ES2206488T3 - Preparacion de l-isoleucina mediante microorganismos recombinantes con una treonina deshidratasa desregulada. - Google Patents
Preparacion de l-isoleucina mediante microorganismos recombinantes con una treonina deshidratasa desregulada.Info
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Abstract
LA INVENCION TRATA DE UN PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCION MICROBIANA DE L-ISOLEUCINA. PARA ESTO, SE CAMBIAN IN VITRO UNA O DOS BASES DE LA REGION DE UN GEN QUE CODIFICA LOS DOMINIOS ALOSTERICOS DE LA ENZIMA TREONINA DEHIDRATASA DE TAL MANERA, QUE AL MENOS SE CAMBIA UN AMINOACIDO POR OTRO EN LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE LOS DOMINIOS ALOSTERICOS DE LA ENZIMA, POR LO QUE LA ENZIMA YA NO ESTA INHIBIDA POR EL SERVOMECANISMO DE LA LISOLEUCINA. AUN MAS, LOS CAMBIOS DE AMINOACIDOS CONCRETOS EN LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS SE EFECTUAN EN UN GEN IN VITRO DE LA TREONINA DEHIDRATASA DE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM POR INTERCAMBIO DE BASES, TANTO FUERA COMO DENTRO Y FUERA DE LA REGION DEL GEN QUE CODIFICA LOS DOMINIOS ALOSTERICOS DE LA ENZIMA, POR TANTO DESPUES DE LA TRANSFORMACION DE ESTOS GENES MUTADOS DE TREONINA DEHIDRATASA EN UNA CELULA HUESPED QUE PRODUCE TREONINA O L-ISOLEUCINA, DESPUES SOLO VA A PRODUCIR LISOLEUCINA.
Description
Preparación de L-isoleucina
mediante microorganismos recombinantes con una treonina
deshidratasa desregulada.
El invento se refiere a procedimientos para la
preparación por vía microbiana de L-isoleucina de
acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10, a genes de treonina
deshidratasas de acuerdo con las reivindicaciones 11 a 12, a
vectores de acuerdo con las reivindicaciones 13 y 14, a células
transformadas de acuerdo con las reivindicaciones 15 a 21, así como
a treonina deshidratasas de acuerdo con las reivindicaciones 22 y
23.
El aminoácido L-isoleucina es
esencial para seres humanos y animales. Éste encuentra una amplia
utilización en alimentos dietéticos así como en calidad de
componente de diferentes mezclas nutritivas con un destino
medicinal. También se usa L-isoleucina como aditivo
o como reactivo en las industrias farmacéuticas y químicas.
Para la obtención de la
L-isoleucina se emplean microorganismos, que
segregan este aminoácido dentro del medio de fermentación. En este
caso la formación de la L-isoleucina se efectúa de
acuerdo con la ruta de biosíntesis representada en la Figura 1.
Como asimismo se demuestra en la Figura 1, hay en la biosíntesis de
la L-isoleucina enzimas claves, y concretamente la
aspartato cinasa, la homoserina deshidrogenasa y la treonina
deshidratasa. La actividad de la aspartato cinasa y de la
homoserina deshidrogenasa es inhibida en retroacción por el
aminoácido L-treonina, asimismo formado en el marco
de la biosíntesis de la L-isoleucina, mientras que
la enzima clave treonina deshidratasa, que es específica para la
síntesis de L-isoleucina, es inhibida en retroacción
por el producto final de la cadena de biosíntesis,
L-isoleucina.
Con el fin de aumentar la formación de
L-isoleucina, se intentó en el pasado constantemente
de manera renovada, obtener mutantes de organismos productores de
L-isoleucina, que formen
L-isoleucina en cantidad aumentada en comparación
con los tipos salvajes.
Para la obtención de tales mutantes, se llevaron
a cabo exclusivamente mutagénesis in vitro, es decir se hizo
actuar un agente mutágeno sobre todo el genoma. Acerca de la
resistencia frente a compuestos análogos a aminoácidos, se
seleccionaron los microorganismos mutados, cuyas enzimas claves,
antes mencionadas, ya no estaban sujetas a ninguna inhibición en
retroacción.
Así, por ejemplo, en el documento de patente de
los EE.UU. US-PS 4.329.427 se describe una mutación,
que conduce a una resistencia frente al
\alpha-amino-butirato o al
isoleucina-hidroxamato, según la cual los
microorganismos producen ciertamente L-isoleucina en
una cantidad aumentada, pero quedaba sin aclarar cuales enzimas ya
no eran inhibidas en retroacción.
En los documentos US-PS 4.442.208
y 4.602.983 se describe que después de una mutagénesis in
vivo se podía aislar un fragmento de ADN - no definido con
mayor exactitud - que confiere resistencia frente al ácido
\alpha-amino-hidroxi-valeriánico.
Después de una transferencia de este fragmento a una cepa de
Corynebacterium o bien de Brevibacterium, éstas cepas
producían L-isoleucina en una cantidad
aumentada.
También se describen procedimientos, en los que
por síntesis en exceso de enzimas clave, todavía reguladas en
retroacción, se puede formar L-isoleucina en una
cantidad aumentada (compárense por ejemplo los documentos de
publicación de solicitud de patente alemana DE-OS
3.942.947 y de solicitud de patente europea EP-OS
0.137.348).
