fragmento génico de acnA, y se conservó para su uso posterior.

El plásmido construido pKOV-Up-Down1 se transformó mediante electroporación en la cepa productora de L-lisina con bajo rendimiento E. coli NRRL B-12185 (disponible en el mercado en Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL); véase también el documento US4346170A para su método de construcción), y la cepa productora de L-lisina con alto rendimiento E. coli K12 W3110 A3 (disponible en el mercado en Microbiology, Chinese Academy of Sciences; la cepa es una cepa modificada productora de L-lisina mutagenizada y mutada a partir de E. coli K12 W3110), respectivamente. Se determinó mediante secuenciación que las dos cepas contenían en sus cromosomas el gen de tipo salvaje de acnA (concretamente, los sitios 1333855 a 1336530 del n.° de registro de GenBank U00096.2) y sus elementos cadena arriba y cadena abajo. Según las instrucciones del fabricante del plásmido pKOV de Addgene, los clones positivos a la recombinación homóloga se seleccionaron después de un cultivo de recuperación en medio LB bajo las condiciones de 30 °C y 100 rpm durante 2 h, y se determinó mediante secuenciación que contenían en sus cromosomas la mutación del codón de inicio ATG a GTG en el gen de tipo salvaje de acnA. Por último, se obtuvieron ambas cepas productoras de lisina E. coli con bajo y alto rendimiento que portan la mutación del codón de inicio de acnA y se denominaron YP-13633 e YP-13664, respectivamente. La cantidad de expresión de las aconitasas en las dos cepas modificadas se midió y resultó reducida en aproximadamente 75-85% (valores diferentes en medios diferentes).

Ejemplo 2: Mutación de la secuencia del gen de aconitasa para la disminución de la actividad de la aconitasa

(1) Construcción de las cepas de E. coli

Se delecionaron 90 nucleótidos antes del codón de terminación en el gen acnA de E. coli para disminuir la actividad aconitasa. De modo específico, el cromosoma genómico de la cepa de tipo salvaje de Escherichia coli, E. coli K12

y se mezclaron como moldes Se obtuvo un fragmento de la amplificación por PCR se durante 30 s (segundos) a 52

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W3110, se extrajo como molde para la amplificación por PCR empleando los cebadores P5/P6 y P7/P8, respectivamente. Se obtuvieron dos fragmentos de ADN de 752 pb y 657 pb y se denominaron los fragmentos Up2 y Down2, respectivamente. El proceso de la amplificación por PCR se muestra como sigue: desnaturalización durante 30 s (segundos) a 94 °C, reasociación durante 30 s (segundos) a 52 °C, extensión durante 30 s (segundos) a 72 °C, y realización de 30 ciclos. Las secuencias de los cebadores se muestran como sigue:

P5: 5'-CGCGGATCCCGTCACACGATCCGATACCT-3'

P6: 5'-CGGCAAGCAAATAGTTGTTATACGACTTCCTGGCTACCAT -3'

P7: 5'-ATGGTAGCCAGGAAGTCGTATAACAACTATTTGCTTGCCG-3'

P8: 5'-ATTGCGGCCGC CATGGGGCGATTTCCTGATG-3'

Los dos fragmentos de ADN se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa para la amplificación por PCR de solapamiento empleando los cebadores P5/P8. aproximadamente 1400 pb y se denominó el fragmento Up-Down2. El proceso de muestra como sigue: desnaturalización durante 30 s (segundos) a 94 °C, reasociación °C, extensión durante 60 s (segundos) a 72 °C, y realización de 30 ciclos.

El fragmento Up-Down2 purificado mediante electroforesis en gel de agarosa y el plásmido pKOV (disponible en el mercado en Addgene) se digirieron respectivamente con Bam Hl/Not I. Los productos de la digestión se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se acoplaron para producir un vector pKOV-Up-Down2 para la posterior transformación. Se determinó que el vector pKOV-Up-Down2, mediante la secuenciación del vector en una empresa de secuenciación, poseía la deleción de 90 pb antes del codón de fin en el fragmento génico de acnA, y se conservó para su uso posterior.

Según las instrucciones del fabricante del plásmido pKOV de Addgene, el plásmido construido pKOV-Up-Down2 se transformó mediante electroporación en la cepa productora de L-lisina con bajo rendimiento E. coli NRRL B-12185 (véase también el documento US4346170A para su método de construcción), y la cepa productora de L-lisina con alto rendimiento E. coli K12 W3110 A3, respectivamente. Se determinó mediante secuenciación que las dos cepas contenían en sus cromosomas el gen de tipo salvaje de acnA y sus elementos cadena arriba y cadena abajo. Se seleccionaron los clones positivos a la secuenciación homóloga y se determinó, mediante secuenciación, que poseían la deleción de 90 pb antes del codón de fin en el gen de acnA en sus cromosomas. Por último, se obtuvieron ambas cepas productoras de lisina E. coli con bajo y alto rendimiento, en las que las actividades enzimáticas de acnA están reducidas, y se denominaron YP-13675 e YP-13699, respectivamente. Las actividades de aconitasa en las dos cepas modificadas se midieron y resultaron reducidas en aproximadamente 60-80% (valores diferentes en medios diferentes).

