CN111321178B - 一种l-2-氨基丁酰胺的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种L‑2‑氨基丁酰胺的制备方法，属于生物化学技术领域。该L‑2‑氨基丁酰胺的制备方法，包括以下步骤：以L‑苏氨酸为原料，利用苏氨酸脱氨酶将L‑苏氨酸转化为2‑丁酮酸；利用氨基酸脱氢酶将2‑丁酮酸转化为L‑2‑氨基丁酸；在酰胺酶的催化作用下，将L‑2‑氨基丁酸反应成L‑2‑氨基丁酰胺。该制备方法的反应条件温和、专一性强、高效环保、收率高，其以价格低廉的L‑苏氨酸为起始原料，并在大肠杆菌发酵诱导苏氨酸脱氨酶、氨基酸脱氢酶和酰胺酶表达的过程中进行反应，由于大肠杆菌发酵过程中自身会生成NADH和ATP，故不需要额外地添加NADH和ATP，从而可以使整个制备过程的成本降低，以便于在工业上 进行大批量生成制备。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，具体是一种L-2-氨基丁酰胺的制备方法。
背景技术
左乙拉西坦(Levetiracetam)是目前美国癫痫治疗中应用最多的新型抗癫痫药物。其中，L-2-氨基丁酰胺是合成左乙拉西坦的关键手性中间体。目前已报道的L-2-氨基丁酰胺合成工艺分化学法和生物催化法两类。化学法主要包括利用L-酒石酸或D-扁桃酸拆分制备L-2-氨基丁酰胺；或以L-蛋氨酸为手性源，经甲硫基羟化、溴代、酯化、脱卤和氨解生成L-2-氨基丁酰胺：又或以L-2-氨基丁酸为手性源，经酯化、加压氨解生成L-2-氨基丁酰胺，上述方法的合成路线繁琐，反应条件苛刻，而且会产生大量的废水废渣，污染环境，成本高且产率较低。
另外，虽然生物催化法具有工艺路线筒单、反应条件温和、绿色等优点。但是，现有的生物催化法如利用腈水合酶水合2-氨基丁腈和利用氨基肽酶或酰胺酶水解外消旋2-氨基丁酰胺可以获得L-2-氨基丁酰胺，但这些方法存在酶立体选择性差、收率低等问题，故不便于应用到生产上。
发明内容
本发明的目的在于提供一种L-2-氨基丁酰胺的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种L-2-氨基丁酰胺的制备方法，包括以下步骤：
以L-苏氨酸为原料，利用苏氨酸脱氨酶将L-苏氨酸转化为2-丁酮酸；
利用氨基酸脱氢酶将2-丁酮酸转化为L-2-氨基丁酸；
在酰胺酶的催化作用下，将L-2-氨基丁酸反应成L-2-氨基丁酰胺。
其中，L-2-氨基丁酰胺的合成路线如下：
作为本发明实施例的一个优选方案，所述的步骤具体包括：
将含有重组载体的大肠杆菌K12菌株接种于种子培养基中进行振荡培养，得到种子液；所述的重组载体包含苏氨酸脱氨酶的编码基因、氨基酸脱氢酶的编码基因以及酰胺酶的编码基因；
将上述种子液接种于含有L-苏氨酸的发酵培养基中，得到发酵液；
将上述发酵液的pH值控制在6.5～7.5，同时对发酵液进行搅拌发酵，当发酵液的OD600为10～15时，往发酵液中加入诱导剂诱导苏氨酸脱氨酶、氨基酸脱氢酶和酰胺酶表达，并继续进行搅拌发酵，得到L-2-氨基丁酰胺。
作为本发明实施例的另一个优选方案，每升所述的种子培养基中包括以下组分：酵母粉4～6g、蛋白胨8～12g、NaCl 4～6g、MgSO40.5～1.5g。
作为本发明实施例的另一个优选方案，每升所述含有L-苏氨酸的发酵培养基中包括以下组分：L-苏氨酸60～80g、酵母粉4～6g、胰蛋白胨1～3g、(NH4)2SO41～3g、K2HPO43～5g、KH2PO43～5g、MgSO40.3～1g、一水合柠檬酸0.1～0.5g、MnCl20.05～0.1g。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述含有L-苏氨酸的发酵培养基与种子液的体积比为100∶(3～5)。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述的步骤还包括：
当发酵液中L-苏氨酸的质量浓度低于10～15g/L时，按照每升发酵液补加20～40g的量往发酵液中补加L-苏氨酸，并重复该步骤3～5次。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
作为本发明实施例的另一个优选方案，每升所述的发酵液中添加的诱导剂的质量为1～3g。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述的步骤中，振荡培养的温度为32～37℃。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述的步骤中，搅拌发酵的温度为32～37℃。
与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：
本发明实施例提供的一种L-2-氨基丁酰胺的制备方法，反应条件温和、专一性强、高效环保、收率高，其以价格低廉的L-苏氨酸为起始原料，并在大肠杆菌发酵诱导苏氨酸脱氨酶、氨基酸脱氢酶和酰胺酶表达的过程中进行反应，由于大肠杆菌发酵过程中自身会生成还原型辅酶I(Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NADH)和腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine Triphosphate，ATP)，故不需要额外地添加NADH和ATP，从而可以使整个制备过程的成本降低，以便于在工业上进行大批量生成制备。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
