BR0207284B1 - BACTÉRIAS CORINEFORMES COM GENE rpsL SUPEREXPRESSO E PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO FERMENTADORA DE L-LISINA - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "BACTÉRIAS

CORINEFORMES COM GENE rpsL SUPEREXPRESSO E PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO FERMENTADORA DE L-LISINA".

Campo da Invenção A invenção refere-se a sequências de nucleotídeos a partir de bactéria corineforme a qual codifica o gene rpsL e um processo para a pre- paração fermentai iva de aminoácidos usando bactérias nas quais o gene rpsL é acentuado. Técnica Anterior L-Aminoácidos, em particular L-lisina, são usados em medicina humana e na indústria farmacêutica, na indústria de gêneros alimentícios, e muito particularmente em nutrição animal. É conhecido que aminoácidos são preparados por fermentação a partir de cepas de bactéria corineforme, em particular Corynebacterium gtuta- micum. Devido a sua grande importância, trabalho está constantemente sendo empreendido para melhorar a preparação dos procedimentos. Melhorias ao processo podem descrever as medidas de fermentação, tal como, por exemplo, agitação e fornecimento de oxigênio, ou a composição do meio nutriente, tal como, por exemplo, a concentração de açúcar durante a fermentação, o avan- ço gradual à forma do produto por, por exemplo, cromatograüa de troca de tôni- ca, ou as propriedades de saída intrínsecas do próprio microorganismo. Métodos de mutagênese, seleção e seleção de mutante são u- sados para melhorar as propriedades de saída destes microorganismos. Ce- pas as quais são resistentes a antimetabólitos ou são auxotrópicas a meta- bólitos de importância reguladora e produzem aminoácidos são obtidas des- te modo. Métodos da técnica de DNA recombinante foram também em- pregados por alguns anos para melhorar a cepa de cepas de Corynebacteri- um as quais produzem L-aminoácido, ampliando genes de biossíntese de aminoácido individual e investigando o efeito na produção de amínoácido.

Objetivo da Invenção Os inventores tinham o objetivo de fornecer novas medidas para preparação fermentiva aperfeiçoada de aminoácidos.

Sumário da Invenção Onde L-aminoácidos ou aminoácidos são mencionados a seguir, isto significa um ou mais aminoácidos, incluindo seus sais, escolhidos do grupo consistido em L-asparagina, L-treonina, L-serina, L-glutamato, L-glicina, L-ala- nina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-feni- lalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptofano e L-arginina. L-lisina é particular- mente preferida.

Quando L-lisina ou lisina é mencionada a seguir, não somente as bases mas também os sais, tais como por exemplo monohidrocloreto de lisina ou sulfato de lisina, são entendidos por isto. A invenção refere-se a um polinucleotídeo isolado de bactéria corineforme, compreendendo uma seqüência de polinucleotídeo a qual codi- fica o gene rpsL escolhida do grupo consistindo em a) polinucleotídeo o qual é idêntico à extensão em pelo menos 70 % a um polinucleotídeo o qual codifica um polipeptídeo o qual compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID N° 2, b) polinucleotídeo o qual codifica um polipeptídeo o qual com- preende uma seqüência de aminoácido a qual é idêntica à extensão em pelo menos 70 % à seqüência de aminoácido de SEQ ID Ns 2, c) polinucleotídeo o qual é complementar aos polinucleotídeos de a) ou b), e d) polinucleotídeo compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos sucessivos da seqüência de polinucleotídeo de a), b) ou c), o polipeptídeo preferivelmente tendo a atividade da proteína ri- bossomal S12. A invenção também fornece o polinucleotídeo acima menciona- do, este preferivelmente sendo um DNA o qual é capaz de reprodução, compreendendo: (i) a seqüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID N- 1, ou (ii) pelo menos uma seqüência a qual corresponde a seqüência (i) dentro do limite da degeneração do código genético, ou (iü) pelo menos uma seqüência a qual hibridiza com a seqüên- cia complementar à seqüência (i) ou (ii), e optativamente (iv) mutações de sentido de função neutra em (i) a qual não modifica a atividade da proteína/polipeptídeo Finalmente, a invenção também fornece polinucleotídeos esco- lhidos do grupo consistindo em a) polinucleotídeos compreendendo pelo menos 15 nucleotí- deos sucessivos escolhidos a partir da seqüência de nucle- otídeos de SEQ ID N9 1 entre posições 1 e 499, b) polinucleotídeos compreendendo pelo menos 15 nucleotí- deos sucessivos escolhidos a partir da seqüência de nucle- otídeos de SEQ ID Ns 1 entre posições 500 e 883, c) polinucleotídeos compreendendo pelo menos 15 nucleotí- deos sucessivos escolhidos a partir da seqüência de nucle- otídeos de SEQ ID N9 1 entre posições 884 e 1775. A invenção também fornece um polinucleotídeo, em particular DNA, o qual é capaz de reprodução e compreende a seqüência de nucleotí- deo como mostrado em SEQ ID Ns 1; um polinucleotídeo o qual codifica um polipeptídeo o qual com- preende a seqüência de aminoácido como mostrada em SEQ ID Ne 2; um vetor contendo o polinucleotídeo de acordo com a invenção, em particular um vetor híbrido ("shuttle vetor") ou vetor de plasmídeo, e bacté- ria corineforme a qual contém o vetor ou na qual o gene rpsL é acentuado. A invenção também fornece polinucleotídeos os quais substan- cialmente compreendem uma seqüência de polinucleotídeo, os quais são obteníveis peneirando por meios de hibridização de uma biblioteca de gene correspondente de uma bactéria corineforme, a qual compreende o gene completo ou partes disso, com uma sonda a qual compreende a seqüência do polinucleotídeo de acordo com a invenção de acordo com SEQ ID N9 1 ou um fragmento disso, e isolamento da seqüência de polinucleotídeo men- cionada.

Descrição Detalhada da Invenção Polinucleotídeos os quais compreendem as seqüências de acor- do com a invenção são adequados como sondas de hibridização para RNA, cDNA e DNA, a fim de isolar, no comprimento total, ácidos nucléicos ou poli- nucleotídeos ou genes os quais codificam a proteína ribossomal S12 ou iso- lar aqueles ácidos nucléicos ou polinucleotídeos ou genes os quais têm uma alta similaridade com a seqüência do gene rpsL. Eles podem também ser aplicados como uma sonda em supostos "arranjos", "micro arranjos" ou "chips de DNA" a fim de detectar e determinar os polinucleotídeos ou seqüências cor- respondentes derivados disso, tais como por exemplo RNA ou cDNA.

Polinucleotídeos os quais compreendem as seqüências de acor- do com a invenção são além disso adequados como iniciadores com o auxí- lio do qual DNA de genes os quais codificam a proteína ribossomal S12 pode ser preparado pela reação de cadeia de polimerase (PCR).

Tais oligonucleotídeos os quais servem como sondas ou inicia- dores compreendem pelo menos 25, 26, 27, 28, 29 ou 30, preferivelmente pelo menos 20, 21, 22, 23 ou 24, muito particularmente preferivelmente pelo menos 15, 16, 17, 18 ou 19 nucleotídeos sucessivos. Oligonucleotídeos com um comprimento de pelo menos 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40, ou pelo menos 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 nucleotídeos são também adequados. Oligonucleotídeos com um comprimento de pelo menos 100, 150, 200, 250 ou 300 nucleotídeos são optativamente também adequados. "Isolado" significa separado de seu meio ambiente natural. "Polinucleotídeo" em geral refere-se a polirribonucleotídeos e polideoxirribonucleotídeos, sendo possível para estes serem RNA ou DNA não modificados ou RNA ou DNA modificados.

