JP2001503630A - 脂肪酸アミドヒドロラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 シス−９，10−オクタデセノアミド及びその他の催眠性脂肪酸一級アミドの催眠活性が脂肪酸アミドヒドロラーゼ(FAAH)の存在下の加水分解により中和される。FAAHによるシス−９，10−オクタデセノアミドの加水分解は、催眠活性を有しない化合物であるオレイン酸の生成をもたらす。FAAHが単離され、FAAHをコードする遺伝子がクローン化され、配列決定され、組換えFAAHを発現するのに使用された。FAAHのインヒビターがヒドロラーゼ活性を阻止することが開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 脂肪酸アミドヒドロラーゼ 発明の詳細な説明 技術分野 本発明は催眠性脂肪酸一級アミドとそれらの相当する脂肪酸の間の加水分解的 変換を触媒作用し、脂肪酸アミドヒドラーゼ(FAAH)と称される酵素、このような 変換の酵素触媒作用方法、及びこのような変換の酵素触媒作用の抑制方法に関す る。更に特別には、本発明は単離された形態または組換え形態のFAAHタンパク質 並びにその使用及び抑制に関する。政府の権利の記述 本発明はNational Institutes of Health Shared Instrumentation補助金No.1 S10 RR07273-01のもとに政府の支持によりなされた。政府は本発明に或る種の 権利を有する。背景 睡眠は、生体がそれ自体休息し、その生理力が回復される自然の周期的挙動状 態である。それは環境に対する反応性の損失を特徴とする。睡眠中に、生体及び 脳の両方の或る生理プロセスは、それらが警戒を怠らない目覚め中に機能するの とは異なって機能する。正常な睡眠は少なくとも二つの全く異なる挙動状態：同 調睡眠（その間、脳波は高振幅の遅い波からなる）と、脱同調された(desynchr- onized)睡眠(DS)又は迅速な眼球運動を特徴とする活性化された睡眠(REM睡眠)（ 脳波パターンが高周波数及び低振幅を特徴とする）からなる。更に、同調された 睡眠は遅く、かつ規則的な呼吸、比較的一定の心拍数及び血圧、並びにデルタ波 の支配を特徴とする。同調された睡眠は、通常、四つの段階からなり、続いて活 性化された睡眠の期間がある。夫々のサイクルは80〜120分間続く。対照的に、 脱同調された睡眠は不規則な心拍数及び呼吸、不随意の筋肉の反射及び運動の期 間、並びに覚醒の高い閾値を更に特徴とする。脱同調された睡眠の期間は５〜20 分間続き、正常な夜の睡眠中に約90分間の間隔で起こる。 睡眠障害は睡眠遮断及び睡眠発作、即ち、ナルコレプシーを含む。睡眠の開始 を促進もしくは抑制し、又は睡眠状態もしくは目覚め状態を維持するための薬理 学的方法は知られていなかった。 脳髄液は、四つの脳室並びに脳及び脊髄の周囲のクモ膜下の間隙中を循環する 無色透明の液体である。脳髄液は第三及び第四の側脳室中で脈絡叢により分泌さ れた血液の限外濾過液として生じる。又、脳髄液は時折髄液と称される。四つの 脳室及びクモ膜下の間隙を通過した後、脳髄液はクモ膜下の柔毛により静脈系に 殆ど再吸収される。脳髄液はそれにより潤された組織からの異化代謝産物、排泄 物、及び老廃物の除去のための媒体として利用できる。現在まで、脳髄液に由来 する因子は睡眠遮断と相関関係があると報告されていなかった。必要とされるも のは、睡眠遮断と相関関係がある物体により生じた生化学的因子を同定するため の脳髄液の分析方法である。 プロスタグランジンの独創的な発見以来、重要な生理プロセスにおける脂肪酸 及びそれらの誘導体の役割が次第に認識されてきている（例えば、B.Samuelsson ，Les Prix Nobel 1982，153-174頁）。 シス−９，10−オクタデセノアミドは睡眠遮断されたネコの脳髄液から単離さ れ、ラットに注射された時に睡眠誘発性を示すことが示されていた。シス−９， 10−オクタデセノアミドの他のその他の脂肪酸一級アミドがネコ、ラット、及び ヒトの脳髄液の天然成分として同定され、これらの化合物が脳脂質の特有のファ ミリーを含むことを示した。一緒になって、これらの結果は、脂肪酸一級アミド が被験者の睡眠誘発に使用し得る生物学的シグナリング分子の新しいクラスに相 当することを教示する。好ましい脂肪酸一級アミドは不飽和を有するアルキル鎖 を含み、下記の式により表される。 NH₂C(O)(CH₂)(6≧n≦11)CH=CH(CH₂)(8≧n≦5)CH₃。好ましい催眠性脂肪酸一級ア ミドはそれらのアルキル鎖中にシス配置で不飽和を有する。シス−９，10−オク タデセノアミドの他に、その他の催眠活性脂肪酸一級アミドとして、シス−８， ９−オクタデセノアミド、シス−11，12−オクタデセノアミド、及びシス− 13，14−ドコセノアミドが挙げられる。 Deutschら(Biochem．Pharmacol.，46:791(1993))は神経芽細胞腫、グリオーマ 細胞及びラット脳組織の粗ホモジネートから採取された膜細胞下のフラクション からのアラキドニルエタノールアミド（アナンドアミド）の加水分解及び合成の 両方を触媒作用するアミダーゼ活性を同定した。その研究は、ラットの心臓及び 骨格筋からではなく、脳、肝臓、腎臓及び肺からの組織のホモジネートからアラ キドニルエタノールアミド（アナンドアミド）からアラキドン酸へのとり込み及 び酵素分解（及びその逆）を検出した。 このアミダーゼ活性を示す活性膜フラクションは、所望の細胞系を均質化し、 続いて粗ホモジネートを密度遠心分離にかけることにより、又はラット脳の粗ホ モジネートを採取し、それらをアナンドアミドとともに直接インキュベートする ことにより調製された。 アラキドニルエタノールアミド（アナンドアミド）のとり込み及び分解が細胞 培地中で［³H］−アナンドアミド(NEN、NET-1073、210Ci/ミリモル)のインキュ ベーションにより分析された。水相及び有機相の液体シンチレーションカウンテ ィングにより、アラキドン酸及びアナンドアミドが有機相に分布されるこがわか った。こうして、細胞培地の有機抽出物が続いて薄層クロマトグラフィーを使用 して視覚化され、表面オートラジオグラフエンハンサー(EN³HANCE、Dupont)で噴 霧され、-80℃でＸ線フィルム(Kodak X-OMAT AR)に露出された。 セリンプロテアーゼインヒビターであるフェニルメチルスルホニルフルオリド は1.5mMの濃度でアミダーゼ活性を完全に抑制した。試験されたその他のインヒ ビターはその活性に対し殆ど効果を有せず、又は全く効果を有せず、それらはア プロチニン、ベンゾアミジン、ロイペプチン、キモスタチン及びペプスタチンを 含んでいた。 第二の原稿中で、Deutschら(J.Biol Chem.，1994，269，22937)はアナンドア ミド加水分解の特定のインヒビターの幾つかの型の合成及びアナンドアミド分解 をin vitroで抑制するそれらの能力を報告している。化合物の四つのクラスが合 成され、脂肪アシルエタノールアミド、α−ケトエタノールアミド、α−ケトエ チルエステル及びトリフルオロメチルケトンを含む。これらの化合物の最も有効 なクラスはトリフルオロメチルケトン及びα−ケトエチルエステルであった。最 も効力のないインヒビターはアナンドアミドのα−ケトアミド及び飽和類縁体で あった。 一例として、アナンドアミドが神経芽腫細胞とともにインキュベートされる場 合、それはアラキドネートに迅速に加水分解されるが、インヒビターアラキドニ ルトリフルオロメチルケトンの存在下では、アナンドアミドレベルの５倍の増加 がある。その研究は、トリフルオロメチルケトン中に見られるような極性カルボ ニルが求核性残基とアナンドアミドのカルボニル基の反応中に生成された四面体 中間体を模擬する安定化された水和物を生成し得ることを推論している。Deutsc hは、求核性残基が加水分解酵素中のセリンヒドロキシルの活性部位であるかも しれないと示唆している。 この酵素は、その酵素がペプチド結合以外の炭素窒素結合に対し作用するアミ ダーゼ(EC#3.5)として分類される。アミダーゼ活性はセリンプロテアーゼインヒ ビターであるPMSFにより抑制され、トリフルオロメチルケトンインヒビター（及 びその他）の作用はその酵素の加水分解活性に直接影響する。更に、Deutschは 、アナンドアミドが活性部位セリンヒドロキシル基を伴うメカニズムにより開裂 されると示唆している。 必要とされることは、これらの化合物の催眠活性を媒介するための、脳脊髄中 に見られる催眠性化合物の分解を触媒作用する脳組織中の酵素の同定である。必 要とされることは、脳髄液中に見られる型の催眠性化合物を分解する酵素の活性 を抑制するためのインヒビターの同定である。発明の要約 催眠性脂肪酸一級アミドを分解し、脂肪酸アミドヒドロラーゼ、またはFAAHと 称される酵素が本明細書に開示される。FAAHは催眠性脂肪酸一級アミドを含む脂 肪酸一級アミドの活性を媒介する酵素の一種である。 本明細書に開示されるように、FAAHは下記のスキーム１に示されるようにその 他の基質の中でオレイン酸へのシス−９，10−オクタデセノアミドの変換を触媒 作用するための酵素活性を特徴とし、それ故、当初にはシス−９，10−オクタデ セノアミダーゼとして同定された。しかしながら、FAAHは種々の脂肪酸一級アミ ドを加水分解する活性を有することが今示され、それ故、シス−９，10−オクタ デセノアミダーゼと当初称されたアミダーゼはFAAHと更に適切に称される。 スキーム１ 本発明の一つの局面がFAAHの精製形態に関する。FAAHはクロマトグラフィー方 法を含む種々の方法により精製される。好ましいクロマトグラフィー方法として 、アフィニティークロマトグラフィー、電気クロマトグラフィー、ゲル濾過クロ マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び分配クロマトグラフィー が挙げられる。アフィニティークロマトグラフィーにおいて、固相吸着剤は特別 なタンパク質を結合する基を含む。何となれば、それらはタンパク質が自然アフ ィニティーを有するリガンドに似ているからである。好ましい様式において、固 相吸着剤はその酵素を結合する一種以上のFAAHインヒビターを含む。抗体アフィ ニティークロマトグラフィーにおいて、FAAHに対する結合特異性を有する抗体を 有する固相免疫吸着剤が使用される。電気クロマトグラフィー又は電気泳動にお いて、FAAHはその分子量又は等電点に応じてその他の分子から分離される。ゲル 透過、モレキュラーシーブ、及び排除クロマトグラフィーとしても知られている ゲ ル濾過において、固相がゲル溶媒の静止相及び排除された溶媒の移動相を生じる 。FAAHはその分子サイズに応じて分離される。何となれば、それが静止相と移動 相の間で分配するからである。ゲル粒子はFAAHを越える排除サイズを有するよう に選択される。イオン交換クロマトグラフィーにおいて、固相イオン交換樹脂が イオン力と非イオン力の間のその分配に応じてFAAHをその他の分子から分離する のに使用される。分配クロマトグラフィーにおいて、静止相及び移動相を有する 不混和性液体が二つの不混和相の間のその分配に応じてFAAHを分離するのに使用 される。好ましいクロマトグラフィー方法として、DEAEクロマトグラフィー、FA AHのインヒビター、例えば、トリフルオロケトンで誘導体化されたHg基を付着し た固相によるアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。 好ましい様式において、FAAHの粗起源が四つの工程で精製される。第一工程に おいて、FAAHの粗起源がDEAEクロマトグラフィーカラムを使用する交換クロマト グラフィーにより精製されて第一溶離生成物を生成する。第二工程において、第 一工程からの溶離生成物がアフィニティークロマトグラフィーで分配することに より更に精製されて第二溶離生成物を生成する。第三工程において、第二工程か らの溶離生成物がヘパリンアフィニティークロマトグラフィーで分配することに より更に精製されて第三溶離生成物を生成する。第四工程において、第三工程か らの溶離生成物がFAAHのトリフルオロケトンインヒビターで誘導体化された静止 相で分配することにより更に精製される。第四工程からの溶離物がFAAHの精製形 態を生成する。 FAAHは本明細書に記載されるようにラット、マウス又はヒトを含む種々の哺乳 類種のいずれからも単離し得る。 脂肪酸アミドヒドロラーゼ(FAAH)は からなる群から選ばれたアミノ酸配列の包含を特徴とする。 本発明の別の局面は脂肪酸一級アミドの加水分解の触媒作用方法に関する。こ の加水分解方法において、脂肪酸一級アミドがFAAHの触媒量の精製形態と合わさ れ、又は接触される。好ましい様式において、脂肪酸一級アミドは、不飽和を有 するアルキル鎖を含み、又は更に特別には下記の式により表される型のものであ る。 NH₂C(O)(CH₂)(6≧n≦11)CH=CH(CH₂)(8≧n≦5)CH₃ 更に特別には、アルキル鎖の不飽和はシス配置を有してもよく、又はシス−９ ，10−オクタデセノアミド、シス−８，９−オクタデセノアミド、シス−11，12 −オクタデセノアミド、又はシス−13，14−ドコセノアミドと同一であってもよ い。 本発明の別の局面はFAAHによるシス−９，10−オクタデセノアミドの如き脂肪 酸一級アミドの酵素触媒加水分解の抑制方法に関する。