CN111770993A - 调节csr系统以生产赖氨酸和赖氨酸衍生产物 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及遗传修饰的微生物，其过表达生物膜扩散相关多肽以增强微生物的赖氨酸和赖氨酸衍生物的生产，产生这种微生物的方法以及使用所述遗传修饰的微生物生产赖氨酸和赖氨酸衍生物的方法。

Description

调节CSR系统以生产赖氨酸和赖氨酸衍生产物
发明背景
分子移入和移出细胞的能力对分子的细胞内浓度具有显著影响。例如，如果分子是营养物，则减慢分子移入细胞将抑制生长(Herbert,D&HL Kornberg,Biochem.J.156(2),477-480,1976)。如果分子是毒素，则减慢分子移出细胞将抑制生长。如果分子是反应的底物，则减慢分子移入细胞将减慢反应速度。如果分子是一系列反应的中间体，则减慢分子移出细胞并使其积聚在细胞内可导致反馈抑制(Kikuchi et al.,FEMS MicrobiologyLetters 173:211-215,1999；Ogawa-Miyata et al.,Biosci.Biotechnol.Biochem.65:1149-1154,2001)。
先前揭示了通过降低双-(3'-5')-环二鸟苷-单磷酸(c-di-GMP)的细胞内浓度来增加生物膜扩散的磷酸二酯酶蛋白影响氨基酸例如赖氨酸及其衍生产物如尸胺的生产(PCT/CN2016/095281)。尽管已经显示有多种基因水解c-di-GMP及增加生物膜扩散活性(例如大肠杆菌(E.coli)的bdcA或yahA；铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的rapA、fleN、rocR或bifA；霍乱弧菌(V.cholerae)的vieA或mbaA；及天蓝色链霉菌(S.coelicolor)的rmdAB)，但是还未知通过降低细胞内c-di-GMP浓度来增加生物膜扩散活性对氨基酸或其衍生物生产的任何影响。PCT/CN2016/095281证实，其中过表达生物膜扩散多肽的遗传修饰的微生物相对于不包含所述遗传修饰的相同菌株的对应微生物，示出赖氨酸或赖氨酸衍生化合物如尸胺的生产增加。
已经鉴定了影响生物膜形成的另一组基因。碳储存调节剂(Csr)CsrA是一种全局调节蛋白，已显示抑制生物膜形成及增加大肠杆菌中的生物膜扩散(Jackson et al.,J.Bacteriol.184:290-301,2002)。已经示出破坏csrA基因会增加生物膜形成，以及从质粒过表达csrA会抑制大肠杆菌中生物膜形成。也已经示出CsrA是mRNA结合蛋白，其是影响糖原生物合成、分解代谢和糖异生的调节途径的一部分(Romeo et al.,J.Bacteriol.175:4744-4755,1993)。CsrA活性被sRNA CsrB的结合所抑制，sRNA CsrB是一种非编码RNA，由18个不完全重复序列(5’-CAGGA(U,C,A)G-3’)组成，形成发夹结构(Romeo et al.,Mol.Microbiol.29:1321-1330,1998)。因此，部分抑制机制是18CsrA蛋白与发夹结构的一个CsrB分子结合。
另外有两种蛋白质/sRNA是Csr系统的一部分。虽然CsrA调节mRNA稳定性及在转录和转录后水平均发挥作用，但CsrD蛋白却是一种信号传导蛋白，可导致受到Csr调节系统影响的基因的正转录调节(Esquerre et al.,Scientific Reports 6:25057,2016)。Csr 系统另外受sRNA CsrC调节，其也可以抑制CsrA的活性(Wellbacher et al.,Mol.Microbiol.48:657-670,2003)。已经示出在营养不良条件期间CsrB和CsrC二者也被上调(Jonas et al.,FEMS Microbiol.Lett.297:80-86)。
先前已经操纵Csr系统以增加氨基酸的生产。例如，已经示出通过减少CsrB的量来增加CsrA产生可以增加苏氨酸生产(WO 2003/046184)。随后示出(EP 2050816和US 2009/0258399)，缺失csrB和csrC可以增加氨基酸生产，特别是精氨酸的生产。EP 2055771指出弱化csrB可以增加氨基酸生产，及在美国专利号8759042中示出，缺失csrC可以增加精氨酸生产。有趣的是，还已经示出，增加csrB的表达可以增加苯丙氨酸生产(Yakandawala et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.78:283-291,2008)和色氨酸生产(Lu et al.,Chin.J.Appl.Environ.Biol.21:647-651,2015)。因此，这些公开表明增加或减少CsrB或CsrC可以增加或减少氨基酸的生产。因此，当在细胞中操纵CsrB或CsrC水平时，技术人员将不能确定与先前评估的氨基酸不同的特定氨基酸是减少或增加。
发明各方面简述
本公开部分基于令人惊讶的发现，即增加大肠杆菌中CsrA的产生并不增加赖氨酸生产；而是降低赖氨酸生产；以及过表达csrB或csrC的细胞示出增加的赖氨酸生产。
因此，一方面，本文提供了遗传修饰的宿主细胞，其包含编码CsrB sRNA或CsrCsRNA的外源核酸，其中所述宿主细胞相对于未被修饰以表达所述外源核酸的对应宿主细胞而言过表达CsrB或CsrC；且与野生型宿主细胞相比具有至少一种额外的遗传修饰以增加赖氨酸或赖氨酸衍生物的生产。在一些实施方案中，所述氨基酸衍生物是尸胺。在一些实施方案中，CsrB sRNA包含与SEQ ID NO:16具有至少85％相同性、或至少90％相同性或至少95％相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，CsrC sRNA包含与SEQ ID NO:17具有至少85％相同性、或至少90％相同性或至少95％相同性的核苷酸序列。在特定的实施方案中，CsrBsRNA包含SEQ ID NO:16所示核酸序列。在其它实施方案中，CsrC sRNA包含SEQ ID NO:17所示核酸序列。在一些实施方案中，CsrB或CsrC sRNA对于宿主细胞是异源的。在一些实施方案中，编码CsrB或CsrC sRNA的所述外源核酸由导入细胞中的表达载体编码，其中所述表达载体包含与启动子可操纵地连接的所述外源核酸。在其它实施方案中，所述外源核酸整合进宿主染色体中。在一些实施方案中，所述宿主细胞过表达赖氨酸脱羧酶。在进一步的实施方案中，所述宿主细胞过表达一种或多种赖氨酸生物合成多肽，例如天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氨基庚二酸脱羧酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶甲酸还原酶或天冬氨酸转氨酶。在特定的实施方案中，天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氨基庚二酸脱羧酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶甲酸还原酶或天冬氨酸转氨酶是LysC、DapA、LysA、Asd、DapB或AspC多肽。在一些实施方案中，所述宿主细胞过表达CadA、LysC、DapA、LysA、Asd、DapB和AspC多肽。在一些实施方案中，所述宿主细胞是埃希氏菌属(Escherichia)、哈夫尼菌属(Hafnia)或棒状杆菌属(Corynebacterium)细胞。在特定实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
另一方面，本文提供了生产赖氨酸或赖氨酸衍生物例如尸胺的方法，所述方法包括例如在前文中所述在CsrB sRNA或CsrC sRNA过表达的条件下培养宿主细胞。
另一方面，本文提供了一种工程化宿主细胞以增加赖氨酸或赖氨酸衍生物生产的方法，所述方法包括将编码CsrB sRNA或CsrC sRNA的外源核酸导入宿主细胞，其中所述宿主细胞与野生型宿主细胞相比具有至少一种另外的遗传修饰以增加赖氨酸或赖氨酸衍生物的生产；在表达CsrB或CsrC sRNA的条件下培养所述宿主细胞，并选择相对于未被修饰以表达所述外源核酸的对应对照宿主细胞而言显示增加的赖氨酸或赖氨酸衍生物生产的宿主细胞。在一些实施方案中，所述氨基酸衍生物是尸胺。在一些实施方案中，CsrB sRNA包含与SEQ ID NO:16具有至少85％相同性、或至少90％相同性或至少95％相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，CsrC sRNA包含与SEQ ID NO:17具有至少85％相同性、或至少90％相同性或至少95％相同性的核苷酸序列。在进一步的实施方案中，CsrB sRNA包含SEQ IDNO:16所示核酸序列。在其它实施方案中，CsrC sRNA包含SEQ ID NO:17所示核酸序列。在一些实施方案中，CsrB sRNA或CsrC sRNA对于宿主细胞是异源的。在一些实施方案中，编码CsrB或CsrC sRNA的外源核酸由导入细胞中的表达载体编码，其中所述表达载体包含与启动子可操纵地连接的所述外源核酸。在其它实施方案中，所述外源核酸整合进宿主染色体中。在一些实施方案中，所述宿主细胞过表达赖氨酸脱羧酶。在一些实施方案中，所述宿主细胞过表达一或多种赖氨酸生物合成多肽，例如天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氨基庚二酸脱羧酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶甲酸还原酶或天冬氨酸转氨酶。在一些实施方案中，所述天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氨基庚二酸脱羧酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶甲酸还原酶或天冬氨酸转氨酶是LysC、DapA、LysA、Asd、DapB或AspC多肽。在一些实施方案中，所述宿主细胞过表达CadA、LysC、DapA、LysA、Asd、DapB和AspC多肽。在一些实施方案中，所述宿主细胞是埃希氏菌属、哈夫尼菌属或棒状杆菌属细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌或谷氨酸棒杆菌。
发明详述
术语
如本文所用，“CsrB”是指小调节RNA(sRNA)，其包含形成发夹结构并结合CsrA的不完全重复。“CsrB”包括大肠杆菌CsrB和来自其它细菌例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)成员的CsrB的同系物。大肠杆菌CsrB的长度约为360个核苷酸，含有18个不完全重复序列5’-CAGGA(U,C,A)G-3’(Romeo et al.,Mol.Microbiol.29:1321-1330,1998)。CsrA结合发夹结构CsrB，由此一个CsrA分子结合每个发夹结构。因此，CsrB隔离CsrA并降低CsrA活性。在其它肠杆菌科例如沙门氏菌属(Salmonella)、志贺菌属(Shigella)和耶尔森菌属(Yersinia)中已经报道了CsrA/CsrB序列。在沙门氏菌属中，CsrB示出具有16个预测的茎环，每个茎环均携带共有序列GWGGRHG(Altier,et al.Mol.Microbiol.35:635-646,2000)，其中“W”是A或U；R是A或G；并且H是A、C或U。示例的大肠杆菌CsrB DNA序列在SEQ ID NO:16中提供。其它CsrB序列包括由如下染色体区域编码的那些序列：肠道沙门氏菌亚种(Salmonella enterica subsp)的染色体区域CP015574.1，福氏志贺菌(Shigellaflexneri)的染色体区域CP024470.1，宋氏志贺菌(Shigella sonnei)的染色体区域CP023645.1和柠檬酸杆菌属(Citrobacter sp.)的染色体区域LT556085.1。
如本文所用，“CsrC”是指这样的sRNA，其包含与CsrB中包含的那些形成发夹结构的不完全重复序列相似的不完全重复序列并且结合CsrA，从而隔离CsrA。该术语包括大肠杆菌CsrC和来自其它细菌如肠杆菌科成员的CsrC的同系物。大肠杆菌CsrC的长度约为245个核苷酸，含有9个这种重复序列(Weilbacher et al.,Mol.Microbiol.48:657-670,2003)。在沙门氏菌属中，CsrC示出具有8个预测的茎环结构(Fortune et al.,Infect.AndImmun.74:1331-1339,2006)。示例的大肠杆菌CsrC DNA序列在SEQ ID NO:17中提供。其它CsrC序列包括由如下染色体区域编码的那些序列：宋氏志贺菌的染色体区域CP023645.1，福氏志贺菌的染色体区域CP024470.1，韦氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)的CP023504.1和肠道沙门氏菌亚种的染色体区域CP018661.1。
术语CsrB或CsrC sRNA的“增加的表达”和“过表达”在本文可互换使用，是指与不具有所述遗传修饰的对应细胞(即没有所述修饰的相同菌株的细胞)中CsrB或CsrC sRNA的量相比，遗传修饰的细胞如其中已经导入编码CsrB或CsrC sRNA的表达构建体的细胞中CsrB或CsrC sRNA的量增加。对于本申请而言，增加的表达水平通常是与所述未修饰的对应细胞相比增加至少5％、或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高。所述未修饰的细胞不需要表达所述CsrB或CsrC sRNA。因此，术语“过表达”还包括其中CsrB或CsrC sRNA在不天然表达所述CsrB或CsrC sRNA的宿主细胞中表达的实施方案。CsrB或CsrC sRNA的增加的表达可以通过多种检测方法进行评估，包括但不限于测量RNA水平和/或CsrB或CsrC sRNA活性的水平，例如直接测量CsrA结合活性或通过评估由CsrB或CsrC sRNA调节的活性。
如本文所用，在赖氨酸或赖氨酸衍生物如尸胺的生产中所用术语“增强的”是指与对照对应细胞(例如野生型菌株细胞或没有所述遗传修饰以增加赖氨酸或所述赖氨酸衍生物生产的相同菌株细胞)相比，遗传修饰的宿主细胞的氨基酸例如赖氨酸或衍生物的生产增加。氨基酸或其衍生物的生产与所述对照细胞相比通常增强至少5％、或至少0％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高。
当在给定氨基酸或多核苷酸序列的编号中使用时，术语“参考……编号”或“对应于”或“参考……确定”是指当将给定氨基酸或多核苷酸序列与参考序列对比时，指定的参考序列残基的编号。例如，CsrB或CsrC sRNA序列变体中的核苷酸“对应于”SEQ ID NO:16中的核苷酸位置是当以最大比对比较SEQ ID NO:16和变体时，所述残基与所述核苷酸比对。
如本文所用，在表达载体和编码CsrB或CsrC sRNA的序列中使用的术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用，是指从5'至3'末端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。本发明所用核酸通常将含有磷酸二酯键，但是在某些情况下，可以使用具有替代主链的核酸类似物，包括例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基亚磷酰胺键(见Eckstein,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,Oxford University Press)；带正电的主链；非离子主链和非核糖主链。核酸或多核苷酸还可包括修饰的核苷酸，其允许聚合酶正确通读。“多核苷酸序列”或“核酸序列”包括核酸的有义和反义链，作为单个单链或是双链体。如本领域技术人员将理解的，单链的描述也定义了互补链的序列；因此本文所述的序列也提供了该序列的互补序列。除非另有说明，否则特定的核酸序列例如编码多肽的核酸序列也隐含涵盖变体简并密码子取代和互补序列，以及明确指出的序列。核酸可以是DNA，基因组DNA和cDNA二者，RNA或杂合体，其中核酸可以包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及碱基的组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等。除非另有说明，否则核酸序列以5'至3'方向呈现。
