ES2197076T3 - Procedimiento para la produccion microbiana de l-valina. - Google Patents
Procedimiento para la produccion microbiana de l-valina.Info
- Publication number
- ES2197076T3 ES2197076T3 ES00906363T ES00906363T ES2197076T3 ES 2197076 T3 ES2197076 T3 ES 2197076T3 ES 00906363 T ES00906363 T ES 00906363T ES 00906363 T ES00906363 T ES 00906363T ES 2197076 T3 ES2197076 T3 ES 2197076T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- gene
- activity
- ilvd
- genes
- microorganism
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1014—Hydroxymethyl-, formyl-transferases (2.1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Procedimiento para la preparación microbiana de L- valina, en el que se refuerzan la actividad de la dihidroxiácido - deshidratasa (ilvD) y/o la expresión del gen de ilvD en un microorganismo.
Description
Procedimiento para la producción microbiana de
L-valina.
El presente invento se refiere a un procedimiento
para la preparación microbiana de L-valina de
acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, así como a células y
respectivamente microorganismos transformadas/os, que se pueden
emplear en el procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 14
a 17.
El aminoácido L-valina constituye
un producto importante comercialmente, que encuentra aplicación en
la nutrición de animales, en la nutrición de seres humanos y en la
medicina. Existe por lo tanto un interés generalizado en poner a
disposición procedimientos mejorados para la preparación de
L-valina.
La valina se puede preparar por síntesis química
o por biotecnología mediante fermentación de microorganismos
apropiados en soluciones nutritivas apropiadas. La ventaja de la
preparación por biotecnología por medio de microorganismos se
encuentra en la formación de la forma
estereo-isómera correcta, a saber de la forma L de
valina exenta de D-valina.
Diferentes especies de bacterias, tales como
p.ej. Escherichia coli, Serratia marcescens, Corynebacterium
glutamicum, Brevibacterium flavum o Brevibacterium
lactofermentum, pueden producir L-valina en una
solución nutritiva, que contiene glucosa. El documento de patente
de los EE.UU. 5.658.766 muestra que en el caso de Escherichia coli,
mediante mutación en la aminoacil - tARN - sintetasa se puede
conseguir una formación aumentada de L-valina. El
documento de solicitud de patente internacional WO 96 06926 muestra
además que mediante una auxotrofía con ácido lipónico se puede
conseguir un aumento de la formación de L-valina con
Escherichia coli. El documento de solicitud de patente
europea EP 0.694.614 A1 describe cepas de Escherichia coli,
que son portadores de resistencias frente al ácido
\alpha-ceto-butírico, y que en una
solución nutritiva que contiene glucosa producen
L-valina, L-isoleucina o
L-leucina.
En el documento EP 0.477.000 se muestra que
mediante mutagénesis de Corynebacterium o
Brevibacterium y selección en cuanto a resistencia a valina
se puede mejorar la formación de L-valina. En el
mismo documento EP se muestra también que por selección de
Corynebacterium o Brevibacterium en cuanto a
resistencia frente a diferentes compuestos análogos a piruvatos,
tales como \beta-fluoro-piruvato,
\beta-cloro-piruvato,
\beta-mercapto-piruvato o
piruvato de trimetilo, se puede conseguir una mejorada formación de
L-valina. Por Nakayama y colaboradores (Nakayama y
colaboradores, 1961, J. Gen. Appl. Microbiol. Jpn) es conocido que
las auxotrofías introducidas por mutaciones no dirigidas pueden
conducir a una acumulación mejorada de L-valina.
En el documento EP 0.356.739 A1 se muestra,
además de ello, que en el caso de una amplificación de la zona de
ADN que codifica la acetohidroxiácido - sintasa (ilvBN, véase
también la Figura 1) se mejora la formación de
L-valina mediante el plásmido pAJ22OV3.
El documento
EP-A-872.547 divulga que en el caso
de microorganismos de Escherichia, se puede aumentar la
producción de L-valina mediante una modificación
del gen de H+ATP. El gen puede incluir también el gen de ilvA.
La revista Journal of Bacteriology, 1993, tomo
175, Nº 17, páginas 5595-5603 divulga que la
acetohidroxiácido - sintasa y la isómero - reductasa (ilvC) son
catalizadores para reacciones consecutivas en la ruta para obtener,
entre otros compuestos, valina en el seno de Corynebacterium
glutamicum. La acetohidroxiácido - sintasa es codificada por
dos genes, ilvB e ilvN.
La cita Nucleic Acids Research, 1987, tomo 15, Nº
5, páginas 2137-2155, divulga la secuenciación del
operón ilvGMEDA de E. Coli, que contiene 5 genes, que
codifican 4 de las 5 enzimas, que son necesarias para la biosíntesis
de L-valina.
La cita de Gene, 1993, tomo 137, páginas
179-185, divulga la secuenciación del gen de ilv3 en
Saccharomyces cerevisiae, que se necesita para la biosíntesis
de la dihidroxiácido - hidratasa.
Es misión del presente invento poner a
disposición nuevos fundamentos para la producción microbiana de
L-valina, en particular con ayuda de bacterias
corineformes.
El problema planteado por esta misión se resuelve
conforme al invento mediante el recurso de que se refuerzan la
actividad de dihidroxiácido - deshidratasa (ilvD) y/o la expresión
del gen de ilvD en un microorganismo. Alternativamente a ello o en
combinación con ello se refuerzan las actividades de
acetohidroxiácido - sintasa (ilvBN) y de isómero - reductasa (ilvC)
y/o la expresión del gen de ilvBNC en un microorganismo. Para el
procedimiento conforme al invento pueden pasar a emplearse
adicionalmente microorganismos, en los que la actividad de por lo
menos una enzima, que participa en la ruta metabólica, que
disminuye la formación de L-valina, ha sido
debilitada o excluida. Así, en los procedimientos conformes al
invento se emplean preferiblemente microorganismos con una mutación
por defecto en el gen de treonina - deshidratasa (ilvA) y/o con una
mutación por defecto en uno o varios genes de la síntesis de
pantotenato.
Con los conceptos ``valina'' o
``L-valina'' se entiende, en el sentido del invento
reivindicado, no solamente el ácido libre, sino también una sal de
éste, tal como p.ej. la sal de calcio, sodio, amonio o potasio.
El concepto ``refuerzo'' describe el aumento de
la actividad intracelular de las mencionadas enzimas ilvD, ilvB,
ilvN e ilvC. Para el aumento de la actividad de las enzimas se
aumenta en particular la actividad endógena en el microorganismo.
Un aumento de la actividad de las enzimas se puede conseguir por
ejemplo mediante el recurso de que por alteración del centro
catalítico se efectúa una conversión aumentada del substrato o por
el hecho de que se suprime el efecto de agentes inhibidores de
enzimas. También se puede provocar una actividad enzimática
aumentada por aumento de la síntesis de enzimas, por ejemplo
mediante amplificación de genes o mediante exclusión de factores,
que reprimen la biosíntesis de enzimas. La actividad endógena de
enzimas se aumenta conforme al invento de modo preferido por
mutación del correspondiente gen endógeno. Tales mutaciones se
pueden generar de manera no dirigida ya sea de acuerdo con métodos
clásicos tales, por ejemplo irradiación con rayos UV o con productos
químicos que provocan mutaciones, o deliberadamente mediante métodos
de tecnología genética, tales como supresiones, inserciones o
intercambios de nucleótidos.
La amplificación de la expresión de genes se
efectúa conforme al invento de un modo preferido por aumento del
número de copias de los genes. Para ello, el gen (o los genes) se
incorpora(n) en una estructura artificial (construcción)
génica o en un vector, que contiene preferiblemente secuencias
reguladoras de genes, asociadas con los genes, en particular las
que refuerzan la expresión de los genes. A continuación un
microorganismo, preferiblemente Corynebacterium glutamicum,
se transforma con las correspondientes estructuras artificiales
génicas.
