JP2002506206A

JP2002506206A - Ｘ線結晶学によるリガンドのスクリーニングおよび設計

Info

Publication number: JP2002506206A
Application number: JP2000534866A
Authority: JP
Inventors: ニーネイバー，ビツキ・エル; グリア，ジヨナサン; アバド−ザパテロ，セレリノ; ノーベツク，ダニエル・ダブリユ
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1998-03-06
Filing date: 1999-03-05
Publication date: 2002-02-26
Also published as: SK13242000A3; WO1999045389A2; EP1068531A2; US6297021B1; AU767991B2; DE69937292D1; CN1299467A; NO20004433L; CN100354627C; AU2003255167A1; HUP0101959A3; ATE375510T1; WO1999045379A3; CN101221138A; HUP0101959A2; AU2887099A; EP1068531B1; KR20010041653A; IL137758A0; AU2987899A

Abstract

(57)【要約】標的生体分子の公知リガンドではない化合物を該標的生体分子に対するその結合能に関してスクリーニングするために、X線結晶学を用いることができる。該方法は、標的生体分子の結晶を得、1以上の試験サンプルに標的生体分子結晶をさらし、リガンド／受容体複合体が形成されるか否かを判定するためにX線結晶回折パターンを得ることを含む。1以上の試験サンプルの存在下で生体分子を共結晶化する又は1以上の試験サンプルの溶液中に生体分子結晶を浸漬することにより、標的を試験サンプルにさらす。もう1つの実施形態においては、より強固に結合する、より特異的に結合する、より良好な生物活性を有する又はより良好な安全性プロフィールを有するリガンドを設計するために、リガンド／受容体複合体からの構造情報を用いる。本発明のもう1つの実施形態は、生物学的に活性な部分を本方法により同定または設計することを含む。もう1つの実施形態においては、分解可能なリガンドと共に生体分子を共結晶化し該リガンドを分解させることにより、容易に接近可能な活性部位を有する生体分子結晶を形成させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の技術分野） X線結晶学は、標的受容体分子に結合するリガンドの同定、および改善された生物活性を有する、標的受容体のリガンドの設計に有用である。

【０００２】（発明の背景） X線結晶学（結晶学）は、結晶中の分子の様態の3次元像として最も良く表現さ
れうるものを提供する確立された十分に研究された技術である。科学者は、生物
学的に重要な多数の分子の結晶構造を解明するために結晶学を用いてきた。タン
パク質、DNA、RNAおよびウイルスを含む（これらに限定されるものではない）生
体分子の多数のクラスが結晶学により研究されうる。科学者は、リガンドをその
受容体内に保持する生体分子（「リガンド-受容体複合体」）の結晶構造さえも報告している。

【０００３】標的生体分子またはリガンド-受容体複合体の「像」が与えられれば、科学者は、生物活性が生じうるポケットまたは受容体を捜すことができる。ついで科学
者は、該受容体の高親和性リガンド（または薬物）を実験的に又は計算により設
計することができる。あるいは、小分子の結合に関してスクリーニングするため
に、計算による方法が用いられている。しかしながら、これらのこれまでの試み
は、限られた成功をおさめているにすぎない。いくつかの問題が、計算による方
法によるリガンドの設計を妨げている。計算による方法は、結合エネルギーの厳
密な測定ではなくその推定に基づくものであり、生体分子内に存在する複雑な相
互作用と比較した場合の単純な計算に基づくものである。さらに、計算モデルは
実験的な証明を要し、それはしばしば、該モデルが、実際の標的に作用しない偽
陽性であることを明らかにする。

【０００４】さらに、該リガンド-受容体複合体の「像」に基づく実験的な高親和性リガンドの設計は、公知リガンドを既に有する生体分子に限定されている。最近になっ
てようやく、科学者は、有機溶媒と標的生体分子との相互作用の結晶学的研究を
報告した（Allenら, J. Phys. Chem., v. 100, pp.2605-11 (1996)）。しかしな
がら、これらの研究は、リガンド部位ではなく溶媒部位のマッピングに限定され
ている。潜在的リガンドを直接同定すること、および該リガンドが標的生体分子
内でどのようにして結合し変化するのかに関する詳細な情報を得ることが望まし
いであろう。また、ある与えられた標的分子に対する生物学的および／または医
薬的活性を有するリガンドを同定および／または設計するための方法を得ること
が望ましいであろう。

【０００５】（発明の概要）標的生体分子の公知リガンドではない化合物を該標的に対するその結合能に関
してスクリーニングし同定するために、結晶学的方法を用いることができる。該
方法（以下、「CrystaLEAD（商標名）」と称する）は、標的生体分子の結晶を得
、該標的の潜在的リガンドである1以上の試験サンプルに該標的をさらし、リガンド／生体分子複合体が形成されるか否かを判定することを含む。1以上の潜在的リガンドの溶液中に結晶を浸漬（soaking）する又は1以上の潜在的リガンドの
存在下で生体分子を共結晶化（co-crystallizing）するなど（これらに限定され
るものではない）の種々の方法により、該標的を潜在的リガンドにさらす。

【０００６】もう1つの実施形態においては、公知リガンドより強固に結合する、より特異的に結合する、より良好な生物活性を有する又はより良好な安全性プロフィール
を有する新規リガンドを設計するために、見出されたリガンド／受容体複合体か
らの構造情報を用いる。

【０００７】好ましい実施形態においては、リガンドが混合物の一部としてさらされる場合
であってもリガンド-受容体複合体の直接的な同定が可能となるよう、「多様な形状（shape-diverse）」の化合物のライブラリーを使用する。これにより、該混合物からのヒットの、時間のかかるデコンボリューションが不要となる。この
場合、3つの重要な工程が同時に達成される。算出された電子密度関数は、結合事象を直接的に表し、結合化合物を同定し、リガンド-受容体複合体の詳細な3-D
構造を与える。1つの実施形態においては、ヒットが見出されたら、通常のスクリーニング方法により、より強固な結合またはより良好な生物活性に関して該ヒ
ットの多数の類似体または誘導体をスクリーニングすることが可能であろう。も
う1つの実施形態では、より強固な結合またはより良好な生物活性を有する類似体または誘導体を開発するために、標的の構造に関するヒットおよび情報を用い
る。さらにもう1つの実施形態においては、より強力なリガンドを得るために2以
上のヒットが連結されうるよう、リガンド-受容体複合体を潜在的リガンドの追加的な反復（iterations）にさらす。

【０００８】（発明の詳細な記載） CrystaLEAD（商標名）は、標的生体分子に結合する化合物を同定するための効
率的なスクリーニング方法を提供する。そのような化合物は、標的に対する改善
された生物活性を有するリガンドおよび／または薬物を設計するためのリード体
またはスカフォード（scaffold、基礎構造体）として使用しうる。より強固な結
合リガンドが、より良好な生物活性を与えたり、あるいは、より良好な薬物にな
るとは限らないことに注意しなければならない（尤も、これが通則なのではある
が）。強固な結合以外の要因（例えば、選択性、バイオアベイラビリティ）によ
り、より弱い結合リガンドが、より良好な生物活性を与える可能性がある。

【０００９】構造に基づく薬物設計（ドラッグデザイン）のために受容体-リガンド複合体を観察するために、結晶学が広範に用いられている。そのような複合体を観察す
るためには、通常、公知リガンドを該標的分子結晶中に浸漬し、ついで該複合体
の結晶学的方法に付す。適当な結晶を得るためには、時には、該リガンドを該標
的分子と共結晶化する必要がある。

【００１０】結晶学は、詳細な構造情報を提供するにもかかわらず、現在のところ、潜在的
リガンドのスクリーニングには利用されていない。結晶学による化合物のスクリ
ーニングに対する考えられる偏見には、該方法が複雑すぎる又はあまりにも長時
間を要する；適当な結晶を得るのが難しい；入手可能な結晶が2以上の化合物の浸漬に耐えられない（まして、10以上の化合物の混合物の場合はなおさらである
）；あまりにも大量の生体分子が必要となる；それはあまりにも長時間を要する
ため常法により結晶をマウントすることができない；X線ゴニオメーター上で絶えず変化する結晶が余りにも煩わしいという考え方が含まれる。

【００１１】しかしながら、現在利用可能な技術は、認められるこれらの欠点の多くを克服
している。例えば、かつては、分子標的は天然源から得られたにすぎず、それら
は時には、自然分解またはグリコシル化のため、結晶化に適さなかった。また、
それらの天然における濃度がしばしば低すぎたため、結晶化に必要な量の高度に
精製されたタンパク質を得ることができなかった。分子生物学により、結晶化用
に大量のタンパク質を発現させ精製することが可能となった。必要に応じて、異
なる又はより良好な結晶形態を得るために、該タンパク質を再操作することさえ
可能である。

【００１２】さらに、高輝度光源（シンクロトロン放射光）およびより高感度の検出器が容
易に入手可能となったため、データ収集に必要な時間は数日間から数時間へ、さ
らには数分間へと劇的に短縮している。さらに、現在ではそれほど常套的ではな
いが、まもなく常套的になりうる既存の技術は、数秒、さらには数分の1秒のオーダーで完全なデータ・セットの収集を可能にする（例えば、ラウエ回折）（J.
Hajduら, Nature, v. 329, pp. 178-81 (1987)）。より速いコンピューターおよびより多くの自動化ソフトウェアが、データの収集および分析に必要な時間を
著しく短縮した。そしてついに本発明者らは、潜在的リガンドに関してスクリー
ニングするために化合物の混合物を浸漬または共結晶化するのが可能なことを見
出した。したがって、後記のとおり、結晶学は今や、実用的かつ実施可能なスク
リーニング方法となっている。

【００１３】 CrystaLEAD（商標名）においては、小分子の単体または混合物のライブラリー
を標的（例えば、タンパク質、核酸など）にさらすことにより、結晶形態を有す
る標的分子のリガンドを同定する。ついで、推定標的-リガンド複合体の電子密度地図を標的生体分子の電子密度地図と比較するために結晶学的データを得る。
該電子密度地図は、同時に、リガンドの結合の直接的な証拠を与え、該結合リガ
ンドの同定をもたらし、該リガンド-標的複合体の詳細な3-D構造を与える。また
、活性部位におけるリガンドの結合に感受性であることが知られている結晶回折
パターン内の個々の反射の変化により、結合をモニターすることができる。これ
は前スクリーニングとして利用されうるが、それほど詳しい構造情報を与えない
ため、第1選択方法にはならないであろう。