Os polinucleotídeos de acordo com a invenção incluem um poli- nucleotídeo de acordo com SEQ ID N® 1 ou fragmento preparado disso e também aqueles os quais são pelo menos em particular 70% a 80%, preferi- velmente pelo menos 81% a 85%, particularmente preferivelmente pelo me- nos 86% a 90%, e muito a invenção particularmente preferivelmente pelo menos 91%, 93%, 95%, 97% ou 99% idênticos ao polinucleotídeo de acordo com SEQ ID Nõ 1 ou um fragmento preparado disso. "Polipeptídeos" são compreendidos como significando peptídeos ou proteínas os quais compreendem dois ou mais aminoácidos ligados via ligações de peptídeos.

Os polipeptídeos de acordo com a invenção incluem um poli- peptídeo de acordo com SEQ ID Ne 2, em particular aqueles com a atividade biológica da proteína ribossomal S12 e também aqueles os quais são pelo menos 70% a 80%, preferivelmente pelo menos 81% a 85%, particularmente preferivelmente pelo menos 86% a 90%, e muito particularmente preferivel- mente pelo menos 91%, 93%, 95%, 97% ou 99% idênticos ao peptídeo de acordo com SEQ ID Ne 2 e têm a atividade mencionada. A invenção além disso refere-se a um processo para a preparação fermentiva dos aminoácidos escolhidos do grupo consistido em L-asparagina, L-treonina, L-serina, L-glutamato, L-glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina L-histidina, L-lisina, L-triptofano e L-arginina usando bactéria corineforme a qual em par- ticular já produz aminoácidos e na qual as seqüências de nucleotí- deo,preferivelmente endógenos, os quais codificam o gene rpsL são acentu- ados, em particular superexpressaram. O termo "intensificação" nesta conexão descreve o aumento na atividade intracelular de uma ou mais enzimas ou proteínas em um microor- ganismo as quais são codificadas pelo DNA correspondente, por exemplo aumentando o número de cópias do gene ou genes, usando um promotor potente ou usando um gene ou alelo o qual codifica uma enzima ou proteína correspondente com uma alta atividade, e optativamente combinando estas medidas.

Por medidas de intensificação, em particular superexpressão, a atividade ou concentração da proteína correspondente é em geral aumenta- da por pelo menos 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% ou 500%, até um máximo de 1000% ou 2000%, baseado naquela da proteí- na do tipo selvagem ou na atividade ou concentração da proteína no micro- organismo inicial.

Os microorganismos os quais a presente invenção fornece po- dem produzir L-aminoácidos de glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido, celulose ou de glicerol e etanol. Eles podem ser representa- tivos de bactéria corineforme, em particular do gênero Corynebacterium. Dos gêneros Corynebacterium, a esse respeito pode ser mencionado em parti- cular as espécies Corynebacterium glutamicum, a qual é conhecida entre versados por sua capacidade de produzir L-aminoácidos.

Cepas adequadas do gênero Corynebacterium, em particular das espécies Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), são em parti- cular as cepas do tipo selvagem conhecidas Corynebacterium glutamicum ATC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Corynebacterium melassecola ATCC17965 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 e Brevibacterium divaricatum ATCC14020 e mutantes ou cepas produtoras de L-aminoácidos preparados disso, tais como, por exemplo,as cepas produtoras de L-lisina Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 Corynebacterium glutamicum DM58-1 Corynebacterium glutamicum DG52-5 Corynebacterium glutamicumDSMJI 5 e Corynebacterium glutamicum DSM12866. O novo gene rpsL de C. glutamicum o qual codifica a proteína ribossomal S12 foi isolado.

Para isolar o gene rpsL ou também outros genes de C. glutami- cum, uma biblioteca de gene deste microorganismo é primeiro organizada em Escherichia coli (C. glutamicum). A organização de bibliotecas de gene é descrita em livros textos e manuais geralmente conhecidos.O livro texto por Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie [Genes and Clones, Na Introduction to Genetic Engineering] (Verlag Chemie, Wei- nheim, Alemanha, 1990), ou o manual por Sambrook e outros: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) podem ser mencionados como um exemplo. Uma biblioteca de gene bem conhecida é aquela da C. glutamicum K-12 cepa W3110 organizada em ve- tores λ por Kohara e outros (Cell 50, 495 - 508 (1987)). Bathe e outros (Mo- lecular and General Genetics, 252:255-265, 1996) descreve uma biblioteca de gene de C. glutamicum ATCC13032, a qual foi organizada com o auxílio do vetor cosmido SuperCos I (Wahl e outros, 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164) na C. glutamicum K-12 cepa NM554 (Raleigh e outros, 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575). Bõrmann e outros (Molecular Microbiology 6(3), 317-326) (1992)) su- cessivamente descrevem uma biblioteca de gene de C. glutamicum ATCC13032 usando o cosmido pHC79 (Hohn e Collins, Gene 11,291-298 (1980)).

Para preparar uma biblioteca de gene de C. glutamicum em C. glutamicum é também possível usar plasmídeos tais como pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) ou pUC9 (Vieira e outros, 1982, Gene, 19:259-268). Hospedeiros adequados são, em particular, aquelas cepas de C. glutamicum as quais são defeituosas em restrição e em recombinação.

Um exemplo destas é a cepa DH5ocmcr, a qual foi descrita por Grant e ou- tros (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649). Os fragmentos de DNA longos clonados com o auxílio de cos- mídeos podem sucessivamente ser subclonados nos vetores comuns ade- quados para seqüenciamento e então seqüenciados, conforme é descrito por exemplo por Sanger e outros (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of América, 74:5463-5467, (1977).

As seqüências de DNA resultantes podem então ser investigadas com algoritmos conhecidos ou programas de análise de sequência, tais como por exemplo aqueles de Staden (Nucleic Acids Research 14, 217-232 (1986)), aquele de Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988)) ou o pro- grama GCG de Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998)). A nova seqüência de DNA de C. glutamicum a qual codifica o gene rpsL e a qual, como SEQ ID Νθ 1, é um constituinte da presente inven- ção foi descoberta. A seqüência de aminoácido da proteína correspondente foi além disso derivada da presente seqüência de DNA pelos métodos des- critos acima. A seqüência de aminoácido resultante do produto de gene rpsL é mostrada em SEQ ID Ne 2. É conhecido que enzimas endógenas no hos- pedeiro podem separar-se da metionina ou formilmetionina do aminoácido N terminal da proteína formada.

Seqüências de DNA codificadoras as quais resultam de SEQ ID N° 1 pela degeneração do código genético são também um constituinte da invenção. Do mesmo modo, seqüências de DNA as quais hibridizam com SEQ ID Ne 1 ou partes de SEQ ID Ns 1 são um constituinte da invenção.

Trocas de aminoácidos conservativos, tais como por exemplo troca de glici- na por alanina ou de ácido aspártico por ácido glutâmico em proteínas, são além disso conhecidas entre versados como "mutações de sentido" as quais não levam a uma mudança fundamental na atividade da proteína, isto é são de função neutra. Tais mutações são também chamadas, inter alia, substi- tuições neutras. É, além disso, conhecido que mudanças na terminação no N e/ou C de uma proteína não podem substancialmente prejudicar ou podem ainda estabilizar a função disso. Informação neste contexto pode ser encon- trada pelo versado, inter alia, em Bem-Bassat e outros (Journal of Bacterio- l°gy 169:751-757 (1987)), em 0'Regan e outros (Gene 77:237-251 (1989)), em Sahin-Toch e outros (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), em Hochuli e outros (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)) e em livros textos conhecidos de genética e biologia molecular. Seqüências de aminoácido as quais resul- tam em um modo correspondente de SEQ ID Nõ 2 são também um consti- tuinte da invenção.

Do mesmo modo, seqüências de DNA as quais hibridizam com SEQ ID NQ 1 ou partes de SEQ ID Nõ 1 são um constituinte da invenção. Fi- nalmente, sequências de DNA as quais são preparadas pela reação de ca- deia de polimerase (PCR) usando iniciadores os quais resultam de SEQ ID

Ne 1 são um constituinte da invenção. Tais oligonucleotídeos tipicamente têm um comprimento de pelo menos 15 nucleotídeos.

