JP2023527951A - L-リジン産生組換え菌株、その構築方法及び使用 - Google Patents
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Abstract
Description
ポリヌクレオチドの発現調節配列は修飾されてもよい。発現調節配列は、それに操作可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を制御し、また、例えばプロモーター、ターミネータ、エンハンサー、サイレンサーなどを含んでもよい。ポリヌクレオチドは開始コドンの変化を有してもよい。ポリヌクレオチドが染色体の特定部位に組み込まれることで、コピー数を増加させてもよい。本明細書では、特定部位は例えばトランスポゾン部位又は遺伝子間部位を含んでもよい。また、ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込み、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することで、コピー数を増加させてもよい。
528番目の塩基が変異するように、宿主菌株中の、例えばSEQ ID NO:1に示される野生型NCgl2176のポリヌクレオチド配列を改変し、変異NCgl2176コード遺伝子を含むコリネバクテリウム組換え菌株を得るステップを含む。
528番目の塩基が変異するように、SEQ ID NO:1に示される野生型NCgl2176遺伝子のヌクレオチド配列を改変し、変異NCgl2176遺伝子ポリヌクレオチド配列を得るステップ(1)と、
前記変異したポリヌクレオチド配列をプラスミドに連結して、組換えベクターを構築するステップ(2)と、
前記組換えベクターを宿主菌株に導入して、前記変異NCgl2176コード遺伝子を含むコリネバクテリウム組換え菌株を得るステップ(3)とを含む。
P1:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCGGCGACCGCATGGACACCG 3'(SEQ ID NO:5)
P2:5'CCGGGGACTGGTTTTCGGGTGTTGGTGTGC 3'(SEQ ID NO:6)
P3:5'GCACACCAACACCCGAAAACCAGTCCCCGG 3'(SEQ ID NO:7)
P4:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCGAGGTCTCTCAGAATCGGT 3'(SEQ ID NO:8)
NCgl2176遺伝子の上下流相同アーム断片、NCgl2176遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列、又は、NCgl2176A528C遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅し、相同組換えによって宿主菌株のゲノムにNCgl2176又はNCgl2176A528C遺伝子を導入することで、前記菌株でNCgl2176又はNCgl2176A528C遺伝子を過剰発現するステップを含む。
P7:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCGTTCTGGACTGAGG3'(SEQ ID NO:11)
P8:5'AACACCATTGTCCCTGTTTTGGGCGAAATTTTCCCGGTGCACCGAGAACAGATG3'(SEQ ID NO:12)。
本発明の一実施形態では、下流相同アーム断片を増幅するプライマーは以下の通りである。
P11:5'CTACGAGACGAAGCCGTTCGCCTGAGATGGCGCAATTAAATCAAG 3'(SEQ ID NO:15)
P12:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCTATGACACCTTCAACGGATC 3'(SEQ ID NO:16)。
P9:5'CGGGAAAATTTCGCCCAAAACAGGGACAATGGTGTTATGGCATTTGCAGACATTGTGCGC3'(SEQ ID NO:13)
P10:5'CTTGATTTAATTGCGCCATCTCAGGCGAACGGCTTCGTCTCGTAG3'(SEQ ID NO:14)。
NCgl 2176遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列、又はNCgl 2176A528C遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅し、過剰発現プラスミドベクターを構築し、前記ベクターを宿主菌株に形質導入することで、前記菌株でNCgl 2176又はNCgl 2176A528C遺伝子を過剰発現するステップを含む。
P17:5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCGGGAAAATTTCGCCCAAAACAG3'(SEQ ID NO:21)