该实施例提供了一种L-2-氨基丁酰胺的制备方法，包括以下步骤：
(1)将从斜面挑取含有重组载体的大肠杆菌K12菌株接种于种子培养基中，并置于32℃、200rpm的条件下进行振荡培养10h，得到种子液；其中，菌株的接种量为3％，重组载体包含苏氨酸脱氨酶的编码基因、氨基酸脱氢酶的编码基因以及酰胺酶的编码基因，其是通过将苏氨酸脱氨酶、氨基酸脱氢酶和酰胺酶的编码基因插入到pET24a载体的Sal I和Xba I之间的位置得到的；含有重组载体的大肠杆菌K12菌株是通过选用T7启动子在大肠杆菌菌株中过量表达苏氨酸脱氨酶，氨基酸脱氢酶和酰胺酶得到的重组大肠杆菌菌株，苏氨酸脱氨酶来源于大肠杆菌K12，氨基酸脱氢酶来源于蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，酰胺酶来自酶赛生物有限公司的市售产品。其中，氨基酸脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，氨基酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示；苏氨酸脱氨酶的编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示；酰胺酶的编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示，酰胺酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：6所示。另外，每升的种子培养基中包括以下组分：酵母粉4g、蛋白胨8g、NaCl4g、MgSO40.5g。
(2)将上述种子液接种于含有L-苏氨酸的发酵培养基中，得到发酵液；其中，含有L-苏氨酸的发酵培养基与种子液的体积比为100∶3；每升含有L-苏氨酸的发酵培养基中包括以下组分：L-苏氨酸60g、酵母粉4g、胰蛋白胨1g、(NH4)2SO41g、K2HPO43g、KH2PO43g、MgSO40.3g、一水合柠檬酸0.1g、MnCl20.05g。
(3)用稀硫酸和氨水将上述发酵液的pH值控制在6.5，并控制发酵液的空气通气量在0.3vvm，同时在32℃、100rpm的条件下对发酵液进行搅拌发酵；当发酵液的OD600为10时，往发酵液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导剂来诱导苏氨酸脱氨酶、氨基酸脱氢酶和酰胺酶表达，以将L-苏氨酸转化为L-2-氨基丁酰胺。另外，当发酵液中L-苏氨酸的质量浓度低于10g/L时，按照每升发酵液补加20g的量往发酵液中补加L-苏氨酸，并重复该步骤补加L-苏氨酸5次，并继续进行搅拌发酵40h，即可得到L-2-氨基丁酰胺。其中，每升发酵液中添加的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导剂的质量为1g。
实施例2
该实施例提供了一种L-2-氨基丁酰胺的制备方法，包括以下步骤：
(1)将从斜面挑取含有重组载体的大肠杆菌K12菌株接种于种子培养基中，并置于37℃、300rpm的条件下进行振荡培养12h，得到种子液；其中，菌株的接种量为3％，重组载体包含苏氨酸脱氨酶的编码基因、氨基酸脱氢酶的编码基因以及酰胺酶的编码基因，其是通过将苏氨酸脱氨酶、氨基酸脱氢酶和酰胺酶的编码基因插入到pET24a载体的Sal I和Xba I之间的位置得到的；含有重组载体的大肠杆菌K12菌株是通过在大肠杆菌菌株中过量表达苏氨酸脱氨酶，氨基酸脱氢酶和酰胺酶得到的重组大肠杆菌菌株，苏氨酸脱氨酶来源于大肠杆菌K12，氨基酸脱氢酶来源于蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，酰胺酶来自酶赛生物有限公司的市售产品。其中，氨基酸脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，氨基酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示；苏氨酸脱氨酶的编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示；酰胺酶的编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示，酰胺酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：6所示。另外，每升的种子培养基中包括以下组分：酵母粉6g、蛋白胨12g、NaCl 6g、MgSO41.5g。
(2)将上述种子液接种于含有L-苏氨酸的发酵培养基中，得到发酵液；其中，含有L-苏氨酸的发酵培养基与种子液的体积比为100∶5；每升含有L-苏氨酸的发酵培养基中包括以下组分：L-苏氨酸80g、酵母粉6g、胰蛋白胨3g、(NH4)25O43g、K2HPO45g、KH2PO45g、MgSO41g、一水合柠檬酸0.5g、MnCl20.1g。
(3)用稀硫酸和氨水将上述发酵液的pH值控制在7.5，并控制发酵液的空气通气量在0.7vvm，同时在37℃、200rpm的条件下对发酵液进行搅拌发酵；当发酵液的OD600为15时，往发酵液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导剂来诱导苏氨酸脱氨酶、氨基酸脱氢酶和酰胺酶表达，以将L-苏氨酸转化为L-2-氨基丁酰胺。另外，当发酵液中L-苏氨酸的质量浓度低于15g/L时，按照每升发酵液补加40g的量往发酵液中补加L-苏氨酸，并重复该步骤补加L-苏氨酸5次，并继续进行搅拌发酵50h，即可得到L-2-氨基丁酰胺。其中，每升发酵液中添加的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导剂的质量为3g。