Instruções para identificar seqüências de DNA por meios de hi- bridização podem ser encontradas pelo versado, inter alia, no manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" de Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemanha, 1993) e em Liebl e outros (International Jour- nal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260). A hibridização acontece sob condições severas, isto quer dizer somente híbridos nos quais a sonda e seqüência alvo, isto é os polinucleotídeos tratados com a sonda, são pelo menos 70% idênticos, são formados. É conhecido que severidade da hibridi- zação, incluindo as etapas de lavagem, é influenciada ou determinada vari- ando a composição compensadora, a temperatura e a concentração de sal. A reação de hibridização é preferivelmente realizada sob uma severidade relativamente baixa comparada com as etapas de lavagem (Hybaid Hybridi- sation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).

Um compensador 5x SSC a uma temperatura de aproximada- mente 50°C - 68°C, por exemplo, pode ser empregado para a reação de hibridização. Sondas podem também hibridizar aqui com polinucleotídeos os quais são menos do que 70% idênticos à seqüência da sonda. Tais híbridos são menos estáveis e são removidos por lavagem sob condições severas.

Isto pode ser alcançado, por exemplo, diminuindo a concentração de sal a 2x SSC e optativamente subseqüentemente 0,5x SSC (The Dig System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Ale- manha, 1995) uma temperatura de aproximadamente 50° - 68°C sendo es- tabelecida. É optativamente possível diminuir a concentração de sal a 0,1x SSC. Fragmentos de polinucleotídeo os quais são, por exemplo, pelo menos 70% ou pelo menos 80% ou pelo menos 90% a 95% idênticos à seqüência da sonda empregada podem ser isolados aumentando a temperatura de hi- bridização em forma de etapas de 50° a 68°C em etapas de aproximada- mente 1 - 2°C. Instruções adicionais em hibridização são obteníveis no mer- cado na forma dos chamados kits (por exemplo DIG Easy Hyb de Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha, Nõ de Catálogo 1603558).

Instruções para ampliação de sequências de DNA com o auxílio da reação de cadeia de polimerase (PCR) podem ser encontradas pelo ver- sado, inter alia, no manual por Gait: Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Ocford, UK, 1984) e em Newton e Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha, 1994).

Foi descoberto que bactéria corineforme produz aminoácidos em um modo aperfeiçoado após acentuação do gene rpsL.

Para concluir uma superexpressão, o número de cópias dos ge- nes correspondentes pode ser aumentado, ou o promotor e região de regu- lação ou o sítio de aglutinação de ribossoma a montante do gene estrutural pode ser mutado. Cassetes de expressão os quais são incorporados a montante do gene estrutural atuam do mesmo modo. Por promotores induzí- veis,é adicionalmente possível aumentar a expressão no curso de produção de aminoácido fermentador. A expressão é igualmente aumentada por me- didas para prolongar a vida do m-RNA. Além disso, a atividade da enzima é também aumentada prevenindo a degradação da proteína da enzima. Os genes ou construtos de gene podem ou estar presentes em plasmídeos com um número variante de cópias, ou podem ser integrados e ampliados no cromossomo. Alternativamente, uma superexpressão dos genes em questão pode além disso, ser alcançada alterando a composição do meio e o proce- dimento de cultura.

Instruções neste contexto podem ser encontradas pelo versado, inter alia, em Martin e outros (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), em Guerrero e outros (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya e Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), em Eikmanns e outros (Gene 102, 93-98 (1991)), no relató- rio descritivo de Patente Européia 0 472 869, em Patente US 4.601.893, em Schwarzer e Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), em Reinscheid e ou- tros (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994), em LaBar- re e outros (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), no pedido de Patente WO 96/15246, em Malumbres e outros (Gene 134, 15-24 (1993)), no relatório descritivo Japonês aberto à inspeção pública JP-A-10-229891, em Jensen e Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), em Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)) e em li- vros textos conhecidos de genética e biologia molecular.

Por meio de exemplo, para intensificação do gene rpsL de acor- do com a invenção foi superexpresso com o auxílio de plasmídeo epissomal.

Plasmídeos adequados são aqueles os quais são reproduzidos em bactéria corineforme. Numerosos vetores de plasmídeo conhecidos, tais como por exemplo pZ1 (Menkel e outros, Applied and Enviroment Microbiology (1989) 64: 549-554), pEXExl (Eikmanns e outros, Gene 102:93-98 (1991)) ou pHS2-1 (Sonnen e outros, Gene 107:69-74 (1991)) são baseados nos plasmídeos crípticos pHM1519, pBL1 ou pGA1. Outros vetores de plasmídeo, tais como, por exemplo, aqueles baseados em pCG4 (US-A 4.489.160), ou pNG2 (Serwold-Davis e outros, FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), ou pAG1 (US-A 5.158.891), podem ser usados do mesmo modo.

Vetores de plasmídeo os quais são, além disso, adequados são também aqueles com o auxílio dos quais o processo de ampliação de gene por integração no cromossomo pode ser usado, como foi descrito, por exemplo, por Reinscheid e outros (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994) por duplicação ou ampliação do hom-thrb operon. Neste método, o gene completo é clonado em um vetor de plasmídeo o qual pode reproduzir em um hospedeiro (tipicamente C. glutamicum), mas não em C. glutamicum. Vetores possíveis são, por exemplo, pSUP301 (Simon e outros, Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob ou ρΚ19πιοβ (Schàfer e ou- tros, Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, Wl, EUA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; US-A 5.487.993), pCR®Blunt (Invitrogen, Groningen, Holland;

Bernard e outros, Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf e outros, 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516) ou pBGS8 (Spratt e outros, 1986, Gene 41: 337-342). O vetor de plasmídeo o qual contém o gene a ser ampliado é então transferido na cepa desejada de C. glutamicum por conjugação ou transformação. O método de conjugação é descrito, por exemplo, por Scháfer e outros (Applied and Environmental Mi- crobiology 60, 756-759 (1994)). Métodos para transformação são descritos, por exemplo, por Thierbach e outros (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunicam e Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) e Tauch e outros (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)). Após recombinação homóloga por meios de um evento de "cruzamento", a cepa resultante contém pelo menos duas cópias do gene em questão.

Foi, além disso, descoberto que mudanças de aminoácidos na seção entre posição 38 a 48 da seqüência de aminoácido da proteína ribos- somal S12 mostrada em SEQ ID Ns 2 melhora a produção de lisina de bac- téria corineforme.

Preferivelmente, L-lisina na posição 43 é trocada por muitos ou- tros aminoácidos proteinogênicos excluindo L-lisina, troca por L-histidina ou L-arginina sendo preferido. Troca por L-arginina é muito particularmente preferida. A seqüência de base do alelo rpsL-1545 contida em cepa DM1545 é mostrada em SEQ ID Ns 3. O alelo rpsL-1545 codifica uma pro- teína, a seqüência de aminoácido da qual é mostrada em SEQ ID N® 4. A proteína contém L-arginina na posição 43. A seqüência de DNA do alelo rpsL-1545 (SEQ ID N® 3) contém a base guanina a posição 128 da região codificadora (CDS), a qual corresponde à posição 627 na seqüência mostra- da em SEQ ID Ne 3. A seqüência de DNA do gene do tipo selvagem (SEQ ID Nõ 1) contem a base adenina nesta posição.

Para mutagênese, processos de mutagênese convencionais po- dem ser usados, usando substâncias mutagênicas tais como, por exemplo, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina ou luz ultravioleta. Métodos in vitro, tais como, por exemplo, um tratamento com hidroxilamina (Miller, J. Η.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Esche- richia coli and Related Bactéria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992) ou oligonucleotídeos mutagênicos (T. A. Brown: Gen- technologie für Einsteiger [Genetic Engineering for Beginners], Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993) ou a reação de cadeia polimerase (PCR), tal como é descrito no manual por Newton e Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994), pode além disso ser usado para a mutagênese. O alelo rpsL de acordo com a invenção pode também ser trans- ferido em cepas adequadas, inter alia, pelo método de substituição de gene, tal como é descrito por Schwarzer e Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) ou Peters-Wendisch e outros (Microbiology 144, 915-927 (1998)). O alelo rpsL correspondente é clonado em um vetor o qual não é reprodutivo por C. glutamicum, tal como, por exemplo, pK18mobsacB ou pK19mobsacB (Jàger e outros, Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)) ou pCR®Blunt (Invi- trogen, Groningen, Holland; Bernard e outros, Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) e isto é então transferido no hospedeiro desejado de C. glutamicum por transformação ou conjugação. Após recombinação ho- móloga por meio de um primeiro evento de "cruzamento" o qual efetua inte- gração e um segundo evento de "cruzamento" o qual efetua excisão no gene alvo ou na seqüência alvo, a incorporação da mutação é alcançada.

