JP6816970B2 - 多価不飽和脂肪酸ポリケチドシンターゼ及びその利用 - Google Patents
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Description
PUFAの生合成経路としては、好気経路と、多価不飽和脂肪酸ポリケチドシンターゼ(以下、PUFA-PKSという。)による経路の二種類が知られている。好気経路は、脂肪酸合成酵素によって合成されたパルミチン酸などの長鎖脂肪酸に、複数の不飽和化酵素、鎖伸長酵素が作用することで、二重結合の導入、炭素鎖の伸長がなされてPUFAが合成される経路で、古くから多くの生物で知られている合成経路である(非特許文献1)。一方、PUFA-PKSは、アセチルCoAを出発物質としてPUFAを合成する酵素であり、一部の海洋性細菌やラビリンチュラ類真核生物に存在することが示されている(非特許文献2、 非特許文献3)。
PUFAは生体において様々な重要な役割を果たしているため、PUFA-PKS活性が向上したPUFA-PKSを取得することが出来れば、微生物や油料種子植物などの生物を用いて、PUFAを効率的かつ効果的に生産させることができ、有用である。しかしながら、これまでに知られているPUFA-PKSはその活性が十分ではなく、より高い活性を有する酵素が求められていた。
(1)多価不飽和脂肪酸(以下、PUFAという。)を合成する活性(以下、PUFA-PKS活性という。)を有する、アシルキャリアー蛋白質(以下、ACPという。)ドメイン、β-ケトアシル-アシルキャリアー蛋白質シンターゼ(以下、KSという。)ドメイン、及びケトレダクターゼ(以下、KRという。)ドメインを含む蛋白質複合体において、元となる該蛋白質複合体に含有されるACPドメインと同一のACPドメインを、元となる該蛋白質複合体に含有されるACPドメイン数より多く保有するACPドメイン増加型蛋白質複合体。
(2)ACPドメインの数が、元となる蛋白質複合体のACPドメイン数より1〜10多い上記(1)に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
(3)元となる蛋白質複合体のACPドメイン領域に、直列的にACPドメインが連結されている、上記(1)又は(2)に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
(4)ACPドメイン、KSドメイン、KRドメイン、鎖伸長因子ドメイン、デヒドラターゼドメイン、エノイルレダクターゼドメイン、アシル転移酵素ドメイン、マロニル-CoA:ACPアシル転移酵素ドメイン及びホスホパンテテイン転移酵素から構成される上記(1)〜(3)のいずれか1に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
(5)PUFAが、ドコサヘキサエン酸(以下、DHAという。)、エイコサペンタエン酸(以下、EPAという。)、ドコサペンタエン酸(以下、DPAという。)、又はアラキドン酸(以下、ARAという。)である上記(1)〜(4)のいずれか1に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
(6)元となる蛋白質複合体が、以下の[1]〜[4]のいずれかに記載の蛋白質を含有することを特徴とする上記(1)に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
[1]配列番号2で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号2で表わされるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質
[2]配列番号14で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号14で表わされるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質
[3]配列番号28で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号28で表わされるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質
[4]配列番号42で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号42で表わされるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質
(7)以下の[5]〜[12]のいずれかに記載の蛋白質を含有する上記(1)に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
[5]配列番号4で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
[6]配列番号6で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
[7]配列番号16で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
[8]配列番号18で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
[9]配列番号30で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
[10]配列番号32で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
[11]配列番号44で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
[12]配列番号46で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
(8)元の蛋白質複合体が、以下の[13]〜[16]のいずれかに記載の蛋白質複合体である請求項1に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
[13]上記(6)[1]に記載の蛋白質、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[14]上記(6)[2]に記載の蛋白質、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[15]上記(6)[3]に記載の蛋白質、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[16]上記(6)[4]に記載の蛋白質、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
(9)以下の[17]〜[24]のいずれかである上記(1)に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
[17]配列番号4で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[18]配列番号6で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[19]配列番号16で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[20]配列番号18で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[21]配列番号30表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[22]配列番号32で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[23]配列番号44で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[24]配列番号46で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
(10)以下の[25]〜[34]のいずれかに記載のDNA。
[25]上記(1)〜(6)のいずれかに記載される、元となる蛋白質複合体に含有されるACPドメインと同一のACPドメインを、元となる該蛋白質複合体に含有されるACPドメイン数より多く保有するACPドメインを有する蛋白質をコードするDNA
[26]上記(7)[5]〜[12]のいずれかに記載の蛋白質をコードするDNA
[27]配列番号3で表わされる塩基配列を含むDNA、又は配列番号3で表わされる塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基酸配列からなり、かつ、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
[28]配列番号5で表わされる塩基配列を含むDNA、又は配列番号5で表わされる塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基酸配列からなり、かつ、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
[29]配列番号15で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号15で表わされる塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
[30]配列番号17で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号17で表わされる塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
[31]配列番号29で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号29で表わされる塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
[32]配列番号31で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号31で表わされる塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
[33]配列番号43で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号43で表わされる塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
