DE69937292T2

DE69937292T2 - Screening nach bindepartnern und deren design nach röntgenkristallographie

Info

Publication number: DE69937292T2
Application number: DE69937292T
Authority: DE
Inventors: Vicki L. Gurnee NIENABER; Jonathan Chicago GREER; Celerino Lake Forest ABAD-ZAPATERO; Daniel W. Grayslake NORBECK
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1998-03-06
Filing date: 1999-03-05
Publication date: 2008-07-03
Anticipated expiration: 2019-03-06
Also published as: SK13242000A3; WO1999045389A2; EP1068531A2; US6297021B1; AU767991B2; DE69937292D1; CN1299467A; NO20004433L; CN100354627C; AU2003255167A1; JP2002506206A; HUP0101959A3; ATE375510T1; WO1999045379A3; CN101221138A; HUP0101959A2; AU2887099A; EP1068531B1; KR20010041653A; IL137758A0

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Röntgenkristallographie ist nützlich zur Bestimmung von Liganden, die sich an Ziel-Rezeptormoleküle binden, und zur Herstellung von Liganden mit verbesserter biologischer Aktivität für den Ziel-Rezeptor.
Hintergrund der Erfindung
Röntgenkristallographie (Kristallographie) ist eine etablierte, gut untersuchte Technik, die liefert, was am besten als dreidimensionales Bild des Aussehens eines Moleküls in einem Kristall zu beschreiben ist. Wissenschaftler haben Kristallographie verwendet, um die Kristallstrukturen vieler biologisch wichtiger Moleküle zu erforschen. Viele Klassen von Biomolekülen können durch Kristallographie untersucht werden, einschließlich Proteinen, DNA, RNA und Viren, aber nicht darauf beschränkt. Wissenschaftler haben sogar die Kristallstrukturen von Biomolekülen identifiziert, die Liganden innerhalb ihrer Rezeptoren tragen (einen "Ligand-Rezeptor-Komplex").
Anhand eines "Bildes" eines Ziel-Biomoleküls oder Liganden-Rezeptor-Komplexes können Wissenschaftler "Taschen" oder Rezeptoren suchen, wo biologische Aktivität stattfinden kann. Dann können Wissenschaftler experimentell oder rechnerisch Hochaffinitäts-Liganden (oder -Arzneimittel) für die Rezeptoren konstruieren. Rechnerische Verfahren sind alternativ verwendet worden, um nach der Bindung kleiner Moleküle zu suchen. Diese früheren Versuche haben jedoch nur begrenzt Erfolg gehabt. Ligandenkonstruktion durch rechnerische Verfahren ist mit mehreren Problemen verbunden. Rechnerische Verfahren beruhen auf Schätzungen anstelle exakter Bestimmungen der Bindungsenergien und stützen sich auf einfache Berechnungen im Vergleich zu den komplexen Interaktionen innerhalb eines Biomoleküls. Weiterhin erfordern Rechenmodelle eine experimentelle Bestätigung, welche die Modelle oftmals als falschpositive Modelle entlarvt, die auf das echte Ziel nicht anwendbar sind.
Außerdem ist experimentelle Hochaffinitäts-Ligandenkonstruktion, die auf einem "Bild" des Liganden-Rezeptor-Komplexes basierte, auf Biomoleküle beschränkt gewesen, die bereits bekannte Liganden haben. Schließlich berichteten Wissenschaftler erst kürzlich über die kristallographische Untersuchung von Interaktionen zwischen organischen Lösungsmitteln und Ziel-Biomolekülen. Allen u. a., J. Phys. Chem., v. 100, S. 2605–11 (1996). Diese Untersuchungen sind jedoch auf die Abbildung von Lösungsmittel-Regionen, nicht Liganden-Regionen, beschränkt.
Verlinde u. a. (1997), Structure-based drug design, S. 365–394, offenbaren ein Verfahren zur Identifikation eines Liganden, der sich an ein Ziel-Biomolekül bindet, folgende Schritte umfassend:

a) Gewinnung eines Ziel-Biomolekül-Kristalls und des Röntgenbeugungsdiagramms des Ziel-Biomoleküls (S. 377, letzter Absatz, bis S. 378, Zeile 19);
b) Aussetzen des Ziel-Biomolekül-Kristalls gegenüber einer Mischung aus mindestens zwei potenziellen Liganden, worin die Liganden in der Mischung auf molekularer Ebene unterschiedlich geformt sind, und Gewinnung eines Röntgen-Kristall-Beugungsdiagramms daraus (S. 378, Zeilen 17 bis 21, "crystallographic cocktail soak (CCS) approach", S. 379, Zeilen 1 bis 2, Tabelle 4); und
c) Bestimmung, ob ein Ligand/Ziel-Biomolekül-Komplex gebildet wird, durch Vergleichen der Röntgen-Kristall-Beugungsdiagramme des Ziel-Biomolekül-Kristalls, wenn es der Mischung aus den mindestens zwei potenziellen Liganden ausgesetzt ist, mit dem Röntgenbeugungsdiagramm des Ziel-Biomolekül-Kristalls, das gewonnen wird, wenn es nicht der Mischung aus den mindestens zwei potenziellen Liganden ausgesetzt ist (S. 378, Zeile 19, bis S. 379, Absatz 2). Die Offenbarung in diesem Dokument ermöglicht es jedoch nicht, positive Treffer ohne die Notwendigkeit nachfolgender Experimente direkt zu identifizieren.

Es wäre wünschenswert, potenzielle Liganden direkt zu identifizieren und detaillierte Informationen darüber zu erhalten, wie sich der Ligand in dem Ziel-Biomolekül bindet und verändert. Außerdem wären Verfahren zur Identifikation und/oder Konstruktion von Liganden wünschenswert, welche biologische und/oder pharmazeutische Wirksamkeit im Hinblick auf ein bestimmtes Zielmolekül aufweisen.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung besteht in einem Verfahren zur Identifikation eines Liganden, der sich an ein Ziel-Biomolekül bindet wie in Anspruch 1 beansprucht. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden in den Ansprüchen 2 und 3 beansprucht. Weitere Ausführungsformen, die nicht unter die beanspruchte Erfindung fallen, sind ebenfalls, in der vorliegenden Beschreibung, offenbart.
Kristallographie kann angewandt werden, um Verbindungen, die keine bekannten Liganden eines Ziel-Biomoleküls sind, auf ihre Fähigkeit, sich an das Ziel zu binden, zu untersuchen und zu identifizieren. Das Verfahren (im Folgenden "CrystaLEAD^TM" genannt) umfasst die Gewinnung eines Kristalls eines Ziel-Biomoleküls, die Aussetzung des Ziels gegenüber einer oder mehreren Untersuchungsproben, die potenzielle Liganden des Ziels sind, und die Bestimmung, ob ein Ligand-Biomolekül-Komplex gebildet wird. Das Ziel wird potenziellen Liganden durch verschiedene Verfahren ausgesetzt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Durchtränken eines Kristalls in einer Lösung aus einem oder mehreren potenziellen Liganden oder Co-Kristallisieren eines Biomoleküls in Anwesenheit eines oder mehrerer potenzieller Liganden.
In einer weiteren Ausführungsform werden strukturelle Informationen von den gefundenen Ligand-Rezeptor-Komplexen verwendet, um neue Liganden zu konstruieren, die sich fester binden, spezifischer binden, bessere biologische Wirksamkeit oder ein besseres Sicherheitsprofil haben als bekannte Liganden.
Bibliotheken von Verbindungen mit heterogener Form ("shape diverse") werden verwendet, um eine direkte Identifikation des Ligand-Rezeptor-Komplexes zu ermöglichen, selbst wenn der Ligand als Teil einer Mischung exponiert wird. Dadurch wird die Notwendigkeit zeitaufwendiger Dekonvolution eines Treffers aus der Mischung beseitigt. Hier werden drei wichtige Schritte gleichzeitig durchgeführt. Die Funktion der berechneten Elektronendichte zeigt direkt das Bindungsereignis, identifiziert die gebundene Verbindung und liefert eine detaillierte 3-D-Struktur des Ligand-Rezeptor-Komplexes. In einer Ausführungsform könnte, sobald ein Treffer gefunden wird, eine Reihe von Analogen oder Derivaten des Treffers durch herkömmliche Screening-Verfahren auf engere Bindung oder bessere biologische Wirksamkeit hin untersucht werden. Der Treffer und die Information über die Struktur des Ziels können verwendet werden, um Analoge oder Derivate mit engerer Bindung oder besserer biologischer Wirksamkeit zu entwickeln. Der Ligand-Rezeptor-Komplex kann zusätzlichen Iterationen potenzieller Liganden unterzogen werden, so dass zwei oder mehr Treffer miteinander verbunden werden können, um einen wirksameren Liganden zu bilden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein strukturbasiertes Arzneimittel-Design, bei dem eine Ausgangs-Führungsverbindung gefunden und dann als Gerüst verwendet wird, um zusätzliche Anteile zu tragen, welche an die Unterregionen passen, die eine Hauptregion umgeben.
2 zeigt ein Fragment-Verbindungs-Verfahren für ein Biomolekül, das zwei oder mehr nebeneinander liegende Haupt-"Taschen" hat.
3 ist eine Übersicht von CrystaLEAD^TM, worin ein Kristall in eine Lösung aus verschiedenen potenziellen Liganden (I₁–I₁₀) eingetaucht und ein Röntgenbeugungs-Datensatz erfasst und in ein Elektronendichtediagramm umgewandelt wird, welches auf die Bindung von Verbindungen hin untersucht wird.
4 stellt eine typische Verbindungsmischung in 2-D und 3-D dar. Die 3-D-Abbildungen sind theoretische 2Fo-Fc-Elektronendichtediagramme, die die "Form" der Moleküle darstellen.
5 ist eine Primärsequenz von Humanurokinase.
6 zeigt, wie ein Treffer erfasst und anhand der Form identifiziert wurde, nachdem Urokinase in eine Lösung eingetaucht wurde, die eine Mischung potenzieller Liganden enthielt.
6A ist das ursprüngliche Fo-Fc-Diagramm. 6B zeigt, wie sich die Verbindung an die aktive Stelle der Urokinase bindet. 6C zeigt die aktive Stelle ohne gebundenen Liganden, wenn keine Verbindung der Mischung gebunden wurde.
7 zeigt einen Treffer für Urokinase, die eingetaucht wurde in eine Lösung, welche eine Mischung potenzieller Liganden enthielt. 7A ist das ursprüngliche Fo-Fc-Diagramm. 7B zeigt, wie sich die Verbindung an die aktive Stelle der Urokinase bindet.
8 zeigt einen Treffer für Urokinase, die eingetaucht wurde in eine Lösung, welche eine Mischung potenzieller Liganden enthielt. 8A ist das ursprüngliche Fo-Fc-Diagramm. 8B zeigt, wie sich die Verbindung an die aktive Stelle der Urokinase bindet.
9 zeigt zwei zusätzliche Treffer für Urokinase, die eingetaucht wurde in eine Lösung, welche eine Mischung potenzieller Liganden enthielt. 9A ist das Fo-Fc-Diagramm für einen starken Liganden in der Mischung. 9B ist das Fo-Fc-Diagramm für einen schwächeren Liganden in der Mischung. Der schwächere Ligand wurde erst nachgewiesen, nachdem der starke Ligand aus der Mischung entfernt worden war.
10 zeigt die Vergleichs-Kristallstrukturen zwischen einer Führungsverbindung, die mit CrystaLEAD^TM gefunden worden war, und einer optimierten Folgeverbindung.
11 stellt Treffer dar, die für VanX identifiziert wurden.
12 stellt einen Treffer für Urokinase dar.
13 stellt die Kristallstruktur von Verbindung 44 mit ErmC' dar.
14 stellt die Kristallstruktur von Verbindung 45 mit ErmC' dar.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung besteht in einem Verfahren zur Identifikation eines Liganden, der sich an ein Ziel-Biomolekül bindet wie in Anspruch 1 beansprucht. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden in den Ansprüchen 2 und 3 beansprucht. Weitere Ausführungsformen, die nicht unter die beanspruchte Erfindung fallen, sind ebenfalls, in der vorliegenden Beschreibung, offenbart.
CrystaLEAD^TM bietet ein effizientes Screening-Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die sich an ein Ziel-Biomolekül binden. Solche Verbindungen können als Führungsverbindungen oder Gerüste zur Herstellung von Liganden und/oder Arzneimitteln dienen, die verbesserte biologische Wirksamkeit für das Ziel haben. Es ist anzumerken, dass Liganden mit engerer Bindung nicht unbedingt bessere biologische Wirksamkeit haben oder bessere Arzneimittel sind, obwohl dies die allgemeine Regel ist. Es ist möglich, dass ein Ligand mit schwächerer Bindung aufgrund anderer Faktoren als enger Bindung (z. B. Selektivität, Bioverfügbarkeit) bessere biologische Wirksamkeit hat.