实施例3
该实施例提供了一种L-2-氨基丁酰胺的制备方法，包括以下步骤：
(1)将从斜面挑取含有重组载体的大肠杆菌K12菌株接种于种子培养基中，并置于35℃、200rpm的条件下进行振荡培养11h，得到种子液；其中，菌株的接种量为3％，重组载体包含苏氨酸脱氨酶的编码基因、氨基酸脱氢酶的编码基因以及酰胺酶的编码基因，其是通过将苏氨酸脱氨酶、氨基酸脱氢酶和酰胺酶的编码基因插入到pET24a载体的Sal I和Xba I之间的位置得到的；含有重组载体的大肠杆菌K12菌株是通过在大肠杆菌菌株中过量表达苏氨酸脱氨酶，氨基酸脱氢酶和酰胺酶得到的重组大肠杆菌菌株，苏氨酸脱氨酶来源于大肠杆菌K12，氨基酸脱氢酶来源于蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，酰胺酶来自酶赛生物有限公司的市售产品。其中，氨基酸脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，氨基酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示；苏氨酸脱氨酶的编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示；酰胺酶的编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示，酰胺酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：6所示。另外，每升的种子培养基中包括以下组分：酵母粉5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、MgSO41g。
(2)将上述种子液接种于含有L-苏氨酸的发酵培养基中，得到发酵液；其中，含有L-苏氨酸的发酵培养基与种子液的体积比为100∶4；每升含有L-苏氨酸的发酵培养基中包括以下组分：L-苏氨酸70g、酵母粉5g、胰蛋白胨2g、(NH4)2SO42g、K2HPO4 4g、KH2PO44g、MgSO40.5g、一水合柠檬酸0.3g、MnCl20.08g。
(3)用稀硫酸和氨水将上述发酵液的pH值控制在7，并控制发酵液的空气通气量在0.5vvm，同时在35℃、100rpm的条件下对发酵液进行搅拌发酵；当发酵液的OD600为12时，往发酵液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导剂来诱导苏氨酸脱氨酶、氨基酸脱氢酶和酰胺酶表达，以将L-苏氨酸转化为L-2-氨基丁酰胺。另外，当发酵液中L-苏氨酸的质量浓度低于12g/L时，按照每升发酵液补加30g的量往发酵液中补加L-苏氨酸，并重复该步骤补加L-苏氨酸4次，并继续进行搅拌发酵45h，即可得到L-2-氨基丁酰胺。其中，每升发酵液中添加的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导剂的质量为2g。
对比例1
该对比例提供了一种传统用酰胺酶立体选择性拆分外消旋2-氨基丁酰胺的方法，其产物收率为41.7％，反应物转化率为58.3％。
上述实施例3最终得到的L-2-氨基丁酰胺在发酵液中的质量浓度为107g/L，其L-苏氨酸转化率为89.0％，L-2-氨基丁酰胺的收率为85％，可以实现L-2-氨基丁酰胺的高效生产。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
序列表
<110> 宁波酶赛生物工程有限公司
<120> 一种L-2-氨基丁酰胺的制备方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaccctgg aaatcttcga atacctggaa aaatatgact atgaacaagt ggtgttctgc 60
caagacaaag aaagcggcct gaaagcgatt atcgcaattc atgataccac gctgggtccg 120
gcactgggcg gtacccgtat gtggacgtat gattccgaag aagcggcaat cgaagacgct 180
ctgcgtctgg caaaaggcat gacctacaaa aacgcagctg cgggtctgaa tctgggcggt 240
gccaaaacgg tgattatcgg cgatccgcgt aaagacaaaa gcgaagccat gtttcgtgca 300
ctgggtcgct atattcaggg cctgaacggt cgctacatca ccgcggaaga tgtgggcacc 360
acggttgatg acatggatat tatccatgaa gaaaccgact ttgttacggg tattagtccg 420
tccttcggca gctctggtaa tccgagtccg gttaccgcct atggcgtcta ccgtggtatg 480
aaagccgcag ctaaagaagc gtttggcacc gataacctgg agggtaaagt gattgcagtt 540
cagggcgtcg gtaatgtggc ttatcacctg tgcaaacatc tgcacgcgga aggtgccaaa 600