[34]配列番号45で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号45で表わされる塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
(11)以下の[35]〜[43]のいずれかに記載のDNA群。
[35]上記(10)[25]のDNA、及び該DNAにコードされる蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNAを含むDNA群
[36]上記(7)[5]の蛋白質をコードするDNA、又は上記(10)[27]のDNA、並びに配列番号7で表される塩基配列を含むDNA、配列番号9で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号11で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
[37]上記(7)[6]の蛋白質をコードするDNA、又は上記(10)[28]のDNA、並びに配列番号7で表される塩基配列を含むDNA、配列番号9で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号11で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
[38]上記(7)[7]の蛋白質をコードするDNA、又は上記(10)[29]のDNA、並びに配列番号19で表される塩基配列を含むDNA、配列番号21で表される塩基配列を含むDNA、配列番号23で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号25で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
[39]上記(7)[8]の蛋白質をコードするDNA、又は上記(10)[30]のDNA、並びに配列番号19で表される塩基配列を含むDNA、配列番号21で表される塩基配列を含むDNA、配列番号23で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号25で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
[40]上記(7)[9]の蛋白質をコードするDNA、又は上記(10)[31]のDNA、並びに配列番号33で表される塩基配列を含むDNA、配列番号35で表される塩基配列を含むDNA、配列番号37で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号39で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
[41]上記(7)[10]の蛋白質をコードするDNA、又は上記(10)[32]のDNA、並びに配列番号33で表される塩基配列を含むDNA、配列番号35で表される塩基配列を含むDNA、配列番号37で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号39で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
[42]上記(7)[11]の蛋白質をコードするDNA、又は上記(10)[33]のDNA、並びに配列番号47で表される塩基配列を含むDNA、配列番号49で表される塩基配列を含むDNA、配列番号51で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号53で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
[43]上記(7)[12]の蛋白質をコードするDNA、又は上記(10)[34]のDNA、並びに配列番号47で表される塩基配列を含むDNA、配列番号49で表される塩基配列を含むDNA、配列番号51で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号53で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
(12)上記(1)〜(9)のいずれか1に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体を生産する微生物。
(13)上記(10)又は(11)に記載のDNAを有する微生物。
(14)微生物が、さらに、当該微生物が元来保有するアシルCoAデヒドロゲナーゼの活性が低下、又は喪失した微生物である、上記(12)又は(13)に記載の微生物。
(15)微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である、上記(12)〜(14)のいずれか1に記載の微生物。
(16)上記(12)〜(15)のいずれかに記載の微生物を培地に培養し、培養物中にPUFA、又はPUFA含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物からPUFA、又はPUFA含有組成物を採取することを特徴とする、PUFA、又はPUFA含有組成物の製造方法。
(17)PUFAが、DHA、EPA、DPA及びARAからなる群より選ばれるPUFAである、上記(16)に記載の製造方法。
1.1 本発明のACPドメイン増加型蛋白質複合体の例-1
本発明は、PUFA-PKS活性を有する、ACPドメイン、KSドメイン、及びKRドメインを含む蛋白質複合体において、元となる該蛋白質複合体に含有されるACPドメインと同一のACPドメインを、元となる該蛋白質複合体に含有されるACPドメイン数より多く保有するACPドメイン増加型蛋白質複合体(以下、本発明のACPドメイン増加型蛋白質複合体という。)に関する。
本発明のACPドメイン増加型蛋白質複合体が合成するPUFAとしては、PUFA 1分子が有する炭素原子の数が18〜30個、好ましくは、19〜23個、より好ましくは20〜22個であり、かつ、1分子中に2〜10個、好ましくは3〜8個、より好ましくは4〜6個の二重結合を有するPUFAを、好ましくは、DHA、EPA、DPA及びARAからなる群より選ばれるPUFAを、より好ましくはDHA又はEPAを挙げることができる。
KSドメインとは、PUFA-PKS活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、マロニルACPとアシルACPの縮合に関わるドメインをいう。
ドメインとは、蛋白質中の連続するアミノ酸配列からなる一部分であって、当該蛋白質において、特定の生物学的活性又は機能を有する領域である。
本明細書において「元となる蛋白質複合体」とは、本発明のACP増加型蛋白質複合体において、ACPドメインを増加させる前の蛋白質複合体のことをいう。
ACPドメインの数は、元となる蛋白質複合体をコードするDNAに、後述の4に記載の方法でACPドメインをコードするDNAを挿入することによって増加させることができる。ACPドメインをコードするDNAを挿入する部位としては、該蛋白質複合体が元来有する活性を消失させない部位であれば、いずれの部位に挿入してもよいが、例えば、該蛋白質複合体のACPドメイン領域に直列的に連結する部位を挙げることができる。
本発明のACPドメイン増加型蛋白質複合体において、元となる蛋白質複合体と比べてACPドメインが増加していることは、後述の4に記載の方法により、本発明のACPドメイン増加型蛋白質複合体のうちACPドメインを有する蛋白質をコードするDNAの塩基配列を取得し、元となる蛋白質複合体のうちACPドメインを有する蛋白質をコードするDNAの塩基配列と比較することにより、増加した塩基配列を取得し、当該増加した塩基配列によりコードされるアミノ酸配列をクエリーとして、元となる蛋白質複合体うちACPドメインを有する蛋白質のACPドメインに対して相同性検索をした結果、少なくとも95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有することにより、確認することができる。
鎖伸長因子ドメインとは、PUFA-PKS活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、炭素鎖の伸長に関わるドメインのことをいう。
エノイルレダクダーゼドメインとは、PUFA-PKS活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、生じた二重結合の還元に関わるドメインのことをいう。
ホスホパンテテイン転移酵素とは、PUFA-PKS活性を有する蛋白質複合体を構成する酵素であり、ACPドメインの活性化に関わる酵素のことをいう。
本発明のACPドメイン増加型蛋白質複合体の元となる蛋白質複合体としては、PUFA−PKS活性を有する蛋白質複合体であれば野生型及び変異型のPUFA-PKS活性を有する蛋白質のいすれのものでもよいが、PUFA-PKS活性を元来有する微生物が有するPUFA-PKS活性を有する蛋白質複合体、以下の[1]〜[4]のいずれかに記載の蛋白質を含有する蛋白質複合体、及び、以下の[13]〜[16]のいずれかに記載の蛋白質複合体を挙げることができる。
[1]配列番号2で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号2で表わされるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質、又は、配列番号2で表わされるアミノ酸配列において、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する変異蛋白質
[2]配列番号14で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号14で表わされるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質、又は、配列番号14で表されるアミノ酸配列において、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する変異蛋白質
[3]配列番号28で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号28で表わされるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質、又は、配列番号28で表されるアミノ酸において、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する変異蛋白質
