JPH04271780A - リコンビナントリパーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】この発明は、エステル分解反応、
エステル合成反応、エステル交換反応等に用いられるリ
パーゼ酵素、その遺伝子、及び該遺伝子を有するプラス
ミドで形質転換された酵母、更には該酵母を培養するこ
とによるリパーゼの生産法に関するものである。 【０００２】 【従来の技術】リパーゼは、例えば、脂肪酸の製造、牛
脂の分解、カカオ代用脂の製造、グリセリド合成、テル
ペルアルコールエステル合成、シュガーエステル合成、
ラセミ体エステルの光学分割等において、広く用いられ
ており極めて重要な酵素である。 【０００３】リパーゼを生産する生物は、動物、植物、
微生物に広く分布しており、それらのリパーゼは、その
給源によって、また組織によって特徴的な性質を持って
いる。これらのリパーゼの中には、アミノ酸全配列の分
かっているものや、部分的に配列の分かっているものが
あり、それらは次にあげる通りである。動物由来には、
ｒａｔ　Ｌｉｎｇａｌ　ｌｉｐａｓｅ　（Ｄｏｃｈｅｒ
ｔｙ，　Ａ．　Ｊ．　Ｐ．；　Ｂｏｄｍｅｒ，　Ｍ．　
Ｗ．；　Ａｎｇａｌ，　Ｓ．；　Ｖｅｒｇｅｒ，　Ｒ．
；　Ｒｉｖｉｅｒｅ，　Ｃ．；　Ｌｏｗｅ，　Ｐ．　Ａ
．；　Ｌｙｏｎｓ，　Ａ．；　Ｅｍｔａｇｅ，　Ｊ．　
Ｓ．；　Ｈａｒｒｉｓ，　Ｔ．　Ｊ．Ｒ．：　Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１３（６），　１８
９１−９０３（１９８５）），　ｒａｔ　ｈｅｐａｔｉ
ｃｌｉｐａｓｅ　（Ｋｏｍａｒｏｍｙ，　Ｍｉｃｈａｅ
ｌ　Ｃ．；　Ｓｃｈｏｔｚ，　Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｃ．：
　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ
．Ｓ．Ａ．　８４（６），　１５２６−３０（１９８７
）），　ｈｕｍａｎ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｌｉｐａｓｅ　
（Ｂｏｄｍｅｒ，　Ｍａｒｋ　Ｗ．；　Ａｎｇａｌ，　
Ｓａｒｏｊａｎｉ；　Ｙａｒｒａｎｔｏｎ，　Ｇｅｏｆ
ｆｒｅｙ　Ｔ．；　Ｈａｒｒｉｓ，　Ｔｉｍｏｔｈｙ　
Ｊ．　Ｒ．；　Ｌｙｏｎｓ，　Ａｌａｎ；　Ｋｉｎｇ，
　Ｄａｖｉｄ　Ｊ．；　Ｐｉｅｒｏｎｉ，　Ｇｅｒａｒ
ｄ；　Ｒｉｖｉｅｒｅ，　Ｃｌａｕｄｅ；　Ｖｅｒｇｅ
ｒ，　Ｒｏｂｅｒｔ；　Ｌｏｗｅ，　Ｐｅｔｅｒ　Ａ．
：Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，９
０９　（３），　２３７−４４（１９８７）），ｂｏｖ
ｉｎｅ　ｂｒａｉｎ　ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ　
ｌｉｐａｓｅ　（Ｆａｒｏｏｑｕｉ，　Ａｋｈｌａｑ　
Ａ．；　Ｃｈｅｎｇ，　Ｓｈｉｙｕａｎ；　Ｒａｍｍｏ
ｈａｎ，　Ｋｏｔｔｉｌ；　Ｋｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ，
　Ｐａｐａｃｈａｎ；　Ｈａｒｒｏｃｋｓ，　Ｌｌｏｙ
ｄ　Ａ．：　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　Ｔｒａｎｓ
．　　１６（３），　２９３（１９８８）），　ｈｕｍ
ａｎ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｌｉｐａｓｅ　（Ｄａｔｔａ，
　Ｓａｎｔａｎｕ；　Ｌｕｏ，　Ｃｈｉ　Ｃｈｅｎｇ；
　Ｌｉ，　Ｗｅｎ　Ｈｓｉｕｎｇ；　Ｖａｎ　Ｔｕｉｎ
ｅｎ　Ｐｅｔｅｒ；　Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，　Ｄａｖｉ
ｄ　Ｈ．；　Ｂｒｏｗｎ，　Ｍａｒｙ　Ａ．；　Ｃｈｅ
ｎ，　Ｓａｎ　Ｈｗａｎ；　Ｌｉｕ，　Ｓｈｙａｎ　Ｗ
ｏｅｉ；　Ｃｈａｎ，　Ｌａｗｒｅｎｃｅ：　Ｊ．　Ｂ
ｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　　２６３　（３），　１１０
７−１０（１９８８）），などがあり、これらは全アミ
ノ酸配列が知られている。またバクテリア由来ではＳｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｙｉｃｕｓ　ｌｉｐａｓ
ｅ　（Ｇｏｅｔｚ，　Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ；　Ｐｏｐｐ
，　Ｆｒｉｔｚ；　Ｋｏｒｎ，Ｅｄｄａ；　Ｓｃｈｌｅ
ｉｆｅｒ，　Ｋａｒｌ　Ｈｅｉｎｚ：　Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１３（１６），　５８９５
−９０６（１９８５）），Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆ
ｒａｇｉ　ｌｉｐａｓｅ　（Ｋｕｇｉｍｉｙａ，　Ｗａ
ｔａｒｕ；　Ｏｔａｎｉ，　Ｙａｓｕｏ；　Ｈａｓｈｉ
ｍｏｔｏ，　Ｙｕｋｉｋｏ；　Ｔａｋａｇｉ，　Ｙａｓ
ｕｙｕｋｉ：　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　
Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　　１４１　（１），　１
８５−９０（１９８６））などがあり、これらも全アミ
ノ酸配列が決定されている。糸状菌由来では、Ｒｈｉｚ
ｏｍｕｃｏｒ　ｍｉｅｈｅｉ　ｌｉｐａｓｅ　（Ｂｏｅ
ｌ，　Ｅｓｐｅｒ；　Ｈｕｇｅｊｅｎｓｅｎ，　Ｂｉｒ
ｇｉｔｔｅ；　Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，　Ｍｏｇｅｎ