【００１４】また、リガンドの電子密度または或る反射の強度のレベルの変化をリガンドの
濃度（結晶に添加された又は共結晶化におけるもの）の関数として観察すること
により、生体分子に対するリガンドの結合親和性を判定することができる。結合
親和性は、競合実験によっても得ることができる。この場合、新規化合物を、既
知結合親和性を有する一連の多様な形状のリガンドの1つと共に浸漬または共結晶化する。該既知リガンドが電子密度地図中に出現したら、該未知リガンドは、
より弱い結合体である。一方、該新規化合物の1つが該部位に関して競合することが判明すれば、それは最強の結合体であろう。該既知リガンドの濃度または種
類を種々変化させることにより、CrystaLEAD（商標名）のヒットに関する結合定
数を推定することができる。

【００１５】スクリーニングされる化合物の数は、所望の検出限界、化合物の溶解度、およ
び該結晶が許容する共存有機溶媒の量に基づく。厳密な数は各結晶によって異な
る。例えば、1％共存有機溶媒を許容する典型的な結晶では、10個の化合物を同時にスクリーニングするためには該検出限界はKd<1.5mMとなるであろう。20個の
化合物では、該検出限界はKd<0.63mMとなるであろう。しかしながら、高度の共存有機溶媒（例えば、40％）を許容する結晶は、Kd<1.5mMの検出限界内で50個ま
での化合物をスクリーニングしうる。

【００１６】 CrystaLEAD（商標名）の最も一般的な用途においては、ヒットまたはリード化
合物を使用して、構造に基づく設計において生物活性に関して試験すべき化合物
を決定する。ついで最良のリガンドまたは薬物を見出すために通常の医化学的方
法により誘導体および類似体を得る。

【００１７】あるいは、該ヒットの類似体または誘導体の示唆を得るために、スクリーニン
グ過程で収集した構造情報を直接用いることができる。このアプローチは、活性
部位が、種々のサブサイトおよび小さなポケットに囲まれた1つの主要ポケットからなる場合（図1）に例示される。化合物がどのようにして受容体に結合するのかに関する詳細な構造情報はヒットの検出と同時に得られる。そのような情報
は、当業者がより良好なリガンドを設計するのに有用である（P. Colman, Curr. Opin. in Struct. Biology , v. 4, pp. 868-74 (1994); J. Greerら, J. Med. Chem. , v. 37, pp. 1035-54 (1994); C. Verlindeら, Structure, v. 15, pp. 5
77-87 (1994)）。特に、該ヒットは、周囲のサブサイトおよび小さなポケットへ
の接近を可能にする類似体合成のための部位を同定する。これは、より良好に活
性部位にフィットする新規化合物の設計を示唆する。さらに、既存の構造-機能相関が存在する場合には、活性を増強する置換パターンを3-D構造レベルで新規リード・スカフォードに直接的に移すことができる。

【００１８】もう1つの実例（図2）は、通常、断片を収容する2以上の独立したポケットを有する標的に適用される。この場合、該結晶性標的を、該部位のすべてを占有す
るリガンドに関して連続的または同時にスクリーニングする。該結合事象は、共
結晶構造を可視化することによりモニターされるため、リガンド結合の部位は直
接的に同定され、該タンパク質上の異なる部位をリガンドが実際に占有すること
を確認するための競合実験は必要とされない。スクリーニングは、結合部位にお
いて重複する異なるポケットに結合するリガンドを別々に考慮する。第1体の存在下での第2体のスクリーニングは、第2部位における協同的結合を検出するであ
ろう。潜在的リード体および構造-活性相関を確立したら、はるかに強力な新規リガンドを得るために、詳細な構造情報および既に記載されている断片連結アプ
ローチを用いて、該部位のそれぞれの間の連結を設計することができる（S.B. S
hukerら, Science, v. 274, pp 1531-34 (1996); C. Verlindeら, Structure, v
. 15, pp 577-87 (1994)）。

【００１９】第3の適用であるスカフォード・マージング（merging、合体）・アプローチ（
示されていない）においては、該標的活性部位は2以上のサブサイトからなる。該結晶性タンパク質を、これらのサブサイトを介して結合するリガンドに関して
スクリーニングし、相対的なリガンド結合の配向を複数の実験で観察する。これ
らのリガンドは、1以上のサブサイトを占有することにより及び複数のヒットの構造体を覆うことにより結合するはずであり、複数のサブサイトへの接近を促進
するコアを設計することができる。このコアは、薬物-設計サイクルにおけるリード・スカフォードとしても有用な、より強力な新規リード化合物として有用で
あろう。

【００２０】 CrystaLEAD（商標名）連結断片アプローチは、Verlindeら, J. Comput. Aided Mol. Des. , v. 6, pp. 131-47 (1992)において計算レベルでのみ報告されている構造に基づく連結断片アプローチを実験的に実施するものである。Verlindeら
は、数学的計算に基づくリガンド断片を提案した。ついで、提案された断片を結
合活性に関してアッセイした。該断片が実際に結合する場合には、X線結晶学により3-D構造を決定し、リンカーを設計した。これとは対照的に、CrystaLEAD（商標名）は該結合事象を同時に検出し、リガンド-タンパク質複合体の実験的に決定された3-D構造を与える。本発明はまた、標的分子とそのリガンドとの間の会合定数を決定する方法を提供する。本発明は、標的の特別の標識を必要としな
い。したがって、標的分子は、タンパク質、ポリペプチド、核酸、核タンパク質
または適当な他の任意の標的分子（天然源から単離されるもの、または当業者に
より開発され実施されている適当な任意の宿主系から組換え法により単離される
もの）を含みうる。

【００２１】結晶学的スクリーニングには、いくつかの利点がある。1つの重要な利点は、該結合事象が直接的にモニターされるため、偽陽性の可能性がほぼゼロにまで減
少することである。結晶学的データは、いずれの化合物が結合しそれがどのよう
にして結合するのかを示すリガンド-受容体複合体の3次元電子密度の「スナップ
-ショット（snap-shot）」を与える。

【００２２】該方法は、標的およびリガンドの両方の構造変化に対して独特の感受性を示す
。構造変化の観察は、異なるリガンド-標的複合体構造からの情報を組合せるスカフォードの設計において決定的に重要である。そのような一例は、1つのリガンドを収容するためにタンパク質が構造を変化させるが、該構造変化が同時に第
2のリガンドの結合を阻止する場合に認められる。また、同様に、一次スカフォードが、異なる様態で結合する場合には、それらをより大きなスカフォードに合
体させることが不可能かもしれないため、構造変化の検出は重要である。

【００２３】該結合事象は直接的にモニターされるため、CrystaLEAD（商標名）は、リガン
ド会合に対して間接的に感受性となる特別に標識されたサンプル、プローブまた
は標的分子を必要としない。結晶構造が入手されうる限り、リガンドに関してス
クリーニングするためにCrystaLEAD（商標名）を使用することが可能である。

【００２４】化合物混合物が多様な形状となるように適切に設計されている場合には、本発
明は、混合物として浸漬されるライブラリーのデコンボリューションの必要性を
軽減する。なぜなら、該結合事象は、結合部位における電子密度の形状を検査す
ることにより直接的に検出されるからである。したがって、電子密度の形状は、
結合事象および化合物の種類の両方を直接的に同定する。あるいは、異常散乱技
術により同定されうる異常散乱原子（例えば、Br、S）と共に化合物を含有するように該混合物を設計することができる。さらに、CrystaLEAD（商標名）は結合
を直接的にモニターするため、それは、公知リガンドが存在しない場合の標的の
研究に特によく適している。

【００２５】 CrystaLEAD（商標名）において計算された電子密度関数は結晶の「実空間」を
示すため、関心のある領域に直接的に焦点を絞ることが可能である。したがって
、該方法は活性部位に限定されるものではないが、結合は関心のある部位のみに
おいて検出されうる。ほとんどの結合アッセイにおいて分析を複雑にする他の部
位における結合は、考慮対象から完全に除外されうる。

【００２６】 CrystaLEAD（商標名）はまた、種々の位置での結合を同時にモニターする方法
を提供する。すなわち、2以上のポケットを有する標的の場合、第2部位に関する
スクリーニングは第1リガンドの存在下でのスクリーニングを必要としない。しかしながら、第2部位に関するスクリーニングは、協同的リガンドを見出すために第1リガンドの存在下で達成されうる。

【００２７】 CrystaLEAD（商標名）は、結晶構造を得ることができる任意の標的分子に適用
可能である。最新の文献によれば、これには、約5000〜200,000の分子量を有する任意の可溶性巨大分子が含まれる。しかしながら、この範囲は、技術の進歩に
呼応して、ほとんど毎日のように拡大している。該方法はまた、広範な結合解離
定数（<ピコモル〜モル）に対して感受性である。より高感度のCCDカメラ検出器
を使用して、回転対陰極源で約<4時間〜約4時間のうちにデータを収集することができる。これは、検出器1個当たり1日当たり数千個の化合物のスクリーニング
を可能にする。シンクロトロン源を使用すると、スクリーニングされる化合物の
数は検出器1個当たり数千の何倍にも増加し、ラウエ（Laue）データ収集法および試験混合物では、CrystaLEAD（商標名）のデータを1秒未満で収集することが可能であり、それにより、1日当たり1ビームライン当たり数千個の化合物が試験
されるのが可能となる。したがって、複数の検出器または単一のシンクロトロン
ビームラインが、真にハイスループットのスクリーニングを促進する。

【００２８】図3は本発明の概要を示す。標的分子の結晶を、該結晶を浸漬することにより又は該標的を1以上の化合物の存在下で共結晶化することにより1以上の化合物に
さらす。ついで結晶学的データを収集し、処理し、電子密度地図に変換し、それ
をリガンド結合の証拠に関して検査する。リガンド結合を検出するための1つの方法は、元の結晶の構造と、そのさらされた結晶の構造とを比較することである
。

【００２９】新規標的は、公開されている条件により、または当技術分野において十分に確
立された他の方法により結晶化することができる。同様に、標的構造体は、Prot
ein Data Bankなどのデータベースから入手可能であるか、または十分に確立された方法により決定することが可能であろう。分子生物学およびタンパク質工学
における進歩は標的の結晶化を促進し、一方、データ収集における進歩は、未知
構造の標的に関する迅速な構造決定を助ける。

