JP6533747B2 - ７デヒドロコレステロール及びビタミンｄ３の製造法 - Google Patents

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Description

本発明は、ラビリンチュラ類微生物を用いた７デヒドロコレステロール（以下、７ＤＨＣともいう。）の製造法、及び該製造法により製造された７ＤＨＣに紫外線を照射することを特徴とする、ビタミンＤ３の製造法に関する。
ビタミンＤ３は、カルシウム及びリンの代謝及び恒常性の維持、並びに骨形成などに関与するビタミンであり、人体内ではコレステロールから生成される。しかし、その生成量は必要量に比べて少ないことから、食品、医薬品、又はサプリメントによってビタミンＤ３を摂取する必要がある。
医薬品又はサプリメントに含まれるビタミンＤ３は、主に羊毛から得られるコレステロールから化学変換によって生産された７ＤＨＣに紫外線を照射することによって生産されている。しかしながら、ＢＳＥや人獣共通感染症の問題から、動物由来の原料は医薬品又はサプリメントの原料として敬遠される傾向にあるため、非動物由来のビタミンＤ３が求められていた。非動物由来のビタミンＤ３は、非動物由来の７ＤＨＣに紫外線を照射することにより生産することができる。
微生物が生成するステロールは、一般的にエルゴステロールであるが、一部の卵菌類微生物やラビリンチュラ類微生物においては、コレステロールを生成することが知られている（非特許文献１〜３）。７ＤＨＣは、７ＤＨＣ還元酵素の作用によりコレステロールに変換されることから、理論上は、当該微生物において、７ＤＨＣ還元活性を低下又は喪失させて発酵生産などに用いることにより、非動物由来の７ＤＨＣを生産することができる。
しかしながら、７ＤＨＣは、ヒト、マウス及び出芽酵母においては著量蓄積しないことが報告されている。すなわち、ヒト及びマウスにおいては、７ＤＨＣ還元活性の喪失に伴う７ＤＨＣの生成が、コレステロール合成の律速段階を触媒するHMG-CoA レダクターゼの分解を引き起こすことにより、７ＤＨＣの蓄積量が著しく減少することが報告されている（非特許文献４〜６）。出芽酵母においては、７ＤＨＣ還元酵素の導入に伴う７ＤＨＣの生成により、７ＤＨＣの蓄積量が著しく減少することが報告されている（非特許文献７）。
また、７ＤＨＣ還元活性の喪失は、ヒトにおいてはスミス-レムリ-オピッツ症候群を引き起こすこと(非特許文献８)、植物においては矮性の表現系を示すこと(非特許文献９)が報告されている。すなわち、７ＤＨＣ還元活性の低下又は喪失は、その宿主生物の生育に悪影響を及ぼすことが考えられた。
Exp. Mycol.(1989) 13:183-195 Lipids (1997) 32:839-845 J. Am. Oil Chem. Soc. (2012) 89:135-14 J Clin. Invest. (2001) 108:905-915 J Lipid Res. (2000) 41:1437-1447 J Lipid Res. (2000) 41: 637-646 Yeast Lipid Conference 要旨集(2007)、インターネット<URL: http://aperto.unito.it/handle/2318/209#.Uq5WatJdW4E> Am. J. Hum. Genet. (1998) 63:55-62 Plant J. (2000) 21:431-443
本発明の課題は、ラビリンチュラ類微生物を用いた効率的な７ＤＨＣの製造法、及び該製造法により製造された７ＤＨＣに紫外線を照射することを特徴とする、ビタミンＤ３の製造法を提供することにある。
本発明は、以下の（１）〜（４）に関する。
（１）親株の染色体ＤＮＡ上に存在する７ＤＨＣ還元活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に、１以上の塩基が欠失、置換または付加されたことにより、親株に比べ７ＤＨＣ還元活性が低下または喪失しており、かつ７ＤＨＣを生産するラビリンチュラ類微生物を培地に培養し、培養物中に７ＤＨＣを生成、蓄積させ、該培養物中から７ＤＨＣを採取することを特徴とする、７ＤＨＣの製造法。
（２）７ＤＨＣ還元活性を有する蛋白質をコードする遺伝子が、以下の［１］〜［６］のいずれかのＤＮＡを有する遺伝子である、上記（１）に記載の製造法。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、７ＤＨＣ還元活性を有する変異蛋白質をコードするＤＮＡ
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有し、かつ、７ＤＨＣ還元活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［５］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、７ＤＨＣ還元活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［６］配列番号１で表される塩基配列と少なくとも９５％以上の同一性を有し、かつ、７ＤＨＣ還元活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