ctgattgtga ccgatatcaa caaagaagct gtccaacgcg cggtggaaga attcggcgca 660
agcgctgtcg aaccgaatga aatttatggt gtggaatgcg atatctacgc accgtgtgct 720
ctgggcgcga ccgtgaacga cgaaacgatt ccgcagctga aagcgaaagt tatcgccggt 780
tctgcaaaca atcaactgaa agaagatcgt catggcgaca ttatccacga aatgggtatt 840
gtgtatgctc cggattacgt tattaacgcg ggcggtgtta tcaatgtcgc cgacgaactg 900
tatggctaca atcgtgaacg cgccctgaaa cgtgttgaat caatttatga taccatcgca 960
aaagtcattg aaatctcgaa acgcgatggt attgcaacgt acgttgcagc agaccgtctg 1020
gcagaagaac gcatcgcatc cctgaaaaac tcccgttcca cctacctgcg taatggtcac 1080
gacatcatca gccgccgcta atga 1104
<210> 2
<211> 366
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Thr Leu Glu Ile Phe Glu Tyr Leu Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln
1 5 10 15
Val Val Phe Cys Gln Asp Lys Glu Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala
20 25 30
Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Met Trp
35 40 45
Thr Tyr Asp Ser Glu Glu Ala Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala
50 55 60
Lys Gly Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly
65 70 75 80
Ala Lys Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Arg Lys Asp Lys Ser Glu Ala
85 90 95
Met Phe Arg Ala Leu Gly Arg Tyr Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr
100 105 110
Ile Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Asp Asp Met Asp Ile Ile
115 120 125
His Glu Glu Thr Asp Phe Val Thr Gly Ile Ser Pro Ser Phe Gly Ser
130 135 140
Ser Gly Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met
145 150 155 160
Lys Ala Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Thr Asp Asn Leu Glu Gly Lys
165 170 175
Val Ile Ala Val Gln Gly Val Gly Asn Val Ala Tyr His Leu Cys Lys
180 185 190
His Leu His Ala Glu Gly Ala Lys Leu Ile Val Thr Asp Ile Asn Lys
195 200 205
Glu Ala Val Gln Arg Ala Val Glu Glu Phe Gly Ala Ser Ala Val Glu
210 215 220
Pro Asn Glu Ile Tyr Gly Val Glu Cys Asp Ile Tyr Ala Pro Cys Ala
225 230 235 240
Leu Gly Ala Thr Val Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys
245 250 255
Val Ile Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Lys Glu Asp Arg His Gly
260 265 270
Asp Ile Ile His Glu Met Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile
275 280 285
Asn Ala Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn
290 295 300
Arg Glu Arg Ala Leu Lys Arg Val Glu Ser Ile Tyr Asp Thr Ile Ala
305 310 315 320
