KR102127181B1

KR102127181B1 - 아코니트산수화 효소 유전자와(또는) 그 조절요소를 개조한 세균 발효를 통한 l-리신 생산방법

Info

Publication number: KR102127181B1
Application number: KR1020157024148A
Authority: KR
Inventors: 지잉 마; 팅이 웬; 진롱 첸; 용 리앙; 수엔 리우; 아이잉 웨이; 리펭 양; 루이 렌; 강 멩; 춘광 자오; 운 장; 시우링 상; 샤오웨이 구오
Original assignee: 닝샤 에펜 바이오테크 코 엘티디
Priority date: 2013-02-08
Filing date: 2014-01-07
Publication date: 2020-06-30
Also published as: JP2016506737A; US20160002684A1; WO2014121669A1; RU2015134995A3; KR20150115009A; CA2900580A1; EP2824186A4; RU2015134995A; CA2900580C; EP2824186A1; ES2673582T3; EP2824186B1; JP6335196B2; DK2824186T3

Abstract

본 발명은 발효에 의한 L-리신 생산 방법을 제시하였으며, 이는 세균 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자 및/또는 조절요소를 바꾸어 아코니트산수화 효소의 효소 활성 및/또는 표현량을 저하시키지만 사라지지는 않게 하는 방식과 개조로 얻은 세균발효에 의한 L-리신 생산을 포함한다. 이밖에, 본 발명은 이 방법을 통해 파생된 방법과 응용(용도) 및 이들 방법과 응용(용도)에 사용된 세균 등을 제시하였다.

Description

아코니트산수화 효소 유전자와(또는) 그 조절요소를 개조한 세균 발효를 통한 L-리신 생산방법{L-LYSINE GENERATION METHOD BY FERMENTING BACTERIA HAVING MODIFIED ACONITASE GENE AND/OR REGULATORY ELEMENT}

본 발명은 아미노산발효 영역에 속하며, 구체적으로 발효에 의한 L-리신의 생산방법과 그 파생된 방법,응용 및 이 방법과 응용 과정에서의 세균 사용과 관련이 있다.

L-리신을 만들어내는 세균（예: 에세리키아 균속의 대장균(E. coli of Escherichia)과 코리네박테리움 균속의 막대모양 세균(bacteria of Corynebacterium)）발효를 통한 L-리신 생산이 이미 산업화 되고 있다. 이들 세균은 자연계에서 분리된 세균일 수도 있고, 돌연변이 유도나 유전자 개조로 얻은 세균일 수도 있으며 두 가지 모두일 수도 있다. 현재 문헌보도를 보면 유전자 개조에 대한 관심은 pnt , dap 및 ppc 등 유전자에 집중되어 있어서, L-리신 생산을 위한 코드 아코니트산수화 효소（예: 대장균 중의 아코니트산수화 효소A，글루타민산 코리네박테리움균 또는 베이징 코리네박테리움균 중의 아코니트산수화 효소）의 유전자의 조절요소에 대한 내용은 없다.

아코니트산수화 효소（Aconitase）는 TCA 사이클(tricarboxylic acid cycle) 중의 한 효소로, 구연산(citric acid)을 아코니트산(aconitic acid)으로 전환하고, 아코니트산을 이소시트르산(isocitric acid)으로 전환하는 등 두 가지 화학반응을 촉진한다. 현재 에세리키아균 중， acnA 유전자（뉴클레오티드 서열: SEQ ID No：1）코드 아코니트산수화 효소A가 있지만 대사물질이 마지막 L-리신 산물과 너무 멀고 중간대사의 종류(branch)가 너무 많고 복잡하여 L-리신발효에서 많은 주목을 받지는 못하고 있다. 글루타민산 코리네박테리움균 등 다른 리신발효균 중에서 아코니트산수화 효소의 L-리신 발효에 대한 영향 관련 보도는 더욱 없는 상태이다. 중국 특허번호 CN1289368A와 CN101631871A 등 문헌에 언급된 아코니트산수화 효소는 모두 L-글루타민산의 발효와 관련이 있으며 아코니트산수화 효소의 L-리신 발효에 대한 영향과는 무관하다.

본 발명인은 장기간의 연구와 실습을 통해, 특히 운이 좋아 우연히 아코니트산수화 효소 유전자 및 조절요소의 개조가 L-리신의 생산량 향상에 도움이 된다는 사실을 발견하였다.

또한 기존의 기술에서는 복사와 부위 특이적 돌연변이 유도 표현량 및 효소 활성 향상에 좋은 유익한 효소 유전자를 늘리거나 안 좋은 유전자를 제거하여 효소 활성과 표현량을 없애고 있지만 본 발명인은 이와 다르게 아코니트산수화 효소 유전자 및 조절요소를 단순히 향상 및 제거할 수 없음을 발견하였으며, 특히 제거 후의 acnA 유전자의 미 표현으로 인해 세균 성장에 어려움이 있어 실제 응용시키는 데 어려움이 있었다. 그래서 L-리신의 생산량을 늘리기 위해 새로운 아코니트산수화 효소 유전자와 조절요소 개조 방법을 개발하였다.

더불어 이 방법은 기존의 개조된 L-리신을 대량생산할 수 있는 세균의 염색체 변위와 충돌하지 않을 뿐만 아니라 추가적으로 더 향상시킬 수 있으므로 실제 활용에 있어서 여러 종류의 세균 발효를 이용한 L-리신 생산에 적용될 수 있다.

본 발명이 해결하려는 기술적 문제는 새로운 발효에 의한 L-리신 생산방법 및 관련 방법을 제시하는 것이다. 개조되지 않은 세균에 의한 L-리신의 발효 생산량 증가 방법과 상반되는 개조된 세균을 발효에 의한 L-리신 생산의 응용(용도), 그리고 개조된 세균의 개조되지 않은 세균에 상대되는 L-리신의 발효 생산량 향상의 응용(용도) 및 세균 개조 방법 등이 이에 포함된다. 이밖에, 본 발명인은 상기 방법에 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드, 매개체 및 세균 등을 제시하였다.

구체적인 내용은 다음과 같다. 첫 번째 측면에서 발효에 의한 L-리신 생산 방법을 제시하였으며, 이는 다음을 포함한다.

（1）세균 염색체의 아코니트산수화 효소 유전자 및/또는 조절요소를 개조하는 단계로서, 아코니트산수화 효소의 효소 활성과 표현량을 줄이지만 완전히 소멸시키지는 않게 개조하는 단계; 및

（2）상기 순서（1）의 개조로 인해 얻은 세균발효에 의한 L-리신을 생산하는 단계.

본문의 '개조(modification)'라는 용어는 해당 개조된 대상에 변화가 발생하고, 이로 인해 어느 정도의 효과를 보게 되는 것을 의미한다. 염색체에 있는 유전자(gene)나 조절요소(regulatory element) 개조 수단으로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 돌연변이 유도(mutagenesis), 부위 특이적 돌연변이(site-directed mutation), 및/또는 상동 재조합(homologous recombination)이 있으며, 뒤의 두 가지를 우선적으로 사용한다. 염색체에 있는 유전자나 조절요소를 개조하면 해당 유전자나 조절요소의 뉴클레오티드 서열이 추가(addition), 결실(deletion)되거나 여러 개의 뉴클레오티드로 교체(substitution)된다. 이러한 기술적 수단은 분자생물학과 미생물학 문헌에 광범위하게 기재되어 있으며, 이미 상품화 된 것도 있다. 본 발명의 구체적인 실시방식 중, 상동 재조합의 원리는 Addgene사의 상품화된 pKOV플라스미드 시스템을 이용해 개조하거나 pK18mobsacB플라스미드 시스템으로 개조할 수 있으며, 개조되지 않은 세균 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자와 조절요소를 개조로 얻은 세균의 아코니트산수화 효소의 표현량과 효소 활성을 저하되지만 사라지지는 않게 하는 새로운 아코니트산수화 효소 유전자와 조절요소로 개조할 수 있다. 그렇기 때문에 본문에서는 상동 재조합을 통한 개조를 우선적으로 선택하였다.