在两个核酸或多肽的语境中使用的术语“基本上相同”是指与参考序列具有至少60％、65％或70％序列相同性的序列。百分比相同性可以是60-100％之间的任何整数。一些实施方案包括使用本文所述程序、优选如下文描述使用标准默认参数的BLAST程序，与参考序列相比具有至少：60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
如果两个序列中的核苷酸或氨基酸残基的序列在如下所述以最大对应性进行比对时分别相同，则认为两个核酸序列或多肽序列是“相同的”。在两个或更多个核酸或多肽序列的语境中，术语“相同的”或百分比“相同性”是指两个或更多个序列或子序列当在比较窗比较或最大对应性比对时是相同的或具有指定百分比的氨基酸残基或核苷酸是相同的，如使用如下序列比较算法或者通过人工比对和目测所测量的。当关于蛋白质或肽使用序列相同性百分比时，应认识到不相同的残基位置通常由于保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基取代，因此不会改变分子的功能性质。在序列因保守取代而不同的情况中，可以上调百分比序列相同性以校正取代的保守性质。进行这种调整的手段是本领域技术人员熟知的。通常，这涉及将保守取代评分为部分错配而不是完全错配，从而增加百分比序列相同性。因此，例如在相同氨基酸的评分为1且非保守取代的评分为0的情况下，保守取代的评分在0至1之间。
为了进行序列比较，通常一个序列作为参考序列，测试序列与其进行比较。使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，及指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，也可以指定可选参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列相同性。
可用于确定CsrB或CsrC sRNA与SEQ ID NO:16或17或另一个多核苷酸参考序列是否具有序列相同性的算法是BLAST算法，其描述于Altschul et al.,1990,J.Mol.Biol.215:403-410，在此将其并入本文作参考。进行BLAST和BLAST2分析的软件可通过国家生物技术信息中心(万维网ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。
如本文所用，“比较窗”包括提及选自20-600、通常约50-约200、更通常约100-约150个连续位置数目的任一节段，其中将两个序列最佳比对后，可以将序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。可以通过如下算法进行比较序列的最佳比对，例如Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法，Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的搜索相似性方法，这些算法的计算机执行程序(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)，或者人工比对和目测。
如本文所用，术语“启动子”是指能驱动细胞中DNA序列转录的多核苷酸序列。因此，在本发明的多核苷酸构建体中使用的启动子包括顺式和反式作用转录控制元件以及参与调节或调控基因的转录时机和/或速率的调节序列。例如，启动子可以是顺式作用转录控制元件，包括增强子、阻抑物结合序列等。这些顺式作用序列通常与蛋白质或其它生物分子相互作用以进行(打开/关闭，调节，调控等)基因转录。核心启动子序列最经常位于翻译起始位点的1-2kb之内，更经常位于翻译起始位点的1kbp之内及通常在翻译起始位点的500bp或200bp或更短的范围内。按照惯例，启动子序列通常作为其控制的基因的编码链上的序列提供。在本申请的上下文中，启动子通常用其天然调节表达的基因的名称来指代。因此，在本发明的表达构建体中使用的启动子以所述基因名称指代。提及启动子的名称包括野生型、天然启动子以及保持诱导表达能力的启动子变体。提及启动子的名称不限于特定物种，还涵盖来自其它物种中相应基因的启动子。
在本发明的上下文中，“组成型启动子”是指在细胞中在大多数条件下例如在不存在诱导分子的条件下能起始转录的启动子。“诱导型启动子”在诱导分子存在下起始转录。
如本文所用，如果多核苷酸源自外来物种，或者如果源自相同物种但是其原始形式的修饰形式，则该多核苷酸对于生物体或第二多核苷酸序列而言是“异源的”。例如，当编码CsrB或CsrC sRNA序列的多核苷酸被称作是可操纵地连接异源启动子时，这意味着编码CsrB或CsrC的多核苷酸编码序列来自一个物种，而启动子序列则来自另一个不同的物种；或者，如果二者均源自同一物种，则编码序列与所述启动子不是天然相关的(例如是遗传工程化的编码序列，例如来自同一物种的不同基因，或来自不同物种的等位基因)。类似地，如果天然野生型宿主细胞不产生CsrB或CsrC sRNA，则CsrB或CsrC sRNA或编码CsrB或CsrCsRNA的多核苷酸对于宿主细胞是“异源”的；如果核苷酸序列与宿主细胞天然的CsrB或CsrC多核苷酸序列不同，则CsrB sRNA或CsrC sRNA变体对于宿主细胞是“异源”的。
如本文所用，术语“外源”通常是指通过分子生物学技术导入宿主细胞以产生重组细胞的多核苷酸序列或多肽。“外源”多核苷酸的实例包括编码希望的蛋白质的载体、质粒和/或人工核酸构建体。在宿主细胞中表达的“外源”多肽或多核苷酸可以天然存在于野生型宿主细胞中或对于宿主细胞是异源的。该术语还涵盖已被工程化以表达外源多核苷酸或多肽序列的原始宿主细胞的后代，即表达“外源”多核苷酸的宿主细胞可以是原始的遗传修饰的宿主细胞或包含所述遗传修饰的后代细胞。
术语“内源”是指可以在给定的野生型细胞或生物体中发现的天然存在的多核苷酸序列或多肽。在这方面，还应注意即使生物体可以包含给定多核苷酸序列或基因的内源拷贝，导入编码该序列的表达构建体或载体例如以过表达或另外调节所编码蛋白质的表达，代表该基因或多核苷酸序列的“外源”拷贝。本文所述的任何途径、基因、RNA或酶都可以利用或依赖于“内源”序列，其可以作为一或多个“外源”多核苷酸序列提供，或两者。
如本文所用，“重组核酸”或“重组多核苷酸”是指遗传工程化的核酸聚合物，其中如下至少一项是真实的：(a)核酸序列对于给定宿主细胞是外源的(即不是天然存在于给定宿主细胞中)；(b)该序列可以天然存在于给定宿主细胞中，但是不是天然的(例如大于预期的)量；或者(c)核酸序列包含两个或更多个子序列，其在自然界中彼此不是在相同的关系中。例如，关于情况(c)，重组核酸序列将具有来自不相关基因的两个或更多个序列，排列成新的功能性核酸。“重组”核酸是指被操纵的原始多核苷酸以及该多核苷酸的拷贝。
术语“可操纵地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如DNA)节段之间的功能关系。通常，其是指转录调节序列与被转录序列的功能关系。例如，如果启动子或增强子序列在合适的宿主细胞或其它表达系统中刺激或调控DNA或RNA序列的转录，则其是可操纵地连接所述DNA或RNA序列。通常，与被转录序列可操纵连接的启动子转录调节序列与被转录序列是物理连续的，即其是顺式作用的。但是，某些转录调节序列如增强子与转录被其增强的编码序列不需要是物理连续的或位于其附近。
术语“表达盒”或“DNA构建体”或“表达构建体”是指当被导入宿主细胞时分别导致RNA或多肽的转录和/或翻译的核酸构建体。在表达转基因的情况下，技术人员将认识到插入的多核苷酸序列不必相同，而可以仅与其来源的基因的序列基本相同。如本文所解释，这些基本相同的变体通过参照特定核酸序列而被特异性涵盖。表达盒的一个示例是多核苷酸构建体，其包含与启动子例如其天然启动子可操纵连接的编码用于本发明的多肽的多核苷酸序列，其中将表达盒导入异源微生物中。在一些实施方案中，表达盒包含编码本发明多肽的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸靶向微生物基因组中的位置，使得所述多核苷酸序列的表达由微生物中存在的启动子驱动。
在本发明的上下文中使用的术语“宿主细胞”是指微生物，包括可以是或已经是本发明任何重组载体或分离的多核苷酸的接受者的单个细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，所述后代由于自然、偶然或有意的突变和/或改变而不一定与原始亲代细胞完全相同(在形态学上或在总DNA补体上)。宿主细胞包括通过转化、转染等已经将本发明的重组载体或多核苷酸导入其中的细胞。
术语“分离的”是指一个材料基本上或实质上没有在其天然状态下通常与其伴随的组分。例如，如本文所用，“分离的多核苷酸”可以指已经与在天然发生的或基因组状态下位于其侧翼的序列分离的多核苷酸，例如已经从与其正常相邻的序列中去除的DNA片段，例如通过克隆进载体进行。例如，如果将多核苷酸克隆进不是其自然环境的一部分的载体中，或者以不同于天然存在的方式人工导入细胞基因组中，则认为该多核苷酸是分离的。
本公开的各方面
本公开部分基于以下发现：在微生物如革兰氏阴性细菌中增加的CsrB或CsrCsRNA的表达增强赖氨酸生产和/或赖氨酸衍生物如尸胺的生产。
根据本发明被工程化以过表达CsrB或CsrC sRNA的宿主细胞也过表达参与氨基酸或氨基酸衍生物合成的至少一种酶，例如赖氨酸脱羧酶多肽；和/或参与氨基酸生物合成的其它多肽。赖氨酸脱羧酶和赖氨酸生物合成多肽和核酸序列是本领域可获得的。
本发明使用各种常规重组核酸技术。通常，以下描述的重组DNA技术中的命名法和实验室程序是本领域中常用的。有许多提供指导进行重组DNA操纵的手册，例如Sambrook&Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(3rd Ed,2001)；和CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel,et al.,John Wiley and Sons,New York,2009-2017)。
编码CsrB或CsrC sRNAs的多核苷酸
已示出多种多核苷酸编码结合CsrA并降低CsrA功能的CsrB和CsrC sRNA。编码适合在宿主细胞中过表达以增加赖氨酸或赖氨酸衍生物生产的CsrB和CsrC sRNA的多核苷酸包括大肠杆菌CsrB和CsrC多核苷酸序列，分别如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示。
在一些实施方案中，对宿主细胞进行遗传修饰以过表达与SEQ ID NO:16具有至少60％或至少70％、75％、80％、85％或至少90％相同性的CsrB多核苷酸。除非另有说明，否则“SEQ ID NO:16”是指在示例的序列表中示出的DNA序列以及其中尿嘧啶碱基置换胸腺嘧啶碱基的其RNA对应物。因此，当将CsrB RNA序列与SEQ ID NO:16比较以确定百分比相同性时，应当理解SEQ ID NO:16将含有“U”而不是“T”。SEQ ID NO:16的CsrB多核苷酸变体保留结合CsrA的能力。在一些实施方案中，CsrB多核苷酸与SEQ ID NO:16具有至少85％的相同性，或者至少90％或至少95％的相同性。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:16所示序列。其它示例的CsrB序列包括来自志贺菌属、小麦属(Triticum)、柠檬酸杆菌属和沙门氏菌属的SEQ ID NO:18、19、20、21和22所示的序列，其与SEQ ID NO:16具有99％的序列相同性(志贺菌属和小麦属)，90％的序列相同性(柠檬酸杆菌属)和87％的序列相同性(沙门氏菌属)。
在一些实施方案中，对宿主细胞进行遗传修饰以过表达与SEQ ID NO:17具有至少60％或至少70％、75％、80％、85％或至少90％相同性的CsrC多核苷酸。除非另有说明，否则“SEQ ID NO:17”是指在示例的序列表中所示的DNA序列以及其中尿嘧啶碱基置换胸腺嘧啶碱基的其RNA对应物。因此，当将CsrC RNA序列与SEQ ID NO:17比较以确定百分比相同性时，应当理解SEQ ID NO:17将含有“U”而不是“T”。SEQ ID NO:17的CsrC多核苷酸变体保留结合CsrA的能力。在一些实施方案中，CsrC多核苷酸与SEQ ID NO:17具有至少85％的相同性，或者至少90％或至少95％的相同性。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:17所示序列。其它示例的CsrC序列包括来自宋氏志贺菌、福氏志贺菌、韦氏柠檬酸杆菌和肠道沙门氏菌的SEQ ID NOS:23、24、25和26所示序列，其与SEQ ID NO:17分别具有100％、99％、89％和88％的序列相同性。
在一些实施方案中，CsrB或CsrC sRNA包含至少8个或至少9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个；及通常少于20个结合CsrA的发夹。在一些实施方案中，发夹结构包含序列GWGGRHG，其中“W”是A或U；R是A或G及H是A、C或U。在一些实施方案中，发夹结构包含序列CAGGA(U,C,A)G。
在一些实施方案中，宿主细胞被遗传修饰为过表达来自沙门氏菌属、柠檬酸杆菌属或志贺菌属的CsrB或CsrC sRNA。
野生型或变体CsrB或CsrC sRNA的活性可以使用许多测定方法评估，包括评估赖氨酸或赖氨酸衍生化合物的生产的测定方法。在一些实施方案中，测量赖氨酸生产或尸胺生产。本文实施例章节提供了示例的测定。在一些实施方案中，在经修饰以共表达LysC、DapA、LysA、Asd、DapB、AspC和CadA以及CsrB或CsrC sRNA的大肠杆菌中测量尸胺生产。以下是用于评估赖氨酸和/或尸胺生产的示例测定。修饰大肠杆菌以表达LysC、DapA、LysA、Asd、DapB、AspC和CadA以及CsrB或CsrC sRNA。可以将基因分别导入大肠杆菌或导入一个或多个操纵子中。例如，LysC、DapA、LysA、Asd、DapB和AspC可以由在一个质粒中存在的合成操纵子编码，而CadA和候选变体可以由单独的质粒编码。每个质粒具有独特的抗生素抗性选择标记。选择并培养抗生素抗性菌落。例如，将培养物在37℃在含有4％葡萄糖、0.1％KH2PO4、0.1％MgSO4、1.6％(NH4)2SO4、0.001％FeSO4、0.001％MnSO4、0.2％酵母提取物，0.05％L-甲硫氨酸，0.01％L-苏氨酸，0.005％L-异亮氨酸和适当抗生素以供选择的3mL培养基中生长过夜。第二天，将每个培养物接种到含有30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO3)2、抗生素的50mL新鲜培养基中，在37℃生长72小时，此时确定赖氨酸的浓度。赖氨酸或尸胺可以使用NMR进行定量。可以通过将生产的赖氨酸或尸胺的摩尔量除以加入的葡萄糖的摩尔量来计算产率。可用于本发明的CsrB或CsrC sRNA增加赖氨酸或尸胺的产率。或者，评估菌落的另一种赖氨酸衍生物的生产增加。