P18:5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACTCAGGCGAACGGCTTCGTCTCGTAG 3'(SEQ ID NO:22)。
(a)SEQ ID NO:30に示されるヌクレオチド配列、又は、
(b)SEQ ID NO:30に示されるヌクレオチド配列とは90%以上、好ましくは、95%以上、又は98%以上の同一性を有するヌクレオチド配列であって、、(a)前記プロモーターの増強活性を保留し、かつ-49番目のヌクレオチドがアデニン(A)として保持され、-51番目のヌクレオチドがチミン(T)として保持され、-54~-58番目のヌクレオチドがGGTGTとして保持されるヌクレオチド配列である。
-49番目、-51番目及び-54~-58番目の塩基が変異するようにSEQ ID NO:29に示されるプロモーター領域を改変し、変異したプロモーター領域を含むヌクレオチド配列を得るステップ(1)を含むL-リジン産生組換え菌株の構築方法を提供する。
前記組換えベクターを宿主菌株に導入し、前記変異したプロモーター領域を含むL-リジン産生組換え菌株を得るステップ(3)とをさらに含む。
dapB遺伝子のプロモーター領域を増幅する2対のプライマーを設計し、PCR技術によって、変異したプロモーター領域ヌクレオチド配列を得ることを含む。
P1’:5' CCGGAATTC ACCATGCCGGACATGCGGAC3'(EcoR I)(SEQ ID NO:31)
P2’:5'CCTTCTGAACGGGTTGTGGTATAATGGTGG 3'(SEQ ID NO:32)
P3’:5'CCACCATTATACCACAACCCGTTCAGAAGG 3'(SEQ ID NO:33)
P4’:5' ACATGCATGC GAATATTGACGTTGAGGAAG 3'(Sph I)(SEQ ID NO:34)。
SEQ ID NO 1:NCgl2176野生型ORF配列
SEQ ID NO 2:NCgl2176A528CORF配列
SEQ ID NO 3:NCgl2176野生型コードタンパク質のアミノ酸配列
SEQ ID NO 4:NCgl2176K176Nコードタンパク質のアミノ酸配列
SEQ ID NO 29:野生型プロモーター配列
SEQ ID NO 30:突然変異后プロモーター配列
本発明は、NCgl 2176遺伝子を弱化又はノックアウトした結果、該遺伝子によってコードされる産物がL-リジン産生能に影響を与え、コード配列に点突然変異を導入したり、該遺伝子のコピー数を増加したり、得た組換え菌株を過剰発現したりすることで、得た菌株が未改変の菌株に比べて、高濃度のL-リジンの生産に有利であることを見出した。
さらに、dapB遺伝子のプロモーター領域に点突然変異を導入することで、組換え型菌株を得る場合、得られた菌株も、未突然変異的菌株に比べて、L-リジンの産生量を大幅に向上させ、生成効率をさらに高め、生成コストを低下させ、普及に有利である。
NCBIによる野生型コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032ゲノム配列に従って、NCgl 2176遺伝子コード領域配列を増幅する2対のプライマーを設計して合成し、対立遺伝子置換によって菌株YP97158(受託番号:CGMCC No.12856、受託日期:2016年8月16日、受託機関:中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター、北京市朝陽区北辰西路1号院3号、電話番号:010-64807355、中国特許出願CN106367432A(出願日2016年9月1日、公開日2017年2月1日)中)の背景に記載のNCgl2176遺伝子コード領域(SEQ ID NO:1)に点突然変異を導入し、コードタンパク質を対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO:3であり、NCgl2176遺伝子のヌクレオチド配列の528番目のAはC(SEQ ID NO:2:NCgl2176A528C)に変わり、コードタンパク質を対応するアミノ酸配列の176番目のリジンはアスパラギン(SEQ ID NO:4:NCgl2176K176N)に変わった。
プライマーは以下のように設計される(上海invitrogen社により合成)。
P1:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCGGCGACCGCATGGACACCG 3'(SEQ ID NO:5)
P2:5'CCGGGGACTGGTTTTCGGGTGTTGGTGTGC 3'(SEQ ID NO:6)
P3:5'GCACACCAACACCCGAAAACCAGTCCCCGG 3'(SEQ ID NO:7)
