KR20010041653A - Ｘ-선 결정학에 의한 리간드 스크리닝 및 설계방법 - Google Patents
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Abstract
X-선 결정학을 사용하여, 표적 생분자에 결합하는 능력에 대해 표적 생분자의 리간드가 알려져 있지 않는 화합물을 스크리닝할 수 있다. 본 발명의 방법은 표적 생분자의 결정을 수득하는 단계; 표적 생분자 결정을 하나 이상의 시험 샘플에 노출시키는 단계 및 X-선 결정 회절 패턴을 수득하여 리간드/수용체 복합체가 형성되는지를 측정하는 단계를 포함한다. 표적은 하나 이상의 시험 샘플의 존재하에 생분자를 공-결정화시키거나 생분자 결정을 하나 이상의 시험 샘플의 용액에 침지시킴으로써 시험 샘플에 노출된다. 또다른 양태에 있어서, 리간드/수용체 복합체로부터의 구조적 정보를 이용하여, 더욱 단단하게 결합하고 더욱 특이적으로 결합하며 보다 우수한 생물학적 활성을 갖거나 보다 우수한 안전성 프로필을 갖는 리간드를 설계한다. 본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 방법에 의해 생물학적 활성 잔기를 확인하거나 설계하는 것을 포함한다. 추가의 양태에 있어서, 용이하게 접근가능한 활성 부위를 갖는 생분자 결정은 생분자를 분해가능한 리간드와 함께 공-결정화시키고 리간드를 분해시킴으로써 형성된다.
Description
X-선 결정학(결정학)은 확립되어 있는 잘 연구된 기술로서, 결정에서 유사하게 보이는 분자가 분자의 3차원 사진으로서 잘 기술될 수 있음을 제공한다. 과학자들은 결정학을 사용하여 다수의 생물학적으로 중요한 분자의 결정 구조를 해석한다. 이로써 제한되지는 않지만, 단백질, DNA, RNA 및 바이러스를 포함하는 많은 부류의 생분자가 결정학에 의해 연구될 수 있다. 과학자들은 이의 수용체내에 리간드를 포함하는 생분자의 결정 구조를 보고하였다("리간드-수용체 복합체").
표적 생분자 또는 리간드-수용체 복합체의 "사진"이 제공되었지만, 과학자들은 생물학적 활성이 일어날 수 있는 포켓 또는 수용체를 찾을 수 있다. 따라서, 과학자들은 수용체에 대한 고-친화성 리간드(또는 약물)을 실험적으로 또는 계산적으로 설계할 수 있다. 계산적 방법은 다른 한편으로는 작은 분자의 결합을 스크리닝하는데 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 선행 시도는 성공이 제한되었다. 몇몇 문제가 계산적 방법에 의한 리간드 설계를 성가시게 한다. 계산적 방법은 결합 에너지의 정확한 측정보다는 대략적인 측정에 기초하며, 분자내에 존재하는 복합체 상호작용과 비교하여 단순한 계산에 의존하고 있다. 더욱이, 계산적 모델은 종종 진정한 표적에 대해 작동하지 않는 펄스 포지티브로서 당해 모델을 노출시키는 시험적 확인을 필요로 한다.
더욱이, 리간드-수용체 복합체의 "사진"에 토대를 두는 실험적 고-친화성 리간드 설계는 이미 공지된 리간드를 갖는 생분자로 제한된다. 결국, 과학자들은 최근에 와서야 유기 용매와 표적 생분자 사이의 상호작용에 대한 결정학적 연구를 보고하였다[참조: Allen et al., J. Phys. Chem., v. 100, pp. 2605-11(1996)]. 그러나, 이들 연구는 리간드 부위보다는 용매 부위의 지도작성으로 제한되고 있다. 잠재적인 리간드를 직접 확인하고 리간드가 결합하여 표적 생분자내에서 변화하는 방법에 대한 상세한 정보를 수득하는 것이 바람직할 것이다. 또한, 제공된 표적 분자와 관련하여 생물학적 및/또는 약제학적 활성을 보유하는 리간드를 확인 및/또는 설계하는 방법이 바람직할 것이다.
발명의 간단한 요약
결정학은 표적에 결합하는 능력에 대해 표적 분자의 비공지된 리간드인 화합물을 스크리닝 및 확인하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법(이하 "CrystaLEADTM"이라 한다)은 표적 생분자의 결정을 수득하는 단계; 표적의 잠재적인 리간드인 하나 이상의 시험 샘플에 표적을 노출시키는 단계; 및 리간드/생분자 복합체가 형성되는지를 측정하는 단계를 포함한다. 표적은, 이로써 제한되지는 않지만, 하나 이상의 잠재적 리간드의 용액에 결정을 침지시키거나 하나 이상의 잠재적 리간드의 존재하에 생분자를 공-결정화시키는 방법을 포함하는 각종 방법에 의해 잠재적 리간드에 노출된다.
추가의 양태에 있어서, 발견된 리간드/수용체 복합체로부터의 구조적 정보는 더욱 단단하게 결합하고 더욱 특이적으로 결합하며 보다 우수한 생물학적 활성을 갖거나 공지된 리간드보다 우수한 안전성 프로필을 갖는 새로운 리간드를 설계하는데 사용된다.
바람직한 양태에 있어서, "형상이 다양한(shape-diverse)" 화합물의 라이브러리는 리간드가 혼합물의 일부로서 노출되는 경우에도 리간드-수용체 복합체를 직접 확인하기 위해 사용된다. 이는 혼합물로부터 시간 소비적인 탈-회선 적중(hit)에 대한 필요성을 회피한다. 여기서, 3개의 중요한 단계가 동시에 달성된다. 계산된 전자 밀도 함수는 결합 빈도를 직접 나타내고, 결합된 화합물을 확인시켜 주며, 리간드-수용체 복합체의 상세한 3-D 구조를 제공한다. 하나의 양태에 있어서, 적중이 발견되면, 전통적인 스크리닝 방법에 의해 더욱 단단한 결합 또는 보다 우수한 생물학적 활성에 대해 다수의 적중 동족체 또는 유도체를 스크리닝할 수 있다. 또다른 양태는 더욱 단단한 결합 또는 보다 우수한 생물학적 활성을 갖는 동족체 또는 유도체를 개발하기 위해 표적 구조에 대한 정보 및 적중을 사용한다. 또다른 양태에 있어서, 리간드-수용체 복합체는 잠재적 리간드의 추가의 반복체에 노출됨으로써 2개 이상의 적중을 함께 연결시켜 더욱 효능있는 리간드를 제조할 수 있다.
X-선 결정학은 표적 수용체 분자에 결합하는 리간드를 확인하고 표적 수용체에 대한 생물학적 활성이 개선된 리간드를 설계하는 데 유용하다.
도 1은 초기 선도(lead) 화합물이 발견되는 경우, 골격으로 사용되어 주요 부위를 둘러싸고 있는 아부위에 적합한 추가의 잔기를 포함하는 구조-기본 약물 설계를 나타낸다.
도 2는 2개 이상의 인접한 1차 포켓을 갖는 생분자에 대한 단편 연결 방법을 나타낸다.
도 3은 결정을 각종 잠재성 리간드(I1-I10)의 용액에 침지시키고 X-선 회절 데이타세트를 수집하여 전자 밀도 지도로 변환시킨 다음 화합물 결합을 검사하는 CrystaLEADTM의 개요이다.
도 4는 2-D 및 3-D에서 전형적인 화합물의 혼합물을 나타낸다. 3-D 외관은 분자의 "형상"을 나타내는 이론적인 2Fo-Fc 전자 밀도 지도이다.
도 5는 사람 유로키나제의 주요 서열이다.
도 6은 유로키나제를 잠재성 리간드의 혼합물을 함유하는 용액에 침지시킨 후 형상에 의해 적중을 검출 및 확인하는 방법을 나타낸다. 도 6A는 초기 Fo-Fc 지도이다. 도 6B는 화합물이 유로키나제의 활성 부위에서 결합하는 방법을 나타낸다. 도 6C는 혼합물의 어떠한 화합물도 결합하지 않는 경우 결합된 리간드를 갖지 않는 활성 부위를 나타낸다.
도 7은 잠재성 리간드의 혼합물을 함유하는 용액에 침지된 유로키나제에 대한 적중을 나타낸다. 도 7A는 초기 Fo-Fc 지도이다. 도 7B는 화합물이 유로키나제의 활성 부위에서 결합하는 방법을 나타낸다.
도 8은 잠재성 리간드의 혼합물을 함유하는 용액에 침지된 유로키나제에 대한 적중을 나타낸다. 도 8A는 초기 Fo-Fc 지도이다. 도 8B는 화합물이 유로키나제의 활성 부위에서 결합하는 방법을 나타낸다.
도 9는 잠재성 리간드의 혼합물을 함유하는 용액에 침지된 유로키나제에 대한 2개의 추가 적중을 나타낸다. 도 9A는 혼합물내의 강력한 리간드에 대한 Fo-Fc 지도이다. 도 9B는 혼합물내의 보다 약한 리간드에 대한 Fo-Fc 지도이다. 보다 약한 리간드는 강력한 리간드가 혼합물로부터 제거된 후에만 검출된다.
도 10은 CrystaLEADTM에 의해 발견된 선도 화합물과 최적화된 후속 화합물 사이의 비교 결정 구조를 나타낸다.
도 11은 VanX에 대해 확인된 적중을 나타낸다.
도 12는 유로키나제에 대한 적중을 나타낸다.
도 13은 ErmC'를 갖는 화합물(44)의 결정 구조를 나타낸다.
도 14는 ErmC'를 갖는 화합물(45)의 결정 구조를 나타낸다.
CrystaLEADTM은 표적 생분자에 결합하는 화합물을 확인하기 위한 효율적인 스크리닝 방법을 제공한다. 이러한 화합물은 표적에 대한 생물학적 활성이 개선된 리간드 및/또는 약물을 설계하기 위한 선도 또는 골격으로서 사용될 수 있다. 더욱 단단하게 결합하는 리간드는, 이것이 일반적인 원칙일지라도, 보다 우수한 생물학적 활성을 반드시 제공하거나 보다 우수한 약물을 반드시 제조할 필요는 없다는 점을 주목하여야 한다. 보다 약하게 결합하는 리간드가 단단한 결합 이외의 인자(예: 선택성, 생물이용성)로 인해 보다 우수한 생물학적 활성을 제공할 수 있다.
결정학은 구조-기본된 약물 설계에 대한 수용체-리간드 복합체를 관찰하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 이러한 복합체를 관찰하기 위해, 공지된 리간드가 통상 표적 분자 결정에 침지된 다음 복합체의 결정학이 수행된다. 종종, 적합한 결정을 수득하기 위해 리간드를 표적 분자와 함께 공-결정화시키는 것이 필요하다.
지금까지, 결정학은 이것이 제공하는 상세한 구조적 정보에도 불구하고 잠재성 리간드를 스크리닝하기 위한 수단이 되지 못했다. 결정학에 의한 화합물 스크리닝에 대한 가능한 편견은 당해 방법이 너무 복잡하거나 시간 소비적이고, 적합한 결정을 수득하기가 곤란하며, 이용가능한 결정이 하나 이상의 화합물(10종 이상의 화합물의 더 적은 혼합물)을 침지시킬 수 없고, 매우 많은 생분자가 필요할 수도 있으며, 너무 시간 소비적이어서 통상 결정을 축적시킬 수 없고, X-선 각도계에 대한 결정의 일정한 변화가 매우 지루할 수 있다는 확신이 포함된다.
그러나, 현재 이용가능한 기술은 다수의 이와 같은 알려진 장애를 극복하였다. 예를 들면, 특정한 시점에서 분자 표적은 천연 공급원으로부터만 수득되고, 자연 분해 또는 글리코실화에 기인하여 결정화에 종종 부적합하였다. 또한, 본래의 농도가 너무 낮아서 결정화에 필요한 고도로 정제된 단백질의 양을 수득할 수 없었다. 분자 생물학에 의해, 다량의 단백질을 발현시켜 결정화용으로 정제할 수 있다. 필요한 경우, 단백질은 재-조작하여 상이하거나 보다 우수한 결정 형태를 제공할 수 있다.
