CN110592084A

CN110592084A - 一种rhtA基因启动子改造的重组菌株及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN110592084A
Application number: CN201910804035.3A
Authority: CN
Inventors: 孟刚; 魏爱英; 苏厚波; 杨立鹏; 赵春光; 周晓群
Original assignee: Inner Mongolia Iray Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Inner Mongolia Iray Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2019-08-28
Filing date: 2019-08-28
Publication date: 2019-12-20
Anticipated expiration: 2039-08-28
Also published as: CN110592084B

Abstract

本发明提供了一种核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的启动子以及包含该启动子的重组载体和重组菌株。本发明是在rhtA基因的野生型启动子的基础上引入点突变，使其‑67位碱基由腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G)。将改造后的启动子导入产L‑苏氨酸的大肠杆菌菌株中得到重组菌株，重组菌株与含rhtA基因的野生型启动子的菌株相比，可以提高rhtA基因的表达效率，提高L‑苏氨酸的产量，能进一步节约L‑苏氨酸的生产成本。

Description

一种rhtA基因启动子改造的重组菌株及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种rhtA基因启动子改造的重组菌株及其构建方法与应用。

背景技术

L-苏氨酸是八大必需氨基酸之一，且是人和动物自身不能合成的氨基酸。L-苏氨酸可以强化谷物吸收，调节体内代谢平衡，促进机体生长发育，被广泛应用于饲料、医药及食品工业中。

目前，L-苏氨酸生产主要有化学合成法、蛋白水解法和微生物发酵法，其中微生物发酵法生产成本低、生产强度高、对环境污染小，因而成为目前工业生产L-苏氨酸应用最广泛的方法。多种细菌可用于L-苏氨酸的微生物发酵生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型。然而，传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。因此，运用代谢工程手段构建重组大肠杆菌是生产L-苏氨酸的有效途径。

目前，利用表达质粒介导的氨基酸合成途径和竞争途径中关键性酶基因的过表达或弱化是对大肠杆菌进行基因改造的主要手段。但是仍然存在对开发以高产率更经济地生产L-苏氨酸的方法的需要。

发明内容

本发明提供一种启动子，其包括SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列上游第-67位碱基发生突变而形成的核苷酸序列。

根据本发明，所述突变是指所述位点的碱基发生变化，所述突变方法可以选自诱变、PCR 定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。

根据本发明，所述突变为SEQ ID NO:1中第-67位碱基由腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G)；具体地，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供一种表达盒，所述表达盒包括上述启动子和rhtA基因的编码核苷酸序列。作为本发明的一个实施方案，所述启动子位于rhtA基因编码核苷酸序列的5’上游，组成表达盒。

本发明中，所述rhtA基因的编码核苷酸序列包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

本发明提供一种重组载体，包括上述启动子。

根据本发明的重组载体，是将包括上述启动子的核苷酸序列导入质粒构建而成；作为一个实施方案，所述质粒为pKOV质粒。具体地，可以将所述启动子的核苷酸序列和所述质粒通过内切酶进行酶切，形成互补的粘性末端，将二者连接构建成重组载体。

本发明还提供一种重组菌株，包含上述启动子。

根据本发明的重组菌株，其包含SEQ ID NO:2所示的启动子核苷酸序列；进一步地，所述重组菌株包含如上所述的表达盒。

根据本发明的重组菌株，是将上述重组载体导入宿主菌株中重组形成；所述宿主菌株没有特别的限定，可以选自本领域已知的保留rhtA基因的产L-苏氨酸菌株，例如选自大肠杆菌。作为本发明的一个实施方案，所述宿主菌株为E.coli K12、或其衍生菌株E.coli K12(W3110) 菌株、E.coli CGMCC 7.232菌株。

根据本发明的重组菌株，是以pKOV质粒为载体。

根据本发明的重组菌株，其可以进一步包括或者不包括其他改造。

本发明还提供一种重组菌株的构建方法，包括如下步骤：

改造如SEQ ID NO:1所示的启动子区域，使其第-67位碱基发生突变，得到包含点突变的启动子的重组菌株。

根据本发明的构建方法，所述改造包括诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。

根据本发明的构建方法，所述突变是指SEQ ID NO:1中第-67位碱基由腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G)；具体地，所述包含点突变的rhtA基因启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO:2 所示。

