JP2006516095A - 脂肪酸アミドヒドロラーゼ(faah)の結晶形 - Google Patents
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Abstract
Description
政府の支援
本出願は部分的に国立予防衛生研究所研究助成金DA13173及びF32 MH12414-03によって補助された。合衆国政府はしたがって本出願に権利を有するであろう。
ASファミリーのメンバー、FAAHは、下等な相同体と前記を区別する固有の特徴を有する。FAAHは、天然の供給源から単離されたとき、又は組換えによって発現されたとき不可欠の膜タンパク質としての態様を示す。前記酵素は、高塩濃度又はアルカリ性炭酸ナトリウムを使用して膜分画から分離することができない。前記は、洗剤の使用によってのみ膜から分離することができる。非変性洗剤を使用して抽出されたFAAHタンパク質は、触媒活性を保持し、したがっておそらくその本来の構造を保持している。
FAAHは、脳、肝、十二指腸、腎及び精巣を含む、哺乳動物の全身の組織に存在する。前記酵素は心臓には明瞭には存在しない。前記組織では、FAAHは広範囲の細胞内膜系、おそらく滑面小胞体(SER)に存在するようである。前記結論は、ラット肝の金免疫電子顕微鏡法とともに、心臓組織の各々から得られた共焦点免疫蛍光データによって支持されている。FAAHがこれら膜に挿入されるメカニズム及び前記がどのようにして固着されるかは、現在のところ活発な研究対象である。
FAAHが哺乳動物で果たす重要な役割のin vivoでの提示が、最近になって機能的FAAH遺伝子を欠く遺伝子操作マウスモデルを用いて綿密に報告された。これらのマウスは、腹腔内投与されたとき脂肪酸アミドの神経学的作用に対して極めて強い感受性を示す。更にまた、これらのマウスは、ナイーヴ状態でさえも痛みに対する耐性の強化を示す。同時に、これらのマウス脳では脂肪酸アミドレベルが非常に上昇し、FAAHが存在しないことによって内因性脂肪酸アミド機能が混乱し、基礎生理に変化が生じることが示唆された。これらの観察は、FAAHの触媒活性の薬理学的干渉は前記遺伝子の欠損と類似の作用をもたらす可能性があることを示唆している。
FAAHがその基質を加水分解する触媒メカニズムが研究され、いくつかの重要な発見が得られた。活性部位の化学作用に必要なアミノ酸残基が特定され、その少なくとも1つは基質結合ポケットに存在する。特に重要な発見は、FAAHは、等量の類似エステルの存在下でアミドの加水分解を触媒することができるということである。この特徴は、溶液化学及び触媒トリオファミリーの中の関連のないセリンヒドロラーゼ作用とは正反対である。どのようにしてFAAHがこの嗜好を維持しているのかはこれまでのところ不明であるが、この作用に寄与している少なくとも1つのアミノ酸残基、リジン142が特定された。
本発明は、結晶化された哺乳動物の脂肪酸アミドヒドロラーゼ(FAAH)を活性部位特異的阻害剤メトキシアラキドニルフルオロホスホネート(MAFP)との複合体として提供する。本発明は更に多様な重金属を含む本発明のFAAH結晶の誘導体、並びに天然の結晶及び誘導体結晶のX線回折パターンの収集方法を提供する。本発明はまた、天然の結晶及び誘導体結晶の多重同形置換(multiple isomorphous replacement)(MIR)並びに単一波長及び多重波長の異常回折(SAD/MAD)によって得られた回折パターンを解析する方法を提供する。
ある実施態様では、二級、三級及び四級レベルのFAAHのタンパク質構造の三次元モデルが提供される。この構造モデルの特定によって、FAAHの物理化学的特性の解析が可能になり、更に酵素の機能及びin vivoのメカニズムの理解のために前記を利用することが可能になった。
別の実施態様では、FAAHの基質結合残基と同様にその活性部位を特定する方法が提供される。本発明は、FAAHタンパク質構造内のMAFP分子の明白な位置の決定を提供し、したがって、前記阻害剤のアラキドニル鎖と類似する、前記酵素の天然の基質と相互作用するアミノ酸残基を割当てることが可能になる。
更に別の実施態様では、酵素の天然の構造に進入し、これと相互作用するか、さもなければ前記を混乱させる酵素の物理的特徴を明らかにする方法を提供する。本発明は、予想されなかった、細胞膜とは別個の活性部位への第二のまた別の進入経路の存在について述べる。更にまた、本発明は、四次界面における酵素の水性表面のsrc相同性(SH3)結合ドメインの特定を提供する。
更に別の実施態様では、FAAHと構造的に関連するタンパク質又はタンパク質複合体の三次元構造を解明する方法が提供される。この実施態様では、分子又は分子複合体を結晶化し、前記結晶からX線回折データを入手する方法が提供される。続いて、得られた回折データを本発明で判明したFAAHの三次元構造と比較することができる。更に前記分子の構造は分子置換の方法によって決定することができる。