この方法において、FAAH がFAAHのインヒビターと合わされ、又は接触される。好ましいインヒビターとし て、フェニルメチルスルホニルフルオリド、HgCl₂、及び下記の構造を有するト リフルオロケトンが挙げられる。 本発明の別の局面はFAAHの候補インヒビターの抑制活性の確認方法に関する。 こうして、FAAHが候補FAAHインヒビターと混合されてスクリーニング方法で抑制 能を評価する。 候補FAAHインヒビターの抑制活性を測定するのに好ましい方法において、意図 される方法は五つの工程を含む。第一工程において、混合物“Ａ”がFAAH及びシ ス−９，10−オクタデセノアミド基質を反応条件下で合わせることにより生成さ れる。第二工程において、混合物“Ｂ”が混合物“Ａ”を候補インヒビターと合 わせることにより生成される。第三工程において、混合物“Ａ”中のシス−９， 10−オクタデセノアミド基質から加水分解生成物への変換が定量される。第四工 程において、混合物“Ｂ”中のシス−９，10−オクタデセノアミド基質から加水 分解生成物への変換が定量される。第五工程において、候補インヒビターの抑制 活性が工程３及び工程４の定量を比較することにより確かめられる。 本発明の別の局面は下記構造により表されるFAAHのトリフルオロケトンインヒ ビターに関する。 本発明の別の局面はFAAHの一部又は全部をコードする一つ以上のヌクレオチド 配列に関する。ヒト、マウス又はラットFAAHをコードする完全ヌクレオチド配列 が夫々配列番号42、39又は35に示される。 ラットFAAHの部分ヌクレオチド配列は以下のように表される。 図面の簡単な説明 図１は天然物質、シス−９，10−オクタデセノアミド(1)、関連類縁体(2-6)の 構造を示す。化合物６は天然産Ｃ₂₂脂肪酸アミドの好ましい構造である。 図２は節B.4に記載されたようなラットFAAHの決定された部分アミノ酸配列を 示す。 図３は1)肝臓膜の蔗糖勾配、続いて2)100mMの炭酸ナトリウム洗浄及び3)トリ トンをベースとする緩衝液中の可溶化を使用してラット肝臓からの原形質膜タン パク質フラクションの単離を伴う部分精製戦略を示す。次いで単離された肝臓原 形質膜が四つの連続のクロマトグラフィー工程：1)、イオン交換DEAEカラム、2) 水銀抑制カラム、3)洗剤交換ヘパリンカラム、続いて4)トリフルオロケトンイン ヒビターを含むアフィニティーカラムにより精製される。精製タンパク質は粗タ ンパク質フラクションとの精製タンパク質バンド強さの目視比較により粗膜タン パク質フラクションからアミダーゼ活性の20〜30倍の強化を有するこが測定され た。推定の精製収率は粗肝臓原形質膜タンパク質から10〜15％である。 図４はジスルフィド誘導体化固体担体（ピリジルジスルフィドビーズ）に結合 されているトリフルオロケトンインヒビターを使用するアフィニティーカラム精 製戦略（工程４、図３）を示す。 図５はトリフルオロケトンインヒビターの合成及びピリジルジスルフィドビー ズを使用するジスルフィド誘導体化固体担体へのインヒビターのその後の結合に 関する合成プロトコルを示す。 図６はオレイン酸への放射能標識されたシス−９，10−オクタデセノアミドの 加水分解及びフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)によるその抑制に関す るラット脳膜フラクションのFAAH活性を示す薄層クロマトグラフィープレート（ SiO₂、55％酢酸エチル／へキサン）のオートラジオグラムを示す。レーン番号、 内容：レーン１、シス−９，10−オクタデセノアミド標準物質；レーン２、ラッ ト脳可溶性フラクションを含むシス−９，10−オクタデセノアミド；レーン３、 ラット脳膜フラクションを含むシス−９，10−オクタデセノアミド；レーン４、 ラット脳膜フラクション＋１mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)を 含むシス−９，10−オクタデセノアミド；レーン５、ラット脳膜フラクション＋ ５mMのEDTAを含むシス−９，10−オクタデセノアミド；レーン６、ラット膵臓ミ クロソームを含むシス−９，10−オクタデセノアミド；レーン７、プロテイナー ゼＫ(200mg)を含むシス−９，10−オクタデセノアミド；レーン８、オレイン酸 標準物質。 図７はオレイン酸への放射能標識されたシス−９，10−オクタデセノアミドの 加水分解及び塩化第二水銀(HgCl₂)によるその抑制に関するラット脳膜フラクシ ョンのFAAH活性を示す薄層クロマトグラフィープレート(SiO₂、55％酢酸エチル ／ヘキサン)のオートラジオグラムを示す。アミド加水分解活性の抑制に必要と される最適濃度は50mM〜５mMのHgCl₂にある。TLCプレートの種々のレーンは以下 のように同定される。レーン１、シス−９，10−オクタデセノアミド標準物質； レーン２、ラット脳可溶性フラクションを含むシス−９，10−オクタデセノアミ ド；レーン３、ラット脳膜フラクション及び500mMのHgCl₂を含むシス−９，10− オクタデセノアミド；レーン４、ラット脳膜フラクション及び50mMのHgCl₂を含 むシス−９，10−オクタデセノアミド；レーン５、ラット脳膜フラクション及び ５mMのHgCl₂を含むシス−９，10−オクタデセノアミド；レーン６、オレイン酸 標準物質。典型的なHgCl₂抑制研究はHgCl₂の100mMのHgCl₂原液（１mLのトリス緩 衝液(50mM)、pH7.5中27mg）を使用する。 図８はクローニング操作から得られたｍＲＮＡのノーザンブロットを示す。リ ボソームマーカーがレーン１の隣に矢印により示され、５kbバンド及び２kbバン ドを示す。レーン６の隣の矢印は、オレイン酸アミダーゼ酵素に代表的である３ kbバンドを指摘する。レーン１はラット脳からの全ＲＮＡであり、レーン２はラ ット肺からの全ＲＮＡであり、レーン３はラット腎臓からの全ＲＮＡであり、レ ーン４はラット心臓からの全ＲＮＡであり、レーン５はラット肝臓からの全ＲＮ Ａであり、レーン６はラット肝臓からのｍＲＮＡであり（レーン６に入れられた ｍＲＮＡは約500ngである）、レーン１〜５に入れられた合計の夫々のＲＮＡは 約15μｇであった。 図９は脂肪酸アミドヒドロラーゼ又はFAAHと又称されるラットオレアミドヒド ロラーゼのコードされた演繹アミノ酸残基配列（配列番号36）を示す。コードさ れたラットFAAHはrFAAHと適切に称される。太字はPSORTにより予測されるような 推定トランスメンブランスパンニングドメインを示す。７つの不連続の下線を施 された領域は酵素のトリプシン消化産物のHPLC精製により得られた７種の別々の ペプチド（その表示は連続している）を示す。二重下線を施されたセグメントは 推定SH3-ドメイン結合配列である。 図10-1〜10-5は節Ｄに記載されたラットFAAHに関する連続二本鎖ｃＤＮＡ配列 を示す。コードされたアミノ酸配列は又ATG開始部位エンコーディングメチオニ ン(M)で始まって示される。終止コドンが又ボックスされて示される。ｃＤＮＡ 配列の上部ストランド及び下部ストランドが配列番号35及び37に夫々リストされ 、そのアミノ酸配列が配列番号35にそのヌクレオチド配列でリストされ、配列番 号36にそれ自体リストされる。 図11は節D1に更に記載されるような幾つかのその他の代表的なアミダーゼとと もにラットFAAHのアミダーゼ標示配列領域（アミノ酸残基215から246までの配列 番号36）の配列を示す。ファミリー員の間で完全に保存される標示配列の残基が 太字で示され、夫々の員の標示配列の相対アミノ酸位置が配列情報の前後の番号 により示される。上部から下部に、配列は下記の夫々の配列番号36（残基215か ら246まで）、47、48、49、50、51、52及び53を有する。 図12A及び12Bは節Ｄに更に記載されるようなラットFAAH cDNAの内部800bpフラ グメントで探査されたサザンブロット及びノーザンブロットの夫々の結果を示す 。 図13-1〜13-4は節D2に記載されるようなマウスFAAHに関する連続二本鎖ｃＤＮ Ａ配列を示す。コードされたアミノ酸配列は又ATG開始部位エンコーディングメ チオニン(M)で始まって示される。終止コドンが又ホックスされて示される。 ｃＤＮＡ配列の上部ストランド及び下部ストランドが配列番号39及び41に夫々リ ストされ、そのアミノ酸配列が配列番号39にそのヌクレオチド配列でリストされ 、配列番号40にそれ自体リストされる。 図14-1〜14-5は節D3に記載されるようなヒトFAAHに関する連続二本鎖ｃＤＮＡ 配列を示す。コードされたアミノ酸配列は又ATG開始部位エンコーディングメチ オニン(M)で始まって示される。終止コドンが又ボックスされて示される。 ｃＤＮＡ配列の上部ストランド及び下部ストランドが配列番号42及び44に夫々リ ストされ、そのアミノ酸配列が配列番号42にそのヌクレオチド配列でリストされ 、配列番号43にそれ自体リストされる。 図15Aは節Ｆに更に記載されるようなオレイン酸への標識オレアミドの変換を 示す薄層クロマトグラフィーにより行われるような節Ｅに記載されるようにして 生じられるCOS-7細胞中の組換えラットFAAHの発現を示す。 図15Bは節Ｆに更に記載されるような図15Aに記載されたようにして又行われた トリフルオロメチルケトンによる組換えラットFAAHの抑制を示す。 図15Cは四つの左のレーン(1-4)に示されるような図９に示されたようなペプチ ド２に対し産生され、又四つの右のレーン(5-8)に示されるようなペプチドと競 合された抗体による組換えラットFAAHのウェスタンブロッティングの結果を示す 。トランスフェクトされなかったCOS-7細胞抽出物のサンプルがレーン４及び８ に示され、FAAHでトランスフェクトされたCOS-7細胞抽出物がレーン３及び７に 示され、アフィニティー精製されたラットFAAHがレーン２及び６に示され、FAAH でトランスフェクトされたCOS-7細胞抽出物及びアフィニティー精製されたFAAH の混合物がレーン１及び５で実験される。タンパク質が競合ペプチド抗原の不在 下(レーン1-4)又は存在下(レーン5-8)で抗体で探査された。対照ではなくFAAHで トランスフェクトされたCOS-7細胞抽出物は過剰のペプチド抗原と一緒の抗体の プレインキュベーションにより有効に競合された免疫反応性60K-65Kタンパク質 を含んでいたが、一方、トランスフェクトされたCOS-7細胞抽出物及びトランス フェクトされなかったCOS-7細胞抽出物の両方で観察された痕跡量の交差反応性 タンパク質はペプチドにより競合されなかった。 図16は薄層クロマトグラフィーを用いて図15Aに、又節Ｆに更に記載されたよ うにオレアミドをオレイン酸に加水分解するヒト組換え発現FAAHの能力を示す。 図17は対照のトランスフェクトされなかった細胞（レーン２）ではなくレーン ３に示されるようなラットFAAHトランスフェクトCOS-7細胞中のアラキドン酸へ の標識アナンドアミドの変換を示す薄層クロマトグラフィーの結果を示す。アナ ンドアミド及びアラキドン酸のTLC標準物質が夫々レーン１及び４に示される。 発明の詳細な説明 Ａ．睡眠の誘発に関するプロトコル 合成シス−９，10−オクタデセノアミドが、異なる投与量：１mg（ｎ＝２）、 ２mg（ｎ＝２）、５mg（ｎ＝７）、10mg（ｎ＝10）、20mg（ｎ＝２）、及び50mg （ｎ＝２）における自然挙動に関するその効果を試験するために、ラットに注射 (ip)された（ｎ＝試験したラットの数）。ラットは、光がサイクルで消され、そ れらのホームケージ中で観察された２時間後に反転暗期間(12:12)中に注射され た。低投与量（１mg及び２mg）では、自然挙動に関する明らかな効果が見られな かった。しかしながら、５mgの閾値以上では、正常な睡眠の特徴の閉じられた眼 、鎮静された挙動と関連する長く持続する運動休止の誘導からなる著しい効果が あった。又、正常な睡眠について、ラットは配向反射で聴覚刺激に対し依然とし て応答し、刺激の源に関する注意を持続した。加えて、運動挙動が損なわれた。 投与後の挙動鎮静に関する潜伏期は約４分であり、通常、被験者は１時間（５mg ）、２時間（10mg）、又は2.5時間（20mg及び50mg）後に再度活性であった。 本発明者らはシス−９，10−オクタデセノアミドをビヒクル及び図１にリスト された合成類縁体と比較してその睡眠誘発ポテンシャルの構造特異性を推定した 。ビヒクル（食塩水溶液中５％のエタノール）又はオレイン酸(5)のいずれもが 明らかな挙動効果を示さなかった。トランス−９，10−オクタデセノアミドはそ のシス相対物と同様の薬理効果を示したが、その睡眠誘発性について比較的短い 期間により測定されたように極めて小さい効力であった（ラット当たり10mgでは 、生物効果はトランス異性体について１時間持続し、シス異性体について２時間 持続した）。オレフィンがアルキル鎖に沿っていずれかの方向（その８，９位(3 )又は11，12位(4)の方に）に移動され、又はアルキル鎖長が22個の炭素(6)に延 長された時、薬理効果の程度及び期間の両方のかなりの減少が観察され、又ラッ トの運動性が依然として低下したが、それらの眼は開いたままであり、またそれ らの警戒がほんのわずかに影響されたことが明らかであった。最後に、シス−９ ，10−オクタデセノアミダドで注射されたラットに関するポリソムノグラフの(p olysomnographic)研究は、ビヒクル対照と比較した時、徐波睡眠(SWS)の合計時 間の増大並びにSWSの個々の期間の平均期間の増大を示す。