（３）ラビリンチュラ類微生物が、シゾキトリウム属、ヤブレツボカビ属、オーランチオキトリウム属、パリエティキトリウム属、ラビリンチュラ属、アルトルニア属、アプラノキトリウム属、イァポノキトリウム属、ラビリンチュロイデス属、ウルケニア属、オブロンギキトリウム属、ボトリオキトリウム属、又はシクヨイドキトリウム属に属するラビリンチュラ類微生物である、上記（１）に記載の製造法。
（４）上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の製造法によって製造された７ＤＨＣに、紫外線を照射することを特徴とする、ビタミンＤ３の製造法。
本発明により、ラビリンチュラ類微生物を用いた効率的な７ＤＨＣの製造法、及び該製造法により製造された７ＤＨＣに紫外線を照射することを特徴とする、ビタミンＤ３の製造法を提供することができる。
１．本発明の製造法に用いられるラビリンチュラ類微生物
本発明の製造法に用いられるラビリンチュラ類微生物は、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する７ＤＨＣ還元活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に、１以上の塩基が欠失、置換または付加されたことにより、親株に比べ７ＤＨＣ還元活性が低下または喪失しており、かつ７ＤＨＣを生産するラビリンチュラ類微生物である。
親株とは、遺伝子改変、および形質転換等の対象となる元株のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元株は宿主株ともいう。
親株としては、該親株を培地に培養したときに、コレステロールを細胞または培地から回収できる程度に生産する能力を有するラビリンチュラ類微生物であれば特に限定されないが、好ましくは、シゾキトリウム属(Schizochytrium)、ヤブレツボカビ属(Thraustochytrium)、オーランチオキトリウム属(Aurantiochytrium)、パリエティキトリウム属（Parietichytrium）、ラビリンチュラ属(Labyrinthula)、アルトルニア属(Althornia)、アプラノキトリウム属（Aplanochytrium）、イァポノキトリウム属(Japonochytrium)、ラビリンチュロイデス属（Labyrinthuloides）、ウルケニア属(Ulkenia)、オブロンギキトリウム属（Oblongichytrium）、ボトリオキトリウム属（Botryochytrium）、又はシクヨイドキトリウム属（Sicyoidochytrium）に属するラビリンチュラ類微生物を、より好ましくは、シゾキトリウム属（Schizochytorium）ヤブレツボカビ属(Thraustochytrium)、オーランチオキトリウム属(Aurantiochytrium)、又はパリエティキトリウム属（Parietichytrium）に属するラビリンチュラ類微生物を、さらに好ましくは、Aurantiochytrium limacinum ATCC MYA-1381、Thraustochytrium aureum ATCC34304、Thraustochytrium sp. ATCC26185、Schizochytrium sp. AL1Ac、Schizochytrium aggregatum ATCC28209、Ulkenia sp. ATCC 28207、Schizochytrium sp. SEK210（NBRC 102615）、Schizochytrium sp. SEK345（NBRC 102616）、Botryochytrium radiatum SEK353（NBRC 104107）、又はParietichytrium sarkarianumSEK364（FERM ABP-11298）を、最も好ましくは、Aurantiochytrium limacinum ATCC MYA-1381を挙げることができる。
７ＤＨＣ還元活性とは、７ＤＨＣの７位の二重結合を還元し、コレステロールを生成する活性をいう。
本発明における７ＤＨＣ還元活性を有する蛋白質とは、ラビリンチュラ類微生物のゲノム染色体上の遺伝子によりコードされる蛋白質であって、７ＤＨＣ還元活性を有する蛋白質であれば限定されないが、好ましくは、以下の［１］〜［３］のいずれかの蛋白質をいう。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、７ＤＨＣ還元活性を有する変異蛋白質
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ、７ＤＨＣ還元活性を有する相同蛋白質
相同蛋白質とは、元となる蛋白質と構造および機能が類似することにより、その蛋白質をコードする遺伝子が進化上の起源を元の蛋白質をコードする遺伝子と同一にすると考えられる蛋白質であって、自然界に存在する生物が有する蛋白質をいう。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. NATドメインl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失、置換、又は該蛋白質中にアミノ酸残基を付加して得られる蛋白質をいう。
