JPH09508011A - 非調節スレオニンデヒドラターゼを用いて組換え微生物によるｌ−イソロイシンの生成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、Ｌ- イソロイシンの微生物による生成方法に関する。更に、試験管内に存在するスレオニンデヒドラターゼ遺伝子中で酵素のアロステリックドメインをコードする遺伝子領域中で突然変異することによって、１種又はそれ以上の塩基を交換するが、その際酵素のアロステリックドメインのアミノ酸配列中のアミノ酸少なくとも１個を、酵素がＬ- イソロイシンによってもはやフィードバック阻害されない様に別のアミノ酸に置き換える。更にコリネバクテリウムグルタミクムから得られるスレオニンデヒドラターゼの試験管内に存在する遺伝子中で、酵素のアロステリックドメインをコードする遺伝子領域の外側と内側の両方及び外側で塩基交換することによって正確なアミノ酸交換を酵素のアミノ酸配列中で行い、それによってスレオニン又はＬ- イソロイシンを産生する宿主細胞中でこの様に突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の形質転換後、これが繰り返しＬ- イソロイシンを生じる。

Description

【発明の詳細な説明】 非調節スレオニンデヒドラターゼを用いて組換え微生物によるＬ- イソ ロイシンの生成方法 本発明は請求の範囲１ないし１０によるＬ- イソロイシンの微生物による生成 方法、請求の範囲１１ないし１３によるスレオニンデヒドラターゼ遺伝子、請求 の範囲１４による遺伝子構造、請求の範囲１５及び１６によるベクター、並びに 請求の範囲１７ないし２３による形質転換された細胞に関する。 アミノ酸Ｌ- イソロイシンは、ヒト及び動物にとって必須である。これはダイ エットに係る食料品中に及び医療目的の種々の栄養食品の成分としてすでに使用 されている。更にＬ- イソロイシンは添加物として又は試剤として医薬及び化学 工業で使用される。 Ｌ- イソロイシンの生成に関して、このアミノ酸発酵培地中に分泌する微生物 を使用する。その際Ｌ- イソロイシンの生成は図１に記載されたバイオ合成法に よって行われる。図１に例示されている様に、Ｌ- イソロイシンのバイオ合成で 鍵酵素、すなわちアスパルトキナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ及びスレオ ニンデヒドラターゼがある。アスパルトキナーゼ及びホモセリンデヒドロゲナー ゼの活性は、同様にＬ- イソロイシンのバイオ合成の範囲内で生成されるアミノ 酸Ｌ- スレオニンによってフィードバック阻害される。一方Ｌ- イソロイシン合 成に対して特定の基鍵素スレオニンデヒドラターゼは、バイオ合成工程の最終生 成物Ｌ- イソロイシンによってフィードバック阻害される。 Ｌ- イソロイシン生成の増加のために、Ｌ- イソロイシン- 産生の突然変異体 て何度も調べられている。 この様な突然変異体の産生のために主に生体内で突然変異生成を行う、すなわ ち突然変異原を全ゲノム上に作用させる。アミノ酸同族体に耐性である点でこの 様な突然変異微生物が選択され、その上述の鍵酵素はフィードバック阻害をもは や受けない。 したがってたとえばα- アミノブチラート又はイソロイシンヒドロキサマート に対して耐性である突然変異が米国特許第４３２９４２７号明細書に記載されて いる。それによれば微生物は増加されたＬ- イソロイシンを産生するが、どの酵 素がフィードバック阻害されないか不明瞭である。 米国特許第４，４４２，２０８号及び第４，６０１，９８３号明細書中に、生 を単離することができ、α- アミノヒドロキシバレリアン酸に対する耐性を促進 することが開示されている。コリネバクテリウム(Corynebacterium)- 又はブレ ビバクテリウム(Brevibacterium)- 株にこのフラグメントを感染させた後、これ は増加されたＬ- イソロイシンを産生する。 