본 발명인은 장기간의 연구를 통해 대장균과 막대모양 간균 등 세균 중 아코니트산수화 효소의 표현량을 사라지게 하여(유전자로 제거하는 방법) 세균 자체의 성장을 어렵게 만들고, 나아가 산을 생산할 수 없도록 할 수 있음을 알게 되었다. 그러므로 본 발명인이 설명하는 '개조'는 개조되지 않은 세균에 대한 것이며, 개조로 인해 얻은 세균의 아코니트산수화 효소의 표현량을 저하시키지만 사라지지는 않게 한다. 우선적으로 개조로 얻은 세균의 아코니트산수화 효소 A의 표현량을 20% ~ 95% 낮추고 더 우선적으로 50% ~ 90%로 낮추었다. 예: 65%, 70% 또는 80% 하락 등.

이와 더불어 본 발명인은 다른 응용(용도) 또는 방법을 제시하였다. 예를 들어, 두 번째 측면에서, 본 발명인은 L-리신의 발효량 향상 방법을 제시하였다. 그 내용은 다음 단계들을 포함한다:

（1）세균 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자 및/또는 조절요소를 개조하는 단계로서, 아코니트산수화 효소의 효소 활성 및 표현량을 저하시키지만 사라지지는 않게 개조하는 단계; 및

（2）상기 순서（1）개조로 얻은 세균발효에 의한 L-리신을 생산하는 단계.

L-리신은 세균의 중요 대사산물로서, 대다수의 세균이 양이 적건 많건 일정량의 L-리신을 발효 생산할 수 있다. L-리신 생산량이 적은 세균은 경제적인 L-리신 생산에 부적합하지만 본 발명인의 방법을 이용하면 L-리신의 발효량을 향상시킬 수 있어 경제적으로 민감하지 않은 분야에서 이를 사용할 수 있다. 물론 본문에서 우선적으로 선택한 세균은 L-리신 생산성이 좋은 세균이며, 본 발명인의 방법을 이용하면 생산량을 더욱 향상시킬 수 있다. 이밖에, 본 발명인의 방법과 응용과정에서 세균 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자 및/또는 조절요소 개조 이외에 다른 개조는 실시하지 않아도 된다. 아코니트산수화 효소 유전자의 조절요소를 개조한 후에 세균 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자를 개조하지 않는 것도 마찬가지이다. 예: 특히 L-리신 생산량이 많은 세균은 세균 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자와 조절요소 중 한가지만 개조하면 된다.

예를 들어, 세 번째 측면에서, 본 발명은 개조로 얻은 세균의 발효에 의한 L-리신 생산에 대한 응용방안을 제시하였다. 이중， 상술한 '개조로 얻었다'는 표현은 세균 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자 및/또는 조절요소를 개조하여 얻은 것을 의미하며, 개조로 얻은 세균의 아코니트산수화 효소의 효소 활성 및 표현량을 저하시키지만 사라지지는 않게 한다.

개조로 얻은 세균은 발효에 의한 L-리신 생산에 단독으로 응용될 수 있으며 L-리신을 생산하는 다른 세균과 혼합한 발효에 의한 L-리신 생산에도 적용될 수 있다. 또는 기타 다른 방식으로 발효에 의한 L-리신 생산에 사용될 수 있다. 본문에서 특별한 제한을 두지 않은 경우 （예를 들어, '개조로 얻은'이라는 제한）， '세균(bacterium)'이라는 용어는 개조를 하지 않았거나 개조를 하기 전의 세균이다. 해당 염색체의 아코니트산수화 효소 유전자 및 이 유전자의 앞뒤에 있는 조절요소는 아코니트산수화 효소의 효소 활성 및 표현량을 저하시키는 아코니트산수화 효소 유전자 및 조절요소가 없다. 예: 야생형 세균 중의 아코니트산수화 효소 유전자 및 조절요소.

예를 들어, 네 번째 측면에서, 본 발명은 개조로 얻은 세균의 L-리신의 발효량 증가 측면에서의 응용방안을 제시하였다. 이중, 상술한 개조로 인한 획득은 세균 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자 및/또는 조절요소를 개조하여 얻은 것이며, 개조로 얻은 세균의 아코니트산수화 효소의 효소 활성 및/또는 표현량을 저하시키지만 사라지지는 않게 한다.

본문에서 세균은 L-리신을 생산하는 세균이며, 이는 에세리키아 균속(Escherichia) 또는 코리네박테리움 균속(Corynebacterium)의 세균을 의미한다. 우선 선택 측면에서 세균은 에세리키아 균속 세균을 선택하고, 더욱 좋은 것은 대장균(Escherichia coli)을 선택하는 것이다. 예를 들어 대장균 K-12균주의 후속 균주는 W3110에서 파생된 균주를 포함한다. 또 다른 우선 선택의 측면에서 보면 세균은 코리네박테리움 균속세균을 선택하고, 더욱 좋은 것은 글루타민산 코리네박테리움균(Corynebacterium glutamicum) 또는 베이징 코리네박테리움균(Corynebacterium pekinense)을 선택하는 것이다. 기존의 기술에서는 L-리신 생산/발효과정에서 세균의 아코니트산수화 효소 유전자 및/또는 조절요소에 거의 관심을 갖지 않았다. 개조된 염색체의 유전자는 대부분 pnt , dap 및 ppc 등 유전자 위치에 집중되어 있기 때문에 기존 기술 중의 L-리신을 생산하는 세균（특히, 에세리키아 균속 또는 코리네박테리움 균속의 세균. 예: 대장균, 글루타민산 코리네박테리움균 또는 베이징 코리네박테리움균）의 아코니트산수화 효소 유전자 및/또는 전후의 조절요소에 대한 개조는 보도된 적이 없다. 그렇기 때문에 야생형을 갖고 있는 아코니트산수화 효소 유전자 및 그 전후의 조절요소는 기본적으로 본 발명의 방법으로 개조하여 L-리신의 발효량을 향상시킨다. 본 발명의 구체적인 실시방식은 L-리신 생산량이 많은 세균이건 적은 세균이건 본 발명의 방법을 통해 개조시키면 L-리신의 발효량이 향상될 수 있다.

좀 더 본질적으로, 다섯 번째 측면에서, 본 발명은 세균 개조 방법을 제시하였다. 상술한 세균 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자 및/또는 조절요소를 개조하여 개조로 얻은 세균의 아코니트산수화 효소의 효소 활성 및/또는 표현량을 저하시키지만 사라지지는 않게 하는 것이 이에 포함된다.

본 발명의 다섯 번째 측면의 방법으로 개조하여 얻은 세균은 발효에 의한 생산이나 L-리신 생산에 사용될 수 있다. 그래서 여섯 번째 측면에서, 본 발명은 다섯 번째 측면의 방법으로 개조하여 얻은 세균을 제시하였다.

본 발명인은 테스트를 통해 에세리키아 균속세균（예: 대장균） 중 많은 아코니트산수화 효소 유전자（acnA）의 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID No：1과 같으며, 코리네박테리움 균속세균 （예: 글루타민산 코리네박테리움균 또는 베이징 코리네박테리움균）중의 많은 아코니트산수화 효소 유전자의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No：2와 같고, 이러한 아코니트산수화 효소 유전자를 개조하여 얻은 세균의 아코니트산수화 효소의 효소 활성 및/또는 표현량을 저하시키지만 사라지지는 않게 함으로써 L-리신의 발효량을 증가시킬 수 있음을 발견하였다. 그러므로 본 발명의 구체적인 실시방식 중 상술한 아코니트산수화 효소 유전자의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No：1 또는 2와 같다. 다른 기타 세균도 서열 분석과 서열 동일성 비교 등 수단을 통해서도 세균 중의 아코니트산수화 효소 유전자의 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있으므로 본 발명의 방법으로 개조하였다.

본 발명에서는 우선 선택한 개조 세균 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자는 상술한 아코니트산수화 효소 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대해 한 개 또는 여러 개 뉴클레오티드를 첨가, 결실 및 교체 하였으며, 개조로 얻은 세균의 아코니트산수화 효소의 효소 활성 및/또는 표현량을 저하시키지만 사라지지는 않게 할 수 있으면 된다.