추가로, 빛나는 광 공급원(싱크로트론 방사) 및 더욱 감수성인 검출기를 용이하게 이용할 수 있게 되어 데이타의 수집에 필요한 시간이 수일에서 수시간 또는 심지어 수분까지 현저히 감소되었다. 현재에는 덜 일반적이지만 앞으로는 일반적일 수 있는 현존하는 기술은 대개 초 또는 1초의 몇 분의 정도까지 충분한 데이타 셋트를 수집하게 한다[참조: Laue diffraction. J. Hajdu et al., Nature, v. 329, pp. 178-81(1987)]. 보다 신속한 컴퓨터 및 더욱 자동화 소프트웨어는 데이타 수집 및 분석에 요구되는 시간을 크게 감소시켰다. 결국, 본 발명자들은 화합물의 혼합물을 침지 또는 공-결정화시켜 잠재성 리간드를 스크리닝할 수 있음을 발견하였다. 따라서, 이하 기술되는 바와 같이, 결정학은 이제 실제적이고 용이한 스크리닝 방법이다.
CrystaLEADTM에 있어서, 결정 형태를 갖는 표적 분자에 대한 리간드는 작은 분자의 라이브러리를 단독으로 또는 혼합물로서 표적(예: 단백질, 핵산 등)에 노출시킴으로써 확인된다. 이어서, 결정학적 데이타를 수득하여 추정된 표적-리간드 복합체의 전자 밀도 지도를 표적 생분자의 전자 밀도 지도와 비교한다. 전자 밀도 지도는 리간드 결합, 결합된 리간드의 확인 및 리간드-표적 복합체의 상세한 3-D 구조의 직접적인 증거를 동시에 제공한다. 결합은 또한 활성 부위에서 리간드 결합에 감수성인 것으로 알려져 있는 결정 회절 패턴내에서 개개 반사의 변화에 의해 모니터할 수 있다. 이는 프리-스크리닝으로서 사용될 수 있지만 1차 선택 방법일 수는 없는데, 이는 그것이 덜 상세한 구조 정보를 제공하기 때문이다.
결정에 첨가되거나 공-결정화시 리간드 농도의 함수로서 회절 패턴에 있어서 리간드 전자 밀도 또는 특정한 반사의 강도의 수준 변화를 관찰함으로써, 또한 생분자에 대한 리간드의 결합 친화성을 측정할 수 있다. 결합 친화성은 또한 경쟁 실험에 의해 수득할 수 있다. 여기서, 새로운 화합물(들)은 침지되거나, 결합 친화성이 공지된 특정한 부류의 다양하게 형상화된 리간드와 함께 공-결정화된다. 공지된 리간드가 전자 밀도 지도에서 나타나는 경우, 비공지된 리간드는 보다 약한 결합제이다. 그러나, 새로운 화합물중 하나가 당해 부위에 대해 경쟁하는 것으로 밝혀지면, 가장 단단한 결합제일 수 있다. 공지된 리간드의 농도 또는 속성을 변화시킴으로써, CrystaLEADTM적중의 결합 상수를 평가할 수 있다.
스크리닝된 화합물의 수는 목적하는 검출 한계, 화합물 용해도, 및 결정이 견딜 수 있는 유기 공-용매의 양에 기초한다. 정확한 수는 각 결정에 따라 달라진다. 예를 들면, 1% 유기 공-용매에 견디는 전형적인 결정의 경우, 10종의 화합물을 동시에 스크리닝하기 위한 감수성 한계는 Kd〈1.5mM일 것이다. 20종의 화합물의 경우, 감수성 한계는 Kd〈0.63mM일 것이다. 그러나, 높은 유기 공-용매(예: 40%)에 견디는 결정은 Kd〈1.5mM의 검출 한계내에서 50종 이하의 화합물을 스크리닝할 수 있다.
CrystaLEADTM의 대부분의 일반 적용에 있어서, 적중 또는 선도 화합물은 화합물이 구조-기본된 약물 설계에 있어서 생물학적 활성에 대해 시험되는지를 측정하기 위해 사용된다. 이어서, 유도체 및 동족체는 최상의 리간드 또는 약물을 찾아내기 위해 전통적인 의-화학에 의해 수득된다.
반면, 스크리닝 방법에서 수집된 구조적 정보는 적중의 동족체 또는 유도체를 시사하기 위해 직접 사용된다. 이러한 방법은 첨가 부위가 다양한 아부위 및 작은 포켓에 의해 둘러싸여 있는 하나의 1차 포켓으로 구성되는 경우에 설명된다(도 1). 화합물이 수용체에 결합하는 방법에 대한 상세한 구조적 정보는 적중이 검출됨과 동시에 수득된다. 이러한 정보는 당업자가 보다 우수한 리간드를 설계하는데 유용하다[참조: P. Colman, Curr. Opin. in Struct. Biology, v. 4, pp. 868-74(1994); J. Greer et al., J. Med. Chem., v. 37, pp. 1035-54(1994); C. Verlinde et al., Structure, v. 15, pp. 577-87(1994)]. 특히, 적중은 주위의 아부위 및 작은 포켓에 접근할 수 있는 동족체 합성용 부위를 확인시켜 준다. 이는 활성 부위에 더욱 적합한 새로운 화합물의 설계를 시사한다. 추가로, 구조-기능 관계가 존재하는 경우, 치환 패턴을 향상시키는 활성은 3-D 구조 수준에서 새로운 선도 골격으로 직접 전달할 수도 있다.
또다른 설명(도 2)는 단편을 수용할 수 있는 2개 이상의 별도의 포켓을 갖는 표적에 통상 적용된다. 여기서, 결정질 표적은 당해 부위 전부를 연속적으로 또는 동시에 점유하는 리간드에 대해 스크리닝된다. 결합 빈도는 공-결정 구조를 가시화함으로써 모니터되기 때문에, 리간드 결합 부위가 직접 확인되며, 당해 리간드가 단백질상의 상이한 부위를 실질적으로 점유하도록 하기 위해 경쟁 실험을 수행할 필요는 없다. 스크리닝은 이들의 결합 부위에서 중첩되는 독특한 포켓에 결합하는 리간드에 대해 개별적으로 허용된다. 제1 부위의 존재하에 제2 부위에 대한 스크리닝은 제2 부위에서의 협조적 결합을 검출할 것이다. 잠재적 선도 및 구조-활성 관계가 확립되면, 각 부위 사이의 연결은 신규하고 더욱 더 효능있는 리간드를 생성하기 위해 이미 기재된 바와 같은 상세한 구조적 정보 및 단편 연결 방법을 사용하여 설계될 것이다[참조: S.B. Shuker et al., Science, v. 274, pp. 1531-34(1996); C. Verlinde et al., Structure, v. 15, pp. 577-87(1994)].
세번째 적용, 즉 골격 통합 방법(도시되지 않음)에 있어서, 표적 활성 부위는 2개 이상의 아부위로 구성된다. 결정질 단백질은 이들 아부위를 통해 결합하는 리간드(들)에 대해 스크리닝되며, 상대적 리간드 결합 배향은 다중 실험을 위해 관찰된다. 이들 리간드는 하나 이상의 아부위를 점유하고 다중 적중의 구조를 중첩시킴으로써 결합되어야 하며, 다중 아부위에 대한 접근을 촉진시킬 코어가 설계될 수도 있다. 이러한 코어는 약물-설계 사이클에서 선도 골격으로서 또한 사용될 수 있는 새롭고 신규하며 더욱 효능있는 선도 화합물로서 사용될 것이다.
CrystaLEADTM연결된-단편 방법은 문헌[참조: Verlinde et al. in J. Comput. Aided Mol. Des., v. 6, pp. 131-47(1992)]에 의해 계산적 수준에서만 보고된 구조-기본된 연결된-단편 방법을 실험적으로 실행한다. 상기 베를린드(Verlinde) 등은 수학적 계산에 기초하는 리간드 단편을 제안하였다. 이어서, 제안된 단편을 결합 활성에 대해 분석한다. 단편이 실제로 결합하는 경우, 이들의 3-D 구조를 X-선 결정학에 의해 측정하고, 링커를 설계한다. 대조적으로, CrystaLEADTM은 결합 빈도를 동시에 검출하고, 리간드-단백질 복합체의 실험적으로 측정된 3-D 구조를 제공한다. 본 발명은 또한 표적 분자와 이의 리간드 사이의 결합 상수를 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 표적의 어떠한 공간적 표지도 요구하지 않는다. 따라서, 표적 분자는 단백질, 폴리펩타이드, 핵산, 핵단백질, 또는 당업자에 의해 개발되어 실시된 바와 같은 어떠한 적합한 숙주 시스템으로부터 천연 공급원 또는 재조합 방법에 의해 분리된 기타 적합한 표적 분자를 포함할 수 있다.
결정학 스크리닝에는 몇가지 잇점이 있다. 한가지 중요한 잇점은 결합 빈도가 직접 모니터되어 펄스 포지티브 가능성을 제로에 가깝게 감소시킨다는 것이다. 결정학 데이타는 리간드-수용체 복합체의 3차원 전자 밀도 "스탭-샷(snap-shot"을 제공하는데, 이는 당해 화합물이 어디에 어떻게 결합하는지를 보여준다.
당해 방법은 표적 및 리간드 모두의 구조 변화에 대해 독특하게 감수성이다. 구조적 변화의 관찰은 상이한 리간드-표적 복합체 구조로부터의 정보를 배합하는 골격의 설계에 중요하다. 이와 같은 한가지 예는 특정한 리간드를 수용하기 위해 단백질의 구조를 변화시키는 경우에 발생하지만, 그러한 구조 변화는 동시에 제2 리간드의 결합을 차단시킨다. 유사하게는, 구조 변화의 검출이 또한 중요한데, 이는 주요 골격이 상이하게 결합하면 이들을 보다 큰 골격으로 조합할 수 없기 때문이다.
결합 빈도는 직접 모니터되기 때문에, CrystaLEADTM은 리간드 결합에 간접적으로 감수성일 수 있는 공간적으로 표지된 샘플, 프로브 또는 표적 분자를 필요로 하지 않는다. 표적의 결정 구조를 수득할 수 있는 한, CrystaLEADTM을 사용하여 리간드를 스크리닝할 수 있다.
화합물의 혼합물이 다양한 형상으로 적절히 설계되는 경우, 본 발명은 혼합물로서 침지되는 라이브러리의 탈-회선에 대한 필요성을 덜게 하는데, 이는 결합 빈도가 전자 밀도의 형상을 결합 부위에서 검사함으로써 직접 검출되기 때문이다. 따라서, 전자 밀도의 형상은 결합 빈도 및 화합물 속성 모두를 직접 확인시켜 준다. 반면, 이상 산란 기술에 의해 확인할 수 있는 이상 산란 원자(예: Br, S)를 갖는 화합물을 함유하도록 혼합물을 설계할 수 있다. 추가로, CrystaLEADTM은 결합을 직접 모니터하기 때문에, 알려진 리간드가 존재하지 않는 경우의 표적 연구에 특히 매우 적합하다.
CrystaLEADTM에서 계산된 전자 밀도 함수는 결정의 "진정한 공간"을 나타내기 때문에, 목적하는 영역에 직접 촛점을 맞출 수 있다. 따라서, 당해 방법이 활성 부위에 제한되지 않을지라도, 결합은 목적하는 부위에서 독점적으로 검출된다. 대부분의 결합 분석에서 분석을 복잡하게 하는 다른 부위에서의 결합은 전반적으로 고려하여 제거될 수 있다.
CrystaLEADTM은 또한 상이한 위치에서의 결합을 동시에 모니터하는 방법을 제공한다. 즉, 하나 이상의 포켓을 갖는 표적의 경우, 제2 부위에 대한 스크리닝은 제1 리간드의 존재하에서의 스크리닝을 필요로 하지 않는다. 그러나, 제2 부위에 대한 스크리닝은 협조적 리간드를 발견하기 위해 제1 리간드의 존재하에 완성될 수 있다.