過剰合成によって更にフィードバック調節された鍵酵素は繰り返しＬ- イソロ イシンを生成することができるという方法も記載されている（たとえばドイツ特 許出願公開第３９４２９４７号公報、ヨーロッパ特許公開第０１３７３４８号公 報参照）。 全体としてＬ- イソロイシン生成の従来すべての方法に於ては、突然変異がむ しろ偶発的にフィードバック阻害をもはや受けない非調節鍵酵素を生じ、そのた めにアミノ酸合成を増加することが共通することである。 本発明の課題は、限定された突然変異によってＬ- イソロイシンバイオ合成の イシンによってもはや行われない様に適切に変化させることによってＬ- イソロ イシンの微生物による生成方法をもたらすことである。 本発明に於て主となる課題は、１種又はそれ以上の塩基を、試験管内に存在す るスレオニンデヒドラターゼ遺伝子中で酵素のアロステリックドメインをコード する遺伝子領域中で突然変異することによって次の様に交換することで解決され る。すなわち酵素のアロステリックドメインのアミノ酸配列中のアミノ酸少なく とも１個を、酵素がＬ- イソロイシンによってもはやフィードバック阻害されな い様に別のアミノ酸に代えることである。ここで“試験管内に存在する遺伝子” なる表現は、スレオニンデヒドラターゼ遺伝子が突然変異生成前にクローン化、 すなわち単離され、ベクター中に組み込まれることを意味する。塩基交換による 突然変異生成の実施は、公知の方法に従って、たとえばＩｔｏ等の方法(Gene 10 2(1991)60 −70)に従って行われる。スレオニン又はＬ- イソロイシンを産 生する宿主細胞中でこの様に突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の形 質転換後、これが繰り返しＬ- イソロイシンを生じる。 原則的にクローン化された又は試験管内に存在するスレオニンデヒドラターゼ 遺伝子は任意のバクテリアから由来する。コリネバクテリウムグルタミクム(glu tamicum)が“古典的な”アミノ酸産生物に属しているので、遺伝子はこの微生物 から、特にＡＴＣＣ１３０３２株から導かれる。このコリネバクテリウムグルタ ミクム- 株からのスレオニンデヒドラターゼ遺伝子のＤＮＡ- 配列はすでに公知 である(Mockel等、J．Bacteriol．174(1992)8065−8072)。酵素のアロステリッ クドメインをコードする遺伝子領域中で塩基交換後、たとえば表１ないし３に示 したＤＮＡ- 配列が得られる。表中、酵素のアロステリックドメインをコードす る遺伝子領域は下線が引かれ、塩基交換の位置は更に下線によって目立たせた。 突然変異生成の実施の後に、試験管内で突然変異した遺伝子をプラスミド中に 組み込む。このプラスミド中でスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の発現が誘発さ れる。プラスミドとしてたとえばｐＶＣ１９又はｐＫＫ２２３−３(Amman等、Ge ne 25，167)が適する。適するプラスミド中に突然変異した遺伝子を組み込んだ 後、これを適当な菌株に形質転換する。 突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子を有するプラスミドも実際上含 有する様なクローンを得るために、所望の形質転換細胞をアミノ酸同族体の耐性 に関して通常の方法に従って単離する。この際同族体としてはたとえばβ- メチ ルノルロイシン、イソロイシンヒドロキサマート又はヒドロキシイソロイシンが 挙げられる。 しかし、変化されたスレオニンデヒドラターゼ遺伝子を微生物中で形質転換し 、そのアセトヒドロキシ酸合成- 活性がＬ- バリンによって阻害されることによ って簡単かつ適切な単離は達成される。形質転換細胞として、たとえば大腸菌Ｋ １２- 株、好ましくは株ＪＭ１０９又はＤＨ５が適する。次いで形質転換細胞を 固形培地上に取り、この培地はスレオニンデヒドラターゼを阻害するＬ- イソロ イシンを、アセトヒドロキシ酸合成によるケトブチラートの物質代謝を阻害する Ｌ- バリン(Umbarger：Escherichla Coli and Salmonella typhimuroum，１( 1987)352-367)を含有する。