更に特別には、雄のS Dラット（手術の時点で300g）にハロタン麻酔（２〜３％）のもとに睡眠記録用 の電極の標準の組を移植した。これは被験者心電図(EEG)を記録するための海馬 の上の頭頂骨中に置かれた二つのスクリュー電極と筋電活性(EMG)により体位ト ーンを記録するための首筋系に挿入された二つのワイヤ電極を含んでいた。ラッ トが食物及び水への随時の接近により個々に収容された。明暗サイクルが調節さ れた(12:12、10p.m.に点灯)。手術の１週間後に、ラットが少なくとも３日間に わたって記録条件について順応された。順応期間の完結後に、ラットはビヒクル （５％のエタノール／食塩水溶液）、シス−９，10−オクタデセノアミド(10mg) 、 又はオレイン酸(10mg)のいずれか２ミリリットル(ip)を受けた。ラットがip注射 後の４時間(12:00p.m.-4:00p.m.)にわたって連続的に記録された。ラットがワン ウェイ・ウィンドーにより挙動の自然変化について観察された。睡眠記録が目視 でスコアを付けられ、四つの段階が測定された：目覚め、徐波睡眠１(SWS1)、徐 波睡眠２(SWS2)、及び迅速眼球運動(REM)睡眠。 徐波睡眠(SWS)に関するこれらの増大は目覚めを犠牲にしていた。REM睡眠の分 布は変化されないものと考えられる。一緒になって、これらのデータは、シス− ９，10−オクタデセノアミドが徐波睡眠変調に重要な役割を果たし得ることを示 唆する。 細胞人工物の受動構造要素としての脂質分子の従来の考えは、これらの薬剤が 細胞シグナルを伝達し、細胞挙動を変更する際に果たす積極的な役割の絶えず増 大している知見、例えば、Liscovitchら，Cell 77:329(1994)に対し迅速に屈し つつある。ここで研究された脂肪酸アミドの魅力的な特徴は、それらが、多くの 多様性がアルカン鎖の長さ並びにその一つ以上のオレフィンの位置、立体化学、 及び数を単に変化することにより生じ得る単純な分子のファミリーに属すること である。重要なことに、それらのカルボキシ末端にアミド修飾を有するその他の 神経活性シグナリング分子が、カルホキサミド末端ペプチドからアラキドニルエ タノールアミドに至るまで報告されていた。カルボキサミド末端ペプチドを使用 する神経活性シグナリング分子がEipperら，Annu.Rev.Neurosci．15:57（1992） により開示されている。アラキドニルエタノールアミドを使用する神経活性シグ ナリング分子がDevaneら，Science 258:1946（1992）により開示されている。シ ス−９，10−オクタデセノアミドは、コアー化学構造の簡単な変化が特異な生理 結果を有する生物学的エフェクターの新しいクラスの一員であることがここに開 示されている。 Ｂ．FAAH 活性を有する細胞膜内タンパク質フラクションの単離及びアッセイ １．脂質アミダーゼ活性の観察 脂質アミダーゼ活性が脳、肝臓、肺、腎臓及び脾臓組織中で観察されたが、心 臓組織中では観察されなかった。その活性は１mMのPMSF（フェニルメチルスルホ ニルフルオリド）及び50mMのHgClにより抑制され、これはその反応のスルフヒド リル基依存性に関する試験である。フラクションは100mMの炭酸ナトリウム（pH1 1.5）により可溶化されないので、サンプルは膜タンパク質であることが明らか であり、これは核、ミクロソーム、及び原形質膜の細胞下のフラクション中で同 定されたが、シトゾル中では同定されなかった。 精製シス−９，10−オクタデセノアミドによるシス−９，10−オクタデセノア ミドからオレイン酸への酵素触媒加水分解及びPMSFによるこの酵素の抑制が、図 ６に示された薄層クロマトグラフィープレート(SiO₂、55％酢酸エチル／ヘキサ ン)のオートラジオグラムで開示される。夫々の場合、酵素反応は別々の反応容 器中で行われ、生成物がTLCプレートにスポットされる。夫々のレーンに相当す る反応容器に関する種々の反応条件は、以下のように同定される。 レーン１：シス−９，10−オクタデセノアミド標準物質、 レーン２：ラット脳可溶性フラクションを含むシス−９，10−オクタデセノア ミド、 レーン３：ラット脳膜フラクションを含むシス−９，10−オクタデセノアミド 、 レーン４：ラット脳膜フラクション＋１mMのPMSFを含むシス−９，10−オクタ デセノアミド、 レーン５：ラット膵臓フラクション＋５mMのEDTAを含むシス−９，10−オクタ デセノアミド、 レーン６：ラット膵臓ミクロソームを含むシス−９，10−オクタデセノアミド 、 レーン７：プロテイナーゼＫ(200mg)を含むシス−９，10−オクタデセノアミ ド、及び レーン８：オレイン酸標準物質。 HgCl₂によるオレイン酸へのシス−９，10−オクタデセノアミド加水分解の抑 制研究が図７に示される。アミド加水分解活性の抑制に必要とされる最適濃度は 50mM〜５mMのHgCl₂にある。精製シス−９，10−オクタデセノアミドによるシス −９，10−オクタデセノアミドからオレイン酸への酵素触媒加水分解及びHgCl₂ によるこの酵素の抑制は、一連の反応容器中で行われ、薄層クロマトグラフィー プレート(SiO₂、55％酢酸エチル／ヘキサン)にスポットされる。典型的なHgCl₂ 抑制研究はHgCl₂の100mMのHgCl₂原液（１mLのトリス緩衝液(50mM)、pH7.5中27mg ）を使用する。夫々のレーンに相当する反応容器に関する種々の反応条件は、以 下のように同定される。 レーン１：シス−９，10−オクタデセノアミド標準物質、 レーン２：ラット脳可溶性フラクションを含むシス−９，10−オクタデセノア ミド、 レーン３：ラット脳膜フラクション及び500mMのHgCl₂を含むシス−９，10−オ クタデセノアミド、 レーン４：ラット脳膜フラクション及び50mMのHgCl₂を含むシス−９，10−オ クタデセノアミド、 レーン５：ラット脳膜フラクション及び５mMのHgCl₂を含むシス−９，10−オ クタデセノアミド、 レーン６：オレイン酸標準物質。 スキーム２ 推定のエフェクター分子であるシス−９，10−オクタデセノアミドを分解する ことができる特異な酵素活性が同定され、本明細書に開示される。ラット脳膜フ ラクションによるオレイン酸への¹⁴C−シス−９，10−オクタデセノアミドの迅 速な変換がTLCにより観察された。酵素活性は５mMのEDTAにより影響されなかっ たが、１mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)により完全に抑制され た。ほんの痕跡のアミド加水分解活性がラット脳可溶性フラクションで観察され たが、ラット膵臓ミクロソーム及びプロテイナーゼＫはオレイン酸へのシス−９ ，10−オクタデセノアミドを加水分解する有意な能力を示さなかった。 ２．脂肪酸一級アミドの合成 例示の脂肪酸一級アミドを合成するのに好ましいプロトコルが提供される。合 成プロトコルは出発物質の鎖長、生成物収率、及び種々のシス生成物及びトラン ス生成物の分離に関してのみ異なる。それ故、シス−９，10−オクタデセノアミ ド及び幾つかのその他の脂肪酸一級アミドの合成に関する合成プロトコルの例示 の記載が示され、脂肪酸一級アミドの全クラスに関する合成プロトコルを説明す るのに利用できる。 ３．FAAH 活性を有するラット細胞膜内タンパク質フラクションの単離 本明細書に記載されるプロトコルは組織約５〜10gに関するものである。一つ 以上のラット肝臓が回収され、計量され、次いで氷の上で１mMのNaHCO₃中に入れ られる。次に、肝臓が切断され、１mMのNaHCO₃ですすがれ(2X)、ワックスのシー トの上でレーザーブレードで細断される。次いでそれが１mMの重炭酸ナトリウム 25mlに入れられ、ティシュマイザー中で２分間にわたってセッティング６で均質 にされる。続いて、１mMの重炭酸ナトリウムによる100mlへの希釈が行われ、続 いてチーズクロスの４層で濾過され、次いで８層で濾過される。次いで濾液が10 0mlにされ、四つのJA-20管に分けられ、１mMの重炭酸ナトリウムで仕上げられる 。管がJA-20ローター中で４℃で12分間にわたって6,000rpm(4500x g)で回転され る。パスツールピペットを使用して、脂肪層が吸引され、上澄み層がデカントさ れ、溜められる。 次に、ペレットがシリンジ及びニードルで残りの上澄み層中で再度懸濁される 。次いで再懸濁液のフラクション20mLが15mlのドウンスホモジナーザーで16回ド ウンスされる(dounced)。次いでフラクションが単一JA-20管に合わされ、１mMの NaHCO₃で所定の容積にされる。次に管がJA-20ローター中で４℃で15分間にわた って6,000rpm(4500x g)で再度回転され、続いて上澄みが注いで除かれ、溜めら れる。ペレットが前記のように再度懸濁され、ドウンスされ、次いで１mMの重炭 酸ナトリウムで10mlの容積にされる。次に、67％の蔗糖溶液20mLが30mLの最終容 積まで添加され、その混合物が二つの管に分けられる。30％蔗糖更に25mLが夫々 の管の上部に添加され、超遠心分離機中で4℃で1時間45分にわたって27K rpmで 回転される。フラクションが蔗糖勾配から回収され、蔗糖勾配からの中央バンド （原形質膜バンド）がキャップ付きのプラスチック管に入れられ、１mMの重炭酸 ナトリウムで満たされる。続いて管が４℃で35分間にわたって17,000rpmで回転 される。 上澄みが廃棄され、ペレットが100mMの炭酸ナトリウム中で再度懸濁される（ ドウンシングによる）。続いて、この溶液が氷の上に１時間保たれ、次いで１時 間にわたって100,000gで回転される。脂質アミダーゼ活性がこのフラクション中 に存在しないので、上澄み（可溶化された周辺膜タンパク質）が廃棄され、ペレ ットが10％グリセロール、１％トリトン、0.1％ホスファチジルコリン、20mMの ヘペス緩衝液中で再度懸濁され（ドウンシングによる）、次いで４℃で２時間に わたって攪拌される。最後に、その溶液が１時間にわたって100,000gで回転され 、こうして得られた上澄みが以下のようにして更に精製される。 ４．４工程カラムクロマトグラフィー方法による精製 工程IDEAEカラム／イオン交換（図３）。上記の可溶化上澄みバッチが更に精 製される。上澄みバッチが１時間にわたって４℃でDEAE-セファデックス（ジエ チルアミノエチル−セファデックス、シグマ・ケミカル社から市販される）と混 合される。DEAE樹脂に結合されるフラクションは脂質アミダーゼ活性を示す（フ ロースルー中にはない）。可溶化ラット肝臓原形質膜（BI：10％グリセロール、 １％トリトンX-100、１mMのEDTA、20mMのヘペス、pH7.2中）がDEAE高速流カラ ム（ファーマシア）に通され、５カラム容積のBI、0.2％トリトンで洗浄される 。次いでアミダーゼ活性が１カラム容積の夫々50mM、100mM、及び200mMのNaCl B I、0.2％トリトンで溶離される。 工程２Hgカラム（図３）。DEAE交換からの上記溶離物が１時間にわたって４℃ でｐ−クロロ水銀安息香酸樹脂（バイオラド・ケミカル社から市販される）と混 合される。上記水銀樹脂に結合されるフラクションは脂質アミダーゼ活性を示し （フロースルー中にはない）、５カラム容積のBI、0.2％トリトン、５カラム容 積のBI、0.2％トリトン及び150mMのNaClで洗浄され、1.5カラム容積のBI、0.2％ トリトン、150 NaCl及び25mMのｐ−メルカプトエタノールで溶離される。 工程３ヘパリンカラム（図３）。Hg溶離されたアミダーゼ活性がヘパリンカラ ム（バイオラド）に通され、10カラム容積のBI、0.7％CHAPS及び150mMのNaClで 洗浄された（洗剤交換）。溶離が１カラム容積の夫々BI、0.7％CHAPS及び300mM 、400mM、500mM、650mM、及び750mMのNaClで行われ、アミダーゼ活性が最後の二 つのフラクション中に溶離された。 工程４アフィニティーカラム（図３及び４）。ヘパリン溶離されたアミダーゼ 活性が0.2％の最終濃度についてトリトンX-100と混合され、次いで活性化ピリジ ルジスルフィドビーズ（ビーズへのインヒビターの付着が以下に記載される）に 結合されたCF₃-インヒビターに通され、20カラム容積のBI、0.2％トリトンX-100 で洗浄された。溶離は、0.2％トリトン及び20mMのDTTを含む３カラム容積のBIに 通し、カラムを４℃で30時間放置することにより行われた。次いでカラムを0.2 ％トリトン及び20mMのDTTを含む1.5カラム容積のBIで洗浄してサイズ60kDの単一 タンパク質を溶離した。 溶離された60kdタンパク質がトリプシンで消化され、ペプチドが以下に記載さ れるように配列決定された。 次いでその活性の純度がこの操作後にアッセイプロトコルに従って分析される 。 ５．脂肪酸アミドヒドロラーゼ活性に関するアッセイ 以下の薄層クロマトグラフィー(TLC)プロトコルがシス−９，10−オクタデセ ノアミド加水分解活性（又、脂肪酸アミドヒドロラーゼ活性と称される）を分析 するのに使用される。オレアミドが最初に¹⁴Cで標識される。これを行うために 、０℃のCH₂Cl₂（200μＬ、0.005-0.05M）中の¹⁴C-オレイン酸(1-10μＭ、モラ ベク・バイオケミカルズ、5-50μＣｉ/μＭ)が過剰の塩化オキサリルで処理され 、その反応混合物が６時間にわたって25℃に温められた。次いで反応混合物が窒 素ガスの一定の流れのもとに濃縮され、残っている残渣が０℃に冷却され、過剰 の飽和水酸化アンモニウム水溶液で処理された。