P4:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCGAGGTCTCTCAGAATCGGT 3'(SEQ ID NO:8)
構築方法:コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032をテンプレートとして、それぞれプライマーP1とP2、P3とP4でPCR増幅を行った。
PCR系:10×Ex Taq Buffer 5μL、dNTP Mixture(各2.5mM)4μL、Mg2+(25mM)4μL、プライマー(10pM)各2μL、Ex Taq(5U/μL)0.25μL、全体積50μL。
前記PCR増幅は以下のように行われる。94℃、5min予備変性、94℃、30s変性、52℃、30sアニーリング、72℃、40s伸長(30サイクル)、72℃、10min過剰伸長。サイズがそれぞれ796bp及び786bpであり、NCgl 2176遺伝子コード領域を含有する2本のDNA断片(NCgl2176UpとNCgl2176Down)が得られた。
上記2本のDNA断片をアガロースゲル電気泳動により分離精製した後、上記2本のDNA断片をテンプレート、P1とP4をプライマーとして、オーバーラップPCRによって、長さ約1552bpの断片を増幅した。
PCR系:10×Ex Taq Buffer 5μL、dNTP Mixture(各2.5mM)4μL、Mg2+(25mM)4μL、プライマー(10pM)各2μL、Ex Taq(5U/μL)0.25μL、全体積50μL。
前記PCR増幅は以下のように行われる。94℃、5min予備変性、94℃、30s変性、52℃、30sアニーリング、72℃、90s伸長(30サイクル)、72℃ 10min過剰伸長。
このDNA断片(NCgl 2176A528C)によって、YP97158NCgl2176遺伝子コード領域の528番目のアデニン(A)はシトシン(C)に変わり、最終的には、コードタンパク質の176番目のアミノ酸はリジン(K)からアスパラギン(N)に変わった。
pK18mobsacBプラスミド(Addgene社より購入)をXba Iで制限酵素切断した後、アガロースゲル電気泳動によってNCgl2176A528Cと線形化したpK18mobsacBプラスミドとを分離精製し、次に、NEBuider組換え系により組み立て、ベクターpK18-NCgl2176A528Cを得て、該プラスミドには、カナマイシン耐性マーカーが含有されている。ベクターpK18-NCgl2176A528Cを配列決定会社に送って配列決定同定を行い、正しい点突然変異(A-C)を含むベクターpK18-NCgl2176A528Cを保管して、使用に備えた。
構築方法:対立遺伝子置換プラスミドpK18-NCgl2176A528Cを電気ショックによりL-リジン生産菌株YP97158(その構築方法はWO2014121669A1を参照する。配列決定した結果、該菌株染色体に野生型のNCgl2176遺伝子コード領域が保留されている)に形質転換し、培養により産生された単一コロニーをそれぞれプライマーP1及びユニバーサルプライマーM13Rで同定し、サイズが約1559bpのバンドを増幅できる菌株を陽性菌株とした。15%スクロース含有培地で陽性菌株を培養し、培養により産生された単一コロニーをそれぞれカナマイシン含有培地及びカナマイシン不含培地で培養し、カナマイシン不含培地で成長しているが、カナマイシン含有培で成長していない菌株を、さらに以下のプライマー(上海invitrogen社により合成)でPCR同定を行った。
P5:5'GAAAACACCGCCCGAATC 3'(SEQ ID NO:9)
P6:5'GGAGTGCGTGTTTGTTGATG 3'(SEQ ID NO:10)
上記PCR増幅産物を高温で変性し、氷浴処理をした後、sscp電気泳動(プラスミドpK18-NCgl2176A528C増幅断片を陽性対照、YP97158増幅断片を陰性対照、水を空白対照とする)を行い、断片の構造が異なるので、電気泳動位置が異なり、このため、断片の電気泳動位置が陰性対照の断片位置と一致せず、かつ陽性対照断片の位置と一致する菌株は対立遺伝子置換に成功した菌株であった。プライマーP5とP6を用いて、再度PCRによって対立遺伝子置換に成功した菌株の目的断片を増幅し、PMD19-Tベクターに連結して、配列決定を行い、配列アラインメントの結果塩基配列が突然変異した配列は、菌株の対立遺伝子置換が成功したと検証し、YPL-4-011と命名された。
NCBIによる野生型コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032ゲノム配列に従って、上下流相同アーム断片、NCgl2176又はNCgl 2176A528C遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅する3対のプライマーを設計して合成し、相同組換えによって菌株YP97158にNCgl2176又はNCgl2176A528C遺伝子を導入した。
プライマーは以下のように設計される(上海invitrogen公司より合成)。