[4]配列番号42で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号42で表わされるアミノ酸配列と95%以上、、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質、又は、配列番号42で表されるアミノ酸配列において、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する変異蛋白質
[13]上記[1]に記載の蛋白質、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[14]上記[2]に記載の蛋白質、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[15]上記[3]に記載の蛋白質、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[16]上記[4]に記載の蛋白質、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
配列番号2で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質は2910アミノ酸残基からなり、アミノ酸配列としてN末端側から、1102〜1204残基、1205〜1313残基、1314〜1424残基、1425〜1535残基、1536〜1651残基、1652〜1762残基、1763〜1866残基、1867〜1977残基、及び1978〜2081残基の領域にACPドメインを有する。
配列番号28で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質は1556アミノ酸残基からなり、アミノ酸配列としてN末端側から、1127〜1204残基、1205〜1318残基、1319〜1430残基、及び1431〜1544残基の領域にACPドメインを有する。
上記[1]〜[4]に記載の蛋白質を有する蛋白質複合体において、該蛋白質以外の、蛋白質複合体を構成する蛋白質としては、上記[1]〜[4]に記載の蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質であればいずれのものでもよいが、具体的には、上記[1]に記載の蛋白質と協働してPUFA−PKS活性を有する蛋白質としては、上記[13]に記載の、[1]に記載の蛋白質以外の蛋白質を、上記[2]に記載の蛋白質と協働してPUFA−PKS活性を有する蛋白質としては、上記[14]に記載の、[2]に記載の蛋白質以外の蛋白質を、上記[3]に記載の蛋白質と協働してPUFA−PKS活性を有する蛋白質としては、上記[15]に記載の、[3]に記載の蛋白質以外の蛋白質を、上記[4]に記載の蛋白質と協働してPUFA−PKS活性を有する蛋白質としては、上記[16]に記載の、[4]に記載の蛋白質以外の蛋白質を、それぞれ挙げることができる。
変異型蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、又は該蛋白質中にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、O-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
C群:アスパラギン、グルタミン
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
E群:プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン
G群:フェニルアラニン、チロシン
本明細書において「協働する」とは、ある蛋白質を他の蛋白質と共存させたとき、一体となって特定の反応を行うことであり、特に本明細書では、PUFA-PKS活性に必要な複数の蛋白質を共存させたとき、他の蛋白質と一体となってPUFA-PKS活性を示すことをいう。
1.2 本発明のACPドメイン増加型蛋白質複合体の例-2
本発明のACPドメイン増加型蛋白質複合体の例としては、以下の[5]〜[12]のいずれかに記載の蛋白質を含有するACPドメイン増加型蛋白質複合体、及び、以下の[17]〜[24]のいずれかに記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体を、好ましくは、以下の[17]〜[24]のいずれかに記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体を挙げることができる。
[5]配列番号4で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号4で表わされるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質、又は、配列番号4で表わされるアミノ酸配列において、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質
[6]配列番号6で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号6で表わされるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質、又は、配列番号6で表わされるアミノ酸配列において、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質
[7]配列番号16で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号16で表わされるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質、又は、配列番号16で表わされるアミノ酸配列において、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質
[8]配列番号18で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号18で表わされるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質、又は、配列番号18で表わされるアミノ酸配列において、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質
[9]配列番号30で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号30で表わされるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質、又は、配列番号30で表わされるアミノ酸配列において、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質
[10]配列番号32で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号32で表わされるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質、又は、配列番号32で表わされるアミノ酸配列において、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質
[11]配列番号44で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号44で表わされるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質、又は、配列番号44で表わされるアミノ酸配列において、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質
[12]配列番号46で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号46で表わされるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質、又は、配列番号46で表わされるアミノ酸配列において、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質
[17]配列番号4で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[18]配列番号6で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[19]配列番号16で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[20]配列番号18で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[21]配列番号30表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[22]配列番号32で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[23]配列番号44で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[24]配列番号46で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
配列番号4で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号6で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質には、それぞれ5個又は6個のACPドメインが存在する。
配列番号6で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質は3135アミノ酸残基からなる蛋白質であり、N末端側から、1102〜1204残基、1205〜1313残基、1314〜1424残基、1425〜1535残基、1536〜1651残基、1652〜1762残基、1763〜1866残基、1867〜1977残基、1978〜2081残基、2082〜2195残基、及び2196〜2306残基にACPドメインを有する。
配列番号16で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質は2639アミノ酸残基からなる蛋白質であり、N末端側から、1223〜1327残基、1328〜1430残基、1431〜1541残基、1542〜1617残基、及び1618〜1719残基にACPドメインを有する。