Além disso, pode ser vantajoso para a produção de L-aminoácidos para intensificar, em particular superexpressar, uma ou mais enzimas do cami- nho de biossíntese particular, de glicólise, de anaplerose, do ciclo de ácido cítrico, do ciclo de pentose fosfato, de exportação de aminoácido e optativa- mente proteínas reguladoras, além disso para o gene rpsL. O uso de genes endógenos é em geral preferido. "Genes endógenos" ou "Seqüências de nucleotídeos endóge- nos" são compreendidos como significando os genes ou seqüências de nu- cleotídeos e alelos disso presentes na população de uma espécie.

Assim, para a preparação de L-lisina, além da acentuação do gene rpsL, um ou mais genes escolhidos do grupo consistindo em - o gene de dapA o qual codifica dihidrodipicolinato sintase (EP- BO 197 335), - o gene de abertura o qual codifica gliceraldeído 3-fosfato dehi- drogenase (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086), - o gene tpi o qual codifica triose fosfato isomerase (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), - o gene pgk o qual codifica 3-fosfoglicerato quinase (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), - o gene zwf o qual codifica glicose 6-fosfato dehidrogenase (JP- A-09224661), - o gene pyc o qual codifica piruvato carboxilase (DE-A-198 31 609), - o gene mqo o qual codifica malato-quinona oxidorreductase (Molenaar e outros, European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)), - o gene lysC o qual codifica um aspartato quinase resistente a retroalimentação (Kalinowski e outros (1990), Molecular Microbiology 5(5), 1197-204 (1991)), - o gene lysE o qual codifica a proteína de exportação lisina (DE- A-195 48 222), - o gene zwa1 o qual codifica a proteína Zwa1 (DE: 199559328.0, DSM 13115), e - o gene rpoB o qual codifica a subunidade β de RNA polimerase B, mostrado em SEQ ID Na 5 e 6 podem ser intensificados, em particular superexpressos. O termo "intensificação" nesta conexão descreve a redução ou eliminação da atividade intracelular de uma ou mais enzimas (proteínas) em um microorganismo as quais são codificadas pelo DNA correspondente, por exemplo usando um promotor fraco ou usando um gene ou alelo o qual co- difica uma enzima correspondente com uma baixa atividade ou inativa o ge- ne ou enzima correspondente (proteína), e optativamente combinando estas medidas.

Por medidas de atenuação, a atividade ou concentração da proteína correspondente é em geral reduzida a 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% ou 0 a 5% da atividade ou concentração da proteína do tipo selva- gem ou da atividade ou concentração da proteína no microorganismo inicial.

Pode, além disso, ser vantajoso para a produção de L-amino- ácidos, além da acentuação do gene rpsL, a um ou mais genes escolhidos do grupo consistindo em: - o gene pck codifica fosfoenol piruvato carboxiquinase (DE 199 50 409.1; DSM 13047), - o gene pgi o qual codifica glicose 6-fosfato isomerase (US 09/396.478; DSM 12969), - o gene poxB o qual codifica piruvato oxidase (DE: 1995 1975.7; DSM 13114), - o gene zwa2 o qual codifica a proteína Zwa2 (DE: 19959327.2, DSM 13113) ser atenuado, em particular para a expressão disso a ser reduzida.

Além disso, para acentuação do gene rpsL pode além do mais ser vantajoso para a produção de aminoácidos eliminar reações colaterais indesejáveis (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorga- nisms", em: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Va- nek (eds.), Academic Press, Londres, RU, 1982). A invenção também fornece os microorganismos preparados de acordo com a invenção, e estes podem ser cultivados continuamente ou descontinuamente no processo em batelada (cultura em batelada) ou no processo em baíeiada de alimentação (processo alimentar) ou em batelada de alimentação repetida (processo de alimentação repetitiva) para o propó- sito de produção de aminoácidos. Um resumo de métodos de cultura conhe- cidos é descrito no livro texto por Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung um die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1 .Introduction to Bio- process Technology (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) ou no livro texto por Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Equipment] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)). O meio de cultura a ser usado deve alcançar as exigências das cepas particulares em um modo adequado. Descrições de meio de cultura para vários microorganismos estão contidos no manual "Manual for General Bacteri- ology" da American Society for Bacteriology (Washington D.C., EUA, 1981). Açúcares e carboidratos, tais como por exemplo glicose, sacaro- se, lactose, frutose, maltose, melaços, amido e celulose, óleos e gorduras, tais como por exemplo óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e gordura de coco, ácidos graxos, tais como por exemplo, ácido palmítico, áci- do esteárico e ácido linoléico, álcoois, tais como por exemplo glicerol e eta- nol, e ácidos orgânicos, tais como por exemplo ácido acético, podem ser usados como a fonte de carbono. Estas substâncias podem ser usadas indi- vidualmente ou como uma mistura.

Compostos contendo nitrogênio orgânico, tais como peptonas, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, líquido de escarpa de milho, farinha de feijão de soja e uréia, ou compostos inorgânicos, tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amô- nio e nitrato de amônio, podem ser usados como a fonte de nitrogênio. As fontes de nitrogênio podem ser usadas individualmente ou como uma mistura. Ácido fosfórico, dihidrogênio fosfato de potássio ou hidrogênio fosfasto de dipotássio ou os sais contendo sódio correspondentes podem ser usados como a fonte de fósforo. O meio de cultura pode além disso compre- ender sais de metais, tais como por exemplo sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, os quais são necessários para crescimento. Finalmente, substâncias de crescimento essenciais, tais como aminoácidos e vitaminas, podem ser empre- gadas além das substâncias mencionadas acima. Precursores adequados podem entretanto ser adicionados ao meio de cultura. As substâncias de partida mencionadas podem ser adicionadas à cultura na forma de uma única batelada, ou podem ser alimentadas durante a cultura em um modo adequado.

Compostos básicos, tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia ou amônia aquosa, ou compostos ácidos, tais como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico, podem ser empregados em um modo adequado para controlar o pH da cultura. Antiespumantes, tais como por exemplo éste- res de poliglicol de ácido graxo, podem ser empregados para controlar o desenvolvimento de espuma. Substâncias adequadas tendo uma ação sele- tiva, tais como por exemplo antibióticos, podem ser adicionados ao meio para manter a estabilidade de plasmídeos. Para manter condições aeróbi- cas, oxigênio ou misturas de gás contendo oxigênio, tais como por exemplo ar, são introduzidos na cultura. A temperatura da cultura é geralmente 20°C a 45°C, e preferivelmente 25°C a 40°C. Cultura é continuada até um máximo do produto desejado ser formado. Este alvo é usualmente alcançado dentro de 10 horas a 160 horas. Métodos para determinação de L-aminoácidos são conhecidos da técnica anterior. A análise pode assim ser realizada, por exemplo, como descrito por Spackman e outros (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) por cromatografia de troca de iônica subsequente a derivação de ninhidrina, ou pode ser realizada por HPLC de fase reversa, por exemplo como descrito por Lindroth e outros (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).