본 발명인의 경험에 의하면 세균은 장기적인 진화를 통해 효소의 활성 및/또는 표현량을 향상시키는 것이 어려웠다. 선택 가능한 변위는 좀 더 정확한 연구가 진행되어야 하지만 효소의 활성 및/또는 표현량을 저하시키는 것은 상대적으로 쉬웠다. 예: 돌연변이가 가능한 효소구조 범위 밖의 뉴클레오티드 서열. 본 발명 과정에서 우선 선택한 개조 세균 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자는 상술한 아코니트산수화 효소 유전자의 뉴클레오티드 서열에 한 개 또는 여러 개의 뉴클레오티드를 교체할 수 있다. 예를 들어, 상기 교체는 상술한 아코니트산수화 효소 유전자의 개시 코돈(initiation codon)을 교체하는 것을 포함하며, 바람직하게는, GTG로 교체한다. 대장균, 글루타민산 코리네박테리움균과 베이징 코리네박테리움균 등에도 실시한다. 본 발명 중， 우선 선택한 개조 세균 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자도 상술한 아코니트산수화 효소 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대해 한 개 또는 여러 개의 뉴클레오티드를 결실시킨다. 예를 들어, 상기 결실은 상술한 아코니트산수화 효소 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대한 결실을 포함하며, 바람직하게는, 1 - 120개의 뉴클레오티드를 결실시키고, 더 바람직하게는, 1 - 90개 뉴클레오티드를 결실시키며 가장 바람직하게는 90개 뉴클레오티드를 결실시킨다. 예를 들어 상술한 아코니트산수화 효소 유전자의 뉴클레오티드 서열의 종결 코돈(termination codon) 전에 90개 뉴클레오티드를 결실시킨다. 이는 대장균, 글루타민산 코리네박테리움균과 베이징 코리네박테리움균 등에도 진행한다.

본문에서 의미하는 조절요소(regulatory element)는 유전자（예: 아코니트산수화 효소 유전자）의 상류영역 또는 하류영역에 위치하고 있고, 이 유전자의 복사 및/또는 표현을 컨트롤 함으로써 이 유전자 표현량의 폴리뉴클레오티드에 영향을 미치는 것을 의미하며 이는 비코드 서열(non-coding sequences)과 코드 서열(encoding sequences)을 포함한다. 조절요소는 유전자의 프로모터(촉진제, promoter), 인핸서(증폭자, enhancer), 억제배열(repressor) 또는 기타 다른 복사와 표현 컨트롤과 관련이 있는 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)이다. 우선 선택한 조절요소는 프로모터일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시방식 중, 상술한 프로모터의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No：4 또는 6과 같다. 우선 선택한 조절요소는 억제배열일 수도 있다. 예: 복사 억제 단백질(transcription repressor). 본 발명의 구체적인 실시방식 중, 상술한 복사 억제 단백질의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No：7과 같다. 프로모터 및/또는 억제배열을 개조하여 얻은 세균의 아코니트산수화 효소의 효소 활성 및/또는 표현량을 저하시키지만 사라지지는 않게 할 수 있다.

본 발명 중, 우선 선택한 개조세균 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자의 조절요소는 상술한 아코니트산수화 효소 유전자의 조절요소의 뉴클레오티드 서열에 추가나 결실을 하거나 한 개 또는 여러 개의 뉴클레오티드를 교체한다. 개조로 얻은 세균의 아코니트산수화 효소의 효소 활성 및/또는 표현량을 저하시키지만 사라지지는 않게 하면 된다.

본 발명인의 경험에 따르면, 세균을 장기 진화시켜서 프로모터나 인핸서의 복사활성(transcription activity)을 향상시키는 것은 어려우며, 선택 가능한 변위는 정밀한 연구를 진행해야 하지만 프로모터나 인핸서의 복사활성을 감소시키는 것은 상대적으로 편리했다. 예: 한 개 또는 몇 개의 뉴클레오티드 서열을 추가하여 프로모터와 유전자의 개시 코돈 사이를 늘리거나 약한 복사 프로모터로 기존의 프로모터를 교체시킨다. 본 발명 중, 우선 선택한 개조세균 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자의 조절요소는 상술한 아코니트산수화 효소 유전자의 프로모터에 대해 한 개 또는 여러 개의 뉴클레오티드를 교체한다. 약한 복사 프로모터로 교체하거나 더 바람직하게는, SEQ ID No：3 또는 5에 나와 있는 뉴클레오티드 서열로 교체한다.

이밖에, 본 발명 중, 우선 선택한 개조세균 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자의 조절요소도 상술한 아코니트산수화 효소 유전자의 복사 억제 단백질의 뉴클레오티드 서열에 첨가를 한다. 예: 새로운 복사 억제 단백질의 뉴클레오티드 서열을 첨가하거나 기존의 복사 억제 단백질의 뉴클레오티드 서열의 복사 수량을 늘린다. 복사 억제 단백질은 프로모터（특히, 강한 복사 프로모터）에 추가된 후 표현량이 증가됨으로써 더욱 효과적으로 아코니트산수화 효소 유전자의 복사를 억제할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시방식 중, 첨가된 것은 직렬연결 된 SEQ ID No：8과 7에 나와 있는 뉴클레오티드 서열이다.

이밖에, 본 발명에서는 상술한 방법에 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드 및/또는 매개체(vector) 등 물질 및 이들의 응용(용도) 등을 제시하였다. 예: 7번째 측면에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 제시하였으며, 다음 뉴클레오티드 서열에서 선택하였다.

（a）SEQ ID No：1과 같은 뉴클레오티드 서열의 개시 코돈을 교체（바람직하게 GTG로 교체）한 후 얻은 뉴클레오티드 서열;

（b）SEQ ID No：1 또는 2와 같은 뉴클레오티드 서열을 결실시키고 （바람직하게 1 - 120개 뉴클레오티드 결실 선택. 더 바람직하게 1 - 90개 뉴클레오티드 결실 선택. 가장 바람직하게 90개 뉴클레오티드 결실 선택）후 얻은 뉴클레오티드 서열; 예를 들어, SEQ ID No：1 또는 2와 같은 뉴클레오티드 서열의 종결 코돈 전에 90개 뉴클레오티드 결실 후 얻은 뉴클레오티드 서열;

（c）직렬연결(tandem)의 SEQ ID No：8 또는 7과 같은 뉴클레오티드 서열.

8번째 측면에서, 본 발명은 매개체(vector)를 제시하였다. 이는 본 발명 7측면의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

9번째 측면에서, 본 발명은 본 발명의 7번째 측면의 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 8번째 측면의 매개체가 본 발명 첫 번째, 두 번째, 세 번째 및/또는 네 번째 측면의 방법 또는 응용(용도)에 활용되는 방안을 제시하였다. 즉, 본 발명의 첫 번째, 두 번째, 세 번째 및/또는 네 번째 측면의 방법 또는 응용 과정에서 본 발명의 7번째 측면에서 제시한 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 8번째 측면에서 제시한 매개체를 사용하였다.

열 번째 측면에서, 본 발명은 본 발명의 7번째 측면의 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명 8번째 측면의 매개체의 본 발명의 다섯 번째 측면의 세균을 화학적 제조하는 과정에서의 응용방안을 제시하였다. 즉, 본 발명의 다섯 번째 측면의 세균을 화학적 제조하는 과정에서 본 발명에서 제시한 본 발명 7번째 측면의 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명 8번째 측면에서 제시한 매개체를 사용하였다.

본 발명의 효과는 새로운 L-리신의 발효량 증가 방식을 발견하고 이를 증명하였다는 데 있으며, L-리신을 많이 생산하는 세균과 적게 생산하는 세균 모두에게 적용이 가능하고 기존의 개조된 L-리신 생산량이 많은 세균의 염색체 변위와도 충돌되지 않는다. 더불어 본 연구를 통해 생산량 향상 효과를 극대화 할 수 있고 실제로 세균발효에 의한 L-리신 생산에 사용되어 광범위 하게 응용될 수 있음을 발견하였다.

좀 더 명확한 이해를 위해 다음의 구체적인 실시사례를 통해 본 발명을 상세히 설명하였다. 이 설명은 예시적인 설명일 뿐이며 본 발명범위를 여기에 국한시키지 않는다. 본 설명서의 논술에 의거한 본 발명의 많은 변화는 해당 영역 기술자들에게 있어서 명백히 알 수 있는 내용이다.

이밖에, 본 발명은 공개적인 문헌을 인용하였으며, 이들 문헌은 본 발명을 상세히 설명하기 위해 사용되었다. 이들 모든 문헌 내용은 본 논문의 참고로 사용되었으며, 이 모든 내용은 본 논문에 그대로 다시 서술하는 방식으로 작성되었다.