ｓ；　Ｔｈｉｍ，　Ｌａｒｓ；　Ｆｉｌｌ，　Ｎｉｅｌ
ｓ　Ｐ．：　Ｌｉｐｉｄｓ，　２３，　７０１（１９８
８）），　Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｎｉｖｅｕｓ　ｌｉｐａ
ｓｅ　（特開昭６４−８０２９０号公報）　、Ｇｅｏｔ
ｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ　ｌｉｐａｓｅ　（特
開昭６３−３２４８９号公報）　等があり、前二者はそ
のアミノ酸配列を、後者はそれをコードするＤＮＡの配
列を明らかにしている。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】ところで、糸状菌由来
のリパーゼはバクテリア由来のものと違って、基質であ
るトリグリセリドの１，３位に特異的に作用する性質を
持つ。この性質は、エステル交換を利用したカカオ代用
脂の製造にはなくてはならない性質である。動物由来の
リパーゼも同様な特異性を持つものが多いが、培養の容
易さの点などを考えると糸状菌リパーゼのほうが利用し
やすいと考えられる。 【０００５】本発明の目的は、トリグリセリドの１，３
位に特異的に作用し、かつ新規なアミノ酸配列を有する
リパーゼ及び該リパーゼをコードする遺伝子ＤＮＡを新
たに提供するとともに、該リパーゼを遺伝子工学的手法
により、純粋な形で安価に大量供給しようとするもので
ある。 【０００６】 【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
上記課題を解決するために、まずリパーゼ生産菌として
糸状菌の一つであるＲｈｉｚｏｐｕｓｄｅｌｅｍａｒ　
ＡＪ６０４５　（本菌株は工業技術院微生物工業技術研
究所に　ＦＥＲＭ　Ｐ−１０５５０　として寄託されて
いる。）　を選び、この培養上澄中に存在するリパーゼ
を精製した。この菌株の生産するリパーゼの精製につい
てはすでに岩井ら　（Ｉｗａｉ，　Ｍｉｅｋｏ；　Ｔｓ
ｕｊｉｓａｋａ，　Ｙｏｓｉｏ：　Ａｇｒ．　Ｂｉｏｌ
．　Ｃｈｅｍ．，　　３８，　１２４１（１９７４））
　によって報告されているが、本発明者らはその精製方
法を大幅に簡略化し、しかもＮ末端アミノ酸配列を決定
するのに十分な純度を持つサンプルを得ることに成功し
、Ｎ末端アミノ酸配列を決定し、該リパーゼが、２つの
サブユニットからなることを見い出した。 【０００７】さらに、このデータをもとに、合成ＤＮＡ
プローブを作製し、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　　ｄｅｌｅｍａ
ｒ　ＡＪ６０４５菌体より抽出したゲノムＤＮＡよりリ
パーゼゲノム遺伝子を、また抽出精製したｍＲＮＡより
合成したｃＤＮＡ遺伝子の中からリパーゼｃＤＮＡ遺伝
子を取得した。そしてそのＤＮＡの全構造、及び対応す
るリパーゼのアミノ酸配列を決定した。また、該遺伝子
によりプラスミドを組換え、該プラスミドを　Ｅｓｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ及び　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＡＨ２２　（本菌株は　
ＦＥＲＭ　Ｐ−１１９０８（ＡＪ１４６５３）　として
寄託されている）　に導入したところ、両菌株ともリパ
ーゼ蛋白を生産することを見い出し本発明を完成するに
至ったものである。 【０００８】すなわち、本発明は、配列表中の「配列番
号１」または「配列番号６」記載のアミノ酸配列をコー
ドするリパーゼ遺伝子に関するものであり、更に具体的
には、遺伝子が配列表中の「配列番号２」または「配列
番号５」記載のＤＮＡ配列で表されるリパーゼ遺伝子に
関するものである。更に、本発明は、上記記載のリパー
ゼ遺伝子を含む組換えプラスミド、或いはこの組換えプ
ラスミドで形質転換された酵母に関するものである。 【０００９】更に、本発明は、上記形質転換された酵母
を培地中で培養し、生成蓄積されたリパーゼを採取する
ことを特徴とするリパーゼの製造方法に関するものであ
る。更に、本発明は、配列表中の「配列番号３」または
「配列番号７」記載のアミノ酸配列を有するサブユニッ
トβ及び配列表中の「配列番号４」記載のアミノ酸配列
を有するサブユニットαを含む新規リパーゼ、或いは配
列表中の「配列番号３」又は「配列番号７」記載のアミ
ノ酸配列を有するサブユニットβを含む新規リパーゼに
関するものである。 【００１０】以下に本発明を詳述する。リパーゼのＮ末
端配列を決定するためには、まず、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属
の糸状菌を培養し、産生するリパーゼを精製する。培養
方法は従来のＲｈｉｚｏｐｕｓ属の培養方法と特に変わ
らない。すなわち培地としては炭素源、窒素源、無機イ
オン、さらに必要に応じ硝酸塩、リン酸塩等を含有する
通常のものである。炭素源としてはグルコース及びこれ
らを含有する澱粉加水分解物、糖蜜等が用いられる。窒
素源としてはポリペプトン、トリプトン、肉エキス、酵
母エキス等が使われる。培養は好気的条件下で培地のｐ
Ｈ及び温度を適宜調節することが望ましいが、必ずしも
その必要はない。 培養時間は培地中のリパーゼ活性が最高になるところま
で行われる。 【００１１】培養上澄よりリパーゼを精製するには以下
の様な方法が用いられる。培養液のｐＨを塩酸により４
．６に調整し、沈澱を除く。この時調整するｐＨの範囲
は４．６付近であれば良い。また用いる酸は塩酸でなく
ともかまわない。得られた上澄を硫安沈澱し、脱塩した
後、ファルマシアＰｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　
ＣＬ４Ｂ　オープンカラムにかけ分画を行う。このカラ