Kristallographie ist in großem Maße verwendet worden, um Rezeptor-Ligand-Komplexe auf strukturbasiertes Arzneimittel-Design hin zu untersuchen. Zur Untersuchung solcher Komplexe wird das Zielmolekül-Kristall normalerweise mit bekannten Liganden durchtränkt, gefolgt von Kristallographie des Komplexes. Manchmal ist es notwendig, die Liganden mit dem Zielmolekül zu co-kristallisieren, um einen geeigneten Kristall zu erhalten.
Bis heute ist Kristallographie nicht zum Screening potenzieller Liganden eingesetzt worden, trotz der detaillierten strukturellen Information, die sie liefert. Mögliche Vorurteile gegenüber dem Screening von Verbindungen durch Kristallographie schließen den Glauben ein, dass das Verfahren zu kompliziert oder zu zeitaufwendig sei, dass geeignete Kristalle schwierig zu gewinnen seien, dass verfügbare Kristalle nicht das Durchtränken mit mehr als einer Verbindung tolerieren könnten (noch viel weniger Mischungen aus zehn oder mehr Verbindungen), dass zu viel Biomolekül benötigt würde, dass es zu zeitaufwendig wäre, Kristalle routinemäßig anzuordnen, und dass die kontinuierliche Änderung von Kristallen auf dem Röntgen-Goniometer zu mühsam wäre.
Die aktuell verfügbare Technologie hat jedoch viele dieser vermeintlichen Hindernisse überwunden. Zum Beispiel wurden molekulare Ziele früher nur aus natürlichen Quellen gewonnen und waren manchmal ungeeignet für die Kristallisation aufgrund von natürlicher Zersetzung oder Glykosylierung. Außerdem war die natürliche Konzentration oftmals zu niedrig, um die Menge an hochgereinigtem Protein zu erhalten, die für die Kristallisation notwendig war. In der Molekularbiologie können große Mengen an Protein exprimiert und für die Kristallisation gereinigt werden. Falls nötig, kann das Protein zur Bereitstellung anderer oder besserer Kristallformen sogar einem Re-Engineering unterzogen werden.
Weiter sind helle Lichtquellen (Synchrotronstrahlung) und empfindlichere Detektoren ohne Weiteres verfügbar geworden, so dass die Zeit, die zur Erfassung von Daten erforderlich ist, drastisch von Tagen auf Stunden oder sogar Minuten reduziert wurde. Außerdem ermöglichen vorhandene Technologien, die zu diesem Zeitpunkt noch weniger Routine sind, aber bald Routine werden können, die Erfassung vollständiger Datensätze in der Größenordnung von Sekunden oder sogar Bruchteilen einer Sekunde (z. B. Laue-Beugung). J. Hajdu u. a., Nature, v. 329, S. 178–81 (1987). Schnellere Computer und mehr Automatisierungssoftware haben die Zeit, die für Datenerfassung und -analyse erforderlich ist, stark verringert. Schließlich haben die Erfinder festgestellt, dass es möglich ist, zum Screening potenzieller Liganden Mischungen von Verbindungen einzutränken oder zu co-kristallisieren. Daher ist, wie unten beschrieben, Kristallographie heutzutage ein praktisches und durchführbares Screening-Verfahren.
In CrystaLEAD^TM werden Liganden für ein Zielmolekül mit kristalliner Form identifiziert, indem eine Bibliothek kleiner Moleküle, entweder einzeln oder in Mischungen, dem Ziel (z. B. Protein, Nukleinsäure usw.) ausgesetzt wird. Dann werden kristallographische Daten gewonnen, um das Elektronendichtediagramm des mutmaßlichen Ziel-Liganden-Komplexes mit dem Elektronendichtediagramm des Ziel-Biomoleküls zu vergleichen. Das Elektronendichtediagramm liefert gleichzeitig einen direkten Nachweis der Ligandenbindung, Identifikation des gebundenen Liganden und die detaillierte 3-D-Struktur des Ligand-Ziel-Komplexes. Die Bindung kann auch durch Änderungen einzelner Reflexionen in dem kristallographischen Beugungsdiagramm überwacht werden, von denen bekannt ist, dass sie empfindlich für Ligandenbindung an der aktiven Stelle sind. Dies könnte als Vorklassierung dienen, wäre jedoch nicht das primäre Verfahren der Wahl, da es weniger detaillierte Struktur-Informationen liefert.
Durch Beobachtung von Änderungen des Niveaus der Liganden-Elektronendichte oder der Intensität bestimmter Reflexionen im Beugungsmuster abhängig von Ligandkonzentration, entweder zum Kristall hinzugefügt oder in Co-Kristallisation, können auch die Bindungsaffinitäten von Liganden für Biomoleküle bestimmt werden. Bindungsaffinitäten können auch durch konkurrierende Experimente ermittelt werden. Hier wird (werden) die neue(n) Verbindung(en) mit einem von einer Reihe verschieden geformter Liganden mit bekannter Bindungsaffinität getränkt oder co-kristallisiert. Wenn der bekannte Ligand im Elektronendichtediagramm erscheint, sind die unbekannten Liganden schwächere Liganden. Wenn jedoch festgestellt wird, dass eine der neuen Verbindungen um die Region konkurriert, wäre sie der stärkste Ligand. Durch Variierung der Konzentration oder Identität des bekannten Liganden kann eine Bindungskonstante für den CrystaLEAD^TM-Treffer ermittelt werden.
Die Anzahl getesteter Verbindungen hängt ab von der gewünschten Nachweisgrenze, der Verbindungslöslichkeit und der Menge an organischem Co-Solvens, die von den Kristallen toleriert wird. Genaue Zahlen hängen von jedem Kristall ab. Zum Beispiel würde bei einem typischen Kristall, das 1% organisches Co-Solvens toleriert, die Nachweisgrenze zum gleichzeitigen Screening von 10 Verbindungen bei Kd < 1,5 mM liegen. Bei 20 Verbindungen läge die Nachweisgrenze bei Kd < 0,63 mM. Kristalle, die einen hohen Anteil an organischen Co-Solvenzien tolerieren (z. B. 40%), können jedoch innerhalb einer Nachweisgrenze von Kd < 1,5 mM bis zu 50 Verbindungen untersuchen.
Bei der allgemeinsten Anwendung von CrystaLEAD^TM wird der Treffer oder die Führungsverbindung verwendet, um zu bestimmen, welche Verbindungen in strukturbasiertem Arzneimittel-Design auf biologische Wirksamkeit getestet werden sollten. Dann werden durch herkömmliche Arzneimittelchemie Derivate und Analoge gewonnen, um den besten Liganden oder das beste Arzneimittel zu finden.
Alternativ können die strukturellen Informationen, die in dem Screening-Verfahren gesammelt werden, direkt genutzt werden, um Analoge oder Derivate des Treffers vorzuschlagen. Diese Vorgehensweise wird verdeutlicht, wenn die aktive Stelle aus einer "Primärtasche", umgeben von einer Vielzahl von Unter-Regionen und kleinen "Taschen", besteht (1). Detaillierte strukturelle Informationen darüber, wie eine Verbindung vom Rezeptor gebunden wird, werden gleichzeitig gewonnen, wenn ein Treffer erfasst wird. Solche Informationen sind für Personen mit durchschnittlichem Fachwissen nützlich, um bessere Liganden zu konstruieren. P. Colman, Curr. Opin. in Struct. Biology, v. 4, S. 868–74 (1994); J. Greer u. a., J. Med. Chem., v. 37, S. 1035–54 (1994); C. Verlinde u. a., Structure, v. 15, S. 577–87 (1994). Im Speziellen kennzeichnet der Treffer Stellen für analoge Synthese, die Zugang zu den umgebenden Unter-Regionen und kleinen "Taschen" ermöglichen. Dies ermöglicht die Herstellung neuer Verbindungen, die besser an die aktive Stelle passen. Weiterhin können in Fällen, in denen eine Struktur-Funktions-Beziehung vorhanden ist, die Wirksamkeit verbessernde Substitutionsmuster auf 3-D-Strukturebene direkt an das neue Führungsgerüst übertragen werden.
Eine andere Darstellung (2) bezieht sich normalerweise auf ein Ziel mit zwei oder mehr separaten "Taschen", die Fragmente aufnehmen. Hier wird das Kristallziel auf Liganden untersucht, die alle Stellen entweder sequentiell oder gleichzeitig besetzen. Da das Bindungsereignis durch die Visualisierung von Co-Kristallstrukturen überwacht wird, wird die Stelle der Ligandenbindung direkt identifiziert, und es besteht nicht die Notwendigkeit von konkurrierenden Experimenten, um sicherzustellen, dass die Liganden tatsächlich verschiedene Stellen am Protein besetzen. Separates Screening ermöglicht Liganden, die sich an getrennte "Taschen" binden, die sich an ihren Bindungsstellen überlappen. Das Screening des zweiten in Anwesenheit des ersten würde kooperative Bindung an einer zweiten Stelle erfassen. Sobald potenzielle Führungsverbindungen und eine Struktur-Aktivitäts-Beziehung erfasst wurden, können anhand der detaillierten Strukturinformation und des Ansatzes zur Fragmentverbindung wie oben beschrieben Verbindungen zwischen allen Stellen hergestellt werden, um neue, viel wirksamere Liganden zu erzeugen. S. B. Shuker u. a., Science, v. 274, S. 1531–34 (1996); C. Verlinde u. a., Structure, v. 15, S. 577–87 (1994).
In einer dritten Anwendung, dem Gerüst-Verschmelzungs-Verfahren (nicht dargestellt), besteht die aktive Stelle des Ziels aus zwei oder mehr Unter-Regionen. Das kristalline Protein wird auf Liganden untersucht, die sich an diese Unter-Regionen binden, und die relative Liganden-Bindungs-Ausrichtung wird über mehrere Experimente hinweg beobachtet. Diese Liganden sollten sich binden, indem sie eine oder mehrere Unter-Regionen besetzen, und durch Überlagerung der Strukturen von Mehrfach-Treffern kann ein Kern konstruiert werden, der den Zugang zu mehreren Unter-Regionen erleichtert. Dieser Kern würde dann als neue, neuartige und wirksamere Führungsverbindung dienen, die auch das Führungsgerüst im Arzneimittel-Design-Zyklus darstellen würde.
Das CrystaLEAD^TM-Verfahren vernetzter Fragmente implementiert experimentell das strukturbasierte Verfahren vernetzter Fragmente, über das von Verlinde u. a. in J. Comput. Aided Mol. Des., v. 6, S. 131–47 (1992) nur auf rechnerischer Ebene berichtet wird. Verlinde u. a. schlugen Ligand-Fragmente anhand mathematischer Berechnungen vor. Die vorgeschlagenen Fragmente wurden dann auf Bindungsaktivität hin getestet. Wenn die Fragmente sich tatsächlich banden, wurden ihre 3-D-Strukturen durch Röntgenkristallographie bestimmt, und ein Linker wurde konstruiert. CrystaLEAD^TM hingegen erfasst gleichzeitig das Bindungsereignis und liefert eine experimentell bestimmte 3-D-Struktur des Ligand-Protein-Komplexes. Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Bestimmung der Assoziationskonstante zwischen einem Zielmolekül und seinem Liganden. Die Erfindung erfordert keine spezielle Markierung des Ziels. Daher kann das Zielmolekül Proteine, Polypeptide, Nukleinsäuren, Nukleoproteine oder jedes andere geeignete Zielmolekül umfassen, das aus natürlichen Quellen oder durch Rekombinationsverfahren aus einem beliebigen geeigneten Host-System, wie von Personen mit durchschnittlichem Fachwissen entwickelt und praktiziert, isoliert wird.
Kristallographie-Screening hat mehrere Vorteile. Ein wichtiger Vorteil ist, dass das Bindungsereignis direkt beobachtet wird, so dass die Wahrscheinlichkeit falschpositiver Ergebnisse auf nahe Null reduziert wird. Die kristallographischen Daten liefern einen dreidimensionalen Elektronendichte-"Schnappschuss" des Ligand-Rezeptor-Komplexes, der zeigt, welche Verbindung sich bindet und wie sie gebunden wird.
Das Verfahren ist spezifisch empfindlich gegenüber strukturellen Veränderungen, sowohl beim Ziel als auch beim Liganden. Die Beobachtung struktureller Veränderungen ist entscheidend bei der Konstruktion von Gerüsten, die Informationen aus verschiedenen Ligand-Ziel-Komplex-Strukturen kombinieren. Ein solches Beispiel wäre, wenn ein Protein seine Struktur verändert, um einen Liganden aufzunehmen, aber die Strukturänderung gleichzeitig die Bindung eines zweiten Liganden blockiert. Ähnlich ist die Erfassung struktureller Veränderungen auch wichtig, weil es eventuell nicht möglich ist, wenn sich die Primärgerüste anders binden, sie zu einem größeren Gerüst zu kombinieren.