５分後に、反応混合物がEtAc（ 1.5mL）と10％のHCl（1.0mL）の間に分配された。次いで有機層が水(1.0mL)で洗 浄され、窒素ガスの一定の流れのもとに濃縮されて、TLCにより判定して定量的 収率で¹⁴C-オレアミドを得た（ヘキサン中60％のEtOAc;オレアミドＲ_f-0.2;オレ イン酸Ｒ_f-0.8）。 エタノール中¹⁴C-オレアミド約１μＣｉ(比活性5-50μＣｉ/μＭ)が126mMのト リス-HCl、pH9.0 70μＬとともに37℃で１〜２時間インキュベートされた（エタ ノールの最終濃度は2.0％であった）。次いでその反応混合物が酢酸エチル(1.0m L)と0.07MのHCl（0.6mL）の間で分配された。酢酸エチル層が窒素ガスの一定の 流れのもとに濃縮され、残っている残渣がエタノール15μＬ中で再度懸濁された 。次いでこのエタノール原液約３μＬがTLC分析に使用された（ヘキサン中60％ のEtOAc;オレアミドＲ_f-0.2;オレイン酸Ｒ_f-0.8）。溶媒への露出後に、TLCプレ ートが空気乾燥され、EN³HANCEスプレー(デュポンNEN)で製造業者のガイドライ ンに従って処理され、１〜２時間にわたって-78℃でフィルムに露出された。 精製タンパク質は、粗タンパク質フラクションとの精製タンパク質バンド強さ の目視比較により粗膜タンパク質からアミダーゼ活性の20-30倍の強化を有する と測定された。推定精製収率は10−15％である（図３）。 スキーム３ スキーム４ Ｃ．合成プロトコル １．シス−９，10−オクタデセノアミド（１：図１） ０℃のCH₂Cl₂(8.9mL、0.4M)中のオレイン酸(1.0g、3.55ミリモル、1.0当量)の 溶液を塩化オキサリル(5.32mL、CH₂Cl₂中2.0Mの溶液、10.64ミリモル、3.0当量) で滴下して処理した。その反応混合物を25℃で４時間攪拌し、減圧で濃縮し、０ ℃に冷却し、飽和NH₄OH水溶液(2.0mL)で処理した。次いでその反応混合物を酢酸 エチル(EtOAc)(100mL)とH₂O（100mL）の間に分配し、有機層を乾燥させ（Na₂SO₄ ）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、5cmx15cm、40〜100％EtOAc-ヘ キサン勾配溶離)にかけて１を白色の固体として得た(0.810g、理論値0.996g、81 .3％)。 シス異性体とトランス異性体を区別するスペクトルの領域はδ5.3から5.2までの オレフィン性プロトン及びδ2.0から1.8までのアリル性プロトンである。これら の領域は天然化合物をシス−９，10−オクタデセノアミドと同定する。 ２．トランス−９，10−オクタデセノアミド（２：図１） ０℃のCH₂Cl₂(8.9mL、0.4M)中のエライジン酸(1.0g、3.55ミリモル、1.0当量) の溶液を塩化オキサリル(5.32mL、CH₂Cl₂中2.0Mの溶液、10.64ミリモル、3.0当 量)で滴下して処理した。その反応混合物を25℃で４時間攪拌し、減圧で濃縮し 、０℃に冷却し、飽和NH₄OH水溶液(2.0mL)で処理した。次いでその反応混合物を 酢酸エチル(EtOAc)(100mL)とH₂O(100mL)の間に分配し、有機層を乾燥させ(Na₂SO₄ )、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、5cmx15cm、40〜100％EtOAc-ヘ キサン勾配溶離)にかけて２を白色の固体として得た。シス異性体とトランス異 性体を区別するスペクトルの領域はδ5.3から5.2までのオ レフィン性プロトン及びδ2.0から1.8までのアリル性プロトンである。これらの 領域は化合物をトランス−９，10−オクタデセノアミドと同定する。 ３．シス−８，９−オクタデセノアミド（３：図１） ０℃のCH₂Cl₂(1.5mL、0.31M)中の以下のように合成した11の溶液(0.130g、0.4 61ミリモル、1.0当量)を塩化オキサリル(0.69mL、CH₂Cl₂中2.0Mの溶液、1.38ミ リモル、3.0当量)で滴下して処理した。その反応混合物を25℃で４時間攪拌し、 減圧で濃縮し、０℃に冷却し、飽和NH₄OH水溶液(2.0mL)で処理した。次いでその 反応混合物を酢酸エチル(EtOAc)(100mL)とH₂O（100mL）の間に分配し、有機層を 乾燥させ（Na₂SO₄）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、5cmx15cm、4 0〜100％EtOAc-ヘキサン勾配溶離)にかけて３を白色の固体として得た(0.105g、 理論値0.130、80.8％)。 ４．シス−11，12−オクタデセノアミド（４：図１） ０℃のCH₂Cl₂(8.9mL、0.4M)中のΔ11,12オクタデセン酸(1.0g、3.55ミリモル 、1.0当量)の溶液を塩化オキサリル(5.32mL、CH₂Cl₂中2.0Mの溶液、10.64ミリモ ル、3.0当量)で滴下して処理した。その反応混合物を25℃で４時間攪拌し、減圧 で濃縮し、０℃に冷却し、飽和NH₄OH水溶液(2.0mL)で処理した。次いでその反応 混合物を酢酸エチル(EtOAc)(100mL)とH₂O（100mL）の間に分配し、有機層を乾燥 させ（Na₂SO₄）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、5cmx15cm、40〜1 00％EtOAc-ヘキサン勾配溶離)にかけて４を白色の固体として得た。 ５．オレイン酸（５：図１） オレイン酸をアルドリッチ・ケミカル社から入手した(CAS #112-80-1)。 ６．エルカミド（６：図１） エルカミドをアルドリッチ・ケミカル社から入手した(CAS #28,057-7)。 ７．メチル−８−ヒドロキシ−オクタノエート（７：スキーム３） -20℃のテトラヒドロフラン(THF)(32.0mL、0.25M)中のスベリン酸モノメチル エステル(1.5g、7.97ミリモル、1.0当量)の溶液をBF₃・THF（THF中1Mの溶液、7. 97mL、7.97ミリモル、1.0当量）で滴下して処理した。その反応混合物を一夜攪 拌し、続いて室温に到達させた。次いでその反応混合物を酢酸エチル（100mL） で希釈し、メタノール(10mL)及び10％HCl（10mL）で反応停止した。NaHCO₃(1X20 mL)、水(2X10mL)、及び食塩水(1X10mL)で抽出して、メチル−８−ヒドロキシ− オクタノエート（７）を白色の粗固体として得た。 ８．メチル−８−ブロモ−オクタノエート（８：スキーム３） ０℃のCH₂Cl₂(15mL、0.48M)中の粗メチル−８−ヒドロキシ−オクタノエー ト（７、1.24g、7.13ミリモル、1.0当量）の溶液をCBr₄(3.07g、9.27ミリモル、 1.3当量)及びPPh₃(2.61g、9.98ミリモル、1.4当量)で連続して処理し、その反応 混合物を10時間にわたって４℃で攪拌する。次いでその反応混合物を減圧で濃縮 し、Et₂O(8X10mL洗浄)で繰り返し洗浄した。Et₂O洗浄液を合わせ、減圧で濃縮し た。クロマトグラフィー(SiO₂、5cmx15cm、ヘキサン)にかけて、８を無色透明の 油(1.25g、理論量1.69g、74.0％)として得た。 ９．メチル−８−トリフェニルホスホラニル−オクタノエート−ブロミド（９ ：スキーム３） CH₃CN(4.0mL、1.31M)中の８（1.25g、5.23ミリモル、1.0当量）の溶液をトリ フェニルホスフィン(1.52g、5.75ミリモル、1.1当量)で処理し、10時間にわたっ て還流下で攪拌した。追加のトリフェニルホスフィン(0.685g、2.61ミリモ ル、0.5当量)を反応混合物に添加し、攪拌を還流下に５時間続けた。その反応混 合物を減圧で濃縮し、Et₂O(5X10mL洗浄)で繰り返し洗浄した。次いで残りの残渣 をCH₂Cl₂の最小容積中で可溶化し、減圧で濃縮して９を無色のフォーム(2.20g、 理論量2.61g、84.3％)として得た。 10．メチル−シス−８，９−オクタデセノエート（10：スキーム３） 25℃のTHF（7.0mL、0.2M）中の９（0.71g、1.42ミリモル、1.0当量）の溶液を KHMDS（3.0mL、THF中0.5Mの溶液、1.5ミリモル、1.06当量）で処理し、その反応 混合物を還流下で１時間攪拌した。次いでその反応混合物を-78℃に冷却し、デ シルアルデヒド(0.321mL、1.71ミリモル、1.2当量)で処理し、25℃に温め、更に 30分間攪拌した。次いでその反応混合物を飽和NH₄Cl水溶液で処理し、EtOAc（10 0mL）とH₂O（100mL）の間に分配した。有機層を乾燥させ（Na₂SO₄）、減圧で濃 縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、5cmx15cm、０〜２％EtOAc-ヘキサン勾配溶 離)にかけて10を無色の油(0.290g、理論量0.422g、68.7％)として得た。 11．シス−８，９−オクタデセン酸（11：スキーム３） ０℃のTHF-MeOH-H₂O（3-1-1比、4.1mL、0.2M）中の10（0.245g、0.825ミリモ ル、1.0当量）の溶液をLiOH・H₂O（0.104g、2.48ミリモル、3.0当量）で処理し た。その反応混合物を25℃に温め、８時間攪拌し、次いでEtOAC（100mL）とH₂O （100mL）の間に分配した。有機層を10％HCl水溶液(100mL)及び飽和NaCl水溶液( 100mL)で連続的に洗浄し、乾燥させ、減圧で濃縮した。クロマトグラフィ ー(SiO₂、5cmx15cm、10〜30％EtOAc-ヘキサン勾配溶離)にかけて11を無色の油(0 .156g、理論量0.233g、67.0％)として得た。 12．18 −ヘミスクシネート−シス−９，10−オクタデセノアミド（12：スキー ム４） CH₂Cl₂−CHCl₃（3-1、1.60mL、0.1M）中の18（0.047g、0.160M、1.0当量）の 溶液をEt₃N（0.045mL、0.320ミリモル、2.0当量）、無水コハク酸(0.033g、0.32 0ミリモル、2.0当量)及びDMAP（0.002g、0.016ミリモル、0.1当量）で連続的に 処理し、その反応混合物を25℃で10時間攪拌した。次いでその反応混合物をCH₂C l₂（50mL）とH₂O（50mL）の間に分配し、有機層を10％HCl水溶液(50mL)及び飽和 NaCl水溶液(50mL)で連続して洗浄し、乾燥させ（Na₂SO₄）、減圧で濃縮した。ク ロマトグラフィー(SiO₂、3cmx15cm、０〜10％MeOH-EtOAc)にかけて12を白色の固 体(0.051g、理論量0.063、80.3％)として得た。 13．メチル−９−ブロモ−ノナノエート（13：スキーム４） ０℃のCH₂Cl₂(30mL、0.2M)中のメチル−９−ヒドロキシ−ノナノエート（1. 1g、5.85ミリモル、1.0当量）の溶液をCBr₄(2.5g、7.54ミリモル、1.3当量)及び PPh₃(2.15g、8.19ミリモル、1.4当量)で連続して処理し、その反応混合物を10時 間にわたって４℃で攪拌した。次いでその反応混合物を減圧で濃縮し、Et₂O(8X1 0mL洗浄)で繰り返し洗浄した。Et₂O洗浄液を合わせ、減圧で濃縮し た。クロマトグラフィー(SiO₂、5cmx15cm、ヘキサン)にかけて、13を無色透明の 油(1.02g、理論量1.47g、69.5％)として得た。 14．メチル−９−トリフェニルホスホラニル−ノナノエート−ブロミド（14： スキーム４） CH₃CN(3.5mL、1.16M)中の13（1.02g、4.06ミリモル、1.0当量）の溶液をトリ フェニルホスフィン(1.17g、4.47ミリモル、1.1当量)で処理し、10時間にわたっ て還流下で攪拌した。追加のトリフェニルホスフィン(0.532g、2.03ミリモル、0 .5当量)を反応混合物に添加し、攪拌を還流下に５時間続けた。その反応混合物 を減圧で濃縮し、Et₂O(5X10mL洗浄)で繰り返し洗浄した。次いで残りの残渣をCH₂ Cl₂の最小容積中で可溶化し、減圧で濃縮して14を無色のフォーム（1.90g、理 論量2.08g、91.3％）として得た。 15．メチル−18−ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ−シス−９，10−オクタ デセノエート（15：スキーム４） 25℃のTHF（6.5mL、0.3M)中の14（1.0g、1.95ミリモル、1.0当量）の溶液をKH MDS（3.9mL、THF中0.5Mの溶液、1.95ミリモル、1.0当量）で処理し、その反応混 合物を還流下で１時間攪拌した。次いでその反応混合物を-78℃に冷却し、３（0 .93g、2.35ミリモル、1.2当量）で処理し、25℃に温め、更に30分間攪拌した。 次いでその反応混合物を飽和NH₄Cl水溶液で処理し、EtOAc（100mL）とH₂O（100m L）の間に分配した。有機層を乾燥させ（Na₂SO₄）、減圧で濃縮した。クロマト グラフィー(SiO₂、5cmx15cm、０〜２％EtOAc-ヘキサン勾配溶離)にか けて15を無色の油(0.82g、理論量1.07g、76.3％)として得た。 16．18 −Ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ−シス−９，10−オクタデセン酸 （16：スキーム４） ０℃のTHF-MeOH-H₂O（3-1-1比、7.3mL、0.2M）中の５（0.81g、1.47ミリモル 、1.0当量）の溶液をLiOH・H₂O（0.188g、4.48ミリモル、3.0当量）で処理した 。