A partir del documento de solicitud de patente
europea EP-A-0.436.886 se conoce el
aislamiento de un gen mutado de treonina deshidratasa procedente de
Corynebacterium glutamicum.
A partir de la cita de "Gene, 63, 1988,
245-252, Taillon, B. E. y colaboradores" se
conocen la secuencia de un gen de tipo salvaje de Tda procedente de
E. coli K12, así como la secuencia de Tda de dos mutantes,
que ya no son inhibidos en retroacción por isoleucina.
Considerados en conjunto, todos los
procedimientos descritos hasta ahora, para la elevación de la
producción de L-isoleucina, tienen en común la
característica de que las mutaciones conducían más bien
accidentalmente a enzimas claves desreguladas, que no están sujetas
a ninguna inhibición en retroacción, y además de ello se aumentaba
la síntesis de aminoácidos.
Es misión del invento, proporcionar
procedimientos para la preparación por vía microbiana de
L-isoleucina, mediante el cual se modifique
deliberadamente mediante mutaciones definidas la enzima clave de la
biosíntesis de L-isoleucina -la treonina
deshidratasa-, de tal manera que ya no se efectúe una inhibición en
retroacción por la L-isoleucina.
El problema planteado por la misión que
constituye el fundamento del invento, se resuelve mediante el
recurso de que en un gen de una treonina deshidratasa, presente
in vitro, se intercambian por mutación una o varias bases en
la región del gen que codifica el dominio alostérico de la enzima,
de tal manera que por lo menos un aminoácido en la secuencia de
aminoácidos del dominio alostérico de la enzima se reemplace por
otro aminoácido, de tal manera que la enzima ya no sea inhibida en
retroacción por la L-isoleucina. La expresión "gen
presente in vitro" significa aquí que el gen de treonina
deshidratasa, antes de la mutación, es clonado, es decir que por lo
tanto es aislado e incorporado en un vector. La realización de la
mutagénesis mediante uno o varios intercambio(s) de bases se
efectúa de acuerdo con un método conocido, por ejemplo de acuerdo
con el método de Ito y colaboradores (Gene 102 (1991)
67-70). Después de una transformación de los genes
de treonina deshidratasas, mutados de tal manera, en el seno de una
célula hospedante productora de treonina o
L-isoleucina, ésta forma
L-isoleucina en una cantidad aumentada.
En principio, un gen de treonina deshidratasa,
clonado o bien presente in vitro, puede proceder de una
bacteria arbitraria. Puesto que la Corynebacterium glutamicum
se cuenta entre las "clásicas" productoras de aminoácidos, el
gen procede preferiblemente de este microorganismo, en particular de
la cepa ATCC 13032. La secuencia de ADN del gen de treonina
deshidratasa procedente de esta cepa de Corynebacterium
glutamicum ya es conocida (compárese la cita de Möckel y
colaboradores, J. Bacteriol., 174 (1992) 8065-8072).
Después del intercambio de bases en la región del gen que codifica
el dominio alostérico de la enzima, se obtienen por ejemplo las
secuencias de ADN que se exponen en la Tabla 1 (que corresponde a
Seq ID No. 1), en la Tabla 2 (que corresponde a Seq ID No. 3) y en
la Tabla 3 (que corresponde a Seq ID No. 5). En las tablas, la
región del gen que codifica el dominio alostérico de la enzima está
subrayada y los sitios de los intercambios de bases se hacen
reconocibles por un subrayado adicional.
Después de haber llevado a cabo la mutagénesis,
los genes mutados in vitro se incorporan en un plásmido, en
el que se puede inducir la expresión del gen de treonina
deshidratasa. Como plásmidos se adecuan por ejemplo los pVC 19 o pKK
223-3 (Amman y colaboradores, Gene 25, 167).
Después de la incorporación de los genes mutados en un plásmido
apropiado, éstos se transforman en el seno de una cepa bacteriana
apropiada.
Con el fin de obtener los clones, que realmente
contienen también los plásmidos con los genes mutados de treonina
deshidratasas, los deseados transformantes se pueden aislar acerca
de la resistencia a compuestos análogos a aminoácidos, entrando en
consideración como compuestos análogos, por ejemplo,
\beta-metil-norleucina,
isoleucina-hidroxamato o
hidroxi-isoleucina.
