CN114540335A - 固定化经修饰的苏氨酸转醛酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了固定化经修饰的苏氨酸转醛酶及其催化合成3‑苯基‑L‑丝氨酸及其衍生物的应用。固定化酶相比自由酶而言提高了产品的纯度，降低了酶的使用成本以及后续反应的纯化成本。

Description

固定化经修饰的苏氨酸转醛酶及其应用

技术领域

本发明涉及酶工程及固定化酶领域。具体而言，本发明涉及固定化经修饰的苏氨酸转醛酶催化合成3-苯基-L-丝氨酸及其衍生物的应用。

背景技术

3-苯基-L-丝氨酸及其衍生物，其结构通式如下所示：

3-苯基-L-丝氨酸及其衍生物是一类很重要的有机合成中间体，其广泛应用于药物合成中。比如：(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸是合成兽药氟苯尼考跟甲砜霉素的关键中间体，(2S,3R)-对硝基苯丝氨酸可作为抗菌药物氯霉素的关键中间体。另外，3-苯基-L-丝氨酸及其衍生物还可以通过简单的转化制备手性氮杂环丙烷(David Tanner,ChiralAziridines-Their Synthesis and Use in Stereoselective Transformations,Angew.Chem.,Int.Ed.Engl.,33,599(1994))，其广泛应用于手性药物的合成。目前3-苯基-L-丝氨酸衍生物主要是通过有机合成制备，此类方法往往存在步骤多，收率低，立体选择性差等缺点。

生物工作者对此类化合物的制备也做了一些尝试，例如Steinreiber等人(Johannes Steinreiber et al.,Threonine aldolases—an emerging tool fororganic synthesis,Tetrahedron,63,918-926(2007))利用苯甲醛衍生物与甘氨酸在醛缩酶的作用下合成3-苯基-L-丝氨酸衍生物，其反应式如下所示：

目前此方法还是存在转化率低、立体选择性差、产品的分离纯化难度大等缺陷，不具备产业化的条件。因此探索一种温和、高效、经济的方法制备此类化合物受到了广大化学生物工作者的关注。

中国专利申请CN109836362A公开了利用苏氨酸转醛酶(LTTA)催化对甲砜基苯甲醛和L-苏氨酸反应得到(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸。

WO2020135000A进一步公开了，LTTA可以催化苯甲醛或其衍生物和L-苏氨酸反应生成3-苯基-L-丝氨酸或其衍生物和乙醛，反应通式如式I所示：

通过此方法，整个3-苯基-L-丝氨酸或其衍生物的制备、提纯工艺操作简单、条件温和、大幅度降低了固体废弃物和生产的成本。然而，此方法的酶的用量仍然较大，成本较高。因此，本领域仍然需要提供能回收套用的固定化酶催化剂来降低成本。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种固定化酶法催化合成3-苯基-L-丝氨酸及其衍生物的方法。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种固定化酶催化剂，该固定化酶催化剂包括树脂以及共价结合在所述树脂上的酶；所述酶为苏氨酸转醛酶或者苏氨酸转醛酶和乙醛还原酶的组合或者苏氨酸转醛酶、乙醛还原酶和辅酶再生酶的组合；

进一步地，所述树脂为活化的带有氨基的树脂，活化剂优选戊二醛溶液。

进一步地，戊二醛溶液的浓度为1％-2％。

进一步地，苏氨酸转醛酶和乙醛还原酶的组合或者苏氨酸转醛酶、乙醛还原酶和辅酶再生酶的组合被同时共价固定到一种树脂上。

进一步地，所述辅酶再生酶选自：醇脱氢酶、甲酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶中的一种或多种。

进一步地，所述苏氨酸转醛酶来源于Pseudomonas fluorescens，乙醛还原酶来源于Escherichia coli，醇脱氢酶来自于Rhodococcus ruber，葡萄糖脱氢酶来源于Bacillussubtilis，甲酸脱氢酶来自于Candida boidinii。

