CN111850010B - 一种dapB基因改造的重组菌株及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核苷酸序列以及包括该多核苷酸序列的重组菌株，是对谷氨酸棒杆菌中的dapB基因的启动子区域序列进行点突变形成，突变后的启动子区域基因序列如SEQ ID NO:2所示。该重组菌株与未突变的菌株相比，提高了L‑赖氨酸产量，且菌株稳定性好，作为L‑赖氨酸生产菌株能够进一步降低生产成本。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种dapB基因启动子的改进，以及由此获得的改造的重组菌株、其构建方法与在L-赖氨酸生产上的应用。
背景技术
L-赖氨酸是人体和动物所不能合成的八种必需氨基酸中最重要的一种。目前，赖氨酸是目前全球使用量最大的氨基酸类饲料添加剂，约90％的L-赖氨酸产品用于饲料添加剂，约5％用作食品添加剂，其余5％用作医药中间体。如豆粕中添加适量的L-赖氨酸可以大大提高蛋白质的利用率，促进禽畜生长。由于国内饲料工业惊人的发展速度，L-赖氨酸的市场需求与日俱增。但由于发酵产酸水平较低，生产规模较小，致使生产成本较高，难于同进口产品竞争。因此，很有必要选育L-赖氨酸高产菌，使我国的赖氨酸工业具有国际竞争力。
最早，生产L-赖氨酸的方法是蛋白质水解法，后来发展的化学合成法使用剧毒原料，存在严重的环保问题，酶法因酶活性不稳定、规模小成本高等被慢慢淘汰，直到1960年日本采用微生物直接发酵生产赖氨酸获得成功，才真正推动了赖氨酸的规模生产。直接发酵法是目前广泛采用的赖氨酸生产方法。
棒杆菌是氨基酸生产中使用的最重要的菌种，其包括谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色棒杆菌(C.flavum)、钝齿棒杆菌(C.crenatum)、北京棒杆菌等。以谷氨酸棒杆菌为例，C.glutamicum生物合成途径中合成1mol L-赖氨酸需要消耗4mol NADPH。因此，为了提高C.glutamicum生物合成途径中L-赖氨酸的积累，提高C.glutamicum代谢途径中NADPH量或降低L-赖氨酸合成途径中NADPH需求量是非常重要的策略。
二氢吡啶二羧酸还原酶(Dihydrodipicolinate reductase,DHDPR)是细菌和高等植物生物合成二氨基庚二酸和L-赖氨酸过程中第二个关键酶，催化二氢吡啶二羧酸的NAD(P)H-依赖的还原性反应，生成六氢吡啶二羧酸。该酶在细胞壁形成中起到关键性作用。DHDPR既以NADH又以NADPH作为辅助因子，不同细菌的DHDPR对不同辅因子的亲和力也不同，如E.coli更青睐NADH，而C.glutamicum中DHDPR主要以NADPH作为辅因子参与L-赖氨酸的合成。和其他已发现的生物体中的DHDPR一样，C.glutamicum中DHDPR由基因dapB编码，其酶活不受合成途径中终产物的调节作用，但受2,6-吡啶二羧酸(2,6-PDC)的抑制。
赖氨酸的产率与生物合成途径中的酶活性有关，该活性一般可以通过扩增赖氨酸生物合成途径中的一个或多个基因或者通过应用基因的修饰的启动子来增强。
发明内容
本发明提供一种启动子核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:1所示的启动子区域第-49位、第-51位、第-54～-58位的碱基发生突变形成的核苷酸序列。
根据本发明，SEQ ID NO:1所示的启动子区域的第-49位核苷酸胞嘧啶(C)突变为腺嘌呤(A)、第-51位的核苷酸鸟嘌呤(G)突变为胸腺嘧啶(T)、第-54～-58位的核苷酸CTGCA突变为GGTGT。
根据本发明，所述启动子核苷酸序列如下所述：
(a)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或者是，
(b)与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有90％以上，优选的具有95％以上、或98％以上同一性的核苷酸序列，且其保留(a)所述启动子的增强活性，并且第-49位核苷酸保持为腺嘌呤(A)、第-51位的核苷酸保持为胸腺嘧啶(T)、第-54～-58位的核苷酸保持为GGTGT。
本发明还提供一种包含上述启动子的表达盒，所述表达盒包含所述启动子和可操纵地连接在所述启动子后的编码序列。在本发明的一个实施方案中，所述编码序列为dapB基因的编码序列。
本发明还提供一种包含本发明的启动子核苷酸序列的重组载体。
根据本发明，将本发明的启动子核苷酸序列与穿梭质粒相连接来构建所述重组载体；作为本发明的一个实施方案，所述穿梭质粒为pK18mobsacB质粒。
本发明还提供一种包含上述启动子核苷酸序列或上述重组载体的重组菌株。
根据本发明的重组菌株，其包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。所述SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列为dapB基因的启动子区域。进一步地，所述SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列连接dapB基因编码序列。具体地，所述重组菌株可以包括本发明上述的表达盒或者重组载体。具体地，本发明的重组菌株由表达盒或者重组载体转化得到。根据本发明的重组菌株，是将上述突变的启动子核苷酸序列导入宿主菌株中重组形成；所述宿主菌株可以选自本领域已知的产L-赖氨酸的菌株，例如选自棒杆菌中的至少一种，所述棒杆菌可以为谷氨酸棒杆菌、黄色棒杆菌、钝齿棒杆菌、北京棒杆菌；优选谷氨酸棒杆菌。作为本发明的一个实施方案，所述宿主菌株为YP97158(保藏编号：CGMCC No.12856，保藏日期：2016年8月16日，保藏单位：中国科学院微生物研究所)。
根据本发明的重组菌株，是以pK18mobsacB质粒为载体。
根据本发明的重组菌株，还可进一步包括其他改造。