ムは、充填剤の基材につけた疎水性基と試料の疎水性官
能基との相互作用の違いにより分離を行う担体ならば他
のものでも使用することが可能である。また、このステ
ップを省略してしまうことが可能である。分画したサン
プルを高速液体クロマトグラフィーを用い　（ここで言
う高速液体クロマトグラフィーとは、常圧以上でクロマ
トを行う装置であって、ファルマシアＦＰＬＣを含む）
　、東ソー製　ＴＳＫ−ＧＥＬ、　Ｐｈｅｎｙｌ−５Ｐ
Ｗカラムを使って分画した。このカラムはやはり充填剤
の基材につけた疎水性基と試料の疎水性官能基との相互
作用のちがいにより試料を分離するクロマトグラフなら
ば他のものでも使用可能である。次に、高速液体クロマ
トグラフィーで東ソー製　Ｇ３０００ＳＷカラムを使っ
てゲル濾過を行った。このカラムは、ゲル濾過の特性を
持つカラムであれば他のものでも使用可能である。また
このステップは省略することも可能である。しかし省略
した場合、次のステップのために脱塩をする必要がある
。ここで得られたサンプルをさらに２成分に分離するた
め、高速液体クロマトグラフィーで、ファルマシア陽イ
オン交換カラムＭｏｎｏ　Ｓを使って分画を行った。こ
の時使用するカラムは陽イオンを分離する陽イオン交換
の性質を持つものならば他のものでも使用可能である。 【００１２】精製したサンプルをアミノ酸配列アナライ
ザーにかけ、以下に示す２つのサブユニットに由来する
２種のＮ末端アミノ酸配列を決定した。Ａｓｐ　Ａｓｐ
　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　
Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａ
ｓｐ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅ
ｕ　（サブユニットα），　　及びＶａｌ　Ｓｅｒ　Ｇ
ｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓ
ｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ
　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　（サブユ
ニットβ）　同一リパーゼであっても、上記アミノ酸配
列のうち、数個が別のアミノ酸に置換することは可能で
ある。 【００１３】本発明のリパーゼをコードする遺伝子はＲ
ｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ　ＡＪ６０４５菌体か
らゲノムＤＮＡを抽出してもよくまたｍＲＮＡの逆転写
によって調製することもできる。抽出する場合には菌体
を磨砕等の手段により破壊してプロテアーゼ処理等を行
った後、ＤＮＡを抽出する。得られたＤＮＡを制限酵素
で切断し、λベクターに結合し、インビトロパッケージ
ングしてライブラリーを作製する。一方、前記のＮ末端
アミノ酸配列からＤＮＡ自動合成装置等を用いて対応す
るＤＮＡプローブを合成しておく。そこでこの合成プロ
ーブを用いて前記ライブラリーからゲノムＤＮＡクロー
ンを分離する。 【００１４】ｍＲＮＡの逆転写による場合においては、
ＲＮＡの抽出は、ゲノムＤＮＡの抽出と同様であるが、
全ての段階においてＲＮａｓｅ　の混入を防ぐ、もしく
はＲＮａｓｅ　の活性を阻害する工夫が必要である。抽
出されたＲＮＡの中が、オリゴｄＴセルロースカラムを
用いることにより、ポリＡ　　ＲＮＡ画分を精製し、こ
れをもとに、リバーストランスクリプターゼによって、
ｃＤＮＡを合成する。得られたｃＤＮＡをλベクターに
結合し、インビトロパッケージングしてライブラリーを
作製する。あとはゲノムＤＮＡの時と同様の方法でクロ
ーンを分離する。 【００１５】以上のようにして得られたゲノムＤＮＡ及
びｃＤＮＡを遺伝子構造解析した結果、ゲノムＤＮＡに
おいては下記配列表中「配列番号２」のＤＮＡ配列を有
しており、また、ｃＤＮＡにおいては同「配列番号５」
のＤＮＡ配列を有していた。そして、対応するアミノ酸
配列は、それぞれ同「配列番号１」及び「配列番号６」
に示す配列を有していた。 【００１６】そして、これらのＤＮＡにおいては、コー
ドされる蛋白質は同「配列番号４」（サブユニットα）
　、及び「配列番号３」、「配列番号７」　（サブユニ
ットβ）　に示す２種のサブユニットからなっており、
サブユニットαの配列は、特開昭６４−８０２９０号公
報に示すＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｎｉｖｅｕｓ　ｌｉｐａｓ
ｅ　と同一であった。次に、これらゲノムＤＮＡあるい
はｃＤＮＡにより適当なベクタープラスミドを常法によ
り組み換え、Ｅ．ｃｏｌｉあるいは酵母形質転換する。 これらの形質転換された微生物はリパーゼを産生するこ
とが確認できた。 【００１７】 【発明の効果】本発明により遺伝子工学的手段でリパー
ゼを容易に高純度で大量生産することができる。また、
蛋白質工学的手法を用いることにより、より高活性な、
あるいは、より安定性の高い新規リパーゼを作ることも
可能になる。 【００１８】 【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。但し、これらの実施例により本発明の技術的範囲が
限定されるものではない。 【００１９】 【実施例１】（１）　リパーゼ生産菌Ｒｈｉｚｏｐｕｓ
　ｄｅｌｅｍａｒ　ＡＪ６０４５（本菌株はＦＥＲＭ　
Ｐ−１０５５０として寄託れている）　の培養。リパー
ゼ生産菌Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒＡＪ６０４
５　を２００リットルスケールで培養した。培地ポリペ
プトン５％、ＮａＮＯ３　０．１％、ＫＨ２ＰＯ４　０