本发明还发现，可以对苏氨酸转醛酶进行定点突变，突变后的7β-羟基甾体脱氢酶在树脂上的负载量以及负载牢固度得到大幅提升；

进一步地，所述固定化酶催化剂反应30次后仍然保持70％以上的反应活性。

进一步地，所述突变发生在苏氨酸转醛酶第424个氨基酸位置；

进一步地，所述突变体为N424K，上述突变后的苏氨酸转醛酶具有SEQ ID No.6的氨基酸序列。

进一步地，酶蛋白与树脂质量比为1:15到1:8。

根据本发明的另一个方面，提供了一种合成3-苯基-L-丝氨酸及其衍生物的方法，其特征在于使用了如前所述的固定化酶催化剂，所述反应步骤如下：

其中，R选自：氢基、烷基、烷氧基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、烷基硫基、磺酸基、亚磺酸基、巯基、硝基和卤素；

n为0、1、2或3；

其中：

“烷基”是指直链或支链的在链中具有1至20个碳原子的脂肪族烃基。优选的烷基在链中具有1至12个碳原子，更优选的是本文所定义的低级烷基。“支链的”是指一个或多个低级烷基，例如甲基、乙基或丙基连接到线性烷基链上。“低级烷基”是指链中可以是直链或支链的1至4个碳原子。

“烷氧基”是指烷基-O-基团，其中烷基如本文所述。示例性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、z-丙氧基、正丁氧基和庚氧基等。

“烷基磺酰基”是指烷基-SO₂-基团，其中烷基如上所定义。示例性的基团是其中烷基是低级烷基的那些。

“烷基亚磺酰基”是指烷基-SO-基团，其中烷基如上定义。示例性的基团是其中烷基是低级烷基的那些。

“烷基硫基”是指烷基-S-基团，其中烷基如本文所述。示例性的烷硫基包括甲硫基、乙硫基、z-丙硫基和庚硫基。

应用本发明的技术方案，通过将酶高效地固定于树脂上，避免了在反应液中残留宿主核酸和蛋白，提高了产品纯度，降低了生产成本。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1：固定化酶催化剂的制备

如无特别说明，本发明中使用的实验方法均为常规方法。

i)试剂和仪器：

对甲砜基苯甲醛购自阿拉丁，货号M185093，纯度98％；

L-苏氨酸购自麦克林，货号C10393311，分析纯；

磷酸吡哆醛购自阿拉丁，货号P136795，纯度≥98％；

氯化镁购自阿拉丁，货号A2006034，分析纯；

氧化型烟酰胺腺嘌呤双核苷酸(NAD)购自阿拉丁，货号N196974，纯度95％。

LX-1000NH购自蓝晓科技。

ii)载体和菌株：所使用的表达载体为pET-30a(+)，质粒购自Novagen公司，所使用的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)，购自天根生化科技(北京)有限公司。

测序、引物合成和基因合成由苏州泓迅生物科技股份有限公司完成。其中基因合成后，构建到载体pET-30a中。

iv)定点突变：

设计特异性引物对，在所需突变的氨基酸位置对应碱基引入所需的取代。用提取的突变前质粒(包含野生型苏氨酸转醛酶编码序列，pET-30a(+)骨架)为模版，利用Packer和Liu描述的方法制备突变体(Methods for the directed evolution of proteins.NatRev Genet,2015,16(7):379-394)。

定点突变的突变策略见表1：

酶编号	突变	突变策略
			SEQ ID No.1	无	无
SEQ ID No.5	N424K	第424个氨基酸由N变为K

表1

v)蛋白表达及酶液的制备：

将用含有目的基因的质粒转化的大肠杆菌细胞接种至含有50mg/L的卡那霉素的LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0)中，37℃震荡温育过夜。将培养物转接至TB液体培养基(蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油4mL/L，磷酸二氢钾2.31g/L，磷酸氢二钾12.54g/L)中，37℃震荡温育至OD600达到0.6-0.8，加入IPTG(终浓度为0.4mM)在30℃温育过夜以诱导蛋白质表达。

温育后，将培养物以4,000g在4℃离心10min，弃上清，收集大肠杆菌细胞。将收集的大肠杆菌细胞重悬于预冷的20mL pH 7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中，在4℃超声破碎大肠杆菌细胞。细胞破碎液以6,000g在4℃离心15min去除沉淀，得到的上清为含有重组酶的酶液，用于催化反应。也可以将酶液冷冻干燥成酶粉，保存于4℃备用。

vi)固定化酶制备

将氨基树脂LX-1000NH预先用2％戊二醛溶液活化过夜，用水清洗干净。

将含1g苏氨酸转醛酶(SEQ ID No.1或突变体SEQ ID No.6)，1g乙醛还原酶(SEQID No.2)和1g葡萄糖脱氢酶(SEQ ID No.3)的蛋白溶液与30g树脂LX-1000NH混合，30度搅拌18h。固定结束后过滤固定化酶，用水清洗三次，保存于4℃备用。使用甲酸脱氢酶(SEQ IDNo.4)再生辅酶的反应中，把葡萄糖脱氢酶替换成相应的酶进行固定化后反应。固定化反应后，活性自由酶被固定在树脂上，而酶粉中带有的残留宿主蛋白和核酸则无法被树脂固定，随之被清洗掉。反应产物见表2：