실시예

다음 실시 예를 통해 본 발명의 내용을 더 심도 있게 설명하였다. 특별한 설명이 없는 경우 실시 예에 사용된 기술 수단은 본 영역 기술자가 알고 있는 일반적인 수단이자 시장에 판매되는 일반 기기 및 시약이다. <분자클론실험매뉴얼（3판）>（과학출판사), <미생물학실험（4판）>（고등교육출판사） 및 상응하는 기기와 시약의 업체 설명서 등을 참조.

실시예 1. 아코니트산수화 효소 교체 개시 코돈ATG는 GTG임.

추출한 야생형 대장균E. coli K12 W3110균주（일본기술평가연구소 바이오자원센터 (NITE Biological Resource Center, NBRC)에서 구입） 유전체를 주형으로 삼고, 프라이머 P1/P2 및 P3/P4를 각각 PCR확대를 시켜 길이가 각각 510 bp와 620 bp인 두 줄의 DNA조각（각각 Up1과 Down1조각으로 명명）을 얻는다. 이중, PCR은 다음의 방식으로 진행한다： 94 ℃ 에서 30 s（초）간 변성， 52 ℃ 에서 30 s（초）간 열을 식힘. 72 ℃ 에서 30 s（초）간 확대시킴. （30번 순환）. 이중, 프라이머(Primer)의 서열(sequence)은 다음과 같다.

P1: 5'-CGCGGATCCGGAGTCGTCACCATTATGCC-3'

P2: 5'-TCTCGTAGGGTTGACGACACAGCTCCTCCTTAATGACAGG-3'

P3: 5'-CCTGTCATTAAGGAGGAGCTGTGTCGTCAACCCTACGAGA-3'

P4: 5'-ATTGCGGCCGCTCCATTCACCGTCCTGCAAT-3'

상기 두 줄의 ＤＮＡ조각은 아가로스 겔 전기영동법 정제 후, 상기 두 줄의 ＤＮＡ조각을 혼합하여 주형으로 만든다. P1/P4를 프라이머 로 하고, Overlap PCR을 통해 약 1200 bp인 조각으로 확대시킨다. (Up-Down1조각이라 명명함). 이중, PCR은 다음의 방식으로 진행한다： 94 ℃ 에서 30 s（초）간 변성, 52 ℃ 에서 30 s（초）간 열을 식힘 및 72 ℃ 에서 60 s（초）간 확대시킴（30번 순환）.

아가로스 겔 전기영동법으로 정제된 Up-Down1과 pKOV플라스미드（ Addgene사에서 구입가능）를 각각 Bam HI/Not I를 효소 두 개로 자르고， 아가로스 겔 전기영동법으로 정제 후 연결시켜 도입에 사용되는 매개체 pKOV-Up-Down1을 얻는다. 또한 매개체 pKOV-Up-Down1을 서열 분석 회사에 보내 서열 분석감정을 받아 이것이 정확한 돌연변이 （A-G）의 acnA 유전자 조각을 갖고 있음을 확인하고 이를 저장 및 보관하였다.

구축된 pKOV-Up-Down1플라스미드를 각각 L-리신을 적게 생산하는 E. coli NRRL B-12185균주（미국 농업균종보존센터 （Agricultural Research Service Culture Collection；NRRL）에서 구입 가능. 구축방법은 US4346170A참조)와 L-리신 생산량이 많은 E. coli K12 W3110 Δ 3균주（중과원미생물연구소에서 구입 가능, E. coli K12 W3110돌연변이 유도 돌연변이를 통해 얻은 리신 생산공정균） 에 넣어 전기충격 형질전환을 시킨다 （서열 분석을 통해 이 두 균주 염색체에 야생형 acnA 유전자（즉, Genbank 등록번호 U00096.2 중의 1333855 ~ 1336530자리 및 상 및 하류영역 요소 확인）가 있음이 확인 되었으며, 30 ℃ 및 100 rpm상태에서 LB배양기에서 2시간 재생한 후， A ddgene사의 pKOV플라스미드의 제품 매뉴얼에 따라 상동 재조합 양성의 단일클론을 선택하였다. 서열 분석을 통해 염색체 상의 야생형 acnA 유전자의 개시 코돈이 ATG에서 GTG로 돌연변이 되었으며, 각각 acnA 개시코돈 돌연변이의 （/L-리신 생산량이 많은/적은）대장균을 얻었고 이는 각각 YP-13633과 YP-13664로 명명하였다. 얻은 두 개의 균주의 아코니트산수화 효소 표현량이 약 75 ~ 85%（배양기에 따라 약간의 차이가 있음）하락한 것으로 검측 되었다.

실시예 2. 아코니트산수화 효소 유전자 서열 돌연변이의 아코니트산수화 효소활성 저하.

（1）대장균 줄기의 구축

대장균acnA 유전자 종결 코돈 전의 90 bp염기를 결손시켜 아코니트산수화 효소활성을 낮춘다. 구체적으로 보면 추출한 야생형 대장균E. coli K12 W3110 유전체를 주형으로 하고, 프라이머 P5/P6 및 P7/P8에 대해 각각 PCR을 확대시켜 길이가 각각 752 bp와 657 bp인 두 줄의 DNA조각（각각 Up2와 Down2 조각으로 명명）을 얻는다. 이중, PCR은 다음의 방식으로 진행한다： 94 ℃ 에서 30 s（초）간 변성, 52 ℃ 에서 30 s（초）간 열을 식힘 및 72 ℃ 에서 30 s（초）간 확대시킴. （30번 순환）. 이중, 프라이머(Primer)의 서열(sequence)은 다음과 같다.

P5: 5'-CGCGGATCCCGTCACACGATCCGATACCT-3'

P6: 5'-CGGCAAGCAAATAGTTGTTATACGACTTCCTGGCTACCAT -3'

P7: 5'-ATGGTAGCCAGGAAGTCGTATAACAACTATTTGCTTGCCG-3'

P8: 5'-ATTGCGGCCGC CATGGGGCGATTTCCTGATG-3'

상기 두 줄의 ＤＮＡ조각을 아가로스 겔 전기영동법으로 정제한 후 상기 두 줄의 ＤＮＡ조각을 혼합하여 주형으로 만들고, P5/P8을 프라이머로 하여 Overlap PCR을 통해 약 1400 bp인 조각(Up-Down2 조각이라 명명함）으로 확대시킨다. 이중, PCR은 다음의 방식으로 진행한다： 94 ℃ 에서 30 s（초）간 변성, 52 ℃ 에서 30 s（초）간 열을 식힘 및 72 ℃ 에서 60 s（초）간 확대시킴. （30번 순환）.

아가로스 겔 전기영동법으로 정제한 후의 Up-Down2와 pKOV플라스미드（Addgene사에서 구매 가능）를 각각 Bam HI/Not I효소를 이용해를 효소 두 개로 자르고， 아가로스 겔 전기영동법으로 정제한 후 연결하여 도입에 사용된 매개체pKOV-Up-Down2를 얻는다. 또한 매개체pKOV-Up-Down2를 서열 분석회사에 보내 서열 분석감정을 한 결과 종결 코돈 전 90 bp염기를 결실한 acnA 유전자 조각을 함유하고 있음이 밝혀졌고, 이를 저장 및 보관하였다.

Addgene사의 pKOV플라스미드의 제품 매뉴얼에 따라, 구축된 pKOV-Up-Down2플라스미드를 각각 L-리신을 적게 생산하는 E. coli NRRL B-12185균주와(그 구축방법은 US4346170A를 참조)와 L-리신 생산량이 많은 E. coli K12 W3110 Δ 3균주（서열 분석을 통해 두 개의 균주 염색체에 야생형의 acnA 유전자 및 상/하류영역 요소가 존재함을 확인）에 넣어 전기충격 형질전환을 시켜 상동 재조합 양성의 단일클론을 선택하였다. 또한 서열 분석을 통해 그 염색체 상의 야생형 acnA 유전자의 종결코돈 전 90 bp염기가 결실되어 각각 acnA효소 활성이 저하된 （/L-리신 생산량이 많은/적은）대장균을 각각 YP-13675와 YP-13699라 명명하였다. 얻은 두 개의 균주의 아코니트산수화 효소 표현량이 약 60 ~ 80%（배양기에 따라 약간의 차이가 있음）하락한 것으로 검측 되었다.