在一些实施方案中，与包含除了过表达CsrB或CsrC sRNA的修饰之外的相同遗传修饰的相同菌株的对应宿主细胞相比，当在宿主中表达时，CsrB或CsrC sRNA使赖氨酸或尸胺生产增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或更高。在一些实施方案中，当在修饰为过表达赖氨酸脱羧酶、天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氨基庚二酸脱羧酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶甲酸还原酶和天冬氨酸转氨酶的宿主细胞中表达时，与包含修饰以过表达赖氨酸脱羧酶、天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氨基庚二酸脱羧酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶甲酸还原酶和天冬氨酸转氨酶但是不过表达CsrB或CsrC sRNA的相同菌株的对应宿主细胞相比，CsrB或CsrC sRNA使赖氨酸或尸胺生产增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或更高。
在一些实施方案中，CsrB或CsrC sRNA的活性可以通过例如在定量迁移测定中确定RNA结合CsrA的能力来评估。
可以通过多种技术来实现CsrB或CsrC序列的分离或产生以掺入表达盒用于在宿主细胞中过表达。这种技术将在CsrB或CsrC多核苷酸序列上下文中讨论。但是，技术人员理解可以使用相同技术分离和表达其它希望的基因。在一些实施方案中，基于本文揭示序列的寡核苷酸探针可用于从希望的细菌物种的cDNA或基因组DNA文库中鉴别希望的多核苷酸。探针可用于与基因组DNA杂交以在相同或不同物种中分离同源基因。
在典型的实施方案中，使用常规扩增技术从核酸样品扩增感兴趣的核酸。例如，PCR可用于直接从基因组DNA扩增序列。PCR和其它体外扩增方法也可以用于例如克隆编码待表达蛋白质的核酸序列，使核酸用作探针以检测样品中希望的mRNA的存在，用于核酸测序或者其它目的。
可以通过比较本文提供的序列确定在细菌中产生CsrB和CsrC多核苷酸的合适引物和探针。关于PCR的一般概述见PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications.(Innis,M,Gelfand,D.,Sninsky,J.and White,T.,eds.),Academic Press,San Diego(1990)。示例的引物序列在实施例章节的引物表中示出。
编码赋予宿主细胞增加的赖氨酸或赖氨酸衍生产物如尸胺生产的CsrB或CsrCsRNA的核酸序列可另外进行密码子优化以在希望的宿主细胞中表达。可以采用的方法和数据库是本领域已知的。例如，优选的密码子可以关于如下方面确定：单个基因、具有共同功能或起源的一组基因、高度表达的基因中的密码子使用，整个生物体的总蛋白编码区中的密码子频率，相关生物体的总蛋白质编码区中的密码子频率，或其组合。见例如Henaut andDanchin in"Escherichia coli and Salmonella,"Neidhardt,et al.Eds.,ASM Pres,Washington D.C.(1996),pp.2047-2066；Nucleic Acids Res.20:2111-2118；Nakamura etal.,2000,Nucl.Acids Res.28:292)。
制备重组载体
表达CsrB或CsrC sRNA的重组载体可以使用本领域熟知的方法制备。例如，可以将编码CsrB或CsrC sRNA的DNA序列(在下文中进一步详细描述)与转录序列和指导该序列在指定细胞例如细菌细胞如大肠杆菌细胞中转录的其它调节序列组合。在一些实施方案中，包含含有编码CsrB或CsrC sRNA的多核苷酸的表达盒的表达载体进一步包含与CsrB或CsrC多核苷酸可操纵连接的启动子。在其它实施方案中，指导CsrB或CsrC多核苷酸转录的启动子和/或其它调节元件对于宿主细胞内源的，通过例如同源重组导入包含CsrB或CsrC多核苷酸的表达盒，由此外源CsrB或CsrC多核苷酸与内源启动子可操纵地连接，以及由内源启动子驱动表达。
如上所述，CsrB或CsrC多核苷酸的表达可以通过许多调节序列来控制，所述调节序列包括启动子，其可以是组成型或诱导型的；以及如果需要任选包括阻抑物序列。合适的启动子、特别是在细菌宿主细胞中的启动子实例是得自大肠杆菌lac操纵子的启动子以及从参与其它糖例如半乳糖和麦芽糖代谢的基因衍生的其它启动子。其它实例包括例如trp启动子、bla启动子噬菌体λPL和T5等启动子。另外，可以使用合成启动子，例如tac启动子(美国专利号4,551,433)。启动子的其它实例包括天蓝色链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)生麦淀粉酶基因(amyM)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)，地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)，枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因。合适的启动子也见于Ausubel and Sambrook&Russell,均如前。其它启动子包括由Jensen&Hammer,Appl.Environ.Microbiol.64:82,1998；Shimada,et al.,J.Bacteriol.186:7112,2004；和Miksch et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.69:312,2005描述的启动子。
在一些实施方案中，可以修饰影响天然CsrB或CsrC多核苷酸表达的启动子以增加表达。例如，内源CsrB或CsrC启动子可以由与天然启动子相比提供增加的表达的启动子置换。
表达载体也可以包含影响编码CsrB或CsrC sRNA的多核苷酸表达的其它序列。这种序列包括增强子序列，核糖体结合位点或其它序列如转录终止序列等。
表达编码CsrB或CsrC sRNA的核酸的载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以含有确保自主复制的任何手段。或者，载体可以是当导入宿主中时被整合进基因组中并与其已经整合进的染色体一起复制的载体。因此，表达载体可另外含有允许载体整合进宿主基因组中的元件。
本发明的表达载体优选包含一或多个选择标记，其允许容易地选择转化的宿主。例如，表达载体可包含赋予重组宿主生物体例如细菌细胞如大肠杆菌抗生素抗性(例如氨苄青霉素，卡那霉素，氯霉素或四环素抗性)的基因。
尽管可以使用任何合适的表达载体以掺入希望的序列，但容易获得的细菌表达载体包括但不限于：质粒，例如pSClOl、pBR322、pBBRlMCS-3、pUR、pET、pEX、pMRlOO、pCR4、pBAD24、p15a、pACYC、pUC如pUC18或pUC19，或者衍生自这些质粒的质粒；以及噬菌体，例如Ml 3噬菌体和λ噬菌体。然而，本领域普通技术人员可以通过常规实验容易地确定任何特定表达载体是否适合任何给定宿主细胞。例如，可以将表达载体导入宿主细胞，然后监测宿主细胞的活力和包含于载体中的序列的表达。
本发明的表达载体可以使用许多熟知方法导入宿主细胞，所述方法包括基于氯化钙的方法、电穿孔或本领域已知的任何其它方法。
宿主细胞
本发明提供了经遗传修饰的宿主细胞，其被工程化以过表达CsrB或CsrC sRNA。这种宿主细胞可包含编码异源CsrB或CsrC sRNA(包括任何非天然存在的CsrB或CsrC sRNA变体)的核酸；或者可被遗传修饰为相对于野生型宿主细胞过表达天然CsrB或CsrC sRNA。
本发明的遗传修饰的宿主菌株通常包含至少一种另外的遗传修饰，以相对于没有所述至少一种另外的遗传修饰的对照菌株例如野生型菌株或没有所述至少一种另外的遗传修饰的相同菌株的细胞，增强赖氨酸或赖氨酸衍生物的生产。“增强赖氨酸或赖氨酸衍生物的生产的另外的遗传修饰”可以是任何遗传修饰。在一些实施方案中，所述遗传修饰是导入表达参与赖氨酸或衍生物如尸胺的合成的酶的多核苷酸。在一些实施方案中，所述宿主细胞包含多种修饰以相对于野生型宿主细胞增加赖氨酸或赖氨酸衍生物例如尸胺的生产。
在一些方面，遗传修饰宿主细胞以过表达CsrB或CsrC sRNA可以与修饰宿主细胞以过表达赖氨酸脱羧酶多肽和/或一或多种赖氨酸生物合成多肽联合进行。
赖氨酸脱羧酶是指将L-赖氨酸转化为尸胺的酶。该酶分类为E.C.4.1.1.18。赖氨酸脱羧酶多肽是经充分鉴定的酶，其结构为本领域熟知(见例如Kanjee,et al.,EMBOJ.30:931-944,2011；及综述Lemmonier&Lane,Microbiology 144；751-760,1998；以及其中描述的参考文献)。赖氨酸脱羧酶的EC编号为4.1.1.18。示例的赖氨酸脱羧酶序列是来自如下的CadA同系物：克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)，WP 012968785.1；产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，YP 004592843.1；肠道沙门氏菌，WP 020936842.1；沙雷氏菌属(Serratia sp.)，WP 033635725.1；和解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultellaornithinolytica)，YP 007874766.1；以及来自如下的LdcC同系物：志贺菌属(Shigellasp.)，WP 001020968.1；柠檬酸杆菌属，WP 016151770.1；及肠道沙门氏菌，WP001021062.1。如本文所用，赖氨酸脱羧酶包括具有赖氨酸脱羧酶酶活性的天然赖氨酸脱羧酶的变体。其它赖氨酸脱羧酶在PCT/CN2014/080873和PCT/CN2015/072978中描述。
在一些实施方案中，宿主细胞可以被遗传修饰为表达影响赖氨酸生物合成的一或多种多肽。赖氨酸生物合成多肽的实例包括大肠杆菌基因SucA，Ppc，AspC，LysC，Asd，DapA，DapB，DapD，ArgD，DapE，DapF，LysA，Ddh，PntAB，CyoABE，GadAB，YbjE，GdhA，GltA，SucC，GadC，AcnB，PflB，ThrA，AceA，AceB，GltB，AceE，SdhA，MurE，SpeE，SpeG，PuuA，PuuP和YgjG，或者其它生物体的相应基因。这些基因为本领域已知(见例如Shah et al.,J.Med.Sci.2:152-157,2002；Anastassiadia,S.Recent Patents on Biotechnol.1:11-24,2007)。也见Kind,et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.91:1287-1296,2011关于参与尸胺生产的基因的综述。编码赖氨酸生物合成多肽的示例基因在下文提供。
Figure BDA0002567790220000111
Figure BDA0002567790220000121
在一些实施方案中，对宿主细胞进行遗传修饰以表达赖氨酸脱羧酶、天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氨基庚二酸脱羧酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶甲酸还原酶和天冬氨酸转氨酶。也可以将其它修饰掺入宿主细胞中。
在一些实施方案中，可以对宿主细胞进行遗传修饰以弱化或降低影响赖氨酸生物合成的一或多种多肽的表达。这种多肽的实例包括大肠杆菌基因Pck、Pgi、DeaD、CitE、MenE、PoxB、AceA、AceB、AceE、RpoC和ThrA，或来自其它生物体的相应基因。这些基因是本领域已知的(见例如Shah et al.,J.Med.Sci.2:152-157,2002；Anastassiadia,S.RecentPatents on Biotechnol.1:11-24,2007)。也参见Kind,et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.91:1287-1296,2011关于对基因进行弱化以增加尸胺生产的综述。编码其弱化增加了赖氨酸生物合成的多肽的示例基因在下文提供。
Figure BDA0002567790220000122
Figure BDA0002567790220000131
可以将编码赖氨酸脱羧酶或赖氨酸生物合成多肽的核酸与编码CsrB或CsrC sRNA的多核苷酸一起导入宿主细胞，例如在一个表达载体上编码，或同时在多个表达载体中导入。或者，可以在对宿主细胞进行遗传修饰以过表达CsrB或CsrC sRNA之前或之后，对宿主细胞进行遗传修饰以过表达赖氨酸脱羧酶或一或多种赖氨酸生物合成多肽。
在另一个实施方案中，可以通过其它技术获得过表达天然存在的CsrB或CsrCsRNA的宿主细胞，例如通过诱变细胞如大肠杆菌细胞，并筛选细胞以鉴别与诱变前的细胞相比以更高水平表达CsrB或CsrB的那些细胞。
如本文所述的CsrB或CsrC sRNA的宿主细胞是细菌宿主细胞。在典型的实施方案中，所述细菌宿主细胞是革兰氏阴性细菌宿主细胞。在本发明的一些实施方案中，所述细菌是肠细菌。在本发明的一些实施方案中，所述细菌是棒状杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、沙门氏菌属、志贺菌属、肠杆菌属(Enterobacter)、柠檬酸杆菌属、阪崎肠杆菌属(Cronobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、哈夫尼菌属、耶尔森菌属、摩根氏菌属(Morganella)、爱德华菌属(Edwardsiella)或克雷伯氏菌属分类学类别的物种。在一些实施方案中，所述宿主细胞是埃希氏菌属、哈夫尼菌属或棒状杆菌属的成员。在一些实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌或谷氨酸棒杆菌宿主细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阳性细菌宿主细胞，例如芽孢杆菌属物种，如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌；或另一种芽孢杆菌属物种，例如嗜碱芽孢杆菌(B.alcalophilus)、噬胺芽孢杆菌(B.aminovorans)、解淀粉芽孢杆菌、热溶芽孢杆菌(B.caldolyticus)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、嗜热脂肪芽孢杆菌、热葡糖昔酶芽胞杆菌(B.thermoglucosidasius)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)或韦氏芽孢杆菌(B.vulgatis)。
可以针对赖氨酸或赖氨酸衍生物如尸胺的生产增加来筛选根据本发明修饰的宿主细胞，如本文所述。
生产赖氨酸或赖氨酸衍生物的方法
经遗传修饰以过表达CsrB或CsrC sRNA的宿主细胞可用于生产赖氨酸或赖氨酸的衍生物。在一些实施方案中，所述宿主细胞生产尸胺。为生产赖氨酸或赖氨酸衍生物，可以在适合于允许CsrB或CsrC sRNA表达和用于生产赖氨酸或赖氨酸衍生物的酶表达的条件下培养如本文所述的经遗传修饰以过表达CsrB或CsrC sRNA的宿主细胞。相对于以天然水平表达CsrB或CsrC sRNA的未修饰的对应宿主细胞，根据本发明修饰的宿主细胞提供更高的赖氨酸或赖氨酸衍生物产率。
可以使用熟知技术培养宿主细胞(见例如在实施例章节提供的示例条件)。
然后可以使用已知技术分离和纯化赖氨酸或赖氨酸衍生物。然后可以将根据本发明生产的赖氨酸或赖氨酸衍生物例如尸胺用于任何已知方法中，例如用于生产聚酰胺。
在一些实施方案中，可以使用化学催化剂或使用酶和化学催化剂将赖氨酸转化为己内酰胺。.
