JP2006516095A - 脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ｆａａｈ）の結晶形 - Google Patents
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Abstract
本発明は、阻害剤メトキシアラキドニルフルオロホスホネート（MAFP）と複合体を形成したFAAH結晶、及びこれら結晶を使用してFAAHの三次元構造を決定することを目的とする。本発明は更に、関連タンパク質の構造のモデリング又は決定のために前記構造を使用することを目的とする。本発明は更に、ドラッグデザインの研究において前記構造を使用してFAAHの活性部位、基質チャネル、生成物チャネル又は調節部位と結合する作用物質を特定、性状決定又は最適化することを目的とし、更に、これら作用物質を評価して、FAAH及び／又はその活性を刺激、阻害、再配置、安定化又は脱安定化することができる作用物質を特定することを目的とする。本発明は更に、設計操作によって改変された可溶性、触媒プロフィール又は基質特異性を示すFAAH変種を開発する工程で前記構造を使用することを目的とする。本発明は更に、設計操作により改変された膜トロピズムを有する異種タンパク質を開発する工程で前記構造を使用することを目的とする。
Description
本発明は、一般的に、構造生物学及び医薬、特にエンドカンナビノイドの影響及び同系の生理学的プロセスを遮断する医薬に関する。具体的には、本発明は、脂肪酸アミドヒドロラーゼ（FAAH）の結晶形及び前記タンパク質の三次元構造決定において前記結晶を使用することに関する。
政府の支援
本出願は部分的に国立予防衛生研究所研究助成金DA13173及びF32 MH12414-03によって補助された。合衆国政府はしたがって本出願に権利を有するであろう。
政府の支援
本出願は部分的に国立予防衛生研究所研究助成金DA13173及びF32 MH12414-03によって補助された。合衆国政府はしたがって本出願に権利を有するであろう。
脂肪酸アミドヒドロラーゼ（FAAH）は、セリンヒドロラーゼのアミダーゼシグナチャー（AS）ファミリーの中で性状が決定された唯一の哺乳動物メンバーである。このファミリーは、太古から普遍的に存在する酵素群であり、アミダーゼシグナチャーとして知られているアミノ酸モチーフを共有する。これまで報告されたほとんどのAS酵素は、小さな代謝中間体（例えばアセトアミド、オピン、プロピオンアミド及びマロンアミド）のアミドを加水分解する。これまで報告されたこれらAS酵素はまた例外なく可溶性タンパク質のみのようである。
ASファミリーのメンバー、FAAHは、下等な相同体と前記を区別する固有の特徴を有する。FAAHは、天然の供給源から単離されたとき、又は組換えによって発現されたとき不可欠の膜タンパク質としての態様を示す。前記酵素は、高塩濃度又はアルカリ性炭酸ナトリウムを使用して膜分画から分離することができない。前記は、洗剤の使用によってのみ膜から分離することができる。非変性洗剤を使用して抽出されたFAAHタンパク質は、触媒活性を保持し、したがっておそらくその本来の構造を保持している。
FAAHは、脳、肝、十二指腸、腎及び精巣を含む、哺乳動物の全身の組織に存在する。前記酵素は心臓には明瞭には存在しない。前記組織では、FAAHは広範囲の細胞内膜系、おそらく滑面小胞体（SER）に存在するようである。前記結論は、ラット肝の金免疫電子顕微鏡法とともに、心臓組織の各々から得られた共焦点免疫蛍光データによって支持されている。FAAHがこれら膜に挿入されるメカニズム及び前記がどのようにして固着されるかは、現在のところ活発な研究対象である。
ASファミリーのメンバー、FAAHは、下等な相同体と前記を区別する固有の特徴を有する。FAAHは、天然の供給源から単離されたとき、又は組換えによって発現されたとき不可欠の膜タンパク質としての態様を示す。前記酵素は、高塩濃度又はアルカリ性炭酸ナトリウムを使用して膜分画から分離することができない。前記は、洗剤の使用によってのみ膜から分離することができる。非変性洗剤を使用して抽出されたFAAHタンパク質は、触媒活性を保持し、したがっておそらくその本来の構造を保持している。
FAAHは、脳、肝、十二指腸、腎及び精巣を含む、哺乳動物の全身の組織に存在する。前記酵素は心臓には明瞭には存在しない。前記組織では、FAAHは広範囲の細胞内膜系、おそらく滑面小胞体（SER）に存在するようである。前記結論は、ラット肝の金免疫電子顕微鏡法とともに、心臓組織の各々から得られた共焦点免疫蛍光データによって支持されている。FAAHがこれら膜に挿入されるメカニズム及び前記がどのようにして固着されるかは、現在のところ活発な研究対象である。
下等生物における前記の代謝相補物とは異なり、FAAHは神経系の機能において重要な役割を保有する。FAAHの基質である脂肪酸アミドは、痛み、歩行、記憶、認知、パイレーシス及び睡眠の生理学に関連するテスト動物で強力な神経調節作用を有することが示された。前記の化合物がそれらの影響を表すメカニズムはまだ十分には明らかにされていないが、これらの作用の一部分は、G-タンパク質トリマーが結合した受容体CB1の拮抗物質によってin vivoで停止させることができる。脂肪酸アミドは、FAAHによって薬理学的に不活性なそれらの酸に迅速に加水分解される。したがって、FAAHは、これらの分子のシグナリングを終了させ、前記分子の基準レベルを樹立するように作用する。結果として、FAAHはその基質に付随する生理学に深く関与する。
FAAHが哺乳動物で果たす重要な役割のin vivoでの提示が、最近になって機能的FAAH遺伝子を欠く遺伝子操作マウスモデルを用いて綿密に報告された。これらのマウスは、腹腔内投与されたとき脂肪酸アミドの神経学的作用に対して極めて強い感受性を示す。更にまた、これらのマウスは、ナイーヴ状態でさえも痛みに対する耐性の強化を示す。同時に、これらのマウス脳では脂肪酸アミドレベルが非常に上昇し、FAAHが存在しないことによって内因性脂肪酸アミド機能が混乱し、基礎生理に変化が生じることが示唆された。これらの観察は、FAAHの触媒活性の薬理学的干渉は前記遺伝子の欠損と類似の作用をもたらす可能性があることを示唆している。
FAAHがその基質を加水分解する触媒メカニズムが研究され、いくつかの重要な発見が得られた。活性部位の化学作用に必要なアミノ酸残基が特定され、その少なくとも1つは基質結合ポケットに存在する。特に重要な発見は、FAAHは、等量の類似エステルの存在下でアミドの加水分解を触媒することができるということである。この特徴は、溶液化学及び触媒トリオファミリーの中の関連のないセリンヒドロラーゼ作用とは正反対である。どのようにしてFAAHがこの嗜好を維持しているのかはこれまでのところ不明であるが、この作用に寄与している少なくとも1つのアミノ酸残基、リジン142が特定された。
FAAHが哺乳動物で果たす重要な役割のin vivoでの提示が、最近になって機能的FAAH遺伝子を欠く遺伝子操作マウスモデルを用いて綿密に報告された。これらのマウスは、腹腔内投与されたとき脂肪酸アミドの神経学的作用に対して極めて強い感受性を示す。更にまた、これらのマウスは、ナイーヴ状態でさえも痛みに対する耐性の強化を示す。同時に、これらのマウス脳では脂肪酸アミドレベルが非常に上昇し、FAAHが存在しないことによって内因性脂肪酸アミド機能が混乱し、基礎生理に変化が生じることが示唆された。これらの観察は、FAAHの触媒活性の薬理学的干渉は前記遺伝子の欠損と類似の作用をもたらす可能性があることを示唆している。
FAAHがその基質を加水分解する触媒メカニズムが研究され、いくつかの重要な発見が得られた。活性部位の化学作用に必要なアミノ酸残基が特定され、その少なくとも1つは基質結合ポケットに存在する。特に重要な発見は、FAAHは、等量の類似エステルの存在下でアミドの加水分解を触媒することができるということである。この特徴は、溶液化学及び触媒トリオファミリーの中の関連のないセリンヒドロラーゼ作用とは正反対である。どのようにしてFAAHがこの嗜好を維持しているのかはこれまでのところ不明であるが、この作用に寄与している少なくとも1つのアミノ酸残基、リジン142が特定された。
発明の要旨
本発明は、結晶化された哺乳動物の脂肪酸アミドヒドロラーゼ（FAAH）を活性部位特異的阻害剤メトキシアラキドニルフルオロホスホネート（MAFP）との複合体として提供する。本発明は更に多様な重金属を含む本発明のFAAH結晶の誘導体、並びに天然の結晶及び誘導体結晶のＸ線回折パターンの収集方法を提供する。本発明はまた、天然の結晶及び誘導体結晶の多重同形置換（multiple isomorphous replacement）（MIR）並びに単一波長及び多重波長の異常回折（SAD／MAD）によって得られた回折パターンを解析する方法を提供する。
ある実施態様では、二級、三級及び四級レベルのFAAHのタンパク質構造の三次元モデルが提供される。この構造モデルの特定によって、FAAHの物理化学的特性の解析が可能になり、更に酵素の機能及びin vivoのメカニズムの理解のために前記を利用することが可能になった。
別の実施態様では、FAAHの基質結合残基と同様にその活性部位を特定する方法が提供される。本発明は、FAAHタンパク質構造内のMAFP分子の明白な位置の決定を提供し、したがって、前記阻害剤のアラキドニル鎖と類似する、前記酵素の天然の基質と相互作用するアミノ酸残基を割当てることが可能になる。
更に別の実施態様では、酵素の天然の構造に進入し、これと相互作用するか、さもなければ前記を混乱させる酵素の物理的特徴を明らかにする方法を提供する。本発明は、予想されなかった、細胞膜とは別個の活性部位への第二のまた別の進入経路の存在について述べる。更にまた、本発明は、四次界面における酵素の水性表面のsrc相同性（SH3）結合ドメインの特定を提供する。
本発明は、結晶化された哺乳動物の脂肪酸アミドヒドロラーゼ（FAAH）を活性部位特異的阻害剤メトキシアラキドニルフルオロホスホネート（MAFP）との複合体として提供する。本発明は更に多様な重金属を含む本発明のFAAH結晶の誘導体、並びに天然の結晶及び誘導体結晶のＸ線回折パターンの収集方法を提供する。本発明はまた、天然の結晶及び誘導体結晶の多重同形置換（multiple isomorphous replacement）（MIR）並びに単一波長及び多重波長の異常回折（SAD／MAD）によって得られた回折パターンを解析する方法を提供する。
ある実施態様では、二級、三級及び四級レベルのFAAHのタンパク質構造の三次元モデルが提供される。この構造モデルの特定によって、FAAHの物理化学的特性の解析が可能になり、更に酵素の機能及びin vivoのメカニズムの理解のために前記を利用することが可能になった。
別の実施態様では、FAAHの基質結合残基と同様にその活性部位を特定する方法が提供される。本発明は、FAAHタンパク質構造内のMAFP分子の明白な位置の決定を提供し、したがって、前記阻害剤のアラキドニル鎖と類似する、前記酵素の天然の基質と相互作用するアミノ酸残基を割当てることが可能になる。
更に別の実施態様では、酵素の天然の構造に進入し、これと相互作用するか、さもなければ前記を混乱させる酵素の物理的特徴を明らかにする方法を提供する。本発明は、予想されなかった、細胞膜とは別個の活性部位への第二のまた別の進入経路の存在について述べる。更にまた、本発明は、四次界面における酵素の水性表面のsrc相同性（SH3）結合ドメインの特定を提供する。
更に別の実施態様では、FAAHの内部チャネルと相互作用し、したがってFAAH及び／又はその活性を刺激し、阻害し、最分布させ、安定化させ、又は脱安定化させる作用物質を特定し、その性状を決定し、更に最適化する方法が提供される。そのような作用物質はFAAHと、例えば前記活性部位、基質結合ポケット、膜ポート(port)、細胞質ゾルポート、二量体化トンネル、膜結合ドメイン、アルキルトンネル、ヘッド基トンネルなどで相互作用することができるかもしれない。別の実施態様では、SH3結合ドメイン及び表面ヘリックス-ループ-ヘリックスと相互作用する作用物質を特定する方法が提供される。そのような作用物質を更に、MAFP分子との比較によって特定し、性状決定し、又は最適化することができる。FAAHとそのような作用物質との相互作用は、それらの相互作用を手動又はコンピュータシミュレーション支援によって解明することができる。続いてそのようなシミュレーションは、条件下で観察されたFAAHと前記作用物質間の相補性及び不適合性を基にして最適化することができる。続いて、そのような作用物質の影響は、前記作用物質を入手し、FAAHと接触させることによって決定することができる。
