BG104802A - Скрининг и конструиране на лиганди чрез рентгеноструктурен анализ - Google Patents
Скрининг и конструиране на лиганди чрез рентгеноструктурен анализ Download PDFInfo
- Publication number
- BG104802A BG104802A BG104802A BG10480200A BG104802A BG 104802 A BG104802 A BG 104802A BG 104802 A BG104802 A BG 104802A BG 10480200 A BG10480200 A BG 10480200A BG 104802 A BG104802 A BG 104802A
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- ligand
- target biomolecule
- crystal
- target
- biomolecule
- Prior art date
Links
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title claims abstract description 141
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims description 49
- 238000013461 design Methods 0.000 title abstract description 4
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 title abstract 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 166
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 128
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims abstract description 106
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 47
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 81
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 75
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 8
- 238000002288 cocrystallisation Methods 0.000 claims description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 10
- 238000002791 soaking Methods 0.000 abstract 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 46
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 46
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 45
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 14
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 14
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 12
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 12
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- IWZSHWBGHQBIML-ZGGLMWTQSA-N (3S,8S,10R,13S,14S,17S)-17-isoquinolin-7-yl-N,N,10,13-tetramethyl-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-amine Chemical compound CN(C)[C@H]1CC[C@]2(C)C3CC[C@@]4(C)[C@@H](CC[C@@H]4c4ccc5ccncc5c4)[C@@H]3CC=C2C1 IWZSHWBGHQBIML-ZGGLMWTQSA-N 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 6
- 238000012900 molecular simulation Methods 0.000 description 6
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 150000007942 carboxylates Chemical group 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 5
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 5
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 description 4
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 4
- GCMNJUJAKQGROZ-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dihydroquinolin-2-imine Chemical compound C1=CC=CC2=NC(N)=CC=C21 GCMNJUJAKQGROZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UFVLIVCXTIGACT-UHFFFAOYSA-N 2-aminoquinolin-8-ol Chemical compound C1=CC=C(O)C2=NC(N)=CC=C21 UFVLIVCXTIGACT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005162 X-ray Laue diffraction Methods 0.000 description 3
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 238000002447 crystallographic data Methods 0.000 description 3
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 3
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 3
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- ASGMFNBUXDJWJJ-JLCFBVMHSA-N (1R,3R)-3-[[3-bromo-1-[4-(5-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)phenyl]pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-6-yl]amino]-N,1-dimethylcyclopentane-1-carboxamide Chemical compound BrC1=NN(C2=NC(=NC=C21)N[C@H]1C[C@@](CC1)(C(=O)NC)C)C1=CC=C(C=C1)C=1SC(=NN=1)C ASGMFNBUXDJWJJ-JLCFBVMHSA-N 0.000 description 2
- ZYZCALPXKGUGJI-DDVDASKDSA-M (e,3r,5s)-7-[3-(4-fluorophenyl)-2-phenyl-5-propan-2-ylimidazol-4-yl]-3,5-dihydroxyhept-6-enoate Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1N1C(\C=C\[C@@H](O)C[C@@H](O)CC([O-])=O)=C(C(C)C)N=C1C1=CC=CC=C1 ZYZCALPXKGUGJI-DDVDASKDSA-M 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 229940127007 Compound 39 Drugs 0.000 description 2
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 2
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 101150023810 PHO1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 2
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 2
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 2
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 2
- SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N Quinoline Chemical compound N1=CC=CC2=CC=CC=C21 SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100271429 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ATP6 gene Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101100115751 Trypanosoma brucei brucei dnaaf11 gene Proteins 0.000 description 2
- MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N Zirconium dioxide Chemical compound O=[Zr]=O MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 2
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- -1 ethylene- Chemical class 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 101150098537 kdsB gene Proteins 0.000 description 2
- 150000002611 lead compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N triphenylphosphine Chemical compound C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- UAOUIVVJBYDFKD-XKCDOFEDSA-N (1R,9R,10S,11R,12R,15S,18S,21R)-10,11,21-trihydroxy-8,8-dimethyl-14-methylidene-4-(prop-2-enylamino)-20-oxa-5-thia-3-azahexacyclo[9.7.2.112,15.01,9.02,6.012,18]henicosa-2(6),3-dien-13-one Chemical compound C([C@@H]1[C@@H](O)[C@@]23C(C1=C)=O)C[C@H]2[C@]12C(N=C(NCC=C)S4)=C4CC(C)(C)[C@H]1[C@H](O)[C@]3(O)OC2 UAOUIVVJBYDFKD-XKCDOFEDSA-N 0.000 description 1
- IUSARDYWEPUTPN-OZBXUNDUSA-N (2r)-n-[(2s,3r)-4-[[(4s)-6-(2,2-dimethylpropyl)spiro[3,4-dihydropyrano[2,3-b]pyridine-2,1'-cyclobutane]-4-yl]amino]-3-hydroxy-1-[3-(1,3-thiazol-2-yl)phenyl]butan-2-yl]-2-methoxypropanamide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](C)OC)[C@H](O)CN[C@@H]1C2=CC(CC(C)(C)C)=CN=C2OC2(CCC2)C1)C(C=1)=CC=CC=1C1=NC=CS1 IUSARDYWEPUTPN-OZBXUNDUSA-N 0.000 description 1
- WWTBZEKOSBFBEM-SPWPXUSOSA-N (2s)-2-[[2-benzyl-3-[hydroxy-[(1r)-2-phenyl-1-(phenylmethoxycarbonylamino)ethyl]phosphoryl]propanoyl]amino]-3-(1h-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)O)C(=O)C(CP(O)(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)OCC=1C=CC=CC=1)CC1=CC=CC=C1 WWTBZEKOSBFBEM-SPWPXUSOSA-N 0.000 description 1
- STBLNCCBQMHSRC-BATDWUPUSA-N (2s)-n-[(3s,4s)-5-acetyl-7-cyano-4-methyl-1-[(2-methylnaphthalen-1-yl)methyl]-2-oxo-3,4-dihydro-1,5-benzodiazepin-3-yl]-2-(methylamino)propanamide Chemical compound O=C1[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC)[C@H](C)N(C(C)=O)C2=CC(C#N)=CC=C2N1CC1=C(C)C=CC2=CC=CC=C12 STBLNCCBQMHSRC-BATDWUPUSA-N 0.000 description 1
- UDQTXCHQKHIQMH-KYGLGHNPSA-N (3ar,5s,6s,7r,7ar)-5-(difluoromethyl)-2-(ethylamino)-5,6,7,7a-tetrahydro-3ah-pyrano[3,2-d][1,3]thiazole-6,7-diol Chemical compound S1C(NCC)=N[C@H]2[C@@H]1O[C@H](C(F)F)[C@@H](O)[C@@H]2O UDQTXCHQKHIQMH-KYGLGHNPSA-N 0.000 description 1
- OMBVEVHRIQULKW-DNQXCXABSA-M (3r,5r)-7-[3-(4-fluorophenyl)-8-oxo-7-phenyl-1-propan-2-yl-5,6-dihydro-4h-pyrrolo[2,3-c]azepin-2-yl]-3,5-dihydroxyheptanoate Chemical compound O=C1C=2N(C(C)C)C(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC([O-])=O)=C(C=3C=CC(F)=CC=3)C=2CCCN1C1=CC=CC=C1 OMBVEVHRIQULKW-DNQXCXABSA-M 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-M (R)-lactate Chemical compound C[C@@H](O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-M 0.000 description 1
- ODIGIKRIUKFKHP-UHFFFAOYSA-N (n-propan-2-yloxycarbonylanilino) acetate Chemical compound CC(C)OC(=O)N(OC(C)=O)C1=CC=CC=C1 ODIGIKRIUKFKHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNRATNLHPGXHMA-XZHTYLCXSA-N (r)-(6-ethoxyquinolin-4-yl)-[(2s,4s,5r)-5-ethyl-1-azabicyclo[2.2.2]octan-2-yl]methanol;hydrochloride Chemical group Cl.C([C@H]([C@H](C1)CC)C2)CN1[C@@H]2[C@H](O)C1=CC=NC2=CC=C(OCC)C=C21 QNRATNLHPGXHMA-XZHTYLCXSA-N 0.000 description 1