【００３０】浸漬により潜在的リガンドにさらされる結晶は、接近可能な空の活性部位を必
要とする。空の活性部位を有する結晶は、リガンドの不存在下での結晶化、遠位
部位において結合したリガンドの存在下での結晶化、または生体分子が結晶化す
ると標的から容易に希釈または交換される非共有結合性リガンドの存在下での結
晶化を含む（これらに限定されるものではない）種々の方法により得ることがで
きる。本発明者らは、新規方法により、生体分子から結晶を得た。すなわち、活
性部位に分解性リガンドが存在する状態で該生体分子を結晶化し、ついで、結晶
が形成したら該リガンドを分解することにより、該結晶を得た。別法として、ス
クリーニングされる化合物の存在下で結晶を成長させることが可能である。結晶
を該混合物の存在下で平衡化させる。その時点で、該リガンドは、それらの濃度
および結合親和性の関数として結合する。

【００３１】浸漬方法の場合、結晶中のタンパク質の濃度は計算可能であり、リガンドの濃
度は既知量であるため、該方法の感度を簡単な平衡関係により推定することがで
きる。例えば、結晶中の分子量25,000のタンパク質（ウロキナーゼ）の濃度は以
下のとおりに計算される。55 X 53 X 82Å³の容積を有する斜方晶単位格子（すべて角度90°）中には4個の分子が存在する。アボガドロ数を用いると、該濃度は28mMである。したがって、各リガンドについて6mMの濃度を有する化合物の混合物は、Kd<1.5mMの算出検出限界を与えるであろう（該結晶における約80％の占
有率の検出限界を仮定した場合）。

【００３２】また、化合物の混合物を浸漬する場合には、多重占有（関心のある部位に対す
る2以上のリガンドの結合）の問題が生じる。異なるポケット内にリガンドが結合する多重占有の場合には（図2を参照されたい）、別々の部位における結合は電子密度地図により個々に識別されうるため、CrystaLEAD（商標名）による分析
は容易である。同一部位を占有するように種々のリガンドを競合させる計画にお
いては、そのような結合のための要件を計算するために単純な競合阻害モデルを
用いることができる。実験的観察から、結晶学は、1つの阻害剤の占有率が80％であり他方が20％である場合の分析を行ないうると考えられる。したがって、4 より大きな結合親和性比率は、より高い親和性のリガンドのみによる見掛け上の
占有をもたらすであろう。混合物中の2つの化合物の結合定数の比率が4未満とな
るのは考えにくいが、そのような場合には、得られる電子密度は、それらの2つの別々の密度の加重平均となり、同定は困難であろう。したがって、結合親和性
の比率が4未満の場合に限って言えば、該混合物をデコンボリューションするための更なる浸漬実験を行なう（例えば、別々の結晶中で各化合物を個々に観察す
る）ことが必要であろう。これは、少なくとも2つのヒットが該混合物中に存在することが既に確認されているため、それでもなお注目に値し効率的であろう。

【００３３】スクリーニングされる化合物からライブラリーを形成させる。これを考察する
目的においては、ライブラリーは化合物の大混合物（100〜10,000+）であり、一
般的ライブラリーまたは構造指向性（structure-directed）ライブラリーとなり
うる。一般的ライブラリーはランダムである（すなわち、サイズ、形状および機
能において完全に多様性である）。構造指向性ライブラリーは、標的分子の活性
部位内の特定の機能混合物またはサブサイトを標的とする（例えば、標的活性部
位内の正電荷に対して指向性であるカルボキシラート官能性を全化合物が含有す
るライブラリー）。

【００３４】好ましい実施形態においては、どちらのタイプのライブラリーも、多様な形状
の混合物の、より小さなグループに分割される。したがって、混合物は、結晶に
浸漬されうる又は成長しうるライブラリーのサブセットと定義される。それらの
2次元化学構造体の目視検査により又はプログラムでの計算により、該混合物が多様な形状を有することを確認する。該混合物の形状の多様性は、得られる電子
密度地図から結合リガンドが直接的に同定されるのを可能にする（図4を参照されたい）。これは、該混合物のいずれの化合物がヒット（標的に結合しているも
の）であるかを決定するためのフォローアップ実験の必要性を排除する。

【００３５】試験化合物が水溶性である場合には、結晶化に使用する典型的なバッファーお
よび沈殿剤溶液を使用して該混合物を可溶化しそれを結晶中に浸漬することがで
きる。それほど水溶性でない化合物は、最終濃度2Mになるまで適当な有機溶媒中
に個々に溶解する。1つの実施形態においては、それらを100％ DMSO中に溶解し、4℃で保存し、該DMSOストックを混合することにより混合し、ついで該結晶にさらす。これらの混合物は、結晶の成長のための条件が有機溶媒を含まない場合
のほとんどの結晶系に有用であろう。該化合物を、典型的には、最終濃度1〜10 ％のDMSOに浸漬し、予め決められた時間（4〜24時間）にわたり結晶性タンパク質と共に平衡化させる。このような計画においては、各結晶を浸漬混合物当たり
複数の化合物にさらす。いくつかの結晶成長条件は、典型的にはアルコール誘導
体である高濃度の有機溶媒（40〜50％）を含みうる。この場合、該化合物ライブ
ラリーを、浸漬実験のための最終的な共存溶媒濃度40〜50％を与えうる結晶化有
機溶媒中に溶解することができる。この場合、浸漬混合物当たりの化合物の数は
増加しうるであろう。

【００３６】浸漬後、該浸漬混合物中の5〜20％グリセロールなどの凍結保護物質に各結晶をさらし、ナイロンループ中でマウントし、冷窒素流下でX線ユニット上に配置する。該結晶研究は、室温または他の適当な条件（該結晶の安定性のための必要
性に応じて）においても行なうことができる。該方法のこの工程を促進するため
に、結晶のマウントおよび充填のための自動装置を使用することができる。

【００３７】結晶学的データを収集し、処理する。この場合、回折パターン上の各反射（斑
点）を指数（h、k、l）に帰属し、該強度を該フィールド内の基準値として測定する。X線源は、非常に高速の回折データ収集を可能にする実験室用X線発生装置
または高輝度シンクロトロン源であってもよい。特に、実験室内でのデータ収集
は、結晶あたり30分間〜数時間を要するかもしれないが、該時間はシンクロトロ
ン源の使用により減少させることができる。結晶当たりのデータ収集は、ラウエ
（Laue）データ収集計画を用いて数分の1秒にまで減少させることが可能であろう。

【００３８】ついで、当業者によく知られた方法により、該回折データを電子密度地図に変
換する。該電子密度地図はリガンドおよび／標的生体分子の3-D像である。

【００３９】 Fo-Fc地図の場合、リガンドが結合していない既知結晶構造から得られた算出構造-因子振幅（|Fc|）を、実測振幅（|Fo|）から引き算する。したがって、この地図は、ライブラリー混合物の存在下で浸漬した結晶から得られたデータから
、天然タンパク質構造から得られたデータを直接引き算したものを表す。その結
果は、正および負のピークを有する電子密度地図である。CrystaLEAD（商標名）
に関連したピークは、標的上の関心のある部位におけるリガンドの結合（すなわ
ち、該標的生体分子に対する該リガンドの付加）の直接的な結果である正のピー
クである。図3において、該Fo-Fc地図は、ウロキナーゼの活性部位における大き
な正のピークを明らかに示している。該ピークの形状は、リガンドである2-アミ
ノ-8-ヒドロキシキノリンに対応する。該リガンドは正差（positive difference
）密度を占有することが示されている。その他の正のピークは、結合しているス
ルファート部分（SO₄ ^2-で示されている）および結合している水分子（H₂Oで示さ
れている）に対応する。このタイプの地図は、小さな構造変化（△で示されてい
る）（これは、2Fo-Fcと共に用いられた場合には全リガンド-タンパク質複合体の詳細な構造の決定を可能にする）にも非常に敏感である。2Fo-Fc地図を計算す
るためには、2(|Fo|)から(|Fc|)を引き算する。この場合、該地図は正であり、該分子の全原子に関する密度を有する。

【００４０】図3においては、該地図の検査から、結合している化合物の種類および構造が示される。好ましくは、Fo-Fc地図において見出されうる正の密度を識別するために、さらされた結晶の地図を、さらされていない標的分子の地図と比較する。
時には、結合リガンドの不存在下、水分子が結晶中の活性部位を占有する。これ
は容易に識別される。なぜなら、結合した水分子は、しばしば、水素結合と一致
した幾何配置で配向し、また、それらは、共有結合の網目構造により連結されて
いないからである。したがって、得られる地図は、有機化合物ではなく結合溶媒
を示す不連続性となる傾向にある。Fo-Fcまたは2Fo-Fc地図における密度が有機化合物を表すことを確認したら、その3次元の形状を、ライブラリー中に存在する化合物のものと比較し、最もよく適合するマッチを得る。あるいは、QUANTA（
Molecular Simulations Inc., Quanta Generating and Displaying Molecules,
San Diego: Molecular Simulations Inc., 1997）のXFITモジュールなどのプログラムは、この過程を自動化しうる。

【００４１】回折強度を測定または処理する能力の向上に伴い、電子密度地図上での比較を
行なう必要がないかもしれない。さらされた結晶の回折パターンを、さらされて
いない結晶のものと単に比較することにより、結合を検出することが可能である
。したがって、この前スクリーニング過程において結合事象が検出される場合に
のみ、電子密度地図を作成すればよいのである。

【００４２】前記のとおり、CrystaLEAD（商標名）は、結晶学的構造を得ることができる任
意の生体分子標的に適用することができる。その広範な適用可能性のため、それ
は後記の実施例により最もよく例示される。

【００４３】ウロキナーゼおよびVanXの実施例は、CrystaLEAD（商標名）の使用に関する2 つの筋書きを表す。ウロキナーゼの場合、再操作されたマイクロUK（μUK）結晶
は、非常によく回折し、高い対称空間群に属する。これとは対照的に、VanX結晶
は、それより弱く回折し、より低い対称性を有する。したがって、VanXは、より
長いデータ収集時間を要する。また、ウロキナーゼ結晶は、非対称単位中に1個の分子を有するが、VanXは6個の分子を有する。より大きな非対称単位は、より高分解能のデータの収集を要し、地図の検査をより面倒なものにする。しかしな
がら、VanXの場合、CrystaLEAD（商標名）により見出される以前には、非基質類
似結合体は全く知られていなかった。したがって、CrystaLEAD（商標名）は、薬
物発見サイクル内に供給される新規非ペプチド性リード化合物を提供したことに
なる。ウロキナーゼの場合には、CrystaLEAD（商標名）は、新規一次スカフォー
ドを提供した。出願人は、公知ウロキナーゼリガンドと比べて改善されたバイオ
アベイラビリティを有する、より高い親和性の誘導体を設計するために、既存の
SARおよび結晶構造を用いることにより、一次スカフォードの効力を迅速に増加させることができた。