Da das Bindungsereignis direkt überwacht wird, benötigt CrystaLEAD^TM keine spezifisch markierten Proben, Sonden oder Zielmoleküle, die indirekt gegenüber Liganden-Assoziation empfindlich wären. Solange es möglich ist, eine Kristallstruktur des Ziels zu erhalten, kann CrystaLEAD^TM angewandt werden, um nach Liganden zu suchen.
Wenn Verbindungsmischungen passenderweise so konstruiert sind, dass sie verschiedene Formen beinhalten, beseitigt die Erfindung die Notwendigkeit der Dekonvolution von Bibliotheken, die als Mischung durchtränken, weil das Bindungsereignis direkt durch Untersuchung der Form der Elektronendichte an der Bindungsstelle erfasst wird. Daher kennzeichnet die Form der Elektronendichte direkt sowohl das Bindungsereignis als auch die Identität der Verbindung. Alternativ kann die Mischung so zusammengesetzt werden, dass sie Verbindungen mit anomalen Streuatomen (z. B. Br, S) enthält, die durch anomale Streutechniken identifiziert werden können. Weiterhin ist sie, da CrystaLEAD^TM die Bindung direkt überwacht, besonders gut geeignet zur Untersuchung von Zielen, für die kein bekannter Ligand existiert.
Da die mit CrystaLEAD^TM berechnete Elektronendichte-Funktion den "realen Raum" des Kristalls zeigt, ist es möglich, sich direkt auf den Bereich von Interesse zu konzentrieren. Daher kann die Bindung exklusiv an der Stelle von Interesse erfasst werden, obwohl das Verfahren nicht auf die aktive Stelle beschränkt ist. Die Bindung an anderen Stellen, die in den meisten Bindungs-Assays die Analyse verkompliziert, kann vollständig außer Acht gelassen werden.
CrystaLEAD^TM bietet auch ein Verfahren, um die Bindung an verschiedenen Stellen gleichzeitig zu überwachen. Das heißt, bei einem Ziel mit mehreren "Taschen" erfordert die Suche nach einer zweiten Stelle nicht die Suche in Anwesenheit des ersten Liganden. Die Suche nach einer zweiten Stelle kann jedoch zur Entdeckung kooperativer Liganden in Anwesenheit des ersten Liganden durchgeführt werden.
CrystaLEAD^TM ist auf jedes Zielmolekül anwendbar, für das eine Kristallstruktur gewonnen werden kann. Gemäß aktueller Literatur schließt dies jedes lösliche Makromolekül mit einem Molekulargewicht zwischen ungefähr 5000 und 200.000 ein. Dieser Bereich wird jedoch aufgrund technischer Fortschritte fast täglich größer. Das Verfahren ist auch empfindlich gegenüber einer großen Bandbreite von Bindungs-Dissoziationskonstanten (< picomolar zu molar). Mit Hilfe empfindlicherer ladungsgekoppelter Kameradetektoren können Daten mit einer Drehanoden-Quelle in ungefähr < 4 Stunden bis ungefähr 4 Stunden erfasst werden. Dies ermöglicht das Screening Tausender von Verbindungen pro Detektor und Tag. Bei Anwendung von Synchrotron-Quellen steigt die Anzahl untersuchter Verbindungen auf mehrere Tausend pro Detektor, und mit Laue-Datenerfassungsverfahren und -Testmischungen können CrystaLEAD^TM-Daten in einer Sekunde oder weniger erfasst werden, was es möglich macht, Tausende von Verbindungen pro Tag und Strahlrohr zu testen. Somit erleichtern mehrere Detektoren oder ein einziges Synchrotron-Strahlrohr echtes Hochdurchsatz-Screening.
3 stellt eine Übersicht über die Erfindung dar. Kristalle des Zielmoleküls werden durch Durchtränken des Kristalls oder durch Co-Kristallisation des Ziels in Anwesenheit einer oder mehrerer Verbindungen einer oder mehreren Verbindungen ausgesetzt. Dann werden kristallographische Daten erfasst, verarbeitet und in Elektronendichtediagramme umgewandelt, die nach Hinweisen auf Ligandenbindung untersucht werden. Eine Möglichkeit, Ligandenbindung zu erfassen, besteht darin, die Struktur des ursprünglichen Kristalls mit der Struktur des exponierten Kristalls zu vergleichen.
Neue Ziele können durch veröffentlichte Bedingungen oder durch andere Verfahren, die im Fachgebiet gut etabliert sind, kristallisiert werden. Ähnlich können Zielstrukturen von Datenbanken, wie z. B. der Proteindatenbank, erhältlich sein oder durch gut etablierte Methodik bestimmt werden. Fortschritte in Molekularbiologie und Protein-Engineering fördern die Ziel-Kristallisation, während Fortschritte in der Datenerfassung die schnelle Strukturbestimmung bei Zielen mit zuvor unbekannter Struktur unterstützen.
Kristalle, die durch Tränken potenziellen Liganden ausgesetzt werden, benötigen eine leere, zugängliche aktive Stelle. Kristalle mit einer leeren aktiven Stelle können durch verschiedene Verfahren gewonnen werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Kristallisation in Abwesenheit eines Liganden, Kristallisation in Anwesenheit eines Liganden, der an einer distalen Stelle gebunden ist, oder Kristallisation in Anwesenheit eines nicht kovalenten Liganden, der leicht verdünnt oder vom Ziel ausgetauscht wird, sobald das Biomolekül kristallisiert. Durch ein neues Verfahren haben die Erfinder Kristalle von einem Biomolekül gewonnen durch Kristallisation des Biomoleküls in Anwesenheit eines abbaubaren Liganden an der aktiven Stelle und anschließenden Abbau des Liganden, sobald sich ein Kristall gebildet hatte. Alternativ ist es möglich, die Kristalle in Anwesenheit der zu untersuchenden Verbindungen zu züchten. Kristalle werden in Anwesenheit der Mischung äquilibrieren gelassen; an diesem Punkt binden sich die Liganden abhängig von ihrer Konzentration und Bindungsaffinität.
Bei dem Tränkverfahren^^ kann die Empfindlichkeit des Verfahrens durch einfache Gleichgewichtsbeziehungen approximiert werden, da die Konzentration von Protein im Kristall berechnet werden kann und die Konzentration des Liganden eine bekannte Größe ist. Zum Beispiel wird die Konzentration eines 25.000-MW-Proteins (Urokinase) in einem Kristall wie folgt berechnet: Es gibt 4 Moleküle in der orthorhombischen Elementarzelle (alle Winkel 90°), die ein Volumen von 55 × 53 × 82 Å³ hat; unter Anwendung der Avogadro'schen Zahl beträgt die Konzentration 28 mM. Daher resultiert eine Mischung aus Verbindungen mit einer 6 mM-Konzentration für jeden Liganden in einer berechneten Nachweisgrenze von Kd < 1,5 mM (unter Annahme einer Nachweisgrenze von ungefähr 80% Besetzung im Kristall).
Das Eintauchen von Mischungen von Verbindungen wirft auch die Frage der Mehrfach-Besetzung auf (mehrere Liganden binden sich an die Stelle von Interesse). In Fällen von Mehrfach-Besetzung, wo die Liganden in verschiedenen "Taschen" gebunden sind (siehe 2), ist die Auflösung durch CrystaLEAD^TM einfach, weil die Bindung an den separaten Stellen individuell durch die Elektronendichtediagramme unterschieden werden kann. In dem Szenario, in dem verschiedene Liganden um dieselbe Stelle konkurrieren, kann ein einfaches Konkurrenzhemmungs-Modell verwendet werden, um die Anforderungen für eine solche Bindung zu berechnen. Aufgrund von empirischer Beobachtung wird angenommen, dass Kristallographie in Situationen helfen kann, in denen die Besetzung durch einen Inhibitor 80% und durch einen anderen 20% beträgt. Daher würde ein Verhältnis der Bindungsaffinität, das größer ist als vier, in einer scheinbaren Besetzung nur durch den Liganden mit größerer Affinität resultieren. In dem unwahrscheinlichen Fall, in dem das Verhältnis der Bindungskonstanten von zwei Verbindungen in der Mischung weniger als vier beträgt, wäre die resultierende Elektronendichte ein gewichteter Durchschnitt der zwei separaten Dichten und könnte schwierig zu identifizieren sein. Daher wäre es nur dann nötig, weitere Tränkungs-Experimente zur differenzierten Betrachtung der Mischung vorzunehmen (z. B. zur Betrachtung jeder Verbindung einzeln in separaten Kristallen), wenn das Verhältnis der Bindungsaffinitäten kleiner als vier ist. Dies wäre nach wie vor lohnend und effizient, weil dadurch bereits festgestellt wird, dass mindestens zwei Treffer in der Mischung vorhanden sind.
Zu untersuchende Verbindungen werden in Bibliotheken gruppiert. Im Rahmen dieser Abhandlung sind Bibliotheken große Mischungen von Verbindungen (100–10.000+) und können allgemein oder strukturbezogen sein. Eine allgemeine Bibliothek ist unspezifisch, d. h. völlig heterogen in Bezug auf Größe, Form und Funktionalität. Eine strukturbezogene Bibliothek bezieht sich auf eine bestimmte funktionelle Mischung oder Unter-Regioin in der aktiven Stelle des Zielmoleküls (z. B. eine Bibliothek, worin alle Verbindungen eine Carboxylat-Funktionalität enthalten, die auf eine positive Ladung in der aktiven Stelle des Ziels gerichtet werden soll).
In einer bevorzugten Ausführungsform werden beide Arten von Bibliotheken in kleinere Gruppen von Mischungen mit heterogenen Formen aufgeteilt. Daher wird eine Mischung definiert als Teilmenge der Bibliothek, die in den Kristall eingetränkt oder eingewachsen sein kann. Die Mischung wird durch Sichtprüfung der zweidimensionalen chemischen Strukturen oder rechnerisch durch Programme als heterogene Formen habend bestimmt. Die Formdiversität der Mischung ermöglicht es, einen gebundenen Liganden direkt anhand des resultierenden Elektronendichtediagramms zu identifizieren (siehe 4). Dies beseitigt die Notwendigkeit von Folgeexperimenten, um zu bestimmen, welche Verbindung der Mischung ein Treffer (an das Ziel gebunden) ist.
Wenn die Testverbindungen wasserlöslich sind, können typische in der Kristallisation benutzte Puffer und Ausfällungsmittel-Lösungen verwendet werden, um die Mischungen löslich zu machen und den Kristall mit ihnen zu durchtränken. Weniger wasserlösliche Verbindungen werden einzeln bis zu einer Endkonzentration von 2 M in einem geeigneten organischen Lösungsmittel aufgelöst. In einer Ausführungsform werden sie in 100%igem DMSO aufgelöst und bei 4°C gelagert und gemischt durch Mischen der DMSO-Vorratslösungen vor Kontakt mit dem Kristall. Diese Mischungen genügen den meisten Kristallsystemen, wo die Bedingungen für Kristallwachstum keine organischen Reagenzien einschließen. Die Verbindungen werden typischerweise bis auf eine DMSO-Endkonzentration von 1–10% eingetränkt und mit dem kristallinen Protein über einen vordefinierten Zeitraum (4–24 Std.) äquilibrieren gelassen. In diesem Szenario wird jeder Kristall mehreren Verbindungen pro Eintränkmischung ausgesetzt. Manche Kristallwachstums-Bedingungen können eine hohe Konzentration von organischem Lösungsmittel (40–50%) einschließen, das typischerweise ein Alkoholderivat ist. In diesem Fall können die Verbindungs-Bibliotheken in dem organischen Kristallisations-Lösungsmittel aufgelöst werden, was eine Co-Solvens-Endkonzentration von 40–50% für das Eintränk-Experiment ermöglichen würde. Hier könnte die Anzahl von Verbindungen pro Eintränkmischung zunehmen.
Nach dem Durchtränken wird jeder Kristall einem Kälteschutzmittel, wie z. B. 5–20%igem Glycerol, in der Eintränkmischung ausgesetzt, in eine Nylonschlaufe platziert und auf die Röntgeneinheit unter einen kalten Stickstoffstrahl (160 K) gelegt. Die Kristalluntersuchungen können auch bei Raumtemperatur oder unter anderen geeigneten Bedingungen durchgeführt werden, je nachdem, wie es für die Stabilität der Kristalle nötig ist. Automatisierte Kristallplatzierungs- und -wechselausrüstung kann eingesetzt werden, um diesen Schritt des Verfahrens zu beschleunigen.