(2) Construcción de cepas de Corynebacterium

Se delecionaron 90 nucleótidos antes del codón de terminación en el gen acn de Corynebacterium para disminuir la actividad aconitasa. El proceso de construcción fue sustancialmente el mismo que el de la etapa (1) mencionada anteriormente, excepto que se empleó el genoma de Corynebacterium pekinense AS1.299 (que es similar a Corynebacterium glutamicum y a veces se considera, de forma errónea, que es Corynebacterium glutamicum; disponible en el mercado en China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC)) como molde para una amplificación empleando los cebadores P9-P12 como sigue (que se corresponden con los cebadores P4-P8 mencionados anteriormente, respectivamente), y se obtuvo un fragmento de 542 pb (Up2), un fragmento de 527 pb (Down2), y un fragmento de aproximadamente 1069 pb (Up-Down). Las secuencias de los cebadores se muestran como sigue:

P9: 5'-CGGGATCCTGCAGCTCAGTACTTGGAT-3'

P10: 5'-AAAGTCTTCTAATTAC TTACTGCGTCGAACTCGACG-3'

P11: 5'-GTTCGACGCAGTAAGTAATTAGAAGACTTTTGAT-3'

P12: 5'-TCCCCCGGGGAATACCGGGTCGGTGCG-3'

Después el fragmento Up-Down2 purificado mediante electroforesis en gel de agarosa y el plásmido pK18mobsacB (disponible en el mercado en American Type Culture Collection (ATCC)) se digirieron respectivamente con Bam Hl/Sma I. Los productos de la digestión se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se acoplaron para producir un vector recombinante pK18mobsacB-Up-P-Down que tiene una deleción de 90 pb antes del codón de fin en el gen acn. El plásmido construido pK18mobsacB-Up-Down2 se verificó mediante secuenciación y se transformó, respectivamente, mediante electroporación en la cepa productora de L-lisina con bajo rendimiento Corynebacterium pekinense AS1.299, la cepa productora de L-lisina con bajo rendimiento Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (disponible en el mercado en ATCC), y la cepa productora de L-lisina con alto rendimiento Corynebacterium pekinense AS1.563 (disponible en el mercado en China General Microbiological

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Culture Collection Center). Se determinó mediante secuenciación que las dos últimas cepas contienen en sus cromosomas el gen acn de Corynebacterium pekinense AS1.299, cuya secuencia de nucleótidos se muestra en SEQ ID NO:2. Se seleccionaron los clones positivos a la recombinación homóloga después de un cultivo de recuperación en medio BHIS bajo las condiciones de 30 °C y 120 rpm durante 2 h, y se verificaron mediante secuenciación. Por último, se obtuvieron tres cepas productoras de L-lisina de Corynebacterium con rendimiento bajo, bajo y alto, respectivamente, que portan la mutación del gen acn y se denominaron YP-14808, YP-14852 e YP- 14837.

Ejemplo 3: Sustitución del promotor del gen de aconitasa por un promotor con una actividad de transcripción débil

(1) Construcción de las cepas de E. coli

Mediante el análisis de la secuencia cadena arriba de acnA en E. coli K12 W3110, los inventores proporcionan un promotor con actividad de transcripción débil (cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO:3) para reemplazar la región del promotor de tipo salvaje (cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO:4) cadena arriba del ORF del gen acnA para disminuir la expresión del gen acnA de tipo salvaje.

De modo específico, el cromosoma genómico de la cepa de tipo salvaje de Escherichia coli, E. coli K12 W3110, se extrajo como molde para la amplificación por PCR empleando los cebadores P13/P14 y P15/P16, respectivamente. Se obtuvieron dos fragmentos de ADN de 580 pb y 618 pb y se denominaron los fragmentos Up3 y Down3, respectivamente. Se empleó un plásmido que comprende el promotor con actividad de transcripción débil mencionado anteriormente como molde para la amplificación por PCR empleando P17/P18, y se obtuvo un fragmento de promotor de 161 pb con actividad de transcripción débil y se denominó fragmento P. El proceso de la amplificación por PCR se muestra como sigue: desnaturalización durante 30 s (segundos) a 94 °C, reasociación durante 30 s (segundos) a 52 °C, extensión durante 30 s (segundos) a 72 °C, y realización de 30 ciclos.

Los tres fragmentos de ADN mencionados anteriormente se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Después, los fragmentos Up3 y P se mezclaron como moldes para la amplificación por PCR de solapamiento empleando los cebadores P13/P18. Se obtuvo un fragmento de aproximadamente 716 pb y se denominó el fragmento Up-P. El proceso de la amplificación por PCR se muestra como sigue: desnaturalización durante 30 s (segundos) a 94 °C, reasociación durante 30 s (segundos) a 52 °C, extensión durante 60 s (segundos) a 72 °C, y realización de 30 ciclos.

Los fragmentos Up-P y Down3 purificados mediante electroforesis en gel de agarosa se mezclaron como moldes para la amplificación por PCR de solapamiento empleando los cebadores P13/P16. Se obtuvo un fragmento de aproximadamente 1334 pb y se denominó el fragmento Up-P-down. El proceso de la amplificación por PCR se muestra como sigue: desnaturalización durante 30 s (segundos) a 94 °C, reasociación durante 30 s (segundos) a 52 °C, extensión durante 60 s (segundos) a 72 °C, y realización de 30 ciclos.