固定化酶编号	树脂	酶1	酶2	酶3
					Immob-NH-01	LX-1000NH	SEQ ID No.1	SEQ ID No.2	SEQ ID No.3
Immob-NH-02	LX-1000NH	SEQ ID No.1	SEQ ID No.2	SEQ ID No.4
					Immob-NH-03	LX-1000NH	SEQ ID No.5	SEQ ID No.2	SEQ ID No.3

表2

实施例2：固定化酶制备(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸

对甲砜基苯甲醛50g/L，L-苏氨酸42g/L，氯化镁1g/L，磷酸吡哆醛0.15g/L，辅底物(具体量见表2)，100mM磷酸缓冲液(pH7.0)加热至30℃磁力搅拌均匀，加入实施例1制备的固定化酶，开始搅拌反应，反应24小时取样HPLC检测转化率(首次)，套用30次后检测转化率(结果见表3)。

表3

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖南引航生物科技有限公司

<120> 固定化经修饰的苏氨酸转醛酶及其应用

<130> 2020

<141> 2020-11-25

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 440

<212> PRT

<213> Pseudomonas fluorescens

<400> 1

Met Ser Asn Val Lys Gln Gln Thr Ala Gln Ile Val Asp Trp Leu Ser

1 5 10 15

Ser Thr Leu Gly Lys Asp His Gln Tyr Arg Glu Asp Ser Leu Ser Leu

20 25 30

Thr Ala Asn Glu Asn Tyr Pro Ser Ala Leu Val Arg Leu Thr Ser Gly

35 40 45

Ser Thr Ala Gly Ala Phe Tyr His Cys Ser Phe Pro Phe Glu Val Pro

50 55 60

Ala Gly Glu Trp His Phe Pro Glu Pro Gly His Met Asn Ala Ile Ala

65 70 75 80

Asp Gln Val Arg Asp Leu Gly Lys Thr Leu Ile Gly Ala Gln Ala Phe

85 90 95

Asp Trp Arg Pro Asn Gly Gly Ser Thr Ala Glu Gln Ala Leu Met Leu

100 105 110

Ala Ala Cys Lys Pro Gly Glu Gly Phe Val His Phe Ala His Arg Asp

115 120 125

Gly Gly His Phe Ala Leu Glu Ser Leu Ala Gln Lys Met Gly Ile Glu

130 135 140

Ile Phe His Leu Pro Val Asn Pro Thr Ser Leu Leu Ile Asp Val Ala

145 150 155 160

Lys Leu Asp Glu Met Val Arg Arg Asn Pro His Ile Arg Ile Val Ile

165 170 175

Leu Asp Gln Ser Phe Lys Leu Arg Trp Gln Pro Leu Ala Glu Ile Arg

180 185 190

Ser Val Leu Pro Asp Ser Cys Thr Leu Thr Tyr Asp Met Ser His Asp

195 200 205

Gly Gly Leu Ile Met Gly Gly Val Phe Asp Ser Pro Leu Ser Cys Gly

210 215 220

Ala Asp Ile Val His Gly Asn Thr His Lys Thr Ile Pro Gly Pro Gln

225 230 235 240

Lys Gly Tyr Ile Gly Phe Lys Ser Ala Gln His Pro Leu Leu Val Asp

245 250 255

Thr Ser Leu Trp Val Cys Pro His Leu Gln Ser Asn Cys His Ala Glu

260 265 270

Gln Leu Pro Pro Met Trp Val Ala Phe Lys Glu Met Glu Leu Phe Gly

275 280 285

Arg Asp Tyr Ala Ala Gln Ile Val Ser Asn Ala Lys Thr Leu Ala Arg

290 295 300

His Leu His Glu Leu Gly Leu Asp Val Thr Gly Glu Ser Phe Gly Phe

305 310 315 320

Thr Gln Thr His Gln Val His Phe Ala Val Gly Asp Leu Gln Lys Ala

325 330 335

Leu Asp Leu Cys Val Asn Ser Leu His Ala Gly Gly Ile Arg Ser Thr

340 345 350

Asn Ile Glu Ile Pro Gly Lys Pro Gly Val His Gly Ile Arg Leu Gly

355 360 365

Val Gln Ala Met Thr Arg Arg Gly Met Lys Glu Lys Asp Phe Glu Val

370 375 380