进一步地，所述构建方法包括如下步骤：

(1)改造如SEQ ID NO:1所示的rhtA基因的野生型启动子区域，使其-67位碱基发生突变，得到突变的启动子区域核苷酸序列；

(2)将所述突变的启动子区域核苷酸序列与质粒连接，构建重组载体；

(3)将所述重组载体导入宿主菌株，得到包含突变的启动子区域的重组菌株。

根据本发明，所述步骤(1)中，使所述碱基发生突变的方法包括诱变、PCR定点突变或同源重组，优选PCR定点突变法。

根据本发明，所述步骤(1)包括：

根据genebank中野生型rhtA基因启动子序列，合成两对扩增rhtA基因启动子区片段的引物，通过等位基因置换在宿主菌株背景中的rhtA基因启动子区。

在本发明的一个实施方案中，所述引物为：

P1:5'CGGGATCCTCGCTGGTGTCGTGTTTGTAGG 3'(划线部分为限制性内切酶酶切位点BamH I)(SEQ ID NO:5)

P2:5'TATACCCAATGCTGGTCGAG 3'(SEQ ID NO:6)

P3:5'CGACCAGCATTGGGTATATC 3'(SEQ ID NO:7)

P4:5'AAGGAAAAAAGCGGCCGCCGAAAATTAACGCTGCAATCAAC 3'(划线部分为限制性内切酶酶切位点Not I)(SEQ ID NO:8)。

在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)包括：以E.coli K12为模板，分别以引物 P1和P2、P3和P4，进行PCR扩增，获得两条含有rhtA基因启动子区分离的DNA片段，大小为690bp及640bp，即PrhtA^(A(-67)G)-Up和PrhtA^(A(-67)G)-Down片段；以上述两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过重叠PCR扩增(Overlap PCR)，所述重叠PCR扩增按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸60s(30个循环)，获得 PrhtA^(A(-67)G)-Up-Down片段。

根据本发明，所述步骤(2)包括：对于PrhtA^(A(-67)G)-Up-Down片段进行琼脂糖凝胶电泳和分离纯化，将上述片段用BamH I/Not I双酶切后，与EcoR I/Sph I双酶切后的质粒相连接，获得等位替换的重组载体。

在本发明的一个实施方案中，所述步骤(3)的转化为电转化法。

本发明还提供如上所述的构建方法所获得的重组菌株。

本发明提供如上所述的重组菌株在L-苏氨酸制备中的应用。

根据本发明所述的重组菌株在L-苏氨酸制备中的应用，包括采用所述重组菌株进行发酵，制备得到L-苏氨酸。

有益效果

本发明通过对产L-苏氨酸菌株中rhtA基因启动子序列引入点突变，获得重组型菌株，所获得的菌株与未突变的野生型菌株相比，有利于生产高浓度的L-苏氨酸，且菌株稳定性好，作为L-苏氨酸生产菌株能够进一步降低生产成本。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。但本领域技术人员了解，本发明的保护范围不仅限于以下实施例。根据本发明公开的内容，本领域技术人员将认识到在不脱离本发明技术方案所给出的技术特征和范围的情况下，对以上所述实施例做出许多变化和修改都属于本发明的保护范围。

实施例1包含点突变的rhtA基因启动子的转化载体pKOV-PrhtA^(A(-67)G)的构建

苏氨酸和高丝氨酸外排蛋白(RHTA酶)由rhtA基因编码，在E.coli K12菌株及其衍生菌株 (如W3110等)中，野生型的rhtA基因启动子序列PrhtA如Genbank登录号为AP009048.1中序列 850520-850871所示。依据该序列设计并合成两对扩增启动子PrhtA的引物，构建载体用于将出发菌株中PrhtA启动子的碱基序列上游第-67位碱基A变为G。引物设计如下(由上海invitrogen 公司合成)：

P2:5'TATACCCAATGCTGGTCGAG 3'(SEQ ID NO:6)

P3:5'CGACCAGCATTGGGTATATC 3'(SEQ ID NO:7)

构建方法为：以野生型菌株E.coli K12基因组为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4进行 PCR扩增，获得含有点突变的、长度分别为690bp和640bp的两条DNA片段(PrhtA^(A ^(-67)G)-Up和 PrhtA^(A(-67)G)-Down片段)。PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL， Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL，所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，(94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环)， 72℃过度延伸10min。

将上述两条DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以纯化后的两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过Overlap PCR扩增出长度约为1310bp的片段(PrhtA^(A(-67)G)-Up-Down 片段)。

PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物 (10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL，所述Overlap PCR按如下方式进行：94℃ 变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸60s(30个循环)。