Es werden kristallographische Daten erfasst und verarbeitet, worin jeder Reflexion (jedem Punkt) im Beugungsmuster ein Index (h, k, l) zugewiesen und die Intensität als Standard im Feld gemessen wird. Die Röntgenquellen können Labor-Röntgengeneratoren oder Hochbrillanz-Synchrotron-Quellen sein, die eine Beugungs-Datenerfassung mit sehr hoher Geschwindigkeit gestatten. Genauer kann die Labordatenerfassung 30 Minuten bis mehrere Stunden pro Kristall dauern, während die Zeit bei Verwendung von Synchrotron-Quellen verkürzt werden kann. Die Datenerfassung pro Kristall kann mit Hilfe von Laue-Datenerfassungsschemata auf Bruchteile einer Sekunde reduziert werden.
Die Beugungsdaten werden dann durch Verfahren, die Personen mit durchschnittlichem Fachwissen vertraut sind, in Elektronendichtediagramme umgewandelt. Die Elektronendichtediagramme sind die dreidimensionalen Bilder der Liganden und/oder der Ziel-Biomoleküle.
Bei Fo-Fc-Diagrammen werden die berechneten Struktur-Faktor-Amplituden (|Fc|), die aus der bekannten Kristallstruktur ohne gebundenen Liganden gewonnen werden, von den beobachteten Amplituden (|Fo|) subtrahiert. So stellt dieses Diagramm eine direkte Subtraktion der Daten, die der natürlichen Proteinstruktur zu entnehmen sind, von Daten dar, die Kristallen zu entnehmen sind, welche in Anwesenheit einer Bibliotheks-Mischung durchtränkt werden. Das Ergebnis ist ein Elektronendichtediagramm, das positive und negative Peaks hat. Die Peaks, die CrystaLEAD^TM betreffen, sind die positiven, die das direkte Ergebnis der Ligandenbindung an der Stelle von Interesse am Ziel – d. h. des Hinzufügens des Liganden zum Ziel-Biomolekül – sind. In 3 zeigt das Fo-Fc-Diagramm deutlich einen hohen positiven Peak an der aktiven Stelle der Urokinase. Die Form des Peaks entspricht dem Liganden 2-Amino-8-hydroxychinolin. Der Ligand wird als die positive Differenz-Dicht einnehmend dargestellt. Die anderen positiven Peaks entsprechen einem gebundenen Sulfatanteil (dargestellt durch SO₄ ^2–) und gebundenen Wassermolekülen (dargestellt durch H₂O). Diese Art von Diagramm ist auch sehr empfindlich gegenüber kleinen strukturellen Änderungen (dargestellt durch Δ) und ermöglicht, wenn sie in Verbindung mit 2Fo-Fc-Diagrammen verwendet werden, die Bestimmung der detaillierten Struktur des gesamten Ligand-Protein-Komplexes. Zur Berechnung der 2Fo-Fc-Diagramme wird (|Fc|) von 2(|Fo|) subtrahiert. Hier ist das Diagramm positiv und hat Dichte für alle Atome des Moleküls.
In 3 zeigt eine Untersuchung des Diagramms die Identität und Struktur der gebundenen Verbindung an. Vorzugsweise werden die Diagramme exponierter Kristalle mit den Diagrammen des nicht exponierten Zielmoleküls verglichen, um die positive Dichte zu unterscheiden, die in dem Fo-Fc-Diagramm zu finden sein kann. Manchmal besetzen Wassermoleküle die aktive Stelle im Kristall in Abwesenheit eines gebundenen Liganden. Dies ist leicht zu erkennen, da gebundene Wassermoleküle oftmals in einer Geometrie ausgerichtet sind, die mit Wasserstoffbindung konsistent ist, und da sie nicht durch ein Netzwerk kovalenter Bindungen verbunden sind. Somit neigt das resultierende Diagramm dazu, unverbunden zu sein, was eher auf ein gebundenes Lösungsmittel als auf eine organische Verbindung hindeutet. Wenn festgestellt wird, dass die Dichte im Fo-Fc- oder 2Fo-Fc-Diagramm eine organische Verbindung darstellt, wird die dreidimensionale Form mit derjenigen der Verbindungen verglichen, die in der Bibliothek vorhanden sind, und ein Abgleich mit der besten Übereinstimmung wird vorgenommen. Alternativ können Programme wie die XFIT-Module von QUANTA (Molecular Simulations Inc., Quanta Generating and Displaying Molecules, San Diego: Molecular Simulations Inc., 1997) diesen Prozess automatisieren.
Während die Fähigkeit zur Messung oder Verarbeitung von Beugungsintensitäten verbessert wird, ist es möglicherweise nicht notwendig, den Vergleich an Elektronendichtediagrammen durchzuführen. Die Bindung kann erkannt werden, einfach indem die Beugungsmuster der exponierten Kristalle mit den nicht exponierten Kristallen verglichen werden. Daher muss ein Elektronendichtediagramm nur dann erstellt werden, wenn in diesem Vorklassierungs-Verfahren ein Bindungsereignis erfasst wird.
Wie oben gezeigt, kann CrystaLEAD^TM auf jedes biomolekulare Ziel angewandt werden, für das eine kristallographische Struktur gewonnen werden kann. Aufgrund seiner breiten Anwendbarkeit ist es am besten durch die unten stehenden Beispiele zu erläutern.
Die Urokinase- und VanX-Beispiele stehen für zwei Szenarien für die Anwendung von CrystaLEAD^TM. Bei Urokinase beugen die einem Re-Engineering unterzogenen MikroUK-(μUK-)Kristalle sehr gut und gehören zu einer Raumgruppe mit hoher Symmetrie. Hingegen beugen VanX-Kristalle schwächer und mit niedrigerer Symmetrie. Daher benötigt VanX eine längere Datenerfassungszeit. Außerdem haben Urokinase-Kristalle ein Molekül in der asymmetrischen Einheit, während VanX sechs hat. Die größere asymmetrische Einheit erfordert die Erfassung von Daten mit höherer Auflösung und macht die Begutachtung des Diagramms mühsamer. Bei VanX waren jedoch keine Nicht-Substrat-mimetischen Binder vor denjenigen bekannt, die durch CrystaLEAD^TM entdeckt wurden. Daher lieferte CrystaLEAD^TM eine neue Nicht-Peptid-Führungsverbindung, die in den Arzneimittel-Entdeckungszyklus eingeführt werden konnte. Im Fall von Urokinase lieferte CrystaLEAD^TM ein neues Primärgerüst. Anwender konnten die Wirksamkeit des Primärgerüsts rasch erhöhen, indem sie vorhandene SAR- und Kristallstrukturen nutzten, um ein Derivat mit höherer Affinität und verbesserter Bioverfügbarkeit gegenüber bekannten Urokinase-Liganden herzustellen.
Diese Beispiele stellen jedoch die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar und schränken die Ansprüche oder die Beschreibung nicht ein. Personen mit durchschnittlichem Fachwissen werden schnell erkennen, dass Änderungen und Modifikationen der angegebenen Ausführungsformen vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang und Geist der Erfindung abzuweichen. Schließlich sind alle Entgegenhaltungen hierin durch die Bezugnahme eingeschlossen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Urokinase
Urokinase, eine Serinprotease, ist eng mit Tumorzellen assoziiert. Urokinase aktiviert Plasminogen zu Plasmin, was wiederum die Matrix-Metall-Proteasen aktiviert. Plasmin und die Metall-Proteasen bauen die extrazelluläre Matrix ab und fördern Tumorwachstum und Metastase. Daher können Inhibitoren, die spezifisch auf Urokinase abzielen, als wirksame Antikrebsmittel dienen.
Human-Prourokinase besteht aus 411 Aminosäuren (5). Verde u. a., Proc. Nat'l Acad. Sci., v. 81(5), S. 4727–31 (1984); Nagai u. a., Gene, v. 36(1–2), S. 183–8 (1985). Bei Aktivierung durch proteolytische Spaltung an der Lys¹⁵⁸-Ile¹⁵⁹-Peptidbindung wird das Enzym zu zwei Ketten, die durch eine einzige Disulfidbrücke (Cys¹⁴⁸-Cys²⁷⁹) verbunden sind. Die A-Kette (Reste 1–158) enthält eine EGF-artige Domäne und eine Kringel-Domäne. Die B-Kette (Reste 159–411) enthält die katalytische Serinprotease-Domäne. Weitere Inkubation von Urokinase resultiert in einer zusätzlichen proteolytischen Spaltung an der Lys¹³⁵-Lys¹³⁶-Peptidbindung zur Bildung von Urokinase mit niedrigem Molekulargewicht. Kristalle dieser Enzymform im Komplex mit dem kovalenten Inhibitor Glu-Gly-Arg-Chlormethylketon wurden gewonnen von Spraggon u. a., Structure, v. 3, S. 681–91 (1995), und es wurde gezeigt, dass sie bei einer energiereichen Synchrotron-Quelle auf eine Auflösung von 2,5 Å beugen. Die schlechten Beugungseigenschaften dieser Kristalle, gemeinsam mit der Anwesenheit eines kovalent gebundenen Inhibitors, erschweren jedoch die Anwendung von CrystaLEAD^TM.
μUK-Kristall Herstellung & Struktur
Zur Implementierung von CrystaLEAD^TM wurde Human-Urokinase einem Re-Engineering unterzogen, so dass sie nur aus den Resten 159–404 der B-Kette bestand, worin Asn³⁰² zum Entfernen einer Glykosylierungs-Stelle durch ein Glutamin ersetzt wurde und Cys²⁷⁹ zum Entfernen des freien Sulfhydryl-Anteils durch ein Alanin ersetzt wurde. Es wurde gezeigt, dass diese Form von Urokinase (μUK) vollständig aktiv war, und es wurde festgestellt, dass sie in einer Kristallform kristallisierte, die mit CrystaLEADTM kompatibel war. (Siehe auch U.S.-Patent Nr. 5,112,755 , erteilt am 12. Mai 1992, von Heyneker u. a.)
Herstellung des Vektor-Konstrukts pBC-LMW-UK-Ala²⁷⁹
Mutanten von Human-UK wurden in einen dicistronischen bakteriellen Expressionsvektor pBCFK12 geklont. Pilot-Matias u. a., Gene, v. 128, S. 219–25 (1993). Die folgenden Oligonukleotide wurden verwendet, um verschiedene UK-Mutanten durch PCR herzustellen:
Das ursprüngliche Klonen einer UK mit niedrigem Molekulargewicht, im Folgenden bezeichnet als LMW-UK (L¹⁴⁴-L⁴¹¹), wurde durchgeführt unter Verwendung von Human-UK-cDNA als Matrize und SEQ-ID-NR. 1 und 2 als Primern in einer Standard-PCR-Reaktion. Die durch PCR amplifizierte DNA wurde mit Gel gereinigt und mit den Restriktionsenzymen SalI und HindIII abgebaut. Das abgebaute Produkt wurde dann zur Erzeugung des Expressionsvektors pBC-LMW-UK in einen pBCFK12-Vektor ligiert, der zuvor mit denselben zwei Enzymen durchgeschnitten worden war. Der Vektor wurde in DH5α-Zellen umgewandelt (Life Technologies, Gaithersburg, MD), isoliert, und die Sequenz wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Die Produktion von LMW-UK in Bakterien wurde analysiert durch SDS-PAGE und Zymographie, Granelli-Piperno u. a., J. Exp. Med., v. 148, S. 223–34 (1978), welche die Plasminogen-Aktivierung durch UK misst. Diese LMW-UK wurde in E. coli exprimiert, und dass sie im Zymographie-Assay aktiv war, wurde durch Commassie Blau-gefärbtes Gel demonstriert.
Der Erfolg der schnellen Expression und des schnellen Nachweises von LMW-UK in E. coli machte es möglich, eine Mutagenese-Analyse von UK durchzuführen, um ihre minimale funktionelle Struktur zu bestimmen. Ein Mutant, bei dem Cys²⁷⁹ durch Ala²⁷⁹ ersetzt wurde, wurde durch PCR mit SEQ-ID Nrn. 2 und 3 hergestellt. Das PCR-Produkt wurde mit AviII und HindIII durchgeschnitten und verwendet, um ein AviII- und HindIII-Fragment im pBC-LMW-UK-Konstrukt zu ersetzen. Das resultierende pBC-LMW-UK-Ala²⁷⁹-Konstrukt wurde in E. coli exprimiert, und durch Zymographie wurde gezeigt, dass das Produkt aktiv war.
Klonen und Exprimieren von μUK (UK(I¹⁵⁹-K⁴⁰⁴)A²⁷⁹Q³⁰²) in Baculovirus
μUK (UK-Aminosäuren Ile¹⁵⁹-Lys⁴⁰⁴, die Ala²⁷⁹Gln³⁰² enthalten) wurde durch PCR mit den folgenden Oligonukleotid-Primern erzeugt:
Zur Mutation der einzigen Glykosylierungs-Stelle (Asn³⁰²) in UK wurden die Oligonukleotid-Primer Seq-ID Nrn. 4 und 6 und Seq-ID Nrn. 5 und 8 in zwei PCR-Reaktionen mit pBC-LMW-UK-Ala²⁷⁹ als Matrize verwendet. Die zwei PCR-Produkte wurden mit Restriktionsenzym PvuII durchgeschnitten, mit T4 DNA-Ligase ligiert und als Matrize zur Herstellung von LMW-UK-A²⁷⁹-Q³⁰² verwendet. In der Zwischenzeit wurde natürliche UK-Führungssequenz durch PCR mit Seq-ID Nrn. 7 und 9 unter Verwendung natürlicher UK-cDNA als Matrize direkt an Ile¹⁵⁹ ankondensiert.