CrystaLEADTM은 결정 구조가 수득될 수 있는 표적 분자에 적용할 수 있다. 현재의 문헌에 따르면, 여기에는 분자량이 약 5000 내지 200,000인 가용성 거대분자가 포함된다. 그러나, 이러한 범위는 기술적인 진보로 인해 거의 매일 신장한다. 당해 방법은 또한 다양한 범위의 결합 해리 상수(〈pmol 내지 mol)에 대해 감수성이다. 더욱 감수성인 CCD 카메라 검출기를 사용함으로써, 회전 음극 공급원으로 약 4시간 이내에 데이타를 수집할 수 있다. 이는 1일당 검출기당 수천종의 화합물을 스크리닝하게 한다. 싱크로트론 공급원을 사용함으로써, 스트리닝된 화합물의 수는 검출기당 수천종까지 증가하며, 라우에(Laue) 데이타 수집 방법 및 시험 혼합물에 의해 CrystaLEADTM데이타는 수초 이내에 수집됨으로써 광선당 1일당 수천종의 화합물이 시험될 수 있다. 따라서, 다중 검출기 또는 단일 싱크로트론 광선은 진정한 고-처리량의 스크리닝을 용이하게 한다.
도 3은 본 발명을 요약한 것이다. 표적 분자의 결정은 결정을 침지시키거나 하나 이상의 화합물의 존재하에 표적을 공-결정화시킴으로써 하나 이상의 화합물에 노출된다. 이어서, 결정학 데이타를 수집하고, 처리하여 전자 밀도 지도로 전환시킨 다음 리간드 결합의 증거에 대해 검사한다. 리간드 결합을 검출하는 한 가지 방법은 본래의 결정 구조를 노출된 결정 구조와 비교하는 것이다.
새로운 표적은 공개된 조건에 의하거나 당 분야에서 잘 확립된 기타 방법에 의해 결정화될 수 있다. 유사하게는, 표적 구조는 단백질 데이타 뱅크(Protein Data Bank)와 같은 데이타베이스로부터 입수하거나 잘 확립된 방법에 의해 측정할 수 있다. 분자 생물학 및 단백질 조작에 있어서의 진보는 표적 결정화를 촉진시키는 반면, 데이타 수집에 있어서의 진보는 이전에 알려져 있지 않은 구조를 갖는 표적에 대한 신속한 구조 측정을 보조한다.
침지에 의해 잠재성 리간드에 노출된 결정은 접근가능한 중공(empty) 활성 부위를 필요로 한다. 중공 활성 부위를 갖는 결정은, 이로써 제한되지는 않지만, 리간드 부재하의 결정화; 말단 부위에 결합된 리간드 존재하의 결정화; 또는 생분자가 결정화되면 표적으로부터 용이하게 희석되거나 교환되는 비-공유결합 리간드 존재하의 결정화를 포함하는 각종 방법에 의해 수득될 수 있다. 신규한 방법에 의해, 본 발명자들은 분해가능한 리간드의 존재하에 생분자를 활성 부위에서 결정화시킨 다음 결정이 형성되면 리간드를 분해시킴으로써 생분자로부터 결정을 수득하였다. 반면, 스크리닝되는 화합물의 존재하에 결정을 성장시킬 수 있다. 결정은 혼합물의 존재하에 평형을 유지하며, 이때 리간드는 이들의 농도와 결합 친화성의 작용으로 결합한다.
침지 방법의 경우, 당해 방법의 감수성은 단순한 평형 관계에 의해 어림잡을 수 있는데, 이는 결정내의 단백질 농도가 계산될 수 있고 리간드 농도가 공지된 양이기 때문이다. 예를 들면, 결정내의 25,000MW 단백질(유로키나제)의 농도는 다음과 같이 계산된다: 55×53×82Å3의 용적을 갖는 사방 단위 셀(모든 각 90°)내에는 4개의 분자가 존재한다; 아보가드로 수를 이용하면 상기 농도는 28mM이다. 따라서, 각 리간드에 대해 6mM 농도를 갖는 화합물의 혼합물은 계산된 감수성 한계가 Kd〈1.5mM일 것이다(검출 한계는 결정내의 점유를 약 80%로 추정함).
화합물의 침지 혼합물은 또한 다중 점유(하나 이상의 리간드가 당해 부위에 결합)의 문제를 제기한다. 리간드가 상이한 포켓에서 결합되는 다중 점유의 경우(도 2 참조)에는 CrystaLEADTM에 의한 분해가 용이한데, 이는 별도의 부위에서의 결합이 전자 밀도 지도에 의해 개별적으로 구별될 수 있기 때문이다. 상이한 리간드가 동일한 부위를 점유하기 위해 경쟁한다는 시나리오에 있어서는 이러한 결합에 대한 요건을 계산하기 위해 단순한 경쟁 억제 모델을 사용할 수 있다. 경험적인 관찰로부터, 결정학은 특정한 억제제의 점유가 80%이고 다른 억제제의 점유가 20%인 상황을 분해할 수 있다. 따라서, 4 이상의 결합 친화성 비율은 친화성이 보다 높은 리간드에 의해서만 명백한 점유를 나타낼 것이다. 혼합물에서 두 화합물의 결합 상수 비율이 4 미만인 경우에는 수득된 전자 밀도가 2개의 개별적인 밀도의 평균일 것이며, 확인하기가 어려울 것이다. 따라서, 결합 친화성의 비율이 4 미만일 경우에만 혼합물(예: 별도의 결정에서 각 화합물을 개별적으로 관찰)을 탈-회선시키는 추가의 침지 실험을 수행하여야 할 것이다. 이는 여전히 유용하고 효과적일 수 있는데, 이는 2개 이상의 적중이 혼합물내에 존재한다는 것을 이미 결정하기 때문이다.
스크리닝될 화합물은 라이브러리로 형성된다. 이러한 논의를 위해, 라이브러리는 화합물의 큰 혼합물(100-10,000+)이며, 일반 라이브러리이거나 구조-유도된 라이브러리일 수 있다. 일반 라이브러리는 무작위성인데, 즉 크기, 형상 및 작용이 완전히 다르다. 구조-유도된 라이브러리는 표적 분자의 활성 부위내의 특정한 작용성 혼합물 또는 아부위를 목적으로 한다(예를 들면, 모든 화합물이 표적 활성 결정내의 포지티브 전하에 대해 유도되는 카복실레이트 관능성을 함유하는 라이브러리).
바람직한 양태에 있어서, 둘중 어느 라이브러리 형태도 보다 작은 그룹의 형상이 다양한 혼합물로 분리된다. 따라서, 혼합물은 침지되거나 결정으로 성장할 수 있는 라이브러리의 서브세트로서 정의된다. 혼합물은 2차원 화학 구조의 시각적 검사에 의해 또는 프로그램에 의해 계산적으로 형상이 다양한 것으로 측정된다. 혼합물의 형상 다양성은 수득된 전자 밀도 지도로부터 결합된 리간드를 직접 확인시켜 준다(도 4 참조). 이는 혼합물의 화합물이 적중(표적에 결합됨)되는지를 측정하기 위한 후속 실험에 대한 필요성을 제거한다.
시험 화합물이 수용성인 경우, 결정화에 사용된 전형적인 완충제 및 침전제 용액을 사용하여 혼합물을 가용화시키고 이들을 결정으로 침지시킬 수 있다. 보다 덜 수용성인 화합물은 적합한 유기 용매중에서 최종 농도 2M까지 개별적으로 용해시킨다. 한가지 양태에 있어서, 이들을 100% DMSO에 용해시켜 4℃에서 저장하며, 결정에 노출시키기 전에 DMSO 스톡을 혼합하여 혼합한다. 이들 혼합물은 결정 성장에 대한 조건이 유기 시약을 포함하지 않는 대부분의 결정 시스템을 사용할 것이다. 이러한 화합물은 전형적으로 1 내지 10%의 최종 DMSO 농도까지 침지될 것이고, 예비-결정된 시간(4 내지 24시간) 동안 결정질 단백질로 평형시킨다. 이러한 시나리오하에, 각 결정을 침지 혼합물당 다중 화합물에 노출시킨다. 몇몇 결정 성장 조건은 전형적으로 알콜 유도체인 고농도의 유기 용매(40 내지 50%)를 포함할 수 있다. 이 경우, 침지 시험 동안 최종 공-용매 농도를 40 내지 50%로 되게 하는 결정화 유기 용매에 화합물 라이브러리를 용해시킬 수 있다. 여기서, 침지 혼합물당 화합물의 수는 증가할 수 있다.
침지 후, 각 결정을 침지 혼합물중의 5 내지 20% 글리세롤과 같은 동결방지제에 노출시키고, 나일론 루프에 고정시킨 다음 질소 냉 스트림(160K)하에 X-선 장치에 위치시킨다. 결정 연구는 또한 결정의 안정성을 위해 필요에 따라 실온 또는 기타 적합한 조건에서 수행할 수 있다. 자동화 결정 고정 및 변화 장비를 사용하여 당해 공정의 이러한 단계를 가속화시킬 수 있다.
회절 패턴상의 각 반사(스폿)를 지수(h, k, l)로 지정하여 강도를 당해 분야의 표준으로서 측정한 결정학 데이타를 수집하고 처리한다. X-선 공급원은 매우 고속에서 회절 데이타 수집을 가능케 하는 실험실 X-선 발생기 또는 고휘도 싱크로트론 공급원일 수 있다. 구체적으로, 실험실 데이타 수집은 싱크로트론 공급원을 사용하여 시간을 감소시키면서 결정당 30분 내지 수시간 동안 수행할 수 있다. 결정당 데이타 수집은 라우에 데이타 수집 도식을 사용하여 1초의 수분까지 감소시킬 수 있다.
이어서, 회절 데이타를 당업자에게 친근한 방법에 의해 전자 밀도 지도로 전환시킨다. 전자 밀도 지도는 리간드 및/또는 표적 생분자의 3-D 사진이다.
Fo-Fc 지도에 있어서, 리간드가 결합되지 않은 공지된 결정 구조로부터 수득한 계산된 구조-인자 진폭(｜Fo｜)은 관찰된 진폭(｜Fo｜)으로부터 뺀다. 따라서, 이러한 지도는 라이브러리 혼합물의 존재하에 침지된 결정으로부터 생성되는 데이타로부터 천연 단백질 구조로부터 생성되는 데이타를 직접 뺀 것이다. 그 결과는 포지티브 및 네가티브 피크를 갖는 전자 밀도 지도이다. CrystaLEADTM과 관련된 피크는 표적상의 목적 부위에서 리간드 결합의 직접적인 결과(즉, 표적 생분자내로 리간드의 첨가)인 포지티브 피크이다. 도 3에 있어서, Fo-Fc 지도는 유로키나제의 활성 부위에서 거대한 포지티브 피크를 명백히 나타낸다. 피크의 형상은 리간드 2-아미노-8-하이드록시퀴놀린에 상응한다. 리간드는 포지티브 차이 밀도의 점유를 나타낸다. 다른 포지티브 피크는 결합된 설페이트 잔기(SO4 2-에 의해 지시됨) 및 결합된 물 분자(H2O에 의해 지시됨)에 상응한다. 이러한 유형의 지도는, 2Fo-Fc 지도와 함께 사용되는 경우 전체 리간드-단백질 복합체의 상세한 구조를 측정하게 하는 작은 구조 변화(△에 의해 지시됨)에 대해 매우 감수성이다. 2Fo-Fc 지도를 계산하기 위해, 2(｜Fo｜)로부터 (｜Fc｜)를 뺀다. 여기서, 지도는 포지티브이고, 분자의 모든 원자에 대한 밀도를 갖는다.