Se comprobó que mediante expresión reforzada del
gen de ilvD para la biosíntesis de valina a partir de
Corynebacterium glutamicum, que codifica la enzima
dihidroxiácido - deshidratasa, se produce L-valina
de una manera mejorada. Conforme al invento, junto a la expresión
reforzada de este gen, también la expresión reforzada de los genes
de ilvBN, que codifican la enzima acetohidroxiácido - sintasa, y
del gen de ilvC, que codifica la enzima isómero - reductasa, produce
en Corynebacterium glutamicum una formación mejorada de
L-valina. Una mejora adicional de la formación de
L-valina se consigue por sobreexpresión de todos
los mencionados genes en Corynebacterium glutamicum. Los
genes o estructuras artificiales génicas se pueden presentar en el
organismo hospedante ya sea en plásmidos con un diferente número de
copias o se pueden integrar y amplificar en el cromosoma.
Un aumento adicional de la expresión de genes se
puede producir - de manera alternativa o combinada con un aumento
del número de copias - mediante el refuerzo de factores
reguladores, que influyen positivamente sobre la expresión de
genes. Así, un refuerzo de elementos reguladores puede efectuarse en
el plano de la transcripción, utilizándose en particular señales de
transcripción reforzadas. También la región de promotor y de
regulación, que se encuentra secuencia arriba del gen estructural,
se puede mutar. De igual manera actúan ciertas casetes de
expresión, que se incorporan secuencia arriba del gen estructural.
Mediante promotores inducibles es posible adicionalmente aumentar la
expresión en el transcurso de una formación de
L-valina por fermentación. Junto a ello, sin
embargo, también es posible un refuerzo de la traducción,
mejorándose por ejemplo la estabilidad del ARNm (ácido ribonucleico
mensajero). Además, se pueden utilizar genes que codifican la
correspondiente enzima con una alta actividad. Alternativamente, se
puede conseguir además una sobreexpresión de los correspondientes
genes por modificación de la composición de los medios y
realización de la cultivación. Instrucciones acerca de ello las
encuentra un experto en la especialidad, entre otras, en las citas
de Martín y colaboradores (Bio/Technology 5,
137-146 (1987)), de Guerrero y colaboradores (Gene
138, 35-41 (1994)), de Tsuchiya y Morinaga
(Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), de Eikmanns y
colaboradores (Gene 102, 93-98 (1991)), en el
documento de patente europea EP 0.472.869, en la patente de los
EE.UU. 4.601.893, en las citas de Schwarzer y Pühler
(Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), de Reinscheid y
colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 60,
126-132 (1994)), de LaBarre y colaboradores
(Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)) y en
la solicitud de patente internacional WO 96/15246.
Para un refuerzo de la expresión de genes son
posibles asimismo todas las combinaciones imaginables de las medidas
antes mencionadas.
Los microorganismos, que se pueden emplear en el
procedimiento conforme al invento, pueden producir
L-valina a partir de glucosa, sacarosa, lactosa,
fructosa, maltosa, melazas, almidón, celulosa o a partir de glicerol
y etanol. Puede tratarse de bacterias
gram-positivas, p.ej. del género Bacillus, o
de bacterias corineformes del género Corynebacterium ya
mencionado o también de Arthrobacter. En el caso del género
Corynebacterium se mencionó en particular ya la especie
Corynebacterium glutamicum, que es conocida en el sector
especializado por su capacidad de formar aminoácidos. A esta especie
pertenecen cepas de tipo salvaje, tales como p.ej.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Brevibacterium
flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum
ATCC13869, Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240,
Corynebacterium melassecola ATCC19765 y otras.
Para el aislamiento del gen de ilvD de
Corynebacterium glutamicum u otros genes se establece
primeramente un banco de genes. El establecimiento de bancos de
genes se describe fundamentalmente en libros de texto y manuales
generalmente conocidos. Como ejemplos se mencionarán el libro de
texto de Winnacker: Gene und Klone. Eine Einführung in die
Gentechnologie [Genes y clones. Una introducción en la tecnología
genética] (Editorial Chemie, Weinheim, Alemania, 1990) o el manual
de Sambrook y colaboradores: Molecular Cloning, A Laboratory Manual
[Clonación molecular, un manual de laboratorio] (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989). Un banco de genes conocido es el de la
cepa W3110 de E. coli K-12, que fue
establecida en vectores \lambda por Kohara y colaboradores (Cell
50, 495-508 (1987)). Bathe y colaboradores
(Molecular and General Genetics, 252: 255-265,
1996) describen un banco de genes de Corynebacterium
glutamicum ATCC13032, que se estableció con ayuda del vector
cósmido SuperCos (Wahl y colaboradores, 1987, Proceedings of the
National Academy of Sciences USA 84: 2160-2164) en
E. coli K-12 NM554 (Raleigh y colaboradores,
1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575). Para
la producción de un banco de genes de Corynebacterium
glutamicum en Escherichia coli se pueden utilizar
también plásmidos tales como pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25,
807-818 (1979)) o pUC19 (Norrander y colaboradores,
1983, Gene, 26: 101-106). Para la producción de un
banco de genes de Corynebacterium glutamicum en
Corynebacterium glutamicum se pueden utilizar plásmidos
tales como pJC1 (Cremer y colaboradores, Mol. Gen. Genet. (1990)
220: 3221-3229) o pECM2 (Jäger y colaboradores, J.
Bacteriol (1992) 174: 5462-5465). Como hospedante
son idóneas en especial las cepas de bacterias que tienen defecto
de restricción y recombinación. Un ejemplo de ello es la cepa de
Escherichia coli DH5\alphamcr, que había sido
descrita por Grant y colaboradores (Proceedings of the National
Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649), o la
cepa Corynebacterium glutamicum R127, que había sido aislada
por Liebl y colaboradores (FEMS Lett (1989) 65:
299-304).
El banco de genes se incorpora a continuación en
una cepa indicadora por transformación (Hanahan, Journal of
Molecular Biology, 166, 557-580, 1983) o por
electroporación (Tauch y colaboradores, 1994, FEMS Microbiological
Letters, 123: 343-347). La cepa indicadora se
distingue por el hecho de posee una mutación en el gen que
interesa, que provoca un fenotipo detectable, p.ej. una auxotrofía.
Las cepas indicadoras y respectivamente mutantes son obtenibles a
partir de fuentes publicadas o de colecciones de cepas o deben
eventualmente ser producidas por sí mismas. Dentro del marco del
presente invento se ha aislado la mutante R127/7 de
Corynebacterium glutamicum, que tiene defecto en el gen ilvD
que codifica la dihidroxiácido deshidratasa. Después de
transformación de la cepa indicadora, tal como p.ej. la mutante
R127/7 de ilvD, con un plásmido recombinante que lleva el gen que
interesa, tal como p.ej. el gen de ilvD y después de expresión del
mismo, la cepa indicadora es prototrofa en lo que se refiere a la
correspondiente propiedad, tal como p.ej. la necesidad de consumir
L-valina.
El gen o fragmento de ADN que se ha aislado de
esta manera se puede caracterizar por determinación de la secuencia,
tal como p.ej. se describe en la cita de Sanger y colaboradores
(Proceedings of the National of Sciences of the United States of
America USA, 74: 5463-5467, 1977). A continuación se
puede analizar el grado de identidad con genes conocidos, que están
contenidos en bancos de datos tal como p.ej. el GenBank (Benson y
colaboradores, 1998, Nucleic Acids Research, 26:
1-7), con métodos publicados (Altschul y
colaboradores, 1990, Journal of Molecular Biology 215:
403-410).
De esta manera se obtuvo la secuencia de ADN de
Corynebacterium glutamicum que codifica el gen ilvD, que es
parte componente del presente invento como SEQ ID NO 1. Además a
partir de la secuencia de ADN presente se dedujeron con los métodos
antes descritos las secuencias de aminoácidos de las
correspondientes enzimas. En SEQ ID NO 2 se representa la secuencia
resultante de aminoácidos del producto del gen ilvC, a saber la
dihidroxiácido deshidratasa.