（2）막대모양 간균（Corynebacterium）줄기의 구축

막대모양 간균 acn 유전자 종결 코돈 전 90 bp염기를 결실시켜 아코니트산수화 효소활성을 낮춘다. 구축과정은 기본적으로 상기 과정（1）과 같은 순서로 이루어 지며, 다른 점은 다음과 같다：베이징 코리네박테리움균AS1.299（Corynebacterium pekinense은 글루타민산 코리네박테리움균과 유사하며, 가끔 글루타민산 코리네박테리움균으로 오인되기도 함）（중국보통미생물균종보존관리센터（CGMCC）에서 구입가능） 게놈을 주형으로 하며, 다음 프라이머 P9 ~ P12는 각각 상기 프라이머 P4 ~ P8에 대응된다. 확대된 Up2조각은 542 bp이며, Down2조각은 527 bp， Up-Down2조각은 약 1069bp이다. 여기에 사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다.

P9: 5'-CGGGATCCTGCAGCTCAGTACTTGGAT-3'

P10: 5'-AAAGTCTTCTAATTAC TTACTGCGTCGAACTCGACG-3'

P11: 5'-GTTCGACGCAGTAAGTAATTAGAAGACTTTTGAT-3'

P12: 5'-TCCCCCGGGGAATACCGGGTCGGTGCG-3'

그 후, 아가로스 겔 전기영동법으로 정제한 후의 Up-Down2조각과 pK18mobsacB플라스미드（미국미생물보존센터（ATCC）에서 구입가능）를 각각 Bam HI/Sma I를 효소 두 개로 자르고， 아가로스 겔 전기영동법으로 정제한 후 연결하여 acn 유전자 종결코돈 전 의 90 bp염기를 결실한 재결합 매개체pK18mobsacB-Up-P-Down을 얻는다. 서열 분석 감정확인이 끝난 후, 구축된 pK18mobsacB-Up-Down2플라스미드를 각각 L-리신을 적게 생산하는 베이징 코리네박테리움균AS1.299균주, L-리신을 적게 생산하는 글루타민산 코리네박테리움균 （Corynebacterium glutamicum） ATCC 13032균주 （ATCC에서 구입가능）와 L-리신 생산량이 많은 베이징 코리네박테리움균 AS1.563 균주（중국보통미생물균종보존관리센터에서 구입가능）（후자 두 가지 서열 분석을 통해 염색체에 베이징 코리네박테리움균 AS1.299의 acn 유전자가 존재함이 확인 됐으며, 그 유전자의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO：2와 같다）에 넣어 전기충격 형질전환하고, 30 ℃ 및 120 rpm상태에서， BHIS배양기에서 2 h 재생한 후 상동 재조합 양성의 단일클론을 선택하였다. 서열 분석을 통해 정확함을 확인한 후 각각 acn 유전자돌연변이의 （/L-리신 생산량이 많은/적은）막대모양 간균을 얻고, 각각 YP-14808 , YP-14852 및 YP-14837이라 명명하였다.

실시예 3. 약한 복사활성의 프로모터로 아코니트산수화 효소 유전자의 프로모터 교체

（1）대장균 줄기의 구축

E. coli K12 W3110 중 acnA 상류영역 서열분석을 통해 우리는 약한 복사 프로모터 （서열은 SEQ ID No：3과 같다）를 제공하여 acnA 유전자ORF 상류영역 야생형 의 프로모터 영역 （서열은 SEQ ID No：4와 같다）을 교체하여 야생형 acnA 유전자의 강도를 약화시켰다.

구체적으로 보면 추출된 야생형 대장균E. coli K12 W3110 유전체를 주형으로 하고 프라이머 P13/P14 및 P15/P16으로 각각 PCR 확대를 실시하여 길이가 각각 580 bp와 618 bp인 두 줄의 DNA조각（각각 Up3과 Down3조각이라 명명함）을 얻었다. 상기 약한 복사 프로모터를 함유한 플라스미드를 주형으로 하고 P17/P18 PCR 확대를 실시하여 길이가 161 bp인 약한 복사 프로모터 조각（P조각이라 명명함）을 얻는다. 이중, PCR은 다음의 방식으로 진행한다： 94 ℃ 에서 30 s（초）간 변성, 52 ℃ 에서 30 s（초）간 열을 식힘 및 72 ℃ 에서 30 s（초）간 확대시킴. （30번 순환）.

상기 세 줄의 ＤＮＡ조각을 아가로스 겔 전기영동법으로 정제한 후, 상기 Up3과 P조각을 혼합하여 주형으로 만들고, P13/P18을 프라이머 로 하여 Overlap PCR을 통해 약 716 bp인 조각(Up-P조각이라 명명함）으로 확대한다. 이중, PCR은 다음의 방식으로 진행한다： 94 ℃ 변성 30s（초），52 ℃ 에서 30 s（초）간 열을 식힘 및 72 ℃ 에서 60 s（초）간 확대시킴. （30번 순환）.

아가로스 겔 전기영동법으로 정제한 후의 Up-P와 Down3조각을 주형으로 삼고, P13/P16을 프라이머 로 하여, Overlap PCR을 통해 약 1334 bp인 조각(Up-P-down조각이라 명명함）으로 확대한다. 이중, PCR은 다음의 방식으로 진행한다： 94 ℃ 에서 30 s（초）간 변성, 52 ℃ 에서 30 s（초）간 열을 식힘 및 72 ℃ 에서 60 s（초）간 확대시킴. （30번 순환）.

위에 사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다.

P13: 5'-CGCGGATCCGAAGAAATTGAGGTCATGTT -3'

P14: 5'- GGTTTCTTAGACGTCGGATTCGTTTCGTTTCTGTTTCATT-3'

P15: 5'- ATCAGCAGGACGCACTGACCCATTAAGGAGGAGCTATGTCG -3'

P16: 5'- ATTGCGGCCGCTCCATTCACCGTCCTGCAATT -3'

P17: 5'- AATGAAACAGAAACGAAACGCAATCCGACGTCTAAGAAACC -3'

P18: 5'- CGACATAGCTCCTCCTTAATGGGTCAGTGCGTCCTGCTGAT -3'

아가로스 겔 전기영동법으로 정제한 후의 Up-P-down조각과 pKOV플라스미드（Addgene사에서 구입가능）를 각각 Bam HI/Not I를 효소 두 개로 자르고， 아가로스 겔 전기영동법으로 정제한 후 연결하여 도입에 사용된 매개체pKOV-Up-P-Down을 얻는다. 그리고 매개체pKOV-Up-P-Down을 서열 분석 회사에 보내 서열 분석감정을 한 결과 정확한 약한 복사 프로모터 서열을 함유하고 있음이 밝혀졌고, 이를 저장 및 보관하였다.

구축된 pKOV-Up-P-Down플라스미드를 각각 L-리신을 적게 생산하는 E. coli NRRL B-12185균주와 L-리신 생산량이 많은 E. coli K12 W3110 Δ 3균주（서열 분석을 통해 두 개의 균주 염색체에 야생형의 acnA 유전자 및 상/하류영역 요소가 존재함을 확인)（그 상류영역 프로모터는 Genbank 등록번호 CP004009.1의 2102518 ~ 2102713자리임）에 넣어 전기충격 형질전환을 하고, 30 ℃ 및 100 rpm의 상태에서 LB배양기에서 2시간 재생한 후， A ddgene사의 pKOV플라스미드의 제품 매뉴얼에 따라 상동 재조합 양성의 단일클론을 선택하였다. 서열 분석을 통해 그 염색체 상의 야생형 acnA 유전자의 상류영역 프로모터가 약한 복사 프로모터로 교체되었음을 확인하고 각각 acnA프로모터돌연변이의 （/L-리신 생산량이 많은/적은）대장균을 얻어 각각 YP-13627과 YP-13682라 명명하였다. 검측을 통해 각기 다른 배양기에 있는 이 두 개의 균주의 아코니트산수화 효소의 표현량이 모두 65 ~ 80% 하락하였음을 알 수 있었다.