．１％、ＭｇＳＯ４　０．０５％、Ｇｌｕｃｏｓｅ２％
、ｐＨ約６。温度２７℃。 （２）　リパーゼの精製 活性測定法は専ら簡便法　（大日本製薬製リパーゼキッ
トＳ）　によったが、最終精製標品についてはオリーブ
油を用いた活性測定法　（Ｆｋｕｍｏｔｏ，　Ｊｕｉｃ
ｈｉｒｏ；　Ｉｗａｉ，Ｍｉｅｋｏ；　Ｔｓｕｊｉｓａ
ｋａ，　Ｙｏｓｈｉｏ：　Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ａｐｐｌ．
　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　１０，　２５７（１９６４
））で活性のあることを確認した。以下に示すｕ　（ユ
ニット）　とは、リパーゼキットＳで測定した時の、サ
ンプルとブランクの吸光度の差を、１分当りの量に換算
したものである。またＢはバッファーを意味する。 【００２０】■　　得られた培養ブロス　１８０リット
ルを２４φ振切にかけ、８ｋｇの菌体を分離した。上澄
液に濃塩酸を加えｐＨ４．６に調整したところ、わずか
に沈澱を生じた。生じた沈澱をシャープレスによって除
き、上澄液　１６０リットルを得た。これに硫安８０ｋ
ｇ　（７０％飽和）　を加え、４℃、１６ｈｒ放置した
ところ、塩析物が液表面に浮いた。この沈澱物をすくい
取り、７８０ｇの硫安沈澱物を得た。 【００２１】この沈澱物を５０ｇ取り、それを最小液量
の０．０２Ｍ酢酸Ｂ　（ｐＨ５．２）　に溶解、不溶物
を遠心により除去した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５
　Ｍｅｄｉｕｍで脱塩した。脱塩したサンプルを凍結乾
燥し、４．７２ｇのリパーゼパウダーを得た。このリパ
ーゼパウダーは、１６００ｕ／ｇパウダーであり活性回
収率８５％、これを０．０２Ｍ　酢酸Ｂ　（ｐＨ５．６
）　に溶かした時の比活性は６５ｕ／ｍｇであった。 【００２２】■　　■で得たリパーゼパウダー２．３６
ｇを２３．６ｍｌの０．０２Ｍ　酢酸Ｂ　（ｐＨ５．２
）　に溶解し、それに４Ｍ　硫安１４．７５ｍｌ　を加
え硫安濃度を１．５Ｍ　に調整した。これを内径２．３
ｃｍ、長さ５０ｃｍ、ベッド体積２１０ｍｌ　のファル
マシアＰｈｅｎｙ　ＣＬ４Ｂにチャージし、１．５Ｍ　
硫安、０．０２Ｍ　酢酸Ｂ　（ｐＨ５．２）　で洗浄後
、０．０２Ｍ　酢酸Ｂ　（ｐＨ５．６）　で吸着画分を
溶出した。活性は全て０．０２Ｍ　酢酸Ｂ　（ｐＨ５．
６）　溶出画分にあり、活性画分を回収後フォローファ
イバーで濃縮し液量１３０ｍｌ　にした。この時比活性
７７ｕ／ｍｇ、全活性２０００ｕ、活性回収率５３％で
あった。次にこのうち７１ｍｌを、ＨＰＬＣ　（Ｗａｔ
ｅｒｓ　Ｍ６００　マルチソルベントシステム）　、カ
ラムＴＳＫｇｅｌ　Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ　７．５ｍｍ
　ＩＤ×７．５ｃｍを用い、条件０分→３０分、１．５
Ｍ　硫安、０．０２Ｍ　酢酸Ｂ　（ｐＨ５．２）　アイ
ソクラテック、流速１ｍｌ／ｍｉｎ　。３０分→９０分
、１．５→０Ｍ　硫安、０．０２Ｍ　酢酸Ｂ、グラディ
エント、流速１ｍｌ／ｍｉｎ　で分画した。　（チャー
ジは２０ｍｌ＋１７ｍｌ＋１７ｍｌ＋１７ｍｌ；４回に
分け、それぞれ４Ｍ　硫安を加えて行った。）　活性フ
ラクションは互いに混合せず、液体チッ素で瞬間凍結後
−７０℃で保存した。このサンプルの比活性は　２４０
〜３００ｕ／ｍｇで、全活性は５００ｕ、活性回収率４
４％であった。 【００２３】■　　■で得られた各活性フラクションを
相互に混合せずに、全活性として６００ｕ分を、ＨＰＬ
Ｃ　（Ｗａｔｅｒｓ　Ｍ６００　マルチソルベントシス
テム）　、カラム、ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ　７．
５ｍｍ　ＩＤ×６０ｃｍに０．５ｍｌ〜０．７ｍｌづつ
チャージしてゲル濾過を行った。　（条件、平衡Ｂ　０
．２Ｍ　ＮａＣｌ、０．０２Ｍ　酢酸Ｂ、流速１ｍｌ／
ｍｉｎ　。）これによって得られたサンプルは、比活性
　１４２ｕ／ｍｇ、活性回収率は８０％であった。また
ゲル濾過による分子量は、同条件でスタンダードサンプ
ルを流した結果から、９８０００　と計算された。 【００２４】■　　■で得られたサンプルのうち、全活
性　３３０ｕ分をファルマシアＦＰＬＣ、カラムＭｏｎ
ｏ　Ｓ　ＨＲ５／５　（陽イオン交換）　にかけた。ゲ
ル濾過したサンプルは０．２Ｍ　のＮａＣｌを含むため
、ＦＰＬＣ、ファーストディソルティングカラムをＨＲ
１０／１０　を用い脱塩し、Ｍｏｎｏ　Ｓに通すサンプ
ルを調整した。なおファーストディソルティングカラム
を通した時の活性回収率は７５％であった。またその条
件は、流速２ｍｌ／ｍｉｎ　、平衡Ｂ、０．０２Ｍ　酢
酸Ｂ。（Ｍｏｎｏ　Ｓ　の条件は、０．０２Ｍ　酢酸Ｂ
→１ＭＮａＣｌ、０．０２Ｍ　酢酸Ｂ　（ｐＨ５．２）
　６０分グラディエント、流速１ｍｌ／ｍｉｎ　。）　
Ｍｏｎｏ　Ｓによって得られた蛋白のピークとリパーゼ
活性は一致した。このサンプルの比活性はリパーゼが　
２８０ｕ／ｍｇで活性回収率は５０％であった。 【００２５】このリパーゼは、電気泳動より分子量３３
０００　と予測される。ここまでの精製のまとめを表１
（各ステップとも最終標品を得るための量に換算されて
いる。）に示す。 【００２６】 【表１】 【００２７】（３）　Ｎ末端アミノ酸配列の決定■　（
２）で精製したリパーゼをシークエンス分析の結果、こ
の蛋白は、以下の表２にみられるようにＮ末端側の各順
位においてそれぞれ２種のアミノ酸が検出されることに
より、２種のサブユニットからなっており、その構成量
比は　１：１　であることが明らかとなった。 【００２８】 【表２】 【００２９】■　　Ｍｏｎｏ　Ｓで精製したサンプルは
表２に示す様に２種のサブユニットを含んでいるため、
一方のサブユニットのＮ末端アミノ酸配列を明らかにす