配列番号30で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号32で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質には、それぞれ5個又は6個のACPドメインが存在する。
配列番号32で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質は1784アミノ酸残基からなる蛋白質であり、N末端側から、1127〜1204残基、1205〜1318残基、1319〜1430残基、1431〜1544残基、1545〜1658残基、及び1659〜1772残基にACPドメインを有する。
配列番号44で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質は2754アミノ酸残基からなる蛋白質であり、N末端側から、1254〜1330残基、1331〜1432残基、1433〜1533残基、1534〜1634残基、1635〜1740残基、及び1741〜1842残基にACPドメインを有する。
上記[5]〜[12]に記載の蛋白質を有する本発明のACP増加型蛋白質複合体において、該蛋白質以外の、本発明のACP増加型蛋白質複合体を構成する蛋白質としては、上記[5]〜[12]に記載の蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質であればいずれのものでもよいが、具体的には、上記[5]及び[6]に記載の蛋白質と協働してPUFA−PKS活性を有する蛋白質としては、上記[17]及び[18]に記載の、配列番号4及び6で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質以外の蛋白質を、上記[7]及び[8]に記載の蛋白質と協働してPUFA−PKS活性を有する蛋白質としては、上記[19]及び[20]に記載の、配列番号16及び18で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質以外の蛋白質を、上記[9]及び[10]に記載の蛋白質と協働してPUFA−PKS活性を有する蛋白質としては、上記[21]及び[22]に記載の、配列番号30及び32で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質以外の蛋白質を、上記[11]及び[12]に記載の蛋白質と協働してPUFA−PKS活性を有する蛋白質としては、上記[23]及び[24]に記載の、配列番号44及び46で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質以外の蛋白質を、それぞれ挙げることができる。
2.本発明のDNA
本発明は、本発明のACP増加型蛋白質複合体をコードするDNA(以下、本発明のDNAという。)を含む。
本発明のDNAは、複数のDNAから構成されるDNA群であってもよい。
2.1 本発明のDNAの例-1
本発明のDNAとしては、以下の[25]〜[34]のいずれかに記載のDNAを挙げることができる。
[25]上記(1)〜(6)のいずれかに記載される、元となる蛋白質複合体に含有されるACPドメインと同一のACPドメインを、元となる該蛋白質複合体に含有されるACPドメイン数より多く保有するACPドメインを有する蛋白質をコードするDNA
[26]上記[5]〜[12]のいずれかに記載の蛋白質をコードするDNA
[27]配列番号3で表わされる塩基配列を含むDNA、配列番号3で表わされる塩基配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有する塩基酸配列からなり、かつ、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA、又は、配列番号3で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
[28]配列番号5で表わされる塩基配列を含むDNA、配列番号5で表わされる塩基配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有する塩基酸配列からなり、かつ、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA、又は、配列番号5で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
[29]配列番号15で表される塩基配列を含むDNA、配列番号15で表わされる塩基配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA、又は、配列番号15で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
[30]配列番号17で表される塩基配列を含むDNA、配列番号17で表わされる塩基配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA、又は、配列番号17で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
[31]配列番号29で表される塩基配列を含むDNA、配列番号29で表わされる塩基配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA、又は、配列番号29で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
[32]配列番号31で表される塩基配列を含むDNA、配列番号31で表わされる塩基配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA、又は、配列番号31で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
[33]配列番号43で表される塩基配列を含むDNA、配列番号43で表わされる塩基配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA、又は、配列番号43で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
[34]配列番号45で表される塩基配列を含むDNA、配列番号45で表わされる塩基配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA、又は、配列番号45で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
上記において「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するDNA又は該DNAの一部がハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するDNA又は該DNAの一部の塩基配列は、ノーザン又はサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、又はPCR解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのDNAであってもよい。プローブとして用いるDNAとしては、少なくとも100塩基以上、好ましくは200塩基以上、より好ましくは500塩基以上のDNAを挙げることができ、プライマーとして用いられるDNAとしては、少なくとも10塩基以上、好ましくは15塩基以上のDNAを挙げることができる。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLAST及びFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、元となる塩基配列と少なくとも95%以上、好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、もっとも好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAを挙げることができる。
2.2 本発明のDNAの例-2
本発明のDNAとしては、さらに、以下の[35]〜[43]のいずれかに記載のDNA群を挙げることができる。
[35]上記[25]のDNA、及び該DNAにコードされる蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNAを含むDNA群
[36]上記[5]の蛋白質をコードするDNA、又は上記[27]のDNA、並びに配列番号7で表される塩基配列を含むDNA、配列番号9で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号11で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
[37]上記[6]の蛋白質をコードするDNA、又は上記[28]のDNA、並びに配列番号7で表される塩基配列を含むDNA、配列番号9で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号11で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
[38]上記[7]の蛋白質をコードするDNA、又は上記[29]のDNA、並びに配列番号19で表される塩基配列を含むDNA、配列番号21で表される塩基配列を含むDNA、配列番号23で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号25で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
[39]上記[8]の蛋白質をコードするDNA、又は上記[30]のDNA、並びに配列番号19で表される塩基配列を含むDNA、配列番号21で表される塩基配列を含むDNA、配列番号23で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号25で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
[40]上記[9]の蛋白質をコードするDNA、又は上記[31]のDNA、並びに配列番号33で表される塩基配列を含むDNA、配列番号35で表される塩基配列を含むDNA、配列番号37で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号39で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