Las secuencias de los cebadores mencionados anteriormente se muestran como sigue:

P13: 5'-CGCGGATCCGAAGAAATTGAGGTCATGTT -3'

P14: 5'- GGTTTCTTAGACGTCGGATTCGTTTCGTTTCTGTTTCATT-3'

P15: 5'- ATCAGCAGGACGCACTGACCCATTAAGGAGGAGCTATGTCG -3'

P16: 5'- ATTGCGGCCGCTCCATTCACCGTCCTGCAATT -3'

P17: 5'-AATGAAACAGAAACGAAACGCAATCCGACGTCTAAGAAACC -3'

P18: 5'- CGACATAGCTCCTCCTTAATGGGTCAGTGCGTCCTGCTGAT -3'

El fragmento Up-P-down purificado mediante electroforesis en gel de agarosa y el plásmido pKOV (disponible en el mercado en Addgene) se digirieron respectivamente con Bam HI/Not I. Los productos de la digestión se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se acoplaron para producir un vector pKOV-Up-P-Down para la posterior transformación. Se determinó que el vector pKOV-Up-P-Down, mediante la secuenciación del vector en una empresa de secuenciación, poseía la secuencia correcta del promotor con actividad de transcripción débil y se conservó para su uso posterior.

El plásmido pKOV-Up-P-Down construido se transformó mediante electroporación en la cepa productora de L-lisina con bajo rendimiento E. coli NRRL B-12185, y la cepa productora de L-lisina con alto rendimiento E. coli K12 W3110 A3, respectivamente. Se determinó mediante secuenciación que las dos cepas contenían en sus cromosomas el gen de tipo salvaje de acnA y sus elementos cadena arriba y cadena abajo, en las que el promotor cadena arriba comprende los sitios desde 2102518 a 2102713 del n.° de registro de GenBank CP004009.1. Según las instrucciones del fabricante del plásmido pKOV de Addgene, los clones positivos a la recombinación homóloga se seleccionaron después de un cultivo de recuperación en medio LB bajo las condiciones de 30 °C y 100 rpm durante 2 h, y se determinó mediante secuenciación que contenían en sus cromosomas la sustitución del promotor con

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actividad de transcripción débil por el promotor de tipo salvaje cadena arriba del gen acnA. Por último, se obtuvieron ambas cepas productoras de lisina E. coli con bajo y alto rendimiento que portan la mutación promotor de acnA y se denominaron YP-13627 e YP-13682, respectivamente. La cantidad de expresión de las aconitasas en las dos cepas modificadas se midió y resultó reducida en aproximadamente 65-80% en diferentes medios.

(2) Construcción de cepas de Corynebacterium

Mediante el análisis de la secuencia cadena arriba de acn en Corynebacterium, los inventores proporcionan un promotor con actividad de transcripción débil (cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO:5) para reemplazar la región de 166 pb del promotor de tipo salvaje (cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO:6) cadena arriba del ORF del gen acn de Corynebacterium. El proceso de construcción fue sustancialmente el mismo que el de la etapa (1) mencionada anteriormente, excepto que:

se empleó el genoma de Corynebacterium pekinense AS1.299 (disponible en el mercado en China General Microbiological Culture Collection Center) como molde para una amplificación empleando los cebadores P19-P24 como sigue (que se corresponden con los cebadores P13-P18 mencionados anteriormente, respectivamente), y se obtuvo un fragmento de 573 pb (Up3), un fragmento de 581 pb (Down3), un fragmento de 130 pb (P), y un fragmento de aproximadamente 1284 pb (Up-P-down). Las secuencias de los cebadores se muestran como sigue:

P19: 5'-CGGGATCCGCCAAAGCAACCAACCCC -3'

P20: 5'-CTTTTTAGTTTTCAACGGTCGGATTTGCTCGAAAT-3'

P21: 5'- GCCGAAAC AAAGTAGCCGAAGCAGACGCCGTCG -3'

P22: 5'-CGGAATTCTGACCTGGTGGACGATAC-3'

P23: 5'-CGAGCAAATCCGACCGTTGAAAACTAAAAAGCTGG-3'

P24: 5'-GCGTCTGCTTCGGCTACTTTGTTTCGGCCACCC-3'

Después, el fragmento Up-P-down purificado mediante electroforesis en gel de agarosa y el plásmido pK18mobsacB se digirieron respectivamente con Bam HIlEco RI. Los productos de la digestión se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se acoplaron para producir un vector recombinante pK18mobsacB-Up- P-Down para la posterior sustitución del promotor. El plásmido construido pK18mobsacB-Up-P-Down se verificó mediante secuenciación y se transformó, respectivamente, mediante electroporación en la cepa productora de L- lisina con bajo rendimiento Corynebacterium pekinense AS1.299, la cepa productora de L-lisina con bajo rendimiento Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, y la cepa productora de L-lisina con alto rendimiento Corynebacterium pekinense AS1.563. Se determinó mediante secuenciación que las dos últimas cepas contenían en sus cromosomas el gen acn y sus elementos cadena arriba y cadena abajo de Corynebacterium pekinense AS1.299. Se seleccionaron los clones positivos a la recombinación homóloga después de un cultivo de recuperación en medio BHIS bajo las condiciones de 30 °C y 120 rpm durante 2 h, y se verificaron mediante secuenciación. Por último, se obtuvieron tres cepas productoras de L-lisina de Corynebacterium con rendimiento bajo, bajo y alto, respectivamente, que portan la mutación del promotor de acn y se denominaron YP-14755, YP-14732 e YP-14780.