【００４４】しかしながら、これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示するもの
であり、特許請求の範囲および本明細書を限定するものではない。本発明の範囲
および精神から逸脱することなく、特定されている実施形態に変更および修飾を
施しうることは、当業者に容易に理解されるであろう。最後に、本明細書中のす
べての引用文献を参照により本明細書に組み入れることとする。

【００４５】（実施例）実施例1：ウロキナーゼウロキナーゼ（セリンプロテアーゼ）は腫瘍細胞と深く関連している。ウロキ
ナーゼはプラスミノーゲンを活性化してプラスミンにし、今度はこれがマトリッ
クスメタロプロテアーゼを活性化する。プラスミンおよび該メタロプロテアーゼ
は、細胞外マトリックスを分解し、腫瘍の増殖および転移を促進する。したがっ
て、特異的にウロキナーゼを標的とする阻害剤は、有効な抗癌剤として有用とな
りうる。

【００４６】ヒトプロウロキナーゼは411アミノ酸よりなる（図5）（Verdeら, Proc. Nat’ l Acad. Sci. , v. 81(5), pp. 4727-31 (1984); Nagaiら, Gene, v. 36(1-2), p
p.183-8 (1985)）。該酵素は、Lys¹⁵⁸-Ile¹⁵⁹ペプチド結合におけるタンパク質分解切断により活性化されると、単一のジスルフィド架橋（Cys¹⁴⁸-Cys²⁷⁹）により連結された2本の鎖になる。A鎖（残基1-158）は、EGF様ドメインおよびクリ
ングルドメインを含有する。B鎖（残基159-411）は、触媒セリンプロテアーゼド
メインを含有する。ウロキナーゼの更なるインキュベーションは、Lys¹³⁵-Lys¹³ ⁶ ペプチド結合における追加的なタンパク質分解切断をもたらして低分子量ウロキナーゼを形成する。共有結合性阻害剤であるGlu-Gly-Argクロロメチルケトンと複合化したこの酵素の結晶形態を、Spraggonら, Structure, v 3, pp. 681-91
(1995)により得た。それは、高エネルギーシンクロトロン源において2.5Åの分
解能に回折されることが示された。しかしながら、これらの結晶の劣悪な回折特
性は、共有結合した阻害剤の存在と共に、CrystaLEAD（商標名）の適用を困難に
した。

【００４７】 μUK結晶の調製および構造 CrystaLEAD（商標名）を実施するために、ヒトウロキナーゼを再操作して、B 鎖の残基159-404のみからなるものにした。この場合、Asn³⁰²をグルタミンで置換してグリコシル化部位を除去し、Cys²⁷⁹をアラニンで置換して遊離スルフヒド
リル部分を除去した。この形態のウロキナーゼ（μUK）は完全に活性であること
が示され、CrystaLEAD（商標名）に適合する結晶形態で結晶化することが判明し
た（1992年5月12日付け発行のHeynekerらの米国特許第5,112,755号も参照された
い）。

【００４８】ベクター構築物pBC-LMW-UK-Ala²⁷⁹の調製ヒトUKの突然変異体をジシストロニック（dicistronic）細菌発現ベクターpBC
FK12（Pilot-Matiasら, Gene, v. 128, pp. 219-25 (1993)）内にクローニングした。以下のオリゴヌクレオチドを使用して、PCRにより種々のUK突然変異体を作製した。

【００４９】

【化１】

【００５０】標準的なPCR反応においてヒトUK cDNAを鋳型として、配列番号1および2をプラ
イマーとして使用して、低分子量UK（以下、LMW-UKと称される）（L¹⁴⁴-L⁴¹¹）の初期クローニングを行なった。PCR増幅した該DNAをゲル精製し、制限酵素SalI
およびHindIIIで消化した。ついで該消化産物を、同じ2つの酵素で予め切断され
たpBCFK12ベクター内に連結して、発現ベクターpBC-LMW-UKを得た。該ベクターをDH5α細胞（Life Technologies, Gaithersburg, MD）内に形質転換し、単離し
、該配列をDNA配列決定により確認した。細菌内でのLMW-UKの産生をSDS-PAGEおよびザイモグラフィー（Granelli-Pipernoら, J. Exp. Med., v 148, pp. 223-3
4 (1978)）（これは、UKによるプラスミノーゲンの活性化を測定するものである
）により分析した。LMW-UKが大腸菌（E. coli）内で発現されたこと、およびそれがザイモグラフィーアッセイにおいて活性であったことが、クーマシーブルー
染色ゲルにより示された。

【００５１】大腸菌（E. coli）内でのLMW-UKの迅速な発現および検出の成功は、UKの最小機能構造を決定するためにUKの突然変異誘発分析を行なうことを可能にした。Cy
s²⁷⁹からAla²⁷⁹への置換を有する1つの突然変異体を、配列番号2および3を使用するPCRにより作製した。該PCR産物をAviIIおよびHindIIIで切断し、それを使用
してpBC-LMW-UK構築物中のAviIIおよびHindIII断片を置換した。得られたpBC-LM
W-UK-Ala²⁷⁹構築物を大腸菌（E. coli）内で発現させた。該産物はサイモグラフ
ィーにおいて活性であることが示された。

【００５２】バキュロウイルス内でのμUK（μUK(UK(I¹⁵⁹-K⁴⁰⁴)A²⁷⁹Q³⁰²）のクローニングおよび発現 μUK（Ala²⁷⁹Gln³⁰²を含有するUKアミノ酸Ile¹⁵⁹-Lys⁴⁰⁴）を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用するPCRにより作製した。

【００５３】

【化２】

【００５４】 UK内のグリコシル化部位（Asn³⁰²）のみを突然変異させるために、オリゴヌク
レオチドプライマー配列番号4および6ならびに配列番号5および8を、pBC-LMW-UK
-A²⁷⁹を鋳型として使用する2つのPCR反応において使用した。それらの2つのPCR 産物を制限酵素PvuIIで切断し、T4 DNAリガーゼで連結し、それを鋳型として使用してLMW-UK-A²⁷⁹-Q³⁰²を作製した。一方、鋳型として天然UK cDNAを使用する配列番号7および9でのPCRにより、天然UKリーダー配列をIle¹⁵⁹に直接的に融合させた。

【００５５】鋳型としてLMW-UK-A²⁷⁹-Q³⁰² DNAを使用する新たなPCR反応において、配列番号8と共にこのPCR産物をプライマーとして使用して、μUK cDNAを作製した。μU
KをNheIで切断し、同じ酵素で切断されたバキュロウイルス導入ベクターpJVP10z
（Vialardら, J. Virology, v. 64 (1); pp. 37-50, (1990)）に連結した。得ら
れた構築物pJVP10z-μUKを標準的なDNA配列決定技術により確認した。

【００５６】構築物pJVP10z-μUKを、Pharmingen（San Diego, CA）からのBaculoGoldキットを使用するリン酸カルシウム沈降法によりSf9細胞内にトランスフェクトした。活性なμUKの活性が該培地内で検出された。μUKを発現する単一の組換えウイ
ルスを標準的な方法によりプラーク精製し、該ウイルスの大きなストックを作製
した。

【００５７】 μUKの大規模な発現を、懸濁液中の別の昆虫細胞系High-Five細胞（Invitroge
n, Carlsbad, CA）内で行なった [80rpm、28℃で振とうしながら、2リットルフラスコ中のExcel 405無血清培地（JRH Biosciences, LeneXa, KS）中で増殖させ
た]。High-Five細胞を2 X 10⁶細胞/mlまで増殖させ、組換えμUKウイルスを0.1 の感染多重度で加え、該培養を3日間継続した。該培養上清を、精製用の出発物質として集めた。該培養上清中のμUKの活性を、発色性UK基質S2444（Claesonら
, Haemostasis, v 7, p. 76 (1978)）のアミド分解（amidolysis）により測定し
たところ、それは6〜10mg/リットルであった。

【００５８】ピチア・パストリス（Pichia pastoris）内でのμUKの発現ピチア（Pichia）内でμUKを発現させるために、合成リーダー配列を有する発
現ベクターを使用した。組換えタンパク質の分泌のための合成リーダー配列を含
むようにベクターpHil-D2（Invitrogen）を修飾することにより、ピチア（Pichi
a）発現ベクターpHil-D8を構築した。該リーダー配列：

【００５９】

【化３】は、KEX2切断のためのプロ-ペプチド配列（太字で示されている）に作動的に結合したPHO1分泌シグナル（一重下線で示されている）をコードしている。pHil-D
8を構築するために、鋳型としてpHil-S1（Invitrogen）使用してPCRを行なった。なぜなら、このベクターは、PHO1をコードする配列、pHil-S1のヌクレオチド5
09-530に対応するフォワードプライマー（配列番号11）、およびPHO1分泌シグナ
ルの後半部分をコードするヌクレオチド（配列番号10のヌクレオチド45-66）および該プロ-ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号10のヌクレオチド67-108）を有するリバースプライマー（配列番号12）を含有するからであ
る。該プライマー配列（Operon Technologies, Inc. Alameda, CAから入手）は以下のとおりであった。

【００６０】

【化４】

【００６１】標準的なPCR条件下で増幅を行なった。該PCR産物（約500bp）をゲル精製し、B
lpIおよびEcoRIで切断し、同じ酵素で切断されたpHil-D2に連結した。該DNAを大
腸菌（E. coli）HB101細胞内に形質転換し、制限酵素消化および配列分析により
陽性クローンを同定した。適切な配列を有する1つのクローンをpHil-D8と命名し
た。

【００６２】ついで、pHil-D8内へのクローニングのためにμUKを増幅するために、以下の2
つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。

【００６３】

【化５】

【００６４】鋳型としてpJVP10z-μUKを使用して配列番号13および14で該PCR産物を得た。該増幅産物をBamHIおよびXhoIで切断し、同じ2つの酵素で切断されたpHil-D8に連結した。得られたプラスミドpHilD8-μUKをDNA配列決定により確認し、それを
使用して、ピチア（Pichia）株GS115（Invitrogen）を該供給業者の説明書に従い形質転換した。形質転換されたピチア（Pichia）コロニーを、供給業者（Invi
trogen）が詳述しているとおりにBMGY培地内で増殖させBMMY培地内で発現させる
ことにより、μUKの発現に関してスクリーニングした。該μUK活性を発色基質S2
444で測定した。ピチア（Pichia）内でのμUKの発現レベルは、バキュロウイルス-High Five細胞内で認められるものより高く、30〜60mg/Lであった。