- KQZLRWGGWXJPOS-NLFPWZOASA-N 1-[(1R)-1-(2,4-dichlorophenyl)ethyl]-6-[(4S,5R)-4-[(2S)-2-(hydroxymethyl)pyrrolidin-1-yl]-5-methylcyclohexen-1-yl]pyrazolo[3,4-b]pyrazine-3-carbonitrile Chemical compound ClC1=C(C=CC(=C1)Cl)[C@@H](C)N1N=C(C=2C1=NC(=CN=2)C1=CC[C@@H]([C@@H](C1)C)N1[C@@H](CCC1)CO)C#N KQZLRWGGWXJPOS-NLFPWZOASA-N 0.000 description 1
- ZCBIFHNDZBSCEP-UHFFFAOYSA-N 1H-indol-5-amine Chemical compound NC1=CC=C2NC=CC2=C1 ZCBIFHNDZBSCEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYRKKGOKRMZEIT-UHFFFAOYSA-N 2-[6-(2-cyclopropylethoxy)-9-(2-hydroxy-2-methylpropyl)-1h-phenanthro[9,10-d]imidazol-2-yl]-5-fluorobenzene-1,3-dicarbonitrile Chemical compound C1=C2C3=CC(CC(C)(O)C)=CC=C3C=3NC(C=4C(=CC(F)=CC=4C#N)C#N)=NC=3C2=CC=C1OCCC1CC1 PYRKKGOKRMZEIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHIBSEICBQMMDB-UHFFFAOYSA-N 2-aminooxypropanoic acid Chemical compound NOC(C)C(O)=O AHIBSEICBQMMDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ICSNLGPSRYBMBD-UHFFFAOYSA-N 2-aminopyridine Chemical group NC1=CC=CC=N1 ICSNLGPSRYBMBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NEAQRZUHTPSBBM-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3,3-dimethyl-7-nitro-4h-isoquinolin-1-one Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C=C2C(=O)N(O)C(C)(C)CC2=C1 NEAQRZUHTPSBBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- BGAJNPLDJJBRHK-UHFFFAOYSA-N 3-[2-[5-(3-chloro-4-propan-2-yloxyphenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-3-methyl-6,7-dihydro-4h-pyrazolo[4,3-c]pyridin-5-yl]propanoic acid Chemical compound C1=C(Cl)C(OC(C)C)=CC=C1C1=NN=C(N2C(=C3CN(CCC(O)=O)CCC3=N2)C)S1 BGAJNPLDJJBRHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CNPURSDMOWDNOQ-UHFFFAOYSA-N 4-methoxy-7h-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-amine Chemical compound COC1=NC(N)=NC2=C1C=CN2 CNPURSDMOWDNOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 241000425361 Chlorodium Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000012545 EGF-like domains Human genes 0.000 description 1
- 108050002150 EGF-like domains Proteins 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- VSNHCAURESNICA-UHFFFAOYSA-N Hydroxyurea Chemical compound NC(=O)NO VSNHCAURESNICA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000033229 Immune-mediated cerebellar ataxia Diseases 0.000 description 1
- 101150045458 KEX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090000279 Peptidyltransferases Proteins 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- PSLUFJFHTBIXMW-WYEYVKMPSA-N [(3r,4ar,5s,6s,6as,10s,10ar,10bs)-3-ethenyl-10,10b-dihydroxy-3,4a,7,7,10a-pentamethyl-1-oxo-6-(2-pyridin-2-ylethylcarbamoyloxy)-5,6,6a,8,9,10-hexahydro-2h-benzo[f]chromen-5-yl] acetate Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(O[C@](C)(CC(=O)[C@]2(O)[C@@]2(C)[C@@H](O)CCC(C)(C)[C@@H]21)C=C)C)OC(=O)C)C(=O)NCCC1=CC=CC=N1 PSLUFJFHTBIXMW-WYEYVKMPSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- VYTBPJNGNGMRFH-UHFFFAOYSA-N acetic acid;azane Chemical compound N.N.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O VYTBPJNGNGMRFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001409 amidines Chemical class 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 229940126208 compound 22 Drugs 0.000 description 1
- 229940125877 compound 31 Drugs 0.000 description 1
- 229940125878 compound 36 Drugs 0.000 description 1
- 229940125807 compound 37 Drugs 0.000 description 1
- 229940126540 compound 41 Drugs 0.000 description 1
- 229940125936 compound 42 Drugs 0.000 description 1
- 238000000205 computational method Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000002153 concerted effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 229940125808 covalent inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 238000012866 crystallographic experiment Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 229940001501 fibrinolysin Drugs 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 125000003392 indanyl group Chemical group C1(CCC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940126701 oral medication Drugs 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- WXVUCMFEGJUVTN-UHFFFAOYSA-N phenyl methanesulfonate Chemical compound CS(=O)(=O)OC1=CC=CC=C1 WXVUCMFEGJUVTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WVVOKXIXQQJFAE-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 WVVOKXIXQQJFAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- ACVYVLVWPXVTIT-UHFFFAOYSA-M phosphinate Chemical class [O-][PH2]=O ACVYVLVWPXVTIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 230000033885 plasminogen activation Effects 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 125000005344 pyridylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C(=N1)C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000002943 quinolinyl group Chemical group N1=C(C=CC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108010073863 saruplase Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000008362 succinate buffer Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 230000005469 synchrotron radiation Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 101150096103 vanX gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 1
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C30—CRYSTAL GROWTH
- C30B—SINGLE-CRYSTAL GROWTH; UNIDIRECTIONAL SOLIDIFICATION OF EUTECTIC MATERIAL OR UNIDIRECTIONAL DEMIXING OF EUTECTOID MATERIAL; REFINING BY ZONE-MELTING OF MATERIAL; PRODUCTION OF A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; SINGLE CRYSTALS OR HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; AFTER-TREATMENT OF SINGLE CRYSTALS OR A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; APPARATUS THEREFOR
- C30B7/00—Single-crystal growth from solutions using solvents which are liquid at normal temperature, e.g. aqueous solutions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N23/00—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00
- G01N23/20—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00 by using diffraction of the radiation by the materials, e.g. for investigating crystal structure; by using scattering of the radiation by the materials, e.g. for investigating non-crystalline materials; by using reflection of the radiation by the materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/972—Plasminogen activators
- G01N2333/9723—Urokinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Metallurgy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
За скрининг на съединения, които не са известни като лиганди на биомолекулна мишена с цел установяване способността им да се свързват с нея, се използва рентгеноструктурна кристалография. Изобретението се отнася до метод, който включва получаване накристали на биомолекулната мишена, подлагане на този кристал на едно или повече изпитвания и получаване на рентгеноструктурна кристализационна дифракционна проба за определяне на това дали е формиранкомплексът лиганд/рецептор.
Description
Скрининг и конструиране на лиганд чрез рентгеноструктурен анализ
Техническа област на изобретението
Рентгеноструктурният анализ е полезен за идентифициране на лиганди, които свързват молекули на рецептор-мишена, и за конструиране на лиганди с подобрена биологична активност за рецептора-мишена.
Предшестващо ниво на техниката
Рентгеноструктурният анализ е солиден, добре изучен метод, който дава това, което може да бъде най-добре описано като триизмерна картина за това как изглежда молекулата в кристала. Учените са използвали рентгеноструктурния анализ за да изяснят кристалните структури за много биологически важни молекули. Много класове биомолекули могат да бъдат изучавани чрез рентгеноструктурния анализ включително, но не ограничаващо се от протеини, ДНК (дезоксирибонуклеинова киселина), РНК (рибонуклеинова киселина) и вируси. Учени дори са докладвали за структури на биомолекулен кристал, който носи лиганди в неговите рецептори (лиганд-рецепторен комплекс).