れば他方のＮ末端アミノ酸配列よりも明らかになると考
え、等電点電気泳動を用いて分離を行った。リパーゼ画
分　（リパーゼ画分とは　Ｐｈｅｎｙｌ　５ＰＷ後のサ
ンプルを言う）　を内径６ｍｍ、長さ１３ｃｍのガラス
管カラムで等電点電気泳動しクマジ染色の後、単一バン
ドであるｐＩ　９．３０　のバンドを切り出した。ブロ
ッティングにより、この蛋白をミリポアイモビロントラ
ンスファーメンブレン　（材質Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄ
ｅｎｅ　ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ，Ｃａｔ．　ＮＯ．　Ｉ
ＰＶＨ３０４ＦＯ）　に移し、メンブレンごとアミノ酸
シークエンサーにかけＮ末端アミノ酸配列を決定した。 結果を表３（ＩＥＦ　ｐＩ　９．３０バンドのＮ末端ア
ミノ酸配列）に示す。 【００３０】 【表３】 【００３１】そして、この表３の配列は２種のサブユニ
ットのうちの一方のＮ末端側のアミノ酸配列を表わすか
ら、表２の各配列の順位において、この表３のアミノ酸
以外の表２のアミノ酸が他方のサブユニットにおけるア
ミノ酸配列上のアミノ酸ということになる。このように
して以下の表４に示す２種のサブユニットα、βＮ末端
アミノ酸配列を決定した。 【００３２】 【表４】 【００３３】 【実施例２】（１）　ゲノムＤＮＡの調整Ｒｈｉｚｏｐ
ｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ　ＡＪ６０４５　菌体１６ｇを液
体窒素存在下、乳鉢と乳棒により破砕し、　１５０ｍｌ
の０．５Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ　バッファー　（ｐＨ８．０）　を加え
よく懸濁させた。数秒間ポリトロンをかけた後１５０ｍ
ｌ　の０．５Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ８．０）　２００μｇ／ｍｌ　Ｐｒ
ｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ，１％　Ｓａｒｃｏｓｙｌ　を加
え、５０℃で３時間放置した。 バッファー飽和フェノールを等量加え、攪拌し、遠心機
にかけた後、水相を取る操作　（以後フェノール処理と
いう）　を３回繰り返した。水相を５０ｍＭＴｒｉｓ　
（ｐＨ８．０）　、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　、１０ｍＭ　
ＮａＣｌ　に対し透析し、得られたサンプルにＲＮａｓ
ｅ　を１００μｇ／ｍｌ加え、３７℃、３時間反応させ
た。 フェノール処理の後、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ８．
０）　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　溶液に対して透析し、１０
分の１体積の２．５Ｍ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ａｃｅｔａｔａ
　（ｐＨ５．２）を加え、２倍量のエタノールを加えて
、−２０℃で１夜放置した。遠心して沈澱を集め　（以
後この操作をエタノール沈澱という）　その沈澱をＣｓ
Ｃｌ−ＥｔｄＢｒ平衡密度勾配超遠心し、ＤＮＡのバン
ドを回収し、それを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）
　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　に対し透析しゲノムＤＮＡを得
た。 （２）　ゲノムライブラリーの作製 ゲノムＤＮＡ（２３０μｇ／ｍｌ）２３０μｌ、１０×
Ａバッファー　（ベーリンガーマンハイム社製５−バッ
ファーシステム）　４６μｌ、　Ｈ２Ｏ　２３０μｌ、
Ｓａｕ３ＡＩ　（宝社製制限酵素）　１．６μｌ　を加
え３７℃、６５秒反応した後、フェノール処理をし、溶
液中のフェノールをエーテルによって除いた。エタノー
ル沈澱の後、１ｍｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ８．
０）　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　を加え、その内の６μｌ　
に、λファージ　ＥＭＢＬ３　（プロメガ社より購入）
　２μｌ（１μｇ）、１μｌ　の０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ　
（ｐＨ７．４）　、０．１Ｍ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＡＴ
Ｐ、０．１Ｍ　ＭｇＣｌ２　、及びＴ４　ＤＮＡリパー
ゼ　（宝社より購入）　を加え、１１℃、１夜放置した
。この反応液を、インビトロパッケージングキット　（
アマシャム社より購入）　の指示に従ってパッケージン
グし、ライブラリーを作製した。 （３）　合成ＤＮＡプローブの作製 決定されたＮ末端アミノ酸配列をもとに図１に示すよう
にＤＮＡを設計し、アプライドバイオシステムズ社製　
３８０Ａ　ＤＮＡシンセサイザーを用いてフォスフォア
ミダイド法でプローブを作製した。但し、βサブユニッ
トプローブに関しては、Ｎ末端アミノ酸配列データをも
とに作製した。正確なアミノ酸シークエンサーでの分析
結果よりβＮ末端配列は、Ｖａｌ，　Ｓｅｒ，　Ｇｌｙ
，　Ｌｙｓ，　Ｓｅｒ，　Ｇｌｙ，　Ｓｅｒ，　Ｓｅｒ
，　Ａｓｎ，　Ｔｈｒ，　Ａｌａ，　Ｖａｌ，　Ｓｅｒ
，　Ａｌａ，　Ｓｅｒ，　Ａｓｐ，　Ａｓｎ，　Ａｌａ
，　Ａｌａ　である。 （４）　プローブのアイソトープラベル合成ＤＮＡプロ