Ejemplo 4: Aumento del número de copias del gen acnR que codifica el represor de la transcripción del gen de aconitasa

Se aumentó el número de copias del gen acnR que codifica el represor de la transcripción de acn para disminuir el nivel de transcripción del gen acn. De modo específico, se empleó el genoma de Corynebacterium pekinense AS1.299 como molde para la amplificación por PCR empleando los cebadores P25/P26 y P27/P28, respectivamente. Se obtuvieron dos fragmentos de ADN de 715 pb y 797 pb y se denominaron los fragmentos Up4 y Down4. Se empleó el molde o una amplificación por PCR usando los cebadores P29/P30. Se obtuvo un fragmento de 567 pb de acnR y se denominó el fragmento R, cuya secuencia de nucleótidos se muestra en in SEQ ID NO:7. Además, se empleó el plásmido de expresión pXMJ19 (disponible en el mercado en Biovector Science Lab, Inc) como molde para la amplificación por PCR empleando los cebadores P31/P32. Se obtuvo un promotor de 164 pb Ptac con fuerte actividad de transcripción y se denominó el fragmento Ptac, cuya secuencia de nucleótidos se muestra en in SEQ ID NO:8. El proceso de la amplificación por PCR se muestra como sigue: desnaturalización durante 30 s (segundos) a 94 °C, reasociación durante 30 s (segundos) a 52 °C, extensión durante 30 s (segundos) a 72 °C, y realización de 30 ciclos.

P25: 5'-CGGGATCCTTCGCAACCGATAGAGCA-3'

P26: 5'-CACGAATTATGCAGAATAAGCCTTTAAGTAACAA-3'

P27: 5'-TAAACGCGACTAAGCGTGACCATTAAAAGGCT-3'

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P28: 5'-CGGAATTCAAAAGCCTATTAAGTGTC-3'

P29: 5'-TTCACACAGGAAAGTGTCCGTAGCGGCAGGCGA-3'

P30: 5'-TTTAATGGTCACGC TTAGTCGCGTTTACGGACAG-3'

P31: 5'-TTAAAGGCTTATTCTGCATAATTCGTGTCGCTC-3'

P32: 5'-GCCGCTACGGACACTTTCCTGTGTGAAATTGTTA-3'

Los fragmentos R y Ptac se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se mezclaron como moldes para la amplificación por PCR de solapamiento empleando los cebadores P31/P30. Se obtuvo un fragmento de aproximadamente 731 pb y se denominó el fragmento Ptac-R. Los fragmentos Up4 y Pfac-R se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se mezclaron como moldes para la amplificación por PCR de solapamiento empleando los cebadores P25/P30. Se obtuvo un fragmento de aproximadamente 1446 pb y se denominó el fragmento Up4-Ptac-R. Los fragmentos Up4-Ptac-R y Down4 se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se mezclaron como moldes para la amplificación por PCR de solapamiento empleando los cebadores P25/P28. Se obtuvo un fragmento de aproximadamente 2243 pb y se denominó el fragmento Up-Ptac-R-Down. El proceso de la amplificación por PCR se muestra como sigue: desnaturalización durante 30 s (segundos) a 94 °C, reasociación durante 30 s (segundos) a 52 °C, extensión durante 60 s (segundos) a 72 °C, y realización de 30 ciclos.

Después, el fragmento Up-Pfac-R-Down purificado mediante electroforesis en gel de agarosa y el plásmido pK18mobsacB se digirieron respectivamente con Bam HI/Eco RI. Los productos de la digestión se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se acoplaron para producir un vector recombinante pK18mobsacB-Up- Pfac-R-Down para la posterior inserción de copias adicionales de acnR en una región no codificadora de un cromosoma. Se determinó que el vector pK18mobsacB-Up-Pfac-R-Down, mediante la secuenciación del vector en una empresa de secuenciación, poseía los fragmentos génicos Pfac-acnR y se conservó para su uso posterior.

El plásmido construido pK18mobsacB-Up-P tac -R-Down se transformó, respectivamente, mediante electroporación en la cepa productora de L-lisina con bajo rendimiento Corynebacferium pekinense AS1.299, la cepa productora de L-lisina con bajo rendimiento Corynebacferium glufamicum ATCC 13032, y la cepa productora de L-lisina con alto rendimiento Corynebacferium pekinense AS1.563. Se seleccionaron los clones positivos a la recombinación homóloga después de un cultivo de recuperación en medio BHIS bajo las condiciones de 30 °C y 100 rpm durante 2 h, y se verificaron mediante secuenciación. Por último, se obtuvieron tres cepas productoras de L-lisina de Corynebacferium con rendimiento bajo, bajo y alto, respectivamente, en cuyas regiones no codificadoras de los cromosomas se insertaron copias adicionales del gen acnR y se denominaron YP-14857, YP-14896 e YP-14860.