При наличие на рентгенограма на биомолекулата-мишена или на лигандрецепторен комлекс учените могат да търсят сгъвки (джобове) или рецептори, където може да се извършва биологическа деятелност. Учените могат също така да конструират експериментално и чрез изчисляване високоафинитетни лиганди (или лекарствени субстанции), предназначени за рецептори. Изчислителните методи са били използвани алтернативно за скрининг при свързването на малки молекули. Тези предишни опити са били обаче с ограничен успех. Различни
WO 99/45379
PCT/US99/04967 • · ·.·2 • · · ···· ··«· • · ···· · ·· · • · ·· ·····« ·· · • · · · ····· ····· ·· ·· ·· ·· проблеми затрудняват конструирането на лиганди посредством изчислителни
... · · методи. Изчислителните методи се основават по-скоро на пресмятания отколкото на точни определяния на свързващите енергии и се осланят на елементарни изчисления, докато в същото време съществуващите в биомолекулата взаимодействия имат комплексен характер. Освен това, изчислителните методи изискват експериментално потвърждение, при което моделите се оказват често неверни и не действат като реална мишена.
При това конструирането на експериментален високо-афинитетен лиганден конструкт, основаващ се на дифрактограма на лиганд-рецепторния комплекс, е било ограничено до биомолекули, които са вече известни лиганди. В заключение, едва неотдавна учени докладваха рентгено-кристалографското изследване за взаимодействия между органични разтворители и биомолекулярни мишени (Allen et al., J, Phys, Chem.. v. 100, pp.2605-2611 (1996)). Все пак тези научни изследвания са ограничени повече от картографирането на координационните позиции на разтворителя отколкото от коордиционните позиции на лиганда. Би било желателно да се идентифицират непосредствено потенциални лиганди и да се получи подробна информация за това как лигандът свързва и променя биомолекулата-мишена. В допълнение би било желателно използването на методи за идентифициране и/или конструиране на лиганди, които притежават биологическа и/или фармацевтична активност.
Техническа същност на изобретението
Рентгеноструктурният анализ може да бъде използван за скрининг и идентифициране на съединения, които не са известни лиганди на биомолекуламишена относно тяхните способности да се свързват координационно с мишената. Методът (тук и по-нататък озаглавен CrystalLEAD™) се състои в
| WO 99/45379 | PCT/US99/04967 |
| ·· »···3 ·· ·· ·· ·· ·· · ···· · ♦ · · • · ···· · · · · • · · · · ··· · · * · · • · · · ····· ···· · ·· ·· ·· ·· |
получаване на кристал на биомолекула-мишена; подлагане мишената на въздействие в една или повече изпитателни проби, които са потенциални лиганди за мишената, и определяне дали е образуван лиганд/биомолекулен комплекс. Мишената е подлагана на въздействие чрез разнообразни методи включително, но не ограничаващо се от всмукване (поглъщане) на кристала в разтвор на един или повече потенциални лиганди или съвместно кристализиране на биомолекула в присъствието на един или повече потенциални лиганди.
В друго примерно изпълнение структурна информация от установените лиганд/рецепторни комплекси е използвана за конструиране на нови лиганди, които се свързват по-тясно, по-специфично, имат по-добра биологическа активност или са с по-добре съхранен профил, отколкото известните лиганди.
В предпочитано примерно изпълнение подреждания от разнообразни поформа съединения (наричани по-нататък библиотеки) са използвани, за да позволят непосредствено идентифициране на лиганд-рецепторния комплекс, дори когато лигандът е подложен на въздействие като част от смес. Така се избягва необходимостта от времеемко разсукване на сместа за постигане на координационно свързване на лиганд от сместа (процес, наричан по-нататък попадение). В разглеждания случай са осъществени едновременно три важни етапа. Изчислената функция на електронната плътност разкрива непосредствено свързващото събитие, идентифицира се свързаното съединение и се получава детайлна триизмерна структура на лиганд-рецепторния комплекс. В едно примерно изпълнение, след като вече е установено свързване на лиганд (попадение), би могло чрез традиционни скрининг-методи да се получи скрининг на много аналози или производни на този лиганд за по-тясно свързване или подобра биологическа активност. Друго примерно изпълнение използва попадението и информацията относно структурата на мишената за разработване на аналози или производни за по-тясно свързване или по-добра биологическа активност. В още по-друго примерно изпълнение лиганд-рецепторният комплекс е
WO 99/45379 PCT/US99/04967 ·· ···· 4 ·· ···· ·· ·· · ···· · · ·· • · ···· < · ·· • · · · · ··· · · · ·· • · · · ····· · ·· ···· ·· подложен на допълнителни итерации от потенциални лиганди, така че при две или повече попадения лигандите могат да бъдат свързани заедно, за да се получи поефикано действащ лиганд.
Описание на фигурите фигура 1 пояснява нагледно конструиране на структура на лекарствена субстанция, базирана на нуклеотидната молекула на ДНК или на РНК, за която е намерено начално водещо съединение, използвано след това като матрица да носи допълнителни фрагменти, които се вместват в подпозициите, заобикалящи по-важната позиция.
Фигура 2 пояснява нагледно фрагмент от подхода на свързване на биомолекула, притежаваща два или повече съседни първични сгъвки (джоба).
Фигура 3 излага схематично метода CrystalLEAD™, при който кристалът се всмуква в разтвор на разнобразни потенциални лиганди (1Г11О) и полученият набор данни от дифрактограми е преобразуван в карта на електронната плътност, която е проучена за координационно свързване на дадено съединение.
фигура 4 пояснява нагледно характерна смес от съединения в дву- и триизмерна проекция. Триизмерните фигури са теоретични 2Fo-Fc карти на електронни плътности, които представят формата на молекулите (б. прев. Fo-Fc представлява разликата между наблюдаваните и изчислените структурни фактори).
WO 99/45379
PCT/US99/04967 ·· ···· 5 ·· ·· ·· ·· · ···· ···· • · ···· ···· • · ·· ······ ·· · • · ·· ····· ···· · ·· ·· ·· ·· фигура 5 представя първична секвенция на ензима урокиназа (б. прев.:
ензим в кръвта и урината на бозайник) у човека.
фигура 6 пояснява нагледно как бе установено и идентифицирано по форма попадение (свързване на лиганд) след всмукване на урокиназа в разтвор, съдържащ смес от потенциални лиганди. фигура 6А е началната Fo-Fc карта, фигура 6В показва как съединението се свързва в активната позиция на урокиназа. фигура 6С показва нагледно активната позиция без свързан в нея лиганд, когато съединение от сместа не е свързано с мишената.
фигура 7 пояснява нагледно попадение за урокиназа, всмукната в разтвор, съдържащ смес от потенциални лиганди. фигура 7А представя началното Fo-Fc изображение, фигура 7В показва как съединението се свързва в активната позиция на урокиназа.
I фигура 8 пояснява нагледно попадение за урокиназа, всмукната в разтвор, съдържащ смес от потенциални лиганди. фигура 8А представя началното Fo-Fc изображение, фигура 8В показва как съединението се свързва в активната позиция на урокиназа.
ф фигура 9 пояснява нагледно две допълнителни попадения за урокиназа, всмукната в разтвор, съдържащ смес от потенциални лиганди. фигура 9А представя Fo-Fc изображението за здраво свързан лиганд в сместа, фигура 9В представя Fo-Fc изображението за по-слабо свързан лиганд в сместа. По-слабо; свързаният лиганд бе установен едва след отстраняване на здравосвързания лиганд от сместа.
WO 99/45379
• · · · · ···· · ·· ·· фигура 10 пояснява нагледно сравняеми кристални структури между водещо съединение, установено посредством метода CrystalLEAD™ и оптимизирано съединение с повишена ефективност.
фигура 11 пояснява нагледно попадения, които бяха идентифицирани за
VanX.
фигура 12 пояснява нагледно попадение за урокиназа.
фигура 13 пояснява нагледно кристална структура на съединение 44 с
ErmC.
фигура 14 пояснява нагледно кристална структура на съединение 45 с
ErmC'.
Описание на изобретението
Методът CrystalLEAD™ обезпечава ефикасен скрининг за идентифициране на съединения, които ще се свързват координационно с биомолекула-мишена. Такива съединения могат да служат като примерни или матрици за конструиране на лиганд и или лекарствени субстанции, които имат подобрена биологическа активност за мишената. Тук трябва да се отбележи, че по-здраво свързващи се лиганди не обезпечават задължително по-добра биологическа активност или не водят до получаването на по-добри лекарствени препарати, въпреки че по правило това е така. Възможно е по-слабосвързащ се лиганд да обезпечава подобра биологическа активност, което, освен на здрава координационна връзка, се дължи и на други фактори (селективност, биоусвояемост).