El gen caracterizado de esta manera se puede
llevar a extrusión a continuación individualmente o en combinación
con otros en un apropiado microorganismo. Un método conocido para
expresar o sobreexpresar genes consiste en amplificar a estos con
ayuda de vectores de plásmidos que además de ello pueden estar
provistos de señales de expresión. Como vectores de plásmidos entran
en cuestión aquellos que pueden replicarse en los correspondientes
microorganismos. Para el Corynebacterium glutamicum entran en
cuestión p.ej. los vectores pEKEx1 (Eikmanns y colaboradores, Gene
102:93-98 (1991)) o pZ8-1 (documento
de patente europea 0 375 889) o pEKEx2 (Eikmanns y colaboradores,
Microbiology 140: 1817-1828 (1994) o pECM2 (Jäger y
colaboradores, Journal of Bacteriology 174(16):
5462-5465 (1992)). Ejemplos de tales plásmidos son
pJC1ilvD, pECM3ilvBNCD, y pJC1ilvBNCD. Estos plásmidos son los
vectores pendulantes de Escherichia coli y Corynebacterium
glutamicum que son portadores del gen ilvD y respectivamente
del gen ilvD junto con los genes ilvB, ilvN e ilvC.
Los autores del invento han encontrado además que
el refuerzo del gen individualmente o en combinación con los genes
ilvB, ilvN e ilvC repercute de manera ventajosa en aquellos
microorganismos que presentan una síntesis reducida del aminoácido
L-isoleucina. Esta síntesis reducida se puede
conseguir mediante supresión del gen ilvA, que codifica la enzima
treonina deshidratasa que es específica para la síntesis de
L-isoleucina. La supresión se puede efectuar
mediante técnicas de ADN recombinante dirigidas. Con ayuda de estos
métodos se puede suprimir por ejemplo en el cromosoma el gen ilvA
que codifica la treonina deshidratasa. Métodos apropiados para ello
se describen en la las citas de Schäfer y colaboradores (Gene (1994)
145:69-73) o también Link y colaboradores (Journal
of Bacteriology (1998) 179:6228-6237). También se
pueden suprimir solamente partes del gen o también se pueden
intercambiar fragmentos mutados del gen de treonina deshidratasa.
Por supresión se consigue de esta manera una pérdida de la
actividad de treonina deshidratasa. Un ejemplo de una de tales
mutantes es la cepa ATCC13032\DeltailvA de Corynebacterium
glutamicum, que lleva una supresión en el gen de ilvA.
Los autores del invento han encontrado además que
el refuerzo de los genes ilvD, ilvB, ilvN e ilvC en una combinación
adicional con la síntesis reducida de
D-pantotenato, preferiblemente en combinación con
una supresión adicional del gen ilvA, repercute en microorganismos
de manera ventajosa sobre la formación de L-valina,
así por ejemplo mediante supresiones en el gen panB y panC. La
síntesis reducida de D-pantotenato se puede
conseguir por debilitación o exclusión de las correspondientes
enzimas de biosíntesis o de sus actividades. Para ello entran en
cuestión por ejemplo las enzimas cetopantoatohidroximetil -
transferasa (EC 2.1.2.11), cetopantoato - reductasa, pantotenato -
ligasa (EC 6.3.2.1) y aspartato - descarboxilasa (EC 4.1.1.11). Una
posibilidad de excluir o debilitar enzimas y sus actividades son
procedimientos de mutagénesis.
A éstos pertenecen procedimientos no dirigidos,
que utilizan reactivos químicos, tales como p.ej.
N-metil-N-nitro-N-nitroso-guanidina,
o también irradiación por UV para la mutagénesis, con una búsqueda
subsiguiente de los deseados microorganismos en cuanto a necesidad
de D-pantotenato. Los procedimientos para provocar
una mutación y buscar mutantes son conocidos en términos generales y
se pueden rebuscar, entre otras citas en las de Miller (A Short
Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for
Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1992)) o en el Manual ``Manual of Methods for
General Bacteriology'' de la American Society for Bacteriology
(Washington D.C., EE.UU, 1981).
Además pertenecen a estas tecnologías de ADN
recombinante dirigidas. Con ayuda de estos métodos se puede suprimir
por ejemplo los genes panB, panC, panE y panD que codifican la
cetopantoatohidroximetil - transferasa, la pantotenato - ligasa, la
cetopantoin ácido - reductasa o la aspartato - descarboxilasa
individualmente o también en común dentro del cromosoma. Métodos
apropiados para ello se describen en las citas de Schäfer y
colaboradores (Gene (1994) 145: 69-73) o también de
Link y colaboradores (Journal of Bacteriology (1998) 179:
6228-6237). También se pueden suprimir solamente
partes de los genes o también se pueden intercambiar fragmentos
mutados de la cetopantoatohidroximetil - transferasa, la pantotenato
- ligasa, la cetopantoin ácido - reductasa y la aspartato -
descarboxilasa. Por supresión o intercambio se consigue de esta
manera una pérdida o una reducción de la respectiva actividad de
enzimas. Un ejemplo de una de tales mutantes es la cepa
ATCC13032\DeltapanBC de Corynebacterium glutamicum, que es
portadora de una supresión en el operón de panBC.
Los microorganismos producidos conformes al
invento se pueden cultivar en régimen continuo o discontinuo en el
procedimiento batch (cultivación por tandas) o por el procedimiento
fed batch (procedimiento de afluencia) o repeated fed batch
(procedimiento de afluencia repetitivo) con el fin de producir
L-valina. Un resumen acerca de métodos de
cultivación conocidos se describen en el libro de texto de Chmiel
(Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik
[Técnica de bioprocesos 1. Introducción en la técnica de
bioprocedimientos] (editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1991) o en
el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere
Einrichtungen [biorreactores y disposiciones periféricas]
(editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbadenm 1994)).
El método de cultivación que se ha de utilizar
debe cumplir de manera apropiada las exigencias de los respectivos
microorganismos. Descripciones de medios de cultivo de diferentes
microorganismos están contenidos en el manual ``Manual of Methods
for General Bacteriology'' [manual de métodos para bacteriología
general] de la American Society of Bacteriology (Washington D.C.,
EE.UU., 1981). Como fuente de carbono se pueden utilizar azúcares e
hidratos de carbono tales como p.ej. glucosa, sacarosa, lactosa,
fructosa, maltosa, melaza, almidón y celulosa, aceites y grasas
tales como p.ej. aceite de soja, aceite de girasol, aceite de
cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos tales como p.ej. ácido
palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como
p.ej. glicerol y etanol y ácidos orgánicos tales como p.ej. ácido
acético. Estas sustancias se pueden utilizar individualmente o en
forma de mezclas. Como fuente de nitrógeno se pueden utilizar
compuestos orgánicos que contienen nitrógeno tales como peptonas,
un extracto de levadura, un extracto de carne, un extracto de
malta, agua de maceración de maíz, harina de haba de soja y urea o
compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de
amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio.
Las fuentes de nitrógeno se pueden utilizar de modo individual o en
forma de mezclas. Como fuente de fósforo se pueden utilizar
dihidrógeno fosfato de potasio o hidrógeno fosfato de dipotasio o
las correspondientes sales que contienen sodio. El medio de cultivo
debe contener además sales de metales, tales como p.ej. sulfato de
magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el
crecimiento. Finalmente se pueden emplear sustancias hormonales
somatotropas tales como aminoácidos y vitaminas, de modo adicional a
las sustancias antes mencionadas. Las sustancias de partida
mencionadas se pueden añadir al cultivo en forma de una tanda para
uso en una sola vez o se pueden añadir como alimento de manera
apropiada durante la cultivación.
Para el control del pH del cultivo se emplean de
manera apropiada compuestos de carácter básico tales como hidróxido
de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o compuestos de carácter
ácido, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para el
control del desarrollo de espuma, se pueden emplear agentes
antiespumantes tales como p.ej. ésteres de poliglicoles con ácidos
grasos. Para la conservación de la estabilidad de plásmidos se
pueden añadir al medio apropiadas sustancias con acción selectiva,
p.ej. antibióticos. Con el fin de conservar unas condiciones
aerobias se incorporan en el cultivo oxígeno o mezclas de gases que
contienen oxígeno, tales como p.ej. aire. La temperatura del
cultivo está situada normalmente entre 20ºC y 50ºC y de modo
preferido entre 25ºC y 45ºC. La cultivación se prosigue hasta tanto
que se haya formado una cantidad máxima de
L-valina. Esta meta se alcanza normalmente en el
transcurso de un período de tiempo de 10 horas a 160 horas.