Val Ala Arg Phe Ile Ala Asp Leu Tyr Phe Lys Lys Thr Glu Pro Ala

385 390 395 400

Lys Val Ala Gln Gln Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ala Phe Pro Leu Ala

405 410 415

Pro Leu Ala Tyr Ser Phe Asp Asn Tyr Leu Asp Glu Glu Leu Leu Ala

420 425 430

Ala Val Tyr Gln Gly Ala Gln Arg

435 440

<210> 2

<211> 336

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 2

Met Lys Ala Ala Val Val Thr Lys Asp His His Val Asp Val Thr Tyr

1 5 10 15

Lys Thr Leu Arg Ser Leu Lys His Gly Glu Ala Leu Leu Lys Met Glu

20 25 30

Cys Cys Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Val Lys Asn Gly Asp Phe

35 40 45

Gly Asp Lys Thr Gly Val Ile Leu Gly His Glu Gly Ile Gly Val Val

50 55 60

Ala Glu Val Gly Pro Gly Val Thr Ser Leu Lys Pro Gly Asp Arg Ala

65 70 75 80

Ser Val Ala Trp Phe Tyr Glu Gly Cys Gly His Cys Glu Tyr Cys Asn

85 90 95

Ser Gly Asn Glu Thr Leu Cys Arg Ser Val Lys Asn Ala Gly Tyr Ser

100 105 110

Val Asp Gly Gly Met Ala Glu Glu Cys Ile Val Val Ala Asp Tyr Ala

115 120 125

Val Lys Val Pro Asp Gly Leu Asp Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ile Thr

130 135 140

Cys Ala Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Lys Leu Ser Lys Ile Arg

145 150 155 160

Pro Gly Gln Trp Ile Ala Ile Tyr Gly Leu Gly Gly Leu Gly Asn Leu

165 170 175

Ala Leu Gln Tyr Ala Lys Asn Val Phe Asn Ala Lys Val Ile Ala Ile

180 185 190

Asp Val Asn Asp Glu Gln Leu Lys Leu Ala Thr Glu Met Gly Ala Asp

195 200 205

Leu Ala Ile Asn Ser His Thr Glu Asp Ala Ala Lys Ile Val Gln Glu

210 215 220

Lys Thr Gly Gly Ala His Ala Ala Val Val Thr Ala Val Ala Lys Ala

225 230 235 240

Ala Phe Asn Ser Ala Val Asp Ala Val Arg Ala Gly Gly Arg Val Val

245 250 255

Ala Val Gly Leu Pro Pro Glu Ser Met Ser Leu Asp Ile Pro Arg Leu

260 265 270

Val Leu Asp Gly Ile Glu Val Val Gly Ser Leu Val Gly Thr Arg Gln

275 280 285

Asp Leu Thr Glu Ala Phe Gln Phe Ala Ala Glu Gly Lys Val Val Pro

290 295 300

Lys Val Ala Leu Arg Pro Leu Ala Asp Ile Asn Thr Ile Phe Thr Glu

305 310 315 320

Met Glu Glu Gly Lys Ile Arg Gly Arg Met Val Ile Asp Phe Arg His

325 330 335

<210> 3

<211> 261

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 3

Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ala

1 5 10 15

Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu Val

35 40 45

Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln Gly

50 55 60

Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Ile

65 70 75 80

Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Val Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Glu