Lys Val Ile Glu Ile Ser Lys Arg Asp Gly Ile Ala Thr Tyr Val Ala
325 330 335
Ala Asp Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Ser Leu Lys Asn Ser Arg
340 345 350
Ser Thr Tyr Leu Arg Asn Gly His Asp Ile Ile Ser Arg Arg
355 360 365
<210> 3
<211> 1548
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggcagaca gccagcctct gagcggtgca cctgagggtg cagagtacct gcgtgcagtg 60
ctgcgtgcac ctgtgtacga ggcagcacag gtgacccctc tgcagaagat ggagaagctg 120
agcagccgtc tggacaacgt gatcctggtg aagcgtgagg accgtcagcc tgtgcacagc 180
ttcaagctgc gtggtgcata cgcaatgatg gcaggtctga ccgaggagca gaaggcacac 240
ggtgtgatca ccgcaagcgc aggtaaccac gcacagggtg tggcattcag cagcgcacgt 300
ctgggtgtga aggcactgat cgtgatgcct accgcaaccg cagacatcaa ggtggacgca 360
gtgcgtggtt tcggtggtga ggtgctgctg cacggtgcaa acttcgacga ggcaaaggca 420
aaggcaatcg agctgagcca gcagcagggt ttcacctggg tgcctccttt cgaccaccct 480
atggttattg caggtcaggg taccctggca ctggagctgc tgcagcagga cgcacacctg 540
gaccgtgtgt tcgtgcctgt gggtggtggt ggtctggcag caggtgtggc agtgctgatc 600
aagcagctga tgcctcagat caaggttatt gcagtggagg cagaggacag cgcatgcctg 660
aaggcagcac tggacgcagg tcaccctgtg gacctgcctc gtgtgggtct gttcgcagag 720
ggtgtggcag ttaagcgtat cggtgacgag accttccgtc tgtgccagga gtacctggac 780
gacatcatca ccgtggacag cgacgcaatc tgcgcagcaa tgaaggacct gttcgaggac 840
gtgcgtgcag tggcagagcc tagcggtgca ctggcactgg caggtatgaa gaagtacatc 900
gcactgcaca acatccgtgg tgagcgtctg gcacacatcc tgagcggtgc caacgtgaac 960
ttccacggtc tgcgttacgt gagcgagcgt tgcgagctgg gtgagcagcg tgaggcactg 1020
ctggcagtga ccatccctga ggagaagggt agcttcctga agttctgcca gctgctgggt 1080
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agcctgttcc actaccgtag ccacggtacc gactacggtc gtgtgctggc agcattcgag 1440
ctgggtgacc acgagcctga cttcgagacc cgtctgaacg agctgggtta cgactgccac 1500
gacgagacca acaaccctgc attccgtttc ttcctggcag gttaataa 1548
<210> 4
<211> 514
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Asp Ser Gln Pro Leu Ser Gly Ala Pro Glu Gly Ala Glu Tyr
1 5 10 15
Leu Arg Ala Val Leu Arg Ala Pro Val Tyr Glu Ala Ala Gln Val Thr
20 25 30
Pro Leu Gln Lys Met Glu Lys Leu Ser Ser Arg Leu Asp Asn Val Ile
35 40 45
Leu Val Lys Arg Glu Asp Arg Gln Pro Val His Ser Phe Lys Leu Arg
50 55 60
Gly Ala Tyr Ala Met Met Ala Gly Leu Thr Glu Glu Gln Lys Ala His
65 70 75 80
Gly Val Ile Thr Ala Ser Ala Gly Asn His Ala Gln Gly Val Ala Phe
85 90 95
Ser Ser Ala Arg Leu Gly Val Lys Ala Leu Ile Val Met Pro Thr Ala
100 105 110