도 3에 있어서, 지도의 조사는 결합된 화합물의 속성 및 구조를 나타낸다. 바람직하게는, 노출된 결정의 지도를 노출되지 않은 표적 분자의 지도와 비교하여, Fo-Fc 지도에서 발견될 수 있는 포지티브 밀도를 구별한다. 때때로, 물 분자는 결합된 리간드의 부재하에 결정내의 활성 부위를 점유한다. 이는 용이하게 구별되는데, 이는 결합된 물 분자가 종종 수소 결합과 일치하는 기하로 배향되어 있고 이들이 공유 결합의 네트워크에 의해 연결되어 있지 않기 때문이다. 따라서, 수득된 지도는 단절되는 경향이 있는데, 이는 유기 화합물보다 결합된 용매를 나타낸다. Fo-Fc 또는 2Fo-Fc 지도내의 밀도를 측정하여 유기 화합물을 나타내고, 3차원 형상을 라이브러리에 존재하는 화합물의 형상과 비교하여 가장 적합한 것을 제조한다. 반면, QUANTA(Molecular Simulations Inc., Quanta Generating and Displaying Molecules, San Diego: Molecular Simulations Inc., 1997)의 XFTT 모듈과 같은 프로그램은 이러한 공정을 자동화시킬 수 있다.
회절 강도를 측정 또는 처리하는 능력이 개선됨에 따라서, 전자 지도 밀도에 대한 비교를 수행하지 않을 수도 있다. 노출된 결정의 회절 패턴을 노출되지 않은 결정의 회절 패턴과 단순히 비교함으로써 결합을 검출할 수 있다. 따라서, 결합 빈도가 이러한 프리-스크리닝 공정에서 검출되는 경우에만 전자 밀도 지도를 작성하여야 한다.
상기 제시된 바와 같이, CrystaLEADTM은 결정학 구조를 수득할 수 있는 모든 생분자 표적에 적용할 수 있다. 이의 광범위한 적용성으로 인해, 이는 하기 실시예에 의해 가장 잘 설명된다.
유로키나제 및 VanX 예는 CrystaLEADTM의 용도에 대한 2가지 시나리오를 나타낸다. 유로키나제의 경우, 재-조작된 마이크로 UK(μUK) 결정은 매우 잘 회절시키며, 고도의 대칭성 스페이스 그룹으로 이루어진다. 대조적으로, VanX 결정은 더욱 약하게 회절시키며, 보다 낮은 대칭성을 갖는다. 따라서, VanX는 보다 많은 데이타 수집 시간을 요구한다. 또한, 유로키나제 결정은 비대칭성 단위내에 하나의 분자를 가지는 반면, VanX는 6개의 분자를 갖는다. 보다 큰 비대칭성 단위는 고도의 분해 데이타의 수집을 필요로 하며, 지도 조사를 더욱 지루하게 한다. 그러나, VanX의 경우에, CrystaLEADTM에 의해 발견되기 전에는 어떠한 비-기질 유사성 결합제도 알려져 있지 않았다. 따라서, CrystaLEADTM은 약물 발견 사이클내로 공급되는 신규한 비-펩타이드 선도 화합물을 제공한다. 유로키나제의 경우, CrystaLEADTM은 신규한 주요 골격을 제공한다. 본 출원인들은 공지된 유로키나제 리간드에 비해 생물이용성이 개선된 고-친화성 유도체를 설계하기 위해 기존의 SAR 및 결정 구조를 사용함으로써 주요 골격의 효능을 신속하게 증가시킬 수 있었다.
그러나, 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 설명하는 것이며, 특허청구의 범위 및 명세서를 제한하는 것은 아니다. 당업자는 본 발명의 범위 및 범주를 벗어나지 않고도 구체화된 양태에 대한 변화 및 변경이 이루어질 수 있음을 인지할 것이다. 마지막으로, 본원내의 모든 인용문헌은 참조로서 도입된다.
실시예 1: 유로키나제
세린 프로테아제인 유로키나제는 종양 세포와 강력히 결합한다. 유로키나제는 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화시키고 매트릭스 메탈로프로테아제를 차례로 활성화시킨다. 플라스민 및 메탈로프로테아제는 세포외 매트릭스를 분해시키고, 종양 성장과 대사를 촉진시킨다. 따라서, 유로키나제를 특이적으로 표적화하는 억제제는 효과적인 항암제로서 사용될 수 있다.
사람 프로-유로키나제는 411개의 아미노산으로 구성되어 있다(도 5)[참조: Verde et al., Proc. Nat'l Acad. Sci., v. 81(5), pp. 4727-31(1984); Nagai et al., Gene, v. 36(1-2), pp. 183-8(1985)]. Lys158-Ile159펩타이드 결합에서 단백질분해 절단에 의해 활성화되는 경우, 효소는 단일 디설파이드 브릿지(Cys148-Cys279)에 의해 연결된 이본쇄가 된다. A-쇄(잔기 1 내지 158)은 EGF-유사 도메인과 크링글 도메인을 함유한다. B-쇄(잔기 159 내지 411)은 촉매적 세린 프로테아제 도메인을 함유한다. 유로키나제를 추가로 항온처리하면, Lys135-Lys136에서 펩타이드 결합이 단백질분해에 의해 추가로 절단되어 저분자량의 유로키나제를 형성한다. 공유결합 억제제 Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤과의 복합체로서 이러한 효소의 결정 형태는 스프라곤 등(Spraggon et al., Structure, v. 3, pp. 681-91(1995)]에 의해 수득되었고, 고에너지 싱크로트론 공급원에서 2.5Å 해상도를 회절시키는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 공유 결합된 억제제의 존재와 함께 이들 결정의 불량한 회절 특성은 CrystaLEADTM의 적용을 어렵게 한다.
μUK 결정 제조 및 구조
CrystaLEADTM을 실행시키기 위해, 사람 유로키나제를 재-조작하여 B-쇄의 잔기 159 내지 404만으로 구성되게 하는데, 여기서 Asn302를 글루타민으로 대체시켜 글리코실화 부위를 제거하고, Cys279를 알라닌으로 대체시켜 유리 설프하이드릴 잔기를 제거한다. 이러한 형태의 유로키나제(μUK)는 충분히 활성적인 것으로 밝혀졌으며, CrystaLEADTM에 적합한 결정형으로 결정화하는 것으로 밝혀졌다[참조: Heyneker 등에게 1992년 5월 12일자로 허여된 미국 특허 제5,112,755호].
벡터 작제물 pBC-LMW-UK-Ala279의 제조
사람 UK의 돌연변이체를 디시스트로닉 세균 발현 벡터 pBCFK12내로 클로닝시킨다[참조: Pilot-Matias et al., Gene, v. 128, pp. 219-25(1993)]. 하기 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 PCR에 의해 각종 UK 돌연변이체를 생성한다:
서열 번호 PCR 프라이머의 서열
1 5'-ATTAATGTCGACTAAGGAGGTGATCTAATGTTAAAATTTCAGTGTGGCCAA-3'
2 5'-ATTAATAAGCTTTCAGAGGGCCAGGCCATTCTCTTCCTTGGTGTGACTCCTGATCCA-3'
3 5'-ATTAATTGCGCAGCCATCCCGGACTATACAGACCATCGCCCTGCCCT-3'
저분자량 UK(이하 LMW-UK(L144-L411)이라 한다)의 초기 클로닝은 표준 PCR 반응에서 주형으로서 사람 UK cDNA를 사용하고 프라이머로서 서열 1 및 2를 사용하여 수행한다. PCR 증폭된 DNA를 겔 정제하고, 제한 효소 SalI 및 HindIII으로 분해시킨다. 이어서, 분해된 생성물을 동일한 2개의 효소로 미리 절단시킨 pBCFK12 벡터에 연결시켜 발현 벡터 pBC-LMW-UK를 생성한다. 이 벡터를 DH5α 세포(Life Technologies, Gaithersburg, MD)에 형질전환시키고, 분리한 다음 DNA 서열분석에 의해 서열을 확인한다. 세균내에 LMW-UK의 생성은 SDS-PAGE 및 지모그래피[참조: Granelli-Piperno et al., J. Exp. Med., v. 148, pp. 223-34(1978)]에 의해 분석하여 UK에 의한 플라스미노겐 활성화를 측정한다. LMW-UK가 이. 콜라이(E. coli)에서 발현되고, 지모그래피 분석에서 활성적이라는 것은 코마시에 블루 염색된 겔에 의해 입증한다.
이. 콜라이에서 LMW-UK의 신속한 발현 및 검출의 성공은 UK의 돌연변이유발 분석을 수행하여 이의 최소 관능성 구조를 측정할 수 있게 한다. Cys279가 Ala279로 치환된 특정한 돌연변이체를 서열 2와 3으로 PCR에 의해 제조한다. PCR 생성물을 AviII 및 HindIII으로 절단하고, 이를 사용하여 pBC-LMW-UK 작제물에서 AviII 및 HindIII 단편을 대체시킨다. 수득한 pBC-LMW-UK-Ala279작제물을 이. 콜라이에서 발현시키고, 생성물은 지모그래피에서 활성적인 것으로 밝혀졌다.
바쿨로바이러스에서 μUK(UK(I159-K404)A279Q302)의 클로닝과 발현
μUK(Ala279Gln302를 함유하는 UK 아미노산 Ile159-Lys404)는 하기 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 생성한다:
서열 PCR 프라이머의 서열
4 5'-ATTAATCAGCTGCTCCGGATAGAGATAGTCGGTAGACTGCTCTTTT-3'
5 5'-ATTAATCAGCTGAAAATGACTGTTGTGA-3'
6 5'-ATTAATGTCGACTAAGGAGGTGATCTAATGTTAAAATTTCAGTGTGGCCAA-3'
7 5'-ATTAATGCTAGCCTCGAGCCACCATGAGAGCCCTGCT-3'
8 5'-ATTAATGCTAGCCTCGAGTCACTTGTTGTGACTGCGGATCCA-3'
9 5'-GGTGGTGAATTCTCCCCCAATAATGCCTTTGGAGTCGCTCACGA-3'
UK에서 글리코실화 부위(Asn302)만을 돌연변이시키기 위해, 올리고뉴클레오타이드 서열 4와 6, 및 서열 5와 8을 주형으로서 pBC-LMW-UK-Ala279와 함께 2회의 PCR 반응에 사용한다. 2개의 PCR 생성물을 제한 효소 PvuII로 절단하고, T4 DNA 리가제로 연결시키며, 이를 주형으로 사용하여 LMW-UK-A279-Q302를 수득한다. 반면, 천연 UK 리더 서열은 주형으로서 천연 UK cDNA를 사용하여 서열 7 및 9와 함께 PCR에 의해 Ile159에 직접 융합시킨다.
이 PCR 생성물을 LMW-UK-A279-Q302DNA를 주형으로서 사용하여 새로운 PCR 반응에서 서열 8과 함께 프라이머로서 사용하여 μUK cDNA를 수득한다. μUK를 NheI으로 절단하고, 동일한 효소로 절단된 바쿨로바이러스 전달 벡터 pJVP10z에 연결시킨다[참조: Vialard et al, J. Virology, v. 64(1); pp. 37-50, (1990)]. 수득된 작제물 pJVP10z-μUK를 표준 DNA 서열분석 기술에 의해 확인한다.
작제물 pJVP10z-μUK를 PharMingen(San Diego, CA)사의 BaculoGold 키트를 사용하는 인산칼슘 침전 방법에 의해 Sf9 세포에 형질감염시킨다. 활성 μUK 활성을 배양 배지에서 검출한다. μUK를 발현하는 단일 재조합 바이러스를 표준 방법에 의해 플라크 정제하고, 바이러스의 거대 스톡을 제조한다.
μUK의 대규모 발현은 2L 플라스크중의 Excel 405 혈청-비함유 매질(JRH Biosciences, LeneXa, KS)에서 성장하는 현탁액중에서 80rpm 및 28℃에서 진탕시키면서 곤충 세포의 또다른 균주, High-Five 세포(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 수행한다. High-Five 세포는 2×106개 세포/ml로 성장시키고, 재조합체 μUK 바이러스를 0.1의 감염 중복도로 첨가하며, 3일 동안 배양을 계속한다. 배양 상청액을 정제를 위한 출발 물질로서 수거한다. 배양 상청액중의 μUK의 활성을 색원체 UK 기질 S2444의 아미도분해에 의해 측정한 결과 6 내지 10mg/L이었다[참조: Haemostasis, v. 7, p. 76(1978)].