P7:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCGTTCTGGACTGAGG3'(SEQ ID NO:11)
P8:5'AACACCATTGTCCCTGTTTTGGGCGAAATTTTCCCGGTGCACCGAGAACAGATG3'(SEQ ID NO:12)
P9:5'CGGGAAAATTTCGCCCAAAACAGGGACAATGGTGTTATGGCATTTGCAGACATTGTGCGC3'(SEQ ID NO:13)
P10:5'CTTGATTTAATTGCGCCATCTCAGGCGAACGGCTTCGTCTCGTAG3'(SEQ ID NO:14)
P11:5'CTACGAGACGAAGCCGTTCGCCTGAGATGGCGCAATTAAATCAAG 3'(SEQ ID NO:15)
P12:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCTATGACACCTTCAACGGATC 3'(SEQ ID NO:16)
構築方法:コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032又はYPL-4-011をそれぞれテンプレートとして、プライマーP7/P8、P9/P10、P11/P12のそれぞれでPCR増幅を行い、上流相同アーム断片約720bp、NCgl2176遺伝子及びそのプロモーター断片約1092bp、NCgl2176A528C遺伝子及びそのプロモーター断片約1092bp、並びに下流相同アーム断片約653bpを得た。次に、P7/P12をプライマーとして、以上で増幅させた3つの断片(上流相同アーム断片、NCgl2176遺伝子及びそのプロモーター断片、下流相同アーム断片、又は、上流相同アーム断片、NCgl2176A528C遺伝子及びそのプロモーター断片、下流相同アーム断片)を混合してテンプレートとして増幅を行い、組み込み相同アーム断片を得た。
PCR反応終了後、増幅させた産物を電気泳動して回収し、カラムDNAゲル回収キット(TIANGEN)で所望の約2504bpのDNA断片を回収し、NEBuider組換え系により、Xba Iで消化されて回収されたシャトルプラスミドPK18mobsacBに連結し、組み込みプラスミドPK18mobsacB-NCgl2176又はPK18mobsacB-NCgl2176A528Cをそれぞれ取得し、プラスミドには、カナマイシン耐性マーカーが含有されており、カナマイシンによるスクリーニングによって、プラスミドがゲノムに組み込まれた組換え体が得られた。
PCR系:10×Ex Taq Buffer 5μL、dNTP Mixture(各2.5mM)4μL、Mg2+(25mM)4μL、プライマー(10pM)各2μL、Ex Taq(5U/μL)0.25μL、全体積50μL。
前記PCR増幅は以下のように行われる。94℃、5min予備変性、94℃、30s変性、52℃、30sアニーリング、72℃、120s伸長(30サイクル)、72℃、10min過剰伸長。
2つの組み込みプラスミドをそれぞれL-リジン生産菌の菌株YP97158にエレクトロコンバージョンし、培養により産生された単一コロニーをP13/P14プライマーでPCR同定を行い、PCRによりサイズ約1609bpの断片が増幅されたものを陽性菌株、断片が増幅されなかったものを原菌とした。陽性菌株を15%スクロースによるスクリーニングに供した後、それぞれカナマイシン含有培地及びカナマイシン不含培地で培養し、カナマイシン不含培地で成長しているが、カナマイシン含有培地で成長していない菌株をさらにP15/P16プライマーでPCR同定を行い、サイズ約1123bpが増幅された菌はNCgl2176又はNCgl2176A528C遺伝子がYP97158ゲノムに組み込まれた菌株であり、それぞれYPL-4-012(点突然変異無し)とYPL-4-013(点突然変異有り)と命名された。
P13:5'TCCAAGGAAGATACACGCC 3'(SEQ ID NO:17)
P14:5'CCTGAGCGGAATAGTCCTGTG3'(SEQ ID NO:18)
P15:5'ACGCACCCGTGTTCTACCT3'(SEQ ID NO:19)
P16:5'CGTTGGAATCTTGCGTTG 3'(SEQ ID NO:20)
NCBIによる野生型コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032ゲノム配列に従って、NCgl2176又はNCgl2176A528C遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅する1対のプライマーを設計して合成し、プライマーは以下のように設計される(上海invitrogen公司により合成)。
P17:5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCGGGAAAATTTCGCCCAAAACAG3'(SEQ ID NO:21)