培地に更にスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の誘発 のための物質及びデヒドラターゼに対する基質としてのＬ- スレオニンを添加す るのが好ましい。スレオニンデヒドラターゼ遺伝子の誘発のための物質としては ＩＰＴＧ（イソプロピル-β-チオガラクトピラノサイド）を使用するのが好まし い。その結果として変化したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子にベクター中でＩ ＰＴＧ- 誘発可能なプロモーターが連結される。非調節スレオニンデヒドラター ゼを含有するこの様なクローンはＬ- スレオニンを阻害することなくケトブチラ ートに変換する。アセトヒドロキシ酸合成によるケトブチラートの別の変換は添 加されるＬ- バリンによって阻害されるので、ケトブチラートが蓄積する。この ことは非調節スレオニンデヒドラターゼを含有するクローンがケトブチラートの 公知の毒性によって(LaRossa及びSchloss，J．Biol．Chem.259(1984)8752-8757) より一層悪い増殖を行うという事実を有する。より一層悪い増殖とはより小さい クローンの形成、より半透明のコロニー又は亀裂のあるコロニー辺縁を有するコ ロニーの形成として現われる。これらのコロニーは容易に採集され、したがって 非調節デヒドラターゼを有するクローンを容易に単離することができる。 この単離法は、クローン化されたスレオニンデヒドラターゼ遺伝子を含有する 形質転換細胞に於ても当然使用することができる。上記遺伝子は、対応する酵素 がもはやフィードバック阻害を受けない様に塩基交換と異なる突然変異法によっ て変化されている。 上記課題を解決するための本発明による別の方法は、コリネバクテリウムグル タミクムから得られる試験管内に存在するスレオニンデヒドラターゼの遺伝子中 で、酵素のアロステリックドメインをコードする遺伝子領域の外側で塩基交換す ることによって、酵素のアミノ酸配列の位置２５７のアミノ酸アラニンをアミノ 酸グリシン（表４）に又は酵素のアミノ酸配列の位置１９９のアミノ酸メチオニ ンをアミノ酸バリンに（表５）置き換えることにある。それによってスレオニン 又はＬ- イソロイシンを産生する宿主細胞中でこの様に突然変異したスレオニン デヒドラターゼ遺伝子の形質転換後、これが繰り返しＬ- イソロイシンを生じる 。 本発明の課題を解決するためのまた別の方法は、コリネバクテリウムグルタミ クムから得られるスレオニンデヒドラターゼ遺伝子中で、酵素のアロステリック ドメインをコードする遺伝子領域の外側で塩基交換することによって酵素のアミ ノ酸配列の位置２７８のアミノ酸ヒスチジンをアミノ酸アルギニンに及び酵素の アロステリックドメインをコードする遺伝子領域の内側で酵素のアミノ酸配列の 位置３５１のアミノ酸ロイシンをアミノ酸セリンに置き換える（表６）ことにあ る。それによってスレオニン又はＬ- イソロイシンを産生する宿主細胞中でこの 様に突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の形質転換後、これが繰り返 しＬ- イソロイシンを生じる。 突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の形質転換に対する宿主細胞と して又は産生株としてコリネバクテリウムグルタミウム及び特に寄託されたＤＳ Ｍ- 株８８９０が適する。形質転換に対する野性型として、たとえばＤＳＭでナ ンバー８８８９及び８８９１の寄託株が得られる。この株は増加したＬ- イソロ イシンを発酵培地中に分泌する。産生株又は形質転換に対する宿主細胞として、 まだＬ- イソロイシンによって調節された野性型- スレオニンデヒドラターゼを もはや合成しないものを使用するのも有益である。その結果として細胞中で非調 節されたスレオニンデヒドラーゼがＬ- スレオニンの変換を触媒するにほかなら ない。 実施例： １．もはやフィードバック阻害を受けない、突然変異した酵素の生成 １．