更に別の実施態様では、酵素と膜の結合に必要なFAAHのドメイン(膜結合ドメイン、MBD)を特定する方法が提供される。この実施態様では、MBDを他の分子又は分子複合体と一緒にし、前記アッセンブリーで新規な膜結合を惹起させることができる方法が提供される。更にまた、この方法はMBDを除去又は変異させて、膜結合特性が変化した変種又は膜結合特性が失われた変種を生成する手段を提供する。
更に別の実施態様では、FAAHの活性部位及びその基質認識メカニズムを変化させて、酵素の基質選択性における変化に影響を与える方法が提供される。前記方法は、異種化合物を分解するFAAHの変種の開発を提供する。そのようなFAAH変種は、鏡像選択的アミド加水分解のための新規な化学触媒として有用であることを証明することができる。
別の実施態様では、FAAHの活性を調節する能力について作用物質をスクリーニングする方法が提供される。前記方法は、FAAHを前記作用物質と接触させてFAAH-作用物質複合体を形成させ、更に複合体未形成FAAHに対するFAAH-作用物質複合体の活性レベルを測定し、それによってFAAHの活性を調節する能力について作用物質をスクリーニングすることを含む。
本発明は、解釈可能なX線回折データを作成するために十分な量の哺乳動物脂肪酸アミドヒドロラーゼ(FAAH)結晶を提供する。本明細書で用いられる、“脂肪酸アミドヒドロラーゼ(FAAH)”という語句は、脂肪酸アミドのアミド結合を加水分解する触媒活性を示し、更にアミダーゼシグナチャー(AS)配列を含む任意の哺乳動物供給源に由来する任意のタンパク質を含む。そのようなタンパク質は、一次供給源、リコンビナント及び合成物から誘導することができる。本明細書で用いられる、“タンパク質”という用語はタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを指す。
FAAHは、配列番号:1に示されるアミノ酸配列(その保存的変型を含む)を有する。本明細書で用いられる、“保存的変型”という語句は、あるアミノ酸残基によるまた別の生物学的に類似するアミノ酸残基の置換を指す。保存的置換の例には以下が含まれる:疎水性残基(例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン)によるまた別の残基の置換、又は極性残基によるまた別の残基の置換、例えばアルギニンによるリジンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換又はグルタミンによるアスパラギンの置換など。
結晶FAAHは、FAAHタンパク質を母液(例えば100mMのクエン酸ナトリウム(pH5.0)、100mMの硫酸リチウム、8%のポリエチレングルコール(平均分子量6000))と一緒にし、更に、母液槽を用いて前記混合物を十分な時間蒸気平衡させてFAAHの結晶を得ることによって生成することができる。結晶が回転し、完全な回折パターンを記録することができるように適切な結晶を視準X線源に導入する。そのような回折パターンを解析し、続いて重金属を用いて誘導した同系結晶から作製された別個に得られたパターンを比較することができる。本発明の実施に使用される重金属には、オスミウム、白金などが含まれる。
FAAH結晶は多様な形態をとることが予想され、その全てが本発明に包含される。FAAH結晶のある実施態様では、結晶は単純単斜晶系対称P21を示し、不整単位当たり16のFAAH分子を含む。前記単斜晶系態様は、結晶学的単位格子軸a及びcを相互に入れ替えることができるので更に仮性欠面双晶形成を示す。また別の態様では、前記結晶は、C中心垂直斜方晶系対称C2221を示し、不整単位当たり8個の分子を含む。第三の態様では、前記結晶は、単純六方晶系対称P6322を示し、不整単位当たり2個の分子を含む。
更に前記構造によって、FAAHタンパク質は別々の単体として存在せず、その代わりにFAAHタンパク質は、単体の長軸に平行な軸の周りに単純な2回対称をもつ二量体を形成することが明らかになった。この編成は、集合した二量体の同一面上で各単体に由来する15から19のヘリックスの協調的提示を生じる。更にまた、これらのヘリックスは、二量体のこの面上に突出した高度に疎水性の平面を形成する。したがって、この構造モチーフは、特異的で安定した態様で細胞膜と相互作用する手段を提供する。前記酵素のこの面はまた、基質又は他の作用物質が膜から受け渡される可能性がある前記酵素の活性部位への進入経路を提示する。本明細書で用いられる“活性部位”は、その形状及び荷電電位の結果として作用物質(タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸(DNA及びRNAを含む)分子、化合物、抗生物質などを含むが、ただしこれらに限定されない)と相互作用するFAAHの領域を指す。