本发明还提供一种产L-赖氨酸的重组菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)改造如SEQ ID NO:1所示的启动子区域，使其第-49位、第-51位和第-54～-58位碱基发生突变，得到包含突变的启动子区域的核苷酸序列。
根据本发明，所述突变是指SEQ ID NO:1所示的启动子区域的第-49位核苷酸胞嘧啶(C)突变为腺嘌呤(A)、第-51位的核苷酸鸟嘌呤(G)突变为胸腺嘧啶(T)、第-54～-58位的核苷酸CTGCA突变为GGTGT。具体地，所述突变后的启动子区域的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。进一步地，所述构建方法还包括如下步骤：
(2)将所述突变的启动子区域核苷酸序列与质粒连接，构建重组载体；
(3)将所述重组载体导入宿主菌株，得到所述包含突变的启动子区域的产L-赖氨酸重组菌株。
根据本发明，所述步骤(1)中，使所述发生突变的方法包括诱变、PCR定点突变或同源重组，优选PCR定点突变法。
根据本发明，所述步骤(1)包括：
设计两对扩增dapB基因的启动子区域的引物，再通过PCR技术得到突变的启动子区域核苷酸序列。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)中的引物为：
P1:5'CCGGAATTCACCATGCCGGACATGCGGAC3'(EcoR I)(SEQ ID NO:3)
P2:5'CCTTCTGAACGGGTTGTGGTATAATGGTGG 3'(SEQ ID NO:4)
P3:5'CCACCATTATACCACAACCCGTTCAGAAGG 3'(SEQ ID NO:5)
P4:5'ACATGCATGCGAATATTGACGTTGAGGAAG 3'(Sph I)(SEQ ID NO:6)。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)包括：以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4，进行PCR扩增，获得两条含有点突变的DNA片段；以上述两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过重叠PCR扩增(Overlap PCR)，得到包含本发明的启动子区域核苷酸序列(SEQ ID NO:2)的DNA片段。
根据本发明，步骤(1)中，通过重叠PCR扩增(Overlap PCR)，获得的DNA片段两端分别含有EcoR I和Sph I酶切位点。
根据本发明，所述步骤(2)包括：对于重叠PCR反应扩增的产物进行分离纯化，将片段双酶切(EcoR I/Sph I)后，与同样双酶切(EcoR I/Sph I)后的穿梭质粒相连接，获得等位替换重组载体。
根据本发明，所述穿梭质粒为pK18mobsacB质粒；所构建的重组载体为pK18-PdapB(C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)。
在本发明的一个实施方案中，所述重组质粒具有卡那霉素抗性标记。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤(3)的转化为电转化法；示例性地，所述步骤(3)中，是将重组质粒转化至菌株YP97158。
本发明还提供如第四方面所述的重组菌株在L-赖氨酸制备中的应用；或者提供一种提高L-赖氨酸发酵量的方法；或者提供一种生产L-赖氨酸的方法。
根据本发明所述应用和方法，包括采用所述重组菌株进行发酵，制备得到L-赖氨酸。根据本发明所述的应用和方法，可以单独使用本发明的重组菌株，也可以和其他产L-赖氨酸的细菌混合使用。
有益效果
本发明通过对dapB基因的启动子区域引入点突变，获得重组型菌株，所获得的菌株与未突变的菌株相比，大幅提高了L-赖氨酸的产量，进一步提高了生成效率，降低生成成本，便于推广应用。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。但本领域技术人员了解，本发明的保护范围不仅限于以下实施例。根据本发明公开的内容，本领域技术人员将认识到在不脱离本发明技术方案所给出的技术特征和范围的情况下，对以上所述实施例做出许多变化和修改都属于本发明的保护范围。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备；所进行的操作都是本领域已知的，或者按照市售商品的用户手册进行。
实施例1 构建包含点突变的dapB基因启动子区的转化载体pK18-PdapB
(C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)
依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，设计并合成两对扩增dapB基因启动子区序列的引物，以等位基因置换的方式在菌株YP97158(保藏编号：CGMCCNo.12856，保藏日期：2016年8月16日，保藏单位：中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话：010-64807355)背景中的dapB基因启动子区(SEQ ID NO:1)中引入点突变，dapB基因启动子区核苷酸序列的-49bp位C变为A、-51bp位的G变为T、-54--58bpCTGCA变为GGTGT(SEQ ID NO:2)。
引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P1:5'CCGGAATTCACCATGCCGGACATGCGGAC3'(EcoR I)(SEQ ID NO:3)
P2:5'CCTTCTGAACGGGTTGTGGTATAATGGTGG 3'(SEQ ID NO:4)
P3:5'CCACCATTATACCACAACCCGTTCAGAAGG 3'(SEQ ID NO:5)