P18:5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACTCAGGCGAACGGCTTCGTCTCGTAG 3'(SEQ ID NO:22)
構築方法:野生型コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032又はYPL-4-011をそれぞれテンプレートとして、プライマーP17/P18でPCR増幅を行い、NCgl2176又はNCgl2176A528C遺伝子及びそのプロモーター断片1140bpを得て、増幅させた産物を電気泳動して回収し、カラムDNAゲル回収キットで所望の1140bpのDNA断片を回収し、NEBuider組換え系により、EcoR I制限酵素で切断されて回収されたシャトルプラスミドpXMJ19に連結し、過剰発現プラスミドpXMJ19-NCgl2176又はpXMJ19-NCgl2176A528Cを得た。プラスミドにはクロラムフェニコール耐性マーカーが含有されており、クロラムフェニコールによるスクリーニングによって、プラスミドが形質転換された菌株が得られた。
PCR系:10×Ex Taq Buffer 5μL、dNTP Mixture(各2.5mM)4μL、Mg2+(25mM)4μL、プライマー(10pM)各2μL、Ex Taq(5U/μL)0.25μL、全体積50μL。
前記PCR増幅は以下のように行われる。94℃、5min予備変性、94℃、30s変性、52℃、30sアニーリング、72℃、90s伸長(30サイクル)、72℃、 10min過剰伸長。
プラスミドをそれぞれL-リジン生産菌の菌株YP97158にエレクトロコンバージョンし、培養により産生された単一コロニーをM13R(-48)及びP18プライマーでPCR同定を行い、PCR増幅によりサイズ約1147bpの断片を含むものを導入菌株とし、それぞれYPL-4-014(点突然変異無し)とYPL-4-015(点突然変異有り)と命名した。
NCBIによるコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032のゲノム配列に従って、NCgl2176遺伝子コード領域の両端の断片を増幅する2対のプライマーを合成して、上下流相同アーム断片とした。プライマーは以下のように設計される(上海英俊公司により合成)。
P19:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGTCAAAGAGGGCGAGATAAT3'(SEQ ID NO:23)
P20:5'GTTCATGAGACACCCAGTAGGACGACCTACAGAATACTAGTCAGTG 3'(SEQ ID NO:24)
P21:5'CACTGACTAGTATTCTGTAGGTCGTCCTACTGGGTGTCTCATGAAC 3'(SEQ ID NO:25)
P22:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCACCGCACGATGGTTCACT3'(SEQ ID NO:26)
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032をテンプレートとして、それぞれプライマーP19/P20及びP21/P22でPCR増幅を行い、上流相同アーム断片852bp及び下流相同アーム断片787bpを得て、次に、プライマーP19/P22でオーバーラップPCRを行い、完全な相同アーム断片1639を得て、PCR反応終了後、増幅させた産物を電気泳動して回収し、カラムDNAゲル回収キットで所望の1639bpのDNA断片を回収し、NEBuider組換え系によりXba I制限酵素で切断されて回収されたシャトルプラスミドpk18mobsacBプラスミドに連結し、ノックアウトプラスミドを得た。該プラスミドにはカナマイシン耐性マーカーが含有されている。
ノックアウトプラスミドをリジン生産菌株YP97158にエレクトロコンバージョンし、培養により産生された単一コロニーをそれぞれ下記プライマー(上海英俊公司により合成)によってPCR同定を行った。
P23:5'TCAAAGAGGGCGAGATAAT 3'(SEQ ID NO:27)
P24:5'ACCGCACGATGGTTCACT 3'(SEQ ID NO:28)
上記PCRによりサイズ1521bp及び2556bpのバンドが増幅された菌株は陽性菌株であり、2556bpバンドだけが増幅された菌株は原菌である。陽性菌株を15%スクロース培地でスクリーニングした後、それぞれカナマイシン含有培地及びカナマイシン不含培地で培養し、カナマイシン不含培地で成長しているが、カナマイシン含有培地で成長していない菌株をさらにP23/P24プライマーでPCR同定を行い、サイズ1521bpのバンドが増幅された菌株はNCgl2176遺伝子コード領域がノックアウトされた遺伝子改変菌株であり、YPL-4-016と命名された。