上記の変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。
欠失、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、O-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
７ＤＨＣ還元活性を有する蛋白質をコードする遺伝子とは、ラビリンチュラ類微生物のゲノム染色体上に存在する遺伝子であって、７ＤＨＣ還元活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であれば限定されないが、好ましくは、以下の［４］〜［７］のいずれかのＤＮＡを有する遺伝子をいう。
［４］上記［１］〜［３］のいずれかの蛋白質をコードするＤＮＡ
［５］配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［６］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、７ＤＨＣ還元活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［７］配列番号１で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ、７ＤＨＣ還元活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
遺伝子とは、蛋白質のコーディング領域に加え、転写調節領域、プロモーター領域、及びターミネーター領域などを含んでもよいＤＮＡである。
ハイブリダイズするとは、特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部が他のDNAと相補的に複合体を形成することをいう。したがって、該特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはPCR解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのDNAであってもよい。プローブとして用いるDNAとしては、少なくとも100塩基以上、好ましくは200塩基以上、より好ましくは500塩基以上のDNAをあげることができ、プライマーとして用いられるDNAとしては、少なくとも10塩基以上、好ましくは15塩基以上のDNAをあげることができる。
DNAのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第2版、第3版（2001年）、Methods for GenERドメインal and Molecular BactEriology, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドDNAラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などをあげることができる。
ストリンジェントな条件とは、例えばDNAを固定化したフィルターとプローブDNAとを50％ホルムアミド、5×SSC（750 ｍMの塩化ナトリウム、75 mMのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH 7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20 μg/lの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で42 ℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65 ℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができる。
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号１で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAをあげることができる。
７ＤＨＣ還元活性を有する蛋白質をコードする遺伝子への、１以上の塩基の欠失、置換または付加の導入は、親株に比べ、７ＤＨＣ還元活性を低下または喪失させる１以上の塩基の欠失、置換または付加であれば、塩基の種類および数に制限はないが、塩基の欠失としては、プロモーターおよび転写調節領域は、１塩基以上、好ましくは10塩基以上、より好ましくは20塩基以上、さらに好ましくは全部の領域の欠失、コーディング領域は、１塩基以上、好ましくは10塩基以上、より好ましくは20塩基以上、さらに好ましくは100塩基以上、特に好ましくは200塩基以上、最も好ましくはコーディング領域全部の欠失をあげることができる。
１以上の塩基の置換としては、コーディング領域の5’末端から150番目以内の塩基、好ましくは100番目以内の塩基、より好ましくは50番目以内の塩基、特に好ましくは30番目以内の塩基、最も好ましくは20番目以内の塩基を置換してナンセンスコドンを導入する置換をあげることができる。