１ 所望の酵素の選択 ムの原株の調節されたスレオニンデヒドラターゼをコードする(Mockel等、 Molecular Cloning，A Laboratory Handbook，1989，Cold Spring Harbour Labo ratory Press)に従って単離する。次いで制限酵素ＥｃｏＲ１で消化し、１５７ ３塩基対サイズ、スレオニンデヒドラターゼ遺伝子を含有するフラグメントを単 離する。このフラグメントを公知のベクターｐＵＣ１９のＥｃｏＲ１切断部位(V ieira 及びMessing，Gene 19(1976)259-268)中に連結し、それによっ てプラスミドｐＢＭ２０が得られる（図２）。これ中でＣ．グルタミクムからの ＪＭ１０９中でイソプロピル -Ｄ- チオガラクトピラノサイドによって誘発され うる原ベクターｐＵＣ１９のｌａｃＺプロモターのコントロール下に存在する。 スレオニンデヒドラターゼのアロステリックドメイン中に指示されていない突 然変異を伝達するために、公知方法の別々の処理で２つのＤＮＡ- プライマーを 合成する： ５'-プライマーは、スレオニンデヒドラターゼ遺伝子中でＮｃｏｌ- 切断部位 （下線）に類似する。３'-ブライマーは出発ベクターｐＵＣ１９のマルチプル- クローニング部位のＨｉｎｄIII認識部位（下線）に類似する。 ２つのプライマーを用いて、ポリメラーゼ- 鎖反応を実施する(Tindall及びKu nkel，Biochemistry 27(1988)6008-6013)。この際Ｔａｇポリメラーゼの非特異 性反応(Leung等、Technique １(1989)11-15)によって、突然変異を含有する新し いＤＮＡ- フラグメントが生じる。反応混合物は、最終容量１００μｌ中に２μ ｌ５'-プライマー（２５μｇ／ｍｌ）、２０μｌ３'-プライマー（２５μｇ／ｍ ｌ）、１ｍｇ鋳型（ｐＢＭ２０）、１００μＭ ＡＴＰ、１００μＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ，１０μｌ Ｔａｑ １０×緩衝液（１００ｍＭトリス、１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５００ｍＭ ＫＣｌ、ゼラチン（ｍｇ／ｍＬｐＨ８．３）、０．５ Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／ｎｌ）、０．５ｍＭ ＭｎＣｌ₂を含有する。 反応条件として、時間遅延ファイル(Time Delay File)９４℃（３分）、熱循環 ファイル(Thermo Cycle File)９４℃（１分）、５５℃（２分）、７２℃（３分 ）、浸透ファイル(Soak File)４℃、セグメントエクステンション１０秒を３０ 循環数で調製する。反応の後、ＤＮＡ- フラグメントを精製し、(Sambrook等、M olecular Cloning，A Laboratory Handbook，1989，Cold Spring Harbour Labor atory Press)、ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し、ｐＢＭ２０で連結し、これ から前もって対応する７４３塩基対ＮｃｏＩ- ＨｉｎｄIII- フラグメントを切断する。このフラグメントは原株- スレオニンデヒドラターゼ のアロステリッドメインに対して暗号化されている。 転換し(Hanahan，Technigues for Transformation of Coli(1985)DNAcloning、 第１巻、第109-136頁、IRL 0xford)、次いで約１００００のプラスミドを含有す るクローンがLuria-Bertani 培地(Lennox，Virology １(1955) る。もはやフィードバック阻害しないスレオニンデヒドラターゼに対して暗号化 されたクローンを同定するために、Luria-Bertani培地を調製する。この培地は 更にスレオニンデヒドラターゼの基質として４０ｍＭ Ｌ- スレオニン、並びに スレオニンデヒドラターゼ遺伝子のｌａｃＺ条件つき発現を誘発するために１ｍ Ｍイソプロピル -β- Ｄ- チオガラクトピラノサイドを含有する。