La concentración de L-valina
formada se puede determinar con procedimientos conocidos (Jones y
Gilligan (1983) Journal of Chromatography
266:471-482).
El invento se explica con mayor detalle con ayuda
de los siguientes ejemplos de realización.
La cepa R127 de Corynebacterium glutamicum
(Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 61:329-334)
se mutagenizó con
N-metil-N-nitro-N-nitroso-guanidina
(Sambrook y colaboradores, Molecular cloning. A laboratory manual
(1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press). Para ello, 5 ml de un
cultivo de Corynebacterium glutamicum que se habían hecho
crecer durante una noche se mezclaron con 250 \mul de
N-metil-N-nitro-N-nitroso-guanidina
(5 mg/ml de dimetil-formamida) y se incubaron
durante 30 minutos a 30ºC y 200 rpm (Adelberg 1958, Journal of
Bacteriology 76:326). Las células se lavaron a continuación con una
solución estéril de NaCl (al 0,9%). Mediante siembra de réplicas
sobre placas de medio mínimo CGXII con 15 g/l de agar (Keilhauer y
colaboradores, Journal of Bacteriology
175:5595-5603) se aislaron mutantes, que crecieron
solamente al añadir L-valina,
L-isoleucina y L-leucina.
La actividad enzimática de la dihidroxiácido -
deshidratasa se determinó en el extracto bruto de estas mutantes.
Para ello, los clones se cultivaron en 60 ml de un medio LB y se
separaron por centrifugación en la fase de crecimiento exponencial.
El sedimento celular se lavó una vez con un tampón de fosfato de
potasio 0,05 M, y se volvió a suspender el mismo tampón. La
disgregación celular se efectuó mediante tratamiento con
ultrasonidos durante 10 minutos (Branson- Sonifier
W-250, Branson Sonic Power Co, Danbury, EE.UU.). A
continuación, los desechos celulares se separaron mediante una
centrifugación durante 30 minutos a 13.000 rpm y 4ºC, y el material
sobrenadante se empleó como extracto bruto en el ensayo enzimático.
La tanda de reacción del ensayo enzimático contenía 0,2 ml de
Tris/HCl 0,25 M, de pH 8, 0,05 ml de un extracto bruto, y 0,15 ml de
\alpha,\beta-dihidroxi-\beta-metil-valerato
85 mM. Las tandas de ensayo se incubaron a 30ºC, después de 10, 20
y 30 minutos se sacaron cada vez 200 \mul de muestras y se
determinó su concentración de ceto-valerato de
metilo mediante una analítica por HPLC [cromatografía de líquido de
alto rendimiento] (Hara y colaboradores, 1985, Analytica Chimica
Acta 172:167-173). Tal como lo muestra la Tabla 1,
la cepa R127/7 no presenta ninguna actividad de dihidroxiácido
deshidratasa, al contrario de lo cual las actividades de isómero
reductasa y aceto-hidroxiácido sintasa están todavía
presentes como otras enzimas de la síntesis de los aminoácidos de
cadenas ramificadas.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|c|c|c|}\hline\multicolumn{4}{|l|}{Actividades específicas ( \mu mol/min y mg de proteína) de las enzimas para la}\\\multicolumn{4}{|l|}{biosíntesis de valina en cepas de Corynebacterium glutamicum }\\\hline Cepa \+ Dihidroxiácido - \+ Isómero - \+ Acetohidroxiácido – \\ \+ deshidratasa \+ reductasa \+ sintasa \\\hline R127 \+ 0,003 \+ 0,05 \+ 0,07 \\\hline R127/7 \+ 0,000 \+ 0,06 \+ 0,09 \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
El ADN cromosomal (ADNc) procedente de
Corynebacterium glutamicum R127 se aisló, tal como se
describe en la cita de Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9 (1990)
84-87).
Este ADN se cortó con la enzima de restricción
Sau3A (Boehringer Mannheim) y se separó mediante una centrifugación
en gradientes de densidades de sacarosa (Sambrook y colaboradores,
Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour
Laboratory Press). La fracción que tenía el intervalo de tamaños de
fragmentos de aproximadamente 6-10 kb se empleó para
la ligación con el vector pJC1 (Cremer y colaboradores, Molecular
and General Genetics 220 (1990) 478-480). El vector
pJC1 fue para ello linealizado con BamHI y desfosforilado. Cinco
nanogramos (5 ng) de éstos se ligaron con 20 ng de la mencionada
fracción del ADN cromosomal y con ello se transformó la mutante
R127/7 por electroporación (Haynes y Britz, FEMS Microbiology
Letters 61 (1989) 329-334). Las transformantes se
ensayaron en cuanto a la capacidad de poder crecer sobre placas de
agar CGXII sin la adición de aminoácidos de cadenas ramificadas. De
las más de 5.000 transformantes, ensayadas después de siembra de
réplicas en placas y de incubación durante dos días a 30ºC,
crecieron 8 clones sobre placas de medio mínimo. De estos clones se
llevaron a cabo preparaciones con plásmidos, tal como se describe
en la cita de Schwarzer y colaboradores (Bio/Technology (1990)
9:84-87). Los análisis por restricción del ADN de
plásmido dieron como resultado que en la totalidad de los 8 clones
estaba contenido el mismo plásmido, denominado en lo sucesivo pRV.
El plásmido es portador de un inserto de 4,3 kb (kilobases) y fue
ensayado por retransformación en cuanto a su capacidad para
complementar a la mutante R127/7 de ilvD. Por subclonación, la
región responsable de la complementación de la mutante R127/7 se
delimitó a un fragmento de ScaI/XhoI de 2,9 kb (Figura 2).
La secuenciación de ácido nucleico del fragmento
de ScaI/XhoI de 2,9 kb se llevó a cabo de acuerdo con el método de
interrupción de cadena con didesoxi de Sanger y colaboradores
(Proceedings of the National of Sciences of the United States of
America USA (1977) 74:5463-5467). En tal caso se
utilizó el estuche de secuenciación con lectura automática
Auto-Read Sequencing kit (Amersham Pharmacia
Biotech, Uppsala, Suecia). El análisis por electroforesis en gel se
efectuó con el aparato automático de secuenciación por fluorescencia
láser (A.L.F.) de (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). La
obtenida secuencia de nucleótidos se analizó con el paquete de
programas HUSAR (Release 4.0, EMBL, Cambridge, GB [Gran Bretaña]).
La secuencia de nucleótidos se reproduce como SEQ ID NO 1. El
análisis dio como resultado un cuadro de lectura abierto de 1.836
pares de bases, que fue identificado como el gen ilvD y que
codifica un polipéptido de 612 aminoácidos, que se reproduce como
SEQ ID NO 2.