Uma cultura pura da cepa de Corynebacterium glutamicum DM1545 foi depositado em 16 de Janeiro de 2001 ao Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = German Collection of Micro- organismos and Cell Cultures, Braunschweig, Alemanha) em acordo com o Tratado de Budapeste como DSM 13992. O processo de acordo com a invenção é usado para a prepara- ção fermentadora de aminoácidos, em particular L-lisina. A presente invenção é explicada em maiores detalhes a seguir com o auxílio de exemplos de concretização. O isolamento de DNA de plasmídeo de Escherichia coli e todas as técnicas de restrição, tratamento de Klenow e alcalina fosfatase foram realizados pelo método de Sambrook e outros (Molecular Cloning. A Labo- ratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Har- bor, NY, EUA). Métodos para transformação de Escherichia coli são também descritos neste manual. A composição do meio nutriente comum, tal como meio de LB ou TY, pode também ser encontrado no manual por Sambrook e outros.

Exemplo 1 Preparação de uma biblioteca de gene de cosmido aenômica de Corvnebacte- rium glutamicum ATCC 13032 DNA Cromossomal de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 é isolado como descrito por Tauch e outros (1995, Plasmídeo 33:168- 179) e parcialmente dividido com a enzima de restrição Sau3A! (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemanha, Descrição do Produto Sau3AI, Ns de Códi- go 27-0913-02). Os fragmentos de DNA são desfosforilados com fosfatase alcalina de camarão (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha, Des- crição do Produto SAP, Ns do Código 1758250). O DNA do vetor de cosmido SuperCosl (Wahl e outros (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences EUA 84:2160-2164), obtido de Stratagene (La Jolla, EUA, Descri- ção do Produto de Kit de Vetor de Cosmido de SuperCosl, Nõ de Código 251301) é dividido com a enzima de restrição Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemanha, Descrição do Produto Xbal, Na do Código 27-0948-02) e igualmente desfosforilado com fosfatase alcalina de camarão. O DNA de cosmido é então dividido com a enzima de restrição BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemanha, Descrição do Produto BamHI, Ne do Código 27-0868-04). O DNA de cosmido tratado do mesmo modo é misturado com o DNA ATCC13032 tratado e o lote é tratado com T4 DNA ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemanha, Descrição do Pro- duto de T4 DNA ligase, Ne do Código 27-0870-04). A mistura de ligação é então embalada em fagos com o auxílio de Gigapack II XL Packaging Extract (Stratagene, La Jolla, USA, Descrição do Produto de Gigapack II XL Packaging Extract, Nõ do Código 200217).

Para infecção da cepa C. glutamicum NM554 (Raleigh e outros 1988, Nucleic Acid Research 16:1563-1575) as células são levadas em 10 nM de MgSCU e misturadas com uma alíquota do suspensão de fago. A infecção e titulação da biblioteca de cosmido são realizadas como descrito por Sam- brook e outros (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), as células sendo colocadas em placa em LB ágar (Lennox, 1955, Virology, 1:190) com 100 mg/l de ampicilina. Após incubação por toda noite a 37°C, clones recombinantes individuais são selecionados.

Exemplo 2 Isolamento e seqüenciamento do gene rosL O DNA de cosmido de uma colônia individual é isolado com o Qiaprep Spin Miniprep Kit (Ns do Produto 27106, Qiagen, Hilden, Alemanha) em acordo com as instruções do produtor e parcialmente dividido com a en- zima de restrição Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemanha, Des- crição do fabricante Sau3AI, Ns do Produto 27-0913-02). Os fragmentos de DNA são desfosforilasdos com fosfatase alcalina de camarão (Roche Dia- gnostics GmbH, Mannheim, Alemanha, Descrição do Produto SAP, N2 do Produto 1758250). Após separação por eletroforese de gel, os fragmentos de cosmido no limite de tamanho de 1500 a 2000 bp são isolados com o qiaExII

Gel Extraction Kit (Ne do Produto 20021, Qiagen, Hilden, Alemanha). O DNA do vetor de seqüenciamento pZero-1, obtido de Invitro- gen (Groningen, Holland, Descrição do Produto de Zero Background Cloning Kit, Ns do Produto K2500-01), é dividido com a enzima de restrição BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemanha, Descrição do Produto BamHI, Ns do Produto 27-0868-04). A ligação dos fragmentos de cosmidos no vetor de seqüenciamento pZero-1 é realizada como descrito por Sambrook e ou- tros (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), a mistura de DNA sendo incubada por toda noite com T4 ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemanha). Esta mistura de ligação é então eletroporada (Tauch e outros 1994, FEMS Mícrobiol Letters, 123:343-7) em cepa de C. glutamicum DH5aMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645-4649) e colocada em placa em LB ágar (Len- nox, 1955, Virology, 1:190) com 50 mg/l de zeocina. A preparação de plasmídeo dos clones recombinantes é realiza- da com um Biorobot 9600 (N2 do Produto 900200, Qiagen, Hilden, Alema- nha). O seqüenciamento é realizado pelo método de terminação de cadeia dideoxi de Sanger e outros (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 74:5463-5467) com modificações de acordo com Zimmer- mann e outros (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). O "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" de PE Applied Biosystems (N2 do Produto 403044, Weiterstadt, Alemanha) é usado. A separação por eletroforese de gel e análise da reação de seqüenciamento são realizados em um Gel de "Rotiphoresis NF Acrylamide/Bisacrylamide" (29:1) (N2 do Produto A124.1, Roth, Karlsruhe, Alemanha) com o sequenciador "ABI Prism 377" de PE

Applied Biosystems (Weiterstadt, Alemanha).

Os dados de seqüência brutos obtidos são então preparados usan- do o pacote de programa Staden (1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231) versão 97-0. As seqüências individuais dos derivados de pZerol são reunidas a um contig contínuo. A análise da região codificadora assistida por compu- tador é preparada com o programa XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Re- search 14:217-231).

A seqüência de nucleotídeo resultante é mostrada em SEQ ID N9 1. Análise da seqüência de nucleotídeo mostra uma estrutura de leitura abertura de 383 pares de base, a qual é chamada de gene rpsL. O gene rpsL codifica uma proteína de 127 aminoácidos. A seção de DNA estendida a montante de SEQ ID N9 1 foi iden- tificada do mesmo modo, esta seção sendo mostrada em SEQ ID N9 7. A região de gene rpsL estendida por SEQ ID N9 7 é mostrada em SEQ ID N9 8.

Exemplo 3 Ampliação e seaüenciamento do DNA do alelo rpsL de cepa DM1545 A cepa de Corynebacterium glutamicum DM1545 foi preparada por múltipla mutagênese não direcionada, seleção e seleção de mutante de C. glutamicum ATCC13032. A cepa é sensível a metionina.

Da cepa DM1545, DNA cromossomal é isolado por métodos convencionais (Eikmanns e outros, Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)).

Com o auxílio da reação de cadeia de polimerase, uma seção de DNA a qual transporta o gene rpsL ou alelo é ampliada. Na base da seqüência do gene rpsL conhecido para C. glutamicum de exemplo 2, os oligonucleotídeos inici- adores seguintes são escolhidos para o PCR: RpsL-1 (SEQ ID N910): 5' cag ctc tac aag agt gtc ta 3' rpsL-2 (SEQ ID Ns 11): 5' tgg tcg tgg tct tac cag ca 3' Os iniciadores mostrados são sintetizados por MWG Biotech (Ebersberg, Alemanha) e a reação de PCR é realizada pelo método de PCR padrão de Innis e outros (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applicati- ons, 1990, Academic Press). Os iniciadores permitem ampliação de uma seção de DNA de aproximadamente 1,78 kb em comprimento, a qual trans- porta o alelo de rpsL. O fragmento de DNA ampliado de aproximado de aproximada- mente 1,78 kb em comprimento o qual transporta o alelo rpsL da cepa DM1545 é identificado por eletroforese em um gel de agarose 0,8%, isolado do gel e purificado por métodos convencionais (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden). A seqüência de nucleotídeo do fragmento de DNA ampliado ou produto de PCR é determinada por seqüenciamento por MWG Biotech (Ebersberg, Alemanha). A seqüência do produto de PCR é mostrada em SEQ ID Ne 3. A seqüência de aminoácido da proteína ribosomal associada S12 resultante com o auxílio do programa de Patentin é mostrada em SEQ ID N° 4.