１以上の塩基の付加としては、コーディング領域の５’末端から150番目以内の塩基、好ましくは100番目以内の塩基、より好ましくは50番目以内の塩基、特に好ましくは30番目以内の塩基、最も好ましくは20番目以内の塩基の直後に、1塩基以上、好ましくは50塩基以上、より好ましくは100塩基以上、さらに好ましくは200塩基以上、特に好ましくは500塩基以上、最も好ましくは1kb以上のＤＮＡ断片を付加することをあげることができ、最も好ましくはハイグロマイシン耐性遺伝子などの挿入をあげることができる。
親株に比べ７ＤＨＣ還元活性が低下していることは、上記［４］〜［７］のいずれかのＤＮＡの転写物量をノーザン解析もしくはRT‐PCRで定量し、親株と比較する、または、上記［１］〜［３］のいずれかの蛋白質の生産量をSDS−PAGEもしくは抗体を用いたアッセイにより定量し、親株と比較する、などにより確認することができる。
また、上記［１］〜［３］のいずれかの蛋白質の比活性が、親株のそれと比較して低下していることによっても確認することができる。該蛋白質の比活性が、親株のそれと比較して低下していることは、下記３の方法で該ラビリンチュラ類微生物を培養し、その培養物に蓄積された７ＤＨＣを、親株のそれと比較することにより確認することができる。
７ＤＨＣを生産することができるとは、上記の親株の染色体ＤＮＡ上に存在する７ＤＨＣ還元活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に、１以上の塩基が欠失、置換または付加されたことにより、親株に比べ７ＤＨＣ還元活性が低下または喪失したラビリンチュラ類微生物を培地に培養したときに、７ＤＨＣを細胞または培地から回収できる程度に生産する能力を有することをいう。
２．本発明の製造法に用いられるラビリンチュラ類微生物の造成法
本発明の製造法に用いられるラビリンチュラ類微生物は、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する、上記［４］〜［７］のいずれかのＤＮＡを有する遺伝子に、１以上の塩基の欠失、置換または付加を導入して、７ＤＨＣ還元活性を親株に比べ低下または喪失させることにより、造成することができる。
親株の染色体ＤＮＡ上に存在する遺伝子への１以上の塩基の欠失、置換または付加の導入は、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術等による遺伝子置換法等の、ラビリンチュラ類微生物の染色体ＤＮＡに変異を導入することができる方法であれば限定されない。
親株は、コレステロールを生産する能力を有しており、かつ７ＤＨＣ還元活性を有するラビリンチュラ類微生物であれば、野生株であってもよいし、野生株がコレステロールを生産する能力を有しない場合は、人工的にコレステロールを生産する能力を付与した育種株であってもよい。
ラビリンチュラ類微生物にコレステロールを生成する能力を人工的に付与する方法としては、
（ａ）コレステロールの生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法、
（ｂ）コレステロールの生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）コレステロールの生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）コレステロールの生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法、及び
（ｅ）野生型株に比べ、コレステロールのアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独又は組み合わせて用いることができる。
上記したコレステロールを生産する能力を有するラビリンチュラ類微生物の調製に用いることができる親株としては、上記（ａ）〜（ｅ）の方法を適用することができるラビリンチュラ類微生物であればいずれよいが、好ましくは、シゾキトリウム属(Schizochytrium)、ヤブレツボカビ属(Thraustochytrium)、オーランチオキトリウム属(Aurantiochytrium)、パリエティキトリウム属（Parietichytrium）、ラビリンチュラ属(Labyrinthula)、アルトルニア属(Althornia)、アプラノキトリウム属（Aplanochytrium）、イァポノキトリウム属(Japonochytrium)、ラビリンチュロイデス属（Labyrinthuloides）、ウルケニア属(Ulkenia)、オブロンギキトリウム属（Oblongichytrium）、ボトリオキトリウム属（Botryochytrium）、又はシクヨイドキトリウム属（Sicyoidochytrium）に属するラビリンチュラ類微生物を、より好ましくは、シゾキトリウム属（Schizochytorium）ヤブレツボカビ属(Thraustochytrium)、オーランチオキトリウム属(Aurantiochytrium)、又はパリエティキトリウム属（Parietichytrium）に属するラビリンチュラ類微生物を、さらに好ましくは、Aurantiochytrium limacinum