El plásmido pRV se digirió con las enzimas de
restricción ScaI y XhoI, correspondiendo a los datos del fabricante
de las enzimas de restricción (Roche, Boehringer Mannheim). A
continuación, el fragmento de ilvD de 2,9 kb se aisló mediante
columnas con intercambiadores de iones (Quiagen, Hilden). El extremo
colgante de la fracción de corte con XhoI del fragmento aislado se
rellenó con la polimerasa de Klenow. El vector pJC1 (Cremer y
colaboradores, Mol. Gen. Genet. (1990) 220:478-480)
se cortó con PstI, se trató asimismo con la polimerasa de Klenow, y
a continuación se ligaron el fragmento y el vector. Con la tanda de
ligación se transformó la cepa de E. coli DH5\alphamcr
(Grant y colaboradores, Proceedings of the National of Sciences of
the United States of America USA, 87 (1990)
4645-4649) (Hanahan, Journal of Molecular Biology
166 (1983) 557-580). Mediante preparaciones con
plásmidos (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning. A
laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) de
clones se identificó un gen que contenía el plásmido recombinante
pJC1 ilvD. Con este plásmido se transformó mediante electroporación
la cepa Corynebacterium glutamicum ATCC13032, tal como se
describe en la cita de Haynes y colaboradores (1989, FEMS
Microbiol. Lett. 61:329-334). De los pJC1 de
Corynebacterium glutamicum ATCC13032 y pJC1 ilvD de
Corynebacterium glutamicum ATCC13032 se determinó a
continuación la actividad de dihidroxiácido - deshidratasa
codificada por ilvD. Para ello, los clones se cultivaron en 60 ml de
un medio LB y se separaron por centrifugación en la fase de
crecimiento exponencial. El sedimento celular se lavó una vez con
0,05 M de tampón de fosfato de potasio y se volvió a suspender en
el mismo tampón. La disgregación celular se efectuó mediante
tratamiento con ultrasonidos durante 10 minutos (en el sonificador
Branson-Sonifier W-250, Branson
Sonic Power Co, Danbury, EE.UU.). A continuación, los desechos
celulares se separaron por centrifugación durante 30 minutos a
13.000 rpm y 4ºC, y el material sobrenadante se empleó como
extracto bruto en el ensayo enzimático. La tanda de reacción del
ensayo enzimático contenía 0,2 ml de Tris/HCl 0,25 M, de pH 8, 0,05
ml de un extracto bruto y 0,15 ml de
\alpha,\beta-dihidroxi-\beta-metil-
valerato 65 mM. Las tandas de ensayo se incubaron a 30ºC, después de
10, 20 y 30 minutos se tomaron muestras cada una de 200 \mul y se
determinó su concentración de ceto-valerato de
metilo mediante una analítica por HPLC (Hara y colaboradores, 1985,
Analytica Chimica Acta 172:167-173). Tal como lo
muestra la Tabla 2, la cepa Corynebacterium glutamicum
ATCC13032 pJC1 ilvD presenta una actividad aumentada de
dihidroxiácido - deshidratasa en comparación con la cepa
testigo.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|c|}\hline\multicolumn{2}{|l|}{Actividad específica ( \mu mol/min y mg de proteína) de la dihidroxiácido}\\\multicolumn{2}{|l|}{-deshidratasa en Corynebacterium glutamicum ATCC 13032}\\\hline Plásmido \+ Dihidroxiácido - deshidratasa \\\hline pJC1 \+ 0,008 \\\hline PJC1ilvD \+ 0,050 \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
La supresión (deleción) interna del gen ilvA de
Corynebacterium glutamicum ATCC13032 se llevó a cabo con el
sistema para intercambio de genes que ha sido descrito en la cita de
Schäfer y colaboradores (Gene 145:69-73 (1994)).
Para la construcción del vector de desactivación
pK19mobsacB\DeltailvA se eliminó un fragmento interno de BgIII
con 241 pb (pares de bases) a partir del gen de ilvA presente
dentro de un fragmento de EcoRI en el vector pBM21 (Möckel y
colaboradores, 1994, Molecular Microbiology
13:833-842). Para ello, el vector se cortó con BgIII
y, después de haber separado el fragmento interno de BgIII de ilvA
mediante electroforesis en gel de agarosa, se volvió a ligar. A
continuación, a partir del vector se aisló el gen incompleto como
fragmento de EcoRI y se ligó dentro del vector pK19mobsacB
linealizado con EcoRI (Schäfer 1994, Gene
145:69-73). El vector de desactivación
pK19mobsacB\DeltailvA obtenido se incorporó por transformación en
la cepa S 17-1 de E. coli (Hanahan 1983, Journal of
Molecular Biology 166:557-580) y se transfirió por
conjugación hacia Corynebacterium glutamicum ATCC13032
(Schäfer y colaboradores, 1990, Journal of Bacteriology
172:1663-1666). Se obtuvieron clones resistentes a
kanamicina de Corynebacterium glutamicum, en los cuales el
vector de desactivación se presentaba integrado en el genoma. Con
el fin de seleccionar en cuanto a la excisión del vector, clones
resistentes a kanamicina se sembraron sobre placas en un medio LB
que contenía sacarosa (Sambrook y colaboradores, Molecular cloning.
A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) con
15 g/ml de agar, 2% de glucosa y 10% de sacarosa, y se obtuvieron
colonias que había perdido de nuevo el vector mediante un segundo
suceso de recombinación (Jäger y colaboradores, 1992, Journal of
Bacteriology 174:5462-5465). Mediante
sobreinoculación sobre placas con medio mínimo (medio CGXII) con 15
g/l de agar (Keilhauer y colaboradores, Journal of Bacteriology 175
(1993) 5595-5603) con y sin 2 mM de
L-isoleucina o con y sin 50 \mug/ml de
kanamicina, se aislaron 36 clones, que mediante la excisión del
vector eran sensibles a kanamicina y auxotrofos para isoleucina, y
en los que entonces se presentaba en el genoma el gen de ilvA
incompleto (alelo\DeltailvA). Una cepa fue designada como
ATCC13032\DeltailvA y se utilizó ulteriormente.
El ADN cromosomal de C. glutamicum
ATCC13032 se aisló y se cortó con la endonucleasa de restricción
Sau3A. Después de una separación por electroforesis en gel se
extrajeron fragmentos de ADN en un intervalo de tamaños de 3 a 7, y
respectivamente de 9 a 20 kb, y seguidamente se ligaron en el sitio
de corte con BamHI singular del vector pBR322. Las colonias
portadoras de un inserto se aislaron con ayuda de su sensibilidad a
tetraciclina después de haber sobreinoculado sobre placas de LB con
10 \mug/ml de tetraciclina. Mediante preparaciones con plásmidos
(Sambrook y colaboradores, Molecular cloning. A laboratory manual
(1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) de clones agrupados, se
aislaron 8 agrupaciones de plásmidos, cada una de las cuales
contenía 400 plásmidos con un tamaño de inserto de 9 a 40 kb, y 9
agrupaciones de plásmidos cada una de las cuales contenía 500
plásmidos con un tamaño de inserto de 3 a 7 kb. La mutante SJ2 de
panB de E. coli (Cronan y colaboradores, 1982, J.
Bacteriol. 149: 916-922) se transformó con este
banco de genes mediante electroporación (Wehrmann y colaboradores,
1994, Microbiology 140: 3349-3356). Las tandas de
transformación se sembraron directamente sobre un medio CGXII (J.
Bacteriol. (1993) 175:5595-5603). De los clones, que
estaban en situación de crecer sin suplementación con pantotenato,
se aisló el ADN de plásmido (Sambrook y colaboradores, 1989) y por
retransformación se obtuvieron 8 clones, cuya necesidad de
D-pantotenato se confirmó. Con los 8 plásmidos se
llevó a cabo un cartografiado por restricción. Uno de los vectores
investigados, denominado en lo sucesivo pUR1, contenía un inserto de
9,3 kb (Figura 3). La transformación de la mutante DV39 de E.
coli panC_(Vallari y colaboradores, 1985, J. Bacteriol.
164: 136-142) dio como resultado que el vector
pUR1 también estaba en situación de complementar el defecto de panC
de esta mutante. Un fragmento con un tamaño de 2,2 kb del inserto
de pUR1 se secuenció de acuerdo con el método de interrupción de
cadenas con didesoxi de Sanger y colaboradores (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1977) 74: 5463-5467). El análisis por
electroforesis en gel se efectuó con el aparato secuenciador
automático de fluorescencia con láser (A.L.F.) de Amersham
Pharmacia Biotech (Uppsala, Suecia). La obtenida secuencia de
nucleótidos se analizó con el paquete de programas HUSAR (Release
4.0, EMBL, Cambridge, GB). La secuencia de nucleótidos se reproduce
como SEQ ID NO 3. El análisis proporcionó la identificación de dos
cuadros de lectura abiertos. Un cuadro de lectura abierto abarca
813 pares de bases y tiene altas homologías con genes de panB ya
conocidos, procedentes de otros organismos. El gen de panB
procedente de C. glutamicum codifica un polipéptido de 271
aminoácidos (véase la SEQ ID NO 4). El segundo cuadro de lectura
abierto abarca 837 pares de bases y presenta altas homologías con
genes de panC ya conocidos, procedentes de otros organismos. El gen
de panC procedente de C. glutamicum codifica un polipéptido
de 279 aminoácidos (véase SEQ ID NO 5).