そのような作用物質は、FAAH分子と作用物質との間の可能な相互作用の解明を基にして特定、開発及び性状決定することができる。このプロセスは、FAAH構造の目視精査によって、又はより定量的にはそのような目的のために考案された種々のコンピュータアルゴリズム(例えばAUTODOCK、インサイトII及びQUANTA)を用いて実施することができる。本発明は、候補作用物質のin silicoでのバーチャル結合を可能にし、それによって可能な指標としてそれら作用物質の性状を更なる研究のために決定することができる。続いて前記物質をFAAHと接触させ、酵素の正常な機能に対する任意の作用を決定することによって、前記作用物質の作用をFAAHに対する活性についてテストすることができる。本発明の方法によって候補物質として特定されたそのような作用物質は、更なる化学的最適化及び/又は潜在的治療薬としてのin vivoにおける評価のための指標化合物の特定で有用であろう。本発明は、そのような最適化された作用物質は、生きている生物に投与されたとき生理学的作用を示すようにデザインされた薬理学的調製物として用いることができることを示す。本発明を用いて特定又は最適化された作用物質の前記のような医学的に関連する使用には、例えば痛み、睡眠、薬物中毒、不妊、不安、食欲減退、発熱、認知プロセスなどの治療が含まれる。
また別の実施態様では、本発明の方法によって特定された作用物質を含む医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は、以下を含む多様な方法で投与できる:例えば経口的又は非経口的、例えば静脈内、筋肉内、皮下、眼窩内、関節包内、腹腔内、直腸内、又は皮膚からの受動的もしくは促進吸収(例えばそれぞれ皮膚膏薬、又は経皮イオン浸透療法を用いる)投与。更にまた、本発明の医薬組成物は、注射、インキュベーション(経口的インキュベーション又は局所的インキュベーション)によって投与することができる。局所的インキュベーションは、受動的でも(例えば軟膏の直接塗布による)又は能動的(例えば鼻腔スプレー又は吸入剤を用いる)でもよいが、いずれの場合にも組成物の一成分は適切な発射薬である。
別の実施態様では、その必要がある対象者に本発明の医薬組成物を投与することを含む、病的状態の治療方法が提供される。ある実施態様では、前記対象者は哺乳動物である。別の実施態様では、前記対象者はヒトである。本発明の方法によって有効に治療できる病的状態には、例えば不安、空腹、睡眠、受胎能、認知、免疫学的疾患、発熱、振せん、緑内障、腸疾患などが含まれる。
(a)その構造が未知の分子又は分子複合体の結晶を入手し;
(b)前記結晶化された分子又は分子複合体からX線回折データを作成し;
(c)前記分子又は分子複合体のX線回折データをFAAHの結晶形から決定した三次元構造と比較し;更に
(d)分子置換解析を用いて、FAAHの結晶形から決定した三次元構造を結晶化された分子又は分子複合体から得たX線回折データに一致させる。前記方法は例えば、FAAHと構造的に関連を有するタンパク質の決定を可能にする。本明細書で用いられる、“構造的に関連を有する”とは、そのX線回折データをFAAHのX線回折データと比較することによってその構造を決定することができるタンパク質を指す。本発明の前記のような使用は、標的タンパク質又はタンパク質複合体の結晶化及びそのX線回折データの収集を含むであろう。続いて前記標的のデータを、型板としてFAAHの構造を用いて分子置換の手段により解釈することができる。前記の方法では誘導結晶からデータを収集する必要がなく、標的タンパク質の構造の解明プロセスが極めて単純化される。
更に別の実施態様では、FAAH結晶から得られた構造情報を用いて、改変された物理化学的特性を有するタンパク質を設計(engineering)する方法が提供される。したがって、このドメインを全体的又は部分的に変異又は欠失させて、膜トロピズムが改変された又は膜トロピズムをもたないタンパク質を得ることができる。更にまた、特定した膜結合ドメインを完全に又は部分的に異種タンパク質に移植してその膜トロピズムに影響を及ぼすことができる。更にまた、FAAHの活性部位及び基質結合ポケットの特定によって、基質特異性及び/又は酵素特性が改変された変種の標的設定作製が可能になる。そのような変種は、脂肪酸アミドと無関係のアミド加水分解の触媒として有用であることを証明することができる。
本発明はこれから以下の非限定的実施例を参考にしながら極めて詳細に記載する。
タンパク質の結晶は、アミノ末端の29アミノ酸が欠失したラットFAAHを組換えによって発現させて入手した。前記欠失領域は膜結合に参画することが予想されるが(8)、前記切端FAAH変種(残基30−579)は、野生型タンパク質の膜結合、可溶化のための洗剤要求及び哺乳類細胞における脂肪酸アミド分解能を保持する(15)。メトキシアラキドニルフルオロホスホネート、活性部位特異的不可逆性阻害剤と複合体を形成したFAAHの結晶は以下の3つの空間群で得られた:不整単位に16の分子を有するP21、不整単位に8つの分子を有するC2221、及び不整単位に2つの分子を有するP6322(材料と方法(16))。FAAH-阻害剤複合体の構造は、先ず初めに、組合せMIRAS/MADフェージング法及びそれに続く、多数の結晶及びNCS平均化による位相伸長を用いて3.3Åと決定された(表1)。得られた電子密度マップは、90%を超える側鎖について主要な鎖の断裂のない密度を表示し、双晶形成単斜結晶データの分子置換フェージングのための非常に優れた検索モデルが得られた。2.8Åの解像度でP21として構築された最終的モデルは優れた品質を示した。