[41]上記[10]の蛋白質をコードするDNA、又は上記[32]のDNA、並びに配列番号33で表される塩基配列を含むDNA、配列番号35で表される塩基配列を含むDNA、配列番号37で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号39で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
[42]上記[11]の蛋白質をコードするDNA、又は上記[33]のDNA、並びに配列番号47で表される塩基配列を含むDNA、配列番号49で表される塩基配列を含むDNA、配列番号51で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号53で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
[43]上記[12]の蛋白質をコードするDNA、又は上記[34]のDNA、並びに配列番号47で表される塩基配列を含むDNA、配列番号49で表される塩基配列を含むDNA、配列番号51で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号53で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
上記[36]〜[43]に記載のDNA群において、各DNA群に含まれるDNAのうち、ACPドメインを有する蛋白質をコードするDNA以外のDNAとしては、該DNAに代えて、該DNAが有する塩基配列と少なくとも95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、該DNAがコードする蛋白質と複合体を構成する他の蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質をコードするDNA、又は、該DNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該DNAがコードする蛋白質と複合体を構成する他の蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質をコードするDNAを用いてもよい。
2.3 本発明のDNAを有する組換え体DNA
本発明のDNAには、上記の本発明のDNAを有する組換え体DNAを含む。
該組換え体DNAは、本発明のDNAが、宿主生物において自律複製可能又は染色体中への組み込みが可能で、該DNAを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに組み込まれている組換え体DNAである。
宿主生物に細菌などの原核生物を親株として用いる場合は、該組換え体DNAは、プロモーター、リボソーム結合配列、上記の本発明のDNA、及び転写終結配列により構成された組換え体DNAであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
親株にエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとして、例えば、pColdI(タカラバイオ社製)、pET21a、pCOLADuet-1、pACYCDuet-1、pCDF-1b、pRSF-1b(いずれもノバジェン社製)、pMAL-c2x(ニューイングランドバイオラブス社製)、pGEX-4T-1(ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製)、pTrcHis(インビトロエジェン社製)、pSE280(インビトロジェン社製)、pGEMEX-1(プロメガ社製)、pQE-30(キアゲン社製)、pET-3(ノバジェン社製)、pTrc99A (ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescriptII SK(+)、pBluescriptII KS(-)(ストラタジーン社製)、pTrS30[エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(Ferm BP-5407)より調整]、pTrS32[エシェリヒア・コリ JM109/pTrS32(Ferm BP-5408)より調整]、pTK31[APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY、2007、Vol. 73、No. 20、p6378-6385]、pPAC31(WO98/12343)、pUC19[Gene,33 ,103(1985)]、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118(タカラバイオ社製)、pPA1(特開昭63-233798)、pHSG298(タカラバイオ社製)、pUC18(タカラバイオ社製)、等を挙げることができる。
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネ型細菌の細胞中で機能するものであればいかなるものでよいが、例えば、P54-6プロモーター[Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679(2000)]を用いることができる。
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、PH05プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1プロモーター、CUP1プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
3. 本発明の微生物
本発明は、上記2に記載の、本発明のDNAで親株を形質転換して得られる微生物(以下、本発明の微生物という。)を含む。また、本発明の微生物は、さらに、該親株に比べアシルCoAデヒドロゲナーゼの活性が低下又は喪失していてもよい。
親株はいずれの微生物であってもよいが、例えば、任意の細菌、原生生物、微細藻類、真菌、原生動物を挙げることができる。
特に微細藻類としては、ヤブレツボカビ目の微生物を挙げることができる。ヤブレツボカビ目の微生物としては、スラウストキトリウム属、ラビリンチュロイデス属、ジャポノチトリウム属、シゾキトリウム属、オーランチオキトリウム属からなる群より選ばれる微生物を挙げることができる。
親株がPUFA-PKS活性を有する既知の蛋白質複合体をコードする遺伝子を有する場合には、本発明の微生物には、当該既知の蛋白質複合体を構成する、ACPドメインを有する蛋白質にACPドメインを挿入、付加することによって、ACPドメインの数を増加させた蛋白質を有する蛋白質複合体を有する微生物を造成することができる。ACPドメインを挿入、付加する部位としては、当該蛋白質が元来有する活性を消失させない部位であれば、当該蛋白質のいずれの部位に挿入、付加してもよいが、例えば、当該蛋白質において、元来存在するACPドメインに連続する部位を挙げることができる。
アシルCoAデヒドロゲナーゼとは、アシルCoAデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をいう。
アシルCoAデヒドロゲナーゼ活性とは、アシルCoAに二重結合を導入する活性をいう。
(a)親株に比べ、該蛋白質の比活性が80%以下、好ましくは50%以下、より好ましくは30%以下、さらに好ましくは20%以下、特に好ましくは10%以下、最も好ましくは0%に低下した微生物
(b)親株に比べ、該DNAの転写量又は該蛋白質の生産量が80%以下、好ましくは50%以下、より好ましくは30%以下、さらに好ましくは20%以下、特に好ましくは10%以下、最も好ましくは0%に低下した微生物
より好ましくは、該DNAの一部又は全部が欠損した微生物を挙げることができる。
[44]配列番号56で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA
[45]配列番号56で表されるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アシルCoAデヒドロゲナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするDNA
[46]配列番号55で表される塩基配列からなるDNA
[47]配列番号55で表わされる塩基配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アシルCoAデヒドロゲナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするDNA
[48]配列番号55で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アシルCoAデヒドロゲナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするDNA
相同蛋白質に関する記載は、上記1.1の記載と同じである。
上記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば、上記したBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号55で表される塩基配列からなるDNAと少なくとも95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するDNAを挙げることができる。
アシルCoAデヒドロゲナーゼをコードするDNAの転写量又は該蛋白質の生産量が低下又は喪失した微生物の例としては、アシルCoAデヒドロゲナーゼをコードするDNAの一部又は全部が欠損した微生物を挙げることができる。具体的には、例えば、実施例3に記載のBLR(DE)ΔfadE / pCDF-OrfB’, pCOLA Duet-OrfC, pSTV-HetI, pET21-OrfA10株、及びBLR(DE)ΔfadE / pCDF-OrfB’, pCOLA Duet-OrfC, pSTV-HetI, pET21-OrfA11株を、並びに、実施例6に記載のBLR(DE3)ΔfadE / pCDF-EpaC, pColADuet-EpaD, pACYCDuet-EpaEB, pET21-EpaA5株、及びBLR(DE3)ΔfadE / pCDF-EpaC, pColADuet-EpaD, pACYCDuet-EpaEB, pET21-EpaA6株を挙げることができる。
また、上記の微生物が、親株に比べ、アシルCoAデヒドロゲナーゼの活性が低下又は喪失した微生物であることは、例えば、親株及び該微生物を、適当な脂肪酸を含む培地で培養し、培養液中の脂肪酸濃度を比較することにより確認することができる。
組換え体DNAで親株を形質転換する方法については、下記5に後述する。