El fragmento genómico de panBC de
Corynebacterium glutamicum ATCC13032 así de el de
Corynebacterium glutamicum ATCC13032\deltailvA se trataron
con el sistema para el intercambio de genes descrito por Schäfer y
colaboradores (Gene 145: 69-73 (1994). Para la
construcción del vector de supresión pK19mobsacB\DeltapanBC, en
primer lugar el fragmento de SspI/SalI con panBC que tenía un
tamaño de 3,95 kb se ligó con pUC18, que previamente había sido
cortado con SmalI/SalI. A continuación se eliminó un fragmento de
EcoRI/NruI que tenía un tamaño de 1.293 pb a partir de la región
solapada del gen de panBC mediante digestión por restricción y
religación. Con el fin de hacer posible la transclonación en
pK19mobsacB, con los 2 cebadores
5'-GAGAACTTAATCGAGCAACACCCCTG,
5'-GCGCCACGCCTAGCCTTGGCCCTCAA y con la reacción en
cadena de polimerasa (PCR) la región de panBC suprimida se amplificó
en pUC18, para obtener de esta manera un fragmento \DeltapanBC de
0,5 kb, que lleva junto a los extremos unos sitios de corte con
SalI y respectivamente con EcoRI. La PCR se llevó a cabo de acuerdo
con Sambrook y colaboradores (Molecular cloning. A laboratory
manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) con una
temperatura de reanillamiento de 55ºC. El fragmento obtenido fue
ligado con el vector pK19mobsac, que previamente había sido cortado
con EcoRI y SalI y había sido tratado con fosfatasa alcalina. El
vector de desactivación pK19mobsacB\DeltapanBC se incorporó por
transformación en la cepa S 17-1 de Escherichia
coli (Hanahan (1983) J. Mol. Biol. 166: 557- 580) y se
transfirió por conjugación hacia Corynebacterium glutamicum
ATCC13032 (Schäfer y colaboradores (1990) J. Bacteriol. 172:
1663-1666). Se obtuvieron clones resistentes a
kanamicina de Corynebacterium glutamicum, en los que el
vector de desactivación se presentaba integrado en el genoma. Con el
fin de seleccionar en cuanto a la excisión del vector, clones
resistentes a kanamicina se sembraron sobre un medio LB que
contenía sacarosa (Sambrook y colaboradores (Molecular cloning. A
laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) con
15 g/l de agar, 2% de glucosa y 10% de sacarosa, y se obtuvieron
colonias que habían perdido de nuevo el vector mediante un segundo
suceso de recombinación (Jäger y colaboradores, 1992, Journal of
Bacteriology 174: 5462-5465). Por sobreinoculación
sobre placas de medio mínimo (medio CGXII con 15 g/l de agar
(Keilhauer y colaboradores, Journal of Bacteriology 175:
5595-5603) con y sin 2 mM de
L-isoleucina o con y sin 50 mg/ml de kanamicina, se
aislaron 36 clones que, por causa de la excisión del vector, eran
sensibles a kanamicina y auxotrófos para isoleucina, y en los que
entonces se presentaba en el genoma la secuencia de los genes de pan
incompletos (alelos \DeltapanBC). Una cepa fue designada como
ATCC13032\DeltapanBC. De la misma manera que se describe
detalladamente en este Ejemplo, se introdujo también la supresión
(deleción) de panBC en ATCC13032\DeltailvA, para obtener la cepa
ATCC13032\DeltailvA\DeltapanBC.
Los genes de la acetohidroxiácido - sintasa
(ilvBN) y de la isómero - reductasa ilvC (Cordes y colaboradores,
Gene 112: 113-116 y Keilhauer y colaboradores,
Journal of Bacteriology 175: 5595-5603) y de la
dihidroxiácido - deshidratasa (ilvD) (Ejemplo 1) se clonaron para
la expresión en el vector pECM3. El vector pECM3 es un derivado de
pECM2 (Jäger y colaboradores, 1992, Journal of Bacteriology 174:
5462-5465), que resultó por supresión (deleción) del
fragmento de ADN para BamH/BgIII con una longitud de
aproximadamente 1 kpb (kilo pares de bases), que lleva el gen de
resistencia a kanamicina.
En el vector pKK5 (Cordes y colaboradores, 1992,
Gene 112: 113-116) los genes de ilvBNC se
presentaban ya clonados en el vector pJC1 (Cremer y colaboradores,
1990, Molecular and General Genetics 220: 478-480).
A partir de este vector, se aisló un fragmento para
XbaI-ilvBNC de 5,7 kb, y conjuntamente con un
fragmento para XbaI de 3,1 kb del vector pRV, que contenía el gen
de ilvD, se incorporó en el vector pECM3 linealizado con XbaI. La
tanda de ligación se transformó en este caso en el seno de la cepa
DH5\alphamcr de E. coli. A partir de un clon se
obtuvo el plásmido pECM3ilvBNCD.
Mediante electroporación (Haynes 1989, FEMS
Microbiology Letters 61: 329-334) y selección en
cuanto a resistencia a cloramfenicol (3 \mug/ml) se incorporó el
plásmido pECM3ilvBNCD en la cepa ATCC13032\DeltailvA, y se obtuvo
la cepa ATCC13032\DeltailvA/pECM3ilvBNCD.
Para la investigación de la formación de valina
por ellas, las cepas indicadas en la Tabla 4 se cultivaron
previamente durante 14 h a 30ºC en 60 ml de un medio Brain Heart
Infusión [infusión de corazón y cerebro] (Difco Laboratories,
Detroit, EE.UU.). A continuación, las células se lavaron una vez con
0,9%(p/v) de una solución de NaCl y se inocularon con esta
suspensión cada vez 60 ml de un medio CGXII, de tal manera que la
densidad óptica OD600 fue de 0,5. El medio era idéntico al medio
descrito en la cita de Keilhauer y colaboradores, (Journal of
Bacteriology (1993) 175: 5595-5603). Para la
cultivación de las cepas \DeltailvA, el medio contenía sin
embargo adicionalmente 250 mg/l de L-isoleucina.
Éste se representa en la Tabla 3.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|c|}\hline\multicolumn{2}{|l|}{Composición del medio CGXII}\\\hline Componente \+ Concentración \\\hline (NH _{4})_{2} SO _{4} \+ 20 g/l \\\hline Urea \+ 5 g/l \\\hline KH _{2} PO _{4} \+ 1 g/l \\\hline K _{2} HPO _{4} \+ 1 g/l \\\hline Mg _{2} O _{4} *7 H _{2} O \+ 0,25 g/l \\\hline Ácido 3-morfolino-propano-sulfónico \+ 42 g/l \\\hline CaCl _{2} \+ 10 mg/l \\\hline FeSO _{4} *7 H _{2} O \+ 10 mg/l \\\hline MnSO _{4} *H _{2} O \+ 10 mg/l \\\hline ZnSO _{4} *7 H _{2} O \+ 1 mg/l \\\hline CuSO _{4} \+ 0,2 ml \\\hline NiCl _{2} *6 H _{2} O \+ 0,02 mg/l \\\hline Biotina (pH7) \+ 0,2 mg/l \\\hline Glucosa \+ 40 g/l \\\hline Ácido protocatéquico \+ 0,03 mg/l \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Después de una cultivación durante 48 horas se
tomaron muestras, las células se separaron por centrifugación y el
material sobrenadante se filtró en condiciones estériles. La
concentración de L-valina en el material
sobrenadante se determinó con ayuda de la cromatografía de líquido
a alta presión (HPLC) con derivatización de los aminoácidos en una
columna preliminar con o-ftalodialdehído, tal como
se establece en la cita de Jones y Gilligan (J. Chromatogr. 266
(1983) 471-482). Los resultados se representan en
la Tabla 4.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|c|}\hline\multicolumn{2}{|l|}{Producción de L-valina con diferentes cepas de Corynebacterium glutamicum }\\\hline C. Glutamicum \+ L-valina (mM) \\\hline ATCC 13032 \+ 0,5 \\\hline ATCC 13032 pJC1ilvD \+ 2,2 \\\hline ATCC 13032 pJC1ilvBNC1 \+ 20,0 \\\hline ATCC 13032 pJC1ilvBNCD \+ 26,2 \\\hline ATCC 13032 \Delta ilvA \+ 2,7 \\\hline ATCC 13032 \Delta ilvA pJC1ilvD1 \+ 7,0 \\\hline ATCC 13032 \Delta ilvA pJC1ilvBNCD \+ 28,5 \\\hline ATCC 13032 \Delta panBC \+ 8,2 \\\hline ATCC 13032 \Delta ilvA \Delta panBC \+ 31,1 \\\hline ATCC 13032 \Delta ilvA \Delta panBC pJC1ilvBNCD \+ 72,7 \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
(1) DATOS GENERALES:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Forschungszentrum Juelich GmbH
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Apartado de Correos
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- LOCALIDAD: Juelich
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- NÚMERO DE CÓDIGO POSTAL: 52425
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 02461/614480
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 02461/612860
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- DESIGNACION DEL INVENTO: Preparación de valina
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 58
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- REDACCIÓN LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: Disquete
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATORIO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SISTEMA LÓGICO - SOFTWARE:
- Patentin Release nº 1.0, versión nº 1.30 (EPA)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2.952 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: Cadena única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN de genoma
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPÓTESIS: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 612 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO:Aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: Cadena única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPÓTESIS: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2.164 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: Cadena única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN de genoma
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPÓTESIS: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 271 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: Cadena única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPÓTESIS: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 279 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: Cadena única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPÓTESIS: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
Claims (16)
1. Procedimiento para la preparación microbiana
de L-valina, en el que se refuerzan la actividad de
la dihidroxiácido - deshidratasa (ilvD) y/o la expresión del gen de
ilvD en un microorganismo.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que se refuerzan adicionalmente la actividad
de la acetohidroxiácido - sintasa (ilvBN) y la de la isómero
reductasa (ilvC) y/o la expresión del gen de ilvBNC en el
microorganismo.