表1は、データ収集及び洗練統計の要約を含む。初期相は、全てのMAD及びMIRAS寄与分を取り込みDmMulti(24)を用いて計算した。最終モデルにおけるアミノ酸のラマカンドラン分布は、密なNCS拘束下での位相の洗練後にただ1つのタンパク質の鎖からPROCHECK(24)を用いて計算した。密度が観察されなかった側鎖は、洗練中はゼロ占有に設定し、反射のシグマ依存拒否は用いなかった。カッコ内の数字は最高の解像殻内のデータを指す。2つの残基が拒否領域に存在した。すなわち、グルタミン酸122(前記はガンマターンのi+1位に存在する)及びグルタミン189(前記もまた密なターン内にありその直後に第二のターンが続く)である。表2は完全なデータ収集及び洗練統計を含む。
しかしながら、重要な構造的特徴がFAAHを固有のものとし、これら特徴については以下で考察する。更にこれらの変動は、FAAHとその細菌性同族体間の根平均二乗偏差(rmsd)(表3及び4)を測定することによって定量することができる。アミノ酸配列アラインメントにしたがう比較が前記タンパク質ドメイン間で得られるならば、より多くの原子が計算に含まれるのでrmsd差は増加する。このことは、活性部位に中心が来る拡張球体に計算を限定する場合及びCαsから全ての原子に計算を拡張した場合の両方に当てはまる。いずれの場合でも、配列を考慮するためにFAAHの一部分のみしか計算に含むことができないということは重要である(PAMの場合は42%、MAE2の場合は36%(表3))。更にまた、タンパク質が折り畳まれる場合、局所構造が考慮され、包含することができるFAAHの比較可能な部分は、PAMについては22%に、MAE2については34%に更に減少する(表4)。
表4:局所構造準拠同等残基範囲の平均rmsdxyz(計算に含まれるアミノ酸残基数が表示される)
*挿入/欠失及び非同一アミノ酸側鎖は計算には含まれていない。PAM-CHYはペプチドアミダーゼと阻害剤キモスタチンの複合体である。
アミノ酸410−438(MAE2に対するFAAHの別の配列挿入)は、ASの折り畳みを妨げるヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフを形成する。2つのヘリックス、α18及びα19は活性部位に覆いをかぶせ、おそらくFAAHの膜結合面を構成するいくつかの疎水性残基を提示する(図1、3A)。完全な酵素のN-末端(更に別の膜結合ヘリックスを(アミノ酸残基7−29)形成すると配列分析から予測される)は、適切に配置され、α18とα19膜キャップの膜との相互作用を強制するであろう。
第二の主要なトンネルは、アラキドニル充填孔から約80度の角度で活性部位から出現する。このトンネルは二股に分かれて溶媒暴露細胞質ゾルポート及びトリプトファン445封鎖経路の両方を作り上げる(前記トリプトファンは鍵と錠前のサブユニット間接触を形成する)。したがって、FAAH活性部位は、細胞質の水性環境及び二重層の脂質環境の両方に同時に接近するようである。この構造は、脂肪酸アミド基質から自由になった極性アミン置換基にとって細胞質ゾルへの出口経路を提供することができ、更にまたFAAH-脂肪アシル中間体の脱アシル化に必要な水分子のために入口を提供できるかもしれない。
酵素の構造によって明らかになったFAAHの活性部位と細胞膜との親密な関係は、脂肪酸アミドを反応の進行のために細胞の水性区画を通って作用部位から分解部位へ輸送する必要がないかもしれないという可能性をもたらした。結果として、適切なエンドカナビオノイドのトーンは、in vivoでのFAAHの発現レベル及びCB受容体系に対するその存在場所の両方に依存する可能性がある(21)。最後に、FAAHの構造は、種々の神経系疾患に対して治療的利点を有する阻害剤(酵素のアシル鎖ポケットに結合する作用物質だけでなく、細胞質チャネルを介する活性部位を標的にする化合物を含む)のデザインを容易にするであろう(22)。この後者のクラスの阻害剤は、ヒトのプロテオームに存在する百を超える脂質加水分解酵素と比較してFAAHに格別の選択性を示すかもしれない。
ATOM 0 CA LYS A 142 12.558 -31.943 29.679 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA SER A 190 17.871 -20.245 32.364 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA MET A 191 17.760 -22.751 29.499 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LEU A 192 19.766 -20.186 27.640 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA SER A 193 22.793 -22.387 27.483 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA PHE A 194 24.110 -25.405 25.603 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA SER A 217 19.643 -27.223 27.046 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA THR A 236 12.999 -27.716 22.998 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA ILE A 238 15.579 -22.197 19.986 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLY A 239 19.319 -22.114 19.282 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLY A 240 20.185 -25.826 19.177 0.00 0.00
A C
A C
ATOM 0 CA PHE A 244 23.393 -30.169 20.863 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA THR A 257 9.128 -26.186 12.131 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA ASN A 259 4.442 -24.354 14.717 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LEU A 261 3.547 -28.979 17.435 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA SER A 262 1.827 -27.120 20.226 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LYS A 263 3.541 -25.099 22.924 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA SER A 264 0.514 -24.586 24.939 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LEU A 266 5.685 -24.877 27.877 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLY A 268 9.936 -20.496 29.403 0.00 0.00
A C
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A C
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A C
A C
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A C
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A C
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A C
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A C
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A C
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Claims (39)
- 結晶化された哺乳動物の脂肪酸アミドヒドロラーゼ(FAAH)。
- 前記酵素が、配列番号:1のアミノ酸配列又はその保存的置換のアミノ酸配列を有する、請求項1の結晶化FAAH。
- 二級、三級及び四級レベルのFAAHの構造の三次元モデル。
- 請求項1に記載の結晶からFAAHの三次元構造を決定する方法であって、前記結晶からX線回折データを収集し、前記データを多重同形置換(MIR)並びに単一波長及び多重波長の異常回折(SAD/MAD)によって前記データを解析し、それによってFAAHの三次元構造決定することを特徴とする方法。
- 構造が未知である分子又は分子複合体の分子構造を決定する方法であって、以下の工程、
(a)構造が未知である分子又は分子複合体の結晶を入手する工程、
(b)前記結晶化分子又は分子複合体からX線回折データを作製する工程、
(c)前記分子又は分子複合体のX線回折データを請求項1の結晶から決定した三次元構造と比較する工程、及び
(d)分子置換解析を用いて、請求項1の結晶から決定した三次元構造を前記結晶化分子又は分子複合体のX線回折データに一致させる工程、
を含むことを特徴とする、方法。 - 請求項3の三次元モデルを用いて作用物質の手動又はコンピュータ支援適合解析を実施し、それによってFAAHの内部チャネルと相互作用する作用物質を特定することを含む、FAAHの内部チャネルと相互作用する作用物質を特定する方法。