更に別の実施態様では、FAAHと構造的に関連するタンパク質又はタンパク質複合体の三次元構造を解明する方法が提供される。この実施態様では、分子又は分子複合体を結晶化し、前記結晶からＸ線回折データを入手する方法が提供される。続いて、得られた回折データを本発明で判明したFAAHの三次元構造と比較することができる。更に前記分子の構造は分子置換の方法によって決定することができる。
更に別の実施態様では、酵素と膜の結合に必要なFAAHのドメイン（膜結合ドメイン、MBD）を特定する方法が提供される。この実施態様では、MBDを他の分子又は分子複合体と一緒にし、前記アッセンブリーで新規な膜結合を惹起させることができる方法が提供される。更にまた、この方法はMBDを除去又は変異させて、膜結合特性が変化した変種又は膜結合特性が失われた変種を生成する手段を提供する。
更に別の実施態様では、FAAHの活性部位及びその基質認識メカニズムを変化させて、酵素の基質選択性における変化に影響を与える方法が提供される。前記方法は、異種化合物を分解するFAAHの変種の開発を提供する。そのようなFAAH変種は、鏡像選択的アミド加水分解のための新規な化学触媒として有用であることを証明することができる。
別の実施態様では、FAAHの活性を調節する能力について作用物質をスクリーニングする方法が提供される。前記方法は、FAAHを前記作用物質と接触させてFAAH-作用物質複合体を形成させ、更に複合体未形成FAAHに対するFAAH-作用物質複合体の活性レベルを測定し、それによってFAAHの活性を調節する能力について作用物質をスクリーニングすることを含む。
更に別の実施態様では、FAAHと構造的に関連するタンパク質又はタンパク質複合体の三次元構造を解明する方法が提供される。この実施態様では、分子又は分子複合体を結晶化し、前記結晶からＸ線回折データを入手する方法が提供される。続いて、得られた回折データを本発明で判明したFAAHの三次元構造と比較することができる。更に前記分子の構造は分子置換の方法によって決定することができる。
更に別の実施態様では、酵素と膜の結合に必要なFAAHのドメイン（膜結合ドメイン、MBD）を特定する方法が提供される。この実施態様では、MBDを他の分子又は分子複合体と一緒にし、前記アッセンブリーで新規な膜結合を惹起させることができる方法が提供される。更にまた、この方法はMBDを除去又は変異させて、膜結合特性が変化した変種又は膜結合特性が失われた変種を生成する手段を提供する。
更に別の実施態様では、FAAHの活性部位及びその基質認識メカニズムを変化させて、酵素の基質選択性における変化に影響を与える方法が提供される。前記方法は、異種化合物を分解するFAAHの変種の開発を提供する。そのようなFAAH変種は、鏡像選択的アミド加水分解のための新規な化学触媒として有用であることを証明することができる。
別の実施態様では、FAAHの活性を調節する能力について作用物質をスクリーニングする方法が提供される。前記方法は、FAAHを前記作用物質と接触させてFAAH-作用物質複合体を形成させ、更に複合体未形成FAAHに対するFAAH-作用物質複合体の活性レベルを測定し、それによってFAAHの活性を調節する能力について作用物質をスクリーニングすることを含む。
発明の詳細な説明
本発明は、解釈可能なＸ線回折データを作成するために十分な量の哺乳動物脂肪酸アミドヒドロラーゼ（FAAH）結晶を提供する。本明細書で用いられる、“脂肪酸アミドヒドロラーゼ（FAAH）”という語句は、脂肪酸アミドのアミド結合を加水分解する触媒活性を示し、更にアミダーゼシグナチャー（AS）配列を含む任意の哺乳動物供給源に由来する任意のタンパク質を含む。そのようなタンパク質は、一次供給源、リコンビナント及び合成物から誘導することができる。本明細書で用いられる、“タンパク質”という用語はタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを指す。
FAAHは、配列番号:1に示されるアミノ酸配列（その保存的変型を含む）を有する。本明細書で用いられる、“保存的変型”という語句は、あるアミノ酸残基によるまた別の生物学的に類似するアミノ酸残基の置換を指す。保存的置換の例には以下が含まれる：疎水性残基（例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン）によるまた別の残基の置換、又は極性残基によるまた別の残基の置換、例えばアルギニンによるリジンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換又はグルタミンによるアスパラギンの置換など。
結晶FAAHは、FAAHタンパク質を母液（例えば100mMのクエン酸ナトリウム（pH5.0）、100mMの硫酸リチウム、8％のポリエチレングルコール（平均分子量6000））と一緒にし、更に、母液槽を用いて前記混合物を十分な時間蒸気平衡させてFAAHの結晶を得ることによって生成することができる。結晶が回転し、完全な回折パターンを記録することができるように適切な結晶を視準Ｘ線源に導入する。そのような回折パターンを解析し、続いて重金属を用いて誘導した同系結晶から作製された別個に得られたパターンを比較することができる。本発明の実施に使用される重金属には、オスミウム、白金などが含まれる。
本発明は、解釈可能なＸ線回折データを作成するために十分な量の哺乳動物脂肪酸アミドヒドロラーゼ（FAAH）結晶を提供する。本明細書で用いられる、“脂肪酸アミドヒドロラーゼ（FAAH）”という語句は、脂肪酸アミドのアミド結合を加水分解する触媒活性を示し、更にアミダーゼシグナチャー（AS）配列を含む任意の哺乳動物供給源に由来する任意のタンパク質を含む。そのようなタンパク質は、一次供給源、リコンビナント及び合成物から誘導することができる。本明細書で用いられる、“タンパク質”という用語はタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを指す。
FAAHは、配列番号:1に示されるアミノ酸配列（その保存的変型を含む）を有する。本明細書で用いられる、“保存的変型”という語句は、あるアミノ酸残基によるまた別の生物学的に類似するアミノ酸残基の置換を指す。保存的置換の例には以下が含まれる：疎水性残基（例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン）によるまた別の残基の置換、又は極性残基によるまた別の残基の置換、例えばアルギニンによるリジンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換又はグルタミンによるアスパラギンの置換など。
結晶FAAHは、FAAHタンパク質を母液（例えば100mMのクエン酸ナトリウム（pH5.0）、100mMの硫酸リチウム、8％のポリエチレングルコール（平均分子量6000））と一緒にし、更に、母液槽を用いて前記混合物を十分な時間蒸気平衡させてFAAHの結晶を得ることによって生成することができる。結晶が回転し、完全な回折パターンを記録することができるように適切な結晶を視準Ｘ線源に導入する。そのような回折パターンを解析し、続いて重金属を用いて誘導した同系結晶から作製された別個に得られたパターンを比較することができる。本発明の実施に使用される重金属には、オスミウム、白金などが含まれる。
また別には、そのような誘導結晶は、比較のために異常シグナルを得ることができるように適切な波長のＸ線に暴露することができる。続いてそのような比較によってFAAHタンパク質の三次元構造の分子モデルを得ることができる。そのようなモデルは、コンピュータ記録（例えばタンパク質データバンク（pdb）ファイル（例えば表II参照））を含むいくつかの手段によって提示されるであろう。ここに記載した発明は任意の表示を含み、前記にはバイナリーデータ、テキストデータ、図式表示、バーチャル表示（各々は物理的表示でも電子的表示でもよい）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。本発明はまた、前記タンパク質に対する阻害性基質類似体を提供し、それによって前記基質と前記タンパく質との相互作用を決定することができる。
FAAH結晶は多様な形態をとることが予想され、その全てが本発明に包含される。FAAH結晶のある実施態様では、結晶は単純単斜晶系対称P21を示し、不整単位当たり16のFAAH分子を含む。前記単斜晶系態様は、結晶学的単位格子軸ａ及びｃを相互に入れ替えることができるので更に仮性欠面双晶形成を示す。また別の態様では、前記結晶は、Ｃ中心垂直斜方晶系対称C2221を示し、不整単位当たり8個の分子を含む。第三の態様では、前記結晶は、単純六方晶系対称P6322を示し、不整単位当たり2個の分子を含む。
更に前記構造によって、FAAHタンパク質は別々の単体として存在せず、その代わりにFAAHタンパク質は、単体の長軸に平行な軸の周りに単純な2回対称をもつ二量体を形成することが明らかになった。この編成は、集合した二量体の同一面上で各単体に由来する15から19のヘリックスの協調的提示を生じる。更にまた、これらのヘリックスは、二量体のこの面上に突出した高度に疎水性の平面を形成する。したがって、この構造モチーフは、特異的で安定した態様で細胞膜と相互作用する手段を提供する。前記酵素のこの面はまた、基質又は他の作用物質が膜から受け渡される可能性がある前記酵素の活性部位への進入経路を提示する。本明細書で用いられる“活性部位”は、その形状及び荷電電位の結果として作用物質（タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸（DNA及びRNAを含む）分子、化合物、抗生物質などを含むが、ただしこれらに限定されない）と相互作用するFAAHの領域を指す。
FAAH結晶は多様な形態をとることが予想され、その全てが本発明に包含される。FAAH結晶のある実施態様では、結晶は単純単斜晶系対称P21を示し、不整単位当たり16のFAAH分子を含む。前記単斜晶系態様は、結晶学的単位格子軸ａ及びｃを相互に入れ替えることができるので更に仮性欠面双晶形成を示す。また別の態様では、前記結晶は、Ｃ中心垂直斜方晶系対称C2221を示し、不整単位当たり8個の分子を含む。第三の態様では、前記結晶は、単純六方晶系対称P6322を示し、不整単位当たり2個の分子を含む。
更に前記構造によって、FAAHタンパク質は別々の単体として存在せず、その代わりにFAAHタンパク質は、単体の長軸に平行な軸の周りに単純な2回対称をもつ二量体を形成することが明らかになった。この編成は、集合した二量体の同一面上で各単体に由来する15から19のヘリックスの協調的提示を生じる。更にまた、これらのヘリックスは、二量体のこの面上に突出した高度に疎水性の平面を形成する。したがって、この構造モチーフは、特異的で安定した態様で細胞膜と相互作用する手段を提供する。前記酵素のこの面はまた、基質又は他の作用物質が膜から受け渡される可能性がある前記酵素の活性部位への進入経路を提示する。本明細書で用いられる“活性部位”は、その形状及び荷電電位の結果として作用物質（タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸（DNA及びRNAを含む）分子、化合物、抗生物質などを含むが、ただしこれらに限定されない）と相互作用するFAAHの領域を指す。