ATCC MYA-1381、Thraustochytrium aureum ATCC34304、Thraustochytrium sp. ATCC26185、Schizochytrium sp. AL1Ac、Schizochytrium aggregatum ATCC28209、Ulkenia sp. ATCC 28207、Schizochytrium sp. SEK210（NBRC 102615）、Schizochytrium sp. SEK345（NBRC 102616）、Botryochytrium radiatum SEK353（NBRC 104107）、又はParietichytrium sarkarianumSEK364（FERM ABP-11298）を、最も好ましくは、Aurantiochytrium limacinum ATCC MYA-1381を挙げることができる。
突然変異処理法としては、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いる方法（微生物実験マニュアル、１９８６年、１３１頁、講談社サイエンティフィック社）、紫外線照射法等をあげることができる。
組換えＤＮＡ技術等による遺伝子置換法としては、インビトロで遺伝子に１以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入した組み換え体ＤＮＡを作製し、該組み換え体ＤＮＡを親株へ導入し、相同組換え等により染色体上に元来存在していた該遺伝子を置換する方法を挙げることができる。
上記［４］〜［７］のいずれかのＤＮＡは、例えば、斎藤らの方法〔BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA (1963) 72:619-629〕に従い、ラビリンチュラ類微生物から調製した染色体ＤＮＡを鋳型として、及び配列番号１で表される塩基配列に基づき設計、合成したオリゴＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ法により取得することができる。
取得できる具体的なＤＮＡとしては、配列番号１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。
また、上記のＤＮＡの一部、または全部をプローブとしたハイブリダイゼーション法、または公知の方法で該塩基配列を有するＤＮＡを化学合成する方法等によっても取得することができる。
上記［４］のＤＮＡのうち、上記［３］の相同蛋白質をコードするＤＮＡ、並びに上記［６］及び［７］の相同蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、又は、各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて設計することができるプローブＤＮＡ又はプライマーＤＮＡ、及び当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、上記のＤＮＡを取得する方法と同様の方法によって取得することができる。
ＤＮＡの塩基配列は、通常用いられる塩基配列の解析方法、例えばジデオキシ法〔PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES (1977) 74(12):5463-5467〕に基づいて、373A DNAシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより決定することができる。
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
このような方法は、例えば、Molecular cloning:a laboratory manual,3rded., Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)〔以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す〕、Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley & Sons(1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431(1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985)、J.Bacteriol., 182, 6884(2000)、Gene 77: 61-68, 1989等に記載されている。
組換え体ＤＮＡを親株へ導入する方法としては、ラビリンチュラ類微生物へＤＮＡを導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、電気穿孔法［Appl. Microbiol. Biotech., 52, 541(1999)］やプロトプラスト法［J. Bacteriol., 159, 306(1984)］等をあげることができる。
以上の方法で、親株の染色体上の遺伝子置換を行うことができるが、上記の方法に限らず、ラビリンチュラ類微生物の染色体上の遺伝子を置換できる方法であれば他の遺伝子置換法も用いることもできる。