Dieses PCR-Produkt wurde, gemeinsam mit Seq-ID Nr. 8, als Primer in einer neuen PCR-Reaktion mit LMW-UK-A²⁷⁹-Q³⁰²-DNA als Matrize zur Herstellung von μUK-cDNA verwendet. μUK wurde mit NheI durchgeschnitten und an einen Baculovirus-Transfer-Vektor pJVP10z ligiert, der mit demselben Enzym durchgeschnitten war. Vialard u. a., J. Virology, v. 64(1); S. 37–50, (1990). Das resultierende Konstrukt, pJVP10z-μUK, wurde durch Standard-DNA-Sequenzierungsverfahren bestätigt.
Das Konstrukt pJVP10z-μUK wurde durch das Kalziumphosphat-Präzipitationsverfahren unter Verwendung des BaculoGold-Kits von PharMingen (San Diego, CA) in Sf9-Zellen transfiziert. Aktive μUK-Aktivität wurde im Kulturmedium erfasst. Einzelne rekombinante Virus-exprimierende μUK wurde durch Standardverfahren von Plaque gereinigt, und ein großer Vorrat des Virus wurde hergestellt.
Die Expression von μUK in großem Maßstab wurde in einer anderen Linie von Insektenzellen, High-Five-Zellen (Invitrogen, Carlsbad, CA), in einer Suspension vorgenommen, die in Excel 405 serumfreiem Medium (JRH Biosciences, LeneXa, KS) in 2-Liter- Kolben wuchsen, unter Schütteln bei 80 U/min und 28°C. High-Five-Zellen wurden auf 2 × 10⁶ Zellen/ml gezüchtet, rekombiniertes μUK-Virus wurde bei 0,1 Multiplizität der Infektion hinzugefügt, und die Kultur wurde 3 Tage lang fortgesetzt. Die überstehende Kulturflüssigkeit wurde als Ausgangsmaterial für die Reinigung geerntet. Die Aktivität von μUK in der überstehenden Kulturflüssigkeit wurde durch Amidolyse eines UK-Farbsubstrats S2444 gemessen, was 6–10 mg/Liter betrug. Claeson u. a., Haemostasis, v. 7, S. 76 (1978).
Expression von μUK in Pichia pastoris
Zur Expression von μUK in Pichia wurde ein Expressionsvektor mit einer synthetischen Führungssequenz verwendet. Der Pichia-Expressionsvektor, pHil-D8, wurde konstruiert, indem der Vektor pHil-D2 (Invitrogen) modifiziert wurde, um eine synthetische Führungssequenz zur Sekretion eines rekombinierten Proteins einzuschließen. Die Führungssequenz 5'-ATGTTCTCTCCAATTTTGTCCTTGGAAATTATTTTAGCTTTGGCTACTTTGCAAT CTGTCTTCGCTCAGCCAGTTATCTGCACTACCGTTGGTTCCGCTGCCGAGGGATCC-3' (Seq-ID Nr. 10) codiert ein PHO1-Sekretionssignal (dargestellt durch die einfache Unterstreichung), operativ verbunden mit einer Propeptid-Sequenz (fett dargestellt) für die KEX2-Spaltung. Um pHil-D8 zu konstruieren, wurde PCR durchgeführt unter Verwendung von pHil-S1 (Invitrogen) als Matrize, da dieser Vektor die Sequenz enthält, die PHO1 codiert, wobei ein Vorwärts-Primer (Seq-ID Nr. 11) den Nukleotiden 509–530 von pHil-S1 entspricht und ein Rückwärts-Primer (Seq-ID Nr. 12) eine Nukleotidsequenz hat, die den hinteren Teil des PHO1-Sekretionssignals (Nukleotide 45–66 der Seq-ID Nr. 10) codiert, und die Propeptid-Sequenz (Nukleotide 67–108 von Seq-ID Nr. 10). Die Primer-Sequenzen (bezogen von Operon Technologies, Inc. Alameda, CA) waren wie folgt:
Die Amplifizierzung wurde unter Standard-PCR-Bedingungen durchgeführt. Das PCR-Produkt (ungefähr 500 bp) wurde mit Gel gereinigt, mit BlpI und EcoRI durchgeschnitten und an pHil-D2 ligiert, das mit denselben Enzymen durchgeschnitten worden war. Die DNA wurde in E. coli-HB101-Zellen umgewandelt, und positive Klone wurden durch Abbau des Restriktionsenzyms und Sequenzanalyse identifiziert. Ein Klon, der die passende Sequenz hatte, wurde als pHil-D8 bezeichnet.
Die folgenden zwei Oligonukleotid-Primer wurden dann verwendet, um μUK zum Klonen in pHil-D8 zu amplifizieren.
Das PCR-Produkt wurde mit den Seq-ID-Nrn. 13 und 14 gewonnen, unter Verwendung von pJVP10z-μUK als Matrize. Das vergrößerte Produkt wurde mit BamHI und XhoI durchgeschnitten und an pHil-D8 ligiert, das mit denselben zwei Enzymen durchgeschnitten war. Das resultierende Plasmid, pHilD8-μUK, wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt und verwendet, um einen Pichia-Stamm GS115 (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers umzuwandeln. Umgewandelte Pichia-Kolonien wurden durch Wachstum in BMGY-Medium und Expression in BMMY-Medium wie vom Hersteller (Invitrogen) angegeben auf μUK-Expression hin untersucht. Die μUK-Aktivität wurde mit dem Farbsubstrat S2444 gemessen. Das μUK-Expressionsniveau bei Pichia war höher als dasjenige, das bei Baculovirus-High-Five-Zellen beobachtet worden war, und lag in dem Bereich von 30–60 mg/l.
Reinigung von μUK
Die überstehende Kulturflüssigkeit entweder von High Five-Zellen oder von Pichia wurde in einen 20-Liter-Behälter gepoolt. Proteaseinhibitoren, Iodoacetamid, Benzamidin und EDTA wurden bis zu einer Endkonzentration von ungefähr 10 mM, 5 mM bzw. 1 mM hinzugefügt. Der Überstand wurde dann durch Hinzufügen von 5 mM Hepes-Puffer pH 7,5 5-fach verdünnt und durch 1,2 μ- und 0,2 μ- Filtermembranen gegeben. Die μUK wurde auf einem Sartorius-Membranadsorber S100 (Sartorius, Edgewood, NY) eingefangen, indem sie mit einer Fließrate von 50~100 ml/min durch die Membran gegeben wurde. Nach extensivem Waschen mit 10 mM Hepes-Puffer, pH 7,5, 10 mM Iodoacetamid, 5 mM Benzamidin, 1 mM EDTA wurde μUK von der S100-Membran mit einem NaCl-Gradienten (20 mM bis 500 mM, 200 ml) in 10 mM Hepes-Puffer, pH 7,5, 10 mM Iodoacetamid, 5 mM Benzamidin, 1 mM EDTA eluiert. Das Eluat (~100 ml) wurde 10-mal in 10 mM Hepes-Puffer verdünnt, der Inhibitoren enthielt, und auf eine S20-Säule (BioRad, Hercules, CA) geladen. μUK wurde mit einem 20×-Säulen-Volumen-NaCl-Gradienten (20 mM bis 500 mM) eluiert. Es wurden keine Inhibitoren in den Elutionspuffern verwendet. Das Eluat wurde dann 5-fach mit 10 mM Hepes-Puffer, pH 7,5, verdünnt und auf eine Heparin-Agarose-(Sigma)Säule geladen. μUK wurde mit einem NaCl-Gradienten von 10 mM bis 250 mM eluiert. Das Heparinsäulen-Eluat von μUK (~50 ml) wurde auf eine Benzamidin-Agarose-(Sigma, St. Louis, MO)Säule (40 ml) aufgetragen, äquilibriert mit 10 mM Hepes-Puffer, pH 7,5, 200 mM NaCl. Die Säule wurde dann mit dem Äquilibrierungspuffer gewaschen und mit 50 mM NaOAc, pH 4,5, 500 mM NaCl eluiert. Das μUK-Eluat (~30 ml) wurde durch Ultrafiltration auf 4 ml konzentriert und auf eine Sephadex G-75-Säule (2,5 × 48 cm; Pharmacia^® Biotech, Uppsala, Schweden) aufgetragen, äquilibriert mit 20 mM NaOAc, pH 4,5, 100 mM NaCl. Der einzige signifikante Peak, der μUK enthielt, wurde erfasst und als Endprodukt gefriergetrocknet. Das gereinigte Material erschien auf SDS-PAGE als einzige signifikante Bande.
μUK-Kristalle von hoher Qualität erleichterten die Bestimmung ihrer apo-dreidimensionalen Struktur durch Röntgenkristallographie mit einer Auflösung von 1,0 Å. Kristalle wurden gewonnen durch das Hanging Drop Vapor-Diffusionsverfahren. Typische Vertiefungs-Lösungen bestanden aus 0,15 M Li₂SO₄, 20% Polyethylenglykol MW 4000 und Succinatpuffer pH 4,8–6,0. Auf dem Deckglas wurden 2 μl Vertiefungs-Lösung mit 2 μl Proteinlösung vermischt, und das Glas wurde über der Vertiefung versiegelt. Kristallisation fand bei ungefähr 18–24°C innerhalb von 24 Stunden statt. Die Proteinlösung enthielt 6 mg/ml (0,214 mM) μUK in 10 mM Citrat pH4,0, 3 mM ε-Aminohexansäure-p-carbethoxyphenylesterchlorid (Inhibitor) mit 1% DMSO-Co-Solvens. Es wird angenommen, dass der in der Co-Kristallisation verwendete Inhibitor das Serin 195 an der aktiven Stelle acyliert und anschließend enzymatisch desacyliert wird, da die 3-D-Röntgenstruktur von Kristallen, die in Anwesenheit dieser Verbindung wachsen, keinen Inhibitor aufweist, der an der Enzym-aktiven Stelle bleibt. Menegatti u. a., J. Enzyme Inhibition, v. 2, S. 249–59 (1989). Die einzige vorhandene Dichte ist auf gebundene Lösungsmittelmoleküle zurückzuführen. Da μUK in Abwesenheit des Inhibitors nicht kristallisiert, wird angenommen, dass der metastabile Inhibitor-UK-Komplex die Kristallisationseinheit ist. Wichtig ist, dass die resultierenden μUK-Kristalle aus Enzym mit einer leeren aktiven Stelle bestehen, was der Idealfall für die Implementierung von CrystaLEAD^TM ist.
Unter diesen Bedingungen gewonnene Kristalle gehören zur Raumgruppe P2₁2₁2₁ mit Elementarzellen-Maßen von a = 55,16 Ǻ b = 53,00 Ǻ c = 82,30 Ǻ und α = β = γ = 90°. Sie beugen auf mehr als 1,5 Ǻ auf einer Drehanoden-Quelle. Weiterhin ist ein nativer Datensatz mit 1,0 Ǻ Auflösung an der Cornell High Energy Synchrotron Source in Ithaca, New York, erfasst worden. Die Kristallstruktur wurde bestimmt durch das Molekül-Ersetzungsverfahren mit Hilfe des AMORE-Programms, Navaza, J. Acta Cryst., A50: 157–163 (1994), mit der niedrig auflösenden Urokinasestruktur als Sonde, Spraggon u. a., Structure, v. 3, S. 681–691 (1995); PDB-Eintrag 1LMW. Die Struktur wurde mit dem XPLOR-Programmpaket, A. Brunger, X-PLOR (Version 2.1) Manual, Yale University, New Haven CT (1990) verfeinert.
Screening nach schwachen Basen
Die μUK wurde anhand einer strukturbezogenen Bibliothek untersucht, um ein neues Primärgerüst mit günstigen pharmakokinetischen Eigenschaften zu finden. Da die aktive Stelle der Urokinase aus einer Primär-"Tasche" besteht, die einen freien Carboxylat-Anteil in Form einer Asparaginsäure (Asp¹⁸⁹) enthält, sind die meisten bekannten Gerüste stark basisch und enthalten Amidin- oder Guanidin-Anteile. Es ist festgestellt worden, dass die basische Gruppe eine Wasserstoff-Ionenbindung mit Asp¹⁸⁹ ein geht. Dies kann pharmakologisch ein Problem darstellen, da starke Basen dafür bekannt sind, dass sie die orale Bioverfügbarkeit vermindern. Daher wurde eine schwach basische Bibliothek mit Verbindungen ausgewählt, die nicht zuvor als Urokinase-Liganden bekannt waren.