活性部位に接近する第二の経路は、前記二量体境界面に近い酵素の側面に見出される。この第二のポートはヒスチジン449を、更におそらくはトリプトファン445を目印とし、その各々は二量体の片方のポリペプチド鎖に由来する。前記のポートを酵素反応の進行と協調して調節的な態様で開閉することができるように、又は酵素の活性を制御する手段として前記ポートを開閉することができるように、酵素が構造的に再編成される可能なメカニズムが存在する。そのような制御手段は、任意の多数のメカニズム（タンパク質パートナー又はリガンドが含まれるが、ただしこれらに限定されない）からもたらされることができる。例示として（総括的な説明ではないが）、そのような作用は代表的なSH3ドメインクラスのタンパク質が引き金となる可能性がある。FAAHは、その先端表面にSH3ドメインタンパク質と（ホーマーファミリーのタンパク質と同様に）結合するためにコンセンサスポリプロリン配列を提示していることを本構造は示している。このモチーフはヘリックス11と12の間のループ上に存在し、アミノ酸配列プロリン-プロリン-ロイシン-プロリンを含んでいる。調節タンパク質（例えばホーマー又は外因的に供給された作用物質）が前記ポリプロリン配列とFAAH上で結合し、酵素の細胞質ポート又は他の構造的特徴を変化させて活性部位の幾何学的構造又は基質/生成物の通行に変化を与えることができる構造的変化を導入する潜在的なメカニズムが存在する。
別の実施態様では、FAAHの内部チャネルと相互作用し、それによってFAAH及び／又はその活性を刺激し、阻害し、再局在化し、安定化し、脱安定化する作用物質をFAAHの三次元構造に関する情報を基にして特定する方法が提供される。本明細書で用いられる、“内部チャネル”という用語は、タンパク質内のいくつかの部位、例えば活性部位、基質結合ポケット、膜ポート、細胞質ゾルポート、二量体化トンネル膜結合ドメイン、アルキルトンネル、ヘッド基トンネルなどを指す。FAAHの内部チャネルを構成するアミノ酸は表5に示されている。更に別の実施態様では、FAAHのSH3結合ドメイン及び表面ヘリックス-ループ-ヘリックスと相互作用する作用物質を特定する方法が提供される。
そのような作用物質は、FAAH分子と作用物質との間の可能な相互作用の解明を基にして特定、開発及び性状決定することができる。このプロセスは、FAAH構造の目視精査によって、又はより定量的にはそのような目的のために考案された種々のコンピュータアルゴリズム（例えばAUTODOCK、インサイトII及びQUANTA）を用いて実施することができる。本発明は、候補作用物質のin silicoでのバーチャル結合を可能にし、それによって可能な指標としてそれら作用物質の性状を更なる研究のために決定することができる。続いて前記物質をFAAHと接触させ、酵素の正常な機能に対する任意の作用を決定することによって、前記作用物質の作用をFAAHに対する活性についてテストすることができる。本発明の方法によって候補物質として特定されたそのような作用物質は、更なる化学的最適化及び／又は潜在的治療薬としてのin vivoにおける評価のための指標化合物の特定で有用であろう。本発明は、そのような最適化された作用物質は、生きている生物に投与されたとき生理学的作用を示すようにデザインされた薬理学的調製物として用いることができることを示す。本発明を用いて特定又は最適化された作用物質の前記のような医学的に関連する使用には、例えば痛み、睡眠、薬物中毒、不妊、不安、食欲減退、発熱、認知プロセスなどの治療が含まれる。
そのような作用物質は、FAAH分子と作用物質との間の可能な相互作用の解明を基にして特定、開発及び性状決定することができる。このプロセスは、FAAH構造の目視精査によって、又はより定量的にはそのような目的のために考案された種々のコンピュータアルゴリズム（例えばAUTODOCK、インサイトII及びQUANTA）を用いて実施することができる。本発明は、候補作用物質のin silicoでのバーチャル結合を可能にし、それによって可能な指標としてそれら作用物質の性状を更なる研究のために決定することができる。続いて前記物質をFAAHと接触させ、酵素の正常な機能に対する任意の作用を決定することによって、前記作用物質の作用をFAAHに対する活性についてテストすることができる。本発明の方法によって候補物質として特定されたそのような作用物質は、更なる化学的最適化及び／又は潜在的治療薬としてのin vivoにおける評価のための指標化合物の特定で有用であろう。本発明は、そのような最適化された作用物質は、生きている生物に投与されたとき生理学的作用を示すようにデザインされた薬理学的調製物として用いることができることを示す。本発明を用いて特定又は最適化された作用物質の前記のような医学的に関連する使用には、例えば痛み、睡眠、薬物中毒、不妊、不安、食欲減退、発熱、認知プロセスなどの治療が含まれる。
候補作用物質は、治療薬剤として機能する能力について調べたいと考える任意のタイプの分子（例えば、ペプチド、ペプチド模倣体、ポリヌクレオチド、又は有機小分子を含む）であろう。前記治療薬剤はそれを投与される対象者に治療的利点を提供する作用物質である。本発明の方法は高処理様式に容易に適用することができ、したがって本発明の方法は多数のテスト作用物質を連続して又は並行してスクリーニングするために便利であることは理解されよう。多数のテスト作用物質は、例えばテスト作用物質の総当り組合せ方法によって作製されたテスト作用物質ライブラリーであろう。治療活性についてテストすることができる総当り組合せ分子ライブラリーの製造方法は当業界で周知であり、前記には例えば以下が含まれる：ペプチドのファージディスプレーライブラリーの製造方法（前記ペプチドは拘束ペプチドであろう）（例えば以下を参照されたい：米国特許5,622,699号;同5,206,347号;Scott and Smith, Science 249:386-390, 1992; Markland et al., Gene 109:1319, 1991（各々は参照により本明細書に含まれる））；ペプチドライブラリー（米国特許5,264,563号、前記文献は参照により本明細書に含まれる）；ペプチド模倣体ライブラリー（Blondelle et al., Trends Ana. Cehm. 14:8392, 1995）；核酸ライブラリー（O'Connell et al.,上掲書, 1996; Tuerk and Gold, 上掲書, 1990; Gold et al.,上掲書,1995（前記文献は参照により本明細書に含まれる））；多糖類ライブラリー（York et al., Carb. Res. 285:99128, 1996; Liang et al., Science 274:1520-1522, 1996; Ding et al., Adv. Expt. Med. Biol. 376:261-269, 1995（前記文献は参照により本明細書に含まれる））；リポタンパク質ライブラリー（de Kruif et al., FEBS Lett. 399:232-236, 1996（前記文献は参照により本明細書に含まれる）；糖タンパク質又は糖脂質ライブラリー（Karaoglu et al., J. Cell Biol. 130:567-577, 1995（前記文献は参照により本明細書に含まれる））；又は、例えば薬剤又は他の医薬を含む化学ライブラリー（Gordon et al., J. Med. Chem. 37:1385-1401, 1994; Ecker and Crooke, Bio/Technology 13:351-360, 1995（前記文献は参照により本明細書に含まれる））。したがって、本発明はまた、そのような方法によって特定された治療薬剤を提供する。
候補作用物質の投与経路は、部分的には前記候補作用物質の化学構造に左右されるであろう。例えばペプチド及びポリヌクレオチドは、経口的に投与されるときは消化管で分解されるのであまり有用ではない。しかしながら、例えばペプチドを内因性プロテアーゼによる分解に対してより耐性にするか、又は消化管からの吸収を高めるためにそれらを化学的に改変する方法は周知である（例えば以下を参照されたい：Blondelle et al., Trends Anal. Chem. 14:83-92, 1995; Ecker and Crooke, Bio/Technology 13:351-360, 1995：前記文献は参照により本明細書に含まれる）。更にまた、ペプチド作用物質はD-アミノ酸を用いて製造することができる。また前記ペプチドは、ペプチド模倣体（ペプチドドメインの構造を模倣する有機分子）によるか、又はビニローグペプトイドのようなペプチドにより1つ又は2つ以上のドメインを含むことができる。
また別の実施態様では、本発明の方法によって特定された作用物質を含む医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は、以下を含む多様な方法で投与できる：例えば経口的又は非経口的、例えば静脈内、筋肉内、皮下、眼窩内、関節包内、腹腔内、直腸内、又は皮膚からの受動的もしくは促進吸収（例えばそれぞれ皮膚膏薬、又は経皮イオン浸透療法を用いる）投与。更にまた、本発明の医薬組成物は、注射、インキュベーション（経口的インキュベーション又は局所的インキュベーション）によって投与することができる。局所的インキュベーションは、受動的でも（例えば軟膏の直接塗布による）又は能動的（例えば鼻腔スプレー又は吸入剤を用いる）でもよいが、いずれの場合にも組成物の一成分は適切な発射薬である。
また別の実施態様では、本発明の方法によって特定された作用物質を含む医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は、以下を含む多様な方法で投与できる：例えば経口的又は非経口的、例えば静脈内、筋肉内、皮下、眼窩内、関節包内、腹腔内、直腸内、又は皮膚からの受動的もしくは促進吸収（例えばそれぞれ皮膚膏薬、又は経皮イオン浸透療法を用いる）投与。更にまた、本発明の医薬組成物は、注射、インキュベーション（経口的インキュベーション又は局所的インキュベーション）によって投与することができる。局所的インキュベーションは、受動的でも（例えば軟膏の直接塗布による）又は能動的（例えば鼻腔スプレー又は吸入剤を用いる）でもよいが、いずれの場合にも組成物の一成分は適切な発射薬である。
本発明の実施で投与されるべき医薬組成物の全量は、単一回投与として（瞬時投与として又は比較的短時間の輸液による）対象者に投与するか、又は分割治療プロトコルを用いて投与してもよい（前記プロトコルでは複数回投与が長期的に投与される）。前記医薬組成物は、経口製剤（例えば錠剤又は溶液もしくは懸濁液形）のために製剤化することができる。また前記組成物は、経口又は非経口的用途に適した有機もしくは無機担体又は賦形剤を有する混合物を含むことができ、更に例えば通常の毒性のない医薬的に許容できる、錠剤、ペレット、カプセル、座薬、溶液、乳濁液、懸濁液又は使用に適した他の形態のための担体とともに複合物質化することができる。前記担体は上記に開示されたもの以外に以下を含むことができる：グルコース、ラクトース、マンノース、アラビアゴム、ゼラチン、マンニトール、澱粉ペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、トウモロコシ澱粉、ケラチン、コロイドケイ酸、ジャガイモ澱粉、尿素、中鎖トリグリセリド、デキストラン、及び固体、半固体又は液体形の調製物の製造で使用するために適切な他の担体。更にまた、補助剤、安定化剤、膨張剤又は着色剤及び香料も用いることができる。例えば安定化乾燥物質、例えばトリウロースを用いることができる（例えば米国特許5,314,695号を参照されたい）。
別の実施態様では、その必要がある対象者に本発明の医薬組成物を投与することを含む、病的状態の治療方法が提供される。ある実施態様では、前記対象者は哺乳動物である。別の実施態様では、前記対象者はヒトである。本発明の方法によって有効に治療できる病的状態には、例えば不安、空腹、睡眠、受胎能、認知、免疫学的疾患、発熱、振せん、緑内障、腸疾患などが含まれる。
別の実施態様では、その必要がある対象者に本発明の医薬組成物を投与することを含む、病的状態の治療方法が提供される。ある実施態様では、前記対象者は哺乳動物である。別の実施態様では、前記対象者はヒトである。本発明の方法によって有効に治療できる病的状態には、例えば不安、空腹、睡眠、受胎能、認知、免疫学的疾患、発熱、振せん、緑内障、腸疾患などが含まれる。
更に別の実施態様では、以下の工程を含む、その構造が未知の分子又は分子複合体の分子構造を決定する方法が提供される：
（ａ）その構造が未知の分子又は分子複合体の結晶を入手し；
（ｂ）前記結晶化された分子又は分子複合体からＸ線回折データを作成し；
（ｃ）前記分子又は分子複合体のＸ線回折データをFAAHの結晶形から決定した三次元構造と比較し；更に