実施例2~5で構築された菌株と原菌株YP97158とを、BLBIO-5GC-4-H型番の発酵槽(上海百崙生物科技有限公司より購入)にて、表1に示される培地及び表2に示される制御プロセスによって、発酵実験を行った。菌株ごとに3回繰り返して、結果を表3に示す。
表3に示す結果から、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいてNCgl2176遺伝子を過剰発現することや、NCgl2176遺伝子コード領域に対する点突然変異NCgl2176A528C及び過剰発現は、L-リジン産生量の上昇に有利であり、一方、遺伝子の弱化又はノックアウトは、リジンの蓄積に不利である。
NCBIによるコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032ゲノム配列に従って、dapB遺伝子プロモーター領域配列を増幅する2対のプライマーを設計して合成し、対立遺伝子置換によって菌株YP97158背景中のdapB遺伝子プロモーター領域(SEQ ID NO:29)に点突然変異を導入し、dapB遺伝子プロモーター領域のヌクレオチド配列の-49bp番目のCはAに変わり、-51bp発酵槽のGはTに変わり、-54--58bp CTGCAはGGTGT(SEQ ID NO:30)に変わった。
プライマーは以下のように設計される(上海invitrogen公司により合成)。
P1’:5' CCGGAATTCACCATGCCGGACATGCGGAC3'(EcoR I)(SEQ ID NO:31)
P2’:5'CCTTCTGAACGGGTTGTGGTATAATGGTGG 3'(SEQ ID NO:32)
P3’:5'CCACCATTATACCACAACCCGTTCAGAAGG 3'(SEQ ID NO:33)
P4’:5' ACATGCATGCGAATATTGACGTTGAGGAAG 3'(Sph I)(SEQ ID NO:34)。
構築方法:コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032をテンプレートとして、それぞれプライマーP1’とP2’、P3’とP4’でPCR増幅を行った。
PCR系:10×Ex Taq Buffer 5μL、dNTP Mixture(各2.5mM)4μL、Mg2+(25mM)4μL、プライマー(10pM)各2μL、Ex Taq(5U/μL)0.25μL、全体積50μL。
前記PCR増幅は以下のように行われる。94℃、5min予備変性、94℃、30s変性、52℃、30sアニーリング、72℃、60s伸長、30サイクル、72℃、 10min過剰伸長。
点突然変異を有し、長さがそれぞれ665bp及び644bpの2本のDNA断片(dapB UpとdapB Down断片)を得た。上記2本のDNA断片をアガロースゲル電気泳動により分離精製した後、精製した2本のDNA断片をテンプレートとして、P1’とP4’をプライマーとして、Overlap PCRによって、長さ約1279bpの断片(Up-Down断片)を増幅した。
Overlap PCR系:10×Ex Taq Buffer 5μL、dNTP Mixture(各2.5mM)4μL、Mg2+(25mM)4μL、プライマー(10pM)各2μL、Ex Taq(5U/μL)0.25μL、全体積50μL。
前記Overlap PCR増幅は以下のように行われる。94℃、5min予備変性、94℃、30s変性、52℃、30sアニーリング、72℃、90s伸長、30サイクル、72℃、10min過剰伸長。
上記Up-Down断片をアガロースゲル電気泳動により分離精製し、該断片は、dapB遺伝子プロモーター領域及びその上下流配列を含み、断片の両端のそれぞれにEcoR IとSph I制限酵素切断部位を有する。このDNA断片によって、YP97158 dapB遺伝子プロモーター領域の-49bp番目のCはAに変わり、-51bp番目のGはTに変わり、-54~-58bp CTGCAはGGTGTに変わった。
断片を二重制限酵素切断(EcoR I/Sph I)に供した後、精製して回収し、同様に二重制限酵素切断(EcoR I/Sph I)を受けたシャトルプラスミドpK18mobsacB(Addgene公司より購入)に連結し、対立遺伝子置換プラスミドpK18-PdapB(C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)を得て、該プラスミドにはカナマイシン耐性マーカーが含有されている。ベクターpK18-PdapB(C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)を配列決定会社に送って配列決定同定を行い、正しい点突然変異を有するベクターpK18-PdapB(C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)を保管して、使用に備えた。