Thr Ala Asp Ile Lys Val Asp Ala Val Arg Gly Phe Gly Gly Glu Val
115 120 125
Leu Leu His Gly Ala Asn Phe Asp Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ile Glu
130 135 140
Leu Ser Gln Gln Gln Gly Phe Thr Trp Val Pro Pro Phe Asp His Pro
145 150 155 160
Met Val Ile Ala Gly Gln Gly Thr Leu Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gln
165 170 175
Asp Ala His Leu Asp Arg Val Phe Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu
180 185 190
Ala Ala Gly Val Ala Val Leu Ile Lys Gln Leu Met Pro Gln Ile Lys
195 200 205
Val Ile Ala Val Glu Ala Glu Asp Ser Ala Cys Leu Lys Ala Ala Leu
210 215 220
Asp Ala Gly His Pro Val Asp Leu Pro Arg Val Gly Leu Phe Ala Glu
225 230 235 240
Gly Val Ala Val Lys Arg Ile Gly Asp Glu Thr Phe Arg Leu Cys Gln
245 250 255
Glu Tyr Leu Asp Asp Ile Ile Thr Val Asp Ser Asp Ala Ile Cys Ala
260 265 270
Ala Met Lys Asp Leu Phe Glu Asp Val Arg Ala Val Ala Glu Pro Ser
275 280 285
Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Met Lys Lys Tyr Ile Ala Leu His Asn
290 295 300
Ile Arg Gly Glu Arg Leu Ala His Ile Leu Ser Gly Ala Asn Val Asn
305 310 315 320
Phe His Gly Leu Arg Tyr Val Ser Glu Arg Cys Glu Leu Gly Glu Gln
325 330 335
Arg Glu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ile Pro Glu Glu Lys Gly Ser Phe
340 345 350
Leu Lys Phe Cys Gln Leu Leu Gly Gly Arg Ser Val Thr Glu Phe Asn
355 360 365
Tyr Arg Phe Ala Asp Ala Lys Asn Ala Cys Ile Phe Val Gly Val Arg
370 375 380
Leu Ser Arg Gly Leu Glu Glu Arg Lys Glu Ile Leu Gln Met Leu Asn
385 390 395 400
Asp Gly Gly Tyr Ser Val Val Asp Leu Ser Asp Asp Glu Met Ala Lys
405 410 415
Leu His Val Arg Tyr Met Val Gly Gly Arg Pro Ser His Pro Leu Gln
420 425 430
Glu Arg Leu Tyr Ser Phe Glu Phe Pro Glu Ser Pro Gly Ala Leu Leu
435 440 445
Arg Phe Leu Asn Thr Leu Gly Thr Tyr Trp Asn Ile Ser Leu Phe His
450 455 460
Tyr Arg Ser His Gly Thr Asp Tyr Gly Arg Val Leu Ala Ala Phe Glu
465 470 475 480
Leu Gly Asp His Glu Pro Asp Phe Glu Thr Arg Leu Asn Glu Leu Gly
485 490 495
Tyr Asp Cys His Asp Glu Thr Asn Asn Pro Ala Phe Arg Phe Phe Leu
500 505 510
Ala Gly
<210> 5
<211> 1329
<212> DNA
<213> 缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)
<400> 5
atgagcggtc tgcctgttca gcatgtcgag acgcacccct ggcgcgatcc tctggagacg 60
gcggcggggc tgaaccgtcg cgagggcgcc ctggccctgc tggccggggc gggcgatccg 120
caggtgcatg gcgggcgctg gtccttcgtg gcctgcgagc cggatcaggt gttcgtcggc 180
cgcgtgaatg atggggcgct gttccagcgc ctgcgtgagc ccgcctatgc aggcggcggg 240