【００６５】 μUKの精製 High Five細胞またはピチア（Pichia）の培養上清を20リットルの容器内にプールした。プロテアーゼ阻害剤ヨードアセトアミド、ベンズアミジンおよびEDTA
を、それぞれ10mM、5mMおよび1mMの最終濃度になるまで加えた。ついで該上清を
、5mM Hepesバッファー（pH7.5）を加えることにより5倍希釈し、1.2μおよび0.
2μフィルターメンブランに通した。Sartoriusメンブラン吸着剤S100（Sartoriu
s, Edgewood, NY）上への該μUKの捕捉を、50〜100ml/分の流速で該メンブランに通すことにより行なった。10mM Hepesバッファー（pH7.5）、10mMヨードアセトアミド、5mMベンズアミド、1mM EDTAでの十分な洗浄の後、10mM Hepesバッファー（pH7.5）、10mMヨードアセトアミド、5mMベンズアミド、1mM EDTA中のNaCl
勾配（20mM〜500mM、200ml）でS100メンブランからμUKを溶出した。該溶出液（
〜100ml）を、阻害剤を含有する10mM Hepesバッファー中で10倍希釈し、S20カラ
ム（BioRad, Hercules, CA）にローディングした。μUKを20xカラム容積のNaCl 勾配（20mM〜500mM）で溶出した。該溶出バッファー中では阻害剤を使用しなかった。ついで該溶出液を10mM Hepesバッファー（pH7.5）で5倍希釈し、ヘパリン
-アガロース（Sigma）カラムにローディングした。μUKを10mM〜250mMのNaCl勾配で溶出した。μUKのヘパリンカラム溶出液（〜50ml）を、10mM Hepesバッファ
ー（pH7.5）、200mM NaClで平衡化したベンズアミジン-アガロース（Sigma, St.
Louis, MO）カラム（40ml）にアプライした。ついで該カラムを該平衡化バッフ
ァーで洗浄し、50mM NaOAc（pH4.5）、500mM NaClで溶出した。該μUK溶出液（〜30ml）を限外濾過により4mlに濃縮し、20mM NaOAc（pH4.5）、100mM NaClで平
衡化されたSephadex G-75カラム（2.5x48; Pharmacia (登録商標) Biotech, Upp
sala, Sweden）にアプライした。μUKを含有する単一の主ピークを集め、最終産
物として凍結乾燥した。該精製物質は単一の主バンドとしてSDS-PAGE上に出現し
た。

【００６６】高品質のμUK結晶は、1.0Åの分解能までのX線結晶学によるそのアポ-3次元構
造の決定を促進した。結晶はハンギングドロップ蒸気拡散法により得た。典型的
なウェル溶液は、0.15M Li₂SO₄、20％ポリエチレングリコール（MW 4000）およびコハク酸バッファー（pH4.8〜6.0）よりなるものであった。カバーガラス上で
、2μlのウェル溶液を2μlのタンパク質溶液と混合し、該ガラスをウェル上で密
封した。結晶化は約18〜24℃で24時間以内に生じた。該タンパク質溶液は、1％
DMSO共存溶媒と共に10mMクエン酸塩（pH4.0）、3mM ε-アミノカプロン酸 p-カルボエトキシフェニルエステルクロリド（阻害剤）中の6mg/ml（0.214mM）にμU
Kを含有していた。該共結晶化において使用した阻害剤は活性部位のセリン195を
アシル化し、ついで酵素により脱アシル化されると考えられる。なぜなら、この
化合物の存在下で成長した結晶の3-D X線構造は、該酵素活性部位内に残存する阻害剤を示さないからである（Menegattiら, J. Enzyme Inhibition, v. 2, pp
249-59 (1989)）。存在する唯一の密度は、結合溶媒分子によるものである。μU
Kは該阻害剤の不存在下では結晶化しないため、準安定性阻害剤:UK複合体が結晶
化体であると考えられる。重要なのは、得られたμUK結晶が、空の活性部位を有
する酵素からなることである [これは、CrystaLEAD（商標名）の実施に理想的な
ものである]。

【００６７】これらの条件下で得られた結晶は、a=55.16Å、b=53.00Å、c=82.30Åおよび α=β=γ=90°の単位格子寸法を有する空間群P2₁2₁2₁に属する。それらは、回転
対陰極源上で1.5Å以上にまで回折した。さらに、Cornell Energy Synchrotron
Source（Ithaca, New York）においては、1.0Åの分解能のネイティブ・データ・セットが収集されている。検索プローブとしての低分解能ウロキナーゼ構造（
Spraggonら, Structure, v 3, pp. 681-691 (1995); PDB entry 1LMW）と共にAM
OREプログラム（Navaza, J. Acta Cryst., A50:157-163 (1994)）を使用する分子置換法により、該結晶構造を決定した。該構造を、XPLORプログラムパッケージ（A. Brunger, X-PLOR (version 2.1) Manual, Yale University, New Haven
CT (1990)）を使用して精密化した。

【００６８】弱塩基に関するスクリーニング好ましい薬物動態学的特性を有する新規一次スカフォードを見出すために、該
μUKを構造指向性ライブラリーに対してスクリーニングした。ウロキナーゼの活
性部位は、アスパラギン酸（Asp¹⁸⁹）の形態で遊離カルボキシラート部分を含有
する1個の主要ポケットからなるため、最もよく知られたスカフォードは強塩基性であり、アミジンまたはグアニジン部分を含有する。該塩基性基は、水素結合
によりAsp¹⁸⁹と塩結合することが判明している。これは薬理学的に問題となりう
る。なぜなら、強塩基は経口バイオアベイラビリティを減少させることが知られ
ているからである。したがって、ウロキナーゼの結合体であることが未だ知られ
ていない化合物を含有する弱塩基性ライブラリーを選択した。

【００６９】約1〜9のpKaを有する61個の化合物を含有する弱塩基ライブラリーを、アベイラブル・ケミカル・ディレクトリー（available chemical directory）（ACD）内に配置した。該ライブラリーを、2次元化学構造の目視検査による判定で約6〜
7個の多様な形状の化合物の混合物9個に分解した。該化合物混合物を前記の方法
によりスクリーニングした。具体的には、各化合物を100％ DMSOに溶解して最終
濃度約2M（あるいは、それほど可溶性でない場合には飽和）にした。該混合物を
含む6または7個の化合物のそれぞれの等容積を、各個の化合物の最終濃度が0.33
Mになるまで混合した。μUK単結晶を50mlの27％ PEG4000、15.6mMコハク酸（pH5
.4）、0.17M Li₂SO₄中に配置し、該化合物混合物の0.5〜0.8mlを加えて1〜1.6％
DMSOおよび各個の化合物の最終濃度3.3〜5.2mMとした。これらの条件下、該実験の感度は、Kd<1.0mMの結合体を検出すると予想される。結晶を、約8〜24時間、平衡化させた。

【００７０】 RAXISIIまたはMARイメージ・プレート・デテクター（image plate detector）
を有するRigaku RTP 300RC回転対陰極源上でデータを収集した。典型的なデータ
は、2〜5分間の暴露で45〜50 2°の振動よりなるものであった。典型的なデータ
は、13〜26％のマージング（merging）R因子で2.0〜3.0Åの分解能で70〜90％完
全であった。したがって、データの質は、迅速なデータ収集プロトコールにより
適正ないしは劣悪なものとなった。しかしながら、主として、1.5Åの分解能（R
=20.7% R_free=25.3%）にまで精密化されている出発モデルの質が高いことから、
データのこのような質は結合体の検出に適当であることが示された。データをDE
NZOプログラムパッケージ（Otwinowskiら, Methods in Enzymology, 276 (1996)
）により処理し、電子密度をXPLORパッケージにより計算した。

【００７１】 QUANTA 97プログラムパッケージ（Molecular Simulations Inc., Quanta Gene rating and Displaying Molecules , San Diego: Molecular Simulations Inc.,
1997）を使用して、Silicon Graphics INDIGO2ワークステーション上で電子密度
地図を検査した。活性部位における密度の形状を、陽性ヒットを示す混合物中の
化合物の1つ（以上）から生じたもの又は結合の不存在を示す秩序だった水分子から生じたものとして視覚的に同定した。陽性ヒットを与えた実験に関しては、
適当な化合物を該電子密度中に視覚的に移動させた。また、該電子密度地図を該
タンパク質構造中のいずれかの変化に関して調べ、認められれば、適当な修飾を
施した。したがって、該地図検査／化合物フィッティングの工程の後、該化合物
:タンパク質複合体の3次元構造が判明した。該スクリーニングは尚も小規模であ
ったため、このウロキナーゼの実施例では該密度中への該化合物の視覚的な移動
を利用した。より大規模な化合物のスクリーニングに拡張する場合には、QUANTA
のXFITモジュールなどの市販のプログラムが該密度に対する該化合物の自動的フ
ィッティングを促進するであろう。

【００７２】

【化６】

【００７３】図6は、陽性ヒットの一例を示す。スクリーニングした化合物には1〜6の番号が付されており、活性部位におけるFo-Fc電子密度地図は図6Aに示されている。該密度の形状は、該結合体を化合物5と同定した。図6Bは、CrystaLEAD（商標名）電子密度地図の解釈により直接的に得られた主要特異性ポケット中の化合物の
詳細な結合様式を示す。該アミノ窒素はAsp¹⁸⁹のカルボキシルと水素結合してお
り、該ピリミジル窒素はバックボーンカルボニル（Gly²¹⁸）と水素結合している
。また、該構造は、修飾のための理想的な部位が該ピリジルメチルであることを
示している。

【００７４】

【化７】

【００７５】化合物（化合物7〜13）のもう1つの混合物は、いずれのヒットも与えなかった
。この化合物群を浸漬した後で得られた電子密度地図は、この混合物中の試験化
合物のいずれにも対応しなかった。その代わりに、それらは結合溶媒分子に対応
した。図6Cを参照されたい。

【００７６】

【化８】

【００７７】図7は、陽性ヒットのもう1つの具体例を示す。スクリーニングした7個の化合物（14〜20）のうち化合物19が結合していることを、図7Aに示すFo-Fc地図は示している。図7Bに示す結合様式は、該2-アミノがAsp189の側鎖と水素結合してい
ること、および該8-ヒドロキシルが、隣接する疎水性サブポケット（図7Bにおい
てはS1βとして示されている）に接近するための置換のための理想的な部位であ
ることを示している。図8は、もう1つのヒットを表し、この場合、化合物22（5-
アミノインドール）（図8A）は、該アミノ基がAsp189と水素結合することにより
ウロキナーゼに結合することが判明した（図8B）。スクリーニングした化合物は
化合物21〜27であった。