Eine Bibliothek schwacher Basen, die 61 Verbindungen mit pKa zwischen ungefähr 1 und 9 enthielt, befand sich im Verzeichnis verfügbarer Chemikalien (Available Chemicals Directory, ACD). Die Bibliothek wurde in 9 Mischungen ungefähr 6 bis 7 heterogen geformte Verbindungen, wie durch Sichtprüfung der zweidimensionalen chemischen Struktur bestimmt, unterteilt. Die Verbindungsmischungen wurden mit dem oben beschriebenen Verfahren untersucht. Genauer wurde jede Verbindung in 100% DMSO bis zu einer Endkonzentration von ungefähr 2 M (oder Sättigung bei den weniger löslichen Verbindungen) aufgelöst. Gleiche Volumen jeder der 6 oder 7 Verbindungen, die die Mischung bildeten, wurden zu einer Endkonzentration der einzelnen Verbindungen von 0,33 M vermischt. Einzelne μUK-Kristalle wurden in 50 ml von 27% PEG 4000 gegeben, 15,6 mM Succinat pH 5,4, 0,17 M Li₂SO₄ und 0,5–0,8 ml der Verbindungsmischung wurden hinzugefügt, um 1 bis 1,6% DMSO und 3,3 bis 5,2 mM der Endkonzentration der einzelnen Verbindungen zu ergeben. Unter diesen Bedingungen wird erwartet, dass die Empfindlichkeit des Experiments Liganden mit Kd < 1,0 mM erfassen kann. Die Kristalle wurden ungefähr 8–24 Stunden lang äquilibrieren gelassen.
Daten wurden auf einer Rigaku RTP 300 RC-Drehanoden-Quelle mit einem RAXISII- oder MAR-Bildplattendetektor erfasst. Typische Daten bestanden aus 45–50 2°-Oszillationen mit Belichtungen von 2–5 min. Typische Daten waren zu 70–90% vollständig bei 2,0–3,0 Å Auflösung mit verschmelzenden R-Faktoren von 13–26%. Somit reichte die Datenqualität von gut bis schwach aufgrund des schnellen Datenerfassungs-Protokolls. Diese Qualität der Daten erwies sich jedoch als geeignet für die Erfassung von Liganden, hauptsächlich aufgrund der hohen Qualität des Ausgangsmodells, das auf eine Auflösung von 1,5 Å verfeinert worden war (R = 20,7% R_frei = 25,3%). Daten wurden verarbeitet durch das DENZO-Programmpaket, Otwinowski u. a., Methods in Enzymolo qy, 276 (1996), und die Elektronendichtediagramme wurden von dem XPLOR-Paket berechnet.
Elektronendichtediagramme wurden mit dem QUANTA 97-Programmpaket (Molecular Simulations Inc., Quanta Generating and Displaying Molecules, San Diego: Molecular Simulations Inc., 1997) auf einer Silicon Graphics INDIGO2-Workstation untersucht. Die Form der Dichte an der aktiven Stelle wurde visuell identifiziert als aus einer (oder mehreren) der Verbindungen in der Mischung resultierend, was auf einen positiven Treffer hindeutete, oder aus geordneten Wassermolekülen, was auf fehlende Bindung hindeutete. Bei Experimenten, die einen positiven Treffer ergaben, wurde die entsprechende Verbindung visuell in die Elektronendichte bewegt. Die Elektronendichtediagramme wurden auch auf Änderungen in der Proteinstruktur hin überprüft, und falls solche beobachtet wurden, wurden die entsprechenden Modifikationen vorgenommen. Somit war nach dem Schritt der Diagramm-Überprüfung und der Verbindungs-Einpassung die dreidimensionale Struktur des Verbindungs-Protein-Komplexes bekannt. Das Urokinase-Beispiel verwendete die visuelle Bewegung der Verbindung in die Dichte, weil das Screening noch in kleinem Maßstab stattfand. Bei Erweiterung auf Verbindungs-Screening in größerem Maßstab erleichtern handelsübliche Programme, wie das XFIT-Modul von QUANTA, die automatische Einpassung der Verbindung in die Dichte.
6 zeigt ein Beispiel für einen positiven Treffer. Die untersuchten Verbindungen sind von 1 bis 6 durchnummeriert, und das Fo-Fc-Elektronendichtediagramm an der aktiven Stelle ist in 6A dargestellt. Die Form der Dichte kennzeichnete den Liganden als Verbindung 5. 6B zeigt den genauen Bindungsmodus der Verbindung in der primären Spezifitäts-"Tasche", wie er direkt durch Interpretation des CrystaLEAD^TM-Elektronendichtediagramms gewonnen wird. Der Amino-Stickstoff-Wasserstoff bindet sich an das Asp¹⁸⁹-Carboxyl, und der Pyrimidyl-Stickstoff-Wasserstoff bindet sich an ein Hauptketten-Carbonyl (Gly²¹⁸). Die Struktur zeigt auch, dass die ideale Stelle für die Modifikation am Pyridylmethyl wäre.
Eine andere Mischung von Verbindungen (Verbindungen 7 bis 13) erzeugte keine Treffer. Das resultierende Elektronendichtediagramm nach dem Eintauchen dieser Gruppe entsprach keinem von irgendeiner der getesteten Verbindungen in dieser Mischung. Stattdessen entsprechen sie gebundenen Lösungsmittel-Molekülen. Siehe 6C.
7 zeigt ein weiteres Beispiel für einen positiven Treffer. Von den sieben untersuchten Verbindungen (14–20) wird in dem in 7A gezeigten Fo-Fc-Diagramm die Verbindung 19 als gebunden angezeigt. Der in 7B dargestellte Bindungsmodus zeigt, dass das 2-Amino mit der Asp¹⁸⁹-Seitenkette eine Wasserstoffbindung eingeht und dass das 8-Hydroxyl eine ideale Stelle für die Substitution ist, um Zugang zur benachbarten hydrophoben "Unter-Tasche" (bezeichnet als S1β in 7B) zu erlangen. 8 stellt einen weiteren Treffer dar, worin festgestellt wurde, dass Verbindung 22, 5-Aminoindol (8A) sich an Urokinase band, wobei die Aminogruppe eine Wasserstoffbindung mit Asp189 einging (8B). Die untersuchten Verbindungen waren die Verbindungen 21–27.
9 zeigt ein Beispiel, worin festgestellt wurde, dass zwei Verbindungen aus derselben Mischung (Verbindungen 28–34) sich ohne Probleme mit Mehrfach-Besetzung banden. In dem ursprünglichen Experiment, worin das Kristall in Gegenwart der gesamten Verbindungsmischung durchtränkt wurde, wurde festgestellt, dass sich Verbindung 28 band (9A). Außerdem wurde festgestellt, dass, wenn die schwächer bindende Verbindung 31 einzeln durchtränkte (basierend auf früheren Struktur-Aktivitäts-Beziehungen, die durch CrystaLEAD^TM hergestellt wurden), sie sich ebenfalls band (9B). In einer typischeren Anwendung des Verfahrens würde eine Bibliothek in Abwesenheit des stärkeren Liganden erneut durchtränken, um schwächere Liganden in der Mischung zu erfassen, falls gewünscht.

Tabelle 1 fasst die Inhibitionskonstanten für jeden der CrystaLEAD^TM-Treffer zusammen, wie sie durch Pyro-Glu-Gly-Arg-pNA/HCl-(S-2444, Chromogenix)Farbaktivität bestimmt werden. Tests wurden sowohl bei pH 6,5 (0,1 M NaPO₄) als auch 7,4 (50 mM Tris) abgeschlossen. Weitere Bedingungen des Tests waren 150 mM NaCl, 0,5% Pluronic F-68-Reinigungsmittel, 200 mM S-2444, mit einer DMSO-Endkonzentration von 2,5%. Es wurde ermittelt, dass der Km-Wert des Substrats 55 μM betrug. Tabelle 1: Inhibitionskonstanten und pKa für Treffer, die durch CrystaLEAD^TM erfasst wurden

Verbindung (CAS #)	Ki (pH 6,5)	Ki (pH 7,4)	pka
5(42753-71-9)	>> 500 μM	>> 500 μM	6,0*
19(70125-16-5)	56 μM	137 μM	7,3
22(65795-92-8)	200 μM	> 500 μM	6,0*
28(580-22-3)	71 μM	136 μM	7,3
31(1603-41-4)	>> 500 μM	>> 500 μM	7,0*

• zeigt geschätztes pKa an

Anhand der Aktivität und Strukturinformation wurde Verbindung 19 als Führungsverbindung ausgewählt. Kristallographische Informationen deuteten darauf hin, dass Substitution an der 8-Position den Zugang zu der benachbarten hydrophoben "Tasche" (S1β) ermöglichen und dadurch zu einer Erhöhung der Wirksamkeit führen sollte. Anhand kristallographischer und Bindungs-Informationen aus einer Amidin-basierten Reihe wurde Verbindung 35 synthetisiert (das 8-Aminopyrimidinyl-Analog von Verbindung 19). Diese Modifikation resultierte in einer ungefähr 200-fachen Erhöhung der Bindungs-Wirksamkeit bei pH 6,5 (Ki pH 7,4 = 2,5 μM; Ki pH 6,5 = 0,32 μM). Das Experiment weist darauf hin, dass CrystaLEAD^TM sowohl ein Führungsgerüst als auch die detaillierten Struktur-Informationen bereitstellen kann, die nötig sind, um dieses Gerüst durch strukturbasiertes Arzneimittel-Design zu einer wirksameren Verbindung auszubauen.
In 10 sind eine Überlagerung der Kristallverbindung 35: Urokinase und der Stammverbindung 19 dargestellt. Die Überlagerung zeigt, dass der Aminopyridinring in der hydrophoben Unter-"Tasche" (S1β) gebunden ist wie vorhergesagt und dass diese Substitution in der Bewegung des Chinolinrings zu dieser Stelle hin resultiert.
Verbindung 35, das 8-Aminopyrimidinyl-2-aminochinolin, wurde auch auf orale Bioverfügbarkeit hin getestet. Es wurde ermittelt, dass Verbindung 35 für Ratten zu 30–40% oral biologisch verfügbar ist, wenn sie in einer Dosis von 10 mg/kg verabreicht wird. Somit resultierte die erfolgreiche Implementierung von CrystaLEAD^TM in einem neuen Führungsgerüst, das durch einen Zyklus des strukturbasierten Arzneimittel-Designs eine Verbindung mit einer 200-fach höheren Wirksamkeit erzeugte und von dem festgestellt wurde, dass es oral biologisch verfügbar war.
Beispiel 2: VanX
Vancomycin ist das Arzneimittel der Wahl gegen Infektionen, die durch Streptokokken- oder Staphylokokken-Bakterienstämme verursacht werden, die resistent gegen β-Lactam-Antibiotika sind. Nun sind jedoch Stämme von gegen Vancomycin resistenten Bakterien für dieses Arzneimittel der letzten Zuflucht gefunden worden. Manche Forscher haben VanX, eine Metallproteinase, mit Vancomycin-Resistenz in Verbindung gebracht. VanX ist Teil einer Kaskade, die in einer Ersetzung des endständigen D-Ala-D-Ala-Anteils der bakteriellen Peptidoglykan-Kette (der Bindungsstelle für Vancomycin) durch ein D-Ala-D-Lactat resultiert. Dies führt zu einer 1000-fachen Abschwächung der Vancomycin-Bindung. Die einzigen bekannten Inhibitoren von VanX sind Peptide oder Peptidderivate, wie z. B. Phosphonat- oder Phosphinat-Analoge des D-Ala-D-Ala-Substrats. Als solche sind sie keine geeigneten Arzneimittel, weil sie in vivo metabolisiert und/oder abgebaut werden. Erste Versuche, durch normale Screening-Verfahren geeignete Arzneimittel zu finden, ergaben keinen geeigneten Liganden. Danach griffen Anwender auf CrystaLEAD^TM zurück, um eine Nicht-Peptid-Führungsverbindung zum Zwecke der Arzneimittelentwicklung für eine Behandlung dieser resistenten Stämme zu finden.
Herstellung von VanX
E. coli W3110, das Plasmid pGW1 enthielt, worin das VanX-Gen unter Kontrolle des IPTG-induzierbaren tac-Promotors ist, wurde bei 37°C in LB-Medium gezüchtet, das Ampicillin (100 μg/ml) enthielt, bis zu einer Absorbanz von ungefähr 1,3–1,5 bei 595 nm. Dann wurde IPTG bis zu einer Endkonzentration von 0,8 mM hinzugefügt, und die Zellen wurden weitere 1,5 Stunden lang wachsen gelassen.