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se aumenta la
actividad endógena de ilvD o de ilvBNCD en el microorganismo.
4. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3, caracterizado porque por mutación del gen
de ilvD endógeno o de los genes de ilvBNCD se producen
correspondientes enzimas con una actividad más alta.
5. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
expresión de los genes de ilvD o de ilvBNCD se refuerza por aumento
del número de copias de los genes.
6. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5, caracterizado porque para aumentar el
número de copias de los genes, el gen de ilvD o los genes de
ilvBNCD se incorporan en una estructura artificial génica.
7. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6, caracterizado porque un microorganismo se
transforma con la estructura artificial génica que contiene el gen
de ilvD o los genes de ilvBNCD.
8. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, caracterizado porque como microorganismo
se utiliza Corynebacterium glutamicum.
9. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque se
utiliza un microorganismo, en el que se debilita o excluye la
actividad de por lo menos una enzima que participa en un proceso de
metabolismo, que disminuye la formación de
L-valina.
10. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9, caracterizado porque se debilita o excluye
la actividad de la enzima treonina - deshidratasa (ilvA), que
participa en la síntesis de L-isoleucina.
11. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque se debilita o
excluye la actividad de una o varias enzima(s), que
participa(n) específicamente en la síntesis de
D-pantotenato.
12. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 11, caracterizado porque se debilita o
excluye la actividad de la enzima cetopantoatohidroximetil-
transferasa (panB) y/o de la enzima pantotenato - ligasa
(panC).
13. Microorganismo transformado con una
estructura artificial génica que contiene el gen de ilvD o los genes
de ilvBNCD, en el que se debilita o excluye la actividad de una o
varias enzimas que participan específicamente en la síntesis de
D-pantotenato.
14. Microorganismo transformado de acuerdo con la
reivindicación 13, en el que se debilita o excluye la actividad de
la enzima cetopantoatohidroximetil-transferasa
(panB) y/o de la enzima pantotenato - ligasa (panC).
15. Microorganismo transformado de acuerdo con
la reivindicación 13 ó 14, en el que se debilita o excluye la
actividad de la enzima treonina-deshidratasa (ilvA)
que participa en la síntesis de L-isoleucina.
16. Microorganismo transformado de acuerdo con
una o varias de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado
por ser Corynebacterium glutamicum.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19907567 | 1999-02-22 | ||
DE19907567A DE19907567B4 (de) | 1999-02-22 | 1999-02-22 | Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Valin |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2197076T3 true ES2197076T3 (es) | 2004-01-01 |
ES2197076T5 ES2197076T5 (es) | 2009-05-20 |
Family
ID=7898429
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES00906363T Expired - Lifetime ES2197076T5 (es) | 1999-02-22 | 2000-02-21 | Procedimiento para la produccion microbiana de l-valina. |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7632663B1 (es) |
EP (1) | EP1155139B2 (es) |
JP (1) | JP4638048B2 (es) |
KR (1) | KR100614029B1 (es) |
AT (1) | ATE236991T1 (es) |
CZ (1) | CZ20013037A3 (es) |
DE (2) | DE19907567B4 (es) |
DK (1) | DK1155139T4 (es) |
ES (1) | ES2197076T5 (es) |
PT (1) | PT1155139E (es) |
SK (1) | SK285870B6 (es) |
WO (1) | WO2000050624A1 (es) |
Families Citing this family (33)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19855312A1 (de) * | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien |
JP2005503758A (ja) * | 2001-01-19 | 2005-02-10 | ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト | 3−(2−ヒドロキシ−3−メチル−ブチリルアミノ)−プロピオン酸(hmbpa)の製造方法及び微生物 |
KR100442768B1 (ko) * | 2001-05-21 | 2004-08-04 | 주식회사 한국표지화합물연구소 | 방사성동위원소 표지화합물로서 l-발린의 제조방법 |
KR100451299B1 (ko) * | 2002-03-21 | 2004-10-06 | 씨제이 주식회사 | L―쓰레오닌의 제조방법 |
GB2391083B (en) * | 2002-07-19 | 2006-03-01 | Picochip Designs Ltd | Processor array |
DE102004046933A1 (de) * | 2004-09-28 | 2006-03-30 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Valin sowie dafür geeigneter Mikroorganismus |
DE102005019967A1 (de) | 2005-04-29 | 2006-11-02 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren |
US8273558B2 (en) | 2005-10-26 | 2012-09-25 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Fermentive production of four carbon alcohols |
US9303225B2 (en) | 2005-10-26 | 2016-04-05 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Method for the production of isobutanol by recombinant yeast |
EP1948814B1 (en) * | 2005-10-26 | 2018-11-21 | Butamax (TM) Advanced Biofuels LLC | Fermentive production of four carbon alcohols |
EP1860193A1 (en) * | 2006-05-22 | 2007-11-28 | Evonik Degussa GmbH | Promoter-activity modulation for branched-chain amino acid production |
JP2010017082A (ja) | 2006-10-10 | 2010-01-28 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
KR100832740B1 (ko) * | 2007-01-17 | 2008-05-27 | 한국과학기술원 | 분지쇄 아미노산 생성능이 개선된 변이 미생물 및 이를이용한 분지쇄 아미노산의 제조방법 |
AU2008212799A1 (en) | 2007-02-09 | 2008-08-14 | The Regents Of The University Of California | Biofuel production by recombinant microorganisms |
JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
WO2009093703A1 (ja) | 2008-01-23 | 2009-07-30 | Ajinomoto Co., Inc. | L-アミノ酸の製造法 |
US8623619B2 (en) | 2009-02-09 | 2014-01-07 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Process for producing L-amino acid |
JP5882202B2 (ja) * | 2009-06-05 | 2016-03-09 | エボニック デグサ ゲーエムベーハーEvonik Degussa GmbH | 2−ケトカルボン酸の製造方法 |
WO2011013707A1 (ja) | 2009-07-29 | 2011-02-03 | 味の素株式会社 | L-アミノ酸の製造法 |
JP2012223091A (ja) | 2009-08-25 | 2012-11-15 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
KR101251540B1 (ko) | 2010-10-08 | 2013-04-08 | 한국과학기술원 | L-발린 생성능이 개선된 변이 대장균 w 균주 및 이를 이용한 l-발린의 제조방법 |
KR101117022B1 (ko) | 2011-08-16 | 2012-03-16 | 씨제이제일제당 (주) | L-발린 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-발린 제조방법 |
EP2749638A4 (en) * | 2011-08-22 | 2015-04-22 | Res Inst Innovative Tech Earth | TRANSFORMANT OF CORNEFORMED BACTERIUM AND METHOD FOR PRODUCING VALINE USING THE SAME |
JP5831669B2 (ja) | 2013-05-13 | 2015-12-09 | 味の素株式会社 | L−アミノ酸の製造法 |
JP2016165225A (ja) | 2013-07-09 | 2016-09-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
BR112016008830B1 (pt) | 2013-10-23 | 2023-02-23 | Ajinomoto Co., Inc | Método para produzir uma substância alvo |