（2）막대모양 간균 줄기의 구축

막대모양 간균 중의 acn상류영역 서열분석을 통해 우리는 약한 복사 프로모터（서열은 SEQ ID No：5와 같다）를 제공하여 막대모양 간균acn 유전자 ORF 상류영역 166 bp의 야생형 프로모터 영역（서열은 SEQ ID No：6와 같다）을 교체하였다. 구축과정은 기본적으로 상기 과정（1）과 같은 순서를 따르며, 다른 점은 다음과 같다:

베이징 코리네박테리움균AS1.299（중국보통미생물균종보존관리센터에서 구입가능）의 게놈을 주형으로 하며, 다음 프라이머 P19~P24를 각각 상기 프라이머 P13~P18에 대응시킨다. 확대된 Up3조각은 573 bp， Down3조각은 581 bp， P조각은 130 bp， Up-P-down조각은 약 1284 bp로 한다. 여기에 사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다.

P19: 5'-CGGGATCCGCCAAAGCAACCAACCCC -3'

P20: 5'-CTTTTTAGTTTTCAACGGTCGGATTTGCTCGAAAT-3'

P21: 5"- GCCGAAAC AAAGTAGCCGAAGCAGACGCCGTCG -3'

P22: 5'-CGGAATTCTGACCTGGTGGACGATAC-3'

P23: 5'-CGAGCAAATCCGACCGTTGAAAACTAAAAAGCTGG-3'

P24: 5'-GCGTCTGCTTCGGCTACTTTGTTTCGGCCACCC-3'

그 후, 아가로스 겔 전기영동법으로 정제한 후의 Up-P-down조각과 pK18mobsacB플라스미드를 각각 Bam HI/Eco RI를 이용하여 효소 두 개로 자르고， 아가로스 겔 전기영동법으로 정제한 후 연결하여 프로모터 교체에 사용된 재결합 매개체pK18mobsacB-Up-P-Down을 얻는다. 서열 분석 감정확인이 끝난 후, 구축된 pK18mobsacB-Up-P-Down플라스미드를 각각 L-리신을 적게 생산하는 베이징 코리네박테리움균AS1.299균주, L-리신을 적게 생산하는 글루타민산 코리네박테리움균ATCC 13032균주와 L-리신 생산량이 많은 베이징 코리네박테리움균AS1.563균주（후자 두 가지 서열 분석을 통해 그 염색체에 베이징 코리네박테리움균AS1.299가 있는 acn 유전자 및 그 상/하류영역 요소가 남아 있음을 확인）에 넣어 전기충격 형질전환을 실시하고, 30 ℃ 및 120 rpm상태에서， BHIS배양기에서 2 h 재생한 후 상동 재조합 양성의 단일클론을 선택하였다. 서열 분석을 통해 정확함을 확인한 후 각각 acn프로모터돌연변이 의 （/L-리신 생산량이 많은/적은）막대모양 간균을 얻고 각각 YP-14755, YP-14732와 YP-14780이라 명명하였다.

실시예 4. 아코니트산수화 효소 유전자복사 억제 단백질 코드 유전자 a cnR 의 복사 수 첨가

acn복사 억제 단백질 코드 유전자 acnR의 복사 수를 늘려 acn 유전자의 복사 수준을 낮춘다. 구체적으로 보면 베이징 코리네박테리움균AS1.299의 게놈을 주형으로 하며, 프라이머 P25/P26 및 P27/P28에 각각 PCR 확대를 실시하여 길이가 각각 715 bp와 797 bp인 두 줄의 DNA조각（각각 Up4와 Down4조각이라 명명함）을 얻는다. 프라이머 P29/P30에 PCR 확대를 실시하여 길이가 567 bp의 acnR조각（ R조각이라 명명함. 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No：7과 같다）을 얻는다. 이밖에, 표현 플라스미드pXMJ19（Biovector Science Lab, Inc회사에서 구입가능）를 주형으로 하고 프라이머 P31/P32에 PCR확대를 실시하여 길이가 164 bp인 강한 프로모터P _tac （ P _tac 조각이라 명명함. 그 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No：8과 같다）를 얻는다. 이중, PCR은 다음의 방식으로 진행한다： 94 ℃ 에서 30 s（초）간 변성, 52 ℃ 에서 30 s（초）간 열을 식힘 및 72 ℃ 에서 30 s（초）간 확대시킴. （30번 순환）.

위에 사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다.

P25: 5'-CGGGATCCTTCGCAACCGATAGAGCA-3'

P26: 5'-CACGAATTATGCAGAATAAGCCTTTAAGTAACAA-3'

P27: 5'-TAAACGCGACTAAGCGTGACCATTAAAAGGCT-3'

P28: 5'-CGGAATTCAAAAGCCTATTAAGTGTC-3'

P29: 5'-TTCACACAGGAAAGTGTCCGTAGCGGCAGGCGA-3'

P30: 5'-TTTAATGGTCACGC TTAGTCGCGTTTACGGACAG-3'

P31: 5'-TTAAAGGCTTATTCTGCATAATTCGTGTCGCTC-3'

P32: 5'-GCCGCTACGGACACTTTCCTGTGTGAAATTGTTA-3'

아가로스 겔 전기영동법으로 정제한 후의 R조각과 P _tac 조각을 혼합하여 주형으로 만들고, P31/P30을 프라이머 로 하여 Overlap PCR을 통해 약 731 bp인 조각(P _tac -R조각이라 명명함)으로 확대시킨다. 아가로스 겔 전기영동법으로 정제한 후의 Up4와 P _tac -R조각을 혼합하여 주형으로 만들고, P25/P30을 프라이머 로 하여 Overlap PCR을 통해 약 1446 bp인 조각(Up4-P _tac -R조각이라 명명함)을 얻는다. 아가로스 겔 전기영동법으로 정제한 후의 Up4-P _tac -R과 Down4조각을 혼합하여 주형으로 만들고, P25/P28을 프라이머 로 하여 Overlap PCR을 통해 약 2243 bp인 조각(Up-P _tac -R-Down조각이라 명명함）으로 확대시킨다. 이중, PCR은 다음의 방식으로 진행한다： 94 ℃ 에서 30 s（초）간 변성, 52 ℃ 에서 30 s（초）간 열을 식힘 및 72 ℃ 에서 60 s（초）간 확대시킴. （30번 순환）.

그 후, 아가로스 겔 전기영동법으로 정제한 후의 Up-P _tac -R-Down과 pK18mobsacB 플라스미드를 각각 Bam HI/Eco RI를 이용하여 효소 두 개로 자르고， 아가로스 겔 전기영동법으로 정제한 후 연결하여 염색체의 비 코드 영역 포인트에 별도의 복사된 acnR을 삽입하는 데 사용되는 재결합 매개체pK18mobsacB-Up-P _tac -R-Down을 얻는다. 더불어 매개체pK18mobsacB-Up-P _tac -R-Down을 서열 분석회사에 보내 서열 분석감정을 한 결과 P _tac -acnR 유전자 조각을 함유하고 있음이 밝혀졌고, 이를 저장 및 보관하였다.

구축된 pK18mobsacB-Up-P _tac -R-Down플라스미드를 각각 L-리신을 적게 생산하는 베이징 코리네박테리움균AS1.299균주, L-리신을 적게 생산하는 글루타민산 코리네박테리움균ATCC 13032균주와 L-리신 생산량이 많은 베이징 코리네박테리움균AS1.563균주에 넣어 전기충격 형질전환 시킨다. 30 ℃ 및 120 rpm， BHIS배양기에서 2 h 재생한 후 상동 재조합 양성의 단일클론을 선택하였다. 서열 분석을 통해 정확함을 확인한 후 각각 염색체의 비 코드 영역 포인트에 별도의 복사된 acnR 유전자의 （/L-리신 생산량이 많은/적은）막대모양 간균을 얻으며, 각각 YP-14857, YP-14896과 YP-14860이라 명명하였다.

실시예 5. L- 리신발효실험

E. coli의 발효를 위해, 하기 표 1의 종자 배양기(seed medium) 25 mL를 각각 실시예 1 내지 3에서 구축된 E. coli K12 W3110 Δ 3균주, E. coli NRRL B-12185균주 및 E. coli균주에 접종시키고 37 ℃ 및 220 rpm으로 9 h 배양시킨다. 그 후, 하기 표 1의 발효 배양기(fermentation medium) 25 mL를 1 mL의 상기 종자 배양기 배양물에 접종시키고 37 ℃ 및 220 rpm으로 48 h 배양시킨다 배양이 완료되면 HPLC를 통해 l-리신의 발생을 측정한다.