gtcgtcgggt tgatgagtta tgacgctggg gcgcgtcctg cgacgggcga gcgcggcgac 300
ggttggcccg acttgatgct ggcccgctat ccggccctgc tggccttcga ccatcaggaa 360
cgacaggtgc gggcggtcgg gcgcggcgcc gacgccgagg cggcgcggct tgaggctcgg 420
cgcgccgtgg actggttgga tgcagcggcc tcggtcgagg cgccttcgcc gccgtgcgat 480
catgcgctcg aggagggttc gggcgcggcc tatgaggcgg cggtggccga cgtggtcgcc 540
cgtatcggcg cgggcgagct gtttcaggcc aatatcgcgc gggcctggac cggacgactg 600
aaatcgggcc gtgacccgtt cgaggtcttc ctgcggttgt cggcgggacg aggggcggct 660
tacggcgctt tctggcggct gggcgagcgg gcgctggtgt ccaactcgcc ggaactgttc 720
ctgaccttcg acggcgacag cggccgcatc gagacccggc cgatcaaggg cacccgcgcg 780
cgcgaccctg acccggcgcg cgatgcggcc cttgcggcgg agctatgcgc cagcgccaag 840
gaccgggccg agaacctgat gatcgtcgat ctgatgcgca acgacgtggc gcgggcggcg 900
cggcccggtt cggtccaggt cgagcgcctg ttcgaactgg agcgccatcc gacggtgcat 960
cacctggtct cgacggtcag cgcccaggcg gcgcagggcg tcggtccggc cgaggtcatg 1020
gaggccgcct tcccgcccgg ctccatcacc ggcgcgccca agcatcaggc catgaaggtg 1080
atcgcgggcc atgagccgcc gcgcgggccg tggtgcggct ctctgttcgg ctgggggctg 1140
ggcgaggagg cgaggctgac ggcttccgtc ctgatccgca cggcggcgtt cgagcgcgga 1200
gcggacggct gggtctggcg cgccctggcg ggggcgggga ttgtggccga cagcgacccc 1260
cgcgccgaac ggctggagac cgaggccaag ttcagcgcat tgaaggaggc tctggtcggg 1320
cgcggctag 1329
<210> 6
<211> 442
<212> PRT
<213> 缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)
<400> 6
Met Ser Gly Leu Pro Val Gln His Val Glu Thr His Pro Trp Arg Asp
1 5 10 15
Pro Leu Glu Thr Ala Ala Gly Leu Asn Arg Arg Glu Gly Ala Leu Ala
20 25 30
Leu Leu Ala Gly Ala Gly Asp Pro Gln Val His Gly Gly Arg Trp Ser
35 40 45
Phe Val Ala Cys Glu Pro Asp Gln Val Phe Val Gly Arg Val Asn Asp
50 55 60
Gly Ala Leu Phe Gln Arg Leu Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Gly Gly Gly
65 70 75 80
Val Val Gly Leu Met Ser Tyr Asp Ala Gly Ala Arg Pro Ala Thr Gly
85 90 95
Glu Arg Gly Asp Gly Trp Pro Asp Leu Met Leu Ala Arg Tyr Pro Ala
100 105 110
Leu Leu Ala Phe Asp His Gln Glu Arg Gln Val Arg Ala Val Gly Arg
115 120 125
Gly Ala Asp Ala Glu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Arg Arg Ala Val Asp
130 135 140
Trp Leu Asp Ala Ala Ala Ser Val Glu Ala Pro Ser Pro Pro Cys Asp
145 150 155 160
His Ala Leu Glu Glu Gly Ser Gly Ala Ala Tyr Glu Ala Ala Val Ala
165 170 175
Asp Val Val Ala Arg Ile Gly Ala Gly Glu Leu Phe Gln Ala Asn Ile
180 185 190
Ala Arg Ala Trp Thr Gly Arg Leu Lys Ser Gly Arg Asp Pro Phe Glu
195 200 205