Un aislamiento más sencillo y más planificado se
consigue, sin embargo, mediante el recurso de que los genes
modificados de treonina deshidratasas se transforman en el seno de
un microorganismo, cuya actividad de acetohidroxiácido sintasa se
puede inhibir mediante L-valina. Como transformantes
se adecuan p.ej. cepas de Escherichia coli K 12, de modo
preferido las cepas JM 109 o DH 5. Los transformantes se llevan a
continuación a un medio sólido, que contiene
L-isoleucina para la inhibición de la treonina
deshidratasa y L-valina para la metabolización del
cetobutirato por la acetohidroxiácido sintasa (Umbarger:
Escherichia coli and Salmonella typhimurium
[Escherichia coli y Salmonella typhimurium], 1 (1987)
352-367). Al medio se le añaden adicionalmente de
modo preferente una sustancia destinada a la inducción del gen de
treonina deshidratasa, así como L-treonina como
substrato para la deshidratasa. Como sustancia destinada a la
inducción del gen de treonina deshidratasa se utiliza
preferiblemente IPTG
(isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido),
de manera tal que, delante del gen modificado de treonina
deshidratasa, se dispone en el vector un promotor inducible por
IPTG. Los clones, que contienen una treonina deshidratasa
desregulada, convierten a la L-treonina de una
manera no inhibida en cetobutirato. Puesto que la conversión
ulterior del cetobutirato mediante la acetohidroxiácido sintasa es
inhibida por la L-valina añadida, se acumula
cetobutirato, lo cual tiene como consecuencia que los clones, que
contienen una treonina deshidratasa desregulada, crecen peor a causa
de la conocida toxicidad del cetobutirato (La Rossa y Schloss, J.
Biol. Chem. 259 (1984) 8753-8757). El peor
crecimiento se exterioriza en la formación de colonias de menor
tamaño, de colonias más traslúcidas o de colonias con un contorno
quebrado de colonia. Estas colonias se pueden evacuar con facilidad
por inoculación y por lo tanto se pueden aislar fácilmente clones
con una deshidratasa desregulada.
Este método de aislamiento se puede aplicar
evidentemente también en los transformantes que contienen un gen
clonado de treonina deshidratasa, que ha sido modificado por otros
tipos de mutaciones, distintas de las realizadas por intercambio de
bases, de tal manera que la correspondiente enzima ya no está
sujeta a ninguna inhibición por retroacción.
Una alternativa conforme al invento para la
resolución del problema planteado por la mencionada misión,
consiste en que en un gen, presente in vitro, de una
treonina deshidratasa procedente de Corynebacterium
glutamicum, mediante intercambio de bases fuera de la región
del gen que codifica el dominio alostérico de la enzima, el
aminoácido alanina situado en la posición 257 de la secuencia de
aminoácidos de la enzima se reemplaza por el aminoácido glicina
(Tabla 4 y respectivamente Seq ID No. 8) o el aminoácido metionina
situado en la posición 199 de la secuencia de aminoácidos de la
enzima se reemplaza por el aminoácido valina (Tabla 5 y
respectivamente Seq ID No. 10), después de lo cual, tras una
transformación de los genes de treonina deshidratasas, que se han
mutado de esta manera, en el seno de una célula hospedante
productora de treonina o de L-isoleucina, ésta forma
L-isoleucina en una cantidad aumentada.
Una alternativa adicional a la resolución del
problema planteado, consiste en que en un gen de una treonina
deshidratasa procedente de Corynebacterium glutamicum,
mediante intercambio de bases fuera de la región del gen que
codifica el dominio alostérico de la enzima, el aminoácido histidina
situado en la posición 278 de la secuencia de aminoácidos de la
enzima se reemplaza por el aminoácido arginina, y dentro de la
región del gen que codifica el dominio alostérico de la enzima, el
aminoácido leucina situado en la posición 351 de la secuencia de
aminoácidos de la enzima se reemplaza por el aminoácido serina
(Tabla 6 y respectivamente Seq ID No. 12), después de lo cual, tras
una transformación de un gen de treonina deshidratasa, que se ha
mutado de esta manera, en el seno de una célula hospedante
productora de treonina o de L-isoleucina, ésta
forma asimismo L-isoleucina en una cantidad
aumentada.
Como célula hospedante para la transformación de
un gen mutado de treonina deshidratasa, o bien como cepa productora,
se adecua preferiblemente Corynebacterium glutamicum, y en
particular la cepa depositada en la DSM bajo el número 8890. Como
transformantes son obtenibles por ejemplo las cepas depositadas en
la DSM bajo los números 8885 y 8891, que segregan
L-isoleucina en cantidad aumentada dentro del medio
de fermentación. También es útil utilizar como cepas productoras o
respectivamente células hospedantes para la transformación,
aquellas que ya no sintetizan la treonina deshidratasa de tipo
salvaje todavía regulada por L-isoleucina, de tal
manera que en las células solamente una treonina deshidratasa
desregulada cataliza la conversión de
L-treonina.
El conocido plásmido pBMi/ExoB, que codifica la
treonina deshidratasa regulada del tipo salvaje de
Corynebacterium glutamicum (Möckel y colaboradores, J.
Bacteriol., 174 (1992) 8065-8072), se aisló de
acuerdo con procedimientos conocidos (Sambrook y colaboradores,
Molecular Cloning, A Laboratory Handbook [Clonación molecular, un
manual de laboratorio], 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press).
A continuación se digirió con la enzima de restricción EcoR1
y se aisló el fragmento con un tamaño de 1.573 pares de bases, que
contenía el gen de treonina deshidratasa. Este fragmento se ligó en
el sitio de corte con EcoR1 del conocido vector pUC19
(Vieira y Messing, Gene 19 (1976) 259-268), y con
ello se obtuvo el plásmido pBM20 (Figura 2), en el que seguidamente
se presenta el gen de treonina deshidratasa procedente de C.
glutamicum, que por sí mismo no es expresado en E. coli
(Cordes y colaboradores, Gene 112 (1992) 113-115),
en la cepa de laboratorio patrón E. coli JM109 bajo el
control del promotor lacZ, inducible por
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido,
del vector original pUC19.