E. coli 배양기 배합법

	종자 배양기 배합법	발효배양기 배합법
（성분）	（g/L）	（g/L）
포도당	15	40
황산암모늄	4	10
인산이수소칼륨	3	1.6
황산마그네슘 7수화물	0.4	1
황산철(Ⅱ)	0.01	0.03
망간 설페이트 모노하이드레이트	0.01	0.03
효모 추출액	2.0	4.0
탄산칼슘		25
KOH	pH 7.0	pH 7.0
L-타이로신		0.1
L-메티오닌		0.5
L-트레오닌		0.1
L-이소류신		0.05

막대모양 간균의 발효를 위해, 하기 표 2의 종자 배양기 30 mL를 각각 실시예 2 내지 4에서 구축된 막대모양 간균AS1.299균주, ATCC13032균주 및 AS1.563균주에 접종시키고 30 ℃ 및 220 rpm으로 8 h 배양시킨다. 그 후, 하기 표 2의 발효 배양기 30 mL를 1 mL의 상기 종자 배양기 배양물에 접종시키고 30 ℃ 및 220 rpm으로 48 h 배양시킨다. 배양이 완료되면 HPLC를 통해 L-리신의 발생을 측정한다.

막대모양 간균(Corynebacterium) 배양기 배합법

	종자 배양기 배합법	발효배양기 배합법
（성분）	（g/L）	（g/L）
포도당	20	40
황산암모늄	5	20
인산이수소칼륨	1	1.6
황산마그네슘 7수화물	0.7	0.8
황산철(Ⅱ)	0.01	0.01
망간 설페이트 모노하이드레이트	0.01	0.01
효모 추출액	5.0	4.0
탄산칼륨		20
KOH	pH 7.0	pH 7.0

하기 표 3에서 보여지는 결과와 같이 대장균이건 막대모양 간균이건 상응하는 균주의 아코니트산수화 효소 자체구조에 돌연변이 （예: 결실 또는 교체）를 실시하여 이 효소의 활성을 낮추거나 상응하는 균주의 아코니트산수화 효소 유전자의 조절요소를 개조（예: 교체와 삽입）하여 이 효소의 표현량을 낮추면 모두 L-리신 생산량 향상에 도움이 된다.

각종 균주의 L-리신 생산량

균주	L-리신 생산량（g/L）	생산량 향상 비율（%）
E. coli NRRL B-12185	1.5	-
YP-13633	2.1	40
YP-13675	1.8	20
YP-13627	2.0	33
E. coli K12 W3110 Δ3	10.2	-
YP-13664	16.1	57.8
YP-13699	12.5	22.5
YP-13682	14.1	38.2
막대모양 간균AS1.299	1.2	-
YP-14808	1.6	33
YP-14755	1.9	58
YP-14857	1.4	17
막대모양 간균ATCC 13032	1.1	-
YP-14852	1.5	36
YP-14732	2.0	82
YP-14896	1.3	18
막대모양 간균AS1.563	23.5	-
YP-14837	27.4	16.6
YP-14780	31.2	32.8
YP-14860	25.6	8.9

<110> NINGXIA EPPEN BIOTECH CO.,LTD. <120> L-LYSINE GENERATION METHOD BY FERMENTING BACTERIA HAVING MODIFIED ACONITASE GENE AND/OR REGULATORY ELEMENT <130> P1440001C <150> CN 201310050196.0 <151> 2013-02-08 <150> CN 201310050144.3 <151> 2013-02-08 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2676 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atgtcgtcaa ccctacgaga agccagtaag gacacgttgc aggccaaaga taaaacttac 60 cactactaca gcctgccgct tgctgctaaa tcactgggcg atatcacccg tctacccaag 120 tcactcaaag ttttgctcga aaacctgctg cgctggcagg atggtaactc ggttaccgaa 180 gaggatatcc acgcgctggc aggatggctg aaaaatgccc atgctgaccg tgaaattgcc 240 taccgcccgg caagggtgct gatgcaggac tttaccggcg tacctgccgt tgttgatctg 300 gcggcaatgc gcgaagcggt taaacgcctc ggcggcgata ctgcaaaggt taacccgctc 360 tcaccggtcg acctggtcat tgaccactcg gtgaccgtcg atcgttttgg tgatgatgag 420 gcatttgaag aaaacgtacg cctggaaatg gagcgcaacc acgaacgtta tgtgttcctg 480 aaatggggaa agcaagcgtt cagtcggttt agcgtcgtgc cgccaggcac aggcatttgc 540 catcaggtta acctcgaata tctcggcaaa gcagtgtgga gtgaattgca ggacggtgaa 600 tggattgctt atccggatac actcgttggt actgactcgc acaccaccat gatcaacggc 660 cttggcgtgc tggggtgggg cgttggtggg atcgaagcag aagccgcaat gttaggccag 720 ccggtttcca tgcttatccc ggatgtagtg ggcttcaaac ttaccggaaa attacgtgaa 780 ggtattaccg ccacagacct ggttctcact gttacccaaa tgctgcgcaa acatggcgtg 840 gtggggaaat tcgtcgaatt ttatggtgat ggtctggatt cactaccgtt ggcggatcgc 900 gccaccattg ccaatatgtc gccagaatat ggtgccacct gtggcttctt cccaatcgat 960 gctgtaaccc tcgattacat gcgtttaagc gggcgcagcg aagatcaggt cgagttggtc 1020 gaaaaatatg ccaaagcgca gggcatgtgg cgtaacccgg gcgatgaacc aatttttacc 1080 agtacgttag aactggatat gaatgacgtt gaagcgagcc tggcagggcc taaacgccca 1140 caggatcgcg ttgcactgcc cgatgtacca aaagcatttg ccgccagtaa cgaactggaa 1200 gtgaatgcca cgcataaaga tcgccagccg gtcgattatg ttatgaacgg acatcagtat 1260 cagttacctg atggcgctgt ggtcattgct gcgataacct cgtgcaccaa cacctctaac 1320 ccaagtgtgc tgatggccgc aggcttgctg gcgaaaaaag ccgtaactct gggcctcaag 1380 cggcaaccat gggtcaaagc gtcgctggca ccgggttcga aagtcgtttc tgattatctg 1440 gcaaaagcga aactgacacc gtatctcgac gaactggggt ttaaccttgt gggatacggt 1500 tgtaccacct gtattggtaa ctctgggccg ctgcccgatc ctatcgaaac ggcaatcaaa 1560 aaaagcgatt taaccgtcgg tgcggtgctg tccggcaacc gtaactttga aggccgtatc 1620 catccgctgg ttaaaactaa ctggctggcc tcgccgccgc tggtggttgc ctatgcgctg 1680 gcgggaaata tgaatatcaa cctggcttct gagcctatcg gccatgatcg caaaggcgat 1740 ccggtttatc tgaaagatat ctggccatcg gcacaagaaa ttgcccgtgc ggtagaacaa 1800 gtctccacag aaatgttccg caaagagtac gcagaagttt ttgaaggcac agcagagtgg 1860 aagggaatta acgtcacacg atccgatacc tacggttggc aggaggactc aacctatatt 1920 cgcttatcgc ctttctttga tgaaatgcag gcaacaccag caccagtgga agatattcac 1980 ggtgcgcgga tcctcgcaat gctgggggat tcagtcacca ctgaccatat ctctccggcg 2040 ggcagtatta agcccgacag cccagcgggt cgatatctac aaggtcgggg tgttgagcga 2100 aaagacttta actcctacgg ttcgcggcgt ggtaaccatg aagtgatgat gcgcggcacc 2160 ttcgccaata ttcgcatccg taatgaaatg gtgcctggcg ttgaaggggg gatgacgcgg 2220 catttacctg acagcgacgt agtctctatt tatgatgctg cgatgcgcta taagcaggag 2280 caaacgccgc tggcggtgat tgccgggaaa gagtatggat caggctccag tcgtgactgg 2340 gcggcaaaag gtccgcgtct gcttggtatt cgtgtggtga ttgccgaatc gtttgaacga 2400 attcaccgtt cgaatttaat tggcatgggc atcctgccgc tggaatttcc gcaaggcgta 2460 acgcgtaaaa cgttagggct aaccggggaa gagaagattg atattggcga tctgcaaaac 2520 ctacaacccg gcgcgacggt tccggtgacg cttacgcgcg cggatggtag ccaggaagtc 2580 gtaccctgcc gttgtcgtat cgacaccgcg acggagttga cctactacca gaacgacggc 2640 attttgcatt atgtcattcg taatatgttg aagtaa 2676 <210> 2 <211> 2832 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 ttggagctca ctgtgactga aagcaagaac tccttcaatg ctaagagcac ccttgaagtt 60 ggcgacaagt cctatgacta cttcgccctc tctgcagtgc ctggcatgga gaagctgccg 120 tactccctca aggttctcgg agagaacctt cttcgtaccg aagacggcgc aaacatcacc 180 aacgagcaca ttgaggctat cgccaactgg gatgcatctt ccgatccaag catcgaaatc 240 cagttcaccc cagcccgtgt tctcatgcag gacttcaccg gtgtcccttg tgtagttgac 300 ctcgcaacca tgcgtgaggc agttgctgca ctcggtggcg accctaacga cgtcaaccca 360 ctgaacccag 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ctccatccct gcaacccgca tggttaacga aggtggcgga 1260 cagcctgaag gcggcgtcga agctgacaac tacaacgctt cctgggctgg ctccggcgag 1320 tccttggcta ctggcgcaga aggacgtcct tccaagccag tcaccgttgc atccccacag 1380 ggtggcgagt acaccatcga ccacggcatg gttgcaattg catccatcac ctcttgcacc 1440 aacacctcta acccatccgt gatgatcggc gctggcctga tcgcacgtaa ggcagcagaa 1500 aagggcctca agtccaagcc ttgggttaag accatctgtg caccaggttc ccaggttgtc 1560 gacggctact accagcgcgc agacctctgg aaggaccttg aggccatggg cttctacctc 1620 tccggcttcg gctgcaccac ctgtattggt aactccggcc cactgccaga ggaaatctcc 1680 gctgcgatca acgagcacga cctgaccgca accgcagttt tgtccggtaa ccgtaacttc 1740 gagggacgta tctcccctga cgttaagatg aactacctgg catccccaat catggtcatt 1800 gcttacgcaa tcgctggcac catggacttc gacttcgaga acgaagctct tggacaggac 1860 caggacggca acgacgtctt cctgaaggac atctggcctt ccaccgagga aatcgaagac 1920 accatccagc aggcaatctc ccgtgagctt tacgaagctg actacgcaga tgtcttcaag 1980 ggtgacaagc agtggcagga actcgatgtt cctaccggtg acaccttcga gtgggacgag 2040 aactccacct acatccgcaa 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cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc 60 acgaggccct ttcgtcttca cctcgagtcc ctatcagtga tagagatgga catccctatc 120 agtgatagag atactgagca catcagcagg acgcactgac c 161 <210> 4 <211> 454 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 4 ggaatgttcc gtcgttattc cagacgactg gcaactaaca tcgcagcagc aagcctttat 60 agaactgttt gctgaagatg atcagccgaa acaataatta tcatcattct tattacccat 120 ttttaatgaa ttaaagggct tttaatacac cgcagcaata acagcttgag ttatctcaac 180 acaaaataat aaccgttaag ggtgtagcct atgatcaaca caaatatgaa atattggtcc 240 tggatgggcg cgttttctct gtcgatgctc ttctgggccg aactcctctg gatcattact 300 cactgatcct tgaccccgct gcggcggggt tgtcatttgc tttgccacaa ggtttctcct 360 cttttatcaa tttgggttgt tatcaaatcg ttacgcgatg tttgtgttat ctttaatatt 420 caccctgaag agaatcaggg cttcgcaacc ctgt 454 <210> 5 <211> 130 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 5 ccgttgaaaa ctaaaaagct gggaaggtga atcgaatttc ggggctttaa agcaaaaatg 60 aacagcttgg tctatagtgg ctaggtaccc tttttgtttt ggacacatgt agggtggccg 120 aaacaaagta 130 <210> 6 <211> 166 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DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 8 ctgcataatt cgtgtcgctc aaggcgcact cccgttctgg ataatgtttt ttgcgccgac 60 atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg acaattaatc atcggctcgt 120 ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaa 164