ーブ５０ｐｍｏｌｅ　に３μｌ　の０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ
　（ｐＨ７．６）、０．１Ｍ　ＭｇＣｌ２　、０．０５
Ｍ　ＤＴＴ　、０．００１Ｍ　ＥＤＴＡ　、１μｌ　Ｔ
４　ポリヌクレオチドカイネース　（宝社より購入）　
１０μｌ　〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰ　（アマシャム社より
購入）　を混合し、　Ｈ２Ｏ　で液量を３０μｌ　にし
た。。３７℃、６０分反応させた後、フェノール処理を
行い、セファデックスＧ−５０　によるゲル濾過を行っ
てアイソトープラベルしたプローブを得た。 （５）　スクリーニング インビトロパッケージングキット　（アマシャム社製）
　に示された方法に従ってファージをプレーティングし
、プレートを４℃に冷やした後、表面にニトロセルロー
スフィルターを密着させてファージをフィルター上に移
した。フィルターを１．５Ｍ　ＮａＣｌ、０．５Ｍ　Ｎ
ａＯＨ溶液に浸し、付着したＤＮＡを変性させ、１．５
Ｍ　ＮａＣｌ、０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ８．０）溶
液で中和した。さらに０．３６Ｍ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ
　ＮａＨ２ＰＯ４　（ｐＨ７．４）、２ｍＭ　ＥＤＴＡ
　（ｐＨ７．４）　でリンスした後乾燥させた。このフ
ィルターを以下に示す溶液に浸し５０℃、１夜ハイブリ
ダイゼーションを行った。〔溶液：５ｍｌのＣａｒｒｉ
ｅｒ　ＤＮＡ　（Ｓａｌｍｏｎ　５ｍｇ／ｍｌ）　、２
５ｍｌの１ｍＭ　ＥＤＴＡ　を加え１００℃５分処理し
急冷した。５０ｍｌの１０×ＳＳＣ（１０×ＳＳＣ　と
はＮａＣｌ　８７．５ｇ、Ｎａ＋　−ｃｉｔｒａｔｅ　
４４ｇ、　Ｈ２Ｏ　を加え１リットルとする）　０．２
％　ＳＤＳ、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ　を加え、２０ｍｌの
１％　ＢＡＳ、１％ＰＶＰ　（ＰＶＰ−３６０）１％　
Ｆｉｃｏｌｌ　４００　を加えたものにアイソトープラ
ベルしたプローブを加えたもの。〕ハイブリダイズ終了
後２．５×ＳＳＣ　で洗浄し、乾燥させたオートラジオ
グラフをとった。オートラジオグラフィーの結果、約６
０株のポジティブクローンを得た。 （６）　塩基配列決定 ポジティブクローンよりプレートライゼット法によって
　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（
１９８２））ファージＤＮＡを調整し、挿入されたＤＮ
Ａを　ｐＵＣ１８　（宝社より購入）　に乗せ換えＰＬ
ＤＡ　ｌｌｌを作製した。　（このプラスミドを含有す
るＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株は工業技術院微生物工業
技術研究所にＦＥＲＭ　Ｐ−１１２１２として寄託され
ている。）ＰＬＤＡ　ｌｌｌ　中のプローブと親和性の
ある部分について塩基配列を決定した。塩基配列決定は
　ＤＥＡＺＡシークエンスキット（宝酒造社製）　を用
い、その指示に従った。決定した塩基配列を下記配列表
中「配列番号２」及び「配列番号８」に示す。「配列番
号８」の中で各サブユニットα，βのコーディング領域
と考えられる部分をアミノ酸に翻訳してある。　（サブ
ユニットα…「配列番号４」，　サブユニットβ…「配
列番号３」参照）　また　２０３〜２０８　のＣＣＴＡ
ＡＴと２６１〜２６５　の　ＴＡＴＡＡ配列は真核生物
のプロモーター配列であり、１５９９〜１６０５のＡＡ
ＴＡＡＡはポリアデニレーションシグナルである。また
　４５６〜５１２　がβサブユニットのＮ末端プローブ
に相当する部位であり、　６５７〜７１４　がαサブユ
ニットのＮ末端プローブに相当する部位である。また１
１５２〜１１９６に他のリパーゼと相同性のあるアミノ
酸配列をコードする部分がある。 【００３４】 【実施例３】（１）　ｍＲＮＡの調整 凍結した菌体（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ　Ａ
Ｊ６０４５）　を液体窒素中で乳鉢と乳棒を用いて破砕
し、１ｇの菌体に対し５ｍｇの　ＤＴＴを添加、さらに
１ｇの菌体に対し２．６ｍｌの０．２Ｍ　ＮａＢｏｒａ
ｔｅ　（ｐＨ９．０）、１％　ＳＤＳ、３０ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ　、１０ｍＭ　Ｖａｎａｄｙｌ−ｒｉｂｏｎｕｃｌ
ｅｏｓｉｄｅ（これを　ＸＴＢと言う、９０〜９５℃）
　を加え、ポリトロンをかけた。Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ
ｋ　を０．５ｍｇ／ｍｌになるように加え、４０℃で２
時間放置した。１ｍｌの　ＸＴＢに対し８０μｌ　の２
Ｍ　ＫＣｌ　を加え、氷上１時間放置した。１２０００
ｒｐｍで２０分、４℃で遠心し、沈澱を２Ｍ　ＬｉＣｌ
で２回洗浄した。１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７．５）
　に約２ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、酢酸カリウム
　（２００ｍＭ）を加えた後エタノール沈澱した。沈澱
を２ｍｌの　Ｈ２Ｏ　に溶かし、６５℃、１分間加熱し
た。２ｍｌの１．５Ｍ　ＮａＣｌ、２ｍｌの２０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７．６）　を加え、セルロースカラム
を通し、非吸着画分をオリゴｄＴセルロースカラムに吸
着させた。この時カラムの平衡化には０．４Ｍ　ＮａＣ
ｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７．６）（これをＢｉ