WO 99/45379 PCT/US99/04967 ·· ···· 7 ·· ·· ·· ·· «· · ···· · ·· · • · · · · · ···· • · · · · ··· · · ·· · • · ·· ····· ···· · ·· ·· ·· ··
Рентгеноструктурният анализ е бил широко използван за проучване на рецептор-лигандни комплекси за конструиране на структурно-базиран лекарствен препарат (базиран на нуклеотидната молекула на ДНК или на РНК). За да се изследват такива комплекси е обичайно, известни лиганди да бъдат всмуквани в кристала на молекулата-мишена, след което се извършва рентгеноструктурен анализ на образувания комплекс. Понякога е необходимо лигандите да бъдат кристализирани съвместно с молекулата-мишена за да се получи подходящия кристал.
Рентгеноструктурният анализ не е бил осъществен до настоящия момент за скрининг на потенциални лиганди, въпреки че този метод обезпечава подробна структурна информация. Възможни предубеждения срещу използването на рентгеноструктурния анализ за скрининг на съединения включват мнението, че методът е твърде усложнен и времеемък, подходящи кристали се получават трудно, усвоимите кристали биха могли да не допускат всмукването на повече от едно съединение (много по-малко смеси от по 10 или повече съединения), твърде много биомолекули биха били необходими, твърде много време би се изразходвало за рутинно подготвяне на кристали и за изследавенето им, и
постоянната смяна на кристали в рентгеновия гониометър би било твърде изморително.
С достъпната понастоящем технология се преодоляват обаче много от тези възприети ограничения. Например за даден период от време молекулярните мишени бяха получавани само от природни източници и понякога бяха неподходящи за кристализиране поради естествено разграждане или глюколизиране. В допълнение природната концентрация бе твърде често ниска, за да се получи такова количество високо пречистен протеин, необходимо за кристализацията. С развитието на молекулярната биология могат да бъдат експресирани и
WO 99/45379 PCT/US99/04967 ·· »··8 ·· ···· ··
9 V ···· · · «· • · · · · · « · ·· • · · · · ··« « » · ·« • · · · · · · ·· ·»»· · >· ·· »· φφ пречистени за кристализация големи количества протеин. Когато е необходимо, протеинът може дори да бъде генно преустроен за да осигурят различни или подобри кристални форми.
При това станаха лесно достъпни ярки светлинни източници (синхротронно излъчване) и по-чувствителни детектори, така че времето, необходимо за събиране на данните, бе намалено драстично от дни до часове и дори до минути. Освен това съществуващи по това време технологии, които са рутинни в по-малка степен, но обещават да станат рутинни в по-ново време, позволяват пълен набор от данни в порядъка на секунди или дори на части от секундата (например при дифракция на Laue, J. Hajdu et al., Nature, v. 329, pp. 178-181 (1987)). По-мощни компютри и все по-автоматизирани софтуерни продукти понижават значително изискваното време за събиране и анализиране на данните. Най-сетне авторите на изобретението са установили, че е възможно да се всмукнат или да кристализират съвместно смеси от съединения за да се получи скрининг за възможни лиганди. По този начин, както е описано по-долу, рентгеноструктурният анализ се оказва понастоящем приложим и практичен скрининг-метод.
При CrystalLEAD™ метода лиганди за молекула-мишена, имаща кристалин-
на форма, са идентифицирани чрез подлагане на библиотека от малки молекули на въздействие, или поотделно или в смеси, в мишената (например протеин, нуклеинова киселина и т.нат.) В този случай се получават рентгеноструктурни данни за сравняване на картата на електронната плътност за предполагаемия комплекс лиганд-мишена с картата на електронната плътност за биомолекулатамишена. Картата на електронната плътност едновременно обезпечава непосредствено доказателство за координационна връзка на лиганда (попадение), идентифициране на свързания лиганд и подробна триизмерна структура на комплекса лиганд-мишена. Свързването може да бъде контролирано също така и по измененията на индивидуалните рефлекси в дифрактограмата, за които се
WO 99/45379 PCT/US99/04967 «· ·*··9 ·· ·· ·· ·· * · · *··· ·»«· • · · · · · ···· • · · · * ··· · » ·· · ·· ······* ··«· · ·· ·· ·· ·· знае, че са чувствителни към връзката на лиганда с молекулата-мишена в активната й позиция. Това би могло да служи като предварителен скрининг, но не би следвало да бъде избрано като основен метод, защото дава по-малко инфор мация за структурните детайли.
Чрез наблюдаване на измененията в нивото на електронната плътност на лиганда или интензитета на определени рефлекси в дифрактограмата като функция на концентрацията на лиганда, добавен или към кристала, или при съвместната му кристализация с биомолекулата-мишена, могат да се определят
също и афинитетите към свързване на лиганди за биомолекули. Афинитетите на свръзване могат също така да бъдат получени чрез експерименти на конкурира нето. В този случай, ново съединение (или нови съединения) е всмуквано в или кристализирано съвместно с един лиганд с известен афинитет на свръзване от серия разнообразни по форма лиганди. Ако известният лиганд се появява в картата на електронната плътност, неизвестните лиганди са с по-слаб афинитет към свързване. Ако обаче е установено, че едно от новите съединения е конкури рало успешно останалите за да се свърже в активната позиция на мишената, то то би било с най-висок афинитет на свързване. Чрез вариране на концентрацията
или на природата на известния лиганд може да бъде пресметната константата на свързване за попадението при използването на CrystalLEAD™ метода.
Броят на съединенията, които могат да бъдат подложени на скрининг, се базира на изискваната граница на детектиране, разтворимостта на съединенията и количеството на органичния съвместен разтворител, който кристалите ще допуснат. Точният им брой зависи от всеки индивидуален кристал. Например за типичен кристал, който допуска 1%-ен органичен съвместен разтворител, границата на чувствителността би била Kd<1.5 милимола, за да се получи скрининг едновременно на 10 съединения. За 20 съединения границата на
WO 99/45379
PCT/US99/04967 «· ·Η·ΐη ···· • · φ! U ♦ · ·« • · · · · · • · 9 9 9 999 9
9 9 99
9999 9 ···· ··99
9 99
9 99
9 99
9 99
9999 чувствителността би била КскО.бЗ милимола. За кристали, които допускат обаче органични съвместни разтворители с висок процент (например 40%), може да се получи скрининг на до 50 съединения в граница на детектиране Kd<1.5 милимола.
В най-общо приложение на CrystalLEAD™ метода попадението или водещо съединение е използвано за определяне какви съединения би следвало да бъдат изпитани за биологическа активност в структурно-базиран конструкт на лекарствен препарат. В този случай производни и аналози се получават чрез традиционната медицинска химия, за да се установи най-добрия лиганд или лекарствен препарат.
Алтернативно, структурната информация, получена при скрининг-процеса, може да бъде пряко използвана за предлагане на аналози или производни на лиганда, осъществил попадението. Този подход е пояснен нагледно, когато активната позиция в мишената е съставена от един първостепенен джоб, заобиколен от множество подпозиции и малки джобове (Фигура 1). Подробна структурна информация за това, как съединение се свързва конституционно с рецептора, е получена едновременно с детектиране на попадение за това съеди-
нение. Такава информация е полезна за обикновените, придобили умения в областа изпълнители за конструиране на по-ефикасни лиганди (Р. Colman, Curr.
Opin, in Struc, Biology, v.4, pp. 868-874 (1994); J. Greer et al., J, Med, Chem.. v. 37, pp.