将上述PrhtA^(A(-67)G)-Up-Down片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化，然后将其和pKOV质粒(购自Addgene公司)分别用BamH I/Not I双酶切，将酶切后的PrhtA^(A(-67)G)-Up-Down片段和pKOV质粒经琼脂糖凝胶电泳分离纯化并连接，获得载体pKOV-PrhtA^(A(-67)G)。将载体pKOV-PrhtA^(A(-67)G)送测序公司进行测序鉴定，将含有正确的点突变(PrhtA^(A(-67)G))的载体pKOV-PrhtA^(A(-67)G)保存备用。

实施例2包含点突变点PrhtA^(A(-67)G)的工程菌株的构建

野生型大肠杆菌菌株E.coli K12(W3110)和高产L-苏氨酸的菌株E.coli CGMCC7.232(保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心)的染色体上均保留了野生型的PrhtA启动子。将构建好的质粒pKOV-PrhtA^(A(-67)G)分别转入E.coli K12(W3110)和E.coli CGMCC7.232，通过等位基因置换，将这两个菌株染色体中的PrhtA启动子的碱基序列上游第-67位碱基A变为G。具体过程为：将质粒pKOV-PrhtA^(A(-67)G)通过电击转化转入宿主菌感受态细胞后，加入0.5mL的SOC 液体培养基；在30℃、100rpm的摇床中复苏2h；取100μL培养液涂布于氯霉素含量为34μg/mL 的LB固体培养基，30℃培养18h；挑选长出的单克隆菌落，接种于10mL LB液体培养基中， 37℃、200rpm培养8h；取100μL培养液涂布于氯霉素含量为34μg/mL的LB固体培养基，42℃ 培养12h；挑选1-5个单菌落接种于1mL LB液体培养基中，37℃、200rpm培养4h；取100μL培养液涂布于含有10％蔗糖的LB固体培养基，30℃培养24h；挑选单克隆，并一一对应划线于 LB固体培养基和氯霉素含量为34μg/mL的LB固体培养基；挑选在LB固体培养基上生长，同时在氯霉素含量为34μg/mL的LB固体培养基不能生长的对应菌株进行PCR扩增鉴定。PCR扩增采用如下引物(上海invitrogen公司合成)：

P5:5'ATACACCGCTATCCATCT 3'(SEQ ID NO:9)

P6:5'AACCAGGCATCCTTTCTC 3'(SEQ ID NO:10)

上述PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL，所述PCR扩增按如下方式进行：94℃ 预变性5min，(94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环)，72℃过度延伸10min。 PCR扩增产物进行SSCP(单链构象多态性，Single-Strand ConformationPolymorphism)电泳，以质粒pKOV-PrhtA^(A(-67)G)扩增片段为阳性对照，野生型大肠杆菌扩增片段为阴性对照，水作为空白对照。在SSCP电泳中，长度相同而序列排列不同的单链寡核苷酸链在冰浴中形成的空间结构不同，电泳时迁移率也会有所差异。所以，片段的电泳位置与阴性对照片段位置不一致，且与阳性对照片段位置一致的菌株即为等位替换成功的菌株。以等位替换成功的菌株为模板，用引物P5和P6再次通过PCR扩增目的片段，并将目的片段连接到pMD19-T载体，测序。通过测序结果序列比对，PrhtA启动子的碱基序列上游第-67位碱基A变为G的重组子即为改造成功的菌株。将来自E.coli K12(W3110)的重组子命名为YPThr01，将来自E.coli CGMCC 7.232的重组子命名为YPThr02。

实施例3苏氨酸发酵实验

将E.coli K12(W3110)菌株、E.coli CGMCC 7.232菌株以及突变菌株YPThr01、YPThr02 分别接种在25mL表1所述的液体培养基中，于37℃、200rpm培养12h。然后，分别取1mL各菌株的培养物接种在25mL表1所述的液体培养基中，于37℃、200rpm发酵培养36h。通过HPLC 测定L-苏氨酸的含量，每株菌做三个平行实验，计算平均值，检测结果见表2。

表1 培养基配方

成分	配方g/L
		葡萄糖	40
硫酸铵	12
		磷酸二氢钾	0.8
七水硫酸镁	0.8
		七水硫酸亚铁	0.01
一水硫酸锰	0.01
		酵母提取物	1.5
碳酸钙	0.5
		L-甲硫氨酸	0.5
氢氧化钾调节pH值	pH 7.0