Val Phe Leu Arg Leu Ser Ala Gly Arg Gly Ala Ala Tyr Gly Ala Phe
210 215 220
Trp Arg Leu Gly Glu Arg Ala Leu Val Ser Asn Ser Pro Glu Leu Phe
225 230 235 240
Leu Thr Phe Asp Gly Asp Ser Gly Arg Ile Glu Thr Arg Pro Ile Lys
245 250 255
Gly Thr Arg Ala Arg Asp Pro Asp Pro Ala Arg Asp Ala Ala Leu Ala
260 265 270
Ala Glu Leu Cys Ala Ser Ala Lys Asp Arg Ala Glu Asn Leu Met Ile
275 280 285
Val Asp Leu Met Arg Asn Asp Val Ala Arg Ala Ala Arg Pro Gly Ser
290 295 300
Val Gln Val Glu Arg Leu Phe Glu Leu Glu Arg His Pro Thr Val His
305 310 315 320
His Leu Val Ser Thr Val Ser Ala Gln Ala Ala Gln Gly Val Gly Pro
325 330 335
Ala Glu Val Met Glu Ala Ala Phe Pro Pro Gly Ser Ile Thr Gly Ala
340 345 350
Pro Lys His Gln Ala Met Lys Val Ile Ala Gly His Glu Pro Pro Arg
355 360 365
Gly Pro Trp Cys Gly Ser Leu Phe Gly Trp Gly Leu Gly Glu Glu Ala
370 375 380
Arg Leu Thr Ala Ser Val Leu Ile Arg Thr Ala Ala Phe Glu Arg Gly
385 390 395 400
Ala Asp Gly Trp Val Trp Arg Ala Leu Ala Gly Ala Gly Ile Val Ala
405 410 415
Asp Ser Asp Pro Arg Ala Glu Arg Leu Glu Thr Glu Ala Lys Phe Ser
420 425 430
Ala Leu Lys Glu Ala Leu Val Gly Arg Gly
435 440
Claims (7)
1.一种L-2-氨基丁酰胺的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
以L-苏氨酸为原料，利用苏氨酸脱氨酶将L-苏氨酸转化为2-丁酮酸；
利用氨基酸脱氢酶将2-丁酮酸转化为L-2-氨基丁酸；
在酰胺酶的催化作用下，将L-2-氨基丁酸反应成L-2-氨基丁酰胺；
所述L-2-氨基丁酰胺制备方法的步骤具体包括：
将含有重组载体的大肠杆菌菌株接种于种子培养基中进行振荡培养，得到种子液；所述的重组载体包含苏氨酸脱氨酶的编码基因、氨基酸脱氢酶的编码基因以及酰胺酶的编码基因；所述氨基酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；所述苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示；所述酰胺酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示；
将上述种子液接种于含有L-苏氨酸的发酵培养基中，得到发酵液；
将上述发酵液的pH值控制在6.5~7.5，同时对发酵液进行搅拌发酵，当发酵液的OD600为10~15时，往发酵液中加入诱导剂诱导苏氨酸脱氨酶、氨基酸脱氢酶和酰胺酶表达，并继续进行搅拌发酵，得到L-2-氨基丁酰胺；
每升所述含有L-苏氨酸的发酵培养基中包括以下组分：L-苏氨酸60~80g、酵母粉4~6g、胰蛋白胨1~3g、(NH4)2SO4 1~3g、K2HPO4 3~5g、KH2PO4 3~5g、MgSO4 0.3~1g、一水合柠檬酸0.1~0.5g、MnCl2 0.05~0.1g；
所述的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
2. 根据权利要求1所述的一种L-2-氨基丁酰胺的制备方法，其特征在于，每升所述的种子培养基中包括以下组分：酵母粉4~6g、蛋白胨8~12g、NaCl 4~6g、MgSO4 0.5~1.5g。
3.根据权利要求1所述的一种L-2-氨基丁酰胺的制备方法，其特征在于，所述含有L-苏氨酸的发酵培养基与种子液的体积比为100:(3~5)。
4.根据权利要求1所述的一种L-2-氨基丁酰胺的制备方法，其特征在于，所述的步骤还包括：
当发酵液中L-苏氨酸的质量浓度低于10~15g/L时，按照每升发酵液补加20~40g的量往发酵液中补加L-苏氨酸，并重复该步骤3~5次。
5.根据权利要求1所述的一种L-2-氨基丁酰胺的制备方法，其特征在于，每升所述的发酵液中添加的诱导剂的质量为1~3g。
6.根据权利要求1所述的一种L-2-氨基丁酰胺的制备方法，其特征在于，所述的步骤中，振荡培养的温度为32~37℃。
7.根据权利要求1所述的一种L-2-氨基丁酰胺的制备方法，其特征在于，所述的步骤中，搅拌发酵的温度为32~37℃。
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