Para la introducción de las mutaciones no
dirigidas en el dominio alostérico de la treonina deshidratasa, se
sintetizaron de una manera conocida dos cebadores de ADN:
El cebador en 5' es homólogo con respecto al
sitio de corte con NcoI (subrayado) en el gen de treonina
deshidratasa. El cebador en 3' es homólogo con respecto al sitio de
reconocimiento por HindIII (subrayado) del sitio de
clonación múltiple del vector de partida pUC19.
Con ambos cebadores se llevó a cabo seguidamente
una reacción en cadena de polimerasa (PCA, de Polymerase Chain
Reaction) (Tindall y Kunkel, Biochemistry 27 (1988)
6008-6013) en el que por medio de la reacción
inespecífica de la polimerasa Tag (Leung y colaboradores,
Technique 1 (1989) 11-15) se forman nuevos
fragmentos de ADN que contienen mutaciones. La tanda de reacción
contenía en un volumen final de 100 \mul: 20 \mul del cebador
en 5' (25 \mug/ml), 20 \mul del cebador en 3' (25 \mug/ml), 1
ng de un molde (pBM20), 100 \muM de ATP
(adenina-trifosfato), 100 \muM de una mezcla de
los dNTP (nucleótido-trifosfatos), 10 \mul de 10 x
tampón de Taq (100 mM de Tris, 15 mM de MgCl_{2}, 500 mM de KCl,
gelatina 1 mg/ml, de pH 8,3), 0,5 U (unidades) de la polimerasa
Tag (5 U/\mul), 0,5 mM de MnCl_{2}. Como condiciones de
reacción se ajustaron una Time Delay File (fila de retardo en el
tiempo) de 94ºC (durante 3 min), una Thermo Cycle File (fila de
ciclo térmico) de 94ºC (durante 1 min), de 55ºC (durante 2 min), de
72ºC (durante 3 min), una Soak File (fila de empapamiento) de 4ºC,
una Segment Extension (prolongación de segmento) de 10 s (segundos)
con un número de 30 ciclos. Después de la reacción, los fragmentos
de ADN se purificaron (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning,
A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press),
se digirieron con NcoI y con HindIII, y se ligaron
con pBM20, desde el que previamente se había separado por corte el
correspondiente fragmento de NcoI -HindIII con 743
pares de bases, que codifica el dominio alostérico de la treonina
deshidratasa del tipo salvaje.
Con estos productos de ligación, generados in
vitro, que también contenían genes mutados de treonina
deshidratasas, se transformó seguidamente E. coli JM109 de
acuerdo con procedimientos conocidos (Hanahan, Techniques for
Transformation of E. coli (1985) DNA cloning [Técnicas para
la transformación de E. coli (1986) clonación de ADN],
Volumen 1, páginas 109-136, IRL Press Oxford), y se
obtuvieron clones que contenían aproximadamente 10.000 plásmidos en
un medio de Luria - Bertani (LB) (Lennox, Virology [Virología] 1
(1955) 190-206)), que contenía 50 \mug/ml de
ampicilina.
Con la finalidad de identificar entonces los
clones, que codifican una treonina deshidratasa que ya no se puede
inhibir por retroacción, se preparó un medio de Luria - Bertani
(LB), que adicionalmente contenía 40 mM de
L-treonina como substrato de la treonina
deshidratasa, así como 1 mM de
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido
para la inducción de la expresión, condicionada por lacZ,
del gen de treonina deshidratasa. Tal como es conocido, el medio de
Luria - Bertani ya contiene suficiente cantidad de
L-valina para la inhibición de la actividad de
acetohidroxiácido sintasa en E. coli (Umbarger: Biosynthesis
of branched-chain amino acids (1987) Escherichia
coli and Salmonella typhimurium [Biosíntesis de
aminoácidos de cadena ramificada (1987) Escherichia coli y
Salmonella typhimurium], volumen 1, páginas 352-367,
American Society for Microbiology [Sociedad Americana de
Microbiología], Washington DC), para conseguir con ello en el
procedimiento aquí descrito una acumulación lo más alta que sea
posible de \alpha-cetobutirato. Junto al medio de
Luria - Bertani, que contenía treonina e
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido,
para el testigo de control se utilizó el mismo medio sin
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido,
en donde por lo tanto no se efectúa ninguna inducción de la
treonina deshidratasa. A continuación, los clones de E. coli
JM109, que contenían los derivados de pBM20 que se habían de probar,
se estamparon sobre estas placas de una manera convencional, y se
incubaron durante 24 horas a 37ºC. A continuación de ello, se
pudieron identificar en el medio, que contenía
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido,
60 colonias que crecían anormalmente, las cuales se distinguían por
un menor crecimiento, o por una colonia más pálida, o por un borde
quebrado de colonia, pero que crecían normalmente en el medio
testigo sin
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido.
Estos clones se sometieron individualmente a un ensayo de repaso
idéntico, y finalmente 6 de los clones con un retraso máximamente
pronunciado se sometieron a un ensayo bioquímico para efectuar la
caracterización de la regulación de las treonina deshidratasas que
ellos contenían.