Em posição 128 a seqüência de nucleotídeo da região codifica- dora do alelo rpsL de cepa DM1545, isto quer dizer em posição 627 da se- qüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID Ns 3, está a base guanina. Na posição correspondente do gene do tipo selvagem está a base adenina (SEQ ID Nõ 1).

Em posição 43 da seqüência de aminoácido da proteína riboso- mal S12 de cepa DM1545 está o aminoácido arginina (SEQ ID Ns 4). Na po- sição correspondente da proteína do tipo selvagem está o aminoácido lisina (SEQ ID Ns 2).

Exemplo 4 Substituição do gene do tipo selvagem de rpsL de cepa DSM5715 pelo alelo rosL-1545 4.1 isolamento de um fragmento de DNA o qual transporta o alelo de rpsL-1545 Da cepa de DS1545, DNA cromossomal é isolado pelos méto- dos convencionais (Eikmanns e outros, Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)). A seção de DNA a qual transporta o alelo de rpsL-1545 o qual con- tém a base guanina em posição 128 da região codificadora (CDS) em vez das bases adenina contidas nesta posição no gene do tipo selvagem é am- pliada com o auxílio da reação de cadeia de polimerase. Na base da se- qüência do gene rpsL conhecido para C. glutamicum de exemplo 2, os oligo- nucleotídeos de iniciadores seguintes são escolhidos para a reação de ca- deia de polimerase: RpsL_XL-A1 (SEQ ID N° 12) : 5' ga tct aqa-aat tgc cgg taa tcc tgt tg 3' rpsL_XL-E1 (SEQ ID Nõ 13) : 5' ga tct aqa-cac agg ctg cca gct tat tc 3' Os iniciadores são sintetizados por MWG Biotech (Ebersberg, Alemanha) e a reação de POR é realizada pelo método padrão de PCR de Innis e outros (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 199G, Academic Press). Os iniciadores permitem ampliação de uma seação de DNA aproximadamente 1,59 kb em comprimento a qual transporta o alelo de rpsL-1545 (SEQ ID Ns 9). Os iniciadores além do mais contém a seqüência para o sítio de divisão da endonuclease de restrição Xbal, a qual é comerci- alizada realçando na seqüência de nucleotídeo mostrada acima. O fragmento de DNA ampliado de aproximadamente 1,59 kb em comprimento o qual transporta o alelo de rpsL-1545 é dividido com a endo- nuclease de restrição Xbal, identificada por eletroforese em um gel de agar- se 0,8% e então isolada do gel e purificada por métodos convencionais (Ql- Aquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden). 4.2 Construção do vetor de troca pK18mobsacB_rpsL-1545 O fragmento de DNA de comprimento de aproximadamente 1,58 kb dividido com a endonuclease de restrição Xbal, a qual contém o alelo de rpsL-1545 e é descrito em exemplo 4,1, é incorporado por meios de mutagê- nese de substituição com o auxílio do sistema sacB descrito por Scháfer e outros (Gene, 14, 69-73 (1994)) Em cromossoma da C. glutamicum cepa DSM5715. Este siste- ma permite preparação e seleção de trocas de alelo as quais acontecem por recombinação homóloga. O vetor de clonagem mobilizável pK18mobsacB é digerido com a enzima de restrição Xbal e as extremidades são desfosforiladas com fos- fatase alcalina (Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim, Alemanha). O vetor preparado neste modo é misturado com o fragmento de rpsL-1545 aproximadamente 1,58 kb em tamanho e a mistura é tratada com T4 DNA ligase (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Alemanha). O C. giutamicum de cepa S17-I (Simon e outros, Bio/ Technolo- gie 1: 784-791, 1993) é então transformado com a batelada de ligação (Ha- nahan, In. DNA cloning. A Practical Approach. Vol 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Seleção de células transportadoras de plasmídeo é feita colocando em placa a batelada de transformação em LB ágar (Sam- brook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989), o qual foi suplementado com 25 mg/l de canamicina. DNA de plasmídeo é isolado de um transformante com o auxílio do QIAprep Spin Miniprep kit de Qiagen e checado por divisão de restrição com a enzima Pstl e eletroforese por gel de agarose subsequente. O plas- mídeo é chamado pK18mobsacB_rpsl_-1545 e é mostrado em figura 1. 4.3 Integração do vetor pK18mobsacB_rpsL-1545 em DSM5715 e troca de alelo O vetor pK18mobsacB_rpsl_-1545 mencionado em exemplo 4.2 é transferido por conjugação pelo protocolo de Schâfer e outros (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990) em C. giutamicum cepa DSM5715. O vetor não pode reproduzir-se independentemente em DSM5715 e é retido na célula somente se ele está presente integrado no cromossoma como a con- seqüência de um evento de recombinação. Seleção de transconjugantes, isto é, clones com pK18mobsacB_rpsl_-1545 integrado, é feita colocando em placa a batelada de conjugação em LB ágar (Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989), o qual é suplementado com 15 mg/l de canamicina e 50 mg/l de ácido nali- díxico. Transconjugantes resistentes a canamicina são colocados em placa em placas de LB ágar com 25 g/ml de canamicina e incubados por 24 horas a 33°C. O transconjugante resistente a canamicina é chamado DSM5715: : pK18mobsacB_rpsL-1545. Por integração do vetor, além do gene do tipo selvagem de rpsL ele transporta o alelo rpsL-15455 no cromossoma.

Para seleção de mutantes na qual excisão do plasmídeo aconte- ceu como uma consequência de um segundo evento de recombinação, cé- lulas da cepa DSM5715: :pK18mobsacB_rpsl_-1545 são cultivadas por 30 horas não seletivamente em meio líquido de LB e então colocadas em placa em LB ágar com sacarose 10% e incubadas por 16 horas. O plasmídeo PK18mobsacB_rpsL-1545, como o plasmídeo inici- al pK18mobsacB, contém, além do gene de resistência a canamicina, uma cópia do gene sacB a qual codifica levan sucrase de Bacillus subtilil. A ex- pressão a qual pode ser induzida por sacarose leva a formação de levan, a qual catalisa a síntese do produto levan, o qual é tóxico a C. glutamicum.

Somente aqueles clones nos quais o pK18mobsacB_rpsL-1545 integrado excisou como a consequência de um segundo evento de recombinação portanto cultivaram em LB ágar. Dependendo da posição do segundo evento de recombinação com respeito ao sítio de mutação, troca de alelo ou incor- poração da mutação acontece com a excisão, ou a cópia original permanece no cromossoma do hospedeiro.

Aproximadamente 40 a 50 colônias são testadas para o feótipo "crescimento na presença de sacarose" e "não crescimento na presença de canamicina". Em 4 colônias as quais mostram o fenótipo "crescimento na presença de sacarose" e "não crescimento na presença de canamicina", uma região do gene rpsL transpondo a mutação de rpsL-1545 é sequencia- da, iniciando a partir do iniciador de seqüenciamento de rL-1 (SEQ ID Ns 14), por GATC Biotech AG (Constance, Alemanha) para demonstrar que a muta- ção do alelo de rpsL-1545 está presente no cromossoma. O iniciador rL-1 usado é sintetizado por isto por GATC: rL_1(SEQ ID Ns 14) : 5' atg agg ttg tcc gtg aca tg 3' Um clone o qual contém a base guanina em posição 128 da re- gião coordenante (CDS) do gene rpsL e assim tem o alelo de rpsL-1545 foi identificado neste modo. Este clone foi chamado cepa DSM5715_rpsL-1545.

Exemplo 5 Preparação de Usina As cepas de DSM5715: :pK18mobsacB_rpsL-1545 e DSM5715 rpsL -1545 de C. glutamicina obtidas em exemplo 4 são cultivadas em um meio nutriente adequado para a produção de lisina e o conteúdo de lisina no sobrenadante da cultura é determinado.