P4:5'ACATGCATGCGAATATTGACGTTGAGGAAG 3'(Sph I)(SEQ ID NO:6)。
构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4，进行PCR扩增。
PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸60s，30个循环，72℃过度延伸10min。
获得含有点突变的、长度分别为665bp和644bp的两条DNA片段(dapB Up和dapBDown片段)。将上述两条DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以纯化后的两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过Overlap PCR扩增出长度约为1279bp的片段(Up-Down片段)。
Overlap PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
所述Overlap PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸90s，30个循环，72℃过度延伸10min。
将上述Up-Down片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化，该片段包含dapB基因启动子区及其上下游序列，且片段两端分别含有EcoR I和Sph I酶切位点。此DNA片段导致YP97158dapB基因启动子区的-49bp位的C变为A、-51bp位的G变为T、-54--58bp CTGCA变为GGTGT。
将片段双酶切(EcoR I/Sph I)后纯化回收，与同样双酶切(EcoR I/Sph I)后的穿梭质粒pK18mobsacB(购自Addgene公司)相连接，获得等位替换质粒pK18-PdapB(C (-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)，该质粒上含有卡那霉素抗性标记。并将载体pK18-PdapB(C (-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)送测序公司测序鉴定，将含有正确点突变的载体pK18-PdapB(C (-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)保存备用。
实施例2构建包含点突变的pK18-PdapB(C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)的工程菌株
将等位替换质粒pK18-PdapB(C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)通过电击转化入L-赖氨酸生产菌专利菌株YP97158中(其构建方法可参见WO2014121669A1；经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的dapB基因启动子)，对培养产生的单菌落分别通过引物P1和通用引物M13F进行鉴定，能扩增出1350bp大小条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养。
上述各培养所用基础培养基组成相同，在此基础培养基组成上添加蔗糖至15％，或添加卡那霉素，所述基础培养基组成如下：
| 成分 | 配方 |
| 蔗糖 | 10g/L |
| 多聚蛋白胨 | 10g/L |
| 牛肉膏 | 10g/L |
| 酵母粉 | 5g/L |
| 尿素 | 2g/L |
| 氯化钠 | 2.5g/L |
| 琼脂粉 | 20g/L |
| pH | 7.0 |
| 培养温度 | 32度 |
在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴定：
P5:5'AGATCGTCGGACTCATTGAC3'(SEQ ID NO:7)
P6:5'CAAACATAGTTCCACCTGTG 3'(SEQ ID NO:8)
上述PCR扩增产物通过高温变性、冰浴后进行SSCP电泳(以质粒pK18-PdapB(C (-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)扩增片段为阳性对照，YP97158扩增片段为阴性对照，水作为空白对照)，由于片段结构不同，电泳位置不同，因此片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。再次通过PCR扩增阳性菌株目的片段，并连接到PMD19-T载体测序，通过序列比对，碱基序列发生突变的序列验证菌株的等位替换成功，并被命名为YPL-4-010。
SSCP电泳PAGE的制备及条件
实施例3 L-赖氨酸发酵实验
将实施例2构建的菌株YPL-4-010和原始菌株YP97158在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(购自上海百仑生物科技有限公司)中以表1所示的培养基和表2所示的控制工艺进行发酵实验。每个菌株重复三次，结果如表3所示。
表1发酵培养基配方
| 成分 | 配方 |
| 淀粉水解糖 | 30g/L |
| 硫酸铵 | 12g/L |
| 硫酸镁 | 0.87g/L |
| 糖蜜 | 20g/L |
| 酸化玉米浆 | 3mL/L |
| 磷酸 | 0.4mL/L |
| 氯化钾 | 0.53g/L |
| 消泡剂(2％泡敌) | 4mL/L |
| 硫酸亚铁 | 120mg/L |
| 硫酸锰 | 120mg/L |
| 烟酰胺 | 42mg/L |
| 泛酸钙 | 6.3mg/L |
| 维生素B1 | 6.3mg/L |
| 铜、锌盐溶液 | 0.6g/L |
| 生物素 | 0.88mg/L |
表2发酵控制工艺