対立遺伝子置換プラスミドpK18-PdapB(C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)を電気ショックによりL-リジン生産菌株YP97158(配列決定の結果、該菌株の染色体には野生型dapB遺伝子プロモーターが保留されている)に形質転換し、培養により産生された単一コロニーをそれぞれプライマーP1’及びユニバーサルプライマーM13Fで同定し、サイズ1350bpのバンドが増幅された菌株は陽性菌株であった。陽性菌株を15%スクロース含有培地で培養し、培養により産生された単一コロニーをそれぞれカナマイシン含有培地及びカナマイシン不含培地で培養した。
カナマイシン不含培地で成長しているが、カナマイシン含有培地で成長していない菌株をさらに下記プライマー(上海invitrogen公司により合成)でPCR同定を行った。
P5’:5'AGATCGTCGGACTCATTGAC3'(SEQ ID NO:35)
P6’:5'CAAACATAGTTCCACCTGTG 3'(SEQ ID NO:36)
上記PCR増幅産物を高温で変性し、氷浴処理した後、SSCP電気泳動(プラスミドpK18-PdapB(C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)増幅断片を陽性対照、YP97158増幅断片を陰性対照、水を空白対照とする)を行い、断片構造が異なるので、電気泳動位置が異なり、このため、断片の電気泳動位置が陰性対照断片の位置と一致せず、陽性対照断片の位置と一致する菌株は対立遺伝子置換に成功した菌株であった。次に、PCRによって陽性菌株の目的断片を増幅し、PMD19-Tベクターに連結して配列決定を行い、配列アラインメントの結果塩基配列が突然変異した配列は、菌株の対立遺伝子置換に成功したと検証し、YPL-4-010と命名された。
実施例8で構築された菌株YPL-4-010及び原菌株YP97158を、BLBIO-5GC-4-H型番の発酵槽(上海百崙生物科技有限公司(bailun bio)より購入)にて、表1に示される培地及び表2に示される制御プロセスによって発酵実験を行った。菌株ごとに3回繰り返して、結果を表4に示す。
表4に示す結果から、コリネバクテリウム・グルタミカムにdapB遺伝子プロモーターの点突然変異したPdapB(C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)を供することは、L-リジン産生量の上昇に有利である。
Claims (16)
- SEQ ID NO:3のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの改善された発現、及び/又は、SEQ ID NO:29に示されるプロモーター領域の-49番目、-51番目、-54~-58番目の塩基の変異を有し、
好ましくは、前記改善された発現は、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現増強、又はSEQ ID NO:3のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点突然変異を有すること、又はSEQ ID NO:3のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点突然変異を有するとともに、発現が増強されることであることを特徴とする、L-リジンを生成するコリネバクテリウム属に属する微生物。 - SEQ ID NO:3のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの点突然変異によって、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列の176番目のリジンが異なるアミノ酸で置換され、好ましくは、176番目のリジンがアスパラギンで置換されることを特徴とする、請求項1に記載の微生物。
- SEQ ID NO:3のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項1~2のいずれか1項に記載の微生物。
- 前記点突然変異を有するポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1に示されるポリヌクレオチド配列の528番目の塩基が変異したものであり、
好ましくは、前記変異は、SEQ ID NO:1に示されるポリヌクレオチド配列の528番目の塩基のアデニン(A)からシトシン(C)への変異であり、
好ましくは、前記点突然変異を有するポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:2に示されるポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項1~3のいずれか1項に記載の微生物。 - SEQ ID NO:29に示されるプロモーター領域の-49番目のヌクレオチドシトシン(C)はアデニン(A)に変異し、-51番目のヌクレオチドグアニン(G)はチミン(T)に変異し、-54~-58番目のヌクレオチドCTGCAはGGTGTに変異し、