親株の染色体上の遺伝子に１以上の塩基の欠失、置換または付加を導入することにより、高い蓋然性をもって、該遺伝子がコードする蛋白質の活性を低下または喪失させることができる〔An Introduction to Genetic Analysis. 7th edition (2000) Griffiths AJF， Miller JH，Suzuki DT et al., New York: W. H. Freeman〕。
上記の方法により造成したラビリンチュラ類微生物を培地に培養したとき、培養物中に７ＤＨＣが生成、蓄積していることは、該培養物から分離したラビリンチュラ類微生物を、例えば、超音波やダイノミルなどによって破砕した後、例えば、クロロホルム、ヘキサン、ブタノール等による溶媒抽出を行い、ガスクロマトグラフィーを用いて該抽出物中に存在する７ＤＨＣを検出することにより、確認することができる。
３．本発明の７ＤＨＣの製造法
本発明の７ＤＨＣの製造法は、上記２の方法で造成されたラビリンチュラ類微生物を培地に培養し、培養物中に７ＤＨＣを生成、蓄積させ、該培養物中から７ＤＨＣを採取することを特徴とする、７ＤＨＣの製造法である。
ラビリンチュラ類微生物の培養は、当該微生物を適当な培地に接種して、常法にしたがって培養することにより行うことができる。
培地としては、公知のものをいずれも使用できる。例えば、炭素源としてはグルコース、フルクトース、ガラクトースなどの炭水化物の他、オレイン酸、大豆油などの油脂類や、グリセロール、酢酸ナトリウムなどが例示できる。これらの炭素源は、例えば、培地１リットル当たり２０〜３００ｇの濃度で使用することができる。特に好ましい態様によれば、培地に最初に含有されていた炭素源がすべて消費された後、炭素源をフィードすることにより引き続き培養を行うことができる。このような条件で培養を行うことにより、消費させる炭素源の量を増大させることが可能になり、７ＤＨＣの生産量を増大させることができる。
また、窒素源としては、酵母エキス、コーンスチープリカー、ポリペプトン、グルタミン酸ナトリウム、尿素等の有機窒素、又は酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、アンモニア等の無機窒素を使用することができる。
無機塩としては、リン酸カリウム等を適宜組み合わせて使用できる。
上記の培地は、調製後、適当な酸又は塩基を加えることによりｐＨを４．０〜９．５の範囲内に調整した後、オートクレーブにより殺菌して使用することが好ましい。
ラビリンチュラ類微生物の培養温度は、７ＤＨＣを生産しうる培養温度に制御することが好ましい。一般的には１０〜４５℃であり、好ましくは２０〜３７℃である。
培養時のｐＨは一般的には３．５〜９．５であり、好ましくはｐＨ４．５〜９．５、最も好ましくは５．０〜８．０である。
培養期間は、例えば２〜７日間とすることができ、通気攪拌培養などで培養を行なうことができる。
このようにして、培養物中に７ＤＨＣを高濃度に蓄積したラビリンチュラ類微生物が、培地１リットル当たり乾燥菌体重量で、一般的には２０〜１００ｇ程度と、高い濃度で得ることができる。培養物から培養液とラビリンチュラ類微生物とを分離する方法は、当業者に公知の常法により行なうことができ、例えば、遠心分離法や濾過などにより行なうことができる。
上記の培養物から分離したラビリンチュラ類微生物を、例えば、超音波やダイノミルなどによって破砕した後、例えば、クロロホルム、ヘキサン、ブタノール等による溶媒抽出を行うことにより、７ＤＨＣを得ることができる。７ＤＨＣ等のステロールを微生物等の細胞から抽出する方法は、L.Parksら〔Methods in Enzymology 111 Edited (1985) by L Rilling， L. Parks, C. Bottema, R. Rodriguez and Thomas Lewis, p333-339〕に記載されている。
このようにして得られた粗精製の７ＤＨＣは、当業者に公知の任意の方法、特に、〔Boselli E, Velazco V, CaboniMf and Lercker G J,ChromatogrA. 2001 May 11;917(l-2):239-44〕に記載されている方法によってさらに精製することができる。
羊毛からコレステロールを抽出するために記載されている方法など、他の方法を使用することもできる。当業者は、特に、米国特許2,688,623号若しくは米国特許2,650,929号又は英国特許GB690879号、GB646227号若しくはGB613778号に記載されている方法を参照することができる。
また本発明の好ましい実施態様によれば、７ＤＨＣは、上記２の方法によって造成されるラビリンチュラ類微生物によって産生される総ステロールの２０％超、好ましくは３５％超の割合で、当該ラビリンチュラ類微生物の細胞中に存在する。
４．本発明のビタミンＤ３の製造法
本発明のビタミンＤ３の製造法は、上記３の製造法によって製造された７ＤＨＣに、紫外線を照射することを特徴とする、ビタミンＤ３の製造法である。