피키아 파스토리스에서 μUK의 발현
피키아(Pichia)에서 μUK를 발현시키기 위해, 합성 리더 서열을 갖는 발현 벡터를 사용한다. 피키아 발현 벡터 pHil-D8은 벡터 pHil-D2(Invitrogen)을 변형시켜 재조합 단백질의 분비를 위한 합성 리더 서열을 포함시킴으로써 작제한다. 리더 서열 5'-ATGTTCTCTCCAATTTTGTCCTTGGAAATTATTTTAGCTTTGGCTACTTTGCAATCT GTCTTCGCTCAGCCAGTTATCTGCACTACCGTTGGTTCCGCTGCCGAGGGATCC-3'(서열 10)은 KEX2 절단을 위한 프로-펩타이드 서열(굵게 표시됨)에 작동적으로 연결된 PHO1 분비 서열(밑줄로 표시됨)을 암호화한다. pHil-D8을 작제하기 위해, 주형으로서 pHil-S1(Invitrogen)을 사용하여 PCR을 수행하는데, 이 벡터는 PHO1을 암호화하는 서열, pHil-S1의 뉴클레오타이드 509 내지 530에 상응하는 전방향 프라이머(서열 11) 및 PHO1 분비 시그날(서열 10의 뉴클레오타이드 45 내지 66)과 프로-펩타이드 서열(서열 10의 뉴클레오타이드 67 내지 108)의 후반 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 역방향 프라이머(서열 12)를 함유한다. 프라이머 서열(Operon Technologies, Inc. Alameda, CA로부터 수득됨)은 다음과 같다:
서열 번호 PCR 프라이머의 서열
11 5'-GAAACTTCCAAAAGTCGCCATA-3'
12 5'-ATTAATGAATTCCTCGAGCGGTCCGGGATCCCTCGGCAGCGGAACCAACGGTAGTGCA GATAACTGGCTGAGCGAAGACAGATTGCAAAGTA-3'
증폭은 표준 PCR 조건하에 수행한다. PCR 생성물(대략 500bp)을 겔 정제하고, BlpI 및 EcoRI으로 절단하고, 동일한 효소로 절단된 pHil-D2에 연결시킨다. DNA를 이. 콜라이 HB101 세포에 형질전환시키고, 포지티브 클론을 제한 효소 분해 및 서열 분석에 의해 확인한다. 적당한 서열을 갖는 하나의 클론을 pHil-D8로서 지정한다.
이어서, 하기 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 pHil-D8내로의 클로닝을 위한 μUK를 증폭시킨다.
서열 번호 PCR 프라이머의 서열
13 5'-ATTAATGGATCCTTGGACAAGAGGATTATTGGGGGAGAATTCACCA-3'
14 5'-ATTAATCTCGAGCGGTCCGTCACTTGGTGTGACTGCGAATCCAGGGT-3'
PCR 생성물은 주형으로서 pJVP10z-μUK를 사용하여 서열 13 및 14로 수득한다. 증폭된 생성물을 BamHI 및 XhoI으로 절단하고, 동일한 2개의 효소로 절단한 pHil-D8에 연결시킨다. 생성된 플라스미드 pHilD8-μUK는 DNA 서열분석에 의해 확인하며, 이를 사용하여 공급자의 지시에 따라 Pichia 균주 GS115(Invitrogen)을 형질전환시킨다. 형질전환된 Pichia 콜로니는 BMGY 배지에서 성장시켜 공급자(Invitrogen)에 의해 상세히 설명된 바와 같이 BMMY 배지에서 발현시킴으로써 μUK 발현에 대해 스크리닝한다. μUK 활성은 색원체 기질 S2444로 측정한다. 피키아에서 μUK 발현 수준은 바쿨로바이러스-High Five 세포에서 관찰된 것보다 높았으며, 30 내지 60mg/L의 범위이다.
μUK의 정제
High Five 세포 또는 피키아의 배양 상청액을 20L 용기에 풀링한다. 프로테아제 억제제, 요오도아세트아미드, 벤즈아미딘 및 EDTA를 각각 최종 농도 약 10mM, 5mM 및 1mM로 가한다. 이어서, 상청액은 5mM 헤르페스 완충제(pH 7.5)를 가하여 5배 희석시키고, 1.2μ 및 0.2μ 여과막을 통과시킨다. μUK를 50 내지 100ml/분의 유속에서 막을 통과시켜 Sartorius 막 흡착제 S100(Sartorius, Edgewood, NY)상에 포획시킨다. 10mM 헤르페스 완충제(pH 7.5), 10mM 요오도아세트아미드, 5mM 벤즈아미딘 및 1mM EDTA로 광범위하게 세척한 후, μUK를 10mM 헤르페스 완충제(pH 7.5), 10mM 요오도아세트아미드, 5mM 벤즈아미딘, 1mM EDTA중에서 NaCl 구배(20mM 내지 500mM, 200ml)로 S100 막으로부터 용출시킨다. 용출물(약 100ml)를 억제제 함유 10mM 헤르페스 완충제중에서 10배 희석시키고, S20 컬럼(BioRad, Hercules, CA)에 적재한다. μUK를 20× 컬럼 용적의 NaCl 구배(20mM 내지 500mM)로 용출시킨다. 어떠한 억제제도 용출 완충제에 사용되지 않았다. 이어서, 용출물을 10mM 헤르페스 완충제(pH 7.5)로 5배 희석시키고, 헤파린-아가로즈(Sigma) 컬럼에 적재한다. μUK를 10mM로부터 250mM까지 NaCl 구배로 용출시킨다. μUK(약 50ml)의 헤파린 컬럼 용출물을 10mM 헤르페스 완충제(pH 7.5), 200mM NaCl로 평형시킨 벤즈아미딘-아가로즈(Sigma, St. Louis, MO) 컬럼(40ml)에 적용시킨다. 이어서, 컬럼을 평형 완충제로 세척하고, 50mM NaOAc(pH 4.5), 500mM NaCl로 용출시킨다. μUK 용출물(약 30ml)는 한외여과에 의해 4ml로 농축시키고, 20mM NaOAc(pH 4.5), 100mM NaCl로 평형시킨 세파덱스 G-75 컬럼(2.5×48cm; PharmaciaRBiotech, Uppsala, Sweden)에 적용시킨다. μUK를 함유하는 단일 주요 피크를 수집하고, 최종 생성물로서 동결건조시킨다. 정제된 물질은 단일 주요 밴드로서 SDS-PAGE상에 나타났다.
고도의 특성을 갖는 μUK 결정은 X-선 결정학에 의해 1.0Å 해상도까지 이의 아포-3차원 구조의 측정을 촉진시켰다. 결정은 현적 배양 증발 분산 방법에 의해 수득한다. 전형적인 웰 용액은 0.15M Li2SO4, 20% 폴리에틸렌 글리콜(MW 4000) 및 석시네이트 완충제(pH 4.8 내지 6.0)로 구성된다. 커버 슬립상에서, 웰 용액 2㎕를 단백질 용액 2㎕와 혼합하고, 슬립을 웰 위에 밀봉시킨다. 결정화는 24시간 이내에 대략 18 내지 24℃에서 발생한다. 단백질 용액은 1% DMSO 공용매와 함께 10mM 시트레이트(pH 4.0)중의 6mg/ml(0.214mM) μUK, 3mM ε-아미노 카프로산 p-카브에톡시페닐 에스테르 클로라이드(억제제)를 함유한다. 공-결정화에 사용된 억제제는 활성 부위 세린 195를 아크릴화시킨 다음 효소에 의해 탈아실화시키는 것으로 생각되는데, 이는 당해 화합물의 존재하에 성장한 결정의 3-D X-선 구조가 효소 활성 부위에 억제제의 부재를 나타내기 때문이다[참조: Menegatti et al., J. Enzyme Inhibition, v. 2, pp. 249-59(1989)]. 존재하는 밀도는 결합된 용매 분자에 기인하는 것이다. μUK는 억제제의 부재하에 결정화되지 않을 것이기 때문에, 메타-안정한 억제제:UK 복합체는 결정화 실체인 것으로 생각된다. 중요하게는, 수득된 μUK 결정은 CrystaLEADTM의 실행에 이상적인 중공 활성 부위를 갖는 효소로 구성되어 있다.
이들 조건하에 수득된 결정은 a=55.16Å, b=53.00Å, c=82.30Å 및 α=β=γ=90°의 단위 셀 직경을 갖는 스페이스 그룹 P212121에 포함된다. 이들은 회전 음극 공급원 상에서 1.5Å까지 회절시킨다. 추가로, 본래의 1.0Å 해상도 데이타 세트는 코넬 하이 에너지 싱크로트론 공급원(Cornell High Energy Synchrotron Source, Ithaca, New York)에서 수집되었다. 결정 구조는 검색 프로브로서 저-분해 유로키나제 구조[참조: Spraggon et al., Structure, v. 3, pp. 681-691(1995); PDB entry 1LMW]와 함께 AMORE 프로그램[참조: Navaza, J. Acta Cryst., A50: 157-163(1994)]를 사용하는 분자 치환 방법에 의해 측정한다. 이 구조는 XPLOR 프로그램 패키지를 사용하여 정제한다[참조: A. Brunger, X-PLOR(version 2.1) Manual, Yale University, New Haven CT(1990)].
약 염기에 대한 스크리닝
μUK를 구조-지시된 라이브러리에 대해 스크리닝하여, 바람직한 약역학적 특성을 가질 수 있는 신규한 주요 골격을 발견할 수 있다. 유로키나제 활성 부위는 아스파르트산(Asp189)의 형태로 유리 카복실레이트 잔기를 함유하는 하나의 주요 포켓으로 구성되어 있고, 가장 잘 알려진 골격은 강 염기성이며 아미딘 또는 구아니딘 잔기를 함유한다. 염기성 그룹은 Asp189와 수소 결합 염 연결되는 것으로 밝혀졌다. 이는 약역학적으로 문제가 있을 수 있는데, 이는 강염기가 경구 생물이용성을 감소시키는 것으로 알려져 있기 때문이다. 따라서, 유로키나제 결합제인 것으로 이전에 알려져 있지 않은 화합물을 함유하는 약염기성 라이브러리가 선택된다.
pKa가 약 1 내지 9인 61개의 화합물을 함유하는 약염기 라이브러리를 이용가능한 화학 디렉토리(ACD)에 위치시킨다. 라이브러리는 2차원 화학 구조의 시각 조사에 의해 측정되는 바와 같이 약 6 내지 7개의 형상이 다양한 화합물의 9개 혼합물로 파괴된다. 화합물의 혼합물은 상술된 방법에 의해 스크리닝한다. 구체적으로, 각 화합물을 최종 농도 약 2M(또는 덜 가용성인 경우 포화)까지 100% DMSO에 용해시킨다. 혼합물을 포함하는 동일한 용적의 6개 또는 7개의 각 화합물을 최종 농도가 0.33M인 개별 화합물에 혼합한다. 단일 μUK 결정을 27% PEG4000, 15.6mM 석시네이트(pH 5.4), 0.17M Li2SO450ml, 및 1 내지 1.6% DMSO 및 3.3 내지 5.2mM의 최종 개별 화합물 농도를 제공하기 위해 첨가된 화합물의 혼합물 0.5 내지 0.8mL에 넣는다. 이들 조건하에, 실험의 감수성은 Kd〈1.0mM인 결합제를 검출할 것으로 예상된다. 결정은 약 8 내지 24시간 동안 평형시킨다.
RAXISII 또는 MAR 영상 플레이트 검출기를 갖춘 Rigaku RTP 300RC 회전 음극 공급원상에서 데이타를 수집한다. 전형적인 데이타는 2 내지 5분의 노출과 함께 45 내지 50 2°진동으로 구성된다. 전형적인 데이타는 13 내지 26%의 통합 R-인자와 함께 2.0 내지 3.0Å 해상도에서 70 내지 90% 완성되었다. 따라서, 데이타 성질은 신속한 데이타 수집 프로토콜에 기인하여 우수하거나 불량하였다. 그러나, 데이타의 이러한 성질은 1.5Å 해상도(R=20.7% Rfree=25.3%)로 정련된 출발 모델의 고도의 성질에 기인하여 주로 결합제의 검출에 적절한 것으로 밝혀졌다. 데이타는 DENZO 프로그램 패키지(Otwinowski et al., Methods in Enzymology, 276(1996))에 의해 처리하고, 전자 밀도 지도는 XPLOR 패키지에 의해 계산한다.