1035-1054 (1994); C. Verlinde et al., Structure, v.15, pp. 577-587 (1994)). В частност попадението идентифицира позиции за синтез на аналог, който би позволил достъп до околните подпозиции и малки джобове. Освен това в случаите, когато има съществуваща структурно-функционална зависимост, активност, разширя ваща пътищата на заместване, може да бъде непосредствено прехвърлена към нова водеща матрица на триизмерно структурно ниво.
| WO 99/45379 | PCT/US99/04967 |
| • · • •••Il ·· ·· ·· ·· • · · · ·· · · ·· · • · ···· ···· • · ·· ······ ·· · • · ·· ····· ····· ·· ·· ·· ·· |
Друго нагредно пояснение (Фигура 2) се прилага обикновено към мишена с два или повече отделни джоба, които ще предоставят убежище на фрагменти. В този случай скринингът на кристалната мишена е за лиганди, които заемат или последователно или едновременно всяка една от позициите в мишената. Тъй като свързващото събитие е проследено чрез визуализиране на съвместно кристали зирали структури, то позицията на лигандното свръзване се определя непосредствено и няма нужда от потвърждаване чрез експерименти на конкуриране за това, че лигандите заемат действително различни позиции в протеина. Самостоятелен скрининг дава възможност свързвани към отделни джобове
лиганди да се припокрият частично в техните свързващи местоположения. Скринингът за втората позиция в присъствието на първата би разкрило наличието на съгласувано свързване във втора позиция. Веднаж установени потенциални свързващи се лиганди и зависимостта на структурата от тяхната активност, могат да бъдат конструирани свръзки между всяка една от позициите като се използва информацията за структурните детайли и подходът на фрагментното прицепване както е описан предварително, за да се получат нови, много по-ефикасни лиганди (S.B. Shuker et al., Science, ν. 274, pp. 1531-1534 (1996); C. Verlinde et al., Structure, v.
15, pp. 577-587 (1994)).
В трето приложение, подходът на обединяваща матрица (който не е показан тук), активната позиция на мишената е съставена от две или повече подпозиции. Извършен е скрининг на кристалинния протеин за търсене на лиганд(и), който(които) се свързва(т) чрез тези подпозиции, и за определяне на относителната ориентация на свързващите се лиганди, наблюдавана при многосъставни експерименти. Тези лиганди би следвало да се свържат заемайки една или повече подпозиции и чрез покриване на структурите на многосъставните попадения може да бъде конструирана сърцевина, което би улеснило достъпа до многосъставните подпозиции. Тази сърцевина би послужила тогава като ново,
WO 99/45379
PCT/US99/04967 ·· ···· jO «· ···· ·· • ♦ ’ · · ♦ · ··· • · ···· · · ·· • · ·· ······ · ·· • · · · · · · ·· ···· ·· · ··· ·· оригинално и по-ефективно водещо съединение, което би послужило също и като водеща матрица в цикъла за конструиране на лекарствен препарат.
Подходът на верижно свързаните фрагменти при CrystalLEAD™ метода осъществява експериментално структурно-базирания подход на верижно свързаните фрагменти, докладван само на ниво изчисление от Verlinde et al., в J. Comput. Aided ΜώΙ Des., v.6, pp. 131-147 (1992). Verlinde et al. предложиха лигандни фрагменти, основаващи се на математически изчисления. Предложените фрагменти бяха след това изпитани по отношение на свързващата им активност. Ако
фрагментите действително се свързваха, техните триизмерни структури бяха определяни чрез рентгеноструктурен анализ и бе конструиран линкер (свързан конструкт). Противоположно на това чрез метода CrystalLEAD™ свързващото събитие се разкрива съгласувано и се осигурява експериментално определена триизмерна структура на лиганд-протеиновия комплекс. Изобретението обезпе чава също така процес за определяне на константата на асоцииране между молекула-мишена и нейния лиганд. Изобретението не изисква специално обозначаване на мишената. Следователно молекулата-мишена може да обхваща протеини, полепептиди, нуклеинови киселини, нуклеопротеини или каквато и да е
друга подходяща молекула-мишена, получена от природни източници или чрез рекомбинационни методи, от която и да е подходяща система на първичния кристал, разработена и експериментирана от придобилите умения в областа обикновени изпълнители.
Полученият чрез рентгеноструктурен анализ скрининг има няколко преимущества. Едно от тях е, че свързващото събитие е проследявано непросредствено, така че вероятността от фалшиви позитиви е равна практически на нула. Данните от рентгеноструктурния анализ дават триизмерена моментална снимка (с много
| WO 99/45379 | PCT/US99/04967 |
| «« «··« 4Q ·♦ ·· ·* ·· • · · 1 Ов · · · · · · · • · · · · · · · · · • · ·· ····«· ·· · • · · · · · · · · • · ·· · ·· · · ·· ·· |
къса задръжка) на електронната плътност за лиганд-рецепторния комплекс показвайки кое съединение се свързва и как то е свързано.
Методът е уникално чувствителен към структурни промени както в мишената, така и в лиганда. Наблюдаването на структурни промени е критично при конструиране на матрици, които обединяват информация от различни структури на комплекса лиганд-мишена. Един такъв пример се среща, когато протеин променя структурата си, за да побере един лиганд, но структурната промена съгласувано блокира свързването на втори лиганд. По същия начин разкриването
на структурни изменения е важно също така и защото, ако първичните матрици свързват различно, възможно е те да не могат да бъдат обединени в по-голяма матрица.
Тъй като свързващото събитие се проследява непосредствено, CrystalLEAD™ методът не изисква специално обозначени образци, проби или молекули-мишени, което би било не непосредствено чувствително към присъединяването на лиганд. Стига да е възможно да се получи кристална структура на мишената, CrystalLEAD™ методът може да се използва за скрининг при
търсенето на свързващи лиганди.
Ако смеси от съединения са подходящо конструирани за да бъдат различими по форма, изобретението облекчава необходимостта от разплитане на библиотеки, които са всмуквани като смес, защото свързващото събитие е разкривано непосредствено чрез, изследване на формата на електронната плътност в позицията на свързването. По този начин формата на електронната плътност идентифицира и двете - свързващото събитие и непосредствено природата на съединението. Алтернативно, сместа може да бъде конструирана да съдържа съединения с аномално разсейващи атоми (например Вг и S), което
WO 99/45379
PCT/US99/04967
може да се установи чрез методиките на аномално разсейване. В допълнение, тъй като CrystalLEAD™ методът непосредствено проследява свързването, той е особено добре изучен при изследване на мишени, за които не съществуват неизвестни лиганди.
Тъй като функцията на електронната плътност, пресметната чрез CrystalLEAD™ метода, показва заемано от кристала действителното пространство, то фокусът може да бъде насочен непосредствено върху представляваща интерес област. По този начин свързването може да бъде разкрито привилеги-
ровано в представляващата интерес координационна позиция, въпреки че методът не е ограничен по отношение на активната позиция. Свързване в други координационни позиции, което усложнява анализа на свързване за по-голяма част от пробите, може да бъде елиминирано изцяло от разглеждането.
CrystalLEAD™ методът обезпечава също и съгласувано проследяване на свързване в различни местоположения. Това е случаят за мишена с повече от един джоб, на която се извършва скрининг за търсене на втора позиция на свързващ се в нея лиганд, при което не се изисква скрининг в присъствие на първия лиганд. Все пак, скрининг за втора позиция може да бъде завършен в присъствието на първия лиганд с цел да се открият съвместно действащи лиганди.
CrystalLEAD™ методът е приложим за произволна молекула-мишена, за която може да бъде получена кристална структура. Съгласно текущата литература, това включва всяка една разтворима макромолекула с молекулно тегло между от около 5000 и 200000. Тази област се разширява обаче почти всеки ден в отговор на технологичния напредък. Методът е също чувствителен към широка област на дисоциационни константи на свързване (от <пикомола до мола). Използвайки по-чувствителни CCD фотоснимачни детектори, данните
WO 99/45379
PCT/US99/04967 ·· ···· I ♦ · ···· ·· • · · ········ • · · · · ····· • · · · · ··· · · ·· · • · · · · · · · · ····· ·· ···· ·· могат да бъдат събирани за около < 4 часа до около 4 часа с ротиращ аноден източник. Това позволява да се осъществи скрининг на хиляди компоненти дневно с помощта на един детектор. Използвайки синхротронни източници, броят на скрининг-съединенията с един детектор нараства до десетки хиляди, а чрез методите за събиране на данни чрез дифракция на Laue и изпитващи смеси, CrystalLEAD™ методът позволява данните да бъдат събирани за секунда или помалко, давайки възможността да бъдат изследвани по този начин хиляди съединения дневно за една линия на лъча. Следователно използването на многосъставни детектори или на единична синхротронна линия на лъча е наистина благоприятно за извършване на високопроизводителен скрининг.