（ｄ）分子置換解析を用いて、FAAHの結晶形から決定した三次元構造を結晶化された分子又は分子複合体から得たＸ線回折データに一致させる。前記方法は例えば、FAAHと構造的に関連を有するタンパク質の決定を可能にする。本明細書で用いられる、“構造的に関連を有する”とは、そのＸ線回折データをFAAHのＸ線回折データと比較することによってその構造を決定することができるタンパク質を指す。本発明の前記のような使用は、標的タンパク質又はタンパク質複合体の結晶化及びそのＸ線回折データの収集を含むであろう。続いて前記標的のデータを、型板としてFAAHの構造を用いて分子置換の手段により解釈することができる。前記の方法では誘導結晶からデータを収集する必要がなく、標的タンパク質の構造の解明プロセスが極めて単純化される。
更に別の実施態様では、FAAH結晶から得られた構造情報を用いて、改変された物理化学的特性を有するタンパク質を設計（engineering)する方法が提供される。したがって、このドメインを全体的又は部分的に変異又は欠失させて、膜トロピズムが改変された又は膜トロピズムをもたないタンパク質を得ることができる。更にまた、特定した膜結合ドメインを完全に又は部分的に異種タンパク質に移植してその膜トロピズムに影響を及ぼすことができる。更にまた、FAAHの活性部位及び基質結合ポケットの特定によって、基質特異性及び／又は酵素特性が改変された変種の標的設定作製が可能になる。そのような変種は、脂肪酸アミドと無関係のアミド加水分解の触媒として有用であることを証明することができる。
本発明はこれから以下の非限定的実施例を参考にしながら極めて詳細に記載する。
（ａ）その構造が未知の分子又は分子複合体の結晶を入手し；
（ｂ）前記結晶化された分子又は分子複合体からＸ線回折データを作成し；
（ｃ）前記分子又は分子複合体のＸ線回折データをFAAHの結晶形から決定した三次元構造と比較し；更に
（ｄ）分子置換解析を用いて、FAAHの結晶形から決定した三次元構造を結晶化された分子又は分子複合体から得たＸ線回折データに一致させる。前記方法は例えば、FAAHと構造的に関連を有するタンパク質の決定を可能にする。本明細書で用いられる、“構造的に関連を有する”とは、そのＸ線回折データをFAAHのＸ線回折データと比較することによってその構造を決定することができるタンパク質を指す。本発明の前記のような使用は、標的タンパク質又はタンパク質複合体の結晶化及びそのＸ線回折データの収集を含むであろう。続いて前記標的のデータを、型板としてFAAHの構造を用いて分子置換の手段により解釈することができる。前記の方法では誘導結晶からデータを収集する必要がなく、標的タンパク質の構造の解明プロセスが極めて単純化される。
更に別の実施態様では、FAAH結晶から得られた構造情報を用いて、改変された物理化学的特性を有するタンパク質を設計（engineering)する方法が提供される。したがって、このドメインを全体的又は部分的に変異又は欠失させて、膜トロピズムが改変された又は膜トロピズムをもたないタンパク質を得ることができる。更にまた、特定した膜結合ドメインを完全に又は部分的に異種タンパク質に移植してその膜トロピズムに影響を及ぼすことができる。更にまた、FAAHの活性部位及び基質結合ポケットの特定によって、基質特異性及び／又は酵素特性が改変された変種の標的設定作製が可能になる。そのような変種は、脂肪酸アミドと無関係のアミド加水分解の触媒として有用であることを証明することができる。
本発明はこれから以下の非限定的実施例を参考にしながら極めて詳細に記載する。
結晶化
タンパク質の結晶は、アミノ末端の29アミノ酸が欠失したラットFAAHを組換えによって発現させて入手した。前記欠失領域は膜結合に参画することが予想されるが（8）、前記切端FAAH変種（残基30−579）は、野生型タンパク質の膜結合、可溶化のための洗剤要求及び哺乳類細胞における脂肪酸アミド分解能を保持する（15）。メトキシアラキドニルフルオロホスホネート、活性部位特異的不可逆性阻害剤と複合体を形成したFAAHの結晶は以下の３つの空間群で得られた：不整単位に16の分子を有するP21、不整単位に8つの分子を有するC2221、及び不整単位に2つの分子を有するP6322（材料と方法（16））。FAAH-阻害剤複合体の構造は、先ず初めに、組合せMIRAS/MADフェージング法及びそれに続く、多数の結晶及びNCS平均化による位相伸長を用いて3.3Åと決定された（表1）。得られた電子密度マップは、90％を超える側鎖について主要な鎖の断裂のない密度を表示し、双晶形成単斜結晶データの分子置換フェージングのための非常に優れた検索モデルが得られた。2.8Åの解像度でP21として構築された最終的モデルは優れた品質を示した。
タンパク質の結晶は、アミノ末端の29アミノ酸が欠失したラットFAAHを組換えによって発現させて入手した。前記欠失領域は膜結合に参画することが予想されるが（8）、前記切端FAAH変種（残基30−579）は、野生型タンパク質の膜結合、可溶化のための洗剤要求及び哺乳類細胞における脂肪酸アミド分解能を保持する（15）。メトキシアラキドニルフルオロホスホネート、活性部位特異的不可逆性阻害剤と複合体を形成したFAAHの結晶は以下の３つの空間群で得られた：不整単位に16の分子を有するP21、不整単位に8つの分子を有するC2221、及び不整単位に2つの分子を有するP6322（材料と方法（16））。FAAH-阻害剤複合体の構造は、先ず初めに、組合せMIRAS/MADフェージング法及びそれに続く、多数の結晶及びNCS平均化による位相伸長を用いて3.3Åと決定された（表1）。得られた電子密度マップは、90％を超える側鎖について主要な鎖の断裂のない密度を表示し、双晶形成単斜結晶データの分子置換フェージングのための非常に優れた検索モデルが得られた。2.8Åの解像度でP21として構築された最終的モデルは優れた品質を示した。
データの構築
表1は、データ収集及び洗練統計の要約を含む。初期相は、全てのMAD及びMIRAS寄与分を取り込みDmMulti（24）を用いて計算した。最終モデルにおけるアミノ酸のラマカンドラン分布は、密なNCS拘束下での位相の洗練後にただ1つのタンパク質の鎖からPROCHECK（24）を用いて計算した。密度が観察されなかった側鎖は、洗練中はゼロ占有に設定し、反射のシグマ依存拒否は用いなかった。カッコ内の数字は最高の解像殻内のデータを指す。２つの残基が拒否領域に存在した。すなわち、グルタミン酸122（前記はガンマターンのｉ＋1位に存在する）及びグルタミン189（前記もまた密なターン内にありその直後に第二のターンが続く）である。表2は完全なデータ収集及び洗練統計を含む。
表1は、データ収集及び洗練統計の要約を含む。初期相は、全てのMAD及びMIRAS寄与分を取り込みDmMulti（24）を用いて計算した。最終モデルにおけるアミノ酸のラマカンドラン分布は、密なNCS拘束下での位相の洗練後にただ1つのタンパク質の鎖からPROCHECK（24）を用いて計算した。密度が観察されなかった側鎖は、洗練中はゼロ占有に設定し、反射のシグマ依存拒否は用いなかった。カッコ内の数字は最高の解像殻内のデータを指す。２つの残基が拒否領域に存在した。すなわち、グルタミン酸122（前記はガンマターンのｉ＋1位に存在する）及びグルタミン189（前記もまた密なターン内にありその直後に第二のターンが続く）である。表2は完全なデータ収集及び洗練統計を含む。
FAAHの結晶構造は二量体酵素を示し（図1）、これは、前記酵素が溶液中で二量体であることを示す化学的架橋実験と一致する（15）。二量体の境界面は、各単体当たり分子の表面領域から約1560Å埋没している（17）。タンパク質コアは、11の混合鎖から成るねじれたベータシートの特徴を有する。前記ベータシートを種々の長さの24のアルファヘリックスが順に取り巻いている。単体の全体的な折り畳みは、窒素固定細菌ブラジリゾビウム=ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）由来のマロンアミダーゼのそれ（12）及びステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）由来のペプチドアミダーゼのそれと非常に類似している（J. Labahn, S. Neumann, G. Buldt, M. Kula, J. Granzin, J. Mol. Biol. 322(5):1053, 2002）。
しかしながら、重要な構造的特徴がFAAHを固有のものとし、これら特徴については以下で考察する。更にこれらの変動は、FAAHとその細菌性同族体間の根平均二乗偏差（rmsd）（表3及び4）を測定することによって定量することができる。アミノ酸配列アラインメントにしたがう比較が前記タンパク質ドメイン間で得られるならば、より多くの原子が計算に含まれるのでrmsd差は増加する。このことは、活性部位に中心が来る拡張球体に計算を限定する場合及びCαsから全ての原子に計算を拡張した場合の両方に当てはまる。いずれの場合でも、配列を考慮するためにFAAHの一部分のみしか計算に含むことができないということは重要である（PAMの場合は42％、MAE2の場合は36％（表3））。更にまた、タンパク質が折り畳まれる場合、局所構造が考慮され、包含することができるFAAHの比較可能な部分は、PAMについては22％に、MAE2については34％に更に減少する（表4）。
しかしながら、重要な構造的特徴がFAAHを固有のものとし、これら特徴については以下で考察する。更にこれらの変動は、FAAHとその細菌性同族体間の根平均二乗偏差（rmsd）（表3及び4）を測定することによって定量することができる。アミノ酸配列アラインメントにしたがう比較が前記タンパク質ドメイン間で得られるならば、より多くの原子が計算に含まれるのでrmsd差は増加する。このことは、活性部位に中心が来る拡張球体に計算を限定する場合及びCαsから全ての原子に計算を拡張した場合の両方に当てはまる。いずれの場合でも、配列を考慮するためにFAAHの一部分のみしか計算に含むことができないということは重要である（PAMの場合は42％、MAE2の場合は36％（表3））。更にまた、タンパク質が折り畳まれる場合、局所構造が考慮され、包含することができるFAAHの比較可能な部分は、PAMについては22％に、MAE2については34％に更に減少する（表4）。
表３：触媒トリオCαsの重ね合わせた後の配列準拠同等残基範囲の平均rmsdxyz（計算に含まれるアミノ酸残基数が表示される）
表４：局所構造準拠同等残基範囲の平均rmsdxyz（計算に含まれるアミノ酸残基数が表示される）
*挿入/欠失及び非同一アミノ酸側鎖は計算には含まれていない。PAM-CHYはペプチドアミダーゼと阻害剤キモスタチンの複合体である。
FAAHの活性部位は、突然変異（10、18）によって以前に限定されたコア触媒残基の位置を基にし、更に阻害剤アダクツのメトキシアラキドニルホスホネート（MAP）の密度から特定した（図2）。触媒性親核分子のセリン241はMAP分子のリン酸に共有結合し、近隣の密度は、エネルギー的に有利な構成でアラキドニル鎖を収容するために作製することができる（図2A）。MAE2で観察されるように、FAAHのセリン親核分子は、セリン217及びリジン142とともに通常ではないセリン-セリン-リジン触媒性トリオの部分を形成し（図2B）、触媒残基の相関する方向性はFAAH及びMAE2の構造間での重ね合わせをほぼ可能にする（rmsd＝0.27Å）。対比すると、FAAHとMAE2の基質結合ポケットは顕著に相違する。FAAHの表面から続き、包埋されたアラキドニル鎖を含むトンネルに沿ってもっぱら芳香族及び脂肪族アミノ酸が並び（図2B）、その多くはMAE2に対するFAAH内の配列挿入から生じている。これらの残基にはイソロイシン491が含まれ、前記はUV架橋及び突然変異実験によって基質認識に関与することが特定された（14）。対比すると、MAE2の活性部位に沿って、その可溶性基質（マロンアミド）を収納する親水性アミノ酸が主に並んでいる（12）。
アミノ酸410−438（MAE2に対するFAAHの別の配列挿入）は、ASの折り畳みを妨げるヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフを形成する。2つのヘリックス、α18及びα19は活性部位に覆いをかぶせ、おそらくFAAHの膜結合面を構成するいくつかの疎水性残基を提示する（図1、3A）。完全な酵素のN-末端（更に別の膜結合ヘリックスを（アミノ酸残基7−29）形成すると配列分析から予測される）は、適切に配置され、α18とα19膜キャップの膜との相互作用を強制するであろう。