- 前記内部チャネルが、活性部位である、請求項6の方法。
- 前記活性部位が、アミノ酸残基142、217、218、236、238、239、240及び241を含む、請求項7の方法。
- 前記内部チャネルが、基質結合ポケットである請求項6の方法。
- 前記基質結合ポケットが、アミノ酸残基491、495、335、372、377、194及び244を含む、請求項9の方法。
- 前記作用物質と前記基質結合ポケットとの相互作用を特定し、最適化し、又はアラキドニル阻害剤MAFPの位置と比較する、請求項9の方法。
- 前記内部チャネルが、FAAHの膜ポートである請求項6の方法。
- 前記膜ポートが、アミノ酸残基403、407、428、429、486、530及び534を含む、請求項12の方法。
- 前記内部チャネルが、FAAHの細胞質ゾルポートである請求項6の方法。
- 前記細胞質ゾルポートが、アミノ酸残基266、271、272、445、449及び453を含む、請求項14の方法。
- 前記内部チャネルが、FAAHの二量体化トンネルである、請求項6の方法。
- 前記二量体化トンネルが、アミノ酸残基257、259、261、262、263、264、306、308、309、448、451、452、455、456、499、500、501及び556を含む、請求項16の方法。
- 前記内部チャネルが、FAAHの膜結合ドメインである、請求項6の方法。
- 前記膜結合ドメインが、アミノ酸残基383−440を含む、請求項18の方法。
- 前記内部チャネルが、FAAHのヘッド基トンネルである、請求項6の方法。
- 前記ヘッド基トンネルが、アミノ酸残基268、269、270、273、274、275、276、277及び278を含む、請求項20の方法。
- 前記内部チャネルが、FAAHのアルキルトンネルである、請求項6の方法。
- 前記アルキルトンネルが、アミノ酸残基190−194、244、335、372、373、376、377、380、381、388、401、402、404、432、484、485、488、489、491、492、495及び531を含む、請求項22の方法。
- 請求項3の三次元モデルを用いて作用物質の手動又はコンピュータ支援適合解析を実施し、それによってFAAHのSH3結合ドメインと相互作用する作用物質を特定することを含む、FAAHのSH3結合ドメインと相互作用する作用物質の特定方法。
- 前記SH3結合ドメインが、アミノ酸残基297−315を含む、請求項24の方法。
- 請求項3の三次元モデルを用いて作用物質の手動又はコンピュータ支援適合解析を実施し、それによってFAAHの表面ヘリックス-ループ-ヘリックスと相互作用する作用物質を特定することを含む、FAAHの表面ヘリックス-ループ-ヘリックスと相互作用する作用物質の特定方法。
- 前記表面ヘリックス-ループ-ヘリックスが、アミノ酸残基511−546を含む、請求項26の方法。
- 請求項6から27のいずれかに記載の方法によって特定される作用物質。
- 請求項28の作用物質及び医薬的に許容できる前記作用物質のための担体を含む医薬組成物。
- 請求項29の医薬組成物をその必要がある対象者に投与し、それによって病的状態を治療することを含む、病的状態の治療方法。
- 前記対象者が、哺乳動物である、請求項30の方法。
- 前記哺乳動物が、ヒトである、請求項31の方法。
- 前記病的状態が、不安、痛み、空腹、睡眠、受胎能、認知、免疫学的疾患、発熱、振せん、緑内障、腸疾患である、請求項30の方法。
- FAAHの活性を調節する能力について作用物質をスクリーニングする方法であって、FAAHを前記作用物質と接触させてFAAH-作用物質複合体を形成し、更に複合体非形成FAAHに対して前記FAAH-作用物質複合体の活性レベルを測定し、それによってFAAHの活性を調節する能力について前記作用物質をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニングする方法。
- 前記作用物質を生細胞又は生きている生物に投与することを含む、請求項34に記載の作用物質の作用を評価する方法。
- FAAHの基質結合部位を特定し、更に前記基質結合部位を改変し、それによって改変された基質特異性又はカイネティクスを有するFAAH変種を設計することを含む、改変基質特異性又はカイネティクスを有するFAAH変種を設計する方法。
- FAAHの完全な膜結合ドメインを異種タンパク質に移植し、それによって異種タンパク質の膜トロピズムを改変することを含む、異種タンパク質の膜トロピズム改変方法。
- FAAHの膜結合ドメインの部分を異種タンパク質に移植し、それによって異種タンパク質の膜トロピズムを改変することを含む、異種タンパク質の膜トロピズム改変方法。
- FAAHの膜結合ドメインを特定し、前記膜結合ドメインを改変し、それによって改変された膜結合特性を有するFAAH変種を設計することを含む、改変膜結合特性を有するFAAH変種を設計する方法。
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