本发明通过具体实施例得以更详细地描述。提供以下实施例只是示例性目的，并不以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地认识到各种非关键参数，可以对其进行改变或修改以产生实质上相同的结果。
实施例
提供如下实施例只是示例，并非限制请求保护的发明。
实施例1:编码CadA的质粒载体的构建
使用PCR引物cadA-F和cadA-R从大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA扩增含有编码赖氨酸脱羧酶CadA(SEQ ID NO:2)的野生型大肠杆菌cadA(SEQ ID NO:1)的质粒载体，用限制酶SacI和BamHI消化，并连接进pSTV28以产生质粒pCIB39。使用PCR引物cadA-F2和cadA-R2优化cadA基因上游的5'序列以产生pCIB40。使用SacI-F和SacI-R引物将SacI限制性位点加回pCIB40以产生pCIB41。
实施例2:表达编码CsrA或CsrD的基因的质粒载体的构建
使用PCR引物csrA-F和csrA-R从大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA扩增编码碳储存调节剂CsrA(SEQ ID NO:4)的大肠杆菌基因csrA(SEQ ID NO:3)，用限制酶SacI和BamHI消化及连接进也用SacI和BamHI消化的pCIB41质粒载体中以产生pCIB49。相似地，使用PCR引物csrD-F和csrD-R从大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA扩增编码CsrD(SEQ ID NO:6)的csrD(SEQ ID NO:5)，使用sewing PCR及引物rmvBamHI-F和rmvBamHI-R除去BamHI限制位点，用限制酶SacI和BamHI消化，并连接进也用SacI和BamHI消化的pCIB41质粒载体中以产生pCIB50。
实施例3：共表达含有来自赖氨酸生物合成途径的三种蛋白质(LysC，DapA，LysA) 的合成操纵子I的质粒载体的构建
来自大肠杆菌的三个基因lysC、dapA和lysA编码参与大肠杆菌赖氨酸生物合成途径的蛋白质：天冬氨酸激酶(LysC或AKIII，由lysC编码)，二氢吡啶二羧酸合酶(DapA或DHDPS，由dapA编码)和二氨基庚二酸脱羧酶(LysA，由lysA编码)。将这三个基因克隆到质粒载体中并在大肠杆菌中过表达这三种蛋白质LysC(SEQ ID NO:7)，DapA(SEQ ID NO:8)和LysA(SEQ ID NO:9)。使用引物lysC-F和lysC-R从大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA扩增基因lysC，使用SacI和BamHI消化扩增的片段并连接到pUC18中产生pCIB7。使用引物dapA-F和dapA-R从大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA扩增基因dapA，使用BamHI和XbaI消化扩增的片段并连接到pCIB7中产生pCIB8。使用引物lysA-F和lysA-R从大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA扩增基因lysA，使用XbaI和SalI消化扩增的片段并连接到pCIB8中产生pCIB9。使用引物lysC-F和lysA-R从pCIB9扩增所述三基因操纵子。使用SacI和SalI消化扩增的产物，并将消化的片段连接到pCIB10中产生pCIB32。
实施例4：共表达不同天冬氨酸激酶的质粒载体的构建。表达不同天冬氨酸激酶以 增加赖氨酸生产。
选择了两对突变，其使大肠杆菌LysC对赖氨酸具有增加的反馈抗性。使用引物318-F、318-R、323-F、323-R构建编码第一突变体LysC-1(M318I，G323D)(SEQ ID NO:10)的基因。将编码LysC-1的基因(M318I，G323D)克隆到pCIB32中并置换野生型大肠杆菌天冬氨酸激酶LysC以产生质粒pCIB43。以前曾提出但未证明来自链霉菌菌株的能产生聚赖氨酸的天冬氨酸激酶与大肠杆菌天冬氨酸激酶相比，对赖氨酸更具反馈抗性。如此，对来自变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)的天冬氨酸激酶基因进行密码子优化，合成并克隆进pCIB32中代替野生型lysC以便使用引物SlysC-F和SlysC-R产生质粒pCIB55。表达的所得天冬氨酸激酶蛋白被称为S-LysC(SEQ ID NO:11)。
实施例5：共表达含有来自赖氨酸生物合成途径的三种蛋白质(Asd，DapB，DapD，AspC)的合成操纵子II的质粒载体的构建
接下来，增强参与大肠杆菌的赖氨酸生物合成途径的四个另外基因asd、dapB、dapD和aspC的表达。这些基因编码以下酶：天冬氨酸半醛脱氢酶(Asd(SEQ ID NO:12)，由asd编码)，二氢吡啶甲酸还原酶(DapB或DHDPR(SEQ ID NO:13)，由dapB编码)，四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶(DapD(SEQ ID NO:14，由dapD编码)及天冬氨酸转氨酶(AspC(SEQ ID NO:15)，由aspC编码)。使用引物asd-F和asd-R从大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA扩增基因asd，使用SacI和BamHI消化扩增的片段并连接到pUC18中产生pCIB12。使用引物dapB-F和dapB-R从大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA扩增基因dapB，使用BamHI和XbaI消化扩增的片段并连接到pCIB12中产生pCIB13。使用引物dapD-F和dapD-R从大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA扩增基因dapD，使用XbaI和SalI消化扩增的片段并连接到pCIB13中产生pCIB14。类似地，使用引物aspC-F和aspc-R从大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA扩增基因aspC，使用XbaI和SalI消化扩增的片段并连接到pCIB13中产生pCIB31。
实施例6：共表达含有来自赖氨酸生物合成途径的蛋白质的合成操纵子I和II的质 粒载体的构建
使用引物lysC-rbs2-F和lysC-rbs2-R进一步优化合成操纵子I以修饰pCIB43并产生质粒pCIB378。使用引物asd-rbs2-F和asd-rbs2-R进一步优化合成操纵子II以修饰pCIB31并产生质粒pCIB380。使用引物SacI-F2、SacI-R2、ApaI-F和ApaI-R进一步修饰pCIB380以将ApaI和SacI的限制酶位点加入pCIB380中产生质粒pCIB393。将由基因lysC、dapA、lysA、asd、dapB和aspC组成的两个合成操纵子-合成操纵子I和合成操纵子II-组合进一个载体中。使用引物LAL2-SacI-F和LAL2-ApaI-R从pCIB378扩增由基因lysC、dapA和lysA组成的操纵子，用限制酶SacI和ApaI消化并连接到pCIB393中产生质粒pCIB394。
实施例7：使用大气压和室温等离子体突变大肠杆菌。
使用大气压和室温等离子体方法(ARTP)诱变大肠杆菌MG1655 K12(Zhang etal.,Appl.Microbiol.Biotechnol.98:5387-5396,2014)。ARTP II-S设备购自WuXiTMAXTREE Biotechnoogy Co.，Ltd.。将过夜培养的细胞接种到新鲜LB培养基中，生长至OD值为0.6，之后将细胞用等离子体处理50、70和90秒。洗涤三个样品中的每一个并用CGXII培养基稀释(Keilhauer et al.,J.Bacteriol.175:5595-5603,1993)。
实施例8：选择示出对S-(β-氨乙基)l-半胱氨酸抗性的突变的大肠杆菌
将每个诱变的大肠杆菌MG1655 K12样品铺板在含有0、100、200、400、600、1000或2000mg/L的S-(β-氨基乙基)l-半胱氨酸(AEC)的LB琼脂平板上。将细胞在37℃生长2天，然后计数每个平板上生长的菌落数。经过多轮ARTP诱变及在含有AEC的LB琼脂平板上筛选后，有可能获得能在含有2000mg/L AEC的平板上生长的菌落。
实施例9：使用ARTP产生的突变大肠杆菌的赖氨酸生产
测定能在2000mg/L AEC上生长的菌落的赖氨酸生产能力。将每个菌落在37℃在含有4％葡萄糖、0.1％KH2PO4、0.1％MgSO4、1.6％(NH4)2SO4、0.001％FeSO4、0.001％MnSO4、0.2％酵母提取物、0.05％L-甲硫氨酸、0.01％L-苏氨酸和0.005％L-异亮氨酸的3mL培养基中生长过夜。第二天，将每个培养物接种到含有30g/L葡萄糖和0.7％Ca(HCO3)2的100mL新鲜培养基中。将培养物在37℃生长72小时，此时测定每个培养物中的赖氨酸浓度(表1)。
表1：使用ARTP突变的大肠杆菌菌株的赖氨酸生产
Figure BDA0002567790220000161
如表1所示，选自含有AEC的LB平板的所有突变体均表现出过量生产赖氨酸的能力。具体地，突变体M3、M11和M15能够生产>2.0g/L。
实施例10：过表达合成操纵子I和II及CsrA或CsrD的突变大肠杆菌的赖氨酸生产
使用以下质粒组合之一转化大肠杆菌突变体M11：pCIB394和pSTV28，pCIB394和pCIB49，或者pCIB394和pCIB50。将每个转化的三个单菌落在37℃在含有4％葡萄糖、0.1％KH2PO4、0.1％MgSO4、1.6％(NH4)2SO4、0.001％FeSO4、0.001％MnSO4、0.2％酵母提取物、0.05％L-甲硫氨酸、0.01％L-苏氨酸、0.005％L-异亮氨酸、氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(20μg/mL)的3mL培养基中生长过夜。第二天，将每个培养物接种到含有30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO3)2、氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(20μg/mL)的100mL新鲜培养基中。将培养物在37℃生长72小时，此时确定每个培养物中的赖氨酸浓度(表2)。
表2：含有合成操纵子I和II及CsrA或CsrD的突变大肠杆菌的赖氨酸生产
Figure BDA0002567790220000171
如表2所示，CsrA或CsrD的过量产生没有导致赖氨酸生产的增加。令人惊讶地，csrA表达的增加导致赖氨酸生产减少。
实施例11：表达sRNAs CsrB或CsrC的质粒载体的构建
使用PCR引物csrB-F和csrB-R从大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA扩增编码CsrB的大肠杆菌csrB(SEQ ID NO:16)，用限制酶SacI和BamHI消化并连接到也用SacI和BamHI消化的pCIB41质粒载体中产生pCIB51。类似地，使用PCR引物csrC-F和csrC-R从大肠杆菌MG1655K12基因组DNA扩增csrC(SEQ ID NO:17)，用限制酶SacI和BamHI消化并连接到也用SacI和BamHI消化的pCIB41质粒载体中产生pCIB52。
实施例12：过表达合成操纵子I和II以及CsrB或CsrC的大肠杆菌的赖氨酸生产
用以下质粒组合之一转化大肠杆菌突变体M11：pCIB394和pSTV28，pCIB394和pCIB51，或者pCIB394和pCIB52。将每个转化的三个单菌落在37℃在含有4％葡萄糖、0.1％KH2PO4、0.1％MgSO4、1.6％(NH4)2SO4、0.001％FeSO4、0.001％MnSO4、0.2％酵母提取物、0.05％L-甲硫氨酸、0.01％L-苏氨酸、0.005％L-异亮氨酸、氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(20μg/mL)的3mL培养基中生长过夜。第二天，将每个培养物接种到含有30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO3)2、氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(20μg/mL)的100mL新鲜培养基中。将培养物在37℃生长72小时，此时确定每个培养物中的赖氨酸浓度(表3)。
表3：含有合成操纵子I和II以及CsrB或CsrC的突变大肠杆菌M11的赖氨酸生产。
Figure BDA0002567790220000172
如表3所示，与对照相比，CsrB或CsrC的过量产生导致赖氨酸生产增加(7.5或7.6g/L比6.8g/L)。
实施例13：编码赖氨酸脱羧酶和CsrB或CsrC的质粒载体的构建
使用引物csrB-F2和csrB-R2在pCIB51上扩增csrB sRNA，使用限制酶BamHI和SphI消化扩增的片段并连接到pCIB41中形成质粒pCIB104。类似地，使用引物csrC-F2和csrC-R2扩增csrC sRNA，使用限制酶BamHI和SphI消化扩增的片段并连接到pCIB41中形成质粒pCIB105。
实施例14：共同过表达编码赖氨酸脱羧酶、CsrB或CsrC的基因以及赖氨酸合成操 纵子I和II的大肠杆菌的赖氨酸生产
用以下质粒组合之一转化大肠杆菌MG1655 K12：pCIB394和pSTV28，pCIB394和pCIB41，pCIB394和pCIB104，或pCIB394和pCIB105。将来自每个转化的三个单菌落在37℃在含有4％葡萄糖、0.1％KH2PO4、0.1％MgSO4、1.6％(NH4)2SO4、0.001％FeSO4、0.001％MnSO4、0.2％酵母提取物、0.05％L-甲硫氨酸、0.01％L-苏氨酸、0.005％L-异亮氨酸、氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(20μg/mL)的3mL培养基中过夜生长。第二天，将每个培养物接种到含有30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO3)2、氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(20μg/mL)的100mL新鲜培养基中。将培养物在37℃生长72小时，此时测定每个培养物中的赖氨酸和尸胺浓度(表4)。
表4：含有赖氨酸合成操纵子I和II以及过量产生赖氨酸脱羧酶和亚胺/烯胺脱氨酶的大肠杆菌菌株的赖氨酸和尸胺生产。
Figure BDA0002567790220000181
如表4所示，CadA的过量产生导致尸胺生产。此外，sRNA CsrB或CsrC的过量产生进一步增加尸胺生产，对于CsrB和CsrC，从3.2g/L至3.8g/L。
尽管为了清楚理解的目的，已经通过示例和实施例的方式详细地描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，可以在所附权利要求的范围内进行一定改变和修改。本文引用的所有出版物、专利、登录号和专利申请均以引用方式并入本文以公开和描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。在本申请与本文提供的参考文献之间存在冲突的情况下，以本申请为准。
实施例中使用的质粒表
Figure BDA0002567790220000182
Figure BDA0002567790220000191
实施例中使用的引物序列表
Figure BDA0002567790220000192
Figure BDA0002567790220000201
示例序列
SEQ ID NO:1大肠杆菌cadA核酸序列
ATGAACGTTATTGCAATATTGAATCACATGGGGGTTTATTTTAAAGAAGAACCCATCCGTGAACTTCATCGCGCGCTTGAACGTCTGAACTTCCAGATTGTTTACCCGAACGACCGTGACGACTTATTAAAACTGATCGAAAACAATGCGCGTCTGTGCGGCGTTATTTTTGACTGGGATAAATATAATCTCGAGCTGTGCGAAGAAATTAGCAAAATGAACGAGAACCTGCCGTTGTACGCGTTCGCTAATACGTATTCCACTCTCGATGTAAGCCTGAATGACCTGCGTTTACAGATTAGCTTCTTTGAATATGCGCTGGGTGCTGCTGAAGATATTGCTAATAAGATCAAGCAGACCACTGACGAATATATCAACACTATTCTGCCTCCGCTGACTAAAGCACTGTTTAAATATGTTCGTGAAGGTAAATATACTTTCTGTACTCCTGGTCACATGGGCGGTACTGCATTCCAGAAAAGCCCGGTAGGTAGCCTGTTCTATGATTTCTTTGGTCCGAATACCATGAAATCTGATATTTCCATTTCAGTATCTGAACTGGGTTCTCTGCTGGATCACAGTGGTCCACACAAAGAAGCAGAACAGTATATCGCTCGCGTCTTTAACGCAGACCGCAGCTACATGGTGACCAACGGTACTTCCACTGCGAACAAAATTGTTGGTATGTACTCTGCTCCAGCAGGCAGCACCATTCTGATTGACCGTAACTGCCACAAATCGCTGACCCACCTGATGATGATGAGCGATGTTACGCCAATCTATTTCCGCCCGACCCGTAACGCTTACGGTATTCTTGGTGGTATCCCACAGAGTGAATTCCAGCACGCTACCATTGCTAAGCGCGTGAAAGAAACACCAAACGCAACCTGGCCGGTACATGCTGTAATTACCAACTCTACCTATGATGGTCTGCTGTACAACACCGACTTCATCAAGAAAACACTGGATGTGAAATCCATCCACTTTGACTCCGCGTGGGTGCCTTACACCAACTTCTCACCGATTTACGAAGGTAAATGCGGTATGAGCGGTGGCCGTGTAGAAGGGAAAGTGATTTACGAAACCCAGTCCACTCACAAACTGCTGGCGGCGTTCTCTCAGGCTTCCATGATCCACGTTAAAGGTGACGTAAACGAAGAAACCTTTAACGAAGCCTACATGATGCACACCACCACTTCTCCGCACTACGGTATCGTGGCGTCCACTGAAACCGCTGCGGCGATGATGAAAGGCAATGCAGGTAAGCGTCTGATCAACGGTTCTATTGAACGTGCGATCAAATTCCGTAAAGAGATCAAACGTCTGAGAACGGAATCTGATGGCTGGTTCTTTGATGTATGGCAGCCGGATCATATCGATACGACTGAATGCTGGCCGCTGCGTTCTGACAGCACCTGGCACGGCTTCAAAAACATCGATAACGAGCACATGTATCTTGACCCGATCAAAGTCACCCTGCTGACTCCGGGGATGGAAAAAGACGGCACCATGAGCGACTTTGGTATTCCGGCCAGCATCGTGGCGAAATACCTCGACGAACATGGCATCGTTGTTGAGAAAACCGGTCCGTATAACCTGCTGTTCCTGTTCAGCATCGGTATCGATAAGACCAAAGCACTGAGCCTGCTGCGTGCTCTGACTGACTTTAAACGTGCGTTCGACCTGAACCTGCGTGTGAAAAACATGCTGCCGTCTCTGTATCGTGAAGATCCTGAATTCTATGAAAACATGCGTATTCAGGAACTGGCTCAGAATATCCACAAACTGATTGTTCACCACAATCTGCCGGATCTGATGTATCGCGCATTTGAAGTGCTGCCGACGATGGTAATGACTCCGTATGCTGCATTCCAGAAAGAGCTGCACGGTATGACCGAAGAAGTTTACCTCGACGAAATGGTAGGTCGTATTAACGCCAATATGATCCTTCCGTACCCGCCGGGAGTTCCTCTGGTAATGCCGGGTGAAATGATCACCGAAGAAAGCCGTCCGGTTCTGGAGTTCCTGCAGATGCTGTGTGAAATCGGCGCTCACTATCCGGGCTTTGAAACCGATATTCACGGTGCATACCGTCAGGCTGATGGCCGCTATACCGTTAAGGTATTGAAAGAAGAAAGCAAAAAATAA