4. 本発明のDNAの取得方法
本発明のACPドメイン増加型蛋白質複合体の元となる蛋白質複合体をコードするDNAは、例えば、配列番号13、19、21、23、及び25で表わされる塩基配列に基づき設計することができるプローブDNAを用いた、微生物、好ましくはシュワネラ(Shewanella)属に属する微生物、より好ましくは、シュワネラ・オネイデンシス(Shewanella oneidensis)MR-1の染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、又は該塩基配列に基づき設計することができるプライマーDNAを用いた、上記微生物の染色体DNAを鋳型としたPCR[PCR Protocols, Academic Press(1990)]により取得することができる。
配列番号13、19、21、23、及び25で表わされる塩基配列からなるDNAによりコードされる蛋白質の相同蛋白質をコードするDNAは、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号13、19、21、23、及び25からなる群より選ばれる配列番号で表わされる塩基配列と95%以上、好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列を検索し、又は、各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号14、20、22、24、及び26からなる群より選ばれる配列番号で表わされるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて設計することができるプローブDNA又はプライマーDNA、及び当該DNAを有する微生物を用いて、上記のDNAを取得する方法と同様の方法によって取得することができる。
塩基配列を決定した結果、取得されたDNAが部分長であった場合は、該部分長DNAをプローブに用いた、染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長DNAを取得することができる。
ACPドメイン増加型蛋白質複合体のうちACPドメインを有する蛋白質をコードするDNAは、上記で得られた、ACPドメイン増加型蛋白質複合体の元となる蛋白質複合体のうちACPドメインをコードする蛋白質をコードするDNA、その相同蛋白質をコードするDNA、又は上記で取得した変異型蛋白質をコードするDNAに、以下の方法により、ACPドメインをコードするDNAを挿入、付加することによって取得することができる。
このような組換え体DNAの例としては、実施例において後述するpET21-OrfA10、pCDF-OrfB'、 pCOLADuet-OrfC、及びpSTV-HetIを、pET21-OrfA11、 pCDF-OrfB'、 pCOLADuet-OrfC、及びpSTV-HetIを、pET21-EpaA5、pCDF-EpaC、 pColADuet-EpaD、 及びpACYCDuet-EpaEBを、並びに、pET21-EpaA6、pCDF-EpaC、 pColADuet-EpaD、 及びpACYCDuet-EpaEBを挙げることができる。
5. 本発明の微生物の造成方法
本発明の微生物は、以下の方法によって造成することができる。
上記4の方法で取得することができる組換え体DNAで親株を形質転換する。
該組換え体DNAを親株において自律複製可能なプラスミドとして導入させる方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69 2110(1972)]、プロトプラスト法(特開昭63-248394)、エレクトロポレーション法[Nucleic Acid Res., 16, 6127(1988)]等の方法を挙げることができる。
相同組換え法は、例えば、導入したい親株内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドDNAと連結して作製できる相同組換え系を利用して、組換え体DNAを導入する方法を挙げることができ、エシェリヒア・コリで頻用される相同組換えを利用した方法としては、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体DNAを導入する方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645(2000)]を挙げることができる。
また、本発明の微生物は、さらに、親株に比べアシルCoAデヒドロゲナーゼの活性が低下又は喪失していてもよい。
突然変異処理法としては、例えば、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)を用いる方法(微生物実験マニュアル、1986年、131頁、講談社サイエンティフィック社)、紫外線照射法等を挙げることができる。
上記方法により取得した微生物が、親株に比べアシルCoAデヒドロゲナーゼの活性が低下又は喪失した微生物であることは、上記3の方法により確認することができる。
6. 本発明のPUFA又はPUFA含有組成物の製造方法
本発明は、上記5で造成された微生物を培地に培養し、培養物中にPUFA又はPUFA含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物からPUFA又はPUFA含有組成物を採取することを特徴とする、PUFA又はPUFA含有組成物の製造方法(以下、本発明の製造方法という。)を含む。
PUFA含有組成物は、例えば、PUFA含有油脂又はPUFA含有リン脂質を、好ましくはPUFA含有油脂を挙げることができる。
該微生物の培養物は、該微生物を適当な培地に接種して、常法にしたがって培養することにより得ることができる。
無機塩としては、リン酸カリウム等を適宜組み合わせて使用できる。
培養温度は、一般的には10〜45℃であり、好ましくは20〜37℃である。培養温度は、PUFA含有組成物を生産しうる培養温度に制御することが好ましい。培養時のpHは、一般的には3.5〜9.5であり、好ましくは4.5〜9.5である。特に好ましいpHは目的によって異なり、油脂を多く生産するためには、pH 5.0〜8.0である。
培養物から培養液と微生物とを分離する方法は、当業者により公知の常法により行うことができ、例えば、遠心分離法や濾過等により行うことができる。
上記の培養物から分離した微生物を、例えば超音波やダイノミルなどによって破砕した後、例えば、クロロホルム、ヘキサン、ブタノール等による溶媒抽出を行うことにより、PUFA含有組成物を得ることができる。
PUFA含有組成物からPUFAを分離して採取することにより、PUFAを製造することができる。例えば、加水分解法によりPUFA含有組成物からPUFAを含有する混合脂肪酸を調整した後、例えば、尿素付加法、冷却分離法、高速液体クロマトグラフィー法又は超臨界クロマトグラフィー法などにより、PUFAを分離して採取することにより、PUFAを製造することができる。
PUFAアルキルエステルは、PUFAアルキルエステルであれば特に限定されないが、好ましくは、PUFAエチルエステルを挙げることができる。
PUFA含有組成物からPUFAアルキルエステルを分離して採取するには、例えばアルコーリシス法によりPUFA含有組成物からPUFAアルキルエステルを含有する混合脂肪酸アルキルエステルを調整した後、例えば、尿素付加法、冷却分離法、高速液体クロマトグラフィー法又は超臨界クロマトグラフィー法等により、PUFAアルキルエステルを分離して採取することにより行うことができる。
以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
大腸菌において、T7プロモーターによりSchizochytrium sp. ATCC20888由来のPUFA-PKSを発現させるために、以下のプラスミドを構築した。まず、常法により抽出した Schizochytrium sp. ATCC20888のゲノムDNAを鋳型に、配列番号57及び58で表わされるプライマーを用いてPCRを行い、Schizochytrium sp. ATCC20888由来のPUFA-PKSのOrfA蛋白質(配列番号2で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質)をコードするDNA(配列番号1で表わされる塩基配列からなるDNA)を含むDNAを得た。得られたDNAを制限酵素NdeI及びEcoRIで処理し、同一の制限酵素処理を行った大腸菌ベクターpET21a (ノバジェン社製)とライゲーションすることにより、pET21-OrfA9を得た。
Shizochytrium sp. ATCC20888のゲノムDNAを鋳型に、配列番号69及び70で表わされるプライマーを用いて OrfC蛋白質(配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質)をコードするDNA(配列番号9で表わされる塩基配列からなるDNA)を含むDNAを、PCRにより増幅した。得られたDNA断片を制限酵素NdeI及びEcoRIで、pCOLADuet-1 (ノバジェン社製)を制限酵素NdeI及びMfeIで処理し、両者をライゲーションすることによりpColADuet-OrfCを構築した。
ACPドメインを10個又は11個有するOrfA蛋白質を遺伝子工学的に再構築した。構築したACPドメイン数の異なるOrfA蛋白質をコードするDNAは、T7プロモーターで発現誘導可能なpET21a (ノバジェン社製)へクローニングした。
野生型のOrfA蛋白質は、その内部に、9個のACPドメインがタンデムに並んだ構造を持っている。このACPドメインをN末端側からACP1、 ACP2と命名し、最もC末端側のACPドメインをACP9とする。このうち、ACP2からACP9ドメインをコードするDNAにはそれぞれ制限酵素ZraI認識配列(GAC|GTC)が存在する。このZraI切断断片はPmlI (CAC|GTG) 切断断片とアミノ酸配列を変えることなく連結できる。また、形成されたDNA断片はZraI、PmlIのどちらでも切断されない。この特性を利用し、ACPドメインを再構築した。
PUFA-PKSによってDHAを生産する大腸菌を構築するため、まず脂肪酸の分解に関わる遺伝子であるfadEの破壊株の構築を試みた。
fadE遺伝子(配列番号55で表わされる塩基配列からなるDNA)の破壊は、Quick & Easy E. coli gene Deletion Kit (GENE BRIDGES社製) を用いて行った。キットに添付のKm耐性遺伝子を鋳型に、配列番号73及び74で表わされるプライマーを用いてPCRを行い、fadE破壊用DNA断片を得た。キットに付属のプロトコルに従い、大腸菌BLR(DE3)株(ノバジェン社製)を得た。上記破壊株にプラスミド708-FLPe (Cmr) を組み込み、プロトコルに従い、BLR(DE3)ΔfadE株を取得した。