【００７８】

【化９】

【００７９】図9は、同じ混合物（化合物28〜34）からの2つの化合物が、多重占有の問題を
伴うことなく結合することが判明した一例を示す。該全化合物混合物の存在下で
該結晶を浸漬した初期実験においては、化合物28が結合することが判明した（図
9A）。さらに、より弱い結合性化合物31を別個に浸漬したところ（CrystaLEAD（
商標名）により確立された先の構造活性相関に基づく）、それもまた結合するこ
とが判明した（図9B）。より典型的な該方法の適用においては、所望により、該
混合物中の、より弱い結合体を検出するために、より強固な結合体の不存在下で
ライブラリーを再浸漬することになろう。

【００８０】

【化１０】

【００８１】表1に、ピロGlu-Gly-Arg-pNA/HCl（S-2444, Chromogenix）の発色活性により測定した、CrystaLEAD（商標名）のヒットのそれぞれに関する阻害定数を要約す
る。アッセイはpH6.5（0.1M NaPO₄）および7.4（50mM Tris）にて完了した。他のアッセイ条件は、150mM NaCl、0.5% Pluronic F-68界面活性剤、200mM S-2444
、および最終濃度2.5％のDMSOであった。該基質のKmは55μMであることが確認さ
れた。

【００８２】

【表１】

【００８３】活性および構造情報に基づき、化合物19をリード化合物として選択した。結晶
学的情報は、8位における置換が隣接疎水性ポケット（S1β）ポケットへの接近を可能にし従って効力の増強をもたらすはずであることを示した。一連のアミジ
ンに基づく結晶学的および結合情報に基づき、化合物35（化合物19の8-アミノピ
リミジニル類似体）を合成した。この修飾は、pH6.5（Ki pH7.4=2.5μM; Ki pH6
.5=0.32μM）における結合効力の約200倍の増加をもたらした。該実験は、Cryst
aLEAD（商標名）がリード・スカフォード、および構造に基づく薬物設計を介してそのスカフォードをより強力な化合物に精密化するのに必要な詳細な構造情報
の両方を与えうることを示している。

【００８４】

【化１１】

【００８５】図10は、結晶化合物35:ウロキナーゼおよび親化合物19の重ね合せを示す。該重ね合せは、該アミノピリジン環が、予想されたとおりに該疎水性サブポケット
（S1β）ポケット内に結合しており、この置換がこの部位への該キノリン環の移
動をもたらすことを示している。

【００８６】また、化合物35（8-アミノピリミジニル-2-アミノキノリン）を経口バイオアベイラビリティに関して試験した。化合物35は、10mg/kgの用量で投与された場合にラットにおいて30〜40％の経口バイオアベイラビリティを有することが確認
された。したがって、CrystaLEAD（商標名）の実施の成功は、200倍の効力増加を有する化合物を構造に基づく薬物設計の1サイクルにより与え経口バイオアベイラビリティを有することが判明した新規リード・スカフォードを与えた。

【００８７】実施例2：VanX バンコマイシンは、β-ラクタム抗生物質に耐性の連鎖球菌またはブドウ球菌株が引き起こす感染症の場合に選択される薬物である。しかしながら、最後の頼
みの綱であるこの薬物にも今や、バンコマイシン耐性菌株が見出されている。幾
人かの研究者は、VanX（メタロプロテイナーゼ）をバンコマイシン耐性と関連づ
けている。VanXは、D-Ala-D-ラクタートによる細菌ペプチドグリカン鎖の末端D-
Ala-D-Ala部分（バンコマイシンに対する結合部位）の置換を引き起こすカスケードの一部である。これは、バンコマイシンの結合における1000倍の減少を引き
起こす。VanXの唯一の公知阻害剤は、ペプチドまたはペプチド誘導体、例えば、
D-Ala-D-Ala基質のホスホナートまたはホスフィナート類似体である。それら自体は、インビボで代謝および／または分解されるため、適当な薬物ではない。通
常のスクリーニング法により適当な薬物を見出すための初期の試みは、適当なリ
ガンドを明らかにしなかった。ついで、本出願人は、これらの耐性株に対する治
療に向けた薬物開発のために非ペプチド性リード化合物を見出すために、Crysta
LEAD（商標名）を使用した。

【００８８】 VanXの調製 vanX遺伝子がIPTG誘導性tacプロモーターの制御下にありプラスミドpGW1を含有する大腸菌（E. coli）W3110を、アンピシリン（100μg/ml）を含有するLB培地中、595nmで約1.3〜1.5の吸光度になるまで37℃で増殖させた。ついでIPTGを最終濃度0.8mMまで加え、該細胞を更に1.5時間増殖させた。

【００８９】細胞を6000rpmで10分間の遠心分離により回収した。ついで該ペレットを、0.0
1% NaN₃、1mM MgCl₂、1mM PMSF、1mM DTT（バッファーA）および25単位/mlのベンゾナーゼ（Nicomed Pharma, Copenhagen, Denmark）を含有する氷冷20mM Tris
-HCl（pH8.0）に再懸濁した。Bead Beater（Biospec）（超音波ビードミル）における1〜3分間の運転により、0.1ミクロンのジルコニア・セラミック・ビーズを該ライセート混合物（1:1 v:v）に加えることにより該細胞を溶解した。該Bea
d Beaterは、冷却ライセートを維持するための氷が充填されたリザーバーを用い
て作動させた。ついで、沈降したガラスビーズから該ライセートをデカントによ
り取り出した。ついで該ビーズを1〜2容積の溶解バッファーでリンスし、該洗液
を元のライセートと共にプールした。該ライセートを25000gで30分間遠心分離し
て細胞残渣を沈降させた。該上清を、50mM Tris-HCl（pH7.6）、1mm EDTAおよび
1mM DTT（バッファーB）中、4℃で一晩透析した。

【００９０】ついで、該透析ライセートを、4ml/分の速度でバッファーA中で予め平衡化されたQセファロース・ファーストフロー（fast flow）カラム上にローディングし
た。該カラムをバッファーAで、ついでバッファーBからバッファーB+0.5M NaCl への直線勾配で十分に洗浄した。この工程からの活性なVanX画分をプールし、濃
縮し、ついでバッファーB中のSuperose-75カラムにアプライした。ついで該Supe
roseカラムでの実施からのVanX画分を、2ml/分の流速でバッファーA中のSource-
Qカラムにアプライした。該カラムを出発バッファーで数カラム容積にわたり洗浄した。ついで該VanXタンパク質を、バッファーAからバッファーA+25mM NaClへ
の浅い勾配で溶出した。この最終工程からの活性VanX画分をAmiconフィルターで
バッファーA中約15mg/mlの最終濃度にまで濃縮した。特に示さない限り、前記の
操作は4℃で行なった。精製された該VanXタンパク質は純度約95％であり、容易に結晶化した。

【００９１】 VanXの結晶構造 VanXの結晶構造を、多重同形置換（Bussiereら, Molecular Cell, Vol. 2, pp
75-84 (1998)）により2.2Åの分解能で決定した。前記で得た組換えタンパク質
を、シッティング・ドロップ（sitting drop）蒸気拡散法により空間群P2₁として結晶化した。典型的な結晶は、a=83.4Å、b=45.5Å、c=171.4Å、α=γ=90° 、β=104°の単位格子寸法を有し、該非対称単位内に6個の分子を有していた。典型的なウェル溶液は、0.1M Mes（pH6.4）、0.24M硫酸アンモニウムおよび20％
PMME 5000よりなる。該シッティング・ドロップ・マイクロブリッジ（sitting
drop microbridge）（Hampton USA）上で、2mlのタンパク質を2mlのウェル溶液と混合し、該チャンバーをカバーグラスで密封する。結晶は18℃で生じ、該結晶
は約2〜3日で完全なサイズに成長する。該タンパク質溶液は、10mM Tris、15mM
DTT（pH7.2）中の12〜15mg/ml（0.5〜0.6mM）のVanXからなる。これらの条件下で成長した結晶の3-D構造は空の活性部位を示し、これは、この系をCrystaLEAD （商標名）の適用に非常に適したものとする。

【００９２】該VanX活性部位は、D-Ala-D-Ala基質を収容しうる広がったポケットを有する。また、該ポケットは触媒性亜鉛を有する。したがって、この場合、単一のリー
ド化合物に合体しうる複数の結合スカフォードを見出すために、最初に、VanXを
亜鉛指向性ライブラリーに対してスクリーニングした。亜鉛に対して指向性のア
ミノ酸、チオール、ヒドロキシアミノ酸またはカルボキシラート部分を用いる3 個のライブラリーのスクリーニングを行なった。

【００９３】スクリーニング該アミノ酸ライブラリーは、光学的に純粋な商業的に入手可能な天然および非
天然に生じるアミノ酸の102個の化合物よりなるものであった。該ライブラリーを、多様な形状の8〜10個の化合物の混合物12個に分割し、前記の方法によりスクリーニングした。具体的には、各化合物を100％ DMSOに溶解して最終濃度2M（
あるいは、それほど可溶性でない場合は飽和）にした。各混合物の各化合物の等
容積を混合して個々の化合物の最終濃度を0.33Mとした。VanX単結晶を50mlの0.1
M Mes（pH6.4）、0.24M硫酸アンモニウム、20％ PMME 5000中に配置し、該化合物混合物0.5〜0.8mlを加えて1〜1.6％ DMSOおよび各個の化合物の最終濃度3.3〜
5.2mMとした。結晶を、3〜4時間、平衡化させた。同様にして、該チオール、ヒドロキシアミノ酸およびカルボキシラートライブラリーを調製し、スクリーニン
グした。

【００９４】 RAXISII、MARイメージプレートまたはMAR CCDデテクターを有するRigaku RTP
300RC回転対陰極源上でデータを収集した。該イメージプレート系の場合、典型的なデータは、15分間の暴露で90 1.25°の振動よりなり、一方、該CCDの場合は
、100 1.0°の振動を2分間暴露した。典型的な使用可能なデータは、10〜20％の
マージング（merging）R因子で2.6〜2.8Åの分解能で>90％完全であった。これは、Fo-Fcまたは2Fo-Fc地図において阻害剤を適切に可視化し同定するのに必要であった。これらの地図では、該出発モデルは、2.1Åの分解能（R=25％ R_free=
28％）にまで精密化されていた。データをDENZOプログラムパッケージにより処理し、該電子密度地図をXPLORパッケージにより計算した。該カルボキシラートライブラリーのいくつかの化合物の存在下では、該空間群は、R2₁からC2（a=170
.6Å、b=47.5Å、c=83.6Å、α=γ=90°、β=104°）へ変化することが示された
。この形態の場合、該非対称単位は三量体を含有することにより自由度が減少し
、そのため、より低い分解能データ（3.0Å）が結合の可視化に適していた。