その反応混合物を25℃に温め、８時間攪拌し、次いでEtOAc（100mL）とH₂O（1 00mL）の間に分配した。有機層を10％HCl水溶液(100mL)及び飽和NaCl水溶液(100 mL)で連続的に洗浄し、乾燥させ、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、 5cmx15cm、10〜30％EtOAc-ヘキサン勾配溶離)にかけて16を無色の油(0.700g、理 論量0.790g、88.7％)として得た。 17．18 −Ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ−シス−９，10−オクタデセノア ミド（17：スキーム４） ０℃のCH₂Cl₂（4.3mL、0.3M）中の16（0.685g、1.28ミリモル、1.0当量）の溶 液を塩化オキサリル（1.92mL、CH₂Cl₂中2Mの溶液、3.84ミリモル、3.0当量）で 滴下して処理した。その反応混合物を25℃で４時間攪拌し、減圧で濃縮し、０℃ に冷却し、飽和NH₄OH水溶液(2.0mL)で処理した。その反応混合物をEtOAc （100mL）とH₂O（100mL）の間に分配し、有機層を乾燥させ（Na₂SO₄）、減圧で 濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、5cmx15cm、40〜100％EtOAc-ヘキサン勾配 溶離)にかけて17を無色の油(0.520g、理論量0.684g、76.0％)として得た。 18．18 −ヒドロキシーシス−９，10−オクタデセノアミド（18：スキーム４） THF(1.1mL、0.31M)中の17（0.185g、0.345ミリモル、1.0当量）の溶液をテト ラブチルアンモニウムフルオリド(0.69mL、THF中1.0Mの溶液、0.69ミリモル、2. 0当量)で処理し、その反応混合物を25℃で２時間攪拌した。次いでその反応混合 物をEtOAc(50mL)とH₂O(50mL)の間に分配し、有機層を乾燥させ（Na₂SO₄）、減圧 で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、3cmx15cm、０〜５％MeOH-EtOAc勾配溶 離)にかけて18を白色の固体(0.097g、理論量0.103g、94.6％)として得た。 19．化合物100（図５）の合成 メチル−９−ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ−ノナノエート（化合物100: 図５の中間体）。CH₂Cl₂（15mL、0.3M）中のメチル−９−ヒドロキシ−ノナノエ ート(0.838g、4.46ミリモル、1.0当量：アルドリッチ)の溶液をEt₃N（0.75mL、5 .38ミリモル、1.2当量）、ｔ−ブチルクロロジフェニルシラン(1.28mL、4.93 ミリモル、1.1当量)、及びDMAP（0.180g、1.48ミリモル、0.33当量）で連続して 処理し、その反応混合物を25℃で12時間攪拌した。飽和NH₄Cl水溶液を反応混合 物に添加し、その混合物をCH₂Cl₂（100mL）とH₂O（100mL）の間に分配した。有 機層を乾燥させ（Na₂SO₄）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、5cmx1 5cm、０〜５％EtOAc-ヘキサン勾配溶離)にかけて、その中間体を無色透明の油(1 .22g、理論量1.831、64.1％)として得た。 20．メチル−９−ブロモ−ノナノエート（化合物100の中間体：図５） ０℃のCH₂Cl₂(30mL、0.2M)中のメチル−９−ヒドロキシ−ノナノエート（1.1g 、5.85ミリモル、1.0当量）の溶液をCBr₄(2.5g、7.54ミリモル、1.3当量)及びPP h₃(2.15g、8.19ミリモル、1.4当量)で連続して処理し、その反応混合物を10時間 にわたって４℃で攪拌した。次いでその反応混合物を減圧で濃縮し、Et₂O(8X10m L洗浄)で繰り返し洗浄した。Et₂O洗浄液を合わせ、減圧で濃縮した。クロマトグ ラフィー(SiO₂、5cmx15cm、ヘキサン)にかけて、その中間体を無色透明の油(1.0 2g、理論量1.47g、69.5％)として得た。 21．９−Ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ−ノナナール（化合物100の中間 体：図５） -78℃のトルエン(9.80mL、3.0M)中の１（1.25g、2.93ミリモル、1.0当量）の 溶液をDIBAL-H（4.40mL)ヘキサン中1.0Mの溶液、4.40ミリモル、1.5当量）で滴 下して処理した。その反応混合物を-78℃で30分間攪拌した。次いでその反応混 合物をMeOH（2mL）で滴下して処理し、EtOAc(100mL)とH₂O（100mL）の間 に分配した。有機層を10％HCl水溶液(100mL)で洗浄し、乾燥させ（Na₂SO₄）、減 圧で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、5cmx15cm、０〜５％EtOAc-ヘキサン 勾配溶離)にかけて３を無色の油(1.1g、94.9％)として得た。 22．メチル−９−トリフェニルホスホラニル−ノナノエートブロミド（化合物 100の中間体：図５） CH₃CN(3.5mL、1.16M)中の９−Ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ−ノナナー ル（1.02g、4.06ミリモル、1.0当量）の溶液をトリフェニルホスフィン(1.17g、 4.47ミリモル、1.1当量)で処理し、10時間にわたって還流下で攪拌した。追加の トリフェニルホスフィン(0.532g、2.03ミリモル、0.5当量)を反応混合物に添加 し、攪拌を還流下に５時間続けた。その反応混合物を減圧で濃縮し、Et₂O（5X10 mL洗浄）で繰り返し洗浄した。次いで残りの残渣をCH₂Cl₂の最小容積中で可溶化 し、減圧で濃縮してその中間体を無色のフォーム(1.90g、理論量2.08g、91.3％) として得た。 23．メチル−18−ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ−シス−９，10−オクタ デセノエート（化合物100の中間体：図５） 25℃のTHF（6.5mL、0.3M）中の（1.0g、1.95ミリモル、1.0当量）の溶液をKHM DS（3.9mL、THF中0.5Mの溶液、1.95ミリモル、1.0当量）で処理し、その反応混 合物を還流下で１時間攪拌する。次いでその反応混合物を-78℃に冷却し、 ３（0.93g、2.35ミリモル、1.2当量）で処理し、25℃に温め、更に30分間攪拌し た。次いでその反応混合物を飽和NH₄Cl水溶液で処理し、EtOAc（100mL）とH₂O（ 100mL）の間に分配した。有機層を乾燥させ（Na₂SO₄）、減圧で濃縮した。クロ マトグラフィー(SiO₂、5cmx15cm、０〜２％EtOAc-ヘキサン勾配溶離)にかけて、 その中間体を無色の油(0.82g、理論量1.07g、76.3％)として得た。 24．18 −Ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ−シス−９，10−オクタデセン酸 （化合物100：図５） ０℃のTHF-MeOH-H₂O（3-1-1比、7.3mL、0.2M）中のメチル−18−ｔ−ブチルジ フェニルシリルオキシ−シス−９，10−オクタデセノエート(0.81g、1.47ミリモ ル、1.0当量)の溶液をLiOH・H₂O（0.188g、4.48ミリモル、3.0当量）で処理した 。その反応混合物を25℃に温め、８時間攪拌し、次いでEtOAc（100mL）とH₂O（1 00mL）の間に分配した。有機層を10％HCl水溶液（100mL）及び飽和NaCl水溶液(1 00mL)で連続的に洗浄し、乾燥させ、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂ 、5cmx15cm、10〜30％EtOAc-ヘキサン勾配溶離)にかけて100を無色の油(0.700g 、理論量0.790g、88.7％)として得た。 25．化合物101（図５）の合成 工程１．０℃のCH₂Cl₂（0.3M）中の100（1.0当量）の溶液を塩化オキサリル(4.0 当量)で滴下して処理した。その反応混合物を25℃で４時間攪拌し、減圧で濃縮 し、０℃に冷却し、飽和NH₄OH水溶液(2.0mL)で処理した。次いでその反応混合物 をEtOAc（100mL）とH₂O（100mL）の間に分配し、有機層を乾燥させ（Na₂SO₄）、 減圧で濃縮した。 工程２．０℃のエーテル(0.3M)中の上記工程１中間体化合物(1.0当量)の溶液を ピリジン(8.0当量)、続いてトリフルオロ無水酢酸(6.0当量、アルドリッチ)で滴 下して処理した。その反応混合物を25℃で３時間攪拌し、減圧で濃縮し、０℃に 冷却し、飽和NH₄OH水溶液(2.0mL)で処理した。次いでその反応混合物をEtOAc（1 00mL）とH₂O（100mL）の間に分配し、有機層を乾燥させ（Na₂SO₄）、減圧で濃縮 した。 工程３．THF（0.31M）中の上記工程２中間体化合物(1.0当量)の溶液をテトラブ チルアンモニウムフルオリド（THF中1.0Mの溶液、3.0当量）で処理し、その反応 混合物を25℃で３時間攪拌した。次いでその反応混合物をEtOAc(50mL)とH₂O（50 mL）の間に分配し、有機層を乾燥させ（Na₂SO₄）、減圧で濃縮した。生成物を通 常のクロマトグラフィー条件により精製し、化合物101を３工程について66％の 全収率で得た。 26．化合物102（図５）の合成 工程１．THF(0.1M)中の101（1.0当量）の溶液を０℃で30分間にわたってトリフ ェニルホスフィン(2.0当量)、続いてジエチルアゾジカルボキシレート溶液(1.0T HF溶液、DEAD、2.0当量、アルドリッチ)で処理した。その反応混合物を減圧で濃 縮し、Et₂O（5x10mLの洗浄）で繰り返し洗浄した。次いで残りの残渣を最小容積 のCH₂Cl₂に可溶化し、減圧で濃縮した。 工程２．THF（0.10M）中の上記工程１化合物(1.0当量)の溶液を０℃で30分間に わたってチオール酢酸(2.0当量、アルドリッチ)で処理した。その反応混合物を 減圧で濃縮し、Et₂O（5ｘ10mLの洗浄）で繰り返し洗浄した。次いで残りの残渣 を最小容積のCH₂Cl₂に可溶化し、減圧で濃縮した。生成物を通常のクロマトグラ フィー条件により精製し、化合物102を２工程について71％の全収率で得た。27 ．化合物103（図４及び５）の合成 工程１．０℃のMeOH/水(2:1混合物、全濃度0.20M)中の102（1.0当量）の溶液をN aOH（3.0当量）で処理し、10分間攪拌し、次いでEtOAc（100mL）と水(100mL)の 間に分配した。有機層を10％HCl水溶液(100mL)及び飽和NaCl水溶液(100mL)で連 続して洗浄し、乾燥させ、減圧で濃縮した。 工程２．０℃の1NのHCl水溶液中の上記工程１化合物(1.0当量)の溶液を、その反 応混合物が7.0のpHに達するまで攪拌し、次いでその混合物をEtOAc（100mL）と 水(100mL)の間に分配した。有機層を飽和NaCl水溶液(100mL)で連続して洗浄し、 乾燥させ、減圧で濃縮した。 工程３．25℃の１mMのNaHCO₃水溶液中の上記工程２化合物(1.0当量)の溶液をピ リジルジスルフィドビーズ(1.1当量、アルドリッチ)で処理し、２時間攪拌した 。続いてビーズを過剰の飽和NaHCO₃(3X)、水(3X)及び食塩水(1X)で洗浄した。通 常に濾過して活性化ビーズ（化合物103)を得、次いで活性化ピリジルジスルフィ ドビーズに結合されたこのCF3-インヒビターを使用してこれを上記の酵素のアフ ィニティークロマトグラフィー用のカラムに詰めた。 Ｄ．シス−９，10−オクタデセノアミダーゼｃＤＮＡのクローニング １．ラット肝臓ｍＲＮＡから得られたシス−９，10−オクタデセノアミダーゼ ｃＤＮＡ ラット肝臓ｍＲＮＡから生じたｃＤＮＡライブラリーからのシス−９，10−オ クタデセノアミダーゼのｃＤＮＡクローンを得るために、縮重オリゴヌクレオチ ドプライマーを、トリプシン消化から得られたシス−９，10−オクタデセノアミ ダーゼポリペプチドフラグメントのアミノ酸残基配列に基いて設計した。簡単に 言えば、上記のようにして精製したシス−９，10−オクタデセノアミダーゼをト リプシン消化にかけて、ウォーチェスター・ファウンデーション、ウォーチェス ター、PAにより行われたようにして中間ポリペプチドフラグメントを生成した。 得られたポリペプチドフラグメントをHPLCにより精製し、飛行時間によるマトリ ックス補助レーザー脱着イオン化(MALDI TOF、パーセプティブ・バイオシステム ズ・リニアー・インストルメンツ）により測定して特有のペプチド質量を示す７ 種のHPLCフラクションを微量配列決定に選んだ。完全ラットシス−９，10−オク タデセノアミダーゼアミノ酸残基配列中で７つの不連続の一本下線を施された領 域により示された図９中に示されたような12アミノ酸残基から25アミノ酸残基ま での範囲の長さを有する７種のポリペプチドフラグメントを微量配列決定した。 夫々のペプチドはそのＣ末端に必要とされるリシン残基又はアルギニン残基を有 し、トリプチン消化が予想された選択性で進行することを示した。 