Ejemplo 5: Experimentos de fermentación de L-lisina

Para la fermentación de E. coli, se inocularon 25 ml del medio de siembra mostrado en la tabla 1 en cada una de las cepas de E. coli K12 W3110 A3, E. coli NRRL B-12185 y E. coli construidas mediante los ejemplos 1-3, respectivamente, y se cultivaron bajo las condiciones de 37 °C y 220 rpm durante 9 h. Después se inocularon 25 ml del medio de fermentación mostrado en la tabla 1 con 1 ml del producto del cultivo del medio de siembra, y se cultivó bajo las condiciones de 37 °C y 220 rpm durante 48 h. Se midió el rendimiento de la L-lisina mediante HPLC después del proceso del cultivo.

Tabla 1 - Medio de cultivo para E. coli

: Medio de siembra Medio de fermentación

(Ingrediente): (g/l) (g/l)

glucosa: 15 40

sulfato de amonio: 4 10

dibifosfato de potasio: 3 1,6

sulfato de magnesio heptahidrato: 0,4 1

sulfato ferroso heptahidrato: 0,01 0,03

sulfato de manganeso monohidrato: 0,01 0,03

extracto de levadura: 2,0 4,0

carbonato de calcio: 25

KOH: pH 7,0 pH 7,0

L-tirosina: 0,1

L-metionina: 0,5

L-treonina: 0,1

L-isoleucina: 0,05

Para la fermentación de Corynebacterium, se inocularon 30 ml del medio de fermentación mostrado en la tabla 2 a cada una de las cepas de Corynebacterium AS1.299, ATCC13032, AS1.563 y las cepas de

Corynebacterium construidas en los ejemplos 2-4, respectivamente, y se cultivaron bajo las condiciones de 30 °C y 5 220 rpm durante 8 h. Después se inocularon 30 ml del medio de fermentación mostrado en la tabla 2 con 1 ml del

producto del cultivo del medio de siembra, y se cultivó bajo las condiciones de 30 °C y 220 rpm durante 48 h. Se midió el rendimiento de la L-lisina mediante HPLC después del proceso del cultivo.

Tabla 2 - Medio de cultivo para Corynebacterium

: Medio de siembra Medio de fermentación

(Ingrediente): (g/l) (g/l)

glucosa: 20 40

sulfato de amonio: 5 20

dibifosfato de potasio: 1 1,6

sulfato de magnesio heptahidrato: 0,7 0,8

sulfato ferroso heptahidrato: 0,01 0,01

sulfato de manganeso monohidrato: 0,01 0,01

extracto de levadura: 5,0 4,0

carbonato de calcio: 20

KOH: pH 7,0 pH 7,0

10 Los resultados se muestran en la tabla 3. La mutación (por ejemplo, deleción o sustitución) de la estructura de la aconitasa de las cepas de Escherichia coli y Corynebacterium para disminuir la actividad de la enzima, o la modificación (por ejemplo, sustitución e inserción) de los elementos reguladores de los genes de aconitasa de las cepas de Escherichia coli y Corynebacterium para disminuir la cantidad de expresión de la enzima, conduce al aumento del rendimiento de la L-lisina.

15 Tabla 3 - Rendimiento de L-lisina según las cepas

Cepa: Rendimiento de L-lisina (g/l) Proporción de aumento de rendimiento (%)

E. coli NRRL B-12185: 1,5 -

YP-13633: 2,1 40

YP-13675: 1,8 20

YP-13627: 2,0 33

E. coli K12 W3110 A3: 10,2 -

YP-13664: 16,1 57,8

YP-13699: 12,5 22,5

YP-13682: 14,1 38,2

Corynebacteríum AS1.299: 1,2 -

YP-14808: 1,6 33

YP-14755: 1,9 58

YP-14857: 1,4 17

Corynebacteríum ATCC 13032: 1,1 -

YP-14852: 1,5 36

YP-14732: 2,0 82

YP-14896: 1,3 18

Corynebacteríum AS1.563: 23,5 -

YP-14837: 27,4 16,6

YP-14780: 31,2 32,8

YP-14860: 25,6 8,9

Listado de secuencias

<110> Ningxia EPPEN Biotech Co., Ltd

<120> Método para producir L-lisina modificando el gen de aconitasa y/o elementos reguladores del mismo