ｎｄｉｎｇ　Ｂと言う）　を用いた。３０ｍｌの　Ｂｉ
ｎｄｉｎｇ　Ｂで洗浄して、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐ
Ｈ７．６）　でＰｏｌｙＡ　ＲＮＡを溶出した。０．５
Ｍとなるように５Ｍ　ＮａＣｌを加え、再度Ｏｌｉｇｏ
　ｄＴセルロースカラムに吸着させ、２０ｍｌの　Ｂｉ
ｎｄｉｎｇ　Ｂで洗浄し、さらに１０ｍｌの０．４Ｍ　
ＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７．６）　で洗
った。１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７．６）　で溶出し
、ＰｏｌｙＡ　ＲＮＡを得た。 （２）　ｃＤＮＡライブラリーの作製 アマシャム社製のｃＤＮＡ合成システムプラスを用いｃ
ＤＮＡ合成を行った。方法はキットの指示に従った。作
製されたｃＤＮＡを材料にしてアマシャム社製ｃＤＮＡ
クローニングシステムλｇｔ　１０ｖｅｒ，　２．０を
用いてライブラリーの作製を行った。方法はキットの指
示に従った。 （３）　スクリーニング、塩基配列決定作製されたｃＤ
ＮＡライブラリーをもとに実施例２の（３）（４）（５
）の方法に従ってｃＤＮＡクローンを多数得た。　（６
）の方法に従い塩基配列の決定を行った。ｃＤＮＡイン
サートを含むｐＵＣ１８　を　ｐＬｃＤＮＡ６−１−２
と言い、このプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０
９は工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＲＭ　Ｐ−
１１２１３として寄託されている。 決定した塩基配列を下記配列表中「配列番号５」及び「
配列番号９」に示す。「配列番号９」でα，　β各サブ
ユニットコーディング領域と考えられる部分をアミノ酸
に翻訳してある　（サブユニットβ−「配列番号７」，
　サブユニットα−「配列番号４」参照）　。なお、α
コーディング領域とβコーディング領域とは連続してい
る。該配列中　１１８〜１７４　部位がβサブユニット
のＮ末端プローブに相当し、　３１９〜３７５　部位が
αサブユニットのＮ末端プローブに相当する。 【００３５】これによりゲノムではα配列中　４７Ｌｙ
ｓとなっているがｃＤＮＡでは　４７Ｇｌｕとなってい
る。なお、β配列中アミノ酸配列にして１〜２８はβの
シグナル配列であると考えられる。 【００３６】 【実施例４】（１）　Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
　における発現　ｐＬｃＤＮＡ６−１−２を　ＥｃｏＲ
ｌでカットし、そのままライゲーションすることによっ
て、ｃＤＮＡインサートが　ｐＬｃＤＮＡ６−１−２と
は逆方向に挿入されたプラスミッド　ｐＬｃＤＮＡ６−
１−２Ｅｘを作成した。このプラスミッドをＥ．ｃｏｌ
ｉ　ＪＭ１０９に導入したところ、この菌株はトリブチ
リンを０．５％懸濁したＬ−Ｂｒｏｔｈ　培地　（Ｂａ
ｃｔｏＴｒｙｐｔｏｎ　１０ｇ，　ＢａｃｔｏＹｅａｓ
ｔＥｘｔｒａｃｔ　５ｇ，　ＮａＣｌ　５ｇ）でリパー
ゼ活性を示すハローを作ることが分かった。またこの菌
株をＭ９培地　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ，　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｍａｎｉａｔｉｓ）　で
液体培養し、菌体内リパーゼ活性をリパーゼキットＳで
測定したところ、以下の表５に示すように明らかな活性
発現が観察された。 【００３７】 【表５】 【００３８】（２）　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現 ｐＬｃＤＮＡ６−１−２をＥｃｏＲｌ　でカットしｃＤ
ＮＡインサートを回収した。このインサートにＸｈｏｌ
Ｌｉｎｋｅｒを接続し、Ｙｅａｓｔ　のベクターｐＡＭ
８２（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ　ｓｔ　ａｌ．，　１９８
３）のＸｈｏｌサイトに挿入した　（図２）　。挿入方
向が、アルカリホスファターゼのプロモーターによって
リパーゼ遺伝子が発現される形になっているものをシー
クエンシングによって確認し、ｐＬＹＥ３８とした。こ
のｐＬＹＥ３８をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ　ＡＨ２２　にトランスフォームし得ら
れた菌を　（この菌は工業技術院微生物工業技術研究所
にＦＥＲＭ−１１９０８として寄託されている）　、０
．５％トリブチリンを懸濁したＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ’
ｓ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｍｅｄｉｕｍ　（Ｂｏｓｔｉａｎ
　ｓｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ
．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７７，　４５０４−４５０８
（１９８０））　プレートにおいてリパーゼ発現を検定
したところ、アルカリフォスファターゼプロモーターの
誘導条件であるリン酸マイナスのときのみハローを形成
することが分かり、Ｙｅａｓｔ　においてリパーゼ蛋白
を発現することに成功した。 【００３９】 【配列表】（１）　配列番号　　；１ 配列の長さ；３９２ 配列の型　　；アミノ酸 トポロジー；直鎖状 配列の種類；蛋白 配列　　　　　　； 【００４０】 【化１】 【００４１】 （２）　配列番号　　　　；２ 配列の長さ　　；１８６０ 配列の型　　　　；核酸 鎖の数　　　　　　；二本鎖 トポロジー　　；直鎖状 配列の種類　　；　ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ起源　　生物