Para isto, as cepas são primeiro incubadas em uma placa de ágar por 24 horas a 33°C. Iniciando a partir desta cultura de placa de ágar, em cada caso uma précultura semeada (10 ml de meio m um frasco cônico de 100 ml). O meio MM é usado como o meio para as pré-culturas. As pré- culturas são incubadas por 24 horas a 33°C a 240 rpm em uma máquina agitadora. Em cada caso uma cultura principal é semeada a partir destas pré-culturas tal que o OD inicial (660 nm) das culturas principais seja 0,1. O meio MM é também usado para as culturas principais.

Meio MM CSL 5 g/| MOPS 20 g/l Glicose (separadamente autoclavada) 50 g/l Sais: (NH4)2S04 25 g/l KH2P04 0,1 g/l MgS04 * 7 H20 1,0 g/l CaCI2 * 2 H20 10 mg/l FeS04 * 7 H20 10 mg/l MnS04 * H20 5,0 mg/l Biotina (filtrada estéril) 0,3 mg/l Tiamina * HCI (filtrada estéril) 0,2 mg/l L-Leucina (filtrada estéril) o, 1 g/l CaC03 25 g/l O CSL (licor de escarpa de milho), MOPS (ácido morfolinopro- panosulfônico) e a solução de sal são levados a pH 7 com amônia aquosa e autoclavados. O substrato estéril e soluções de vitamina, bem como o CaC03 autoclavado no estado seco, são então adicionados.

Cultivo é realizado em um volume de 10 ml em um frasco cônico de 100 ml com defletores. Cultivo é realizado a 33°C e 80% de umidade at- mosférica.

Após 72 horas, o OD é determinado em uma medição de com- primento de onda de 660 nm com um Biomek 1000 (Beckmann Instruments Gmbh, Munique). A quantidade de lisina formada é determinada com um analisador de aminoácido de Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Alemanha) por cromatografia de troca de iônica e derivação pós-coluna com detecção de ninhidrina. O resultado do experimento é mostrado em tabela 1.