5 <130> P064607EP

<140> EP14748825.8 <141> 2014-09-26

<150> CN 201310050196.0 <151> 2013-02-08

10 <150> CN 201310050144.3

<151> 2013-02-08

<160> 8

<170> SeqWin2010, versión 1.0 <210> 1

15 <211> 2676

<212>ADN <213> Escherichia coli

<400> 1

atgtcgtcaa ccctacgaga agccagtaag cactactaca gcctgccgct tgctgctaaa tcactcaaag ttttgctcga aaacctgctg gaggatatcc acgcgctggc aggatggctg taccgcccgg caagggtgct gatgcaggac gcggcaatgc gcgaagcggt taaacgcctc tcaccggtcg acctggtcat tgaccactcg gcatttgaag aaaacgtacg cctggaaatg aaatggggaa agcaagcgtt cagtcggttt catcaggtta acctcgaata tctcggcaaa tggattgctt atccggatac actcgttggt cttggcgtgc tggggtgggg cgttggtggg ccggtttcca tgcttatccc ggatgtagtg ggtattaccg ccacagacct ggttctcact gtggggaaat tcgtcgaatt ttatggtgat gccaccattg ccaatatgtc gccagaatat gctgtaaccc tcgattacat gcgtttaagc gaaaaatatg ccaaagcgca gggcatgtgg agtacgttag aactggatat gaatgacgtt caggatcgcg ttgcactgcc cgatgtacca gtgaatgcca cgcataaaga tcgccagccg cagttacctg atggcgctgt ggtcattgct ccaagtgtgc tgatggccgc aggcttgctg cggcaaccat gggtcaaagc gtcgctggca gcaaaagcga aactgacacc gtatctcgac tgtaccacct gtattggtaa ctctgggccg aaaagcgatt taaccgtcgg tgcggtgctg catccgctgg ttaaaactaa ctggctggcc gcgggaaata tgaatatcaa cctggcttct ccggtttatc tgaaagatat ctggccatcg gtctccacag aaatgttccg caaagagtac aagggaatta acgtcacacg atccgatacc cgcttatcgc ctttctttga tgaaatgcag ggtgcgcgga tcctcgcaat gctgggggat ggcagtatta agcccgacag cccagcgggt

aaagacttta actcctacgg ttcgcggcgt ttcgccaata ttcgcatccg taatgaaatg catttacctg acagcgacgt agtctctatt caaacgccgc tggcggtgat tgccgggaaa gcggcaaaag gtccgcgtct gcttggtatt attcaccgtt cgaatttaat tggcatgggc acgcgtaaaa cgttagggct aaccggggaa ctacaacccg gcgcgacggt tccggtgacg gtaccctgcc gttgtcgtat cgacaccgcg attttgcatt atgtcattcg taatatgttg

<210>2

5 <211> 2832

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum <400>2

gacacgttgc aggccaaaga taaaacttac 60 tcactgggcg atatcacccg tctacccaag 120 cgctggcagg atggtaactc ggttaccgaa 180 aaaaatgccc atgctgaccg tgaaattgcc 240 tttaccggcg tacctgccgt tgttgatctg 300 ggcggcgata ctgcaaaggt taacccgctc 360 gtgaccgtcg atcgttttgg tgatgatgag 420 gagcgcaacc acgaacgtta tgtgttcctg 480 agcgtcgtgc cgccaggcac aggcatttgc 540 gcagtgtgga gtgaattgca ggacggtgaa 600 actgactcgc acaccaccat gatcaacggc 660 atcgaagcag aagccgcaat gttaggccag 720 ggcttcaaac ttaccggaaa attacgtgaa 780 gttacccaaa tgctgcgcaa acatggcgtg 840 ggtctggatt cactaccgtt ggcggatcgc 900 ggtgccacct gtggcttctt cccaatcgat 960 gggcgcagcg aagatcaggt cgagttggtc 1020 cgtaacccgg gcgatgaacc aatttttacc 1080 gaagcgagcc tggcagggcc taaacgccca 1140 aaagcatttg ccgccagtaa cgaactggaa 1200 gtcgattatg ttatgaacgg acatcagtat 1260 gcgataacct cgtgcaccaa cacctctaac 1320 gcgaaaaaag ccgtaactct gggcctcaag 1380 ccgggttcga aagtcgtttc tgattatctg 1440 gaactggggt ttaaccttgt gggatacggt 1500 ctgcccgatc ctatcgaaac ggcaatcaaa 1560 tccggcaacc gtaactttga aggccgtatc 1620 tcgccgccgc tggtggttgc ctatgcgctg 1680 gagcctatcg gccatgatcg caaaggcgat 1740 gcacaagaaa ttgcccgtgc ggtagaacaa 1800 gcagaagttt ttgaaggcac agcagagtgg 1860 tacggttggc aggaggactc aacctatatt 1920 gcaacaccag caccagtgga agatattcac 1980 tcagtcacca ctgaccatat ctctccggcg 2040 cgatatctac aaggtcgggg tgttgagcga 2100

ggtaaccatg aagtgatgat gcgcggcacc 2160 gtgcctggcg ttgaaggggg gatgacgcgg 2220 tatgatgctg cgatgcgcta taagcaggag 2280 gagtatggat caggctccag tcgtgactgg 2340 cgtgtggtga ttgccgaatc gtttgaacga 2400 atcctgccgc tggaatttcc gcaaggcgta 2460 gagaagattg atattggcga tctgcaaaac 2520 cttacgcgcg cggatggtag ccaggaagtc 2580 acggagttga cctactacca gaacgacggc 2640 aagtaa 2676