表2 苏氨酸发酵实验结果

由表2结果所示，无论对于高产还是低产L-苏氨酸的原始菌株，rhtA基因的启动子序列 PrhtA的第-67位碱基A突变为G，都有助于L-苏氨酸产量的提高。

序列表

<110> 内蒙古伊品生物科技有限公司

<120> 一种rhtA基因启动子改造的重组菌株及其构建方法与应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 355

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cataaccacc tcaaatgtga ttcaaataag tcctaagttt taaatatatc aaaaattaat 60

gggaaactct tcgcgatttg tgatgtctaa cgggccattt catgtaacag aacgtttcca 120

tacaccgcta tccatctaaa tttaaatcac tttttcagag aactgcgtaa gtattacgca 180

tgttttccct gtcattcatc cagattattc ctaatcacca gactaatgat tccatcaatc 240

ctggcgcatt ttagtcaaaa cgggggaaaa ttttttcaac aaatgctcaa ccagcattgg 300

gtatatccag tacactccac gctttactta agtctagata tttgtgggag aaagg 355

<210> 2

<211> 355

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cataaccacc tcaaatgtga ttcaaataag tcctaagttt taaatatatc aaaaattaat 60

gggaaactct tcgcgatttg tgatgtctaa cgggccattt catgtaacag aacgtttcca 120

tacaccgcta tccatctaaa tttaaatcac tttttcagag aactgcgtaa gtattacgca 180

tgttttccct gtcattcatc cagattattc ctaatcacca gactaatgat tccatcaatc 240

ctggcgcatt ttagtcaaaa cgggggaaaa ttttttcaac aaatgctcga ccagcattgg 300

gtatatccag tacactccac gctttactta agtctagata tttgtgggag aaagg 355

<210> 3

<211> 888

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 3

atgcctggtt cattacgtaa aatgccggtc tggttaccaa tagtcatatt gctcgttgcc 60

atggcgtcta ttcagggtgg agcctcgtta gctaagtcac tttttcctct ggtgggcgca 120

ccgggtgtca ctgcgctgcg tctggcatta ggaacgctga tcctcatcgc gttctttaag 180

ccatggcgac tgcgctttgc caaagagcaa cggttaccgc tgttgtttta cggcgtttcg 240

ctgggtggga tgaattatct tttttatctt tctattcaga cagtaccgct gggtattgcg 300

gtggcgctgg agttcaccgg accactggcg gtggcgctgt tctcttctcg tcgcccggta 360

gatttcgtct gggttgtgct ggcggttctt ggtctgtggt tcctgctacc gctggggcaa 420

gacgtttccc atgtcgattt aaccggctgt gcgctggcac tgggggccgg ggcttgttgg 480

gctatttaca ttttaagtgg gcaacgcgca ggagcggaac atggccctgc gacggtggca 540

attggttcgt tgattgcagc gttaattttc gtgccaattg gagcgcttca ggctggtgaa 600

gcactctggc actggtcggt tattccattg ggtctggctg tcgctattct ctcgaccgct 660

ctgccttatt cgctggaaat gattgccctc acccgtttgc caacacggac atttggtacg 720

ctgatgagca tggaaccggc gctggctgcc gtttccggga tgattttcct cggagaaaca 780

ctgacaccca tacagctact ggcgctcggc gctatcatcg ccgcttcaat ggggtctacg 840

ctgacagtac gcaaagagag caaaataaaa gaattagaca ttaattaa 888

<210> 4

<211> 295

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 4

Met Pro Gly Ser Leu Arg Lys Met Pro Val Trp Leu Pro Ile Val Ile

1 5 10 15

Leu Leu Val Ala Met Ala Ser Ile Gln Gly Gly Ala Ser Leu Ala Lys

20 25 30

Ser Leu Phe Pro Leu Val Gly Ala Pro Gly Val Thr Ala Leu Arg Leu

35 40 45

Ala Leu Gly Thr Leu Ile Leu Ile Ala Phe Phe Lys Pro Trp Arg Leu

50 55 60

Arg Phe Ala Lys Glu Gln Arg Leu Pro Leu Leu Phe Tyr Gly Val Ser

65 70 75 80

Leu Gly Gly Met Asn Tyr Leu Phe Tyr Leu Ser Ile Gln Thr Val Pro

85 90 95

Leu Gly Ile Ala Val Ala Leu Glu Phe Thr Gly Pro Leu Ala Val Ala

100 105 110

Leu Phe Ser Ser Arg Arg Pro Val Asp Phe Val Trp Val Val Leu Ala

115 120 125

Val Leu Gly Leu Trp Phe Leu Leu Pro Leu Gly Gln Asp Val Ser His

130 135 140

Val Asp Leu Thr Gly Cys Ala Leu Ala Leu Gly Ala Gly Ala Cys Trp

145 150 155 160

Ala Ile Tyr Ile Leu Ser Gly Gln Arg Ala Gly Ala Glu His Gly Pro

165 170 175

Ala Thr Val Ala Ile Gly Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ile Phe Val Pro