SEQ ID NO:2 CadA多肽序列
MNVIAILNHMGVYFKEEPIRELHRALERLNFQIVYPNDRDDLLKLIENNARLCGVIFDWDKYNLELCEEISKMNENLPLYAFANTYSTLDVSLNDLRLQISFFEYALGAAEDIANKIKQTTDEYINTILPPLTKALFKYVREGKYTFCTPGHMGGTAFQKSPVGSLFYDFFGPNTMKSDISISVSELGSLLDHSGPHKEAEQYIARVFNADRSYMVTNGTSTANKIVGMYSAPAGSTILIDRNCHKSLTHLMMMSDVTPIYFRPTRNAYGILGGIPQSEFQHATIAKRVKETPNATWPVHAVITNSTYDGLLYNTDFIKKTLDVKSIHFDSAWVPYTNFSPIYEGKCGMSGGRVEGKVIYETQSTHKLLAAFSQASMIHVKGDVNEETFNEAYMMHTTTSPHYGIVASTETAAAMMKGNAGKRLINGSIERAIKFRKEIKRLRTESDGWFFDVWQPDHIDTTECWPLRSDSTWHGFKNIDNEHMYLDPIKVTLLTPGMEKDGTMSDFGIPASIVAKYLDEHGIVVEKTGPYNLLFLFSIGIDKTKALSLLRALTDFKRAFDLNLRVKNMLPSLYREDPEFYENMRIQELAQNIHKLIVHHNLPDLMYRAFEVLPTMVMTPYAAFQKELHGMTEEVYLDEMVGRINANMILPYPPGVPLVMPGEMITEESRPVLEFLQMLCEIGAHYPGFETDIHGAYRQA DGRYTVKVLKEESKK
SEQ ID NO:3大肠杆菌csrA核酸序列
ATGCTGATTCTGACTCGTCGAGTTGGTGAGACCCTCATGATTGGGGATGAGGTCACCGTGACAGTTTTAGGGGTAAAGGGCAACCAGGTACGTATTGGCGTAAATGCCCCGAAGGAAGTTTCTGTTCACCGTGAAGAGATCTACCAGCGTATCCAGGCTGAAAAATCCCAGCAGTCCAGTTACTAA
SEQ ID NO:4 CsrA多肽序列
MLILTRRVGETLMIGDEVTVTVLGVKGNQVRIGVNAPKEVSVHREEIYQRIQAEKSQQSSY
SEQ ID NO:5大肠杆菌csrD核酸序列
ATGAGATTAACGACGAAATTTTCGGCCTTTGTTACGCTGCTCACCGGGTTAACAATTTTTGTGACTTTGCTGGGCTGTTCGCTAAGTTTCTACAACGCCATTCAGTATAAGTTTAGTCATCGCGTTCAGGCGGTGGCGACGGCGATTGATACCCACCTTGTGTCGAATGACTTCAGCGTATTAAGGCCACAAATTACCGAATTAATGATGTCGGCAGATATCGTTCGTGTAGACCTGCTCCATGGTGATAAACAGGTTTATACCCTGGCCAGAAATGGTAGTTATCGTCCAGTTGGCTCCAGCGATCTGTTTCGCGAACTGAGCGTTCCGTTGATAAAGCATCCGGGGATGTCGTTGCGTCTGGTTTATCAGGACCCGATGGGCAACTATTTCCATTCGTTGATGACCACCGCGCCGCTCACGGGGGCGATTGGCTTTATCATTGTTATGCTCTTCCTGGCGGTACGCTGGTTACAACGGCAACTTGCCGGGCAAGAATTGCTGGAAACCCGGGCTACTCGTATCTTAAACGGTGAGCGTGGCTCTAATGTGTTGGGAACCATCTATGAATGGCCGCCCAGAACCAGCAGTGCGCTGGATACGCTGCTTCGTGAAATTCAGAACGCACGCGAACAACACAGCCGTCTTGATACGCTGATCCGCTCTTATGCCGCCCAGGACGTGAAAACCGGCCTCAATAACCGACTCTTTTTCGATAATCAGTTAGCAACGTTACTGGAAGATCAGGAGAAAGTAGGTACCCACGGGATCGTGATGATGATTCGTCTGCCGGATTTCAATATGTTGAGCGATACCTGGGGGCACAGCCAGGTTGAAGAACAGTTCTTCACTCTGACGAATCTGCTGTCGACATTTATGATGCGCTACCCTGGCGCACTGCTGGCGCGTTACCACCGCAGTGATTTTGCTGCGCTGTTACCGCACCGGACGTTAAAAGAGGCAGAGAGCATCGCCGGTCAGTTAATCAAAGCCGTTGATACCTTGCCGAACAATAAAATGCTCGATCGCGACGATATGATCCACATTGGTATCTGCGCCTGGCGTAGTGGTCAGGATACCGAGCAGGTAATGGAACATGCAGAGTCTGCCACGCGTAATGCGGGATTGCAGGGCGGCAATAGCTGGGCTATTTACGATGACTCGTTGCCTGAAAAAGGACGCGGTAATGTTCGCTGGCGTACGCTTATCGAGCAAATGCTCAGTCGCGGCGGCCCGCGCCTTTATCAAAAACCGGCGGTTACTCGCGAAGGTCAGGTTCATCATCGCGAACTCATGTGCCGCATCTTCGATGGTAATGAAGAGGTTAGCTCGGCGGAGTATATGCCGATGGTCTTGCAGTTTGGCTTATCGGAAGAGTATGACCGTCTGCAAATCAGCCGTCTTATTCCACTATTGCGTTACTGGCCAGAGGAAAATCTGGCGATTCAGGTTACCGTTGAGTCGCTGATTCGCCCGCGTTTTCAGCGTTGGCTGCGCGATACGTTAATGCAATGTGAAAAATCACAACGAAAACGCATAATTATTGAACTTGCAGAGGCCGATGTAGGTCAACATATCAGTCGTTTACAACCTGTTATTCGTTTAGTGAATGCTTTAGGGGTACGGGTAGCCGTCAACCAGGCTGGTTTGACGCTGGTAAGTACCAGTTGGATCAAAGAACTTAATGTTGAGTTACTCAAGCTCCATCCGGGGCTGGTCAGAAACATTGAGAAGCGAACGGAGAACCAGCTGCTGGTTCAAAGCCTGGTGGAAGCCTGCTCCGGGACCAGCACCCAGGTTTACGCCACCGGCGTGCGTTCGCGAAGCGAGTGGCAGACCCTGATTCAGCGCGGTGTTACAGGCGGGCAAGGGGATTTTTTCGCGTCCTCACAGCCACTTGATACTAACGTGAAAAAATATTCACAAAGATACTCGGTTTAA
SEQ ID NO:6 CsrD多肽序列
MRLTTKFSAFVTLLTGLTIFVTLLGCSLSFYNAIQYKFSHRVQAVATAIDTHLVSNDFSVLRPQITELMMSADIVRVDLLHGDKQVYTLARNGSYRPVGSSDLFRELSVPLIKHPGMSLRLVYQDPMGNYFHSLMTTAPLTGAIGFIIVMLFLAVRWLQRQLAGQELLETRATRILNGERGSNVLGTIYEWPPRTSSALDTLLREIQNAREQHSRLDTLIRSYAAQDVKTGLNNRLFFDNQLATLLEDQEKVGTHGIVMMIRLPDFNMLSDTWGHSQVEEQFFTLTNLLSTFMMRYPGALLARYHRSDFAALLPHRTLKEAESIAGQLIKAVDTLPNNKMLDRDDMIHIGICAWRSGQDTEQVMEHAESATRNAGLQGGNSWAIYDDSLPEKGRGNVRWRTLIEQMLSRGGPRLYQKPAVTREGQVHHRELMCRIFDGNEEVSSAEYMPMVLQFGLSEEYDRLQISRLIPLLRYWPEENLAIQVTVESLIRPRFQRWLRDTLMQCEKSQRKRIIIELAEADVGQHISRLQPVIRLVNALGVRVAVNQAGLTLVSTSWIKELNVELLKLHPGLVRNIEKRTENQLLVQSLVEACSGTSTQVYATGVRSRSEWQTLIQRGVTGGQGDFFASSQPLDTNVKKYSQRYSV
SEQ ID NO:7 LysC多肽序列
MSEIVVSKFGGTSVADFDAMNRSADIVLSDANVRLVVLSASAGITNLLVALAEGLEPGERFEKLDAIRNIQFAILERLRYPNVIREEIERLLENITVLAEAAALATSPALTDELVSHGELMSTLLFVEILRERDVQAQWFDVRKVMRTNDRFGRAEPDIAALAELAALQLLPRLNEGLVITQGFIGSENKGRTTTLGRGGSDYTAALLAEALHASRVDIWTDVPGIYTTDPRVVSAAKRIDEIAFAEAAEMATFGAKVLHPATLLPAVRSDIPVFVGSSKDPRAGGTLVCNKTENPPLFRALALRRNQTLLTLHSLNMLHSRGFLAEVFGILARHNISVDLITTSEVSVALTLDTTGSTSTGDTLLTQSLLMELSALCRVEVEEGLALVALIGNDLSKACGVGKEVFGVLEPFNIRMICYGASSHNLCFLVPGEDAEQVVQKLHSNLFE
SEQ ID NO:8 DapA多肽序列
MFTGSIVAIVTPMDEKGNVCRASLKKLIDYHVASGTSAIVSVGTTGESATLNHDEHADVVMMTLDLADGRIPVIAGTGANATAEAISLTQRFNDSGIVGCLTVTPYYNRPSQEGLYQHFKAIAEHTDLPQILYNVPSRTGCDLLPETVGRLAKVKNIIGIKEATGNLTRVNQIKELVSDDFVLLSGDDASALDFMQLGGHGVISVTANVAARDMAQMCKLAAEGHFAEARVINQRLMPLHNKLFVEPNPIPVKWACKELGLVATDTLRLPMTPITDSGRETVRAALKHAGLL
SEQ ID NO:9 LysA多肽序列
MPHSLFSTDTDLTAENLLRLPAEFGCPVWVYDAQIIRRQIAALKQFDVVRFAQKACSNIHILRLMREQGVKVDSVSLGEIERALAAGYNPQTHPDDIVFTADVIDQATLERVSELQIPVNAGSVDMLDQLGQVSPGHRVWLRVNPGFGHGHSQKTNTGGENSKHGIWYTDLPAALDVIQRHHLQLVGIHMHIGSGVDYAHLEQVCGAMVRQVIEFGQDLQAISAGGGLSVPYQQGEEAVDTEHYYGLWNAAREQIARHLGHPVKLEIEPGRFLVAQSGVLITQVRSVKQMGSRHFVLVDAGFNDLMRPAMYGSYHHISALAADGRSLEHAPTVETVVAGPLCESGDVFTQQEGGNVETRALPEVKAGDYLVLHDTGAYGASMSSNYNSRPLLPEVLFDNGQARLIRRRQTIEELLALELL
SEQ ID NO:10 LysC-1M318I,G323D多肽序列
MSEIVVSKFGGTSVADFDAMNRSADIVLSDANVRLVVLSASAGITNLLVALAEGLEPGERFEKLDAIRNIQFAILERLRYPNVIREEIERLLENITVLAEAAALATSPALTDELVSHGELMSTLLFVEILRERDVQAQWFDVRKVMRTNDRFGRAEPDIAALAELAALQLLPRLNEGLVITQGFIGSENKGRTTTLGRGGSDYTAALLAEALHASRVDIWTDVPGIYTTDPRVVSAAKRIDEIAFAEAAEMATFGAKVLHPATLLPAVRSDIPVFVGSSKDPRAGGTLVCNKTENPPLFRALALRRNQTLLTLHSLNILHSRDFLAEVFGILARHNISVDLITTSEVSVALTLDTTGSTSTGDTLLTQSLLMELSALCRVEVEEGLALVALIGNDLSKACGVGKEVFGVLEPFNIRMICYGASSHNLCFLVPGEDAEQVVQKLHSNLFE
SEQ ID NO:11 S-LysC多肽序列
MGLVVQKYGGSSVADAEGIKRVAKRIVEAKKNGNQVVAVVSAMGDTTDELIDLAEQVSPIPAGRELDMLLTAGERISMALLAMAIKNLGHEAQSFTGSQAGVITDSVHNKARIIDVTPGRIRTSVDEGNVAIVAGFQGVSQDSKDITTLGRGGSDTTAVALAAALDADVCEIYTDVDGVFTADPRVVPKAKKIDWISFEDMLELAASGSKVLLHRCVEYARRYNIPIHVRSSFSGLQGTWVSSEPIKQGEKHVEQALISGVAHDTSEAKVTVVGVPDKPGEAAAIFRAIADAQVNIDMVVQNVSAASTGLTDISFTLPKSEGRKAIDALEKNRPGIGFDSLRYDDQIGKISLVGAGMKSNPGVTADFFTALSDAGVNIELISTSEIRISVVTRKDDVNEAVRAVHTAFGLDSDSDEAVVYGGTGR
SEQ ID NO:12 Asd多肽序列
MKNVGFIGWRGMVGSVLMQRMVEERDFDAIRPVFFSTSQLGQAAPSFGGTTGTLQDAFDLEALKALDIIVTCQGGDYTNEIYPKLRESGWQGYWIDAASSLRMKDDAIIILDPVNQDVITDGLNNGIRTFVGGNCTVSLMLMSLGGLFANDLVDWVSVATYQAASGGGARHMRELLTQMGHLYGHVADELATPSSAILDIERKVTTLTRSGELPVDNFGVPLAGSLIPWIDKQLDNGQSREEWKGQAETNKILNTSSVIPVDGLCVRVGALRCHSQAFTIKLKKDVSIPTVEELLAAHNPWAKVVPNDREITMRELTPAAVTGTLTTPVGRLRKLNMGPEFLSAFTVGDQ
SEQ ID NO:13 DapB多肽序列
MHDANIRVAIAGAGGRMGRQLIQAALALEGVQLGAALEREGSSLLGSDAGELAGAGKTGVTVQSSLDAVKDDFDVFIDFTRPEGTLNHLAFCRQHGKGMVIGTTGFDEAGKQAIRDAAADIAIVFAANFSVGVNVMLKLLEKAAKVMGDYTDIEIIEAHHRHKVDAPSGTALAMGEAIAHALDKDLKDCAVYSREGHTGERVPGTIGFATVRAGDIVGEHTAMFADIGERLEITHKASSRMTFANGAVRSALWLSGKESGLFDMRDVLDLNNL
SEQ ID NO:14 DapD多肽序列
MQQLQNIIETAFERRAEITPANADTVTREAVNQVIALLDSGALRVAEKIDGQWVTHQWLKKAVLLSFRINDNQVIEGAESRYFDKVPMKFADYDEARFQKEGFRVVPPAAVRQGAFIARNTVLMPSYVNIGAYVDEGTMVDTWATVGSCAQIGKNVHLSGGVGIGGVLEPLQANPTIIEDNCFIGARSEVVEGVIVEEGSVISMGVYIGQSTRIYDRETGEIHYGRVPAGSVVVSGNLPSKDGKYSLYCAVIVKKVDAKTRGKVGINELLRTID
SEQ ID NO:15 AspC多肽序列
MFENITAAPADPILGLADLFRADERPGKINLGIGVYKDETGKTPVLTSVKKAEQYLLENETTKNYLGIDGIPEFGRCTQELLFGKGSALINDKRARTAQTPGGTGALRVAADFLAKNTSVKRVWVSNPSWPNHKSVFNSAGLEVREYAYYDAENHTLDFDALINSLNEAQAGDVVLFHGCCHNPTGIDPTLEQWQTLAQLSVEKGWLPLFDFAYQGFARGLEEDAEGLRAFAAMHKELIVASSYSKNFGLYNERVGACTLVAADSETVDRAFSQMKAAIRANYSNPPAHGASVVATILSNDALRAIWEQELTDMRQRIQRMRQLFVNTLQEKGANRDFSFIIKQNGMFSFSGLTKEQVLRLREEFGVYAVASGRVNVAGMTPDNMAPLCEAIVAVLSEQ ID NO:16大肠杆菌csrB核酸序列
GAGTCAGACAACGAAGTGAACATCAGGATGATGACACTTCTGCAGGACACACCAGGATGGTGTTTCAGGGAAAGGCTTCTGGATGAAGCGAAGAGGATGACGCAGGACGCGTTAAAGGACACCTCCAGGATGGAGAATGAGAACCGGTCAGGATGATTCGGTGGGTCAGGAAGGCCAGGGACACTTCAGGATGAAGTATCACATCGGGGTGGTGTGAGCAGGAAGCAATAGTTCAGGATGAACGATTGGCCGCAAGGCCAGAGGAAAAGTTGTCAAGGATGAGCAGGGAGCAACAAAAGTAGCTGGAATGCTGCGAAACGAACCGGGAGCGCTGTGAATACAGTGCTCCCTTTTTTTATT
SEQ ID NO:17大肠杆菌csrC核酸序列