縮重オリゴヌクレオチドプライマーを、フォワードプライマー及びバックワー ドプライマーとして機能するプライマーの5'末端に特異な制限部位をとり込むよ うに設計した。また、フォワードプライマーを上流のセンスプライマー又は5'プ ライマーと称する。また、バックワードプライマーを下流のアンチセンスプライ マー又は3'プライマーと称する。制限部位をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物に とり込んで、上記の配列決定ベクターの多重クローニング部位への挿入を可能に した。 最初の２種の不連続の一本下線を施されたアミノ酸残基配列により示されるよ うに図９に示されたような配列決定されたペプチド１及び２の部分に相当する合 成された5'縮重オリゴヌクレオチド及び3'縮重オリゴヌクレオチドを夫々設計し た。縮重ヌクレオチドがIUPACコードＮ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴ及びＲ＝Ａ又はＧに より示される。ペプチド１に相当する5'縮重プライマーのヌクレオチド配列はEc oRI制限部位をとり込み、アミノ酸配列GGEGA(配列番号４)に翻訳する5'CGGAATTC GGNGGNGARGGNGC3'（配列番号３）であった。ペプチド２に相当する3'縮重プライ マーのヌクレオチド配列はBamHI制限部位をとり込み、アミノ酸配列DNYTMP（配 列番号34）に翻訳する5'CGGGATCCGGCATNGTRTARTTRTC3'（配列番号33）であった 。 シス−９，10−オクタデセノアミダーセをコードするｃＤＮＡの領域を増幅す るために、ラット肝臓ｍＲＮＡを、上記の縮重オリゴヌクレオチドプライマーの 選択された対によるPCR中の鋳型としての使用のためにｃＤＮＡに逆転写した。P CRを当業者に公知の条件下で行い、合計40サイクルの夫々のサイクルは温度94℃ で30秒、60℃で45秒及び72℃で60秒を有していた。 クローン化されたPCRフラグメントの中で、３種を配列決定に選択した。３種 のPCRフラグメントは350塩基対(bp)、400bp及び750bpであった。これらのシス− ９，10−オクタデセノアミダーゼをコードするｃＤＮＡフラグメントの配列決定 は、750bpフラグメントが350bpフラグメント及び400bpフラグメントの両方の配 列を含むことを示した。 次いでPCRにより得られた350bp ｃＤＮＡフラグメントを内部標識し、電気泳 動されたラット肝臓ｍＲＮＡに関するノーザン分析用のプローブとして使用した 。そのプローブは長さ約2.5〜3.0キロベース(kb)のフラグメントにハイブリッド を形成し、これは60kDaタンパク質をコードするシス−９，10−オクタデセノア ミダーゼｍＲＮＡの予想サイズである。 完全シス−９，10−オクタデセノアミダーゼタンパク質をコードするｃＤＮＡ クローンを単離するために、350bpプローブをその後に³²Pで内部標識して使用し てクロンテク（パロ・アルト、CA）から得られたラット肝臓ｍＲＮＡからλgt11 ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。スクリーニングについて、増幅さ れた350bpフラグメントを最初に同様に消化されたｐブルースクリプトII SK（- ）（ストラタゲン、ラ・ジョラ、CA）への方向性クローニングのためにEcoRI及 びBamHIで消化した。得られた配列は、350bpフラグメントが縮重オリゴヌクレオ チドプライマーが設計されたペプチド１及び２をコードすることを示し、所望の クローンのPCR及び増幅の精度を確認した。本発明のシス−９，10−オクタデセ ノアミダーゼｃＤＮＡのクローニング方法は当業者に公知の技術であり、例えば 、“Current Protocols in Molecular Biology”，Ausebelら編集，Wiley ＆ So ns，Inc.，New York（1989）に記載されており、これらの開示が参考として本明 細書に含まれる。 ４種の陽性クローンを4.5X10⁵プラークのスクリーニングから同定した。長 さ2.7kbの２種のクローン及び長さ2.0kbの１種のクローンを得た。2.7kbクロー ンの一種（p60と称される）の部分配列は、そのクローンがシス−９，10−オク タデセノアミダーゼ特異性配列を含むことを示す。 先に得られたp60と称するラット肝臓ｃＤＮＡクローンは1996年６月12日以前 にATCCに寄託され、ATCC受理番号97605を指定された。この寄託を特許手続きの 目的のための微生物の寄託の国際認可に関するブタペスト条約の条項及びその規 則（ブタペスト条約）のもとに行った。これは夫々の寄託の日から30年にわたっ て生存プラスミドの管理を保証する。プラスミドは関連米国特許の発行後又は米 国特許出願又はその他の外国特許出願の公衆への公開後（これらのいずれか最初 ）に公衆へのプラスミドの子孫の永久かつ無制限の利用可能性を保証し、かつ35 U.S.C．§122及び米国特許庁の規則(886 OG 638を特に参考にして37 CFR§1.1 4を含む）に従って米国特許庁により定められた者への子孫の利用可能性を保証 するブタペスト条約の条項のもとにATCCにより利用可能にされるであろう。特許 出願の譲受人は、プラスミド寄託物が適当な条件で培養された時に死滅し、又は 損失もしくは破壊された場合に、それが通知後速やかに同プラスミドの生存標本 により置換されることに同意した。寄託物の利用可能性は、特許法に従って政府 の権威のもとに付与された権利に反して本発明を実施するライセンスと見なされ るべきではない。 上記780ヌクレオチドを含むp60ｃＤＮＡクローンの上部ストランドの部分ヌク レオチド配列を演繹アミノ酸残基配列とともに配列番号１にリストする。コード されたアミノ酸残基配列を配列番号２に別々にリストする。配列表中夫々のトリ プレットコドンによりコードされたアミノ酸残基を示すために、終止コドン、TA Aを位置781〜783に付加して、配列表を作成するのに使用したパテンチンプログ ラム中のコード配列(CDS)機能を可能にした。換言すれば、終止コドンを配列番 号１に示されたヌクレオチド配列に人工的に挿入してアミノ酸配列へのｃＤＮＡ コード配列の翻訳を促進する。 完全ｃＤＮＡクローン中のシス−９，10−オクタデセノアミダーゼヌクレオチ ド位置の実際の位置は以下に記載されるように完全ｃＤＮＡ配列から明らかであ る。 次いで２種の最大の陽性ｃＤＮＡクローンをｐブルースクリプトII SK(+)にク ローン化し、配列決定した。１種のクローンは付加的な200bpのイントロン配列 とともにオレアミドアミダーゼの完全コーディング配列を含む部分プロセシング された転写産物をコードした。別のクローンは完全にプロセシングされたオレア ミドアミダーゼ転写産物をコードしたが、ｒＲＮＡをコードする300bpフラグメ ントがクローンの5'末端に融合された。内部オーバーラッピングHindIII制限部 位による２種のクローンの融合はFAAHと略記される脂肪酸アミドヒドロラーゼと 又称される完全長ラットシス−９，10−オクタデセノアミダーゼを生じた。クロ ーンをベックマンオリゴ1000Mシンセサイザーで合成された配列決定プライマー で配列決定した。 得られた完全長ラットｃＤＮＡ FAAHクローン（又、rFAAH ｃＤＮＡと称され る）は2473bpを含み、これは図10-1〜10-5に示されるように63.3kDaのタンパク 質配列をコードする単−1.73kb読み取り枠を含んでいた。二本鎖ラットFAAH ｃ ＤＮＡ配列は受理番号U72497でゲンバンクにより入手し得る。コードされたラッ トFAAHタンパク質は又rFAAHタンパク質と称される。クローンは読み取り枠の開 始の最初のATG指示に5'の50bpの配列を含んでいた。又、クローンは読み取り枠 の末端を示す最初の終止コドンとpolyAテールの間の3'未翻訳領域の685bpを含ん でいた。 図10-1〜10-5中、コードされたアミノ酸残基はトリプレットコドンの第二ヌク レオチドの直接下に位置される。例えば、ATGがメチオニン(M)をコードする開始 部位では、Ａヌクレオチドがヌクレオチド位置50で開始し、Ｇヌクレオチドは52 である。コードされたＭはヌクレオチド位置51でＴヌクレオチドの下に位置され る。図に示されるように、こうして、示されたトリプレットコドンは示されたと おりではない。又、ｃＤＮＡ配列の上部ストランド及び下部ストランドが配列番 号35及び37に夫々リストされる。コードされたアミノ酸配列は配列番号35に上部 ストランドで示され、配列番号36に再度それ自体で示される。 最初のATGの上流のヌクレオチド配列の50塩基はイン−フレーム(in-frame)終 止コドンを有していなかったが、証拠の以下の幾つかのラインが完全なオレアミ ドヒドロラーゼタンパク質配列をコードする2.47kb ｃＤＮＡを支持した。1) ｃＤＮＡのサイズがノーザンブロット(以下に説明される図12B)により推定して ｍＲＮＡ転写産物の予想サイズと密接にマッチした。2)最初のATGの周囲の配列 が真核翻訳開始部位に必要とされるコンセンサス配列を有し、特に、Ａが-3位置 に存在し、Ｇが+4位置に存在し、かつ3)オレアミドヒドロラーゼｃＤＮＡで一時 的にトランスフェクトされた時に、COS-7細胞はSDS-PAGEでアフィニティー単離 されたオレアミドヒドロラーゼとともに同時移動する機能性タンパク質産物を翻 訳した（図12B、レーン１そして以下に説明される）。 オレアミドアミダーゼタンパク質配列(FAAH)によるデータベース検索はアグロ バクテリウム・ツメファシエンス(Kleeら，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81:1728 -1732，1984)、シュードモナス・サバスタノイ(Yamadaら，Proc.Natl.Acad.Sci. ，USA，82:6522-6526，1985)、アスペルギルス・ニジュランス(Corrickら，Gene ，53:63-71，1987)、サッカロミセス・セレビジエ(Changら，Nuc.Acids R-es.， 18:7180，1990)、ケノルハブジチス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)(Wil sonら，Nature，368:32-38，1994)、及びガルス・ドメスチクス(Ettingerら，Ar ch.Biochem.Biophys.，316:14-19，1995)と同程度に分岐した生物からの幾つか のアミダーゼ酵素配列に対し強い相同性を同定した。これらのアミダーゼは、員 の全てが図11に示される様な共通の標示配列を共有する最近特定された酵素ファ ミリー(Mayauxら，J.Bacteriol.，172:6764-6773，1990)を集約的に構成する。 ラット脂肪酸アミドヒドロラーゼ（オレアミドヒドロラーゼ又はFAAH）の位置21 5で始まり、246を介して延びるコードされたアミノ酸はアミダーゼのファミリー に見られる残基を含む。本発明のシス−９，10−オクタデセノアミダーゼラット タンパク質中の配列はアミノ酸位置215〜246で配列番号36に示されるGGSSGGEGAL IGSGGSPLGLGTDIGGSIRFPSを有する。幾つかのその他の代表的なアミダーゼと一緒 のラットFAAHのアミダーゼ標示配列領域にわたる配列は、標示配列がアミダーゼ ファミリー員間で完全に保存されることを明らかにする。これらのアミノ酸は図 中太字で示され、夫々のアミダーゼ中の標示配列の相対的アミノ酸位置が配列情 報の前後の番号により示される。配列の夫々について指定された配列番号が図面 の簡単な説明中の図についての注にリストされる。 本発明者らが知る限りでは、FAAHと又称されるオレアミドアミダーゼは分子的 に特性決定されたこの酵素ファミリーの最初の哺乳類員である。 ラットFAAH配列の疎水親水性(hydropathicity)プロット及びトランスメンブラ ンドメイン研究(TMpredプログラム及びPSORTプログラム）を行い、夫々の研究が アミノ酸13-29(図９中の太字)からの強い推定トランスメンブランドメインを示 した。ラットFAAHの推定トランスメンブランドメインを包囲し、含む50アミノ酸 領域はその他のアミダーゼファミリー員のタンパク質配列と相同性を共有せず、 ラットアミダーゼの特異な修飾の一つが膜へのその組込みであるかもしれないこ とを示した。重要なことに、FAAH配列の付加的な分析はコンセンサスクラスIISH 3ドメイン結合配列、PPLPXR（配列番号38）Fengら，Science，266:1241-1246，1 994)に対し位置310から315までの正確なマッチを含むポリプロリンセグメント、 アミノ酸307-315(図９中に二重下線を施された)を明らかにし、その他のタンパ ク質がFAAHと相互作用してその活性(Pawson，Nature，373:573-580，1995)及び ／又は細胞下の局在化(Rotinら，EMBO J.，13:4440-4450，1994)を調節し得るこ とを示唆した。 サザンブロット分析及びノーザンブロット分析をラットFAAH ｃＤＮＡの内部8 00bpフラグメントを用いて行ってFAAHのゲノムコピー数及び組織分布を夫々評価 した。 サザンブロットについて、ラットゲノムＤＮＡ10μｇを12時間にわたって示さ れた制限酵素（夫々100単位）で消化し、次いで0.8％のアガロースゲルで実験し た。