これらのPUFA-PKSを発現するプラスミドを導入した大腸菌を、Terrific broth(アンピシリン100 mg/L、カナマイシン 20 mg/L、クロラムフェニコール 30 mg/L、ストレプトマイシン 20mg/Lを含む)にて1晩培養した。その培養液を新たに調製したTerrific broth(アンピシリン100 mg/L、カナマイシン 20 mg/L、クロラムフェニコール 30 mg/L、ストレプトマイシン 20mg/L、1 mM IPTGを含む)に植菌し、PUFA-PKSの発現を誘導、230rpm 20℃にて48時間培養した。培養後、培養液を採取し、Bligh-Dyer法(Bligh, E. G. and Dyer, W. J. (1959) Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917.)にて脂質抽出した後、三フッ化ホウ素メタノールにて脂肪酸をメチル化し、ガスクロマトグラフィー質量分析法にて分析した。
大腸菌において、T7プロモーターによりShewanella oneidensis MR-1由来のPUFA-PKSを発現させるために、以下のプラスミドを構築した。
まず、Shewanella oneidensis MR-1のゲノムDNAを鋳型に、プライマー配列番号77及78で表わされるプライマーを用いてEpaA蛋白質(配列番号14で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質)をコードするDNA(配列番号13で表わされる塩基配列からなるDNA)を含むDNAをPCRにより増幅した。得られたDNA断片及びpET21a (ノバジェン社製)を、EcoRI及びXhoIで制限酵素処理し、ライゲーションすることで、pET21-EpaA’ (Hisタグ融合酵素として発現)を得た。Hisタグを除去するため、T7プロモーター周辺領域(pET21-EpaA’を鋳型に、プライマーとして配列番号79及び80を使用)及びEpaA蛋白質をコードするDNAの5’末端領域(pET21-EpaA’を鋳型に、プライマーとして配列番号81及び82を使用)をPCRにより増幅した。得られたDNA断片を鋳型に、配列番号79及び82で表わされるプライマーを用いてオーバーラップエクステンションPCRを行った。得られたDNA断片及びpET21-EpaA’をApaI/SalIで制限酵素処理後、ライゲーションすることで、pET21-EpaA4を得た。
Shewanella oneidensis MR-1のゲノムDNAを鋳型に、配列番号89及び90で表わされるプライマーを用いてEpaE蛋白質をコードするDNAを含むDNAをPCRにより増幅した。得られたDNA断片とpACYCDuet-1ベクターを制限酵素NcoI及びBamHIで処理し、ライゲーションすることでpACYCDuet-EpaEを得た。
ACPドメインを5個又は6個有するEpaA蛋白質を遺伝子工学的に再構築した。構築したACPドメイン数の異なるEpaAはT7プロモーターで発現誘導可能なpET21a (ノバジェン社製)へクローニングした。
制限酵素AfeI 認識配列(AGC|GCT) に対応するアミノ酸残基はそれぞれSer及びAlaである。そこで、EpaA蛋白質をコードするDNAにユニークな制限酵素EagI認識配列の上流14 bpに位置するSer1431、Ala1432のコドンをAfeI 認識配列に変異させた。またAfeI切断断片は制限酵素FspI (TGC|GCA) 切断断片と連結した場合、そのアミノ配列は保持され、さらに形成されたDNAはどちらの制限酵素でも切断されない。この特性を利用し、EpaA蛋白質をコードするDNAにACP2ドメインをコードするDNAを挿入し、ACPドメインをコードするDNAの数を増加させた。
実施例3で構築したBLR(DE3)ΔfadE株に、実施例4で造成したpET21-EpaA4、pCDF-EpaC、pColADuet-EpaD、及びpACYCDuet-EpaEBを、又は、実施例5で造成したpET21-Epa5もしくはpET21-Epa6、pCDF-EpaC、 pColADuet-EpaD、及び pACYCDuet-EpaEBを導入した。これらのPUFA-PKSを発現するプラスミドを導入した大腸菌を、Terrific broth(アンピシリン100 mg/L、カナマイシン 20 mg/L、クロラムフェニコール 30 mg/L、ストレプトマイシン 20mg/Lを含む)にて1晩培養した。その培養液を新たに調製したTerrific broth(アンピシリン100 mg/L、カナマイシン 20 mg/L、クロラムフェニコール 30 mg/L、ストレプトマイシン 20mg/L、1 mM IPTGを含む)に植菌し、PUFA-PKSの発現を誘導、230rpm 20℃にて48時間培養した。
その結果、ACPドメインの数が増加するのに伴い、EPA及びDPAの生産性が増大していることがわかった(表2)。
配列番号58−人工配列の説明:合成DNA
配列番号59−人工配列の説明:合成DNA
配列番号60−人工配列の説明:合成DNA
配列番号61−人工配列の説明:合成DNA
配列番号62−人工配列の説明:合成DNA
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Claims (16)
- 多価不飽和脂肪酸(以下、PUFAという。)を合成する活性(以下、PUFA-PKS活性という。)を有する、アシルキャリアー蛋白質(以下、ACPという。)ドメイン、β-ケトアシル-アシルキャリアー蛋白質シンターゼ(以下、KSという。)ドメイン、及びケトレダクターゼ(以下、KRという。)ドメインを含む蛋白質複合体において、元となる該蛋白質複合体に含有されるACPドメインと同一のACPドメインを、元となる該蛋白質複合体に含有されるACPドメイン数より1〜10多く保有するACPドメイン増加型蛋白質複合体。
- 元となる蛋白質複合体のACPドメイン領域に、直列的にACPドメインが連結されている、請求項1に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
- ACPドメイン、KSドメイン、KRドメイン、鎖伸長因子ドメイン、デヒドラターゼドメイン、エノイルレダクターゼドメイン、アシル転移酵素ドメイン、マロニル-CoA:ACPアシル転移酵素ドメイン及びホスホパンテテイン転移酵素から構成される請求項1又は2に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
- PUFAが、ドコサヘキサエン酸(以下、DHAという。)、エイコサペンタエン酸(以下、EPAという。)、ドコサペンタエン酸(以下、DPAという。)、又はアラキドン酸(以下、ARAという。)である請求項1〜3のいずれか1項に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
- 元となる蛋白質複合体が、以下の[1]〜[4]のいずれかに記載の蛋白質を含有することを特徴とする請求項1に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
[1]配列番号2で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号2で表わされるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質
[2]配列番号14で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号14で表わされるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質
[3]配列番号28で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号28で表わされるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質
[4]配列番号42で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号42で表わされるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質 - 以下の[5]〜[12]のいずれかに記載の蛋白質を含有する請求項1に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
[5]配列番号4で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
[6]配列番号6で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
[7]配列番号16で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
[8]配列番号18で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
[9]配列番号30で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
[10]配列番号32で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
[11]配列番号44で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
[12]配列番号46で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質 - 元の蛋白質複合体が、以下の[13]〜[16]のいずれかに記載の蛋白質複合体である請求項1に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
[13]請求項5[1]に記載の蛋白質、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[14]請求項5[2]に記載の蛋白質、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[15]請求項5[3]に記載の蛋白質、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[16]請求項5[4]に記載の蛋白質、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体 - 以下の[17]〜[24]のいずれかである請求項1に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