ATAGAGCGAGGACGCTAACAGGAACAATGACTCAGGATGAGGGTCAGGAGCGCCAGGAGGCGAAGACAGAGGATTGTCAGGAAGACAAACGTCCGGAGACGTAATTAAACGGAAATGGAATCAACACGGATTGTTCCGGCTAAAGGAAAAACAGGGTGTGTTGGCGGCCTGCAAGGATTGTAAGACCCGTTAAGGGTTATGAGTCAGGAAAAAAGGCGACAGAGTAATCTGTCGCCTTTTTTCTT
SEQ ID NO:18福氏志贺菌CsrB核酸序列(CP024470.1)
GAGTCAGACAACGAAGTGAACATCAGGATGATGACACTTCTGCAGGACACACCAGGATGGTGTTTCAGGGAAAGGCTTCTGGATGAAGCGAAGAGGATGACGCAGGACGCGTTAAAGGACACCTCCAGGATGGAGAATGAGAACCGGTCAGGATGATTCGGTGGGTCAGGAAGGCCAGGGACACTTCAGGATGAAGTATCACATCGGGGTGGTGTGAGCAGGAAGCAATAGTTCAGGATGAACGATTGGCCGCAAGGCCAGAGGAAAAGTTGTCAAGGATGAGCAGGGAGCAACAAAAGTAGCTGGAATGCTGCGAAACGAACCGGGAGCACTGTGAATACAGTGCTCCCTTTTTTTATT
SEQ ID NO:19普通小麦(Triticum aestivum)CsrB核酸序列(AK447219.1)GAGTCAGACAACGAAGTGAACATCAGGATGATGACACTTCTGCAGGAAACACCAGGATGGTGTTTCAGGGAAAGGCTTCTGGATGAAGCGAAGAGGATGACGCAGGACGCGTTAAAGGACACCTCCAGGATGGAGAATGAGAACCGGTCAGGATGATTCGGTGGGTCAGGAAGGCCAGGGACACTTCAGGATGAAGTATCACATCGGGGTGGTGTGAGCAGGAAGCAATAGTTCAGGATGAACGATTGGCCGCAAGGCCAGAGGAAAAGTTGTCAAGGATGAGCAGGGAGCAACAAAAGTAGCTGGAATGCTGCGAAACGAACCGGGAGCGCTGTGAATACAGTGCTCCCTTTTTTTATT
SEQ ID NO:20宋氏志贺菌CsrB核酸序列(CP023645.1)
GAGTCAGACAACGAAGTGAACATCAGGATGATGACACTTCTGCAGGACACACCAGGATGGTGTTTCAGGGAAAGGCTTCTGGATGAAGCGAAGAGGATGACGCAGGACGCGTTAAAGGACACCTCCAGGATGGAGAATGAGAACCGGTCAGGATGATTCGGTGGGTCAGGAAGGCCAGGGACACTTCAGGATGAAGTATCACATCGGGGTGGTGTGAGCAGGAAGCAATAGTTCAGGATGAACGATTGGCCGCAAGGCCAGAGGAAAAGTTGTCAAGGATGAGCAGGGAGCAACAAAAGTAGCTGGAATGCTGCGAAACGAACCGGGAGCACTGTGAATACAGTGCTCCCTTTTTTTATT
SEQ ID NO:21柠檬酸杆菌属CsrB核酸序列(LT556085.1)
GAGTCGCACAACGAAGTGAACATCAGGATGATGACACTTCAGCAGGACACACCAGGACGGTGTTACAGGGAAAGGCTTCAGGATGAAGTGAAGAGGATAACGCGGGAATGCGTTAAAGGACACCTCCAGGAAGGAGAACGAGAGCCGGTCAGGATAGTCGGTGGGTCAGGATGGCCAGGATGCTTCAGGATGAAGTAATCACATCGGGGTGGTGTGAGCAGGATGCAAAATGTTCAGGATGAACAACAGGTCGCAAGACCAGAGGAAAAGTTGTCACGGATGAGCAGGGAGCACAAAAAGTAGCTGGAATGCTGCGAAACGAACCGGGAGCACTGTTTTTACAGTGCTCCCTTTTTTT
SEQ ID NO:22肠道沙门氏菌亚种CsrB核酸序列(CP015574.1)
GAGTCGTACAACGAAGCGAACGTCAGGATGATGACGCTTCAGCAGGACACGCCAGGATGGTGTTACAAGGAAAGGCTTCAGGATGAAGCAAAGTGGAAAGCGCAGGATGCGTTAAAGGACACCTCCAGGACGGAGAACGAGAGCCGATCAGGATGTTCGGCGGGTCTGGATGACCAGGGACGCTTCAGGATGAAGCTATCACATCGGGCGATGTGCGCAGGATGCAAACGTTCAGGATGAACAGGCCGTAAGGTCACAGGAAAAGTTGTCACGGATGAGCAGGGAGCACGAAAAGTAGCTGGAATGCTGCGAAACGAACCGGGAGCACTGTTTATACAGTGCTCCCTTTTTTT
SEQ ID NO:23宋氏志贺菌CsrC核酸序列(CP023645.1)
ATAGAGCGAGGACGCTAACAGGAACAATGACTCAGGATGAGGGTCAGGAGCGCCAGGAGGCGAAGACAGAGGATTGTCAGGAAGACAAACGTCCGGAGACGTAATTAAACGGAAATGGAATCAACACGGATTGTTCCGGCTAAAGGAAAAACAGGGTGTGTTGGCGGCCTGCAAGGATTGTAAGACCCGTTAAGGGTTATGAGTCAGGAAAAAAGGCGACAGAGTAATCTGTCGCCTTTTTTCTT
SEQ ID NO:24福氏志贺菌CsrC核酸序列(CP024470.1)
ATAGAGCGAGGACGCTAACAGGAACAATGACTCAGGATGAGGGTCAGGAGCGCCAGGAGGCGAAGACAGAGGATTGTCAGGAAGACAAACGTCCGGAGACGTAATTAAACGGAAATGGAATCAACACGGATTGTTCCGGCTAATGGAAAAACAGGGTGTGTTGGCGGCCTGCAAGGATTGTAAGACCCGTTAAGGGTTATGAGTCAGGAAAAAAGGCGACAGAGTAATCTGTCGCCTTTTTTCTT
SEQ ID NO:25韦氏柠檬酸杆菌CsrC核酸序列(CP023504.1)
AGCGAGGGAGCTAACAGGATAAACGACTCAGGATGAGGGTCAGGAGCGCCAGGAGGCGAAGACGCAGGATTGTCAGGAAGACAAACGTCCGGAGACGTTAGTAAAAGGAAATGGAAACAACACGGAATGTTTCTGGCTAAGGGAAAAACAGGGTGTGTTGATAGCCGACAGGGATTGTAGGGCCCGTTAAGGGTTGAGAGTCAGGAAAAAAGGCGACAGATTACTCTGTCGCCTTTTTTCTT
SEQ ID NO:26肠道沙门氏菌亚种CsrC核酸序列(CP018661.1)
AGCGAGGACGCTAACAGGATCAACGACTCAGGATGAGGGTCAGGAGCGCCAGGAGGCGAAGACACAGGATTGTCAGGAAGACAAACGTCCGGAGACGTTAGTAAAAGGAAATGGAAACAACATGGAATGTTCCAGGCTAAGGGAAAAACAGGGCGTGTTGATAGCCAACAGGGATGGTGGAACCCGTTAAGGGTCGTGAGTCAAGAAAAAAGGCGGCAGATTACTCTGTCGCCTTTTTTCTT
序列表
<110> 上海凯赛生物技术股份有限公司
CIBT美国公司
<120> 调节CSR系统以生产赖氨酸和赖氨酸衍生产物
<130> IBPA17007
<160> 76
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2148
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60
gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120
gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180
aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240
gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300
agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360
actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420
cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480
agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540
tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600
gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660
tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac cattctgatt 720
gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780
tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840
cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900
gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960
acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020
ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080
gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140
aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200
ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca 1260
ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320
cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat 1380
acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440
aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500
gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560
catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620
atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc 1680
gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740
tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800
aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860
tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920
gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980
ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040
gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100
gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148
<210> 2
<211> 715
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 2
Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu
1 5 10 15
Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln
20 25 30
Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn
35 40 45
Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu
50 55 60
Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr
65 70 75 80
Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp
100 105 110
Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile
115 120 125
Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys
130 135 140
Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys
145 150 155 160
Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met
165 170 175
Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp
180 185 190
His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe
195 200 205
Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn
210 215 220
Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile
225 230 235 240
Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp
245 250 255
Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu
260 265 270
Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg
275 280 285
Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys
305 310 315 320
Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr
325 330 335
Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly
340 345 350
Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu
355 360 365
Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val
370 375 380
Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser
385 390 395 400
Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met
405 410 415
Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala
420 425 430
Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly
435 440 445
Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys
450 455 460
Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp
465 470 475 480
Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro
485 490 495
Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser
500 505 510
Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr
515 520 525
Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr
530 535 540
Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe
545 550 555 560
Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu
565 570 575
Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn
580 585 590
Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg
595 600 605
Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe
610 615 620
Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met
625 630 635 640
Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val
645 650 655
Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val