アミノ酸410−438（MAE2に対するFAAHの別の配列挿入）は、ASの折り畳みを妨げるヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフを形成する。2つのヘリックス、α18及びα19は活性部位に覆いをかぶせ、おそらくFAAHの膜結合面を構成するいくつかの疎水性残基を提示する（図1、3A）。完全な酵素のN-末端（更に別の膜結合ヘリックスを（アミノ酸残基7−29）形成すると配列分析から予測される）は、適切に配置され、α18とα19膜キャップの膜との相互作用を強制するであろう。
タンパク質基質の進入路はα18及びα19に隣接し、MAPのアラキドニル鎖はα18のフェニルアラニン432と接触する。前記はFAAH活性部位と疎水性膜二重層との間の直接的接近を示しているかもしれない。前記の仮説的な基質侵入は、縁の三方の側を覆う疎水性残基、並びに残りの側を完全なものにする荷電残基アルギニン486及びアスパルテート403により性質として両親媒性である（図2A、3B）この残基編成は極性脂肪酸アミドのヘッド基の受け入れ及び活性部位への移動を許容することができるであろう。総合的には、膜結合表面とFAAHの活性部位との間のこの親密な関係はスクオレンシクラーゼ（19）及びプロスタグランジンH2シンターゼ（20）の関係と類似する（前記酵素はまた脂質可溶性基質に作用し、それら基質の対応する活性部位入口の周囲に疎水性キャップを有する）。全ての3つの酵素で、疎水性キャップは、陰性荷電リン脂質と相互作用することができる塩基性アミノ酸によって取り巻かれている（図3B）。
第二の主要なトンネルは、アラキドニル充填孔から約80度の角度で活性部位から出現する。このトンネルは二股に分かれて溶媒暴露細胞質ゾルポート及びトリプトファン445封鎖経路の両方を作り上げる（前記トリプトファンは鍵と錠前のサブユニット間接触を形成する）。したがって、FAAH活性部位は、細胞質の水性環境及び二重層の脂質環境の両方に同時に接近するようである。この構造は、脂肪酸アミド基質から自由になった極性アミン置換基にとって細胞質ゾルへの出口経路を提供することができ、更にまたFAAH-脂肪アシル中間体の脱アシル化に必要な水分子のために入口を提供できるかもしれない。
第二の主要なトンネルは、アラキドニル充填孔から約80度の角度で活性部位から出現する。このトンネルは二股に分かれて溶媒暴露細胞質ゾルポート及びトリプトファン445封鎖経路の両方を作り上げる（前記トリプトファンは鍵と錠前のサブユニット間接触を形成する）。したがって、FAAH活性部位は、細胞質の水性環境及び二重層の脂質環境の両方に同時に接近するようである。この構造は、脂肪酸アミド基質から自由になった極性アミン置換基にとって細胞質ゾルへの出口経路を提供することができ、更にまたFAAH-脂肪アシル中間体の脱アシル化に必要な水分子のために入口を提供できるかもしれない。
総合すれば、可溶性AS酵素MAE2の構造とFAAHの構造との比較によって、タンパク質の大きなクレード（clade）の１つのメンバーが、それぞれ別個の折り畳まれたモジュールを付加することにより、更に触媒メカニズム又は折り畳み構造に大きな変化をもたらすことなくどのようにして特殊な細胞機能を達成するために適応させられるかが明らかになった（図4）。例えば、FAAH及びMAE2はほぼ同じ面の周りで二量体化されるが、それらは種々の相対的単体方向性を有する。これら別個の四次方向性によってMAE2及びFAAH単体の活性部位入口のアンチパラレル及びパラレルアラインメントがそれぞれ生じる。FAAHのパラレルな方向性は重要な生物学的意味を有する。なぜならば前記は、同じ膜から基質を補充することによって両方のサブユニットが同時に機能することを可能にするはずだからである。更にまた、このパラレルアラインメントは別の重要な構造モジュール（α18−α19疎水性キャップ）を二量体の同じ面に置き、それによって膜結合を強化する（図4）。FAAHタンパク質における更に別の配列挿入は、この酵素の構造の他の特殊化された特徴（その細胞質チャネル及び非極性基質結合ポケットを含む）の原因となる（図4）。
酵素の構造によって明らかになったFAAHの活性部位と細胞膜との親密な関係は、脂肪酸アミドを反応の進行のために細胞の水性区画を通って作用部位から分解部位へ輸送する必要がないかもしれないという可能性をもたらした。結果として、適切なエンドカナビオノイドのトーンは、in vivoでのFAAHの発現レベル及びCB受容体系に対するその存在場所の両方に依存する可能性がある（21）。最後に、FAAHの構造は、種々の神経系疾患に対して治療的利点を有する阻害剤（酵素のアシル鎖ポケットに結合する作用物質だけでなく、細胞質チャネルを介する活性部位を標的にする化合物を含む）のデザインを容易にするであろう（22）。この後者のクラスの阻害剤は、ヒトのプロテオームに存在する百を超える脂質加水分解酵素と比較してFAAHに格別の選択性を示すかもしれない。
酵素の構造によって明らかになったFAAHの活性部位と細胞膜との親密な関係は、脂肪酸アミドを反応の進行のために細胞の水性区画を通って作用部位から分解部位へ輸送する必要がないかもしれないという可能性をもたらした。結果として、適切なエンドカナビオノイドのトーンは、in vivoでのFAAHの発現レベル及びCB受容体系に対するその存在場所の両方に依存する可能性がある（21）。最後に、FAAHの構造は、種々の神経系疾患に対して治療的利点を有する阻害剤（酵素のアシル鎖ポケットに結合する作用物質だけでなく、細胞質チャネルを介する活性部位を標的にする化合物を含む）のデザインを容易にするであろう（22）。この後者のクラスの阻害剤は、ヒトのプロテオームに存在する百を超える脂質加水分解酵素と比較してFAAHに格別の選択性を示すかもしれない。
図1は、内在性膜タンパク質脂肪酸アミドヒドロラーゼ（FAAH）の構造を示す。前記酵素は63kDaのサブユニットから組み立てられた同種二量体である。前記阻害剤アダクツであるメトキシアラキドニルホスホネート（MAP）は、黄色（炭素）、灰色（リン酸）及び赤色（酸素）で示されるファンデルワールス表面を有する活性部位に示されている。（A）酵素の正面図であり、酵素構造のコアを形成する中央のねじれたベータシートが強調されている。（B）A図を90度回転させて得られた酵素の側面図である。緑色サブユニットのアミノ（N）及びカルボキシ（C）末端が標識されている。プロリン129が表示されている。この位置でスレオニンへの置換を付与する遺伝的多型性は薬物乱用で示唆されており、本酵素がタンパク分解攻撃を受けやすくする（25）。全ての図面はモルスクリプト（Molscript）（26）、GRASP（23）及びラスター（Raster）3D（27）を用いて作製された。膜モデルは、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（POPE）二重層の分子ダイナミクスシミュレーションによって作製された。
図２は、アラキドニル阻害剤MAPと複合体を形成したHAAHの活性部位を示す。（A）一方のユニットについて灰色（親水性）及び緑色（疎水性）で示され、その相手方について青黄色で示されるタンパク質表面を有するFAAH二量体が示されている。前記タンパク質表面の一部分が除去されて、アルギニン486（青）及びアスパルテート403（赤）の膜結合面から活性部位更に細胞質ゾルポートに続く連続した内部チャネルが強調されている。アラキドニル阻害剤に対応する電子密度は紫色で示され、疎水性（緑色）基質結合ポケットに存在する。二量体の相手方のトリプトファン445はファンデルワールス表面に示され、藍色に着色されてこの潜在的ポートの効果的なプラギングが示されている。（B）アラキドニル鎖周囲の基質結合ポケット内の芳香族及び脂肪族残基並びにそれらの相互作用が示されている。更にまた、FAAHの通常でないセリン-セリン-リジン触媒トリオ（ser241-ser217-ser241）が示されている。前記親核性セリン241はMAP阻害剤のリン原子と共有結合している。
図３はFAAHの予想される膜結合キャップを示す。（A）仮説的膜結合キャップを含む疎水性ヘリックスα18及びα19は緑色で示されている。このドメイン（404−433）の一次配列はアミノ酸一文字コード（29）を用いて示されているが、ただし親水性アミノ酸は除かれている（前記はｘで示されている）。これら7つの親水性残基のうち5つはアルギニン又はリジンであり、残りの2つはセリンである。（B）膜面から見たFAAHの分子表面である。観察される構造は疎水性キャップ（上部、緑色）の存在を示し、前記キャップは主として陽性静電気電位（下部；青色、塩基性；赤色、酸性；）によって取り巻かれている。膜面から活性部位への入口が示され、前記はアルギニン486及びアスパルテート403であり、前記はこの接近ポートの一方の側を形成する。
図4は、FAAHとMAE2の構造の違いを基にして可溶性酵素を内在性膜タンパク質に変換する提唱されているモジュール適用の説明である。可溶性酵素（オリゴマーの場合）は、全ての活性部位が最大効率で二重層に同時に接近することができるように再編成される。別々の構造成分（この図では赤色で表示）の添加によって、新規なオリゴマー化ドメイン（トリプトファン445及び残基299-314；下段左のパネル）が、膜結合面（下段中央の左パネル）及び細胞質アクセスチャネル（下段中央の右パネル）とともに与えられる。最終的なモノトピックな一体性（monotopic integral)膜酵素もまた、活性部位内の主要な基質結合残基の変異により効率的にその疎水性標的を脂質二重層から補充しなければならない（下段右パネル）。
表5：FAAHの内部チャネルに並んでいると推測される残基。本構造のCαsの座標は単に目印として提供されている。
ATOM 0 CA LYS A 142 12.558 -31.943 29.679 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA SER A 190 17.871 -20.245 32.364 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA MET A 191 17.760 -22.751 29.499 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LEU A 192 19.766 -20.186 27.640 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA SER A 193 22.793 -22.387 27.483 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA PHE A 194 24.110 -25.405 25.603 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA SER A 217 19.643 -27.223 27.046 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA THR A 236 12.999 -27.716 22.998 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA ILE A 238 15.579 -22.197 19.986 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLY A 239 19.319 -22.114 19.282 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLY A 240 20.185 -25.826 19.177 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LYS A 142 12.558 -31.943 29.679 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA SER A 190 17.871 -20.245 32.364 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA MET A 