ttggagctca ggcgacaagt tactccctca aacgagcaca cagttcaccc ctcgcaacca ctgaacccag gatgcactgg ctgcgttggg gtccaccagg tacccagata ctgggctggg atgctgatcc gcaactgacg ttcgttgagt ggcaacatgt accaagtacc gccaaggcgc ctcgagctgg cgcatccttc gacgctgttt cagcctgaag tccttggcta ggtggcgagt aacacctcta aagggcctca gacggctact tccggcttcg gctgcgatca gagggacgta gcttacgcaa caggacggca accatccagc ggtgacaagc aactccacct gtcaccgaca cacatctccc cacggtgtgg atgatgcgcg ggctacaece gtcaactaca ggttcttccc accgagtcct cagttccctg atcaccggac accaaggaga

ctgtgactga

cctatgacta

aggttctcgg

ttgaggctat

cagcccgtgt

tgcgtgaggc

ccgagatggt

etaagaaegt

gttccgagtc

tcaacattga

cctgcatcgg

gcgttggtgg

ctcgcgttgt

ttgtgctgac

tctacggctc

ccccagagtt

tgcgcctcac

agggcatgtg

acctgtccac

tctccgaggc

ccgtagacac

gcggcgtcga

ctggcgcaga

acaccatcga

acccatccgt

agtccaagcc

accagcgcgc

gctgcaccac

aegageaega

tctcccctga

tcgctggcac

acgacgtctt

aggcaatctc

agtggcagga

acatccgcaa

tccagggcgc

ctgcttcctc

aacgccacga

gcaccttcgc

gcgacttcac

aggctgctgg

gtgactgggc

tcgagcgtat

caggcgaatc

tgaccgcact

acggcgacgt

aagcaagaac

cttcgccctc

agagaacctt

cgccaactgg

tctcatgcag

agttgctgca

cattgaccac

tgagatcgag

cttctccaac

gtacttggct

taccgactcc

cattgaggct

tggcttcaag

catcaccgaa

cggtgttaag

cggctccacc

cggccgccca

gctcgacgag

cgttgttcct

aaaggagcag

ctccatccct

agctgacaac

aggacgtcct

ccacggcatg

gatgatcggc

ttgggttaag

agacctctgg

ctgtattggt

cctgaccgca

cgttaagatg

catggacttc

cctgaaggac

ccgtgagctt

actcgatgtt

ggcaccttac

acgcgttctg

cattaagcca

ctacaactcc

caacatccgc

ccaggagggt

cattccgctg

agctaagggc

tcaccgctcc

ccacgagtcc

caacgagggc

cgtcgagttc

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tctgcagtgc

cttcgtaccg

gatgeatett

gacttcaccg

ctcggtggcg

tccgtcatcg

tacgagcgca

ttccgcgttg

cgcgtcgtct

cacaccacca

gaagcagcaa

ttgaccggcg

atgctgcgcg

gctgttccac

tgtgcgatgt

gaagagcagg

gacaccgttg

tccatcgctg

ttccgtaagg

gcaacccgca

tacaacgctt

tccaagccag

gttgcaattg

gctggcctga

accatctgtg

aaggaccttg

aactccggcc

accgcagttt

aactacctgg

gaettegaga

atctggcctt

tacgaagctg

cctaccggtg

ttcgacggca

gctaagctcg

ggtacccctg

ctgggttcca

ctccagaacc

gctccacagg

gtcgtcttgg

actaacctgc

aacctcatcg

ctgggccttg

gagactccta

gacgcagttg

ctaagagcac

ctggcatgga

aagacggcgc

ccgatccaag

gtgtcccttg

accctaacga

tggaggcttt

acgaggagcg

ttcctccagg

tcgacaacga

tggaaaacgg

tgctcggcca

agatcccagt

accacggcgt

tggctaaccg

tcccaatcga

ttgcactggt

aagctgagta

gccctaagcg

atctgccaac

tggttaacga

cctgggctgg

tcaccgttgc

catccatcac

tcgcacgtaa

caccaggttc

aggccatggg

cactgccaga

tgtccggtaa

catccccaat

acgaagctct

ccaccgagga

actacgcaga

acaccttcga

tgcctgtcga

gcgactctgt

cagctcagta

ggcgtggtaa

agctggttga

cgttcatcta

gcggcaagga

tcggaattcg

gtatgggcgt

acggcaccga

agactgtcaa

tccgcatcga

ccttgaagtt

gaagctgccg

aaacatcacc

catcgaaatc

tgtagttgac

cgtcaaccca

cggccgccca

ttaccagttc

aaccggtatc

gggccttgca

cctgggcatc

gccagtgtcc

aggcgttacc

cgtccagaag

tgcaaccatc

cgaggagacc

cgaggcttac

ctccgagtac

cccacaggac

ctacaccgac

aggtggcgga

ctccggcgag

atccccacag

ctcttgcacc

ggcagcagaa

ccaggttgtc

cttctacctc

ggaaatctcc

ccgtaacttc

catggtcatt

tggacaggac

aatcgaagac

tgtcttcaag

gtgggacgag

gccagtggca

caccaccgac

cttggatgag

ccacgaggtc

catcgcaggt

cgacgcttcc

gtacggcacc

cgcagttatc

tgtcccactg

gaccttcgac

ggtcaccgca

caccccaggt

60

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400

2460

2520

2580

2640

2700

2760

gaggctgact actaccgcca cggcggcatc ctgcagtacg tgctgcgtca gatggctgct 2820 tettetaagt aa 2832