660 665 670
Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly
675 680 685
Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr
690 695 700
Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys
705 710 715
<210> 3
<211> 186
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 3
atgctgattc tgactcgtcg agttggtgag accctcatga ttggggatga ggtcaccgtg 60
acagttttag gggtaaaggg caaccaggta cgtattggcg taaatgcccc gaaggaagtt 120
tctgttcacc gtgaagagat ctaccagcgt atccaggctg aaaaatccca gcagtccagt 180
tactaa 186
<210> 4
<211> 61
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 4
Met Leu Ile Leu Thr Arg Arg Val Gly Glu Thr Leu Met Ile Gly Asp
1 5 10 15
Glu Val Thr Val Thr Val Leu Gly Val Lys Gly Asn Gln Val Arg Ile
20 25 30
Gly Val Asn Ala Pro Lys Glu Val Ser Val His Arg Glu Glu Ile Tyr
35 40 45
Gln Arg Ile Gln Ala Glu Lys Ser Gln Gln Ser Ser Tyr
50 55 60
<210> 5
<211> 1941
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 5
atgagattaa cgacgaaatt ttcggccttt gttacgctgc tcaccgggtt aacaattttt 60
gtgactttgc tgggctgttc gctaagtttc tacaacgcca ttcagtataa gtttagtcat 120
cgcgttcagg cggtggcgac ggcgattgat acccaccttg tgtcgaatga cttcagcgta 180
ttaaggccac aaattaccga attaatgatg tcggcagata tcgttcgtgt agacctgctc 240
catggtgata aacaggttta taccctggcc agaaatggta gttatcgtcc agttggctcc 300
agcgatctgt ttcgcgaact gagcgttccg ttgataaagc atccggggat gtcgttgcgt 360
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acgggggcga ttggctttat cattgttatg ctcttcctgg cggtacgctg gttacaacgg 480
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cttaatgttg agttactcaa gctccatccg gggctggtca gaaacattga gaagcgaacg 1740
gagaaccagc tgctggttca aagcctggtg gaagcctgct ccgggaccag cacccaggtt 1800
tacgccaccg gcgtgcgttc gcgaagcgag tggcagaccc tgattcagcg cggtgttaca 1860
ggcgggcaag gggatttttt cgcgtcctca cagccacttg atactaacgt gaaaaaatat 1920
tcacaaagat actcggttta a 1941
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<213> Escherichia coli
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Leu Thr Ile Phe Val Thr Leu Leu Gly Cys Ser Leu Ser Phe Tyr Asn
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<213> Escherichia coli
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Glu
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<220>
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<213> Escherichia coli
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Leu
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<211> 274
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<213> Escherichia coli
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Met Gln Gln Leu Gln Asn Ile Ile Glu Thr Ala Phe Glu Arg Arg Ala
1 5 10 15
Glu Ile Thr Pro Ala Asn Ala Asp Thr Val Thr Arg Glu Ala Val Asn
20 25 30
Gln Val Ile Ala Leu Leu Asp Ser Gly Ala Leu Arg Val Ala Glu Lys
35 40 45
Ile Asp Gly Gln Trp Val Thr His Gln Trp Leu Lys Lys Ala Val Leu
50 55 60
Leu Ser Phe Arg Ile Asn Asp Asn Gln Val Ile Glu Gly Ala Glu Ser
65 70 75 80
Arg Tyr Phe Asp Lys Val Pro Met Lys Phe Ala Asp Tyr Asp Glu Ala
85 90 95
Arg Phe Gln Lys Glu Gly Phe Arg Val Val Pro Pro Ala Ala Val Arg
100 105 110
Gln Gly Ala Phe Ile Ala Arg Asn Thr Val Leu Met Pro Ser Tyr Val
115 120 125
Asn Ile Gly Ala Tyr Val Asp Glu Gly Thr Met Val Asp Thr Trp Ala
130 135 140
Thr Val Gly Ser Cys Ala Gln Ile Gly Lys Asn Val His Leu Ser Gly
145 150 155 160
Gly Val Gly Ile Gly Gly Val Leu Glu Pro Leu Gln Ala Asn Pro Thr
165 170 175
Ile Ile Glu Asp Asn Cys Phe Ile Gly Ala Arg Ser Glu Val Val Glu
180 185 190
Gly Val Ile Val Glu Glu Gly Ser Val Ile Ser Met Gly Val Tyr Ile
195 200 205
Gly Gln Ser Thr Arg Ile Tyr Asp Arg Glu Thr Gly Glu Ile His Tyr
210 215 220
Gly Arg Val Pro Ala Gly Ser Val Val Val Ser Gly Asn Leu Pro Ser
225 230 235 240
Lys Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Tyr Cys Ala Val Ile Val Lys Lys Val
245 250 255
Asp Ala Lys Thr Arg Gly Lys Val Gly Ile Asn Glu Leu Leu Arg Thr
260 265 270
Ile Asp
<210> 15
<211> 396
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 15
Met Phe Glu Asn Ile Thr Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ile Leu Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Glu Arg Pro Gly Lys Ile Asn Leu Gly
20 25 30
Ile Gly Val Tyr Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Val Leu Thr Ser
35 40 45
Val Lys Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Leu Glu Asn Glu Thr Thr Lys Asn
50 55 60
Tyr Leu Gly Ile Asp Gly Ile Pro Glu Phe Gly Arg Cys Thr Gln Glu
65 70 75 80
Leu Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ala Leu Ile Asn Asp Lys Arg Ala Arg
85 90 95
Thr Ala Gln Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala Leu Arg Val Ala Ala Asp
100 105 110
Phe Leu Ala Lys Asn Thr Ser Val Lys Arg Val Trp Val Ser Asn Pro
115 120 125
Ser Trp Pro Asn His Lys Ser Val Phe Asn Ser Ala Gly Leu Glu Val
130 135 140
Arg Glu Tyr Ala Tyr Tyr Asp Ala Glu Asn His Thr Leu Asp Phe Asp
145 150 155 160
Ala Leu Ile Asn Ser Leu Asn Glu Ala Gln Ala Gly Asp Val Val Leu
165 170 175
Phe His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ile Asp Pro Thr Leu Glu
180 185 190
Gln Trp Gln Thr Leu Ala Gln Leu Ser Val Glu Lys Gly Trp Leu Pro
195 200 205
Leu Phe Asp Phe Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Arg Gly Leu Glu Glu Asp
210 215 220
Ala Glu Gly Leu Arg Ala Phe Ala Ala Met His Lys Glu Leu Ile Val
225 230 235 240
Ala Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu Arg Val Gly
245 250 255
Ala Cys Thr Leu Val Ala Ala Asp Ser Glu Thr Val Asp Arg Ala Phe
260 265 270
Ser Gln Met Lys Ala Ala Ile Arg Ala Asn Tyr Ser Asn Pro Pro Ala
275 280 285
His Gly Ala Ser Val Val Ala Thr Ile Leu Ser Asn Asp Ala Leu Arg
290 295 300
Ala Ile Trp Glu Gln Glu Leu Thr Asp Met Arg Gln Arg Ile Gln Arg
305 310 315 320
Met Arg Gln Leu Phe Val Asn Thr Leu Gln Glu Lys Gly Ala Asn Arg
325 330 335
Asp Phe Ser Phe Ile Ile Lys Gln Asn Gly Met Phe Ser Phe Ser Gly
340 345 350
Leu Thr Lys Glu Gln Val Leu Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val Tyr
355 360 365
Ala Val Ala Ser Gly Arg Val Asn Val Ala Gly Met Thr Pro Asp Asn
370 375 380
Met Ala Pro Leu Cys Glu Ala Ile Val Ala Val Leu
385 390 395
<210> 16
<211> 360
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 16
gagtcagaca acgaagtgaa catcaggatg atgacacttc tgcaggacac accaggatgg 60
tgtttcaggg aaaggcttct ggatgaagcg aagaggatga cgcaggacgc gttaaaggac 120
acctccagga tggagaatga gaaccggtca ggatgattcg gtgggtcagg aaggccaggg 180
acacttcagg atgaagtatc acatcggggt ggtgtgagca ggaagcaata gttcaggatg 240
aacgattggc cgcaaggcca gaggaaaagt tgtcaaggat gagcagggag caacaaaagt 300
agctggaatg ctgcgaaacg aaccgggagc gctgtgaata cagtgctccc tttttttatt 360
<210> 17
<211> 245
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 17
atagagcgag gacgctaaca ggaacaatga ctcaggatga gggtcaggag cgccaggagg 60
cgaagacaga ggattgtcag gaagacaaac gtccggagac gtaattaaac ggaaatggaa 120
tcaacacgga ttgttccggc taaaggaaaa acagggtgtg ttggcggcct gcaaggattg 180
taagacccgt taagggttat gagtcaggaa aaaaggcgac agagtaatct gtcgcctttt 240
ttctt 245
<210> 18
<211> 360
<212> DNA
<213> Shigella flexneri
<400> 18
gagtcagaca acgaagtgaa catcaggatg atgacacttc tgcaggacac accaggatgg 60
tgtttcaggg aaaggcttct ggatgaagcg aagaggatga cgcaggacgc gttaaaggac 120
acctccagga tggagaatga gaaccggtca ggatgattcg gtgggtcagg aaggccaggg 180
acacttcagg atgaagtatc acatcggggt ggtgtgagca ggaagcaata gttcaggatg 240
aacgattggc cgcaaggcca gaggaaaagt tgtcaaggat gagcagggag caacaaaagt 300
agctggaatg ctgcgaaacg aaccgggagc actgtgaata cagtgctccc tttttttatt 360
<210> 19
<211> 360
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<400> 19
gagtcagaca acgaagtgaa catcaggatg atgacacttc tgcaggaaac accaggatgg 60
tgtttcaggg aaaggcttct ggatgaagcg aagaggatga cgcaggacgc gttaaaggac 120
acctccagga tggagaatga gaaccggtca ggatgattcg gtgggtcagg aaggccaggg 180
acacttcagg atgaagtatc acatcggggt ggtgtgagca ggaagcaata gttcaggatg 240
aacgattggc cgcaaggcca gaggaaaagt tgtcaaggat gagcagggag caacaaaagt 300
agctggaatg ctgcgaaacg aaccgggagc gctgtgaata cagtgctccc tttttttatt 360
<210> 20
<211> 360
<212> DNA
<213> Shigella sonnei
<400> 20
gagtcagaca acgaagtgaa catcaggatg atgacacttc tgcaggacac accaggatgg 60
tgtttcaggg aaaggcttct ggatgaagcg aagaggatga cgcaggacgc gttaaaggac 120
acctccagga tggagaatga gaaccggtca ggatgattcg gtgggtcagg aaggccaggg 180
acacttcagg atgaagtatc acatcggggt ggtgtgagca ggaagcaata gttcaggatg 240
aacgattggc cgcaaggcca gaggaaaagt tgtcaaggat gagcagggag caacaaaagt 300
agctggaatg ctgcgaaacg aaccgggagc actgtgaata cagtgctccc tttttttatt 360
<210> 21
<211> 358
<212> DNA
<213> Citrobacter sp.