전자 밀도 지도는 QUANTA 97 프로그램 패키지(Molecular Simulations Inc., Quanta Generating and Displaying Molecules, San Diego: Molecular Simulations Inc., 1997)를 사용하여 실리콘 그래픽 INDIGO2 워크스테이션상에서 조사한다. 활성 부위에서 밀도의 형상은 포지티브 적중을 나타내는 혼합물중의 화합물 하나(이상) 또는 결합의 부재를 나타내는 정렬된 물 분자를 생성하는 것으로 시각적으로 확인된다. 포지티브 적중을 나타낸 실험의 경우, 적절한 화합물은 시각적으로 전자 밀도로 이동된다. 전자 밀도 지도는 또한 단백질 구조내의 변화에 대해 검사하고, 관찰되는 경우 적절한 변형을 수행한다. 따라서, 지도 검사/화합물 적합화 단계후, 화합물:단백질 복합체의 3차원 구조가 밝혀진다. 유로키나제 예는 밀도내로 화합물의 외관상 이동을 이용하는데, 이는 스크리닝이 여전히 소규모로 수행되기 때문이다. 화합물 스크리닝이 대규모로 신장되는 경우, QUANTA의 XFIT 모듈과 같은 상업적 프로그램은 밀도에 대한 화합물의 자동 적합화를 촉진시킬 것이다.
도 6은 포지티브 적중의 예를 나타낸다. 스크리닝된 화합물은 1 내지 6으로 넘버링되어 있고, 활성 부위에서 Fo-Fc 전자 밀도 지도는 도 6A에 나타낸다. 밀도의 형상은 결합제를 화합물(5)로서 확인시켜 준다. 도 6B는 CrystaLEADTM전자 밀도 지도의 해석에 의해 직접 수득된 바와 같은 주요 특이성 포켓에서 화합물의 세부적인 결합 양식을 나타낸다. 아미노 질소 수소는 Asp189카복실과 결합하고, 피리미딜 질소 수소는 백본 카보닐(Gly218)과 결합한다. 당해 구조는 또한 변형을 위한 이상적인 부위가 피리딜 메틸에 존재할 수 있음을 보여준다.
화합물의 또다른 혼합물(화합물 7 내지 13)은 어떠한 적중도 생성하지 않았다. 이러한 그룹을 침지시킨 후 생성되는 전자 밀도 지도는 당해 혼합물중의 시험된 화합물의 것에 상응하지 않는다. 대신에, 이들은 결합된 용매 분자에 상응한다(도 6C).
도 7은 포지티브 적중의 또다른 예를 나타낸다. 스크리닝된 7개의 화합물(14 내지 20)중에서, 도 7A에 제시된 Fo-Fc 지도는 화합물(19)가 결합되었음을 나타낸다. 도 7B에 제시된 결합 양식은 2-아미노가 Asp189 측쇄와의 수소 결합이고 8-하이드록실이 치환을 위한 이상적인 부위여서 인접한 소수성 서브-포켓(도 7B중의 S1β로서 표시됨)에 접근할 수 있음을 보여준다. 도 8은 화합물(22), 5-아미노인돌(도 8A)이 Asp189(도 8B)와의 아미노 그룹 수소 결합과 함께 유로키나제에 결합하는 것으로 밝혀진 또다른 적중을 나타낸다. 스크리닝된 화합물은 화합물(21 내지 27)이었다.
도 9는 동일한 혼합물로부터의 2개의 화합물(화합물 28 내지 34)이 다중 점유 문제없이 결합하는 것으로 밝혀진 예를 나타낸다. 결정이 전체 화합물의 혼합물의 존재하에 침지되는 초기 실험에 있어서, 화합물(28)은 결합하는 것으로 밝혀졌다(도 9A). 또한, 약한 결합 화합물(31)이 개별적으로 침지되는 경우(CrystaLEADTM을 통해 확립된 선행 구조 활성 관계를 기초로 하여), 또한 결합하는 것으로 밝혀졌다(도 9B). 당해 방법의 추가의 전형적인 적용에 있어서, 라이브러리는 경우에 따라 혼합물중의 보다 약한 결합제를 검출하기 위해 보다 단단한 결합제의 부재하에 재-침지시킬 수 있다.
표 1은 피로Glu-Gly-Arg-pNA/HCl(S-2444, Chromogenix) 색원체 활성에 의해 측정된 바와 같은 각각의 CrystaLEADTM적중에 대한 억제 상수를 요약한 것이다. 분석은 pH 6.5(0.1M NaPO4) 및 7.4(50mM 트리스) 모두에서 완결된다. 분석의 다른 조건은 최종 DMSO 농도가 2.5%인, 150mM NaCl, 0.5% 플루로닉 F-68 세정제, 200mM S-2444이었다. 기질의 Km은 55μM인 것으로 측정되었다.
| 화합물(CAS#) | Ki(pH 6.5) | Ki(pH 7.4) | pKa |
| 5(42753-71-9) | 〉〉500μM | 〉〉500μM | 6.0* |
| 19(70125-16-5) | 56μM | 137μM | 7.3 |
| 22(65795-92-8) | 200μM | 〉500μM | 6.0* |
| 28(580-22-3) | 71μM | 136μM | 7.3 |
| 31(1603-41-4) | 〉〉500μM | 〉〉500μM | 7.0* |
*은 평가된 pKa를 나타낸다.
활성 및 구조 정보에 기초하여, 화합물(19)는 선도 화합물로서 선택되었다. 결정학 정보는 8-위치에서의 치환이 인접한 소수성 포켓(S1β) 포켓에 접근시킴으로써 효능의 증가를 유발한다는 것을 나타낸다. 아미딘-기본 계열로부터의 결정학 및 결합 정보에 기초하여, 화합물(35)를 합성한다(화합물(19)의 8-아미노피리미디닐 동족체). 이러한 변형은 pH 6.5에서 결합 효능을 약 200배 증가시켰다(Ki pH 7.4=2.5μM; Ki pH 6.5=0.32μM). 이 실험은 CrystaLEADTM이 구조-기본된 약물 설계를 통해 당해 골격을 더욱 효능있는 화합물로 만드는데 필요한 선도 골격 및 세부적인 구조 정보 모두를 제공할 수 있음을 나타낸다.
도 10에는 결정 화합물(35):유로키나제의 중첩 및 모 화합물(19)가 제시되어 있다. 중첩은 아미노피리딘 환이 예상된 바와 같이 수소성 서브-포켓(S1β) 포켓내에 결합되어 있고 이러한 치환이 당해 부위에 대한 퀴놀린 환의 이동을 유발시킴을 보여준다.
화합물(35), 즉 8-아미노피리미디닐-2-아미노퀴놀린은 또한 경구 생물이용성에 대해 시험된다. 화합물(35)는 10mg/kg의 용량으로 투여되는 경우 랫트에서 경구 생물이용성이 30 내지 40%인 것으로 측정되었다. 따라서, CrystaLEADTM의 성공적인 실행 결과, 구조-기본된 약물 설계의 특정한 사이클을 통해 효능이 200배 증가한 화합물을 생성하는 신규한 선도 골격이 생성되었으며, 경구 생물이용성이 있는 것으로 밝혀졌다.
실시예 2: VanX
반코마이신은 β-락탐 항생물질에 내성이 있는 스트렙토콕칼 또는 스타필로콕칼 세균 균주에 의해 유발된 감염에 대한 선택 약물이다. 그러나, 이러한 약물의 최종적인 수단에 대해 반코마이신 내성 세균 균주가 발견되었다. 일부 연구자들은 VanX, 메탈로프로테이나제를 반코마이신 내성과 연결시켜 왔다. VanX는 세균 펩티도글리칸 쇄의 말단 D-Ala-D-Ala 잔기(반코마이신에 대한 결합 부위)를 D-Ala-D-락테이트로 치환시킨 캐스케이드의 일부이다. 이는 반코마이신 결합을 1000배 감소시켰다. VanX의 공지된 유일한 억제제는 D-Ala-D-Ala 기질의 포스포네이트 또는 포스피네이트 동족체와 같은 펩타이드 또는 펩타이드 유도체이다. 자체로서, 이들은 약물로서 적합하지 않은데, 이는 이들이 생체내에서 대사 및/또는 분해되기 때문이다. 표준 스크리닝 방법에 의해 적합한 약물을 발견하려는 초기의 시도는 적합한 리간드를 발견하지 못했다. 이어서, 출원인들은 이들 내성 균주에 대한 처리에 대해 약물 개발을 위한 비-펩타이드 선도 화합물을 발견하기 위해 CrystaLEADTM으로 방향을 바꾸었다.
VanX 제조
vanX 유전자가 IPTG-유도성 tac 프로모터의 조절하에 있는 플라스미드 pGW1을 함유하는 이. 콜라이 W3110을, 595nm에서 약 1.3 내지 1.5의 흡광도로 암피실린(100㎍/ml)를 함유하는 LB 배지중 37℃에서 성장시킨다. 이어서, IPTG를 최종 농도 0.8mM로 가하고, 세포를 추가로 1.5시간 동안 성장시킨다.
세포를 10분 동안 6000rpm에서 원심분리에 의해 수거한다. 이어서, 0.01% NaN3, 1mM MgCl2, 1mM PMSF, 1mM DTT(완충액 A) 및 25단위/ml의 벤조나제(Nicomed Pharma. Copenhagen, Denmark)를 함유하는 빙냉 20mM 트리스-HCl(pH 8.0)에 펠렛을 재현탁시킨다. 초음파 비드 분쇄기인 Bead Beater(Biospec)중에서 1 내지 3분의 작동과 함께 0.1μ 지르코늄 세라믹 비드를 용해 혼합물(1:1 v:v)에 가하여 세포를 용해시킨다. Bead Beater를 얼음-충전된 저장기에서 작동시켜 냉각된 용해물을 유지시킨다. 이어서, 용해물을 고정된 유리 비드로부터 경사분리한다. 이어서, 비드를 1 내지 2용적의 용해 완충제로 세정하고, 세척물을 본래의 용해물과 함께 풀링한다. 용해물을 25000g에서 30분 동안 원심분리하여 세포 파편을 고정시킨다. 상청액을 50mM 트리스-HCl(pH 7.6), 1mm EDTA 및 1mM DTT(완충제 B)중에서 4℃에서 밤새 투석한다.
그 후, 투석된 용해물을, 분당 4ml의 속도로, 완충제 A에서 예비 평형시킨 Q-세파로즈 고속 유동 컬럼상에 적재한다. 컬럼을 완충제 A로 완전히 세척한 다음 완충제 B 내지 완충제 B+0.5M NaCl의 선형 구배를 수행한다. 이 단계로부터의 활성 VanX 분획을 풀링하고, 농축시킨 다음 완충제 B중의 수퍼로즈-75 컬럼에 적용시킨다. 이어서, 수퍼로즈 컬럼 작동으로부터 VanX 분획을 2ml/분의 유속에서 완충제 A중의 공급원-Q 컬럼에 적용시킨다. 컬럼을 수개의 컬럼 용적에 대해 출발 완충제로 세척한다. 이어서, VanX 단백질을 완충제 A 내지 완충제 A+25mM NaCl의 얕은 구배로 용출시킨다. 이러한 최종 단계로부터의 활성 VanX 분획을 아미콘 필터에 의해 완중제 A의 최종 농도가 대략 15mg/ml가 되게 농축시킨다. 달리 명시되지 않는한, 상기 공정은 4℃에서 수행한다. 정제된 바와 같이, VanX 단백질은 대략적으로 95% 순수하며, 용이하게 결정화된다.