上記３の製造法によって得られた７ＤＨＣに、水銀ランプ等を用いて紫外線を照射した後、加熱することによりビタミンＤ３を製造することができる。加熱する温度は、好ましくは５０〜１００℃、最も好ましくは８０℃〜１００℃である。加熱する時間は、好ましくは５〜３００分、より好ましくは、１０〜１００分である。
得られたビタミンＤ３を高速液体クロマトグラフィー法あるいは超臨界クロマトグラフィー法などにより濃縮採取することにより高濃度に精製されたビタミンＤ３を得ることができる。
[参考例]
コレステロールを著量蓄積するラビリンチュラ類微生物の探索
７ＤＨＣはコレステロールの７位の炭素に二重結合が導入された構造を取っているため、代謝改変により７ＤＨＣを著量生産するラビリンチュラ類微生物を造成するためには、コレステロールを著量蓄積するラビリンチュラ類微生物を親株とすることが望ましい。
そこで、我々は、公的機関に寄託されているラビリンチュラ類微生物のコレステロール生産性を以下のように調べた。
Aurantiochytrium sp. NBRC103268、Aurantiochytrium sp. NBRC103269、Parietichytrium sarkarianum NBRC104108、Schizochytrium sp. ATCC20888、及びAurantiochytrium limacinum ATCC MYA-1381を評価用液体培地（９％ グルコース、１％ 酵母エキス、１％ペプトン、５０％人工海水）にて30℃、７２時間培養した。
培養物からBligh & Dyer法〔Bligh EG and Dyer WJ, Can.J.Biochem.Physiol. 37 911 (1959)〕に従って脂質を抽出し、減圧下で乾燥させた。乾燥させた脂質をさらに、0.1N KOH-Methanolに溶解させ、60℃で30分処理することにより、けん化処理を行った。この処理によって得られたフリーのステロールを抽出するため、等量の水を加え、さらに2倍量のヘキサンで3回抽出した。抽出したヘキサン画分を減圧下で濃縮し、ガスクロマトグラフィーにより分析した。定量処理のため、5αコレスタン(シグマ社製)を抽出の初期に加え、内部標準とした。また、コレステロールの同定のために、コレステロール (東京化成製)を外部標準として用いた。
結果を表１に示す。表１より、Aurantiochytrium limacunum ATCC MYA-1381が、コレステロール生産能が高いことがわかった。
［ガスクロマトグラフィーの条件］
カラム：HR-52 (信和化工）0.25mm x 30cm, 0.25mm
キャリアーガス：N2 31ml/min
カラム温度：280℃
検出：FID
以下に本願発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
７ＤＨＣ還元活性が喪失したラビリンチュラ類微生物の造成
参考例においてコレステロールを著量蓄積することがわかったAurantiochytrium limacunum ATCC MYA-1381（以下、MYA-1381という。）において、以下の方法によって、７ＤＨＣ還元活性を喪失させた。
MYA-1381のゲノムＤＮＡを定法により調製した。当該ゲノムＤＮＡを鋳型として、表２の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
また、薬剤耐性遺伝子発現カセット（ジーンブリッジ社製）を鋳型として、配列番号１１及び１２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ハイグロマイシン耐性遺伝子（配列番号５）を増幅した。
上記において増幅した３種類のＤＮＡ断片を混合して鋳型として用い、配列番号７及び１０で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行った。配列番号８と１１、及び 配列番号９と１２は、それぞれ５'末端に相補的な配列を有しているため、当該ＰＣＲにより、３種類のＤＮＡ断片を結合することができる。すなわち、当該ＰＣＲにより、MYA-1381由来のピルビン酸キナーゼプロモーター及びアクチンターミネーターを有するハイグロマイシン耐性遺伝子の発現カセット断片（配列番号６）を調整した。
さらに、MYA-1381のゲノムＤＮＡを鋳型として、表３の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。各ＤＮＡ断片には、それぞれ、表３の「制限酵素配列」に記載された制限酵素配列を付加した。
上記の上流領域の増幅断片をEcoRI及びBamHIで、下流領域の増幅断片をSse8387I及びBamHIで処理し、EcoRI及びSse8387Iで処理したpUC18〔J. Methods in Enzymology(1983)101:20-78〕にライゲーションしてプラスミドを得た。
当該プラスミドをBamHIで処理し、上記で得られたハイグロマイシン耐性遺伝子の発現カセット断片（配列番号６）をBamHIで処理してライゲーションし、配列番号１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡの上流及び下流領域にハイグロマイシン耐性遺伝子の発現カセットが挿入されたプラスミドを得た。当該プラスミドを、pUCDHCR-hygと命名した。