JP7066977B2 (ja) | 2017-04-03 | 2022-05-16 | 味の素株式会社 | L-アミノ酸の製造法 |
JP7124338B2 (ja) | 2018-02-27 | 2022-08-24 | 味の素株式会社 | 変異型グルタチオン合成酵素、及び、γ-グルタミルバリルグリシンの製造法 |
EP3861109A1 (en) | 2018-10-05 | 2021-08-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
KR102344689B1 (ko) * | 2020-09-01 | 2021-12-29 | 씨제이제일제당 주식회사 | L-발린 생산 미생물 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법 |
WO2023117708A1 (en) * | 2021-12-22 | 2023-06-29 | Chr. Hansen A/S | Reduced pantothenic acid levels in fermentative production of oligosaccharides |
WO2024096123A1 (ja) * | 2022-11-04 | 2024-05-10 | 株式会社バイオパレット | 遺伝子が改変された微生物およびその生産方法 |
CN116731933B (zh) * | 2023-08-03 | 2023-10-03 | 欧铭庄生物科技(天津)有限公司滨海新区分公司 | 一种谷氨酸棒杆菌及其在生产缬氨酸中的应用 |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU875663A1 (ru) | 1978-06-30 | 1982-09-15 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Штаммы е.coLI ВНИИГенетика VL 334 @ N6 и ВНИИГенетика VL 334 @ N7-продуценты L-треонина и способ их получени |
WO1984003301A1 (en) * | 1983-02-17 | 1984-08-30 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Process for preparing amino acid |
JPH0746994B2 (ja) * | 1984-10-04 | 1995-05-24 | 味の素株式会社 | 発酵法によるl−アミノ酸の製造法 |
JP2748418B2 (ja) * | 1988-08-03 | 1998-05-06 | 味の素株式会社 | 組換えdna、該組換えdnaを有する微生物 |
DE3942947A1 (de) * | 1989-12-23 | 1991-06-27 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur herstellung von l-isoleucin und dafuer geeignete mikroorganismen und rekombinante dna |
US5534421A (en) * | 1991-05-30 | 1996-07-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Production of isoleucine by escherichia coli having isoleucine auxotrophy and no negative feedback inhibition of isoleucine production |
JPH05344893A (ja) * | 1992-06-12 | 1993-12-27 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | アセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする遺伝子dna及びその利用 |
JPH06277067A (ja) * | 1993-03-26 | 1994-10-04 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする遺伝子dna |
DE4400926C1 (de) * | 1994-01-14 | 1995-06-01 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Herstellung von L-Isoleucin mittels rekombinanter Mikroorganismen mit deregulierter Threonindehydratase |
US5998178A (en) * | 1994-05-30 | 1999-12-07 | Ajinomoto Co., Ltd. | L-isoleucine-producing bacterium and method for preparing L-isoleucine through fermentation |
WO1996006926A1 (fr) * | 1994-08-30 | 1996-03-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede pour produire de la l-valine et de la l-leucine |
JPH0889249A (ja) * | 1994-09-29 | 1996-04-09 | Mitsubishi Chem Corp | ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を含むdna断片 |
DE19855312A1 (de) * | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien |
-
1999
- 1999-02-22 DE DE19907567A patent/DE19907567B4/de not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-02-21 EP EP00906363A patent/EP1155139B2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-21 ES ES00906363T patent/ES2197076T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-21 DK DK00906363T patent/DK1155139T4/da active
- 2000-02-21 PT PT00906363T patent/PT1155139E/pt unknown
- 2000-02-21 KR KR1020017009864A patent/KR100614029B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-02-21 WO PCT/EP2000/001405 patent/WO2000050624A1/de active IP Right Grant
- 2000-02-21 US US09/914,006 patent/US7632663B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-02-21 DE DE50001708T patent/DE50001708D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-21 SK SK1205-2001A patent/SK285870B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-02-21 JP JP2000601187A patent/JP4638048B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-02-21 CZ CZ20013037A patent/CZ20013037A3/cs unknown
- 2000-02-21 AT AT00906363T patent/ATE236991T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2000050624A1 (de) | 2000-08-31 |
DE19907567B4 (de) | 2007-08-09 |
EP1155139B2 (de) | 2009-02-25 |
ATE236991T1 (de) | 2003-04-15 |
KR20010108172A (ko) | 2001-12-07 |
JP2002537771A (ja) | 2002-11-12 |
US7632663B1 (en) | 2009-12-15 |
SK12052001A3 (sk) | 2002-01-07 |
CZ20013037A3 (cs) | 2002-01-16 |
DK1155139T3 (da) | 2003-07-28 |
DE19907567A1 (de) | 2000-08-24 |
JP4638048B2 (ja) | 2011-02-23 |
EP1155139B1 (de) | 2003-04-09 |
ES2197076T5 (es) | 2009-05-20 |
SK285870B6 (sk) | 2007-10-04 |
PT1155139E (pt) | 2003-08-29 |
EP1155139A1 (de) | 2001-11-21 |
KR100614029B1 (ko) | 2006-08-23 |
DK1155139T4 (da) | 2009-04-20 |
DE50001708D1 (de) | 2003-05-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2197076T3 (es) | Procedimiento para la produccion microbiana de l-valina. | |
US6177264B1 (en) | Method for the fermentative production of D-pantothenic acid using Coryneform bacteria | |
RU2262532C2 (ru) | Полинуклеотид, кодирующий фосфоенолпируваткарбоксикиназу, и зонд, предназначенный для его получения | |
KR100758831B1 (ko) | L-라이신 생산 코리네박테리아 및 l-라이신의 제조방법 | |
US6214591B1 (en) | Methods for producing L-valine and L-leucine | |
KR100760222B1 (ko) | 유전자 증폭에 의해 증가된 리신 생산 | |
ES2206488T3 (es) | Preparacion de l-isoleucina mediante microorganismos recombinantes con una treonina deshidratasa desregulada. | |
ES2203384T3 (es) | Secuencias de nucleotidos que codifican el gen thre y procedimiento para la preparacion fermentativa de l-treonina con bacterias corineformes. | |
ES2247987T3 (es) | Bacterias corineformes productoras de l-lisina, y procedimiento para la preparacion de lisina. | |
US20100151449A1 (en) | Method for poduction of l-amino acids by fermentation | |
US6171833B1 (en) | Pyruvate carboxylase from corynebacterium glutamicum | |
ES2344248T3 (es) | Secuencias de nucleotidos que codifican el gen dapc, y procedimiento para la preparacion de l-lisina. | |
ES2320247T3 (es) | Procedimiento para la produccion de l-valina por fermentacion mediando utilizacion de bacterias corineformes con una actividad aumentada de transaminasa. | |
ES2208178T3 (es) | Procedimiento para la preparacion fermentativa de l-aminoacidos y secuencias de nucleotidos que codifican el gen accda. | |
KR20080006799A (ko) | 역가가 향상된 유전자 argF 염기서열 및 그를 포함하는형질전환 균주를 이용한 L―알지닌의 생산방법 | |
ES2249427T3 (es) | Secuencias de nucleotidos codificadoras de proteinas que participan en la biosintesis de l-serina, rocedimiento mejorado para la produccion microbiana de l-serina y microorganismo modificado geneticamente adecuado para dicho procedimiento. | |
MXPA00009770A (es) | Nuevas secuencias nucleotidicas que codifican para el gen irp. | |
MXPA99010768A (es) | Procedimiento para la preparacion por fermentacion de acido d-pantotenico utilizando bacterias corineformes | |
MXPA00005013A (es) | Procedimiento para la preparacion por fermentacion de l-aminoacidos y las secuencias nucleotidas codificantes al gen accda |