知られている 様に、Luria-Bertani培地は大腸菌中でアセトヒドロキシ酸合成活性の阻害に十 分なＬ- バリンをすでに含有する(Umbarger，Biosynthesis of branched-Chain amino acids(1987)Escherichia coli and Salmonella typhimurium Vol 1,第352 -367頁、American Society for Microbiology，ワシントン DC)これによってこ こに示した方法で可能な限り高いα- ケトブチラートの蓄積が得られる。スレオ ニン及びイソプロピル -β- Ｄ- チオガラクトピラノサイドを含有するLuria-Be rtani培地と共に、イソプロピル -β- Ｄ- チオガラクトピラノシド不含の同一 培地を調製する。そこでスレオニンデヒドラターゼの誘発は行われない トする。その後、イソプロピル -β- Ｄ- チオガラクトピラノサイドを含有する 培地上で６０の変則的に増殖したコロニーを同定する。これはより僅か増殖、又 はより淡色のコロニー又は亀裂のあるコロニー辺縁の点で優れているが、イソプ ロピル -β- Ｄ- チオガラクトピラノサイド不含コントロール培地上で正常に増 殖する。このクローンは個々に同一の反復テスト(Nachtest)に付し、最後に最も 際立った増殖遅れのクローンのうちの６つはこれらを含有するスレオニンデヒド ラターゼの調節を確認するための生化学テストに付す。 １．２ 酵素の阻害の確認 大腸菌ＪＭ１０９の得られた組換えクローン６つを、ＬＢ液体培地１００ｍｌ でインキュベートする。光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）を追跡し、ＯＤ０．５の達 成と同時にイソプロピル -β- Ｄ- チオガラクトピラノサイドを最終濃度ＯＤ０ ．５で添加する。もう１時間３７℃でインキュベーションした後、細胞を遠心分 離によって集め、緩衝液ｐＨ７．０（０．１Ｍリン酸カリウム、０．５ｍＭ Ｌ - イソロイシン、０．２ｍＭリン酸ピリドキサール）で１回洗滌し、同一緩衝液 中に取り、Branson-Sonifier Ｗ２５０中で超音波処理して（３分、２０％の間 隔で拍動、出力２）分解する。細胞破片を分離するために、ホモジナートを１０ 分間１３０００ＵｐＭ及び４℃でSigma冷却遠心分離機中で遠心分離し、その後 生じた澄明上澄液（粗抽出物）をスレオニンデヒドラターゼ活性及び−調節の測 定のための酵素テストに使用する。 酵素テストは０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ８．２）０．８ｍｌ、１ｍＭピリ ドオキザルホスフアート、４０ｍＭ Ｌ- スレオニン及び粗抽出物の最終容量で 行われる。混合物を３０℃でインキュベートし、試料２００μｌを０〜３０分後 に取り出す。スレオニンデヒドラターゼ反応を、夫々試剤１ｍｌの添加によって 終了する。これは水１００ｍｌ中にセミカルバシド１ｇと酢酸ナトリウム０．９ ｇを有する。３０℃１５分のインキュベーション後、水３ｍｌを加え、吸光を２ ５４ｎｍでツァイス(Zeiss)スペクトルフォトメーターＰＭ６で測定する。コン トロール及び０〜１．５μｍｏｌケトブチラートの標準値を同様に処理し、検量 線から具体的に酵素テストで生じるスレオニンデヒドラターゼにより得られるケ トブチラート量を算出する。平行して同一の試みを実施するが、これはスレオニ ンデヒドラターゼの阻害に関する試験のために５ｍＭ Ｌ- イソロイシンを含有 する。この測定と無関係に、(Bradford，Anal Biochem72(1976(248-254)に記載 されている様に粗抽出物のたん白質含有量を測定する。得られた比活性及び阻害 の度合は、表７から明らかである。 突然変異した酵素３８及び１４は、夫々Ｌ- イソロイシンによるアロステリッ ク阻害がないことを明らかに示す。突然変異３１の酵素は、Ｌ- イソロイシンの 存在下でまだ３０％残存活性を示し、これに対して野性型の酵素はこの条件下で ほんの１５％残存活性を有するにすぎない。 １．３ 酵素の突然変異種類の確認 生成された酵素中で突然変異を測定するために、スレオニンデヒドラターゼに 関して暗号化されたプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９クローンから標準法に従って 単離する。スレオニンデヒドラターゼ遺伝子の突然変異領域の配列は、Sanger等 によるジデスオキシヌクレオチド- 終結法(Sanger等、Proceedings of the Nati onal Academy of Sciences，米国(1977)5463-5467)によって行われる。プライマ ーとして蛍光標識された配列特異的ヌクレオチドをファルマシア(Pharmacia)の 対応する確実な指示に従って生成する(Pharmacia，Uppsala、スウェーデン)。こ のプライマーを１００ｍＭ酢酸トリメチルアミンｐＨ７．０中で５−３０％アセ トニトリルの勾配を有する高圧液体クロマトグラフィーによって及びPharmacia SuperPac^RPep-S,５μｍによって精製する。プライマーを標準- 配列化反応中で 使用し、A.L.F．Sequencer(Pharmacia，Uppsala，スウェー デン）で蛍光検出による反応生成物の電気泳動の間及び自動的に検出し、生じる 配列を記録する。 配列化に使用されるプライマー。塩基の位置は、Mockel等、J Bacteriol 174( 1992)8065-8072による図３の配列に関連する。 これによって確認された個々のスレオニンデヒドラターゼ遺伝子配列を公知の 野性型遺伝子(Mockel等、J Bacteriol 174(1992)8065-8072)と比較する。生化学 的に確認されたスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の個々の塩基交換を表８に示す 。変化されたコドンを対応するアミセノ酸中に普遍的な遺伝子暗号を用いて に二重突然変異があり、これは酵素中で数種のアミノ酸交換が所望の非調節表現 型を生じうることも示す。 ２．非調節酵素によるイソロイシン分離の確認 得られた対立遺伝子を大腸菌／Ｃ．グルタミクムシャトルベクターを再クロー ンし、これをＣ．グルタミクム中で発現することができる。 これに先ず大腸菌／Ｃ．グルタミクムシャトルベクターｐＫＷＯを公知のクロ ーン化法(Sambrook等、Molecular Cloning，A Laboratory Handbook，1989，Col d Spring Harbour Laboratory Press)に従って製造する。生じるベクターを図３ に示す。大きさ９．５ｋｂであり、（ｉ）Ｃ．グルタクムレプリコンｐＧＡ２(S onnen，Molekulargenetische Charakterisierung von Phagen-Beziehungenbei c oryneformen Aminosaure-Produzenten，Dissertation，Technische クリン耐性(Ishiwa 及びShibahara，Jpn J Genet 60(1985)485-498)及び（iv） ｐＢＴＩ−１からｃｏｓ- 部位（ベーリンガー・マンハイム）を含有する。ｉＩ ｖＡ対立遺伝子１４．６及び１８並びに野性型対立遺伝子を１．１で製造された ｐＢＭ２０誘導体からＥｃｏＲＩ- フラグメントとして単離し、ＥｃｏＲＩで収 縮されたベクターｐＫＷＯを連結し、ｐＫＷＯｉＩｖＡ、ｐＫＷＯｉＩｖＡ１４ 、ｐＫＷＯｉＩｖＡ１６、及びｐＫＷＯｉｌｖＡ３８を生じる。このプラスミド を用いてエレクトロポレーション(Liedl et al.，FEMS Microbiol Lett 65(1985 )299-304)によってスレオニン産生ＭＨ２０−２２Ｂ：ｐＳＵＲ５−ＤＲ１(Rein scheid et al.，App; Env Microbiol(1994)、in press)を形質転換する。ＭＨ２ ０−２２Ｂは、微生物に関するドイツ寄託機関にナンバーＤＳＭ６８７０で寄託 されている。