191 17.760 -22.751 29.499 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LEU A 192 19.766 -20.186 27.640 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA SER A 193 22.793 -22.387 27.483 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA PHE A 194 24.110 -25.405 25.603 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA SER A 217 19.643 -27.223 27.046 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA THR A 236 12.999 -27.716 22.998 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA ILE A 238 15.579 -22.197 19.986 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLY A 239 19.319 -22.114 19.282 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLY A 240 20.185 -25.826 19.177 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA SER A 241 19.006 -27.246 22.499 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA PHE A 244 23.393 -30.169 20.863 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA THR A 257 9.128 -26.186 12.131 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA ASN A 259 4.442 -24.354 14.717 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LEU A 261 3.547 -28.979 17.435 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA SER A 262 1.827 -27.120 20.226 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LYS A 263 3.541 -25.099 22.924 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA SER A 264 0.514 -24.586 24.939 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LEU A 266 5.685 -24.877 27.877 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLY A 268 9.936 -20.496 29.403 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA CYS A 269 11.633 -17.639 31.102 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA VAL A 270 10.747 -14.992 28.633 0.00 0.00
A C
A C
ATOM 0 CA PHE A 244 23.393 -30.169 20.863 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA THR A 257 9.128 -26.186 12.131 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA ASN A 259 4.442 -24.354 14.717 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LEU A 261 3.547 -28.979 17.435 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA SER A 262 1.827 -27.120 20.226 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LYS A 263 3.541 -25.099 22.924 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA SER A 264 0.514 -24.586 24.939 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LEU A 266 5.685 -24.877 27.877 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLY A 268 9.936 -20.496 29.403 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA CYS A 269 11.633 -17.639 31.102 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA VAL A 270 10.747 -14.992 28.633 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA TYR A 271 7.552 -14.969 26.504 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLY A 272 6.363 -13.140 23.340 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLN A 273 9.614 -13.020 21.432 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA THR A 274 8.660 -14.154 17.873 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA ALA A 275 11.611 -13.454 15.736 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA VAL A 276 13.533 -16.679 15.922 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLN A 277 11.336 -19.629 16.496 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LEU A 278 10.970 -21.950 19.360 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA ASP A 306 -4.793 -26.348 20.414 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA THR A 308 -3.495 -22.832 16.561 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA VAL A 309 -1.332 -25.679 15.400 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA TYR A 335 32.027 -18.555 10.993 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LEU A 372 23.776 -14.742 12.937 0.00 0.00
A C
A C
ATOM 0 CA GLY A 272 6.363 -13.140 23.340 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLN A 273 9.614 -13.020 21.432 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA THR A 274 8.660 -14.154 17.873 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA ALA A 275 11.611 -13.454 15.736 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA VAL A 276 13.533 -16.679 15.922 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLN A 277 11.336 -19.629 16.496 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LEU A 278 10.970 -21.950 19.360 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA ASP A 306 -4.793 -26.348 20.414 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA THR A 308 -3.495 -22.832 16.561 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA VAL A 309 -1.332 -25.679 15.400 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA TYR A 335 32.027 -18.555 10.993 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LEU A 372 23.776 -14.742 12.937 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLU A 373 24.892 -11.299 14.242 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA SER A 376 19.587 -14.121 15.269 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA ALA A 377 21.364 -12.481 18.109 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LEU A 380 17.049 -12.894 20.827 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA PHE A 381 18.126 -9.780 22.708 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA PHE A 388 15.472 -12.482 30.704 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LEU A 401 26.491 -19.448 32.271 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLY A 402 29.874 -17.666 32.101 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA ASP A 403 29.566 -13.889 31.936 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LEU A 404 26.384 -13.628 29.944 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA ILE A 407 27.407 -8.419 30.439 0.00 0.00