VanX 결정 구조
VanX의 결정 구조는 다중 동형치환에 의해 2.2Å 해상도에서 측정한다[참조: Bussiere et al., Molecular Cell, Vol. 2, pp 75-84(1998)]. 상기에서 수득한 재조합 단백질을 싯팅 드롭 증기 분산 방법에 의해 스페이스 그룹 PS1에서 결정화시킨다. 전형적인 결정은 비대칭성 단위내에 6개의 분자를 갖고, 단위 셀 직경이 a=83.4Å, b=45.5Å, c=171.4Å, α=γ=90°, β=104°이다. 전형적인 웰 용액은 0.1M Mes(pH 6.4), 0.24M 황산암모늄 및 20% PMME 5000으로 구성된다. 싯팅 드롭 마이크로브릿지(Hampton USA)상에서, 단백질 2ml를 웰 용액 2ml와 혼합하고, 챔버를 커버 스립으로 밀봉한다. 결정화는 18℃에서 일어나며, 결정은 약 2 내지 3일 이내에 완전한 크기로 성장한다. 단백질 용액은 10mM 트리스중의 12 내지 15mg/ml(0.5 내지 0.6mM) VanX, 15mM DTT(pH 7.2)로 구성되어 있다. 이들 조건하에 성장한 결정에 대한 3-D 구조는 중공 활성 부위를 나타내는데, 이는 이것을 CrystaLEADTM의 적용에 매우 적합한 시스템으로 만든다.
VanX 활성 부위는 D-Ala-D-Ala 기질을 수용할 수 있는 신장된 포켓을 갖는다. 또한, 이 포켓은 촉매 아연을 함유한다. 따라서, 이러한 경우, VanX는 단일 선도 화합물로 통합될 수 있는 다중 결합 골격을 발견하기 위해 아연 유도된 라이브러리에 대해 초기에 스크리닝된다. 아미노산, 티올, 하이드록삼산을 사용하는 3개의 라이브러리 또는 아연에 대해 유도된 카복실레이트 잔기가 스크리닝된다.
스크리닝
아미노산 라이브러리는 광학적으로 순수하고 상업상 이용가능한 천연 및 비-천연 아미노산의 102개 화합물로 구성된다. 라이브러리를 8 내지 10개의 형상이 다양한 화합물의 12개 혼합물로 나누고, 상술된 방법에 의해 스크리닝한다. 구체적으로, 각 화합물을 최종 농도 2M(또는 덜 수용성인 경우에는 포화)까지 100% DMSO중에 용해시킨다. 각 혼합물의 동일한 용적의 각 화합물을 0.33M의 최종 개개 화합물 농도로 혼합한다. 단일 VanX 결정을 0.1M Mes(pH 6.4), 0.24M 황산암모늄, 20% PMME 5000 50ml에 넣고, 화합물의 혼합물 0.5 내지 0.8ml를 가하여 1 내지 1.6% DMSO 및 3.3 내지 5.2mM 최종 개개 화합물 농도를 수득한다. 결정을 3 내지 4시간 동안 평형시킨다. 티올, 하이드록삼산 및 카복실레이트 라이브러리를 제조하고, 동일한 방식으로 스크리닝한다.
데이타는 RAXISII, MAR 영상 플레이트, 또는 MAR CCD 검출기를 갖춘 Rigaku RTP 300 RC 회전 음극 공급원상에서 수집한다. 영상 플레이트 시스템의 경우, 전형적인 데이타는 15분 노출과 함께 90 1.25°진동으로 구성되어 있고, CCD의 경우 100 1.0° 진동을 2분 동안 노출시킨다. 전형적인 사용가능한 데이타는 10 내지 20%의 통합 R-인자와 함께 2.6 내지 2.8Å 해상도에서 〉90% 완성되었다. 이는 Fo-Fc 또는 2Fo-Fc 지도에서 억제제를 적절히 가시화 및 확인하기 위해 요구된다. 이들 지도의 경우, 출발 모델은 2.1Å 해상도(R=25% Rfree=28%)로 정련한다. 데이타는 DENZO 프로그램 패키지로 처리하고, 전자 밀도 지도는 XPLOR 패키지로 계산한다. 카복실레이트 라이브러리의 일부 화합물의 존재하에, 스페이스 그룹은 P21으로부터 C2로 이동하는 것으로 나타났다(a=170.6Å, b=47.5Å, c=83.6Å, α=γ=90°, β=104°). 이러한 형태의 경우, 비대칭 단위는 삼량체를 함유하여 자유도 수를 감소시킴으로써 보다 낮은 해상도 데이타(3.0Å)가 결합의 가시화에 적절하다.
전자 밀도 지도는 QUANTA 97을 사용하여 실리콘 그래픽 INDIGO2 워크스테이션상에서 조사한다. 활성 부위에서 밀도의 형상은 포지티브 적중을 나타내기 위해 혼합물중의 하나 이상의 화합물의 형상에 의해 또는 결합을 부재를 나타내는 정렬된 물 분자에 의해 가시적으로 확인한다. 포지티브 적중을 나타낸 실험의 경우, 적절한 화합물은 외관상 전자 밀도로 이동된다. 전자 밀도 지도는 또한 단백질 구조의 변화에 대해 조사되며, 관찰되는 경우에는 상응하는 변형을 구조내에서 수행한다. 따라서, 지도 검사/화합물-적합화 단계 후, 화합물:단백질 복합체의 상세한 3-D 구조가 밝혀진다.
현재, 6개의 적중이 VanX 스크린(화합물 36 내지 41)에서 검출되었다. 도 11은 대표적인 적중의 결합 방식을 나타낸다. 모든 경우, 전자 밀도 형상은 결합 화합물을 확인시켜 준다. 도 11A는 활성 부위 아연에 배위하는 카복실레이트에 결합된 화합물(39)를 나타낸다. 도 11B는 활성 부위 아연으로 향하는 카복실레이트에 결합된 화합물(36)을 나타낸다. 도 11C에 있어서, 화합물(37)은 또한 카복실레이트를 통해 결합하는 것으로 밝혀졌다. 화합물(39)와 화합물(41)의 결합(도시하지 않음)은 활성 부위 아연이 유리 티올에 비해 카복실레이트의 배위를 선호한다는 것을 시사한다. 이는 추가의 적중이 발견되는 카복실레이트 라이브러리의 스크리닝을 유도한다. 모든 경우, 화합물은 7 내지 10개의 혼합물에서 스크리닝되고, 당해 적중은 전자 밀도 지도의 형상에 의해 직접 확인된다. 이들 적중은 유로키나제 실시예에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 구조-기본된 약물 설계 사이클로 직접 공급된다.
실시예 3: 100개 화합물의 혼합물을 사용한 스크리닝
CrystaLEADTM에 의해 단위 시간당 스크리닝될 수 있는 화합물의 수를 증가시키기 위해, 바람직한 방법 양태는 10개 화합물의 혼합물보다는 오히려 100개 화합물의 혼합물을 스크리닝하는 것이다. 이 방법의 잇점은 적중 검출의 감수성을 저하시킴과 동시에 보다 많은 화합물을 처리하는 것이다. 또한, 혼합물내의 가장 효능있는 화합물만이 결합할 것이기 때문에, 보다 약한 적중은 놓칠 것이다. 일반적인 라이브러리, 예를 들어 크기, 형상 및 관능성이 완전히 상이한 라이브러리가 CrystaLEADTM에 의해 스크리닝되는 경우, 적중-비율은 낮을 것으로 예상된다. 따라서, 보다 많은 조악한 스크린이 보장된다. 또한, 이러한 스크린으로부터의 적중이 보다 효능있는 결합제일 수 있기 때문에, 이들은 구조-기본된 약물 설계를 위한 출발 골격으로 사용될 수 있다. 화합물의 혼합물은 100개의 화합물로 구성될 것이기 때문에, 혼합물은 모든 구성원이 다양하게 형상화되어 탈회선의 필요성을 충분히 제거할 수 있도록 주의하여 설계하여야 한다. 따라서, 적중 검출시에, 적중을 확인하기 위해 일부 탈회선이 필요할 수도 있다.
이러한 특별한 방법을 시험하기 위해, μUK에 결합하는 것으로 공지된 화합물을 100개 화합물 그룹에 가한다. 당해 공지된 결합제, 즉 화합물(19)는 CrystaLEADTM방법에 의해 최초로 발견되었고, pH 6.5에서 56μM 및 pH 7.4에서 137μM의 Ki로 μUK에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 100개 화합물의 혼합물은 10개 화합물의 10개 혼합물을 혼합함으로써 구성된다. 구체적으로, 10개 화합물의 각각 무수 혼합물을 100% DMSO에 용해시켜 최종 농도 약 80 내지 240mM(또는 덜 수용성인 경우 포화)을 수득한다. 10개 화합물의 각 혼합물의 동일한 용적을 8.0 내지 24.0mM의 최종 개개 화합물 농도로 혼합하고, 혼합물을 최종 농도가 18.0mM이 되도록 화합물(19)의 100% DMSO 스톡으로 스파이크한다. 단일 μUK 결정을 27% PEG4000, 15.6mM 석시네이트(pH 5.4), 0.17M Li2SO450㎕에 넣고, 화합물의 혼합물 0.5㎕를 가하여 1% DMSO를 수득한다. 침지 실험에서 각 화합물의 최종 농도는 80 내지 240μM의 범위이고, 화합물(19)의 농도는 180μM이었다. 이들 조건하에 실험의 감수성은 Kd〈20 내지 60μM을 갖는 결합제를 검출할 것으로 예상된다. 결정은 4시간 15분 동안 평형시킨다.
데이타는 MarCCD 카메라가 장착된 Argonne National Labs의 진보된 광자 공급원 싱크로트론 ID 광선 IMCA에서 수집한다. 데이타는 7초 노출과 함께 100 1°진동으로 구성된다. 데이타는 5.4%의 전체 통합 R-인자와 함께 1.6Å 해상도에서 87.4% 완성되었다. 데이타를 DENZO 프로그램 패키지[참조: Otwinowski et al., Methods in Enzymology, 276(1996)]으로 처리하고, 전자 밀도 지도를 XPLOR 패키지로 계산한다.
전자 밀도 지도는 QUANTA 97 프로그램 패키지(Molecular Simulations Inc., Quanta Generating and Displaying Molecules, San Diego: Molecular Simulations Inc., 1997]를 사용하여 실리콘 그래픽 INDIGO2 워크스테이션상에서 검사한다. 활성 부위에서 밀도의 형상은 혼합물중의 하나의 화합물로부터 외관상 확인되는데, 이는 화합물(19)로서 확인되었고 도 12에 예시되어 있는 포지티브 적중을 나타낸다.
이 방법은 선도 화합물을 발견하는데 바람직하다. 선도 화합물은 전형적으로 더욱 단단한 결합제인 특성을 가질 것이다(예를 들면, 당해 방법의 감수성 범위내). 이 방법은 또한 1 내지 2주의 시간에 대해 10,000개 화합물의 비-지시된 라이브러리의 스크리닝을 가능케 한다. 이 방법은 보다 약한 결합제가 확인될 수 있는 시간에서 10개 내지 20개 화합물의 다른 스크리닝 방법과 함께 사용될 수 있다. 이들 결합제는 선도 화합물로서는 덜 사용될 것 같지만, 효능을 증가시키기 위해 선도 골격에 결합할 수 있다.
실시예 4: ErmC'의 CrystaLEADTM스크리닝
ErmC'는 23S rRNA의 펩티딜트랜스퍼라제 루프내에서 S-아데노실-L-메티오닌으로부터의 메틸 그룹을 아데닌의 N6으로 전달하는 rRNA 메틸트랜스퍼라제이다. 이러한 메틸화는 광범위하게 기재된 에리트로마이신과 같이 다수의 마크롤라이드 항생물질에 대해 항생물질 내성을 제공한다. ErmC'의 억제는 내성을 역전시킬 것으로 예상된다. 특이적 및 효능있는 ErmC' 억제제를 설계하기 위해, 보조인자 또는 S-아데노실-L-메티오닌 결합 부위를 표적화시킨다. S-아데노실-L-메티오닌은 화합물(42)로서 하기 예시되어 있다.
ErmC'의 결정 구조는 S-아데노실-S-메티오닌 부위가 아데닌 환과 메티오닌을 수용하는 2개의 제1 포켓으로 구성되어 있음을 보여준다. 또한, 거기에는 메틸화되는 rRNA 아데닌을 수용할 수 있는 제3의 포켓이 있다. 이 부위에서 SAR을 확립하기 위해, N6 및/또는 5' 하이드록실에서 치환된 아데노신 동족체의 라이브러리를 생성한다. 라이브러리내의 변화 부위는 화합물(43)으로서 하기 제시되어 있다.