Seis de los clones recombinantes de E.
coli JM109, así obtenidos, se inocularon en 100 ml de un medio
líquido LB, que contenía adicionalmente 50 \mug de ampicilina/ml,
y se incubaron a 37ºC. La densidad óptica (OD_{500 \ nm}) se
vigiló, y al alcanzarse la OD de 0,5, se añadió
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido
en una concentración final de 0,5 mM. Después de una incubación
durante una hora más a 37ºC, las células se cosecharon por
centrifugación, se lavaron una vez con un tampón de pH 7,0 (0,1 M de
fosfato de potasio, 0,5 mM de L-isoleucina, 0,2 mM
de fosfato de piridoxal), se recogieron en 1 ml del mismo tampón, y
se desintegraron mediante tratamiento con ultrasonidos en el
aparato Branson-Sonifier W250 (durante 3 minutos,
pulsado con un intervalo de 20%, potencia disponible de 2). Con el
fin de separar los desperdicios celulares, el material
homogeneizado se centrifugó durante 10 minutos a 13.000 rpm
(revoluciones por minuto) y a 4ºC en una centrífuga refrigerada de
Sigma, y después de ello el resultante material sobrenadante
transparente (extracto bruto) se usó en el ensayo enzimático para la
determinación y la regulación de la actividad de treonina
deshidratas.
El sistema de ensayo enzimático contenía, en un
volumen final de 0,8 ml, 0,1 M de fosfato de potasio (de pH 8,2), 1
mM de fosfato de piridoxal, 40 mM de L-treonina, y
un extracto bruto. La tanda se incubó a 30ºC y se sacaron muestras
de 200 \mul después de 0 y 30 minutos. La reacción de treonina
deshidratasa se hizo terminar en cada caso por adición de 1 ml de
un reactivo. Éste constaba de 1 g de una semicarbazida más 0,9 g de
acetato de sodio en 100 ml de agua. Después de una incubación
durante 15 minutos a 30ºC, se añadieron a ello 3 ml de agua, y la
extinción a 254 nm se determinó en el fotómetro espectral PM6 de
Zeiss. Los valores testigos y de calibración con 0 a 1,5 \mumol de
cetobutirato se trataron de una manera idéntica, y a partir de una
curva de calibración se averiguó la cantidad de cetobutirato,
realmente formada en el ensayo enzimático por la treonina
deshidratasa. Paralelamente a ello, se llevó a cabo el tratamiento
de tandas idénticas, que para efectuar la comprobación en cuanto a
la inhibición de la treonina deshidratasa contenían 5 mM de
L-isoleucina. Independientemente de esta
determinación, se determinó, tal como se ha descrito (por Bradford,
Anal. Biochem. 72 (1976) 248-254), el contenido en
proteínas de los extractos brutos. Las actividades específicas
obtenidas y el grado de la inhibición pueden observarse a partir de
la Tabla 7.
(Tabla pasa a página
siguiente)
Puede observarse directamente que las enzimas
mutadas 38 y 14 se presentan sin ninguna inhibición alostérica por
L-isoleucina. La enzima de la mutante 31 tiene, en
presencia de L-isoleucina, todavía un 30% de
actividad restante, al contrario de lo cual la enzima del tipo
salvaje tiene, en estas condiciones, solamente un 15% de actividad
restante.
Con el fin de determinar las mutaciones en las
enzimas producidas, los plásmidos que codifican treonina
deshidratasas se aislaron a partir de los clones en E. coli
JM109 de acuerdo con procedimientos clásicos. La secuenciación de la
región mutada del gen de treonina deshidratasa se efectuó con ayuda
del método de terminación con didesoxinucleótidos de acuerdo con
Sanger y colaboradores (Sanger y colaboradores. Proceedings of the
National Academy of Sciences, USA [Actuaciones de la Academia
Nacional de las Ciencias, EE.UU.] (1977) 5463-5467).
Como cebadores se sintetizaron nucleótidos específicos para
secuencias, marcados con fluoresceína, de acuerdo con la
correspondiente prescripción de la entidad Pharmacia (Pharmacia,
Uppsala, Suecia). Estos cebadores se purificaron mediante
cromatografía de líquido a alta presión (HPLC) con un gradiente de
5-30% de acetonitrilo en 100 mM de acetato de
trietil-amina de pH 7,0 y el Pep-S
de 5 \mum Super Pac® de Pharmacia. Los cebadores se emplearon en
una reacción de secuenciación patrón y durante la electroforesis
los productos de la reacción se detectaron automáticamente por
detección de la fluorescencia en el secuenciador A.L.F. Sequencer
(Pharmacia, Uppsala, Suecia) y se anotó la secuencia
resultante.
Cebadores utilizados para la
secuenciación. La posición de las bases se refiere a la
secuencia reseñada en la Figura 3 en la cita de Möckel y
colaboradores, J. Bacteriol., 174 (1992)
8065-8072.