[17]配列番号4で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[18]配列番号6で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[19]配列番号16で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[20]配列番号18で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[21]配列番号30表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[22]配列番号32で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[23]配列番号44で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
[24]配列番号46で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体 - 以下の[25]〜[34]のいずれかに記載のDNA。
[25]請求項1〜5のいずれかに記載される、元となる蛋白質複合体に含有されるACPドメインと同一のACPドメインを、元となる該蛋白質複合体に含有されるACPドメイン数より多く保有するACPドメインを有する蛋白質をコードするDNA
[26]請求項6[5]〜[12]のいずれかに記載の蛋白質をコードするDNA
[27]配列番号3で表わされる塩基配列を含むDNA、又は配列番号3で表わされる塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基酸配列からなり、かつ、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
[28]配列番号5で表わされる塩基配列を含むDNA、又は配列番号5で表わされる塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基酸配列からなり、かつ、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号12で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
[29]配列番号15で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号15で表わされる塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
[30]配列番号17で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号17で表わされる塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号20で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号22で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号24で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号26で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
[31]配列番号29で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号29で表わされる塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
[32]配列番号31で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号31で表わされる塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号34で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号36で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号40で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
[33]配列番号43で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号43で表わされる塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
[34]配列番号45で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号45で表わされる塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号48で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号50で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号52で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号54で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA - 以下の[35]〜[43]のいずれかに記載のDNA群。
[35]請求項9[25]のDNA、及び該DNAにコードされる蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNAを含むDNA群
[36]請求項6[5]の蛋白質をコードするDNA、又は請求項9[27]のDNA、並びに配列番号7で表される塩基配列を含むDNA、配列番号9で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号11で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
[37]請求項6[6]の蛋白質をコードするDNA、又は請求項9[28]のDNA、並びに配列番号7で表される塩基配列を含むDNA、配列番号9で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号11で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
[38]請求項6[7]の蛋白質をコードするDNA、又は請求項9[29]のDNA、並びに配列番号19で表される塩基配列を含むDNA、配列番号21で表される塩基配列を含むDNA、配列番号23で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号25で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
[39]請求項6[8]の蛋白質をコードするDNA、又は請求項9[30]のDNA、並びに配列番号19で表される塩基配列を含むDNA、配列番号21で表される塩基配列を含むDNA、配列番号23で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号25で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
[40]請求項6[9]の蛋白質をコードするDNA、又は請求項9[31]のDNA、並びに配列番号33で表される塩基配列を含むDNA、配列番号35で表される塩基配列を含むDNA、配列番号37で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号39で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
[41]請求項6[10]の蛋白質をコードするDNA、又は請求項9[32]のDNA、並びに配列番号33で表される塩基配列を含むDNA、配列番号35で表される塩基配列を含むDNA、配列番号37で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号39で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
[42]請求項6[11]の蛋白質をコードするDNA、又は請求項9[33]のDNA、並びに配列番号47で表される塩基配列を含むDNA、配列番号49で表される塩基配列を含むDNA、配列番号51で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号53で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
[43]請求項6[12]の蛋白質をコードするDNA、又は請求項9[34]のDNA、並びに配列番号47で表される塩基配列を含むDNA、配列番号49で表される塩基配列を含むDNA、配列番号51で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号53で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群 - 請求項1〜8のいずれか1項に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体を生産する微生物。
- 請求項9又は10に記載のDNAを有する微生物。
- 微生物が、さらに、当該微生物が元来保有するアシルCoAデヒドロゲナーゼの活性が低下
、又は喪失した微生物である、請求項11又は12に記載の微生物。 - 微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である、請求項11〜13のいずれか1項に記載の微生物。
- 請求項11〜14のいずれかに記載の微生物を培地に培養し、培養物中にPUFA、又はPUFA含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物からPUFA、又はPUFA含有組成物を採取することを特徴とする、PUFA、又はPUFA含有組成物の製造方法。
- PUFAが、DHA、EPA、DPA及びARAからなる群より選ばれるPUFAである、請求項15に記載の製造方法。
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