Zellen wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 6000 U/min geerntet. Dann wurde das Pellet in eiskaltem 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) erneut suspendiert, das 0,01% NaN₃, 1 mM MgCl₂, 1 mM PMSF, 1 mM DTT (Puffer A) und 25 Einheiten/ml Benzonase (Nicomed Pharma, Kopenhagen, Dänemark) enthielt. Die Zellen wurden lysiert durch Hinzugabe von 0,1-Mikron-Zirconiumoxid-Keramikkügelchen zu der Lysatmischung (1:1 v:v), mit einem 1–3-minütigen Durchlauf in einem Bead Beater (Biospec), einer Ultraschall-Perlmühle. Der Bead Beater wurde mit einem eisgepackten Behälter zur Aufbewahrung eines gekühlten Lysats betrieben. Dann wurde das Lysat von den abgesetzten Glaskügelchen dekantiert. Die Kügelchen wurden dann mit 1–2 Volumen Lysepuffer gespült, und die Wäschen wurden dann mit dem ursprünglichen Lysat in einen Pool gegeben. Das Lysat wurde bei 25000 g 30 Minuten lang zentrifugiert, um das Absetzen von Zelltrümmern zu fördern. Der Überstand wurde über Nacht bei 4°C in 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mm EDTA und 1 mM DTT (Puffer B) dialysiert.
Danach wurde das dialysierte Lysat auf eine Q-Sepharose-Schnellfluss-Säule, voräquilibriert in Puffer A mit einer Geschwindigkeit von vier Millimetern pro Minute, geladen. Die Säule wurde erschöpfend mit dem Puffer A gewaschen, gefolgt von einem linearen Gradienten von Puffer B zu Puffer B + 0,5 M NaCl. Die aktiven VanX-Fraktionen aus diesem Schritt wurden in einen Pool getan, konzentriert und dann auf eine Superose-75-Säule in Puffer B aufgetragen. VanX-Fraktionen aus dem Superose-Säulen-Durchlauf wurden dann auf eine Source-Q-Säule in Puffer A mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min aufgetragen. Die Säule wurde über mehrere Säulenvolumen mit Ausgangspuffer gewaschen.
Dann wurde das VanX-Protein mit einem flachen Gradienten von Puffer A zu Puffer A + 25 mM NaCl eluiert. Die aktiven VanX-Fraktionen aus diesem abschließenden Schritt wurden mit Amicon-Filtern auf eine Endkonzentration von ungefähr 15 mg/ml in Puffer A konzentriert. Soweit nicht anders angegeben, wurde das oben erwähnte Verfahren bei 4°C durchgeführt. Nach der Reinigung war das VanX-Protein zu ungefähr 95% rein und kristallisierte rasch.
VanX-Kristallstruktur
Die Kristallstruktur von VanX wurde mit 2,2 Å Auflösung durch mehrfachen isomorphen Ersatz bestimmt. Bussiere u. a., Molecular Cell, Band 2, S. 75–84 (1998). Das oben gewonnene Rekombinations-Protein wurde in der Raumgruppe P2₁ durch das "Sitting Drop Vapor"-Diffusionsverfahren kristallisiert. Typische Kristalle hatten Elementarzellen-Maße von a = 83,4 Å, b = 45,5 Å, c = 171,4 Å, α = γ = 90°, β = 104°, mit sechs Molekülen in der asymmetrischen Einheit. Typische Vertiefungs-Lösungen bestehen aus 0,1 M Mes pH 6,4, 0,24 M Ammoniumsulfat und 20% PMME 5000. Auf der Sitting Drop-Mikrobrücke (Hampton USA) werden 2 ml Protein mit 2 ml Vertiefungs-Lösung gemischt, und die Kammer wird mit einem Deckglas abgedeckt. Kristallisation findet bei 18°C statt, und die Kristalle wachsen in ungefähr 2–3 Tagen auf ihre volle Größe. Die Proteinlösung besteht aus 12–15 mg/ml (0,5–0,6 mM) VanX in 10 mM Tris, 15 mM DTT, pH 7,2. Die 3-D-Struktur von Kristallen, die unter diesen Bedingungen gezüchtet wurden, zeigt eine leere aktive Stelle, was dies zu einem System macht, das für die Anwendung von CrystaLEAD^TM sehr gut geeignet ist.
Die aktive Stelle von VanX hat eine erweiterte "Tasche", die das D-Ala-D-Ala-Substrat aufnehmen kann. Die "Tasche" enthält auch katalytisches Zink. Daher wurde für diesen Fall VanX zunächst im Vergleich zu Zink-bezogenen Bibliotheken gescreent, zum Finden mehrfach bindender Gerüste, die zu einer einzigen Führungsverbindung vereinigt werden könnten. Drei Bibliotheken, die Aminosäure, Thiol, Hydroxamsäure oder auf Zink gerichtete Carboxylat-Anteile verwendeten, wurden durchsucht.
Screening
Die Aminosäure-Bibliothek bestand aus 102 Verbindungen optisch reiner handelsüblicher natürlicher und nicht natürlich vorkommender Aminosäuren. Die Bibliothek wurde in 12 Mischungen von 8–10 Verbindungen heterogener Form unterteilt und mit dem oben beschriebenen Verfahren untersucht. Genauer wurde jede Verbindung bis zu einer Endkonzentration von 2 M (oder Sättigung bei den weniger löslichen Verbindungen) in 100% DMSO aufgelöst. Gleiche Volumina jeder Verbindung jeder Mischung wurden bis zu einer Endkonzentration der einzelnen Verbindungen von 0,33 M gemischt. Einzelne VanX-Kristalle wurden in 50 ml von 0,1 M Mes pH 6,4 gegeben, 0,24 M Ammoniumsulfat, 20% PMME 5000 und 0,5–0,8 ml der Verbindungsmischung wurden hinzugefügt, um 1 bis 1,6% DMSO und 3,3 bis 5,2 mM Endkonzentration der einzelnen Verbindungen zu ergeben. Die Kristalle wurden 3–4 Stunden lang äquilibrieren gelassen. Die Thiol-, Hydroxam- und Carboxylat-Bibliotheken wurden auf ähnliche Art hergestellt und untersucht.
Daten wurden auf einer Rigaku RTP 300 RC-Drehanoden-Quelle mit einem RAXISII-, MAR-Bildplatten- oder MAR-Ladungsspeicher-Detektor erfasst. Bei den Bildplattensystemen bestanden typische Daten aus 90 1,25°-Oszillationen mit 15-minütigen Belichtungen, während bei dem Ladungsspeicher 100 1,0°-Oszillationen zwei Minuten lang belichtet wurden. Typische nutzbare Daten waren zu > 90% vollständig bei 2,6–2,8 Å Auflösung mit verschmelzenden R-Faktoren von 10–20%. Dies war erforderlich, um Inhibitoren in den Fo-Fc- oder 2Fo-Fc-Diagrammen angemessen darzustellen und zu identifizieren. Bei diesen Diagrammen war das Ausgangsmodell auf eine Auflösung von 2,1 Å verfeinert worden (R = 25% R_frei = 28%). Daten wurden vom DENZO-Programmpaket verarbeitet und die Elektronendichtediagramme vom XPLOR-Paket berechnet. Es wurde gezeigt, dass in Anwesenheit mancher Verbindungen der Carboxylat-Bibliothek die Raumgruppe sich von P2₁ auf C2 verschob (a = 170,6 Å, b = 47,5 Å, c = 83,6 Å, α = γ = 90°, β = 104°) . Für diese Form enthielt die asymmetrische Einheit einen Trimer, wodurch die Anzahl von Freiheitsgraden reduziert wurde, so dass Daten geringerer Auflösung (3,0 Å) für die Darstellung der Bindung angemessen waren.
Elektronendichtediagramme wurden mit QUANTA 97 auf einer Silicon Graphics INDIGO2-Workstation untersucht. Die Form der Dichte an der aktiven Stelle war visuell erkennbar durch die Form einer oder mehrerer der Verbindungen in der Mischung zum Anzeigen eines positiven Treffers oder durch geordnete Wassermoleküle, was auf fehlende Bindung hindeutete. Bei Experimenten, die einen positiven Treffer ergaben, wurde die entsprechende Verbindung visuell in die Elektronendichte bewegt. Die Elektronendichtediagramme wurden auch auf Änderungen in der Proteinstruktur hin überprüft, und falls solche beobachtet wurden, wurden an der Struktur entsprechende Modifikationen vorgenommen. Daher war nach dem Schritt der Diagramm-Untersuchung/Verbindungs-Einpassung die detaillierte 3-D-Struktur des Verbindungs-Pprotein-Komplexes bekannt.
Zurzeit sind 6 Treffer in den VanX-Screens erfasst worden (Verbindungen 36–41). 11 zeigt den Bindungsmodus exemplarischer Treffer. In allen Fällen kennzeichnete die Form der Elektronendichte die bindende Verbindung. 11A zeigt die gebundene Verbindung 39, wobei sich das Carboxylat mit dem Zink an der aktiven Stelle koordiniert. 11B zeigt die gebundene Verbindung 36, wobei das Carboxylat zum Zink an der aktiven Stelle hin zeigt. In 11C wurde festgestellt, dass sich Verbindung 37 ebenfalls durch das Carboxylat band. Die Bindung der Verbindungen 39 und 41 (nicht dargestellt) deutet darauf hin, dass das Zink an der aktiven Stelle die Koordination mit einem Carboxylat gegenüber einem freien Thiol bevorzugt. Dies führte zum Screening einer Carboxylat-Bibliothek, wo weitere Treffer gefunden wurden. In allen Fällen wurden die Verbindungen in Mischungen von 7–10 untersucht und der Treffer direkt durch die Form des Elektronendichtediagramms identifiziert. Diese Treffer werden direkt in den strukturbasierten Arzneimittel-Design-Zyklus eingeführt, ähnlich wie in dem Urokinase-Beispiel beschrieben.
Beispiel 3: Screening mit Mischungen von 100 Verbindungen
Zur Erhöhung der Anzahl von Verbindungen, die pro Zeiteinheit mit dem CrystaLEAD^TM-Verfahren untersucht werden können, würde eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens darin bestehen, Mischungen von 100 Verbindungen anstatt Mischungen von 10 zu untersuchen. Der Vorteil dieses Verfahrens ist ein höherer Durchsatz von Verbindungen mit einer gleichzeitigen Verringerung der Empfindlichkeit der Treffer-Erkennung. Zusätzlich können, da nur die wirksamste Verbindung in einer Mischung sich bindet, schwächere Treffer übersehen werden. Wenn z. B. eine allgemeine Bibliothek, die in Größe, Form und Funktionalität vollständig heterogen ist, mit CrystaLEAD^TM untersucht wird, wird eine niedrige Trefferrate erwartet. Daher ist ein gröberes Screening garantiert. Zusätzlich könnten die Treffer aus diesem Screening, da sie wirksamere Liganden sind, als Ausgangsgerüste für strukturbasiertes Arzneimittel-Design dienen. Da die Verbindungsmischung aus 100 Verbindungen besteht, sollte sie sorgfältig zusammengestellt werden, um zu gewährleisten, dass alle ihre Mitglieder ausreichend heterogen geformt sind, um die Notwendigkeit einer Dekonvolution zu beseitigen. Daher kann bei Erfassung eines Treffers einige Dekonvolution erforderlich sein, um den Treffer zu identifizieren.
Zum Testen dieses speziellen Verfahrens wurde eine Verbindung, von der bekannt war, dass sie sich an μUK bindet, zu einer Gruppe von 100 Verbindungen gegeben. Dieser bekannte Ligand, Verbindung 19, wurde ursprünglich durch das CrystaLEAD^TM-Verfahren entdeckt, und es wurde gezeigt, dass er sich mit einem Ki von 56 μM bei pH 6,5 und 137 μM bei pH 7,4 an μUK bindet. Die Mischung von 100 Verbindungen wurde hergestellt, indem 10 Mischungen 10 Verbindungen gemischt wurden. Im Speziellen wurde jede trockene Mischung von 10 in 100% DMSO bis zu einer Endkonzentration von ungefähr 80–240 mM (oder Sättigung bei den weniger löslichen Mischungen) aufgelöst. Gleiche Volumina jeder der Mischungen 10 Verbindungen wurden bis zu einer Endkonzentration der einzelnen Verbindungen von 8,0–24,0 mM gemischt, und in die Mischung wurde ein Schuss einer 100%igen DMSO-Vorratslösung von Verbindung 19 gegeben, so dass die Endkonzentration 18,0 mM betrug. Einzelne μUK-Kristalle wurden in 50 μl von 27% PEG4000 platziert, 15,6 mM Succinat pH 5,4, 0,17 M Li₂SO₄ und 0,5 μl der Verbindungsmischung wurden hinzugefügt, um 1%iges DMSO zu ergeben. Die Endkonzentration jeder Verbindung im Eintränk-Experiment lag im Bereich von 80–240 μM, die Konzentration der Verbindung 19 betrug 180 μM. Unter diesen Bedingungen wird erwartet, dass die Empfindlichkeit des Experiments Liganden mit Kd < 20–60 μM erfasst. Kristalle wurden 4 Stunden und 15 Minuten lang äquilibrieren gelassen.