【００９５】 QUANTA 97を使用して、Silicon Graphics INDIGO2ワークステーション上で電子密度地図を検査した。活性部位における密度の形状を、陽性ヒットを示す該混
合物中の1以上の化合物の形状により、または結合の不存在を示す秩序だった水分子により、視覚的に同定した。陽性ヒットを与えた実験に関しては、適当な化
合物を該電子密度中に視覚的に移動させた。また、該電子密度地図を該タンパク
質構造中のいずれかの変化に関して調べ、認められれば、対応する修飾を該構造
中で施した。したがって、該地図検査／化合物フィッティングの工程の後、該化
合物:タンパク質複合体の詳細な3-D構造が判明した。

【００９６】

【化１２】

【００９７】現在までに、VanXのスクリーニングにおいて6個のヒットが検出されている（化合物36〜41）。図11は、代表的なヒットの結合様式を示す。すべての場合にお
いて、電子密度の形状が該結合化合物を同定した。図11Aは、活性部位の亜鉛に配位しているカルボキシラートで結合した化合物39を示す。図11Bは、活性部位の亜鉛に対して指向したカルボキシラートで結合した化合物36を示す。図11Cにおいて、化合物37もカルボキシラートを介して結合することが判明した。化合物
39および化合物41（示されていない）の結合は、活性部位の亜鉛が遊離チオール
よりもカルボキシラートの配位を優先することを示唆している。これは、追加的
なヒットが見出されたカルボキシラートライブラリーのスクリーニングにつなが
った。すべての場合において、7〜10の混合物において該化合物をスクリーニングし、該電子密度地図の形状により該ヒットを直接的に同定した。これらのヒッ
トを、ウロキナーゼの実施例で記載したのと同様の方法で、構造に基づく薬物設
計サイクルに供給する。

【００９８】実施例3：100個の化合物の混合物のスクリーニング CrystaLEAD（商標名）法により単位時間当たりにスクリーニングされうる化合
物の数を増加させるためには、該方法の好ましい実施形態は、10個の化合物の混
合物ではなく100個の化合物の混合物をスクリーニングするものとなるであろう。この方法の利点は、ヒット検出の感度の低下と同時に、より高い化合物スルー
プットが得られることである。さらに、混合物中の最も強力な化合物だけが結合
するため、より弱いヒットは見逃されうる。一般的ライブラリー、例えば、サイ
ズ、形状および官能性において完全に多様性であるものをCrystaLEAD（商標名）
によりスクリーニングする場合、ヒット率は低いと予想される。したがって、よ
り雑なスクリーニングが保証される。また、このスクリーニングからのヒットは
、より強力な結合体となるため、それらは、構造に基づく薬物設計のための出発
スカフォードとして用いることができるであろう。該化合物混合物は100個の化合物からなるため、すべてのメンバーが、デコンボリューションの必要性を排除
するのに十分な程度に多様な形状となることを保証するためには、該混合物を注
意深く設計すべきである。したがって、ヒットが検出されると、該ヒットを同定
するために、ある程度のデコンボリューションが必要かもしれない。

【００９９】この特定の方法を試験するために、μUKに結合することが知られている化合物
を100個の化合物の一群に加えた。この公知結合体（化合物19）は、元々はCryst
aLEAD（商標名）法により見出され、pH6.5では56μM、pH7.4では137μMのKiでμ
UKに結合することが示された。その100個の化合物の混合物は、10個の化合物の混合物10個を混合することにより構築した。具体的には、10の各乾燥混合物を10
0％ DMSOに溶解して最終濃度約80〜240mM（あるいは、それほど可溶性でない場合には飽和）とした。10個の化合物の各混合物の等容積を混合して各化合物の最
終濃度を8.0〜24.0mMとし、該混合物に化合物19の100％ DMSOストックを加えて該最終濃度を18.0mMとした。μUK単結晶を50μlの27％ PEG4000、15.6mMコハク酸（pH5.4）、0.17M Li₂SO₄中に配置し、該化合物混合物の0.5μLを加えて1％ D
MSOとした。該浸漬実験における各化合物の最終濃度は80〜240μMであり、化合物19の濃度は180μMであった。これらの条件下、該実験の感度はKd<20〜60μMの
結合体を検出すると予想される。結晶を、4時間15分、平衡化させた。

【０１００】 MarCCDカメラを備えたArgonne National Labs新型（advanced）光子源シンクロトロンIDビームラインIMCAで、データを収集した。データは、7秒間の暴露で1
00 1°の振動よりなるものであった。データは、5.4％の全マージング（overall
merging）R因子で1.6Åの分解能で87.4％完全であった。データをDENZOプログラムパッケージ（Otwinowskiら, Methods in Enzymology, 276 (1996)）により処理し、電子密度地図をXPLORパッケージにより計算した。

【０１０１】 QUANTA 97プログラムパッケージ（Molecular Simulations Inc., Quanta Gene rating and Displaying Molecules , San Diego: Molecular Simulations Inc.,
1997）を使用して、Silicon Graphics INDIGO2ワークステーション上で該電子密
度地図を検査した。活性部位における密度の形状を、化合物19として同定された
陽性ヒットを示す混合物中の化合物の1つから生じたものとして視覚的に同定し、図12に示す。

【０１０２】この方法は、リード化合物を見出すのに好ましい。リード化合物は、典型的に
は、より強固な結合体（例えば、該方法の感度範囲内で）であるという特性を有
する。また、この方法は、1〜2週間の時間枠で10,000個の化合物の無指向性ライ
ブラリーのスクリーニングを可能にする。この方法は、1度に10〜20個の化合物をスクリーニングする他の方法（この場合、より弱い結合体が同定される）と共
に用いられるであろう。これらの結合体は、リード化合物として使用される可能
性は低いが、該効力を増強するためにリード・スカフォードに結合させることが
可能であろう。

【０１０３】実施例4：ErmC’のCrystaLEAD（商標名）スクリーニング ErmC’は、メチル基をS-アデノシル-L-メチオニンから23S rRNAのペプチジルトランスフェラーゼループ内のアデニンのN6へ転移するrRNAメチルトランスフェ
ラーゼである。このメチル化は、広く処方されているエリスロマイシンなどの多
数のマクロライド系抗生物質に対する抗生物質耐性をもたらす。ErmC’の阻害は
耐性を反転すると予想されるであろう。特異的かつ強力なErmC’阻害剤を設計す
るために、該補因子またはS-アデノシル-L-メチオニン結合部位が標的化されている。S-アデノシル-L-メチオニンを、化合物42として以下に示す。

【０１０４】

【化１３】

【０１０５】 ErmC’の結晶構造は、S-アデノシル-L-メチオニンが、該アデニン環および該メチオニンを収容する2個の主要ポケットからなることを示す。また、メチル化を受けるrRNAアデニンを収容しうる第3のポケットが存在する。この部位におけるSARを確立するために、N6および／または5’ヒドロキシルにおいて置換された
アデノシン類似体のライブラリーを作製した。該ライブラリー内の可変部位を、
化合物43として以下に示す。

【０１０６】

【化１４】

【０１０７】 ErmCの発現および精製発現ベクターpTERM31を、pERM-1からの上流kdsBシストロンおよびermC’遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅により構築した。pET24+（Novagen, Madi
son, WI）内への該PCR産物のサブクローニングを、該「テイルド（tailed）」PC
Rプライマー内に含まれるBamHIおよびHindIII部位を用いて行なった。この新たな構築物は、T7lacプロモーターの制御下でkdsBとの翻訳共役によりErmC’の発現を可能にした。pTERM31プラスミドを大腸菌（E. coli）株BL219(DE3)/pLysS（
Novagen）内に形質転換し、得られた株をErmC’の産生のために使用した。カナマイシン、クロラムフェニコールおよびグルコースで補足された10リットルのSu
perbroth（BIO 101, La Jolla, CA）を含有するNew Brunswick Scientific（Edi
son, NJ）Micros発酵槽内で、形質転換細胞を27.5℃で増殖させた。培養物の光学濃度が1.10に達したら、1mMイソプロピルβ-d-チオガラクトピラノシド（IPTG
）の添加により発現を誘導した。誘導の400分後に細胞を回収した。

【０１０８】凍結細胞ペースト（200〜250g）を室温で融解し、5〜10倍容積の冷溶解バッフ
ァー（50mM Tris、5mM 1,4-ジチオトレイトール (DTT)、1mMフェニルメチルスル
ホナートフルオリド (PMSF)、2mMエチレン-ジアミン四酢酸 (EDTA)、0.2％ Trit
on X-100、pH7.8）に再懸濁した。該細胞をフレンチプレスで溶解し、細胞残渣を遠心分離により除去した。20リットルのTris-DTT-グリセロール-マグネシウム
（TDGM）バッファー（pH7.8）（50mM Tris、5mM DTT、10％グリセロール、10mM
MgCl2）に対して該上清を一晩透析した。ついで該透析物を、TDGMバッファー中で予め平衡化されたSepharose Fast Flowカラム（Pharmacia）にアプライした。
画分をメチルトランスフェラーゼに関してアッセイし、ErmC’を含有する画分を
プールし、TSK SP-5PWカラム（TosoHaas, Montgomeryville, PA）にアプライし、NaCl勾配で溶出した。ついで該精製タンパク質をYM-10（Amicon）メンブラン上で濃縮した。

【０１０９】 ErmC結晶構造 ErmC’の結晶をハンギングドロップ蒸気拡散法により成長させた。25mM Tris/
Cl、100mM NaCl、2mM DTT、10％(v/v)グリセロール（pH7.5）中に5〜8mg/mlのEr
mC’を含有する液滴を、100mM Tris、500mM NH4(SO)4、15% PEG 8000（pH7.8）を含有するリザーバーに対して平衡化した。結晶が1日以内に出現し、1週間以内
にそれらの完全なサイズにまで成長した。結晶は空間群P43212に属した。この空
間群内のErmC’の構造を、空間群P6内のErmC’の結晶構造を用いて2.2Åの分解能までの分子置換法（Bussiereら, Biochemistry Vol. 37, pp 7103-7112）によ
り決定した。これらの条件下で成長した結晶の3-D構造は、この系をCrystaLEAD （商標名）の適用に非常に適したものとする空の活性部位を示している。