好ましくは、当該プロモーターヌクレオチド配列は、
(a)SEQ ID NO:30に示されるヌクレオチド配列、又は、
(b)SEQ ID NO:30に示されるヌクレオチド配列とは90%以上、好ましくは、95%以上、又は98%以上の同一性を有するものであって、(a)前記プロモーターの増強活性を保留し、かつ-49番目のヌクレオチドがアデニン(A)として保持され、-51番目のヌクレオチドがチミン(T)として保持され、-54~-58番目のヌクレオチドがGGTGTとして保持されるヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項1~4のいずれか1項に記載の微生物。 - 前記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、好ましくは、YP97158であることを特徴とする、請求項1~5のいずれか1項に記載の微生物。
- SEQ ID NO:3に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、176番目のリジンが異なるアミノ酸で置換され、好ましくは、176番目のリジンがアスパラギンで置換され、
好ましくは、当該ポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、
好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1に示されるポリヌクレオチド配列の528番目の塩基が変異したものであり、好ましくは、前記変異は、SEQ ID NO:1に示されるポリヌクレオチド配列の528番目の塩基のアデニン(A)からシトシン(C)への変異であり、
好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:2に示されるポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、ポリヌクレオチド配列。 - SEQ ID NO:4に示されることを特徴とする、アミノ酸配列。
- 請求項7に記載のポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、組換えベクター。
- 請求項7に記載のポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、組換え菌株。
- SEQ ID NO:29に示されるプロモーター領域の-49番目、-51番目、-54~-58番目の塩基が変異したヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、SEQ ID NO:29に示されるプロモーター領域の-49番目のヌクレオチドシトシン(C)がアデニン(A)に変異し、-51番目のヌクレオチドグアニン(G)がチミン(T)に変異し、-54~-58番目のヌクレオチドCTGCAがGGTGTに変異する、プロモーターヌクレオチド配列。 - 前記プロモーターヌクレオチド配列は、
(a)SEQ ID NO:30に示されるヌクレオチド配列、又は、
(b)SEQ ID NO:30に示されるヌクレオチド配列とは90%以上、好ましくは、95%以上、又は98%以上の同一性を有するものであって、(a)前記プロモーターの増強活性を保留し、かつ-49番目のヌクレオチドがアデニン(A)として保持され、-51番目のヌクレオチドがチミン(T)として保持され、-54~-58番目のヌクレオチドがGGTGTとして保持されるヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項11に記載のプロモーターヌクレオチド配列。 - 請求項11~12のいずれか1項に記載のプロモーターヌクレオチド配列と、前記プロモーターの後に操作可能に連結されたコード配列とを含み、
好ましくは、前記コード配列はdapB遺伝子のコード配列であることを特徴とする、プロモーターの発現カセット。 - 請求項11~12のいずれか1項に記載のプロモーターヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、前記プロモーターヌクレオチド配列はpK18mobsacBプラスミドに連結されて組換えベクターを構築することを特徴とする、組換えベクター。 - 請求項11~12のいずれか1項に記載のプロモーターヌクレオチド配列、請求項13に記載の発現カセット、または請求項14に記載の組換えベクターを含有し、
好ましくは、宿主菌株がYP97158であることを特徴とする、組換え菌株。 - 請求項1~6のいずれか1項に記載の微生物又は請求項10若しくは15に記載の組換え菌株を培養し、当該培養物からL-リジンを回収する、L-リジンの生産方法。
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