Фигура 3 очертава изобретението. Кристали на молекулата-мишена са подложени на въздействие на една или повече компоненти чрез всмукване на кристала или чрез съвместна кристализация на мишената в присъствието на едно или повече съединения. След това са събрани ренгеноструктурни данни, които са обработени и преобразувани в карти на електронната плътност, които са изследвани за доказване на свързващ се лиганд. Един начин да се разкрие свързващ се лиганд е като се сравни структурата на първоначалния кристал със структурата на подложения на въздействие кристал.
©
Нови мишени могат да бъдат кристализирани при публикуваните условия или чрез други методи, укоренили се добре от специалистите в областта. Посъщия начин структури на мишени могат да бъдат достъпни от базисни данни, такива като данните на протеиновата група, или биха могли да бъдат определени чрез добре установена методология, възходът на молекулярната биология и протеинното инженерство ускорява процеса на кристализация на мишена, докато прогресът при събирането на данни съдейства за бързото определяне на структурата на мишени с неизвестна отнапред структура.
WO 99/45379
PCT/US99/04967 »· »***1G »· ···* »· ·· · ··«· · · ·· • · ···· · · ·· • · · · · ··· · · · *· • · · · · · · ♦· •··· · ·· ···· ··
Кристали, които са подложени чрез всмукването им на въздействие на потенциални лиганди, изискват незаета достъпна позиция в структурата на тяхната биомолекула. Кристали с такава позиция могат да бъдат получени чрез разнообразни методи, включително но не ограничено от: кристализация в отсъствие на лиганд; кристализация в присъствие на лиганд, свързан в дистална (отдалечена от центъра) позиция; или кристализация в присъствие на нековалентен (не притежаващ сдвоени електрони) лиганд, който е лесно разреждан или обменян с мишената, щом като веднаж биомолеулата е кристализирала. Чрез нововъведения метод изобретателите са получили кристали от биомолекула чрез кристализиране на биомолекулата в присъствие на разграждируем лиганд в активната позиция и последвано от разграждане на лиганда след образуване на кристала. Алтернативно, възможен е скрининг при израстване кристали в присъствие на смес от съединения. На кристалите се дава възможност да достигнат равновесие в присъствието на сместа в точка, където лигандите се свързват с мишената във функция от техните концентрация и афинитет на свързване.
Чувствителността при метода на всмукване може да бъде апроксимирана с прости зависимости на равновесията, защото концентрацията на протеин в кристала може да бъде пресметната, а концентрацията на лиганда е известно количество. Например концентрацията от 25000 MW (единици молекулно тегло) протеин (урокиназа) в кристал е пресметната както следва: в една ромбична единична клетка (всички ъгли в нея са 90°), която има обем от (55 χ 53 χ 82) A3; има 4 молекули и като се използва числото на Авогадро се получава концентрация 28 милимола. Следователно, смес от съединения, имаща концентрация 6 милимола за всеки лиганд ще доведе до изчислена гранична чувствителност Kd< 1.5 милимола (допускайки граница на детектиране около 80% запълненост на местата в кристала).
| WO 99/45379 | PCT/US99/04967 |
| ·· ···· 17 ♦· ·· ·· ·· ·· ········· • · ···· ···· • · ·· ······ · · · • · · · ····· ···· · ·· ·· ·· ·· |
Всмукването на смеси от съединения повдига също така въпроса за множествена запълненост (повече от един свързан лиганд в представляващата интерес позиция). За случаи на множествена запълненост, когато лигандите са свързани в различни джобове (виж фигура 2), CrystalLEAD™ методът позволява лесно разделяне, тъй като свързването в отделни позиции може да бъде разграничено индивидуално чрез картите на електронната плътност. При очертание на картината, където различни лиганди се съревновават за да заемат една и съща позиция, може да се използва прост модел на конкурентно забавяне, за да се изчислят условията за такова свързване. Предполага се от емпирично наблюде-
ние, че посредством рентгеноструктурен анализ могат да се разграничат ситуации, при които запълнеността на единия инхибитор е 80%, а на другия - 20%. Следователно отношение на афинитетите на свързване, което е по-голямо от 4, би довело до видима запълненост само на лиганда с по-високия афинитет на свръзване. При малко вероятния случай, когато отношението между константите за афинитета на свързване на две съединения в сместа е по-малко от 4, резултантната електронна плътност би представлявала тегловно усреднената стойност от двете отделни електронни плътности и би могла да се окаже трудна за идентифициране. Съобразно с това би било необходимо да се проведят докрай по-нататъшни всмукващи експерименти за да се размотае сместа (напр., гледайки на всяко съединение индивидуално в отделните кристали), само когато отношението между афинитетите на свързване е по-малко от 4. Това от друга страна би било смислено и ефикасно, защото то вече определя, че в сместа присъстват най-малко две попадения на свързващи лиганди.
Съединенията за скрининг са оформени в библиотеки. Библиотеките, съобразно целите на настоящето обсъждане, са смеси от много на брой съединения (100-10000+), които могат да бъдат общи или да са структурно насочени. Общата библиотека е произволна, т.е. съставящите я съединения са напълно
| WO 99/45379 | PCT/US99/04967 |
| ·· ···· 18 ·· ·· ·· ·· ·· · · · · · · · · · • · · · · · · · · · • · · · ········ · • · ·· ·· ··· ···· · ·· ·· ·· ·· | |
| различни по | размери, форма и функционалност. Структурно насочената |
библиотека е прицелена към специфична функционална смес или подпозиция в активната позиция на молекулата-мишена (напр., библиотека, в която всички съединения съдържат карбоксилатна функционалност, да бъде насочена в посока на положителен товар в активната позиция на мишената.)
В предпочитано примерно изпълнение всеки тип библиотека е разделен на
по-малки групи от разграничени по форма смеси. Следователно смес се дефинира като подгрупа на библиотеката, която може да бъде всмукана или включена в израстването на кристал. Сместа е определена да бъде разграничима по форма чрез визуално проучване на двуизмерни химически структури или чрез използване на изчислителни програми. Разграничимостта на сместа по форма позволява свързан лиганд да бъде идентифициран непосредствено от резултантната карта на електронната плътност (виж Фигура 4). Това обезсмисля необходимостта чрез последващи експерименти да се определя кое съединение от сместа е попадение (свързано с мишената).
Ако изпитваните съединения са водноразтворими, то типични буфери и утаечни разтвори, използвани при кристализацията, могат да бъдат употребени за да се осъществи солюбилизация (колоидно разтваряне) на смесите (при което проникват в макромолекулата) и те да се всмукнат в кристала. По-слабо водноразтворими съединения са разтворени поотделно до крайна концентрация 2 мола в подходящ органически разтворител. В едно примерно изпълнение те са разтворени в 100% ДМСО (диметилсулфоксид) и съхранени при 4°С, и смесени чрез смесване на съхранените ДМСО-разтвори преди да бъдат подложени на въздействие в кристала. Тези смеси биха обслужвали повечето кристални системи, за които условията на кристален растеж не включват органични реагенти. Съединенията биха били всмуквани съобразно вида им при крайна
| WO 99/45379 | PCT/US99/04967 |
| ·· ···· 1Q ·· ·· ·· ·· • · · ' '-'е ·· · · · · · • · ···· ···· • · ·· ······ · · · • · · · ····· ····· ·· ·· ·· ·· | |
| концентрация | на ДМСО от 1-10% и биха получили възможност да достигнат |
равновесие с кристалинния протеин за предопределен интервал от време (4-24 часа). Съгласно този сценарий, всеки кристал е подложен на въздействието на многобройни съединения от всмукваща се в него смес. Някои условия на кристален растеж могат да включват органичен разтворител с висока концентрация (40-50%) и такива условия са типични за производните на алкохола. В този случай библиотеките на съединенията могат да бъдат разтворени в органичния разтворител на кристализацията, което би направило възможна крайна концентрация на съвместния разтворител от 40-50% за експеримента на всмукване. При това положение би следвало да нарастне броят на съединенията, участващи във всмукващата се смес.