表3L-赖氨酸发酵实验结果
注：转化率＝(赖氨酸的总质量/葡萄糖的总消耗量)×100％
结果如表3所示，在谷氨酸棒杆菌中对dapB基因启动子进行点突变PdapB(C (-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)，有助于L-赖氨酸产量的提高。
SEQUENCE LISTING
<110> 黑龙江伊品生物科技有限公司
<120> 一种dapB基因改造的重组菌株及其构建方法与应用
<130> CPCN20410446
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 192
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 1
cttaagtctc atatttcaaa catagttcca cctgtgtgat taatccctag aacggaacaa 60
actgatgaac aatcgttaac aacacagacc aaaacggtca gttaggtatg gatatcagca 120
ccttctgaac gggtacgtct agactggtgg gcgtttgaaa aactcttcgc cccacgaaaa 180
tgaaggagca ta 192
<210> 2
<211> 192
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
cttaagtctc atatttcaaa catagttcca cctgtgtgat taatccctag aacggaacaa 60
actgatgaac aatcgttaac aacacagacc aaaacggtca gttaggtatg gatatcagca 120
ccttctgaac gggttgtggt ataatggtgg gcgtttgaaa aactcttcgc cccacgaaaa 180
tgaaggagca ta 192
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
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<223> 人工序列
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ccaccattat accacaaccc gttcagaagg 30
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<212> DNA
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<223> 人工序列
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
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<400> 7
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 8
caaacatagt tccacctgtg 20
Claims (7)
1.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株的宿主菌株是YP97158，仅对其dapB基因的启动子核苷酸序列进行突变，得到的突变后启动子核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述重组菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)改造如SEQ ID NO:1所示的启动子区域，使其第-49位、第-51位和第-54～-58位碱基发生突变，得到包含突变的启动子区域的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
(2)将所述突变的启动子区域核苷酸序列与质粒连接，构建重组载体；
(3)将所述重组载体导入宿主菌株，得到所述包含突变的启动子区域的产L-赖氨酸重组菌株。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：设计两对扩增dapB基因的启动子区域的引物，通过PCR技术得到突变的启动子区域核苷酸序列，所述引物为：
P1:5'CCGGAATTCACCATGCCGGACATGCGGAC3'(EcoR I)(SEQ ID NO:3)
P2:5'CCTTCTGAACGGGTTGTGGTATAATGGTGG 3'(SEQ ID NO:4)
P3:5'CCACCATTATACCACAACCCGTTCAGAAGG 3'(SEQ ID NO:5)
P4:5'ACATGCATGCGAATATTGACGTTGAGGAAG 3'(Sph I)(SEQ ID NO:6)。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4，进行PCR扩增，获得两条含有点突变的DNA片段；以上述两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过重叠PCR扩增，得到包含SEQ ID NO:2的DNA片段。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，将步骤(1)通过重叠PCR扩增获得的DNA片段，与穿梭质粒相连接，获得等位替换重组载体。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述穿梭质粒为pK18mobsacB质粒。
7.一种生产L-赖氨酸的方法，其特征在于，用权利要求1所述的重组菌株进行发酵，制备得到L-赖氨酸。
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