85 90 95

Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp Lys Val

100 105 110

Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile

115 120 125

Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser

130 135 140

Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala

145 150 155 160

Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr

165 170 175

Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn

180 185 190

Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala Asp

195 200 205

Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile

210 215 220

Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val Thr

225 230 235 240

Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro Ser Phe

245 250 255

Gln Ala Gly Arg Gly

260

<210> 4

<211> 364

<212> PRT

<213> Candida boidinii

<400> 4

Met Lys Ile Val Leu Val Leu Tyr Asp Ala Gly Lys His Ala Ala Asp

1 5 10 15

Glu Glu Lys Leu Tyr Gly Cys Thr Glu Asn Lys Leu Gly Ile Ala Asn

20 25 30

Trp Leu Lys Asp Gln Gly His Glu Leu Ile Thr Thr Ser Asp Lys Glu

35 40 45

Gly Glu Thr Ser Glu Leu Asp Lys His Ile Pro Asp Ala Asp Ile Ile

50 55 60

Ile Thr Thr Pro Phe His Pro Ala Tyr Ile Thr Lys Glu Arg Leu Asp

65 70 75 80

Lys Ala Lys Asn Leu Lys Leu Val Val Val Ala Gly Val Gly Ser Asp

85 90 95

His Ile Asp Leu Asp Tyr Ile Asn Gln Thr Gly Lys Lys Ile Ser Val

100 105 110

Leu Glu Val Thr Gly Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His Val Val