След смукване всеки кристал е подложен на въздействие в криопротектант (свръхнискотемпературен предохранител), такъв като 5-20% глицерол, във всмукващата се смес, монтиран е в найлонова примка и е поставен в рентгеновия отсек в атмосфера на студен азотен поток (160 К). Кристалните изследвания могат да бъдат осъществени също така и при стайна температура или при други подходящи условия, както такива необходими за устойчивостта на кристалите.
Този етап от процеса може да се ускори като се автоматизира монтирането на кристала и се смени оборудването.
Събирани и обработвани са рентгеноструктурни данни, при което на всеки | рефлекс (петно) в дифрактограмите е приписан индекс (h, k, I) и интензитетът е
I измерен като критерий в полето. Рентгенови източници могат да бъдат лабораторни рентгенови генератори или синхротронни източници с висока яркост, което позволява много голяма бързина при събирането на дифракционните данни. ПоI конкретно, събирането на лабораторни данни може да заеме от 30 минути до няколко часа за кристал, като това време може да бъде намалено когато се
WO 99/45379 PCT/US99/04967 .··.···: го*···**· ·····**:
• · · · · · · · · • · · · · ·♦· · ♦ · · ♦ • · · · ····· ····· ·· · · · · · · използват синхротронни източници. Събирането на данни от един кристал може да бъде намалено и до части от секундата като се използват събирателни схеми при дифузия на Laue.
Събраните дифракционните данни са превърнати в карти на електроната плътност чрез методи, известни на редовите изпълнители в областта. Картите на електронната плътност са триизмерните изображения на лигандите и/или на биомолекулите-мишени.
За Fo-Fc карти изчислените стойности на амплитудите за структурния фактор (IFc|), които са получени от известна кристална структура без свързан към нея лиганд, са извадени от наблюдаваните стойности на амплитудите (I Fo|). Така този тип карти представлява непосредствено изваждане на данните, възникващи от природна протеинова структура, от данни, възникващи от кристали, всмукани в присъствие на смес от библиотека съединения. Резултатът е получаване на карта на електронната плътност, която има положителни и отрицателни пикове (максимуми). Съответните на CrystalLEAD™ метода пикове са положителни и те са непосредствен резултат от свързването на лиганд в
представляващата интерес позиция на мишената - това е добавянето на лиганда в биомолекулата-мишена. На фигура 3 Fo-Fc картата показва ясно голям положителен максимум (пик) в активната позиция на урокинеза. формата на пика съответства на лиганд 2-амино-8-хидроксикуинолин. Показано е, че лигандът заема пространството на електронната плътност с положителна разлика. Другите положителни пикове съответстват на свързан сулфатен фрагмент (посочен чрез
SO4 2j и свързани водни молекули (посочени чрез Н2О). Този тип карти са също така много чувствителни към малки структурни изменения (посочени чрез Δ) което, когато се използва в съчетание с 2Fo-Fc карти, позволява определяне на детайлната структура на цялостния лиганд-протеинов комплекс. За да се
WO 99/45379
PCT/US99/04967 пресметнат 2Fo-Fc картите следва да се извади I Fc | от 21 Fo |. В този случай картата е положителна и има електронна плътност за всички атоми на молекулата.
Проучването на картата на фигура 3 показва идентичността и структурата на свързаното съединение. За да се обособи положителната плътност, която може да бъде установена на Fo-Fc картата, е за предпочитане картите на подлаганите на въздействие кристали да се сравняват с картите на неподлаганата на въздействие молекула-мишена. В някои случаи може водни молекули да заемат активната позиция в кристала в отсъствие на свързан лиганд. Това е лесно разграничимо, защото свързаните водни молекули са често пъти ориентирани геометрически съгласувано с водородната им връзка, и защото те не са свързани с кристалната решетка чрез ковалентни връзки. По този начин резултантната карта проявява тенденция да бъде разединена, показвайки повече свързан разтворител отколкото органично съединение. Ако плътността в Fo-Fc или 2Fo-Fc картата е определена да представя органично съединение, триизмерната форма е сравнена с тази на съединения, присъстващи в библиотеката, и е подбрано найдобре съответстващото съединение. Алтернативно този процес може да се автоматизира чрез програми, такива като модулите XFIT на програмните продукти QUANTA (Molecular Simulations Inc., Quanta Generating and Displaying Molecules, San Diego: Molecular Simulations Inc., 1997).
Тъй като нараства умението да се измерват или обработват дифракционните интензитети, то може да отпадне необходимостта да се извършва сравняването на карти на електронната плътност. Свръзването може да се установи чрез просто сравнение на дифрактограмите на подлаганите на въздействие кристали с неподлаганите такива. Следователно е необходимо да се създаде карта на електронната плътност само ако е разкрито свързващо събитие в процеса на този по-ранен скрининг.
PCT/US99/04967
WO 99/45379 ·· ·»·£2 ·· ·· ·· ·· • · · ···· · · · · • · ···· ···· • · · · · ··· · · · · · • · ·· ····· ···· · ·♦ ·· ·· ··
Както е показано по-горе, методът CrystalLEAD™ може да бъде прилаган произволна биомолекула-мишена, за която може да бъде получена кристалографска структура. Поради широка приложимост на метода, той е илюстриран найдобре с приведените по-долу примерни изпълнения.
Примерните изпълнения за урокиназата (UK) и VanX представят два сценария за използването на CrystalLEAD™ метода. За урокиназата, преустроените микроик (gLIK) кристали дифрактират много добре и те представляват простран-
ствена група от висока симетрия. В противоположност на това, VanX кристалите предизвикват по-слаба дифракция и са с по-ниска симетрия. По този начин VanX кристалите изискват по-продължително време за събирането на данни. В допълне ние на това, кристалите на урокиназа имат една молекула в асиметричната си съставна част, докато VanX - имат шест. По-голямата асиметрична част изисква събиране на данни с по-голяма разделителна способност и прави проучването на картата по-дълго и изморително. В случая обаче на VanX кристали не бяха известни неподложени на растеж, подражателни свързващи съединения преди онези, открити чрез метода CrystalLEAD™. Следователно методът CrystalLEAD™ обезпечава захранването на цикъла за откриване на лекарствени препарати с
ново непептидно водещо съединение. За урокиназата методът CrystalLEAD™ осигурява нова първична матрица. Заявителите бяха в състояние бързо да увели чават ефикасността на първичната матрица, използайки съществуващия SAR и кристални структури, за да конструират производни с висок афинитет към свързване и с подобрена биоусвояемост, различни от известните лиганди на урокиназа.
Все пак тези примерни изпълнения показват предпочитани изпълнения на настоящето изобретение и не ограничават претенциите или подробностите.
Редовите изпълнители в областта веднага ще преценят правилно, че промени и модификации в специфицираните примерни изпълнения могат да бъдат
WO 99/45379 PCT/US99/04967 »· ·*·*23 ·· ·· ·· ·· • · · ···· · 4 · · • · ···· ···· • · ·· ······ ·· · • · ·· ····· ···· · ·· ·· ·· извършвани без отклоняване от областта и духа на изобретението. Най-после всички цитирания са включени тук след арбитрарното им разглеждане.
ПРИМЕРНИ ИЗПЪЛНЕНИЯ
Пример 1: Урокиназа
Урокиназата, серинов (аминооксипропионов киселинен) протеаз, е силно
свързана с туморни клетки. Урокиназата активизира плазминогена (профибринолизин, гликопротеид на кръвната плазма) в плазмина (фибринолизина), който на свой ред активизира междуклетъчната матрица на металозависимите протеази. Плазминът и металозависимите протеази разграждат извънклетъчната матрица и съдействат за растеж на тумор и метастази. По този начин съединения, конкрет но свързващи се с молекулата-мишена на урокиназата, могат да служат като ефективни антиракови агенти.
Човешката про-урокиназа се състои от 411 аминокиселини (фигура 5).