Bases 957-958:
5'fluoresceína-d(GGTCAGGGCACCGTGGCTGCTG)-3'
Bases 1.172-1.191:
5'fluoresceína-d(GGAGACTGGTTGATCCCTTTG)-3'
Bases 1.381-1.400:
5'fluoresceína-d(CCTTGCACCTGGTTCTGTC)-3'
Bases 1.586-1.607:
5'fluoresceína-d(CCTCAAGCGCAACAACCGTGAG)-3'
La secuencia comprobada con ello de los genes de
treonina deshidratasas individuales se comparó con la conocida del
gen de tipo salvaje (Möckel y colaboradores, J. Bacteriol., 174
(1992) 8065-8072). Los intercambios individuales de
bases de los genes de treonina deshidratasas, caracterizados por
vía bioquímica, se reproducen en la Tabla 8. Los codones modificados
se tradujeron en los correspondientes aminoácidos con ayuda del
código genético universal y los intercambios de aminoácidos
comprobados con ello, que conducen a la regulación modificada de la
treonina deshidratasa, se reseñan asimismo en la Tabla 8. Se
obtuvieron mutaciones con un fenotipo desregulado a lo largo de toda
la zona, que se había empleado para la mutación. En la mutante 14
se presenta una doble mutación, lo cual muestra que también varios
intercambios de aminoácidos en una enzima pueden conducir al
deseado fenotipo desregulado.
Los alelos obtenidos se cambiaron de clon
(transclonaron) en vectores de lanzadera (shuttle) E.
coli/C. glutamicum, para poder expresarlos de esta manera en
una cepa productora de treonina de C. glutamicum.
Para ello se produjo en primer lugar el vector de
lanzadera (shuttle) E. coli/C. glutamicum pKW0 de
acuerdo con procedimientos conocidos de clonación (Sambrook y
colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold
Spring Harbour Laboratory Press). El vector resultante se representa
en la Figura 3. Éste tiene un tamaño de 9,5 kb, y contiene (i) el
replicón pGA2 en C. glutamicum (Sonnen, Molekulargenetische
Charakterisierung von
Phagen-Wirt-Beziehungen bei
coryneformen Aminosäure - Produzenten [Caracterización genética
molecular de relaciones entre un fago y un hospedante en productoras
corineformes de aminoácidos], Tesis Doctoral, Escuela Técnica
Superior de Darmstadt, 1991), que conduce a un número solamente
pequeño de copias en C. glutamicum, (ii) el replicón en E.
coli procedente de pOU71 (Larsen y colaboradores, Gene 28 (1984)
45-54), que conduce a una copia por célula a 30ºC,
pero a hasta 1.000 copias por célula a 42ºC, (iii) la resistencia a
tetraciclina procedente de pHY163 (Ishiwa y Shibahara, Jpn. J.
Genet. 60 (1985) 485-498)), y (iv) el sitio cos
procedente de pBTI-1 (Boehringer, Mannheim). Los
alelos 14, 16 y 18 de ilvA, así como el alelo de tipo salvaje
se aislaron como fragmentos en EcoRI a partir de los
derivados de pBM20 preparados bajo el apartado 1.1, y se ligaron con
el vector pKW0 restringido con EcoRI, para proporcionar los
pKW0ilvA, pKW0ilvA14, pKW0ilvA16, y
pKW0ilvA38. Con estos plásmidos se transformó mediante
electroporación (Liebl y colaboradores, FEMS Microbiol. Lett. 65
(1985) 299-304) la productora de treonina
MH20-22B::pSUR5-DR1 (Reinscheid y
colaboradores, Appl. Env. Microbiol. 1994, 60, 126 - 132). La
MH20-22B se ha depositado en la Deutsche Sammlung
für Mikroorganismen [ColecciónAlemana de Microorganismos] bajo el
número DSM 6870, al igual que las
MH20-22B::pSUR5-DR1 (DSM 8890) y
MH20-22B::pSUR5-DR1
pKW0ilvA16 (DSM 8889). Estas cepas se cultivaron en el medio
mínimo CGXII como se ha descrito (por Keilhauer y colaboradores, J.
Bacteriol. 175 (1993) 5595-5603), y después de una
incubación durante 72 horas se determinaron los aminoácidos
acumulados en el medio de cultivo. A partir de la Tabla 9 se pone
de manifiesto el inequívoco aumento de la formación de
L-isoleucina por los alelos de las mutantes.
En un experimento adicional el alelo de tipo
salvaje y el de la mutante 38 se integraron en el vector en péndulo
con alto número de copias (high copy) pECM3 (A. Schäfer,
Trabajo para Diplomatura, 1991, Universidad de Bielefeld). Los
fragmentos se aislaron de nuevo como fragmentos de EcoRI a
partir de los derivados de pBM20 preparados bajo el apartado 1.1, y
se ligaron con el vector restringido con EcoRI, para
proporcionar los pECM3ilvA y pECM3ilvA38. Con estos
plásmidos se transformó mediante electroporación (Liebl y
colaboradores, FEMS Microbiol. Lett. 65 (1985)
299-304) la productora de treonina
MH20-22B::pSUR5-DR1 (Reinscheid y
colaboradores, Appl. Env. Microbiol. 1994, 60, 126 - 132). La
MH20-22B se ha depositado en la Deutsche Sammlung
für Mikroorganismen [Colección Alemana de Microorganismos] bajo el
número DSM 6870, al igual que las
MH20-22B::pSUR5-DR1 (DSM 8890) y
MH20-22B::pSUR5-DR1
pECM3ilvA38 (DSM 8891). Estas cepas se cultivaron en el medio
mínimo de MH20-22B tal como se ha descrito (por
Schrumpf y colaboradores Appl. Microbiol. Biotechnol. 37 (1992)
566-571), y después de una incubación durante 72
horas se determinó la cantidad acumulada de aminoácidos. A partir de
la Tabla 10 se desprende de nuevo el inequívoco aumento de la
formación de L-isoleucina por el respectivo alelo
de mutante.