ラットゲノムＤＮＡを最初に以下のようにしてラット肝臓から単離した。ラ ット肝臓約500mgを２mlの100mMのトリス（pH8.0）、0.2％のSDS、200mMのNaCl、 及び0.2mg/mlのプロテイナーゼＫ中で55℃で一夜振とうした。次いで混合物を15 ,000rpmで15分間回転させ、上澄みを除去し、等容積のイソプロパノールで処理 した。沈殿したゲノムＤＮＡを除去し、部分乾燥させ、55℃で４時間加熱するこ とにより水中で再度懸濁させた。ＤＮＡ10μｇを12時間にわたって示された制限 酵素（夫々100単位）で消化し、次いで0.8％のアガロースゲルで実験した。次い でＤＮＡをサザンブロット分析に使用するためのジーンスクリーンプラスハイブ リダイゼーション転移膜（デュポンNEN)に毛管圧力下で移した。ブロットを製造 業者（クロンテク）のガイドラインに従って取扱い、下記の後ハイ ブリダイゼーション洗浄にかけた。１％のSDS及び0.2X SSC（30mMのNaCl、3.0mM のクエン酸ナトリウム、pH7.0）の溶液中で25℃で１回の20分の洗浄、続いて0.1 ％のSDS及び0.2X SSCの溶液中で65℃で２回の20分の洗浄及び65℃で１時間の１ 回の付加的な後ハイブリダイゼーション洗浄（0.1％のSDS、0.1X SSC、pH7.0） 。次いでブロットを12時間にわたって-78℃でＸ線フィルムに露出した。 サザンブロット研究は、ラットゲノムの幾つかの異なる制限消化産物を使用し て、FAAHプローブが主として単−ＤＮＡフラグメントにハイブリッド形成するこ とを示した(図12A)。予想されたように、２種のハイブリッド形成バンドをHindI II消化ＤＮＡ中に観察した。何とならば、FAAHプローブは内部HindIII部位を含 んでいたからである。これらの結果はFAAH遺伝子が単一コピー遺伝子であること と最も合致する。 ノーザン分析について、65℃で１時間の0.1％のSDS及び0.1X SSC(15mMのNaCl 、1.5mMのクエン酸ナトリウム、pH7.0)の溶液による付加的な後ハイブリダイゼ ーション洗浄を行って非特異的ハイブリダイゼーションの除去を確実にした以外 は、クロンテクから得られたブロットを製造業者のガイドラインに従って取り扱 った。得られるブロットを-78℃で６時間Ｘ線フィルムに露出した。 FAAHプローブによるノーザンブロット分析は肝臓及び脳中に最も多量にあり、 少量が脾臓、肺、腎臓、及び睾丸中に存在するサイズ約2.5kbの単一の主要なｍ ＲＮＡ転写産物を同定した(図12B)。この転写産物は心臓又は骨格筋中で検出で きず、これらの２種の組織中でアナンドアミドヒドロラーゼ活性を同定しない先 に報告された生化学研究(Deutschら，Biochem.Pharmacol.，46:791-796，1993) と一致した。又、ノーザンブロットは同様に2.5kbの転写産物を発現する組織中 にのみ存在する二三の大きい転写産物へのFAAH ｃＤＮＡプローブの低レベルの ハイブリダイゼーションを含んでいた。これらの転写産物は2.5kbのｍＲＮＡの プロセシングされなかった形態又はオルタナチブスプライシングされた形態であ るかもしれない。加えて、ラット脳中のラットFAAH転写産物の領域分布をノーザ ン分析により調べて、最高レベルの海馬及び視床とともに、嗅球、皮質、小脳及 び脳下垂体を含む脳のその他の領域中で検出し得る低レベルの転写産物を明らか に した。又、ラット脳切片の予備in situハイブリダイゼーション分析が海馬及び 視床下部の両方中でラットFAAHに関する高い発現レベルを同定した。最後に、マ ウス胚発育の種々の段階におけるマウスFAAH発現レベルのノーザン分析を行い、 そこでマウスFAAHを11日目〜15日目に最初に観察し、レベノレが15日目から17日 目まで著しく増加し続けた。 ２．マウス肝臓ｍＲＮＡから得られたシス−９，10−オクタデセノアミダーゼ ｃＤＮＡ 全ラットｃＤＮＡ（図10-1〜10-5）を標識プローブとして使用した以外は、ラ ットｃＤＮＡを得ることについて上記されたのと同じ条件を使用して、ラットシ ス−９，10−オクタデセノアミダーゼｃＤＮＡのマウス同族体をマウス肝臓5'ス トレッチ＋ｃＤＮＡライブラリー（クロンテク）のスクリーニングから得た。 得られたマウス二本鎖1959bp ｃＤＮＡ同族体及びコードされたアミノ酸残基 が図13-1〜13-4に示され、ATG開始部位がボックスされたメチオニン(M)残基で示 されたヌクレオチド位置７で始まる。終止コドン、TGAがヌクレオチド位置1744 〜1746、続いて3'未翻訳領域で図13-4に示されるように同様にボックスにされる 。又、ｃＤＮＡ配列の上部ストランド及び下部ストランドが夫々配列番号39及び 41としてリストされる。コードされたアミノ酸配列が配列番号39に上部ストラン ドで示され、配列番号40にそれ自体で再度示される。 ３．ヒト肝臓ｍＲＮＡから得られたシス−９，10−オクタデセノアミダーゼｃ ＤＮＡ 先に調製した全ラットｃＤＮＡを標識プローブとして使用し、それ程ストリン ジェントではないハイブリダイゼーション（製造業者の推奨ハイブリダイゼーシ ョン緩衝液中50％のホルムアミドに代えて25％）を使用した以外は、シス−９， 10−オクタデセノアミダーゼのヒト同族体のｃＤＮＡクローンをヒト肝臓5'スト レッチ＋ｃＤＮＡライブラリー（クロンテク）のスクリーニングによりラットに ついて上記されたようにして同様に得た。又、洗浄条件は65℃で0.1％のSDSを含 む1X SSCに代えて50℃で0.1％のSDSを含む２X SSCを含んでいた。 得られたヒト二本鎖2045bp ｃＤＮＡ同族体及びコードされたアミノ酸残基が 図14-1〜14-5に示され、ATG開始部位がボックスされたメチオニン(M)残基で示さ れたヌクレオチド位置36で始まる。終止コドン、TGAがヌクレオチド位置1773〜1 775、続いて3'未翻訳領域で図14-4に示されるように同様にボックスにされる。 又、ｃＤＮＡ配列の上部ストランド及び下部ストランドが夫々配列番号42及び44 としてリストされる。コードされたアミノ酸配列が配列番号42に上部ストランド で示され、配列番号43にそれ自体で再度示される。 Ｅ．発現された組換え脂肪酸アミドヒドロラーゼシス−９，10−オクタデセノ アミダーゼの調製 本発明に使用するための組換えFAAHタンパク質を調製するために、先に得られ たラット、マウス及びヒトのｃＤＮＡをCOS-7細胞中の一時的発現研究のための 真核生物発現ベクターpcDNA3に別々にクローン化した。 ラット、マウス及びヒトのFAAH組換えタンパク質を調製するために、相当する FAAH ｃＤＮＡをブルースクリプトIIベクターから切除し、真核生物発現ベクタ ーpcDNA3（インビトロゲン、サンジエゴ、CA）に別々につないだ。COS-7細胞の1 00mmの皿を完全培地（L−グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム 及びウシ胎児血清を含むDMEM）中で37℃で70％の集密まで増殖させた。次いでCO S-7細胞を無血清培地で洗浄し、トランスフェクション溶液５mlで処理した（FAA H-pcDNA3ベクター5-6μｇを無血清培地１ml中で30分間にわたってトランスフェ クタミン（キブコ-BRL）とともにプレインキュベートし、次いで無血清培地で５ mlの最終容積まで希釈した）。COS-7細胞を37℃で５時間インキュベートし、そ の時点で完全培地10mlを細胞に添加し、インキュベーションを37℃で12時間続け た。次いでトランスフェクション溶液をCOS-7細胞から吸引して除き、細胞を更 に24時間にわたって完全培地の新しいバッチ中でインキュベートした。COS-7細 胞を細胞スクラッペーで回収し、低速でペレットにし、１mMのNaHCO₃で２回洗浄 し、１mMのNaHCO₃200μｌ中で再度懸濁させた。再度懸濁させたCOS-7細胞を12回 ドウンス均質化し、得られた細胞抽出液20μｌを使用してオレアミドヒドロラー ゼ活性について分析し（アッセイは節B6に先に詳述される）、結果が 節Ｆに以下に記載される。トランスフェクションに使用したpcDNA3ベクターが逆 配向でFAAH ｃＤＮＡを含む以外は、対照COS-7細胞を同様に調製した。 次いでラット、ヒト及びマウスに関する得られた発現された組換えFAAHタンパ ク質がその後に以下に記載されるようにして特異性及び酵素活性を評価するのに 使用される。 Ｆ．脂肪酸アミドヒドロラーゼ特異性及び発現された組換え脂肪酸アミドヒド ロラーゼの活性 上記のように、トランスフェクトされたCOS-7細胞を溶解して本発明の組換え 発現ラット、マウス及びヒトFAAHタンパク質の夫々について細胞抽出物を生成し た。 トランスフェクトされなかったCOS-7細胞は無視できる量のオレアミドヒドロ ラーゼ活性を含んでいたが、ラットFAAH ｃＤＮＡでトランスフェクトされたCOS -7細胞は高レベルのオレアミドヒドロラーゼ活性を発現した(図15A)。アッセイ を節Ｂに記載されたようにして行い、そこでTLCによりオレイン酸へのオレアミ ドの変換を評価した。図15Aに示されるように、トランスフェクトされなかったC OS-7細胞（レーン１）又は対照のトランスフェクトされた細胞（レーン２、逆配 向でオレアミドヒドロラーゼｃＤＮＡを含むpcDNA3でトランスフェクトされた） 中ではなく、レーン３に示された発現ベクターpcDNA3中でラットオレアミドヒド ロラーゼｃＤＮＡで一時的にトランスフェクトされたCOS-7細胞は、標識オレア ミドをオレイン酸に変換するのに有効であった。図16に示されたようなヒトオレ アミドヒドロラーゼで一時的にトランスフェクトされたCOS-7細胞で同様の結果 が得られ、そこでオレイン酸への変換がレーン１中の対照COS-7細胞と比較して レーン２中でのみ見られる。 この酵素活性は、ラット肝臓原形質膜オレアミドヒドロラーゼ活性と同様に、 レーン１中の未処理抽出物と比較して50μＭのトリフルオロメチルケトンの存在 下でラットオレアミドヒドロラーゼでトランスフェクトされたCOS-7細胞で図の レーン２に示されるように図15Bに証明されるようにトリフルオロメチルケトン により抑制された。 発現された組換えタンパク質の特異性を確かめるために、単独又は競合ペプチ ドの存在下の抗FAAHポリクローナル抗体によるウェスタンブロット分析を行った 。 ほぼ等しいタンパク質量を含むラットFAAHでトランスフェクトされたCOS-7細胞 及びトランスフェクトされなかったCOS-7細胞からの細胞抽出物のサンプルを２ ％のSDS及び５％のβ−メルカプトエタノールを含むローディング緩衝液中で65 ℃に10分間加熱した。次いで先に示されたサンプルを8-16％のポリアクリルアミ ドゲル勾配トリス−グリシンゲルで実験し、ウェスタンブロッティングのために ニトロセルロースに移した。ニトロセルロースブロットをTBS-トゥイーン中５％ のブロットで４℃で一夜ブロックし、次いで２時間にわたって25℃で内部FAAHペ プチド配列に対し生成された先に記載されたペプチド２（TBS-トゥイーン中15μ g/ml）に対し産生されたポリクローナル抗体とともにインキュベートした。次い でブロットをTBS-トゥイーン(0.1％)中で洗浄し、25℃で30分間にわたって二次 抗体−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体とともにインキュベートし、 TBS-トウイーン中で再度洗浄し、安定なペルオキシド溶液及びルミノール／エン ハンサー溶液（ピアス）で発色させた。ブロットへの抗体の添加の前に30分間に わたってポリクローナル抗体とともに先に記載されたペプチド２に相当する1000 倍モル過剰のペプチド抗原をプレインキュベートすることによりペプチド競合実 験を行った。 FAAHの内部ペプチド２配列に対し産生されたポリクローナル抗体によるラット ｃＤＮＡでトランスフェクトされたCOS-7細胞抽出物のウェスタンブロッティン グは、SDS-PAGEでアフィニティー単離されたFAAHと同時移動する60-65kDa免疫反 応性バンドを示した(図15C)。トランスフェクトされなかったCOS-7細胞抽出物は このサイズの検出可能な免疫反応性タンパク質バンドを含んでいなかった。更に 、60-65kDaのタンパク質の免疫反応性が過剰のペプチド抗原と一緒の抗体のプレ インキュベーションにより有効に競合されて除かれ(図15C)、一方、トランスフ ェクトされたCOS-7細胞抽出物及ひトランスフェクトされなかったCOS-7細胞抽出 物の両方中で観察された痕跡量の交差反応性タンパク質がこのペプチドにより競 合されなかった。 先の研究は、オレアミドを加水分解する酵素活性がアナンドアミド（アラキド ニルエタノールアミド）をアラキドン酸に変換する同じ活性であるかもしれない と示唆した。それ故、ラットFAAH ｃＤＮＡでトランスフェクトされたCOS-7細胞 をアナンドアミドヒドロラーゼ活性について分析した。標識アナンドアミドに関 する本発明の発現された組換え脂肪酸アミドヒドロラーゼの酵素活性を評価する ために、以下の酵素アッセイを行った。¹⁴C-アナンドアミドを以下のようにして 合成した。¹⁴Cアラキドン酸（モラベク・バイオケミカルズ）12.5μＣｉ（50μ Ｃｉ/μＭの比活性）をCH₂Cl₂100μｌに溶解し、０℃に冷却し、過剰の塩化オキ サリルで処理した。その反応混合物を25℃で６時間攪拌し、その時間後に溶媒を 蒸発させた。