【０１１０】スクリーニング該アデノシンライブラリーは59個の化合物よりなるものであった。該ライブラ
リーを、多様な形状の8〜9個の化合物の混合物7個に分割し、CrystaLEAD（商標名）法によりスクリーニングした。具体的には、各化合物を100％ DMSOに溶解し
て最終濃度1M（あるいは、それほど可溶性でない場合には飽和）にした。等容積
の各化合物を混合して、10の混合物を集合させた。ErmC単結晶を50μlの20％ PE
G 8000、0.3M硫酸アンモニウム、10％グリセロール（pH7.7）中に配置し、該化合物混合物の0.5〜0.8μlを加えて1〜1.6％ DMSOおよび各個の化合物の最終濃度
3.3〜5.2μMとした。結晶を、3〜4時間、平衡化させた。

【０１１１】 RAXISIIまたはMARイメージ・プレートまたはMAR CCDデテクターを有するRigak
u RTP 300RC回転対陰極源上でデータを収集した。該イメージ・プレート系の場合、典型的なデータは、20〜30分間の暴露で15〜20 2°の振動よりなり、一方、
CCDの場合には、15〜20 2.0°の振動を8〜15分間暴露した。典型的な使用可能な
データは、7〜16％のマージング（merging）R因子で3.4〜3.6Åの分解能で80〜9
0％完全であった。これは、Fo-Fcまたは2Fo-Fc地図において阻害剤を適切に可視
化し同定するのに必要であった。これらの地図では、出発モデルは2.2Åの分解能（R=22％ R_free=25％）にまで精密化されていた。データをDENZOプログラムパ
ッケージにより処理し、電子密度をXPLORパッケージにより計算した。

【０１１２】 QUANTA 97を使用して、Silicon Graphics INDIGO2ワークステーション上で電子密度地図を検査した。活性部位における密度の形状を、陽性ヒットを示す該混
合物中の化合物の1以上の形状により又は結合の不存在を示す秩序だった水分子により、視覚的に同定した。陽性ヒットを与えた実験に関しては、適当な化合物
を該電子密度中に視覚的に移動させた。また、該電子密度地図を該タンパク質構
造中のいずれかの変化に関して調べ、認められれば、対応する修飾を該構造中で
施した。したがって、該地図検査／化合物フィッティングの工程の後、該化合物
:タンパク質複合体の詳細な3-D構造が判明した。

【０１１３】 ErmC’アデノシン類似体のスクリーニングにおいて2つのヒットが検出された（化合物44および45）。図13および14は、化合物44および45とErmC’との複合体
の結晶構造を示す。

【０１１４】

【化１５】

【０１１５】すべての場合において、電子密度の形状が結合化合物を同定した。該疎水性置
換基は、部分的に露出した疎水性表面に添って結合することが判明した。このこ
とは、これらの化合物の結合に寄与しそれらがヒットとして引き出されるのを可
能にした可能性がある好ましい相互作用を示唆している。5’OH位における置換を含有するヒットは検出されなかった。化合物44および45に続く化合物は、最適
化されたインダン置換基をこの疎水性部位に含有していた。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図1は、初期リード化合物を見出し、ついでそれをスカフォードとして使用して、主要部位を包囲するサブサイトにフィットする追加的部分を担持させる、構
造に基づく薬物設計を例示する。

【図２】図2は、隣接する2以上の主要ポケットを有する生体分子に関する断片連結アプ
ローチを例示する。

【図３】図3は、種々の潜在的リガンド（I₁-I₁₀）の溶液中に結晶を浸漬し、X線回折デ
ータ・セットを集めて電子密度地図に変換し、それを化合物の結合に関して検査
するCrystaLEAD（商標名）の概要図である。

【図４】図4は、2-Dおよび3-Dにおける典型的な化合物混合物を例示する。これらの3-D
図は、該分子の「形状」を表す理論的2Fo-Fc電子密度地図である。

【図５】図5は、ヒトウロキナーゼの一次配列である。

【図６】図6は、潜在的リガンドの混合物を含有する溶液中にウロキナーゼを浸漬した後でヒットがどのようにして形状により検出され同定されたかを示す。図6Aは初
期Fo-Fc地図である。図6Bは、ウロキナーゼの活性部位において該化合物がどのようにして結合するのかを示す。図6Cは、該混合物のいずれの化合物も結合して
いない場合の結合リガンドの不存在下の活性部位を示す。

【図７】図7は、潜在的リガンドの混合物を含有する溶液中に浸漬したウロキナーゼに関するヒットを示す。図7Aは初期Fo-Fc地図である。図7Bは、ウロキナーゼの結合部位において該化合物がどのようにして結合するのかを示す。

【図８】図8は、潜在的リガンドの混合物を含有する溶液中に浸漬したウロキナーゼに関するヒットを示す。図8Aは初期Fo-Fc地図である。図8Bは、ウロキナーゼの活性部位において該化合物がどのようにして結合するのかを示す。

【図９】図9は、潜在的リガンドの混合物を含有する溶液中に浸漬したウロキナーゼに関する2つの追加的なヒットを示す。図9Aは、該混合物内の強力なリガンドに関するFo-Fc地図である。図9Bは、該混合物内の、より弱いリガンドに関するFo-Fc
地図である。該混合物からその強力なリガンドを除去した後においてのみ、その
弱いリガンドが検出された。

【図１０】図10は、CrystaLEAD（商標名）により見出されたリード化合物と最適化された
フォローアップ化合物との間の結晶構造の比較を示す。

【図１１】図11は、VanXに関して同定したヒットを示す。

【図１２】図12は、ウロキナーゼに関するヒットを示す。

【図１３】図13は、ErmC’と化合物44との結晶構造を示す。

【図１４】図14は、ErmC’と化合物45との結晶構造を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者グリア，ジヨナサンアメリカ合衆国、イリノイ・60645、シカゴ、ノース・サクラメント・アベニユー・ 6757 (72)発明者アバド−ザパテロ，セレリノアメリカ合衆国、イリノイ・60045、レイク・フオレスト、グリーンビユー・プレイス・765 (72)発明者ノーベツク，ダニエル・ダブリユアメリカ合衆国、イリノイ・60030、グレイズレイク、ウオルトン・レイン・816 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA20 BB60 DA36 FA40

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】標的生体分子に対するリガンドを同定するための方法であっ
て、（a）標的生体分子結晶を得、（b）該標的生体分子結晶を1以上の試験サンプルにさらし、（c）リガンド／受容体複合体が形成したか否かを判定するためにX線結晶回折
パターンを得ることを含んでなる方法。
【請求項２】該試験サンプルにさらす前に該標的生体分子結晶のX線結晶回折パターンを得、さらす前および後の該標的分子のX線回折パターンを比較する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】回折パターンを電子密度地図に変換する工程を更に含む、請
求項1に記載の方法。
【請求項４】電子密度地図を構造に変換する工程を更に含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】該試験サンプルを含有する溶液中に該標的生体分子結晶を浸
漬することにより該標的生体分子を試験サンプルにさらす、請求項1に記載の方法。
【請求項６】試験サンプルの混合物を含有する溶液中に該標的生体分子結
晶を浸漬することにより該標的生体分子を該試験サンプルにさらす、請求項1に記載の方法。
【請求項７】試験サンプルと共に該標的生体分子結晶を共結晶化すること
により該標的生体分子を該試験サンプルにさらす、請求項1に記載の方法。
【請求項８】試験サンプルの混合物と共に該標的生体分子結晶を共結晶化
することにより該標的生体分子を該試験サンプルにさらす、請求項1に記載の方法。
【請求項９】試験サンプルの混合物が多様に形状化されている、請求項6 に記載の方法。
【請求項１０】試験サンプルの混合物が多様に形状化されている、請求項
8に記載の方法。
【請求項１１】該リガンドが生物学的に活性な部分である、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】該標的がポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】該標的が再操作されたポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】請求項11に記載の方法により同定された生物学的に活性な
部分。
【請求項１５】該リガンドがリード化合物である、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】標的生体分子に対するリガンドを設計するための方法であ
って、 a）標的生体分子結晶を得、 b）X線結晶学的スクリーニングにより該標的生体分子に対する少なくとも2つのリガンドを同定し、 c）それらのリガンドが該標的生体分子に結合している場合の該リガンドの空間的配向を決定し、 d）該空間的配向に従いそれらのリガンドを連結して該リガンドを形成させることを含んでなる方法。
【請求項１７】多重リガンド／標的分子複合体を形成させ該多重リガンド
／標的分子複合体のX線結晶構造を作り出すことにより、該結合リガンドの空間的配向を決定する、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】 1つのリガンドが、もう1つのリガンドが該標的分子に結合
する前に該標的分子に結合する、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】該リガンドが生物学的に活性な部分である、請求項16に記
載の方法。
【請求項２０】該標的がポリペプチドである、請求項16に記載の方法。
【請求項２１】該標的が再操作されたポリペプチドである、請求項16に記
載の方法。
【請求項２２】請求項19に記載の方法により設計された生物学的に活性な
部分。
【請求項２３】該リガンドがリード化合物である、請求項16に記載の方法
。
【請求項２４】標的生体分子に対するリガンドを設計するための方法であ
って、 a）標的生体分子結晶を得、 b）X線結晶学的スクリーニングにより該標的生体分子に対するリガンドを同定
し、 c）該リガンドの誘導体を作製することを含んでなる方法。
【請求項２５】該リガンドがリード化合物である、請求項24に記載の方法
。
【請求項２６】該リガンドが生物学的に活性な化合物である、請求項24に
記載の方法。
【請求項２７】該標的がポリペプチドである、請求項24に記載の方法。
【請求項２８】該標的が再操作されたポリペプチドである、請求項24に記
載の方法。
【請求項２９】請求項25に記載の方法により同定されたリード化合物。
【請求項３０】請求項25に記載の方法により設計された生物学的に活性な
化合物。
【請求項３１】請求項26に記載の方法により設計された生物学的に活性な
化合物。
【請求項３２】生体分子から、容易に接近可能な活性部位を有する結晶を
形成させるための方法であって、 a）分解可能なリガンドと共に該生体分子を共結晶化し、 b）該結晶が形成したら、該リガンドを分解させることを含んでなる方法。
【請求項３３】該生体分子の活性部位が該リガンドを分解させる、請求項
32に記載の方法。
【請求項３４】該リガンドを分解させるために分解剤を加えることを更に
含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３５】該リガンドが自発的に分解する、請求項32に記載の方法。