180 185 190

Ile Gly Ala Leu Gln Ala Gly Glu Ala Leu Trp His Trp Ser Val Ile

195 200 205

Pro Leu Gly Leu Ala Val Ala Ile Leu Ser Thr Ala Leu Pro Tyr Ser

210 215 220

Leu Glu Met Ile Ala Leu Thr Arg Leu Pro Thr Arg Thr Phe Gly Thr

225 230 235 240

Leu Met Ser Met Glu Pro Ala Leu Ala Ala Val Ser Gly Met Ile Phe

245 250 255

Leu Gly Glu Thr Leu Thr Pro Ile Gln Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ile

260 265 270

Ile Ala Ala Ser Met Gly Ser Thr Leu Thr Val Arg Lys Glu Ser Lys

275 280 285

Ile Lys Glu Leu Asp Ile Asn

290 295

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgggatcctc gctggtgtcg tgtttgtagg 30

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tatacccaat gctggtcgag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgaccagcat tgggtatatc 20

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaggaaaaaa gcggccgccg aaaattaacg ctgcaatcaa c 41

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atacaccgct atccatct 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaccaggcat cctttctc 18

Claims

1.一种启动子，其包括SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列上游第-67位碱基发生突变而形成的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的启动子，所述突变为SEQ ID NO:1中第-67位碱基由腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G)；具体地，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.表达盒，包括权利要求1或2所述的启动子，以及rhtA基因的编码核苷酸序列。

4.重组载体，包括权利要求1或2所述的启动子；

优选地，所述重组载体是将权利要求1或2所述的启动子的核苷酸序列导入质粒构建而成。

5.重组菌株，包括权利要求1或2所述的启动子；

优选地，所述重组菌株中，SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列位于rhtA基因编码核苷酸序列的5’上游。

6.根据权利要求5所述的重组菌株，是将权利要求4的重组载体导入宿主菌株中重组形成；优选地，所述宿主菌株为大肠杆菌，例如所述宿主菌株选自E.coli K12或其衍生菌株E.coli K12(W 3110)、E.coli CGMCC 7.232菌株。

7.一种重组菌株的构建方法，包括如下步骤：

改造如SEQ ID NO:1所示的启动子区域，使其第-67位碱基发生突变，并且可调节地与rhtA基因编码序列连接，得到包含点突变的启动子的重组菌株；

优选地，所述突变是指SEQ ID NO:1中第-67位碱基由腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G)，突变后的启动子区域核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

优选地，所述构建方法包括如下步骤：

(1)改造如SEQ ID NO:1所示的启动子区域，使其-67位核苷酸发生突变，得到突变的启动子区域核苷酸序列；

(3)将所述重组载体导入宿主菌株，得到所述包含突变的启动子区域的重组菌株。

8.根据权利要求7所述的构建方法，所述步骤(1)包括：

根据genebank中野生型启动子序列，合成两对扩增启动子区片段的引物，通过等位基因置换在宿主菌株背景中的rhtA基因启动子区，所述步骤(1)的引物为：

P1:SEQ ID NO:5，P2:SEQ ID NO:6，P3:SEQ ID NO:7，P4:SEQ ID NO:8；

优选地，所述步骤(1)包括以E.coli K12为模板，分别以引物P1和P2、P3和P4，进行PCR扩增，获得两条含有rhtA基因启动子区分离的DNA片段，为PrhtA^(A(-67)G)-Up和PrhtA^(A(-67)G)-Down片段；以所述DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过重叠PCR扩增，获得PrhtA^(A(-67)G)-Up-Down片段；优选地，所述PrhtA^(A(-67)G)-Up和PrhtA^(A(-67)G)-Down片段大小为690bp及640bp。

9.根据权利要求1或2所述的启动子在提高L-苏氨酸产量或者制备L-苏氨酸中的应用。

10.权利要求5或6所述的重组菌株在制备L-苏氨酸中的应用，优选地，将所述重组菌株作为菌种进行发酵制备L-苏氨酸。