<210>3 5 <211> 161

<212> ADN <213> Escherichia coli

<400 3

caatccgacg tctaagaaac acgaggccct ttcgtcttca agtgatagag atactgagca

cattattatc atgacattaa cctcgagtcc ctatcagtga catcagcagg acgcactgac

cctataaaaa taggcgtatc tagagatgga catccctatc c

60

120

161

10 <210> 4

<211> 454 <212> ADN <213> Escherichia coli

<400> 4

5

10

15

20

25

ggaatgttcc gtcgttattc cagacgactg agaactgttt gctgaagatg atcagccgaa ttttaatgaa ttaaagggct tttaatacac acaaaataat aaccgttaag ggtgtagcct tggatgggcg cgttttctct gtcgatgctc cactgatcct tgaccccgct gcggcggggt cttttatcaa tttgggttgt tatcaaatcg caccctgaag agaatcaggg cttcgcaacc

<210>5 <211> 130 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum <400>5

ccgttgaaaa ctaaaaagct gggaaggtga aacagcttgg tctatagtgg ctaggtaccc aaacaaagta

<210>6 <211> 166 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum <400>6

acgcgccaag aaccccaact ttcccgccag tagggtcctt ttccacagtt ctgtggaatg gccgaagcag acgccgtcgc gaaatctcac

<210>7 <211> 567 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum <400>7

gtgtccgtag cggcaggcga caaaccaaca cgacggtgct tcgctgagca cggctatgaa acaggtaaat cacgcggagc gatctttcat gccctcgcgc gggaagatgc agcccgcatg gaagtgatgc gaggaatgct ggaagatcct gagatctcca agcagctgcg caccgacccg agtgttctag acgaagctgt ccgcgtgcgt cgcactgacg tcccgatcga agtgctgcac atctcccgtc ttgctaccgg cgcatccaca

gcaactaaca tcgcagcagc aagcctttat 60 acaataatta tcatcattct tattacccat 120 cgcagcaata acagcttgag ttatctcaac 180 atgatcaaca caaatatgaa atattggtcc 240 ttctgggccg aactcctctg gatcattact 300 tgtcatttgc tttgccacaa ggtttctcct 360 ttacgcgatg tttgtgttat ctttaatatt 420 ctgt 454

atcgaatttc ggggctttaa agcaaaaatg 60 tttttgtttt ggacacatgt agggtggccg 120

130

aacgcttgta ctgttaggat aatgaagacg 60 agaatccgat gtttttctca cgccggctca 120 cctaaaaaag ttagaa 166

aatagccgtc aagaaatcct cgaaggtgcc 60 ggcgcaaccg tacgccgact ggaagaagca 120 cacttcggtg acaaagaaaa cctgttccta 180 gcggaggtgg tgtctgaaaa tggcctcgtt 240 gaacgatatg actggatgtc agtacgcctg 300 gtattccgcg caaaatggat tgatcaccaa 360 ttgtcccgca acgtggataa gggacaaatg 420 accttcttag agactgttct cgacggtttc 480 gaaggactgt ccgaagtatt ggatctggtc 540

gagggaactg tccgtaaacg cgactaa 567

<210>8 <211> 164 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum <400>8

ctgcataatt cgtgtcgctc aaggcgcact cccgttctgg ataatgtttt ttgcgccgac 60 atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg acaattaatc atcggctcgt 120 ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaa 164

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un método para producir L-lisina mediante fermentación o para aumentar el rendimiento de fermentación de la L- lisina, que comprende las etapas de:

(1) modificar un gen de aconitasa y/o un elemento regulador de este en un cromosoma de una bacteria productora 5 de L-lisina, de modo que la actividad y/o la cantidad de expresión de la aconitasa de la bacteria se reduce, pero no

se elimina; y

(2) producir L-lisina mediante fermentación con la bacteria obtenida mediante la modificación de la etapa (1), en el que la modificación del gen de aconitasa y/o un elemento regulador de este incluye:

(i) una sustitución del codón de inicio de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 del gen de aconitasa en el 10 cromosoma de una Escherichia coli productora de L-lisina por GTG;

(ii) una sustitución de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:4 de un promotor del gen de aconitasa en el

cromosoma de una Escherichia coli productora de L-lisina por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3;

(iii) una sustitución de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:6 de un promotor del gen de aconitasa en el

cromosoma de una Corynebacterium glutamicum o Corynebacterium pekinense productora de L-lisina por la

15 secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:5;

(iv) una deleción de 90 nucleótidos antes del codón de fin en la secuencia de nucleótidos del gen de aconitasa de SEQ ID NO:1 en el cromosoma de una Escherichia coli productora de L-lisina; o

(v) una adición en la secuencia de nucleótidos de un represor de la transcripción (SEQ ID NO:7) del gen de aconitasa, preferiblemente una adición de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:8 y 7 en tándem.

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