Tabela 1 LISTAGEM DE SEQUENCIA

<110> Evonik Degussa GmbH

<120> BACTÉRIAS CORINEFORMES COM GENE rpsL SUPEREXPRESSO E

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO FERMENTADORA DE L-LISINA

<130> 000779 BT <140> PI0207284-0 <141> 22/01/2002 <150> DE 10107230.9 <151> 16/02/2001 <150> DE 10162386.0 <151> 19/12/2001 <160> 14 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 1775 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> CDS <222> (500)..(880) <223> gene selvagem rpsL <400> 1 cagctctaca agagtgtcta agtggcgggc attccatgct ttggaggagc gatcttcaaa 60 ttcctccaaa gtgagttgac ctcgggaaac agctgcagaa agttcatcca cgacttggtt 120 tcggttaagg tcagtggcga gcttctttgc tggttcgttt ccttgaggaa cagtcatggg 180 aaccattcta acaagggatt tggtgttttc tgcggctagc tgataatgtg aacggctgag 240 tcccactctt gtagttggga attgacggca cctcgcactc aagcgcggta tcgcccctgg 300 ttttccggga cgcggtggcg catgtttgca tttgatgagg ttgtccgtga catgtttggt 360 cgggccccaa aaagagcccc cttttttgcg tgtctggaca ctttttcaaa tccttcgcca 420 tcgacaagct cagccttcgt gttcgtcccc cgggcgtcac gtcagcagtt aaagaacaac 480 tccgaaataa ggatggttc atg cca act att cag cag ctg gtc cgt aag ggc 532 Met Pro Thr Ile Gin Gin Leu Vai Arg Lys Gly 15 10 cgc cac gat aag tcc gcc aag gtg gct acc gcg gca ctg aag ggt tcc 580 Arg His Asp Lys Ser Ala Lys Vai Ala Thr Ala Ala Leu Lys Gly Ser 15 20 25 cct cag cgt cgt ggc gta tgc acc cgt gtg tac acc acc acc cct aag 628 Pro Gin Arg Arg Gly Vai Cys Thr Arg Vai Tyr Thr Thr Thr Pro Lys 30 35 40 aag cct aac tct gct ctt cgt aag gtc gct cgt gtg cgc ctt acc tcc 676 Lys Pro Asn Ser Ala Leu Arg Lys Vai Ala Arg Vai Arg Leu Thr Ser 45 50 55 ggc ate gag gtt tcc gct tac ate cct ggt gag ggc cac aac ctg cag 724 Gly Ile Glu Vai Ser Ala Tyr Ile Pro Gly Glu Gly His Asn Leu Gin 60 65 70 75 gag cac tcc atg gtg ctc gtt cgc ggt ggt cgt gtt aag gac ctc cca 772 Glu His Ser Met Vai Leu Vai Arg Gly Gly Arg Vai Lys Asp Leu Pro 80 85 90 ggt gtc cgt tac aag ate gtc cgt ggc gca ctg gat acc cag ggt gtt 820 Gly Vai Arg Tyr Lys Ile Vai Arg Gly Ala Leu Asp Thr Gin Gly Vai 95 100 105 aag gac cgc aag cag gct cgt tcc ccg cta cgg cgc gaa gag ggg ata 868 Lys Asp Arg Lys Gin Ala Arg Ser Pro Leu Arg Arg Glu Glu Gly Ile 110 115 120 att aaa aat gcg taaatcagca gctcctaagc gtccagtagt tcaggaccct 920 Ile Lys Asn Ala 125 gtatacaagt ccgagctcgt tacccagctc gtaaacaaga tcctcatcgg tggcaagaag 980 tccaccgcag agcgcatcgt ctacggtgca etegagatet gccgtgagaa gaccggcacc 1040 gatccagtag gaaccctcga gaaggctctc ggcaacgtgc gtccagacct cgaagttcgt 1100 tcccgccgtg ttggtggcgc tacctaccag gtgccagtgg atgttcgccc agagcgcgca 1160 aacaccctcg cactgcgttg gttggtaacc ttcacccgtc agcgtcgtga gaacaccatg 1220 atcgagcgtc ttgcaaacga acttctggat gcagccaacg gccttggcgc ttccgtgaag 1280 cgtcgcgaag acacccacaa gatggcagag gccaaccgcg ccttcgctca ctaccgctgg 1340 tagtactgcc aagacatgaa agcccaatca cctttaagat caacgcctgc cggcgccctt 1400 cacatttgaa taagctggca gcctgcgttt cttcaaggcg actgggcttt tagtctcatt 1460 aatgcagttc accgctgtaa gatagctaaa tagaaacact gtttcggcag tgtgttacta 1520 aaaaatccat gtcacttgcc tcgagcgtgc tgcttgaatc gcaagttagt ggcaaaatgt 1580 aacaagagaa ttatccgtag gtgacaaact ttttaatact tgggtatctg tcatggatac 1640 cccggtaata aataagtgaa ttaccgtaac caacaagttg gggtaccact gtggcacaag 1700 aagtgcttaa ggatctaaac aaggtccgca acatcggcat catggcgcac atcgatgctg 1760 gtaagaccac gacca 1775 <210> 2 <211> 127 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Met Pro Thr Ile Gin Gin Leu Vai Arg Lys Gly Arg His Asp Lys Ser 15 10 15 Ala Lys Vai Ala Thr Ala Ala Leu Lys Gly Ser Pro Gin Arg Arg Gly 20 25 30 Vai Cys Thr Arg Vai Tyr Thr Thr Thr Pro Lys Lys Pro Asn Ser Ala 35 40 45 Leu Arg Lys Vai Ala Arg Vai Arg Leu Thr Ser Gly Ile Glu Vai Ser 50 55 60 Ala Tyr Ile Pro Gly Glu Gly His Asn Leu Gin Glu His Ser Met Vai 65 70 75 80 Leu Vai Arg Gly Gly Arg Vai Lys Asp Leu Pro Gly Vai Arg Tyr Lys 85 90 95 Ile Vai Arg Gly Ala Leu Asp Thr Gin Gly Vai Lys Asp Arg Lys Gin 100 105 110 Ala Arg Ser Pro Leu Arg Arg Glu Glu Gly Ile Ile Lys Asn Ala 115 120 125 <210> 3 <211> 1775 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> CDS <222> (500)..(880) <223> rpsL-1545-Alelo <220> <221> mutacao <222> (627) .. (627) <223> Substituição de adenina por guanina <400> 3 cagctctaca agagtgtcta agtggcgggc attccatgct ttggaggagc gatcttcaaa 60 ttcctccaaa gtgagttgac ctcgggaaac agctgcagaa agttcatcca cgacttggtt 120 tcggttaagg tcagtggcga gcttctttgc tggttcgttt ccttgaggaa cagtcatggg 180 aaccattcta acaagggatt tggtgttttc tgcggctagc tgataatgtg aacggctgag 240 tcccactctt gtagttggga attgacggca cctcgcactc aagcgcggta tcgcccctgg 300 ttttccggga cgcggtggcg catgtttgca tttgatgagg ttgtccgtga catgtttggt 360 cgggccccaa aaagagcccc cttttttgcg tgtctggaca ctttttcaaa tccttcgcca 420 tcgacaagct cagccttcgt gttcgtcccc cgggcgtcac gtcagcagtt aaagaacaac 480 tccgaaataa ggatggttc atg cca act att cag cag ctg gtc cgt aag ggc 532 Met Pro Thr Ile Gin Gin Leu Vai Arg Lys Gly 15 10 cgc cac gat aag tcc gcc aag gtg gct acc gcg gca ctg aag ggt tcc 580 Arg His Asp Lys Ser Ala Lys Vai Ala Thr Ala Ala Leu Lys Gly Ser 15 20 25 cct cag cgt cgt ggc gta tgc acc cgt gtg tac acc acc acc cct agg 628 Pro Gin Arg Arg Gly Vai Cys Thr Arg Vai Tyr Thr Thr Thr Pro Arg 30 35 40 aag cct aac tct gct ctt cgt aag gtc gct cgt gtg cgc ctt acc tcc 676 Lys Pro Asn Ser Ala Leu Arg Lys Vai Ala Arg Vai Arg Leu Thr Ser 45 50 55 ggc ate gag gtt tcc gct tac ate cct ggt gag ggc cac aac ctg cag 724 Gly Ile Glu Vai Ser Ala Tyr Ile Pro Gly Glu Gly His Asn Leu Gin 60 65 70 75 gag cac tcc atg gtg ctc gtt cgc ggt ggt cgt gtt aag gac ctc cca 772 Glu His Ser Met Vai Leu Vai Arg Gly Gly Arg Vai Lys Asp Leu Pro 80 85 90 ggt gtc cgt tac aag ate gtc cgt ggc gea ctg gat acc cag ggt gtt 820 Gly Vai Arg Tyr Lys Ile Vai Arg Gly Ala Leu Asp Thr Gin Gly Vai 95 100 105 aag gac cgc aag cag gct cgt tcc ccg cta cgg cgc gaa gag ggg ata 868 Lys Asp Arg Lys Gin Ala Arg Ser Pro Leu Arg Arg Glu Glu Gly Ile 110 115 120 att aaa aat gcg taaatcagca gctcctaagc gtccagtagt tcaggaccct 920 Ile Lys Asn Ala 125 gtatacaagt ccgagctcgt tacccagctc gtaaacaaga tcctcatcgg tggcaagaag 980 tccaccgcag agcgcatcgt ctacggtgca etegagatet gccgtgagaa gaccggcacc 1040 gatccagtag gaaccctcga gaaggctctc ggcaacgtgc gtccagacct cgaagttcgt 1100 tcccgccgtg ttggtggcgc tacctaccag gtgccagtgg atgttcgccc agagcgcgca 1160 aacaccctcg cactgcgttg gttggtaacc ttcacccgtc agcgtcgtga gaacaccatg 1220 atcgagcgtc ttgcaaacga acttctggat gcagccaacg gccttggcgc ttccgtgaag 1280 cgtcgcgaag acacccacaa gatggcagag gccaaccgcg ccttcgctca ctaccgctgg 1340 tagtactgcc aagacatgaa agcccaatca cctttaagat caacgcctgc cggcgccctt 1400 cacatttgaa taagctggca gcctgcgttt cttcaaggcg actgggcttt tagtctcatt 1460 aatgcagttc accgctgtaa gatagctaaa tagaaacact gtttcggcag tgtgttacta 1520 aaaaatccat gtcacttgcc tcgagcgtgc tgcttgaatc gcaagttagt ggcaaaatgt 1580 aacaagagaa ttatccgtag gtgacaaact ttttaatact tgggtatctg tcatggatac 1640 cccggtaata aataagtgaa ttaccgtaac caacaagttg gggtaccact gtggcacaag 1700 aagtgcttaa ggatctaaac aaggtccgca acatcggcat catggcgcac atcgatgctg 1760 gtaagaccac gacca 1775 <210> 4 <211> 127 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4 Met Pro Thr Ile Gin Gin Leu Vai Arg Lys Gly Arg His Asp Lys Ser 15 10 15 Ala Lys Vai Ala Thr Ala Ala Leu Lys Gly Ser Pro Gin Arg Arg Gly 20 25 30 Vai Cys Thr Arg Vai Tyr Thr Thr Thr Pro Arg Lys Pro Asn Ser Ala 35 40 45 Leu Arg Lys Vai Ala Arg Vai Arg Leu Thr Ser Gly Ile Glu Vai Ser 50 55 60 Ala Tyr Ile Pro Gly Glu Gly His Asn Leu Gin Glu His Ser Met Vai 65 70 75 80 Leu Vai Arg Gly Gly Arg Vai Lys Asp Leu Pro Gly Vai Arg Tyr Lys 85 90 95 Ile Vai Arg Gly Ala Leu Asp Thr Gin Gly Vai Lys Asp Arg Lys Gin 100 105 110 Ala Arg Ser Pro Leu Arg Arg Glu Glu Gly Ile Ile Lys Asn Ala 115 120 125 <210> 5 <211> 5099 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220>

Claims (10)

1. Bactéria corineforme, caracterizada pelo fato de que atua co- mo célula hospedeira que contém o vetor compreendendo a sequência de nucleotídeos do gene rpsL, como mostrada na SEQ ID NO:1.

2. Bactéria corineforme, caracterizada pelo fato de que atua co- mo célula hospedeira que contém o vetor compreendendo a sequência de nucleotídeos do gene rpsL, como mostrada na SEQ ID NO:3.

3. Cepa DM1545 de Corynebacterium glutamicum, caracterizada pelo fato de que é depositada como DSM 13992 no Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Coleção Alemã de Microorga- nismos e Culturas de Células, Braunschweigm, Alemanha).

4. Processo para a preparação fermentadora de L-aminoácido, em particular, L-lisina, caracterizado pelo fato de que compreende realizar as etapas seguintes: a) fermentação das bactérias corineforme que produzem o L- aminoácido desejado e nas quais pelo menos o gene rpsL ou sequências de nucleotídeos que o codificam são acentuados, em particular superexpressos; b) concentração do L-aminoácido no meio ou nas células da bactéria, e c) isolamento do L-aminoácido.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que são empregadas bactérias, nas quais os genes adicionais da via de biossíntese do L-aminoácido desejado são adicionalmente acentuados.

6. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que são empregadas bactérias, nas quais as vias metabólicas que reduzem a formação do L-aminoácido desejado são pelo menos parcialmen- te eliminadas.

7. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é empregada uma cepa transformada com um vetor de plasmí- deo, e o vetor de plasmídeo transporta a sequencia de nucleotídeo que codi- fica o gene rpsL.

8. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a expressão do(s) polinucleotídeo(s) que codifica(m) o gene rpsL é acentuada, em particular superexpressa.

9. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as propriedades reguladoras/catalíticas do polipeptídeo (proteína de enzima) ao qual polinucleotídeo de rpsL codifica, são aumentadas.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9, caracterizado pelo fato de que são empregados microorganismos das espécies Corynebacterium glutamicum.