\newpage
Mutante 38
\newpage
Mutante 16
\newpage
Mutante 31
\newpage
Mutante 50
\newpage
Mutante 54
\newpage
Mutante 14
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Forschungszentrum Juelich
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Apartado de Correos 1913
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- LOCALIDAD: Juelich
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 52428
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DEL INVENTO: Preparación de L-isoleucina mediante microorganismos recombinantes con una treonina deshidratasa desregulada
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 12
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- Tipo de medio: Disquete
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATORIO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SISTEMA LÓGICO - SOFTWARE:
- PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.25 (EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.925 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPÓTESIS: NO HAY
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Corynebacterium glutamicum
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- MATERIAL AISLADO INDIVIDUAL: Mutante 38
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN; 432...1742
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /número _EC = 4.2.1.16/
\hskip6cmproducto "treonina deshidratasa"/
\hskip6cmgen = "ilvA"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 436 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.925 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPÓTESIS: NO HAY
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Corynebacterium glutamicum
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- MATERIAL AISLADO INDIVIDUAL: Mutante 16
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN; 432...1742
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /número _EC = 4.2.1.16/
\hskip6cmproducto "treonina deshidratasa"/
\hskip6cmgen = "ilvA"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 436 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.925 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPÓTESIS: NO HAY
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Corynebacterium glutamicum
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- MATERIAL AISLADO INDIVIDUAL: Mutante 31
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN; 432...1742
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / número _EC = 4.2.1.16/
\hskip6cmproducto "treonina deshidratasa"/
\hskip6cmgen = "ilvA"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 436 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.925 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPÓTESIS: NO HAY
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Corynebacterium glutamicum
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- MATERIAL AISLADO INDIVIDUAL: Mutante 50
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN; 432...1742
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / número _EC = 4.2.1.16 /
\hskip6cmproducto "treonina deshidratasa" /
\hskip6cmgen = "ilvA"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 436 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.925 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPÓTESIS: NO HAY
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Corynebacterium glutamicum
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- MATERIAL AISLADO INDIVIDUAL: Mutante 54
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN; 432...1742
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /número _EC = 4.2.1.16/
\hskip6cmproducto "treonina deshidratasa"/
\hskip6cmgen = "ilvA"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 436 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.925 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPÓTESIS: NO HAY
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Corynebacterium glutamicum
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- MATERIAL AISLADO INDIVIDUAL: Mutante 14
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN; 432...1742
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /número _EC = 4.2.1.16/
\hskip6cmproducto "treonina deshidratasa"/
\hskip6cmgen = "ilvA"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 12:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 436 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (23)
1. Procedimiento para la producción por vía
microbiana de L-isoleucina, en el que en un gen,
presente in vitro, de una treonina deshidratasa - que
participa en la síntesis microbiana de la
L-isoleucina como enzima clave -, se intercambian
por mutación una o varias bases en la región del gen que codifica el
dominio alostérico de la enzima, de tal manera que por lo menos un
aminoácido en la secuencia de aminoácidos del dominio alostérico de
la enzima se reemplace por otro aminoácido, de tal manera que la
enzima ya no sea inhibida en retroacción por la
L-isoleucina, tras de lo cual después de una
transformación del gen de treonina deshidratasa, mutado de tal
manera, en el seno de una célula hospedante productora de treonina o
L-isoleucina, ésta forma
L-isoleucina en una cantidad aumentada.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1,
caracterizado porque
el gen de treonina deshidratasa, presente in
vitro para la mutagénesis, procede de Corynebacterium
glutamicum.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1 ó 2,
caracterizado porque
para el aislamiento de clones con una treonina
deshidratasa desregulada, es decir que no está sujeta a ninguna
inhibición en retroacción por L-isoleucina, los
genes de treonina deshidratasa, modificados por mutación, se
transforman en el seno de un microorganismo, cuya actividad de
treonina deshidratasa puede ser inhibida por
L-valina, después de lo cual, tras un crecimiento de
los transformantes en un medio sólido que contiene
L-isoleucina y L-valina, los clones
que contienen una treonina deshidratasa desregulada se obtienen
evacuando por inoculación las colonias con una morfología modificada
por acumulación de cetobutirato.
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
3,
caracterizado porque
el medio contiene adicionalmente una sustancia
destinada a la inducción del gen de treonina deshidratasa.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
4,
caracterizado porque
la sustancia destinada a la inducción del gen de
treonina deshidratasa es IPTG.
6. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 3 a 5,
caracterizado porque
el medio contiene adicionalmente
L-treonina en calidad de substrato para la treonina
deshidratasa.