115 120 125

Met Thr Met Leu Val Leu Val Arg Asn Phe Val Pro Ala His Glu Gln

130 135 140

Ile Ile Asn His Asp Trp Glu Val Ala Ala Ile Ala Lys Asp Ala Tyr

145 150 155 160

Asp Ile Glu Gly Lys Thr Ile Ala Thr Ile Gly Ala Gly Arg Ile Gly

165 170 175

Tyr Arg Val Leu Glu Arg Leu Leu Pro Phe Asn Pro Lys Glu Leu Leu

180 185 190

Tyr Tyr Asp Tyr Gln Ala Leu Pro Lys Glu Ala Glu Glu Lys Val Gly

195 200 205

Ala Arg Arg Val Glu Asn Ile Glu Glu Leu Val Ala Gln Ala Asp Ile

210 215 220

Val Thr Val Asn Ala Pro Leu His Ala Gly Thr Lys Gly Leu Ile Asn

225 230 235 240

Lys Glu Leu Leu Ser Lys Phe Lys Lys Gly Ala Trp Leu Val Asn Thr

245 250 255

Ala Arg Gly Ala Ile Cys Val Ala Glu Asp Val Ala Ala Ala Leu Glu

260 265 270

Ser Gly Gln Leu Arg Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro

275 280 285

Ala Pro Lys Asp His Pro Trp Arg Asp Met Arg Asn Lys Tyr Gly Ala

290 295 300

Gly Asn Ala Met Thr Pro His Tyr Ser Gly Thr Thr Leu Asp Ala Gln

305 310 315 320

Thr Arg Tyr Ala Glu Gly Thr Lys Asn Ile Leu Glu Ser Phe Phe Thr

325 330 335

Gly Lys Phe Asp Tyr Arg Pro Gln Asp Ile Ile Leu Leu Asn Gly Glu

340 345 350

Tyr Val Thr Lys Ala Tyr Gly Lys His Asp Lys Lys

355 360

<210> 5

<211> 440

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 5

Met Ser Asn Val Lys Gln Gln Thr Ala Gln Ile Val Asp Trp Leu Ser

1 5 10 15

Ser Thr Leu Gly Lys Asp His Gln Tyr Arg Glu Asp Ser Leu Ser Leu

20 25 30

Thr Ala Asn Glu Asn Tyr Pro Ser Ala Leu Val Arg Leu Thr Ser Gly

35 40 45

Ser Thr Ala Gly Ala Phe Tyr His Cys Ser Phe Pro Phe Glu Val Pro

50 55 60

Ala Gly Glu Trp His Phe Pro Glu Pro Gly His Met Asn Ala Ile Ala

65 70 75 80

Asp Gln Val Arg Asp Leu Gly Lys Thr Leu Ile Gly Ala Gln Ala Phe

85 90 95

Asp Trp Arg Pro Asn Gly Gly Ser Thr Ala Glu Gln Ala Leu Met Leu

100 105 110

Ala Ala Cys Lys Pro Gly Glu Gly Phe Val His Phe Ala His Arg Asp

115 120 125

Gly Gly His Phe Ala Leu Glu Ser Leu Ala Gln Lys Met Gly Ile Glu

130 135 140

Ile Phe His Leu Pro Val Asn Pro Thr Ser Leu Leu Ile Asp Val Ala

145 150 155 160

Lys Leu Asp Glu Met Val Arg Arg Asn Pro His Ile Arg Ile Val Ile

165 170 175

Leu Asp Gln Ser Phe Lys Leu Arg Trp Gln Pro Leu Ala Glu Ile Arg

180 185 190

Ser Val Leu Pro Asp Ser Cys Thr Leu Thr Tyr Asp Met Ser His Asp

195 200 205

Gly Gly Leu Ile Met Gly Gly Val Phe Asp Ser Pro Leu Ser Cys Gly

210 215 220

Ala Asp Ile Val His Gly Asn Thr His Lys Thr Ile Pro Gly Pro Gln

225 230 235 240

Lys Gly Tyr Ile Gly Phe Lys Ser Ala Gln His Pro Leu Leu Val Asp

245 250 255

Thr Ser Leu Trp Val Cys Pro His Leu Gln Ser Asn Cys His Ala Glu

260 265 270

Gln Leu Pro Pro Met Trp Val Ala Phe Lys Glu Met Glu Leu Phe Gly

275 280 285

Arg Asp Tyr Ala Ala Gln Ile Val Ser Asn Ala Lys Thr Leu Ala Arg

290 295 300

His Leu His Glu Leu Gly Leu Asp Val Thr Gly Glu Ser Phe Gly Phe

305 310 315 320

Thr Gln Thr His Gln Val His Phe Ala Val Gly Asp Leu Gln Lys Ala

325 330 335

Leu Asp Leu Cys Val Asn Ser Leu His Ala Gly Gly Ile Arg Ser Thr

340 345 350

Asn Ile Glu Ile Pro Gly Lys Pro Gly Val His Gly Ile Arg Leu Gly

355 360 365

Val Gln Ala Met Thr Arg Arg Gly Met Lys Glu Lys Asp Phe Glu Val

370 375 380

Val Ala Arg Phe Ile Ala Asp Leu Tyr Phe Lys Lys Thr Glu Pro Ala

385 390 395 400

Lys Val Ala Gln Gln Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ala Phe Pro Leu Ala

405 410 415

Pro Leu Ala Tyr Ser Phe Asp Lys Tyr Leu Asp Glu Glu Leu Leu Ala

420 425 430

Ala Val Tyr Gln Gly Ala Gln Arg

435 440

Claims (10)

1.一种固定化酶催化剂，其特征在于，所述固定化酶催化剂包括树脂以及共价结合在所述树脂上的酶；所述酶为苏氨酸转醛酶或者苏氨酸转醛酶和乙醛还原酶的组合或者苏氨酸转醛酶、乙醛还原酶和辅酶再生酶的组合。

2.如权利要求1所述的固定化酶催化剂，其特征在于，所述树脂为活化的带有氨基的树脂。

3.如权利要求1所述的固定化酶催化剂，其特征在于，所述苏氨酸转醛酶和乙醛还原酶的组合或者苏氨酸转醛酶、乙醛还原酶和辅酶再生酶的组合被同时共价固定到一种树脂上。

4.如权利要求1所述的固定化酶催化剂，其特征在于，所述辅酶再生酶选自：醇脱氢酶、甲酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶中的一种或多种。

5.如权利要求1所述的固定化酶催化剂，其特征在于，所述苏氨酸转醛酶被定点突变。

6.如权利要求5所述的固定化酶催化剂，其特征在于，所述定点突变发生在苏氨酸转醛酶第424个氨基酸位置。

7.如权利要求1-6任一项所述的固定化酶催化剂，其特征在于，所述固定化酶催化剂反应30次后仍然保持70％以上的反应活性。

8.如权利要求5所述的固定化酶催化剂，其特征在于，所述突变体为N424K，上述突变后的苏氨酸转醛酶具有SEQ ID No.6的氨基酸序列。

9.如权利要求1-6任一项所述的固定化酶催化剂，其特征在于，所述酶与树脂质量比为1:15到1:8。

10.一种合成3-苯基-L-丝氨酸及其衍生物的的方法，其特征在于使用了如权利要求1-9任一项所述的固定化酶催化剂，所述反应步骤如下：

其中，R选自：氢基、烷基、烷氧基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、烷基硫基、磺酸基、亚磺酸基、巯基、硝基和卤素；n为0、1、2或3。