名；リゾップス・デレマー　（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅ
ｌｅｍａｒ）　 株　　名；ＡＪ６０４５　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０５５０
）　配列の特徴　　；２０３−２０８　及び２６１−２
６５　真核生物のプロモーター配列 １５９９−１６０５　ポリアデニレーションシグナル４
５６−６５６　　　サブユニットβのコーディング領域
６５７−１５４７　　サブユニットαのコーディング領
域１１５２−１１９６　他のリパーゼと相同性のあるア
ミノ酸配列をコードする部分 配列　　　　　　　　；　　 【００４２】 【化２】 【００４３】 【化３】 【００４４】 （３）　配列番号　　；３ 配列の長さ；６７ 配列の型　　；アミノ酸 トポロジー；直鎖状 配列の種類；ペプチド 配列　　　　　　； 【００４５】 【化４】 【００４６】 （４）　配列番号　　；４ 配列の長さ；２９７ 配列の型　　；アミノ酸 トポロジー；直鎖状 配列の種類；ペプチド 配列　　　　　　； 【００４７】 【化５】 【００４８】 （５）　配列番号　　　　；５ 配列の長さ　　；１５２２ 配列の型　　　　；核酸 鎖の数　　　　　　；２本鎖 起源　　　　株名；ＡＪ６０４５　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１
０５５０）　配列の特徴　　；３４−１１７　　　　Ｓ
ｉｇｎａｌ１１８−３１８　　　サブユニットβコーデ
ィング領域３１９−１２０９　　サブユニットαコーデ
ィング領域配列　　　　　　　　； 【００４９】 【化６】 【００５０】 【化７】 【００５１】 （６）　配列番号　　；６ 配列の長さ；３９２　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　配列の型　　；アミノ酸 トポロジー；直鎖状 配列の種類；ペプチド 配列　　　　　　； 【００５２】 【化８】 【００５３】 （７）　配列番号　　；７ 配列の長さ；６７　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　配列の型　　；アミノ酸 トポロジー；直鎖状 配列の種類；（ペプチド）　 配列　　　　　　； 【００５４】 【化９】 【００５５】 （８）　配列番号　　　　；８ 配列の長さ　　；１８６０ 配列の型　　　　；核酸 鎖の数　　　　　　；二本鎖 トポロジー　　；直鎖状 配列の種類　　；ｇＤＮＡ 起源　　生物名；リゾップス・デレマー　（Ｒｈｉｚｏ
ｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ）　 株　　名；ＡＪ６０４５　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０５５０
）　配列の特徴　　；２０３−２０８　及び２６１−２
６５　真核生物のプロモーター配列 １５９９−１６０５　ポリアデニレーションシグナル４
５６−６５６　　　サブユニットβのコーディング領域
６５７−１５４７　　サブユニットαのコーディング領
域１１５２−１１９６　他のリパーゼと相同性のあるア
ミノ酸配列をコードする部分 配列　　　　　　　　； 【００５６】 【化１０】 【００５７】 【化１１】 【００５８】 【化１２】 【００５９】 （９）　配列番号　　　　；９ 配列の長さ　　；１５２２ 配列の型　　　　；核酸 鎖の数　　　　　　；２本鎖 トポロジー　　；直鎖状 配列の種類　　；ｃＤＮＡ 起源　　生物名；リゾップス・デレマー　（Ｒｈｉｚｏ
ｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ）　 株　　名；ＡＪ６０４５　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０５５０
）　配列の特徴　　；３４−１１７　　　　Ｓｉｇｎａ
ｌ１１８−３１８　　　サブユニットβコーディング領
域３１９−１２０９　　サブユニットαコーディング領
域配列　　　　　　　　； 【００６０】 【化１３】 【００６１】 【化１４】 【００６２】 【化１５】

【図面の簡単な説明】

【図１】合成ＤＮＡプローブ設計を表す図である。ＤＮ
Ａ配列はアンチセンス配列になっている。

【図２】イースト中でリパーゼ活性を発現するプラスミ
ドｐＬＹＥ３２の作成過程を示す。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　「配列番号１」または「配列番号６」
   記載のアミノ酸配列をコードするリパーゼ遺伝子。
2. 【請求項２】　　遺伝子が「配列番号２」または「配列
   番号５」記載のＤＮＡ配列で表される請求項１記載のリ
   パーゼ遺伝子。
3. 【請求項３】　　請求項１又は請求項２記載のリパーゼ
   遺伝子を含む組換えプラスミド。
4. 【請求項４】　　請求項１又は請求項２記載のリパーゼ
   遺伝子を含む組換えプラスミドで形質転換された酵母。
5. 【請求項５】　　請求項４記載の酵母を培地中で培養し
   、生成蓄積されたリパーゼを採取することを特徴とする
   リパーゼの製造方法。
6. 【請求項６】　　「配列番号３」または「配列番号７」
   記載のアミノ酸配列を有するサブユニットβ及び「配列
   番号４」記載のアミノ酸配列を有するサブユニットαを
   含む新規リパーゼ。
7. 【請求項７】　　「配列番号３」又は「配列番号７」記
   載のアミノ酸配列を有するサブユニットβを含む新規リ
   パーゼ。