Claims

（1） L-리신 생산 세균으로 생산된 아코니트산수화 효소의 효소 활성 및/또는 표현량을 저하시키지만 사라지지는 않게 하는 상기 L-리신 생산 세균의 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자 및/또는 조절요소를 개조하는 단계; 및
（2） 상기 세균의 발효에 의해 L-리신을 생산하는 단계를 포함하고,
상기 아코니트산수화 효소 유전자 및/또는 조절요소를 개조하는 단계는 L-리신 생산 대장균(Escherichia coli)의 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자의 핵산 서열 SEQ ID No:1의 개시 코돈 ATG를 GTG로 치환하는 단계를 포함하는
발효에 의한 L-리신 생산 방법, 또는 L-리신의 발효량 향상 방법.
（1） L-리신 생산 세균으로 생산된 아코니트산수화 효소의 효소 활성 및/또는 표현량을 저하시키지만 사라지지는 않게 하는 상기 L-리신 생산 세균의 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자 및/또는 조절요소를 개조하는 단계; 및
（2） 상기 세균의 발효에 의해 L-리신을 생산하는 단계를 포함하고,
상기 아코니트산수화 효소 유전자 및/또는 조절요소를 개조하는 단계는 L-리신 생산 대장균(Escherichia coli)의 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자의 프로모터 핵산 서열 SEQ ID No:4를 뉴클레오티드 서열 SEQ ID No:3으로 치환하는 단계를 포함하는
발효에 의한 L-리신 생산 방법, 또는 L-리신의 발효량 향상 방법.
（1） L-리신 생산 세균으로 생산된 아코니트산수화 효소의 효소 활성 및/또는 표현량을 저하시키지만 사라지지는 않게 하는 상기 L-리신 생산 세균의 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자 및/또는 조절요소를 개조하는 단계; 및
（2） 상기 세균의 발효에 의해 L-리신을 생산하는 단계를 포함하고,
상기 아코니트산수화 효소 유전자 및/또는 조절요소를 개조하는 단계는 L-리신 생산 글루타민산 코리네박테리움균(Corynebacterium glutamicum) 또는 L-리신 생산 베이징 코리네박테리움균(Corynebacterium pekinense)의 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자의 프로모터 핵산 서열 SEQ ID No:6을 뉴클레오티드 서열 SEQ ID No:5로 치환하는 단계를 포함하는
발효에 의한 L-리신 생산 방법, 또는 L-리신의 발효량 향상 방법.
（1） L-리신 생산 세균으로 생산된 아코니트산수화 효소의 효소 활성 및/또는 표현량을 저하시키지만 사라지지는 않게 하는 상기 L-리신 생산 세균의 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자 및/또는 조절요소를 개조하는 단계; 및
（2） 상기 세균의 발효에 의해 L-리신을 생산하는 단계를 포함하고,
상기 아코니트산수화 효소 유전자 및/또는 조절요소를 개조하는 단계는 L-리신 생산 대장균(Escherichia coli)의 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자의 핵산 서열 SEQ ID No:1에서 코드 2584-2673을 결실하는 단계를 포함하는
발효에 의한 L-리신 생산 방법, 또는 L-리신의 발효량 향상 방법.
（1） L-리신 생산 세균으로 생산된 아코니트산수화 효소의 효소 활성 및/또는 표현량을 저하시키지만 사라지지는 않게 하는 상기 L-리신 생산 세균의 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자 및/또는 조절요소를 개조하는 단계; 및
（2） 상기 세균의 발효에 의해 L-리신을 생산하는 단계를 포함하고,
상기 아코니트산수화 효소 유전자 및/또는 조절요소를 개조하는 단계는 L-리신 생산 글루타민산 코리네박테리움균(Corynebacterium glutamicum), 또는 L-리신 생산 베이징 코리네박테리움균(Corynebacterium pekinense)의 염색체 상의 아코니트산수화 효소 유전자의 핵산 서열 SEQ ID No:2에서 코드 2740-2829를 결실하는 단계를 포함하는
발효에 의한 L-리신 생산 방법, 또는 L-리신의 발효량 향상 방법.
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