さらにpUCDHCR-hygをNotIで処理することで、配列番号１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡの上流及び下流領域にハイグロマイシン耐性遺伝子の発現カセットが挿入されたＤＮＡ断片を得た。
当該ＤＮＡ断片をエレクトロポレーション法によりMYA-1381に導入し、ハイグロマイシン耐性株を取得し、MYA-1381Δ7DHCRと命名した。MYA-1381Δ7DHCRは、ＰＣＲにより、配列番号１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡが、配列番号１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡの上流及び下流領域にハイグロマイシン耐性遺伝子の発現カセットが挿入されたＤＮＡ断片に置換していることを確認した。
また、実施例２で後述するとおり、MYA-1381Δ7DHCRは、親株で生成していたコレステロールが生成せず、代わりに７ＤＨＣが生成したことから、MYA-1381Δ7DHCRは、７ＤＨＣ還元活性が喪失していると判断した。
７ＤＨＣの製造
MYA-1381（親株）及びMYA-1381Δ7DHCRを、液体培地（12% グルコース, 1% 酵母エキス, 1% ペプトン, 50%人工海水）を用いて、参考例と同様に培養した。培養後、菌体を回収し、参考例と同様にガスクロマトグラフィーで分析した。結果を表４及び表５に示す。
MYA-1381Δ7DHCRでは、親株で生成していたコレステロールが生成せず、代わりに７ＤＨＣが生成した。
本結果は、これまで報告されていた出芽酵母の成績をはるかに上回るものであった。これは、元来コレステロールを生産するラビリンチュラ類微生物を親株に利用したためと考えられる。
また、これまでの知見より（非特許文献４〜９）、ラビリンチュラ微生物において７ＤＨＣ還元活性を低下または喪失させた場合、その生育が大幅に悪化し、７ＤＨＣの蓄積量が大幅に減少することが予想されたが、MYA-1381Δ7DHCRは、その生育が親株と同等であり、かつ７ＤＨＣを著量蓄積することがわかった。
ビタミンＤ３の製造
実施例２で製造した７ＤＨＣに３００nmのUVを照射し、100℃で30分間処理した。当該処理後、参考例と同様にガスクロマトグラフィーで分析した。
その結果、７ＤＨＣがビタミンＤ３に変換したことを確認した。
本発明により、ラビリンチュラ類微生物を用いた効率的な７ＤＨＣの製造法、及び該製造法により製造された７ＤＨＣに紫外線を照射することを特徴とする、ビタミンＤ３の製造法を提供することができる。
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ

Claims (2)

  1. 親株の染色体ＤＮＡ上に存在する７デヒドロコレステロール（以下、７ＤＨＣという。）還元活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に、１以上の塩基が欠失、置換または付加されたことにより、親株に比べ７ＤＨＣ還元活性が低下または喪失しており、かつ７ＤＨＣを生産するラビリンチュラ類微生物を培地に培養し、培養物中に７ＤＨＣを生成、蓄積させ、該培養物中から７ＤＨＣを採取することを特徴とする、７ＤＨＣの製造法であって、７ＤＨＣ還元活性を有する蛋白質をコードする遺伝子が、以下の［１］〜［６］のいずれかのＤＮＡを有する遺伝子であり、ラビリンチュラ類微生物が、シゾキトリウム属、ヤブレツボカビ属、オーランチオキトリウム属、パリエティキトリウム属、イァポノキトリウム属、又はウルケニア属に属するラビリンチュラ類微生物である、７ＤＨＣの製造法。
    ［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
    ［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、７ＤＨＣ還元活性を有する変異蛋白質をコードするＤＮＡ
    ［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有し、かつ、７ＤＨＣ還元活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
    ［４］配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
    ［５］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、７ＤＨＣ還元活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
    ［６］配列番号１で表される塩基配列と少なくとも９５％以上の同一性を有し、かつ、７ＤＨＣ還元活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
  2. 請求項１に記載の製造法によって７ＤＨＣを製造し、該製造された７ＤＨＣに、紫外線を照射することを特徴とする、ビタミンＤ３の製造法。
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