更にＭＨ２０−２２Ｂ：ｐＳＵＲ５−ＤＲ−（ＤＳＭ８８９０）及 びＭＨ２０−２２Ｂ：ｐＳＵＲ５−ＤＲＩ ｐＫＷＯｉｌｖＡ１６は ＤＳＭ８８８９である。これらの菌株を最小培地ＣＧＸＩＩ中で文献(Keilhauer 等、J Bacteriol 175(1993)5595-5603)に記載されている様に培養し、７２時間 のインキュベーション後培養培地中に蓄積されたアミノ酸を測定する。表９から Ｌ- イソロイシン生成の明らかな増加が突然変異対立遺伝子によって生じる。 他の実験で、野性型対立遺伝子及び突然変異体３８を高いコピーペンデル(Pen del)ベクターｐＥＣＭ３(A．Schater，Diplomarbeit，1991，Bielefeld大学)中 に組み込む。フラグメントを更に１．１で製造されたｐＢＭ２０誘導体からＥｃ ｏＲＩ- フラグメントとして単離し、ＥｃｏＲＩで収縮されたベクターに連結し 、ｐＥＣＭ３ｉｌｖＡ及びｐＥＣＭ３ｉｌｖＡ３８を生じる。このプラスミドを 用いてエレクトロポレーション(Liebl et al.，FEMS Microbiol Lett 65(1985)2 99-304)によってスレニオン産生ＭＨ２０−２２Ｂ：．ｐＳＵＲ５−ＤＲ１(Rein scheid et al.，Appl Env Microbiol(1994)，in press)を形質転換する。ＭＨ２ ０−２２Ｂは、微生物に関するドイツ寄託機関にナンバーＤＳＭ６８７０で寄託 されている。更にＭＨ２０−２２Ｂ：：ｐＳＵＲ５−ＤＲ−（ＤＳＭ８８９０） 及びＭＨ２０−２２Ｂ：：ｐＳＵＲ５−ＤＲＩ ｐＫＷＯｉｌｖＡ１６はＤＳＭ ８８８９及びＭＨ２０−２２Ｂ：：ｐＳＵＲ５−ＤＲＩ ｐＥＣＭ３ｉｌｖＡ３ ８はＤＳＭ８８９１である。これらの菌株をＭＨ２０−２２Ｂ- 最小培地中で文 献(Schrumpf et al．Appl Microbiol Biotechnol 37(1992)566- 571)に記載されている様に培養し、７２時間のインキュベーション後培養培地中 に蓄積されたアミノ酸を測定する。表１０からＬ- イソロイシン生成の明らかな 増加が夫々の突然変異対立遺伝子によって生じる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 エッゲリング・ロタール ドイツ連邦共和国、デー−52428 ユーリ ッヒ、エルゼンカムプ、６ (72)発明者 ザーム・ヘルマン ドイツ連邦共和国、デー−52428 ユーリ ッヒ、ヴェンデリヌスストラーセ、71

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｌ- イソロイシンの微生物による生成方法に於て、試験管内に存在する─Ｌ - イソロイシンの微生物による合成に鍵酵素として関与する─スレオニンデヒド ラターゼ遺伝子中で酵素のアロステリックドメインをコードする遺伝子領域中で 突然変異することによって、１種又はそれ以上の塩基を交換するが、 その際酵素のアロステリックドメインのアミノ酸配列中のアミノ酸少なくとも １個を、酵素がＬ- イソロイシンによってもはやフィードバック阻害されない様 に別のアミノ酸に置き換え、それによってスレオニン又はＬ- イソロイシンを産 生する宿主細胞中でこの様に突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の形 質転換後、これが繰り返しＬ- イソロイシンを生じることを特徴とする、上記方 法。 ２．突然変異生成に関して試験管内に存在するスレオニンデヒドラターゼ遺伝子 が、コリネバクテリウムグルタミクムから由来する、請求の範囲１記載の方法。 ３．クローンを非調節の、すなわちＬ- イソロイシンによるフィードハック阻害 を受けないスレオニンデヒドラターゼを用いて単離し、突然変異によって変化さ れたスレオニンデヒドラターゼ遺伝子を微生物中で形質転換し、そのアセトヒド ロキシ酸合成- 活性をＬ- バリンによって阻害することができ、それによってＬ - イソロイシン及びＬ- バリンを含有する固形培地中上で形質転換体の増殖後、 調節されたスレオニンデヒドラターゼを含有するクローンが、ケトブチラートの 蓄積によってひき起される、変化した形態学を有するコロニーの採取して得られ る、請求の範囲１又は２記載の方法。 ４．培地が更にスレオニンデヒドラターゼ遺伝子を誘発するための物質を含有す る、請求の範囲３記載の方法。 ５．物質がスレオニンデヒドラターゼ遺伝子ＩＰＴＧを誘発するための物質であ る、請求の範囲４記載の方法。 ６．培地が更にＬ- スレオニンデヒドラターゼをスレオニンデヒドラターゼの基 質として含有する、請求の範囲３ないし５のいずれかに記載の方法。 ７．突然変異によって変化されたスレオニンデヒドラターゼ遺伝子を大腸菌Ｋ１ ２によって形質転換する、請求の範囲３ないし６のいずれかに記載の方法。 ８．Ｌ- イソロイシンの微生物による生成方法に於て、コリネバクテリウムグル タミクムから得られる試験管内に存在する─Ｌ- イソロイシンの微生物による合 成で鍵酵素として関与する─スレオニンデヒドラターゼ遺伝子中で、酵素のアロ ステリックドメインをコードする遺伝子領域の外側で塩基交換することによって 、酵素のアミノ酸配列の位置２５７のアミノ酸アラニンをアミノ酸グリシン（表 ４）に又は酵素のアミノ酸配列の位置１９９のアミノ酸メチオニンをアミノ酸バ リンに（表５）置き換え、それによってスレオニン又はＬ- イソロイシンを産生 する宿主細胞中でこの様に突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の形質 転換後、これが繰り返しＬ- イソロイシンを生じることを特徴とする上記方法。 ９．Ｌ- イソロイシンの微生物による生成方法に於て、コリネバクテリウムグリ タミクムから得られる─Ｌ- イソロイシンの微生物による合成で鍵酵素として関 与する─スレオニンデヒドラターゼ遺伝子中で、酵素のアロステリックドメイン をコードする遺伝子領域の外側で塩基交換することによって酵素のアミノ酸配列 の位置２７８のアミノ酸ヒスチジンをアミノ酸アルギニンに及び酵素のアロステ リックドメインに対して暗号化された遺伝子領域の内側で酵素のアミノ酸配列の 位置３５１のアミノ酸ロイシンをアミノ酸セリンに置き換え（表６）、それによ ってスレオニン又はＬ- イソロイシンを産生する宿主細胞中でこの様に突然変異 したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の形質転換後、これが繰り返しＬ- イソロ イシンを生じることを特徴とする上記方法。 10．突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の形質転換に対する宿主細胞 がコリネバクテリウムグルタミクムである、請求の範囲１〜９のいずれかに記載 の方法。 11．１種又はそれ以上の塩基交換によって任意に変化されたスレオニンデヒドラ ターゼのアロステリックドメインに対して暗号化された遺伝子領域を有する、ス レオニンデヒドラクターゼ。 12．表１ないし３のいずれかのＤＮＡ- 配列を有し、その表１ないし３はこの請 求の範囲の構成要素である、請求の範囲１１記載のスレオニンデヒドラクター ゼ。 14．請求の範囲１１ないし１３のいずれかに記載の遺伝子を含有する、遺伝子構 造。 15．請求の範囲１４記載の遺伝子構造を有するベクター。 16．遺伝子に前もって連結された、ＩＰＴＧによって誘発されたプロモターを有 する、請求の範囲１５記載のベクター。 17．請求の範囲１４記載の遺伝子構造を有する形質転換された細胞。 18．請求の範囲１５記載のベクターを有する形質転換された細胞。 19．請求の範囲１６記載のベクターを有する形質転換された細胞。 20．Ｌ- バリンによって阻害可能なアセトヒドロキシ酸合成酵素- 活性を有する 、請求の範囲１８又は１９記載の形質転換された細胞。 21．大腸菌Ｋ１２である、請求の範囲２０記載の形質転換された細胞。 22．コリネバクテリウムグルタミクムである、請求の範囲１７又は１８記載の形 質転換された細胞。 23．野性型- スレオニンデヒドラターゼをもはや合成しない、請求の範囲１７， １８又は２２記載の形質転換された細胞。