A C
A C
ATOM 0 CA SER A 376 19.587 -14.121 15.269 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA ALA A 377 21.364 -12.481 18.109 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LEU A 380 17.049 -12.894 20.827 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA PHE A 381 18.126 -9.780 22.708 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA PHE A 388 15.472 -12.482 30.704 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LEU A 401 26.491 -19.448 32.271 0.00 0.00
A C
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A C
ATOM 0 CA ASP A 403 29.566 -13.889 31.936 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LEU A 404 26.384 -13.628 29.944 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA ILE A 407 27.407 -8.419 30.439 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA ARG A 428 32.279 -10.875 16.349 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA LEU A 429 32.511 -9.785 19.879 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA PHE A 432 27.625 -9.601 20.031 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA TRP A 445 9.219 -4.401 13.406 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLN A 448 10.948 -9.045 11.948 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA HIS A 449 10.701 -7.903 8.430 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA ILE A 451 13.771 -11.849 8.960 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLU A 452 10.849 -12.835 6.872 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA MET A 453 12.858 -11.529 3.862 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA ARG A 455 13.826 -16.561 4.859 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLN A 456 12.307 -15.855 1.397 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA PRO A 484 29.797 -23.817 26.313 0.00 0.00
A C
A C
ATOM 0 CA LEU A 429 32.511 -9.785 19.879 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA PHE A 432 27.625 -9.601 20.031 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA TRP A 445 9.219 -4.401 13.406 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLN A 448 10.948 -9.045 11.948 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA HIS A 449 10.701 -7.903 8.430 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA ILE A 451 13.771 -11.849 8.960 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLU A 452 10.849 -12.835 6.872 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA MET A 453 12.858 -11.529 3.862 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA ARG A 455 13.826 -16.561 4.859 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLN A 456 12.307 -15.855 1.397 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA PRO A 484 29.797 -23.817 26.313 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLY A 485 29.335 -20.718 28.271 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA ARG A 486 32.477 -19.218 26.838 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA THR A 488 28.751 -18.591 22.179 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA GLY A 489 29.978 -18.362 18.590 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA ILE A 491 25.976 -22.214 18.037 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA SER A 492 26.470 -20.646 14.610 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA VAL A 495 20.892 -21.229 15.354 0.00 0.00
A C
ATOM 0 CA CYS A 499 16.329 -18.125 12.495 0.00 0.00
A C
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A C
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A C
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A C
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A C
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A C
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A C
A C
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A C
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A C
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A C
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A C
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A C
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A C
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A C
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A C
SEQ.ID. NO 1:
1 mvlsevwttl sgvsgvclac sllsaavvlr wtgrqkarga atrarqkqra sletmdkavq
61 rfrlqnpdld sealltlpll qlvqklqsge lspeavffty lgkawevnkg tncvtsyltd
121 cetqlsqapr qgllygvpvs lkecfsykgh dstlglslne gmpsesdcvv vqvlklqgav
181 pfvhtnvpqs mlsfdcsnpl fgqtmnpwks skspggssgg egaligsggs plglgtdigg
241 sirfpsafcg icglkptgnr lsksglkgcv ygqtavqlsl gpmardvesl alclkallce
301 hlftldptvp plpfreevyr ssrplrvgyy etdnytmpsp amrralietk qrleaaghtl
361 ipflpnnipy alevlsaggl fsdggrsflq nfkgdfvdpc lgdlililrl pswfkrllsl
421 llkplfprla aflnsmrprs aeklwklqhe iemyrqsvia qwkamnldvl ltpmlgpald
481 lntpgratga isytvlyncl dfpagvvpvt tvtaeddaqm elykgyfgdi wdiilkkamk
541 nsvglpvavq cvalpwqeel clrfmreveq lmtpqkqps
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361 ipflpnnipy alevlsaggl fsdggrsflq nfkgdfvdpc lgdlililrl pswfkrllsl
421 llkplfprla aflnsmrprs aeklwklqhe iemyrqsvia qwkamnldvl ltpmlgpald
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http://indigo1.biop.ox.ac.uk/tieleman/downloads.html, pope.pdb.