Daten wurden am Argonne National Labs Advanced Photon Source Synchrotron ID-Strahlrohr-IMCA, ausgestattet mit einer ladungsgekoppelten Mar-Kamera, erfasst. Die Daten bestanden aus 100 1°-Oszillationen mit Belichtungen von 7 sec. Die Daten waren zu 87,4% vollständig bei 1,6 Å Auflösung mit verschmelzendem Gesamt-R-Faktor von 5,4%. Daten wurden mit dem DENZO-Programmpaket, Otwinowski u. a., Methods in Enzymology, 276 (1996) verarbeitet, und das Elektronendichtediagramm wurde vom XPLOR-Paket berechnet.
Das Elektronendichtediagramm wurde mit dem QUANTA 97-Programmpaket (Molecular Simulations Inc., Quanta Generating and Displaying Molecules, San Diego: Molecular Simulations Inc., 1997) auf einer Silicon Graphics INDIGO2-Workstation untersucht. Die Form der Dichte an der aktiven Stelle wurde visuell als aus einer der Verbindungen in der Mischung resultierend identi fiziert, was auf einen positiven Treffer hindeutete, der als Verbindung 19 identifiziert wurde, und ist in 12 dargestellt.
Dieses Verfahren ist zur Entdeckung von Führungsverbindungen zu bevorzugen. Führungsverbindungen hätten typischerweise die Eigenschaft, dass sie stärkere Liganden sind (z. B. innerhalb des Empfindlichkeitsbereichs des Verfahrens). Dieses Verfahren ermöglicht auch die Untersuchung einer nicht gerichteten Bibliothek mit 10.000 Verbindungen im Zeitrahmen von 1–2 Wochen. Dieses Verfahren würde zu einem Zeitpunkt, zu dem schwächere Liganden identifiziert würden, in Verbindung mit den anderen Verfahren der Untersuchung von 10–20 Verbindungen angewandt werden. Diese Liganden würden mit geringerer Wahrscheinlichkeit als Führungsverbindungen dienen, könnten jedoch zur Erhöhung der Wirksamkeit mit einem Führungsgerüst verbunden werden.
Beispiel 4: CrystaLEAD^TM-Screening von ErmC'
ErmC' ist eine rRNA-Methyltransferase, die eine Methylgruppe von S-Adenosyl-L-methionin an N6 von Adenin in der Peptidyltransferase-Schleife von 23S-rRNA überträgt. Diese Methylierung vermittelt Antibiotikaresistenz gegen eine Reihe von Makrolid-Antibiotika, wie z. B. das in großem Umfang verschriebene Erythromycin. Es wäre zu erwarten, dass eine Hemmung von ErmC' die Resistenz wieder aufhebt. Zur Herstellung eines spezifischen und wirksamen ErmC'-Inhibitors wurde auf die Cofaktor- oder S-Adenosyl-L-methionin-Bindungsstelle abgezielt. S-Adenosyl-L-methionin ist unten als Verbindung 42 dargestellt:
Die Kristallstruktur von ErmC' zeigt, dass die S-Adenosyl-L-methionin-Stelle aus zwei Primär-"Taschen" besteht, die den Adeninring und das Methionin aufnehmen. Zusätzlich gibt es eine dritte "Tasche", die das rRNA-Adenin aufnehmen kann, das einer Methylierung unterzogen wird. Zur Bestimmung einer SAR an dieser Stelle wurde eine Bibliothek von Adenosin-Analogen, substituiert an N6 und/oder 5'-Hydroxyl, erstellt. Die Regionen der Variation in der Bibliothek sind unten als Verbindung 43 dargestellt.
ErmC-Expression und -Reinigung
Der Expressionsvektor pTERM31 wurde durch Polymerase Chain Reaction-(PCR-)Amplifikation des ermC'-Gens und des stromaufwärts gelegenen kdsB-Cistrons von pERM-1 hergestellt. Das Subklonieren des PCR-Produkts in pET24+ (Novagen, Madison, WI) wurde durchgeführt unter Verwendung der BamHI- und HindIII-Stellen, die in die "geschwänzten" PCR-Primer eingeschlossen sind. Dieses neue Konstrukt ermöglichte die Expression von ErmC' durch Translations-Kopplung an kdsB, unter Kontrolle des T7lac-Promotors. pTERM31-Plasmid wurde in den E. coli-Stamm BL219 (DE3)/pLysS (Novagen) umgewandelt, und der resultierende Stamm wurde zur Produktion von ErmC' verwendet. Umgewandelte Zellen wurden bei 27,5°C in einem New Brunswick Scientific (Edison, NJ) Micros-Fermentor gezüchtet, der 10 l Superbroth (BIO 101, La Jolla, CA) enthielt, denen Kanamycin, Chloramphenicol und Glukose hinzugefügt worden waren. Wenn die optische Dichte der Kultur 1,10 erreichte, wurde ErmC'-Expression induziert durch Hinzugabe von 1 mM Isopropyl-β-d-thiogalaktopyranosid (IPTG). Zellen wurden 400 Minuten nach der Induktion geerntet.
Gefrorene Zellpaste (200–250 g) wurde bei Raumtemperatur aufgetaut und in 5–10 Volumen kaltem Lysepuffer (50 mM Tris, 5 mM 1,4-Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonatfluorid (PMSF), 2 mM Ethylen-diamintetraessigsäure (EDTA), 0,2% Triton X-100, pH 7,8) erneut suspendiert. Die Zellen wurden mit einer French Presse lysiert, und Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wurde über Nacht gegen 20 l Tris-DTT-Glycerol-magnesium-(TDGM-)Puffer, pH 7,8 (50 mM Tris, 5 mM DTT, 10% Glycerol, 10 mM MgCl₂) dialysiert. Das Dialysat wurde dann auf eine Sepharose-Schnellfluss-Säule (Pharmacia) aufgetragen, die in TDGM-Puffer voräquilibriert worden war. Fraktionen wurden auf Methyltransferase-Aktivität getestet, und diejenigen, die ErmC' enthielten, wurden in einen Pool getan, auf eine TSK SP-5PW-Säule (TosoHaas, Montgomeryville, PA) aufgetragen und mit einem NaCl-Gradienten eluiert. Das gereinigte Protein wurde dann auf einer YM-10-(Amicon)Membrane konzentriert.
ErmC-Kristallstruktur
Kristalle von ErmC' wurden durch das Hanging Drop Vapor-Diffusionsverfahren gezüchtet. Tropfen, die 5–8 mg/ml ErmC' in 25 mM Tris/Cl, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 10% (v/v) Glycerol, pH7,5, enthielten, wurden gegen ein Reservoir äquilibriert, das 100 mM Tris, 500 mM NH₄(SO)₄, 15% PEG 8000, pH 7,8, enthielt. Kristalle erschienen innerhalb eines Tages und wuchsen innerhalb einer Woche auf ihre volle Größe. Die Kristalle gehörten zur Raumgruppe P43212. Die Struktur von ErmC' in dieser Raumgruppe wurde bestimmt durch Molekül-Ersetzung bis zu einer Auflösung von 2,2 Ångström unter Verwendung der Kristallstruktur von ErmC' in der Raumgruppe P6 (Bussiere u. a., Biochemistry Band 37, S. 7103–7112). Die 3-D-Struktur für Kristalle, die unter diesen Bedingungen gezüchtet wurden, zeigt eine leere aktive Stelle, was dies zu einem System macht, das zur Anwendung von CrystaLEAD^TM in hohem Maße geeignet ist.
Screening
Die Adenosin-Bibliothek bestand aus 59 Verbindungen. Die Bibliothek wurde in 7 Mischungen von 8–9 Verbindungen mit heterogener Form unterteilt und mit dem CrystaLEAD^TM-Verfahren untersucht. Genauer wurde jede Verbindung in 100% DMSO bis auf eine Endkonzentration von 1 M (oder Sättigung bei den weniger löslichen Verbindungen) aufgelöst. Gleiche Volumen von jeder Verbindung wurden gemischt, um die Mischung von 10 zu ergeben. Einzelne ErmC-Kristalle wurden in 50 μl von 20% PEG 8000 platziert, 0,3 M Ammoniumsulfat, 10% Glycerol, pH 7,7, und 0,5–0,8 μl der Verbindungsmischung wurden hinzugefügt, um 1 bis 1,6% DMSO und 3,3 bis 5,2 μM Endkonzentration der einzelnen Verbindungen zu ergeben. Die Kristalle wurden 3–4 Stunden lang äquilibrieren gelassen.
Daten wurden auf einer Rigaku RTP 300 RC-Drehanoden-Quelle mit einem RAXISII-, MAR-Bildplatten- oder MAR ladungsgekoppeltem Detektor erfasst. Bei den Bildplattensystemen bestanden typische Daten aus 15–20 2°-Oszillationen mit 20–30-minütigen Belichtungen, während bei dem ladungsgekoppelten Detektor 15–20 2,0°-Oszillationen 8–15 Minuten lang belichtet wurden. Typische nutzbare Daten waren zu 80–90% vollständig bei 3,4–3,6 Å Auflösung mit verschmelzenden (ββ) R-Faktoren von 7–16%. Dies war erforderlich, um Inhibitoren in den Fo-Fc- oder 2Fo-Fc-Diagrammen angemessen darzustellen und zu identifizieren. Bei diesen Diagrammen war das Ausgangsmodell auf eine Auflösung von 2,2 Å verfeinert worden (R = 22% R_frei = 25%). Daten wurden vom DENZO-Programmpaket verarbeitet und die Elektronendichtediagramme vom XPLOR-Paket berechnet.
Elektronendichtediagramme wurden mit QUANTA 97 auf einer Silicon Graphics INDIGO2-Workstation untersucht. Die Form der Dichte an der aktiven Stelle war visuell gekennzeichnet durch die Form einer oder mehrerer der Verbindungen in der Mischung, um einen positiven Treffer anzuzeigen, oder durch geordnete Wassermoleküle, die auf fehlende Bindung hindeuteten. Bei Experimenten, die einen positiven Treffer ergaben, wurde die entsprechende Verbindung visuell in die Elektronendichte bewegt. Die Elektronendichtediagramme wurden auch auf Änderungen in der Proteinstruktur hin überprüft, und falls solche beobachtet wurden, wurden entsprechende Modifikationen an der Struktur vorgenommen. Somit war nach dem Schritt der Diagramm-Untersuchung/Verbindungs-Einpassung die detaillierte 3-D-Struktur des Verbindungs-Protein-Komplexes bekannt.
Zwei Treffer wurden im ErmC'-Adenosin-Analog-Screening erfasst (Verbindungen 44 und 45). Die 13 und 14 zeigen die Kristallstruktur der Komplexe der Verbindungen 44 und 45 mit ErmC'.
In allen Fällen kennzeichnete die Form der Elektronendichte die bindende Verbindung. Es wurde festgestellt, dass sich die hydrophobe Substitution entlang einer teilweise exponierten hydrophoben Oberfläche band, was auf eine bevorzugte Interaktion hindeutete, die möglicherweise zu der Bindung dieser Verbindungen beitrug und es ermöglichte, sie als Treffer zu identifizieren. Es wurden keine Treffer erkannt, die eine Substitution an der 5'OH-Position enthielten. Eine Folgeverbindung der Verbindungen 44 und 45 enthielt einen optimierten Indansubstituenten an dieser hydrophoben Stelle.
SEQUENZLISTE

Claims

Ein Verfahren zur Identifikation eines Liganden, der sich an ein Ziel-Biomolekül bindet, folgende Schritte umfassend: a) Gewinnung eines Ziel-Biomolekül-Kristalls und Röntgenbeugungsdiagramms des Ziel-Biomoleküls; b) Aussetzen des Ziel-Biomolekül-Kristalls gegenüber einer Mischung aus mindestens zwei potenziellen Liganden, worin die Liganden in der Mischung geeigneterweise auf molekularer Ebene verschieden geformt sind, sodass anschließende Experimente zur Bestimmung, welche Verbindung der Mischung sich bindet, unnötig werden, und Gewinnung eines Röntgenkristall-Beugungsdiagramms daraus; c) Umwandeln der Ziel-Biomolekül-Beugungsdiagramme in Elektronendichtediagramme und d) Vergleichen der Elektronendichtediagramme ohne Aussetzen mit der Mischung und mit Aussetzen mit der Mischung, um zu bestimmen, ob ein Liganden-/Ziel-Biomolekül-Komplex gebildet wird, worin die Form der Elektronendichte im Elektronendichtediagramm die Bindung des Liganden an das Ziel-Molekül bestimmt und die Identität des gebunden Liganden direkt bestimmt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Ziel-Biomolekül ein Polypeptid ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Ziel-Biomolekül ein Rekombinations-Polypeptid ist.