7. Procedimiento de acuerdo con una de las la
reivindicaciones 3 a 6,
caracterizado porque
los genes de treonina deshidratasas, modificados
por mutación, se transforman en el seno de Escherichia coli K
12.
8. Procedimiento para la producción por vía
microbiana de L-isoleucina, en el que en un gen,
presente in vitro, de una treonina deshidratasa - que
participa en la síntesis microbiana de la
L-isoleucina como enzima clave - procedente de
Corynebacterium glutamicum, mediante intercambio de bases
fuera de la región del gen que codifica el dominio alostérico de la
enzima, el aminoácido alanina situado en la posición 257 de la
secuencia de aminoácidos de la enzima se reemplaza por el aminoácido
glicina (Tabla 4 y respectivamente Seq ID No.8) o el aminoácido
metionina situado en la posición 199 de la secuencia de aminoácidos
de la enzima se reemplaza por el aminoácido valina (Tabla 5 y
respectivamente Seq ID No.10), después de lo cual, tras una
transformación de los genes de treonina deshidratasas, que se han
mutado de esta manera, en el seno de una célula hospedante
productora de treonina o de L-isoleucina, ésta forma
L-isoleucina en una cantidad aumentada.
9. Procedimiento para la producción por vía
microbiana de L-isoleucina, en el que en un gen,
presente in vitro, de una treonina deshidratasa - que
participa en la síntesis microbiana de la
L-isoleucina como enzima clave - procedente de
Corynebacterium glutamicum, mediante intercambio de bases
fuera de la región del gen que codifica el dominio alostérico de la
enzima, el aminoácido histidina situado en la posición 278 de la
secuencia de aminoácidos de la enzima se reemplaza por el aminoácido
arginina, y dentro de la región del gen que codifica el dominio
alostérico de la enzima, el aminoácido leucina situado en la
posición 351 de la secuencia de aminoácidos de la enzima se
reemplaza por el aminoácido serina (Tabla 6 y respectivamente Seq ID
No.12), después de lo cual, tras una transformación de un gen de
treonina deshidratasa, que se ha mutado de esta manera, en el seno
de una célula hospedante productora de treonina o de
L-isoleucina, ésta forma
L-isoleucina en una cantidad aumentada.
10. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones precedentes,
caracterizado porque
la célula hospedante para la transformación de un
gen mutado de treonina deshidratasa es Corynebacterium
glutamicum.
11. Gen de treonina deshidratasa con una región
de gen que codifica el dominio alostérico de la treonina
deshidratasa, que ha sido modificada por un intercambio de
bases,
caracterizado por
una secuencia de ADN según una de las secuencias
de nucleótidos representadas en las Seq ID No. 1, 3 y 5 (o en las
Tablas 1, 2 y 3), siendo las Seq ID No. 1, 3 y 5 partes integrantes
de la reivindicación.
12. Gen de treonina deshidratasa con una región
de gen que codifica eldominio alostérico de la treonina
deshidratasa, que ha sido modificada por uno o dos intercambios de
bases,
caracterizado por
una secuencia de ADN según una de las secuencias
de nucleótidos representadas en las Seq ID No. 7, 9 y 11 (o en las
Tablas 4, 5 y 6), siendo las Seq ID No. 7, 9 y 11 partes integrantes
de la reivindicación.
13. Vector, que contiene un gen de acuerdo con
una de las reivindicaciones 11 a 12.
14. Vector de acuerdo con la reivindicación 13
con un promotor inducible por IPTG, dispuesto delante del gen.
15. Célula transformada, que contiene un gen de
acuerdo con una de las reivindicaciones 11 a 12.
16. Célula transformada, que contiene un vector
de acuerdo con la reivindicación 13.
17. Célula transformada, que contiene un vector
de acuerdo con la reivindicación 14.
18. Célula transformada de acuerdo con la
reivindicación 16 ó 17 con una actividad de acetohidroxiácido
sintasa que se puede inhibir por L-valina.
19. Célula transformada de acuerdo con la
reivindicación 18,
caracterizada porque
es Escherichia coli K 12.
20. Célula transformada de acuerdo con la
reivindicación 15 ó 16
caracterizada porque
es Corynebacterium glutamicum.
21. Célula transformada de acuerdo con la
reivindicación 15, 16 ó 20,
caracterizada porque
ya no sintetiza la treonina deshidratasa de tipo
salvaje.
22. Treonina deshidratasa con un dominio
alostérico modificado por un intercambio de aminoácidos,
caracterizado por
una secuencia de aminoácidos según una de las
secuencias representadas en las Seq ID No. 2, 4 y 6 (o en las Tablas
1, 2 y 3), siendo las Seq ID No. 2, 4 y 6 partes integrantes de la
reivindicación.
\newpage
23. Treonina deshidratasa con un dominio
alostérico modificado por uno o dos intercambios de aminoácidos,
caracterizado por
una secuencia de aminoácidos según una de las
secuencias representadas en las Seq ID No. 8, 10 y 12 (o en las
Tablas 4, 5 y 6) siendo las Seq ID No. 8, 10 y 12 partes integrantes
de la reivindicación.
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