<400> 21
gagtcgcaca acgaagtgaa catcaggatg atgacacttc agcaggacac accaggacgg 60
tgttacaggg aaaggcttca ggatgaagtg aagaggataa cgcgggaatg cgttaaagga 120
cacctccagg aaggagaacg agagccggtc aggatagtcg gtgggtcagg atggccagga 180
tgcttcagga tgaagtaatc acatcggggt ggtgtgagca ggatgcaaaa tgttcaggat 240
gaacaacagg tcgcaagacc agaggaaaag ttgtcacgga tgagcaggga gcacaaaaag 300
tagctggaat gctgcgaaac gaaccgggag cactgttttt acagtgctcc cttttttt 358
<210> 22
<211> 353
<212> DNA
<213> Salmonella enterica
<400> 22
gagtcgtaca acgaagcgaa cgtcaggatg atgacgcttc agcaggacac gccaggatgg 60
tgttacaagg aaaggcttca ggatgaagca aagtggaaag cgcaggatgc gttaaaggac 120
acctccagga cggagaacga gagccgatca ggatgttcgg cgggtctgga tgaccaggga 180
cgcttcagga tgaagctatc acatcgggcg atgtgcgcag gatgcaaacg ttcaggatga 240
acaggccgta aggtcacagg aaaagttgtc acggatgagc agggagcacg aaaagtagct 300
ggaatgctgc gaaacgaacc gggagcactg tttatacagt gctccctttt ttt 353
<210> 23
<211> 245
<212> DNA
<213> Shigella sonnei
<400> 23
atagagcgag gacgctaaca ggaacaatga ctcaggatga gggtcaggag cgccaggagg 60
cgaagacaga ggattgtcag gaagacaaac gtccggagac gtaattaaac ggaaatggaa 120
tcaacacgga ttgttccggc taaaggaaaa acagggtgtg ttggcggcct gcaaggattg 180
taagacccgt taagggttat gagtcaggaa aaaaggcgac agagtaatct gtcgcctttt 240
ttctt 245
<210> 24
<211> 245
<212> DNA
<213> Shigella flexneri
<400> 24
atagagcgag gacgctaaca ggaacaatga ctcaggatga gggtcaggag cgccaggagg 60
cgaagacaga ggattgtcag gaagacaaac gtccggagac gtaattaaac ggaaatggaa 120
tcaacacgga ttgttccggc taatggaaaa acagggtgtg ttggcggcct gcaaggattg 180
taagacccgt taagggttat gagtcaggaa aaaaggcgac agagtaatct gtcgcctttt 240
ttctt 245
<210> 25
<211> 242
<212> DNA
<213> Citrobacter werkmaniii
<400> 25
agcgagggag ctaacaggat aaacgactca ggatgagggt caggagcgcc aggaggcgaa 60
gacgcaggat tgtcaggaag acaaacgtcc ggagacgtta gtaaaaggaa atggaaacaa 120
cacggaatgt ttctggctaa gggaaaaaca gggtgtgttg atagccgaca gggattgtag 180
ggcccgttaa gggttgagag tcaggaaaaa aggcgacaga ttactctgtc gccttttttc 240
tt 242
<210> 26
<211> 242
<212> DNA
<213> Salmonella enterica
<400> 26
agcgaggacg ctaacaggat caacgactca ggatgagggt caggagcgcc aggaggcgaa 60
gacacaggat tgtcaggaag acaaacgtcc ggagacgtta gtaaaaggaa atggaaacaa 120
catggaatgt tccaggctaa gggaaaaaca gggcgtgttg atagccaaca gggatggtgg 180
aacccgttaa gggtcgtgag tcaagaaaaa aggcggcaga ttactctgtc gccttttttc 240
tt 242
<210> 27
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer cadA-F
<400> 27
ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa cgttattgca atattgaatc 50
<210> 28
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer cadA-R
<400> 28
ggcggatccc cacttccctt gtacgagcta attatttttt gctttcttct ttc 53
<210> 29
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer cadA-F2
<400> 29
atttcacaca ggaaacagct atgaacgtta ttgcaatatt gaatcac 47
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer cadA-R2
<400> 30
agctgtttcc tgtgtgaaat 20
<210> 31
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer SacI-F
<400> 31
ggcgagctcc tcctgtgtga aattgttatc cgctc 35
<210> 32
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer SacI-R
<400> 32
ggcgagctca tgaacgttat tgcaatattg aatc 34
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer csrA-F
<400> 33
ggcgagctca tgctgattct gactcgtcg 29
<210> 34
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer csrA-R
<400> 34
ggcggatcct tagtaactgg actgctggga t 31
<210> 35
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer csrD-F
<400> 35
ggcgagctca tgagattaac gacgaaattt tcg 33
<210> 36
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer csrD-R
<400> 36
ggcggatcct taaaccgagt atctttgtga atat 34
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer rmvBamHI-F
<400> 37
gtttatcagg acccgatggg ca 22
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer rmvBamHI-R
<400> 38
tgcccatcgg gtcctgataa ac 22
<210> 39
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer lysC-F
<400> 39
ggcgagctca cacaggaaac agaccatgtc tgaaattgtt gtctcc 46
<210> 40
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer lysC-R
<400> 40
ggcggatcct tactcaaaca aattactatg cag 33
<210> 41
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer dapA-F
<400> 41
ggcggatcca cacaggaaac agaccatgtt cacgggaagt attgtc 46
<210> 42
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer dapA-R
<400> 42
ggctctagat tacagcaaac cggcatgc 28
<210> 43
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer lysA-F
<400> 43
ggctctagaa cacaggaaac agaccatgcc acattcactg ttcagc 46
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer lysA-R
<400> 44
ggcgtcgact taaagcaatt ccagcgccag 30
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 318-F
<400> 45
cagcctgaat atactgcatt ctc 23
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 318-R
<400> 46
gagaatgcag tatattcagg ctg 23
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 323-F
<400> 47
gcattctcgc gatttcctcg 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 323-R
<400> 48
cgaggaaatc gcgagaatgc 20
<210> 49
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer SlysC-F
<400> 49
ggcgagctca cacaggaaac agaccatggg cttagttgtg cagaaa 46
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer SlysC-R
<400> 50
ggcggatcct taacgacctg tgccgccata 30
<210> 51
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer asd-F
<400> 51
ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa aaatgttggt tttatcgg 48
<210> 52
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer asd-R
<400> 52
ggcggatcct tacgccagtt gacgaagc 28
<210> 53
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer dapB-F
<400> 53
ggcacacagg aaacagacca tgcatgatgc aaacatccg 39
<210> 54
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer dapB-R
<400> 54
ggctctagat tacaaattat tgagatcaag tacatctc 38
<210> 55
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer dapD-F
<400> 55
ggctctagaa cacaggaaac agaccatgca gcagttacag aacat 45
<210> 56
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer dapD-R
<400> 56
ggcgcatgct tagtcgatgg tacgcagca 29
<210> 57
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer aspC-F
<400> 57
ggctctagaa cacaggaaac agaccatgtt tgagaacatt accgcc 46
<210> 58
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer aspC-R
<400> 58
ggcgcatgcg acctcgaggt agtcgactta cagcactgcc acaatcg 47
<210> 59
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer lysC-rbs2-F
<400> 59
atttcacaca ggaaacagct atgtctgaaa ttgttgtctc ca 42
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer lysC-rbs2-R
<400> 60
agctgtttcc tgtgtgaaat 20
<210> 61
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer asd-rbs2-F
<400> 61
atttcacaca ggaaacagct atgaaaaatg ttggttttat cggctg 46
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer asd-rbs2-R
<400> 62
agctgtttcc tgtgtgaaat 20
<210> 63
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer SacI-F2
<400> 63
ggcgagctct cccctgattc tgtggataa 29
<210> 64
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer SacI-R2
<400> 64
ggcgagctca gcaaaaggcc aggaaccgt 29
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer ApaI-F
<400> 65
ggcgggcccg tattaccgcc tttgagtgag 30
<210> 66
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer ApaI-R
<400> 66
ggcgggccca cagaatcagg ggagagctc 29
<210> 67
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer LAL2-SacI-F
<400> 67
ggcgagctcg ttggccgatt cattaatgc 29
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer LAL2-ApaI-R
<400> 68
ggcgggccct taaagcaatt ccagcgccag 30
<210> 69
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer csrB-F
<400> 69
ggcgagctcg agtcagacaa cgaagtgaac 30
<210> 70
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer csrB-R
<400> 70
ggcggatcca ataaaaaaag ggagcactgt attc 34
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer csrC-F
<400> 71
ggcgagctca tagagcgagg acgctaacag 30
<210> 72
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer csrC-R
<400> 72
ggcggatcca agaaaaaagg cgacagatta ctc 33
<210> 73
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer csrB-F2
<400> 73
ggcggatccc acacaggagg agctcgagtc 30
<210> 74
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer csrB-R2
<400> 74
ggcgcatgca ataaaaaaag ggagcactgt attc 34
<210> 75
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer csrC-F2
<400> 75
ggcggatccc acacaggagg agctcataga g 31
<210> 76
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer csrC-R2
<400> 76
ggcgcatgca agaaaaaagg cgacagatta ctc 33

Claims (30)

1.一种遗传修饰的宿主细胞，其包含编码CsrB sRNA或CsrC sRNA的外源核酸，其中相对于未被修饰为表达所述外源核酸的对应宿主细胞，所述宿主细胞过表达CsrB sRNA或CsrC sRNA；且与野生型宿主细胞相比具有至少一种额外的遗传修饰以增加赖氨酸或赖氨酸衍生物的生产。
2.权利要求1的遗传修饰的宿主细胞，其中所述氨基酸衍生物是尸胺。
3.权利要求1或2的遗传修饰的宿主细胞，其中所述CsrB sRNA包含与SEQ ID NO:16具有至少85％相同性的核苷酸序列并且所述CsrC sRNA包含与SEQ ID NO:17具有至少85％相同性的核苷酸序列。
4.权利要求1或2的遗传修饰的宿主细胞，其中所述CsrB sRNA包含SEQ ID NO:16的核酸序列并且所述CsrC sRNA包含SEQ ID NO:17的核酸序列。
5.权利要求1-4任一项的遗传修饰的宿主细胞，其中所述CsrB或CsrC对于所述宿主细胞是异源的。
6.权利要求1-5任一项的遗传修饰的宿主细胞，其中编码所述CsrB或CsrC的外源核酸由导入所述细胞中的表达载体编码，其中所述表达载体包含与启动子可操纵地连接的所述外源核酸。
7.权利要求1-5任一项的遗传修饰的宿主细胞，其中所述外源核酸整合进所述宿主染色体中。
8.权利要求1-7任一项的遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞过表达赖氨酸脱羧酶。
9.权利要求1-8任一项的遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞过表达一或多种赖氨酸生物合成多肽。
10.权利要求9的遗传修饰的宿主细胞，其中所述一或多种赖氨酸生物合成多肽是天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氨基庚二酸脱羧酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶甲酸还原酶或天冬氨酸转氨酶。
11.权利要求10的遗传修饰的宿主细胞，其中所述天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氨基庚二酸脱羧酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶甲酸还原酶或天冬氨酸转氨酶是LysC、DapA、LysA、Asd、DapB或AspC多肽。
12.权利要求1-7任一项的遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞过表达CadA、LysC、DapA、LysA、Asd、DapB和AspC多肽。
13.权利要求1-12任一项的遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞是埃希氏菌属(Escherichia)、哈夫尼菌属(Hafnia)或棒状杆菌属(Corynebacterium)的。
14.权利要求13的遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌(Escherichiacoli)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
15.权利要求14的遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
16.一种生产赖氨酸或赖氨酸衍生物的方法，所述方法包括在过表达CsrB sRNA或CsrCsRNA的条件下培养权利要求1-15任一项的宿主细胞。
17.一种工程化宿主细胞以增加赖氨酸或赖氨酸衍生物生产的方法，所述方法包括将编码CsrB或CsrC sRNA的外源核酸导入宿主细胞，其中所述宿主细胞具有至少一个额外的遗传修饰，其与野生型宿主细胞相比增加赖氨酸或赖氨酸衍生物的生产；
在表达所述CsrB或CsrC sRNA的条件下培养所述宿主细胞，及
选择相对于未被修饰为表达所述外源核酸的对应对照宿主细胞，呈现出增加的赖氨酸或赖氨酸衍生物生产的宿主细胞。
18.权利要求17的方法，其中所述氨基酸衍生物是尸胺。
19.权利要求17或18的方法，其中所述CsrB或CsrC sRNA对于宿主细胞是异源的。
20.权利要求17-19任一项的方法，其中编码所述CsrB或CsrCsRNA的所述外源核酸由导入所述细胞中的表达载体编码，其中所述表达载体包含与启动子可操纵地连接的所述外源核酸。
21.权利要求17-19任一项的方法，其中所述外源核酸整合进所述宿主染色体中。
22.权利要求17-21任一项的方法，其中所述CsrB sRNA包含SEQ ID NO:16的核酸序列并且所述CsrC sRNA包含SEQ ID NO:17的核酸序列。
23.权利要求17-22任一项的方法，其中所述宿主细胞过表达赖氨酸脱羧酶。
24.权利要求17-23任一项的方法，其中所述宿主细胞过表达一或多种赖氨酸生物合成多肽。
25.权利要求24的方法，其中所述赖氨酸生物合成多肽是天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氨基庚二酸脱羧酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶甲酸还原酶或天冬氨酸转氨酶。
26.权利要求25的方法，其中所述天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氨基庚二酸脱羧酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶甲酸还原酶或天冬氨酸转氨酶是LysC、DapA、LysA、Asd、DapB或AspC多肽。
27.权利要求17-22任一项的方法，其中所述宿主细胞过表达CadA、LysC、DapA、LysA、Asd、DapB和AspC多肽。
28.权利要求17-27任一项的方法，其中所述宿主细胞是埃希氏菌属、哈夫尼菌属或棒状杆菌属的。
29.权利要求28的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌或谷氨酸棒杆菌。
30.权利要求29的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
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