２９．A, alanine; F, phenylalanine; L, leucine; I, isoleucine; P, proline; W, tryptophan.
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２９．A, alanine; F, phenylalanine; L, leucine; I, isoleucine; P, proline; W, tryptophan.
本発明は、特定の好ましい態様に関連して詳細に説明されているが、変更及び変化が、記載され請求されている精神及び範囲内にあることは理解されよう。
Claims (39)
- 結晶化された哺乳動物の脂肪酸アミドヒドロラーゼ（FAAH）。
- 前記酵素が、配列番号:１のアミノ酸配列又はその保存的置換のアミノ酸配列を有する、請求項１の結晶化FAAH。
- 二級、三級及び四級レベルのFAAHの構造の三次元モデル。
- 請求項１に記載の結晶からFAAHの三次元構造を決定する方法であって、前記結晶からＸ線回折データを収集し、前記データを多重同形置換（MIR）並びに単一波長及び多重波長の異常回折（SAD／MAD）によって前記データを解析し、それによってFAAHの三次元構造決定することを特徴とする方法。
- 構造が未知である分子又は分子複合体の分子構造を決定する方法であって、以下の工程、
（a）構造が未知である分子又は分子複合体の結晶を入手する工程、
（b）前記結晶化分子又は分子複合体からＸ線回折データを作製する工程、
（c）前記分子又は分子複合体のＸ線回折データを請求項１の結晶から決定した三次元構造と比較する工程、及び
（d）分子置換解析を用いて、請求項１の結晶から決定した三次元構造を前記結晶化分子又は分子複合体のＸ線回折データに一致させる工程、
を含むことを特徴とする、方法。 - 請求項3の三次元モデルを用いて作用物質の手動又はコンピュータ支援適合解析を実施し、それによってFAAHの内部チャネルと相互作用する作用物質を特定することを含む、FAAHの内部チャネルと相互作用する作用物質を特定する方法。
- 前記内部チャネルが、活性部位である、請求項6の方法。
- 前記活性部位が、アミノ酸残基142、217、218、236、238、239、240及び241を含む、請求項7の方法。
- 前記内部チャネルが、基質結合ポケットである請求項6の方法。
- 前記基質結合ポケットが、アミノ酸残基491、495、335、372、377、194及び244を含む、請求項9の方法。
- 前記作用物質と前記基質結合ポケットとの相互作用を特定し、最適化し、又はアラキドニル阻害剤MAFPの位置と比較する、請求項9の方法。
- 前記内部チャネルが、FAAHの膜ポートである請求項6の方法。
- 前記膜ポートが、アミノ酸残基403、407、428、429、486、530及び534を含む、請求項12の方法。
- 前記内部チャネルが、FAAHの細胞質ゾルポートである請求項6の方法。
- 前記細胞質ゾルポートが、アミノ酸残基266、271、272、445、449及び453を含む、請求項14の方法。
- 前記内部チャネルが、FAAHの二量体化トンネルである、請求項6の方法。
- 前記二量体化トンネルが、アミノ酸残基257、259、261、262、263、264、306、308、309、448、451、452、455、456、499、500、501及び556を含む、請求項16の方法。
- 前記内部チャネルが、FAAHの膜結合ドメインである、請求項6の方法。
- 前記膜結合ドメインが、アミノ酸残基383−440を含む、請求項18の方法。
- 前記内部チャネルが、FAAHのヘッド基トンネルである、請求項6の方法。
- 前記ヘッド基トンネルが、アミノ酸残基268、269、270、273、274、275、276、277及び278を含む、請求項20の方法。
- 前記内部チャネルが、FAAHのアルキルトンネルである、請求項6の方法。
- 前記アルキルトンネルが、アミノ酸残基190−194、244、335、372、373、376、377、380、381、388、401、402、404、432、484、485、488、489、491、492、495及び531を含む、請求項22の方法。
- 請求項3の三次元モデルを用いて作用物質の手動又はコンピュータ支援適合解析を実施し、それによってFAAHのSH3結合ドメインと相互作用する作用物質を特定することを含む、FAAHのSH3結合ドメインと相互作用する作用物質の特定方法。
- 前記SH3結合ドメインが、アミノ酸残基297−315を含む、請求項24の方法。
- 請求項3の三次元モデルを用いて作用物質の手動又はコンピュータ支援適合解析を実施し、それによってFAAHの表面ヘリックス-ループ-ヘリックスと相互作用する作用物質を特定することを含む、FAAHの表面ヘリックス-ループ-ヘリックスと相互作用する作用物質の特定方法。
- 前記表面ヘリックス-ループ-ヘリックスが、アミノ酸残基511−546を含む、請求項26の方法。
- 請求項６から27のいずれかに記載の方法によって特定される作用物質。
- 請求項28の作用物質及び医薬的に許容できる前記作用物質のための担体を含む医薬組成物。
- 請求項29の医薬組成物をその必要がある対象者に投与し、それによって病的状態を治療することを含む、病的状態の治療方法。
- 前記対象者が、哺乳動物である、請求項30の方法。
- 前記哺乳動物が、ヒトである、請求項31の方法。
- 前記病的状態が、不安、痛み、空腹、睡眠、受胎能、認知、免疫学的疾患、発熱、振せん、緑内障、腸疾患である、請求項30の方法。
- FAAHの活性を調節する能力について作用物質をスクリーニングする方法であって、FAAHを前記作用物質と接触させてFAAH-作用物質複合体を形成し、更に複合体非形成FAAHに対して前記FAAH-作用物質複合体の活性レベルを測定し、それによってFAAHの活性を調節する能力について前記作用物質をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニングする方法。
- 前記作用物質を生細胞又は生きている生物に投与することを含む、請求項34に記載の作用物質の作用を評価する方法。
- FAAHの基質結合部位を特定し、更に前記基質結合部位を改変し、それによって改変された基質特異性又はカイネティクスを有するFAAH変種を設計することを含む、改変基質特異性又はカイネティクスを有するFAAH変種を設計する方法。
- FAAHの完全な膜結合ドメインを異種タンパク質に移植し、それによって異種タンパク質の膜トロピズムを改変することを含む、異種タンパク質の膜トロピズム改変方法。
- FAAHの膜結合ドメインの部分を異種タンパク質に移植し、それによって異種タンパク質の膜トロピズムを改変することを含む、異種タンパク質の膜トロピズム改変方法。
- FAAHの膜結合ドメインを特定し、前記膜結合ドメインを改変し、それによって改変された膜結合特性を有するFAAH変種を設計することを含む、改変膜結合特性を有するFAAH変種を設計する方法。
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