ErmC 발현 및 정제
발현 벡터 pTERM31은 pERM-1의 ErmC' 유전자와 상부 kdsB 시스트론의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭에 의해 작제한다. "미부" PCR 프라이머내에 포함된 BamHI 및 HindIII 부위를 사용하여 PCR 생성물을 pET24++(Novagen, Madison, WI)내로 아클로닝시킨다. 이러한 새로운 작제물은 T7lac 프로모터의 조절하에 kdsB에 대한 해독 결합에 의해 ErmC'를 발현시킨다. pTERM31 플라스미드를 이. 콜라이 균주 BL219(DE3)/pLysS(Novagen)에 형질전환시키고, 생성된 균주를 ErmC'의 생산에 사용한다. 형질전환된 세포를, 카나마이신, 클로람페니콜 및 글루코즈가 보충된 수퍼브로쓰(BIO 101, La Jolla, CA) 10l를 함유하는 New Brunswick Scientific(Edison, NJ) Micros 발효기중에서 27.5℃에서 성장시킨다. 배양물 광학 밀도가 1.10에 도달하면, 1mM 이소프로필 β-d-티오갈락토피라노사이드(IPTG)의 첨가에 의해 ErmC' 발현을 유도한다. 세포를 유도후 400분에서 수확한다.
동결된 세포 페이스트(200 내지 250g)을 실온에서 해동시키고, 냉동 용해 완충제(50mM 트리스, 5mM 1,4-디티오트레이톨(DTT), 1mM 페닐메틸설포네이트 플루오라이드(PMSF), 2mM 에틸렌-디아민테트라아세트산(EDTA), 0.2% 트리톤 X-100(pH 7.8)) 5 내지 10 용적에 재현탁시킨다. 세포를 프렌치(French) 프레스로 용해시키고, 세포 파편을 원심분리하여 제거한다. 상청액을 20L 트리스-DTT-글리세롤-마그네슘(TDGM) 완충제(pH 7.8)(50mM 트리스, 5mM DTT, 10% 글리세롤, 10mM MgCl2)에 대해 밤새 투석한다. 이어서, 투석물을 TDGM 완충제에서 미리 평형시킨 세파로즈 고속 유동 컬럼(Pharmacia)에 적용한다. 분획의 메틸트랜스퍼라제 활성을 분석하고, ErmC'를 함유하는 것을 풀링하여 TSK SP-5PW 컬럼(TosoHaas, Montgomeryville, PA)에 적용시키고, NaCl 구배로 용출시킨다. 이어서, 정제된 단백질을 YM-10(Amicon) 막 위에서 농축시킨다.
ErmC 결정 구조
ErmC'의 결정은 현적 배양 증기 분산 방법에 의해 성장시킨다. 25mM 트리스/Cl, 100mM NaCl, 2mM DTT, 10%(v/v) 글리세롤(pH 7.5)중에 ErmC' 5 내지 8mg/ml를 함유하는 소적은 100mM 트리스, 500mM NH4(SO)4, 15% PEG 8000(pH 7.8)을 함유하는 저장기에 대해 평형시킨다. 결정이 1일 이내에 나타났고, 1주일 이내에 완전한 크기로 성장하였다. 결정은 스페이스 그룹 P43212내에 속한다. 이러한 스페이스 그룹내의 ErmC'의 구조는 스페이스 그룹 P6내의 ErmC'의 결정 구조를 사용하여 2.2Å 해상도로 분자 치환에 의해 측정한다[참조: Bussiere et al., Biochemistry Vol. 37, pp 7103-7112]. 이들 조건하에 성장한 결정의 3-D 구조는 중공 활성 부위를 나타내는데, 이는 당해 시스템을 CrystaLEADTM의 적용에 매우 적합하게 한다.
스크리닝
아데노신 라이브러리는 59개의 화합물로 구성된다. 이 라이브러리를 8 내지 9개의 형상이 다양한 화합물의 7개 혼합물로 나누고, CrystaLEADTM방법에 의해 스크리닝한다. 구체적으로, 각 화합물을 100% DMSO에 용해시켜 최종 농도 1M이 되게 한다(또는 덜 가용성인 경우 포화). 동일한 용적의 각 화합물을 혼합하여 10개의 혼합물을 조합한다. 단일 ErmC 결정을 20% PEG 8000, 0.3M 황산암모늄, 10% 글리세롤(pH 7.7) 50㎕에 넣고, 화합물의 혼합물 0.5 내지 0.8㎕를 가하여 1 내지 1.6% DMSO 및 3.3 내지 5.2μM의 최종 개개 화합물 농도를 수득한다. 결정을 3 내지 4시간 동안 평형시킨다.
데이타는 RAXISII, MAR 영상 플레이트 또는 MAR CCD 검출기를 갖는 Rigaku RTP 300RC 회전 음극 공급원상에서 수집한다. 영상 플레이트 시스템의 경우, 전형적인 데이타는 20 내지 30분 노출과 함께 15 내지 20 2°진동으로 구성되는 반면, CCD의 경우에는 15 내지 20 2.0°진동에 8 내지 15분 동안 노출시킨다. 전형적인 유용한 데이타는 7 내지 16%의 통합 R-인자와 함께 3.4 내지 3.6Å 해상도에서 80 내지 90% 완성되었다. 이는 Fo-Fc 또는 2Fo-Fc 지도에서 억제제를 적절하게 가시화시키고 확인하여야 한다. 이들 지도의 경우, 출발 모델은 2.2Å 해상도(R=22% Rfree=25%)로 정련된다. 데이타는 DENZO 프로그램 패키지로 처리하고, 전자 밀도 지도는 XPLOR 패키지로 계산한다.
전자 밀도 지도는 QUANTA 97을 사용하는 실리콘 그래픽 INDIGO2 워크스테이션상에서 조사한다. 활성 부위에서의 밀도 형상은 포지티브 적중을 나타내기 위한 혼합물중의 하나 이상의 화합물의 형상에 의해 또는 결합의 부재를 나타내는 정렬된 물 분자에 의해 가시적으로 확인된다. 포지티브 적중을 나타낸 실험의 경우, 적절한 화합물은 외관상 전자 밀도로 이동된다. 전자 밀도 지도는 또한 단백질 구조의 변화에 대해 검사되며, 관찰되는 경우, 상응하는 변형을 구조내에서 수행한다. 따라서, 지도 검사/화합물-적합화 단계 후, 화합물:단백질 복합체의 상세한 3-D 구조가 밝혀진다.
2개의 적중이 ErmC' 아데노신 동족체 스크린(화합물(44) 및 (45))에서 검출된다. 도 13 및 14는 화합물(44) 및 (45)와 ErmC'의 복합체의 결정 구조를 나타낸다.
모든 경우, 전자 밀도 형상은 결합 화합물을 확인시켜 준다. 소수성 치환은 부분적으로 노출된 소수성 표면을 따라 결합하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 이들 화합물의 결합에 관여하여 이들을 적중물로서 유인할 수 있는 바람직한 상호작용을 시사한다. 5'OH 위치에 치환체를 갖는 어떠한 적중도 검출되지 않았다. 화합물(44) 및 화합물(45)에 대한 후속 화합물은 이러한 소수성 부위에 최적화된 인단 치환체를 함유한다.
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〈213〉 Pichia pastoris
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Claims (35)
- (a) 표적 생분자 결정을 수득하는 단계,(b) 표적 생분자 결정을 하나 이상의 시험 샘플에 노출시키는 단계 및(c) X-선 결정 회절 패턴을 수득하여 리간드/수용체 복합체가 형성되었는지를 측정하는 단계를 포함하는, 표적 생분자에 대한 리간드의 확인방법.
- 제1항에 있어서, 시험 샘플에 노출시키기 전에 표적 생분자 결정의 X-선 결정 회절 패턴을 수득하고 노출 전과 노출 후의 표적 분자의 X-선 회절 패턴을 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 회절 패턴을 전자 밀도 지도로 변환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제3항에 있어서, 전자 밀도 지도를 구조로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 표적 생분자가 시험 샘플을 함유하는 용액에 표적 생분자 결정을 침지시킴으로써 시험 샘플에 노출되는 방법.
- 제1항에 있어서, 표적 생분자가 시험 샘플의 혼합물을 함유하는 용액에 표적 생분자 결정을 침지시킴으로써 시험 샘플에 노출되는 방법.
- 제1항에 있어서, 표적 생분자가 표적 생분자 결정을 시험 샘플과 함께 공-결정화시킴으로써 시험 샘플에 노출되는 방법.
- 제1항에 있어서, 표적 생분자가 표적 생분자 결정을 시험 샘플의 혼합물과 함께 공-결정화시킴으로써 시험 샘플에 노출되는 방법.
- 제6항에 있어서, 시험 샘플의 혼합물이 다양하게 형상화되는 방법.
- 제8항에 있어서, 시험 샘플의 혼합물이 다양하게 형상화되는 방법.
- 제1항에 있어서, 리간드가 생물학적 활성 잔기인 방법.
- 제1항에 있어서, 표적이 폴리펩타이드인 방법.
- 제1항에 있어서, 표적이 재-조작된 폴리펩타이드인 방법.
- 제11항에 따르는 방법에 의해 확인된 생물학적 활성 잔기.
- 제1항에 있어서, 리간드가 선도 화합물인 방법.
- (a) 표적 생분자 결정을 수득하는 단계,(b) 표적 생분자에 대한 2개 이상의 리간드를 X-선 결정학적 스크리닝으로 확인하는 단계,(c) 표적 생분자에 결합할 때의 리간드의 공간적 배향을 측정하는 단계 및(d) 리간드를 공간적 배향에 따라 함께 연결시켜 리간드를 형성하는 단계를 포함하는, 표적 생분자에 대한 리간드의 설계방법.
- 제16항에 있어서, 결합된 리간드의 공간적 배향이 다중-리간드/표적 분자 복합체를 형성하고 다중-리간드/표적 분자 복합체의 X-선 결정 구조를 형성함으로써 측정되는 방법.
- 제16항에 있어서, 하나의 리간드가 표적 분자에 결합된 후에 또다른 리간드가 표적 분자에 결합되는 방법.
- 제16항에 있어서, 리간드가 생물학적 활성 잔기인 방법.
- 제16항에 있어서, 표적이 폴리펩타이드인 방법.
- 제16항에 있어서, 표적이 재-조작된 폴리펩타이드인 방법.
- 제19항에 따르는 방법에 의해 설계된 생물학적 활성 잔기.
- 제16항에 있어서, 리간드가 선도 화합물인 방법.
- (a) 표적 생분자 결정을 수득하는 단계,(b) 표적 생분자에 대한 리간드를 X-선 결정학적 스크리닝으로 확인하는 단계 및(c) 리간드의 유도체를 제조하는 단계를 포함하는, 표적 생분자에 대한 리간드의 설계방법.
- 제24항에 있어서, 리간드가 선도 화합물인 방법.
- 제24항에 있어서, 리간드가 생물학적 활성 화합물인 방법.
- 제24항에 있어서, 표적이 폴리펩타이드인 방법.
- 제24항에 있어서, 표적이 재-조작된 폴리펩타이드인 방법.
- 제25항의 방법에 의해 확인된 선도 화합물.
- 제25항에 따르는 방법에 의해 설계된 생물학적 활성 화합물.
- 제26항에 따르는 방법에 의해 설계된 생물학적 활성 화합물.
- (a) 생분자를 분해가능한 리간드와 함께 공-결정화시키는 단계 및(b) 결정이 형성되면 리간드를 분해시키는 단계를 포함하는, 생분자로부터 접근이 용이한 활성 부위를 갖는 결정을 형성하는 방법.
- 제32항에 있어서, 생분자 활성 부위가 리간드를 분해시키는 방법.
- 제32항에 있어서, 분해제를 가하여 리간드를 분해시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제32항에 있어서, 리간드가 자발적으로 분해되는 방법.
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