残っている残渣を０℃に冷却し、大過剰のエタノールアミンで処理 し、25℃で15分間攪拌した。次いでその反応混合物を酢酸エチルと2MのHClの間 に分配し、有機層を水洗し、次いで蒸発、乾燥させた。得られる¹⁴C-アナンドア ミドを未標識アナンドアミドでエタノール中５μＣｉ/μＭの最終比活性に希釈 した。¹⁴C−アナンドアミド約１μＣｉ及びドウンス均質化されたCOS-7細胞抽出 物20μｌをオレアミドヒドロラーゼアッセイについて先に詳述されたような夫々 のアナンドアミドヒドロラーゼアッセイに使用した。簡単に言えば、FAAH加水分 解アッセイを100μＭの基質、ラットトランスフェタトされたCOS-7細胞タンパク 質を用いて37℃で３回の反復実験で５分間行った（ステアリン酸アミドの場合を 除く、この場合、低溶解性のためにオレアミドとの比較を20μＭの基質で行った ）。生成物を前記のようにしてTLCで分離し、シンチレーション液体にこすって 取り、放射能をシンチレーションカウンティングにより定量した。等しい量のト ランスフェクトされなかったCOS-7細胞タンパク質抽出物の存在下の基質加水分 解が全ての場合にバックグラウンド対照として利用でき、FAAH加水分解速度から 引かれて以下に示されるようなデータを得た。 アナンドアミドアッセイの結果は、トランスフェクトされなかったCOS-7細胞 が無視できる量のアナンドアミドヒドロラーゼ活性を含むが、トランスフェクト されたCOS-7細胞が高レベルのアナンドアミドヒドロラーゼ活性を生じることを 示した(図17)。こうして、FAAHはオレアミド及びアナンドアミドの両方を加水分 解する能力を有し、アミダーゼがシグナリング分子の脂肪酸アミドファミリーに 一般の分解酵素として作用し得ることを示す。FAAHの基質乱婚は種々のアミン含 有神経伝達物質を酸化するのに利用できるモノアミンオキシダーゼ酵素を連想さ せる。 本発明の組換え発現タンパク質の酵素加水分解活性の基質特異性スペクトルを 更に評価するために、その他の¹⁴C-標識脂肪酸アミドを節B6に記載されたように して、又上記アナンドアミドを除いて¹⁴C-オレアミドについて上記されたように して合成した。 結果は、組換え発現ラットFAAHがほぼ等しい速度でオレアミド及びアナンドア ミドの加水分解を触媒作用するが、FAAHが脂肪酸アミド間で識別することを示し た。何とならば、FAAHは以下の表１に示されるようにオレアミド又はアナンドア ミドで見られる速度と較べてかなり低下された速度でミリスチン酸アミド、パル ミチン酸アミド及びステアリン酸アミドを含むその他の代表的な脂肪酸アミドを 加水分解するからである。表に示される場合、アナンドアミド及びオレアミド加 水分解速度はFAAHの活性の100％であると考えられ、それに対してその他の脂肪 酸アミド加水分解速度が比較される。 表１ 基質 加水分解の速度^* ％ アナンドアミド(100μＭ) 333+/-30 100 オレアミド(100μＭ) 242+/-20 72.6 ミリスチン酸アミド(100μＭ) 81+/-7 24.3 パルミチン酸アミド(100μＭ) 33+/-2 9.9 オレアミド(20μＭ) 41+/-2 100 ステアリン酸アミド(20μＭ) 2.3+/-1 5.8^* 速度は夫々についてｎモル／分／mgで測定される。 比較アッセイを先に使用したラット酵素に対しマウス及びヒト組換え同族体を 用いて行う。 こうして、先に示されたように、ラットFAAH酵素は基質優先性を有しないこと はないが、それは幾つかのアミド基質に対する活性を示した。FAAHが基質選択性 を示した程度はオレアミド及びステアリン酸アミドの酵素加水分解の間でほぼ20 倍の速度の差により最良に例示され、その２種の化台物はΔ９位置で単一の不飽 和度のみを異にする。このパターンが又インヒビタートリフルオロメチルケトン によるアッセイで確認され、これはステアリン酸アミドの相当するトリフルオロ メチルケトン類縁体よりも20倍強いFAAHのインヒビターであった。こうして、FA AHはステアリン酸アミドのアルキル直鎖よりもオレアミドの曲がったアルキル鎖 をかなり好む。 又、本発明のFAAH分子の可溶性形態を生成するための欠失変異体を調製した。 推定トランスメンブランドメインが欠失された構築物をつくって、１ではなくコ ードされたタンパク質のアミノ酸残基30で開始するトランケートFAAHを生じた。 この構築物を調製するために、FAAHのアミノ末端30アミノ酸をコードする最初の 140bpを欠いているラットFAAH ｃＤＮＡの5'末端のPCR増幅のために下記のプラ イマーを設計した。5'プライマー及び3'プライマーはアミノ酸30-35をコードし 、KpnI部位及び人工終止コドンを含む夫々のヌクレオチド配列5'GCGGTACCATGCGA TGGACCGGGCGC3'（配列番号45）及び5'GGTCTGGCCAAAGAGAGG3'（配列番号46）（そ の逆補体はアミノ酸199-204をコードする）を有していた。 次いで増幅されたトランスメンブラン欠失ラットFAAH ｃＤＮＡフラグメント を適当な制限酵素(KpnI及びHindIII)で消化し、最初のｃＤＮＡ5'末端を置換す る同様に消化されたFAAH-pブルースクリプトベクターにクローン化した。欠失構 築物を配列決定により確認し、次いで切除し、本明細書に記載された発現研究の ためにpcDNA3に転移した。 発現のために、トランスフェクトされたCOS-7細胞抽出物を以下のようにして 可溶性フラクション及び膜フラクションに分離した。抽出物を25℃で５分間にわ たって2500rpmで回転させ、上澄みをエアーフュージ管に移し、可溶性上澄みを 調製するために超遠心分離機（４℃で40分間にわたって30psi）中で回転させた 。ペレットは膜結合フラクションを含み、次いでこれを上澄みの容積に等しい容 積の１mMのNaHCO₃中で再度懸濁させた。 トランスメンブラン欠失発現組換えFAAHは上記のCOS-7細胞発現アッセイで機 能性であった。ラットｃＤＮＡのマウス及びヒトトランスメンブラントランケー ション同族体を同様に調製し、本発明を実施するのに使用する。 シグナリング分子の脂肪酸アミドファミリーの種々の員について生物活性を実 証する増大する数の研究を考慮すると、本明細書に記載されたようなラット、マ ウス及びヒトの間に相同性を有する脂肪酸アミドヒドロラーゼ(FAAH)ファミリー の発見は脂肪酸アミドを不活化する代謝プロセスの調節、メカニズム、及び薬理 学を理解するのに専念する進行中の研究に有益な発明を提供する。加えて、クロ ーン化されたFAAH遺伝子は強力なFAAHインヒビターと協力して脂肪酸アミドファ ミリーにより影響される生理学的経路を解明するとともにこれらの生物学的プロ セスの薬理学的介入に関する系統的なアプローチを開発する可能性を与える。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｑ 1/34 Ｃ１２Ｑ 1/34 Ｃ０７Ｃ 49/227 // Ｃ０７Ｃ 49/227 Ａ６１Ｋ 37/54 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 クラヴァット ベンジャミン エフ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92122 サン ディエゴ レボン ドライ ヴ 3435 ナンバー 1024 (72)発明者 ラーナー リチャード エイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92037 ラ ジョラ イースト ローズラ ンド ドライヴ 7750

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. シス−９，10−オクタデセンアミド、アナンドアミド、ミリスチン酸アミド 、パルミチン酸アミド及びステアリン酸アミドを加水分解することができる単離 された脂肪酸アミドヒドロラーゼ(FAAH)。 2. 前記FAAHが配列番号36に示されたアミノ酸残基配列を有する請求の範囲第１ 項に記載のFAAH。 3. 前記FAAHが残基３から581まで配列番号40に示されたアミノ酸残基配列を有 する請求の範囲第１項に記載のFAAH。 4. 前記FAAHが残基12から590まで配列番号43に示されたアミノ酸残基配列を有 する請求の範囲第１項に記載のFAAH。 5. 前記FAAHが からなる群から選ばれたアミノ酸配列の包含を特徴とする請求の範囲第１項に 記載のFAAH。 6. 前記FAAHが哺乳類から単離される請求の範囲第１項に記載のFAAH。 7. 前記FAAHが配列番号35、39及び42からなる群から選ばれた配列を有するFAAH をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ発現ベクターの発現により生 成される請求の範囲第１項に記載のFAAH。 8. 前記FAAHがアフィニティークロマトグラフィー、電気クロマトグラフィー、 ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び分配クロマ トグラフィーからなる群から選ばれたクロマトグラフィー方法による精製により 単離される請求の範囲第１項に記載のFAAH。 9. 前記アフィニティークロマトグラフィーがFAAHを吸着するためのFAAHのトリ フルオロケトンインヒビターで誘導体化された固相吸収剤を使用する請求の範囲 第８項に記載のFAAH。 10．前記FAAHが以下のような精製： 工程Ａ：DEAEクロマトグラフィーカラムを使用して、FAAHの粗起源を交換ク ロマトグラフィーにより精製して第一溶離生成物を生成し、次いで 工程Ｂ：前記工程Ａの第一溶離生成物をHgアフィニティークロマトグラフィ ーカラムによる溶離により更に精製して第二溶離生成物を生成し、次いで 工程Ｃ：前記工程Ｂの第二溶離生成物をヘパリンアフィニティークロマトグ ラフィーカラムによる溶離により更に精製して第三溶離生成物を生成し、次い で 工程Ｄ：前記工程Ｃの溶離生成物をFAAHのトリフルオロケトンインヒビター で誘導体化されたアフィニティークロマトグラフィーカラムによる溶離により 更に精製してFAAHの精製形態を生成して、単離される請求の範囲第１項に記載 のFAAH。 11．脂肪酸一級アミドを反応条件下で請求の範囲第１項に記載の単離されたFAAH の触媒量と接触させる工程を含むことを特徴とする脂肪酸一級アミドの加水分解 を触媒作用する方法。 12．脂肪酸一級アミドが不飽和を有するアルキル鎖を含む請求の範囲第11項に記 載の脂肪酸一級アミドの加水分解を触媒作用する方法。 13．不飽和がシス配置を有するアルキル鎖中にある請求の範囲第12項に記載の脂 肪酸一級アミドの加水分解を触媒作用する方法。 14．脂肪酸一級アミドがシス−９，10−オクタデセノアミド、シス−８，９−オ クタデセノアミド、シス−11，12−オクタデセノアミド、シス−13，14−ドコセ ノアミド、及び式： NH₂C(O)(CH₂)(6≧n≦11)CH=CH(CH₂)(8≧n≦5)CH₃ を有する脂肪酸一級アミドからなる群から選ばれる請求の範囲第11項に記載の 脂肪酸一級アミドの加水分解を触媒作用する方法。 15．請求の範囲第１項に記載のFAAHによる脂肪酸一級アミドの酵素触媒加水分解 の抑制方法であって、その方法が前記FAAHをFAAHのインヒビターと接触させる 工程を含むことを特徴とする抑制方法。 16．前記脂肪酸一級アミド基質がシス−９，10−オクタデセノアミド、アナンド アミド、ミリスチン酸アミド、パルミチン酸アミド及びステアリン酸アミドから なる群から選ばれる請求の範囲第15項に記載の方法。 17．前記脂肪酸一級アミドがシス−９，10−オクタデセノアミドである請求の範 囲第15項に記載の方法。 18．FAAHの前記インヒビターがフェニルメチルスルホニルフルオリド、HgCl₂、 及び下記の構造： を有するトリフルオロケトンからなる群から選ばれる請求の範囲第15項に記載 の方法。 19．脂肪酸アミドヒドロラーゼ(FAAH)の候補インヒビターの抑制活性の確認方法 であって、その方法が下記の工程： 工程Ａ：請求の範囲第１項に記載のFAAH及び脂肪酸一級アミド基質を反応条件 下で合わせることにより混合物“Ａ”を生成し、 工程Ｂ：前記工程Ａの混合物“Ａ”を候補インヒビターと合わせることにより 混合物“Ｂ”を生成し、次いで 工程Ｃ：混合物“Ａ”中の前記脂肪酸一級アミド基質から加水分解生成物への 変換を定量し、 工程Ｄ：混合物“Ｂ”中の前記脂肪酸一級アミド基質から加水分解生成物への 変換を定量し、次いで 工程Ｅ：前記工程Ｃ及びＤの定量化を比較することにより候補インヒビターの 抑制活性を確認することを含むことを特徴とするFAAHの候補インヒビターの抑制 活性の確認方法。 20．前記脂肪酸一級アミド基質がシス−９，10−オクタデセノアミド、アナンド アミド、ミリスチン酸アミド、パルミチン酸アミド及びステアリン酸アミドから なる群から選ばれる請求の範囲第19項に記載の方法。 21．下記の構造： により表される脂肪酸アミドヒドロラーゼのトリフルオロケトンインヒビター。 22．脂肪酸アミドヒドロラーゼタンパク質をコードする核酸分子であって、前記 核酸分子が配列番号35、配列番号39及び配列番号42からなる群から選ばれたヌク レオチド配列を有する核酸分子。 23．脂肪酸アミドヒドロラーゼタンパク質の一部をコードする核酸分子であって 、前記核酸分子が配列番号１：1-783に示されたヌクレオチド配列を有する核酸 分子。