Verde et al., Proc, Nat'l Acad, Sci.. v.81(5), pp.4727-4731 (1984); Nagai et al., Gene,
v.36 (1-2), pp.183-188 (1985). Когато е активиран чрез протеолитично разцепване на пептидната връзка при Lys158 - Не159, ензимът уподобява две вериги, свързани чрез обикновен дисулфиден мост (Cys148 - Cys279). А-веригата (групи от атоми в молекулата с NN от 1 до 158) съдържа специфични области: EGF-подобен домен и крингел домен. В-веригата (групи от атоми в молекулата с NN от 159 до 411) съдържа домен на каталитичен серинов протеаз. По-нататъшната инкубация на урокиназата води до допълнително протеолитично разцепване на пептидната връзка при Lys135 - Не136, при което се образува урокиназа с ниско молекулно тегло. Кристали на тази ензимна форма, съвместно с ковалентния инхибитор GluWO 99/45379
PCT/US99/04967 ·» ···· 04 ·· ·· • · · ^*9 9 9
Gly-Arg хлорометилов кетон, бяха получени от Spraggon et al., DStructure, v.3, pp.681-691 (1995) и бе показана дифракцията им при разделителна способност до
2.5 А в лъча на високоенергиен синхротронен източник. Незадоволителното дифракционно качество при тези кристали заедно с присъствието на ковалентно свързан инхибитор затруднява обаче прилагането на метода CrystalLEAD™.
Получаване и структура на juUK кристал
За практическо осъществяване на метода CrystalLEAD™ човешка урокиназа бе така преконструирана, че молекулата й да се състои само от групи атоми с NN от 159 до 404 в В-веригата, в която Asn302 бе заместен с глутамин за да се отстрани предизвикващата глюколиза позиция, a Cys279 бе заместен с аланин за да се отстрани свободния сулфохидрилен фрагмент. Показано бе, че тази форма на урокиназа (ц1Ж) е изцяло активна е бе установено, че тя кристализира в кристална форма, съгласуваща се с метода CrystalLEAD™ . (Виж също U.S. Patent No. 5,112,755, издаден на 12 май 1992 от Heyneker et al.)
Получаване на векторен конструкт pBC-LMW-UK-Ala279
Мутанти на човешка UK бяха клонирани в дицистроничен вектор pBCFK12 на експерсия. (б. прев. т.е. в мутирал вирус като транспозиционен агент на бактериално активиран ген за производството на специфичен протеин, кодиран чрез удвоен сегмент от ДНК.) Pilot-Matias et al., Gene, ν. 128, pp. 219-225 (1993). Следващите олигонуклеотиди (олигонуклеозидфосфати) бяха използвани за генериране на разнообразни UK мутанти чрез полимеризирана верижна реакция (ПВР):
WO 99/45379
Секв. ID #
PCT/US99/04967 ·· »···οε ·· ···· ·· • · · · · · · ·· • · · · · · · · ·« • · ·· ······ · ·· • ♦ · ··«··· ···· · ·· ·»·· ··
Секвенция на получен чрез ПВР праймер (къс фрагмент на ДНК.добавян към единия край на ДНК-спирала, за да дефинира частта, която ше бъде копирана)
5' - ATTAATGTCGACTAAGGAGGTGATCTAATGTTAAATTTCA
GTGTGGCCAA - 3'
5' - ATTAATAAGCTTTCAGAGGGCCAGGCCATTCTCTTCCTTG
GTGTGACTCCTGACCA - 3*
5' - ATTAATTGCGCAGCCATCCCGGACTATACAGACCATCGC
CCTGCCCT - 3’
Началното клониране на UK с ниско молекулно тегло, тук и по-нататък обозначена с LMW-UK (L144-L411), бе осъществено като се използваше с-ДНК на човешка UK като темплейт (6. прев. верига на ДНК, която да послужи като матрица за образуване на допълваща верига), и секвенциите SEQ ID NOs: 1 и 2 като праймери, получени при стандартна ПВР. (б. прев.: секвенция - линейна последователност на нуклеотиди в ДНК или аминокиселини в протеини). Разширената чрез ПВР ДНК представляваше гел, пречистен и химически
дезинтегриран с ограничителни ензими SALi и HindUl. Дезинтегрираният продукт бе след това свързан лигатурно в pBCFKI 2 вектор, предварително накъсан със същите два ензима за да се генерира вектор на експресия pBC-LMW-UK. Векторът бе преобразуван в DH5a клетки (Life Technologies, Gaithersburg, MD), изолирани и секвентно закрепени чрез осъществяване на ДНК секвенция. Получаването на LMW-UK в бактерия бе анализирано чрез SDS-PAGE и зимогенографски анализ (б. прев.: зимогени - проферменти, неактивни предшественици на ферментите), Granelli-Piperno et al., J, Exp, Med., v.148, pp.223-234 (1978), която измерва активацията на плазминогена чрез UK. Този LMW-UK бе
| WO 99/45379 | PCT/US99/04967 |
| ·· ••••оо ·· ·· ·· ·· * · · · · · <···· • · · · · · «·<· • · · · · ··· · · · · · • Ф Ф Ф · Ф Ф 9 · ФФФФ · ·· ·· »· ·· |
експресиран в Е coli, и бе демонстрирана неговата активност в зимогенографския субстанционен анализ чрез commassie синьооцветен гел.
Успехът на бързото експресиране и детектиране на LMW-UK в Е coli, направи възможно осъществяването на анализ за произхода и развитието на мутацията в UK, за да се определи минимално функционалната структура на този ензим. Един мутант, притежаващ заместването на Cys279 с Ala279, бе получен с SEQ ID Nos: 2 и 3 чрез ПВР. Продуктът на ПВР бе накъсан с ΑνΛΙ и HindiW и използван за да замести Avh\ и HindW фрагменти в конструкта pBC-LMW-UK. Резултантният конструкт pBC-LMW-UK-Ala279 бе експресиран в Е coli и бе показано, че полученият продукт е активен в зимогенографския анализ.
Клониране и експресиране на ju_UK (UK(I159- К404^27^302) в Бакуловирус μυκ (UK аминокиселини lle159-Lys404, които съдържат Ala^GIn302) бе генериран чрез ПВР със следващите олигонуклеотидни праймери:
GhkbJD# Секвенция на получен чрез ПВР праймер
5' - ATTAATCAGCTGCTCCGGATAGAGATAGTCGGTA
GACTGCTCTTTT - 3'
5' - ATTAATCAGCTGAAAATGACTGTTGTGA - 3'
5' - ATTAATGTCGACTAAGGAGGTGATCTAATGTTAAAATTT
CAGTGTGGCCAA - 3'
5' - ATTAATGCTAGCCTCGAGCCACCATGAGAGCCCTGCT - 3'
5' - ATTAATGCTAGCCTCGAGTCACTTGTTGTGACTGCGGAT
ССА - 3'
5' - GGTGGTGAATTCTCCCCCAATAATGCCTTTGGAGTCGCT
CACGA - 3’
WO 99/45379
PCT/US99/04967
За да мутира само предизвикващата глюколиза позиция (Asn302) в UK, олигонуклеотидни праймери SEQ ID Nos: 4 и 6, и SEQ ID Nos: 5 и 8 бяха използвани в две ПВР реакции с pBC-LMW-UK-Ala279 като темплейт. Двата продукта на ПВР бяха накъсани с ограничителен ензим PvoII, лигатурно свързан с Т4 ДНК лигаз (б. прев.: ензим, катализиращ присъединяването на две молекули с ковалентна връзка, при което се хидролизира АТф) и използвани като темплейт, за да се генерира LMW-UK-A^-Q302. Междувременно водеща секвенция на природен UK бе стопена непосредствено до Не159 чрез ПВР с праймерите SEQ ID Nos: 7 и 9 като се използваше сДНК на природен UK като темплейт.
Този продукт на ПВР бе използван като праймер заедно със секвенция SEQ ID Nos: 8 в нова ПВР (полимеризирана верижна реакция) с LMW-UK-A279-Q3°2 ДНК - като темплейт, за да се генерира сДНК на μΙΜ. μΙ_ΙΚ бе накъсана с Nhe I и бе свързана лигатурно с вектор на пренос на бакуловирос pJVPIOz, накъсан със същия ензим. (Vialard et al., J, Virology, v. 64(1), pp.37-50 (1990)). Резултантият конструкт pJVPIOz-μΙΙΚ бе потвърден чрез стандартни техники за закрепване на ДНК секвенции.
В бактериални клетки Sf9 на вирусна нуклеинова киселина бе вложен конструкт pJVPIOz-μυΚ, за да произведат клетките вирус чрез метода на утаяване на калциев фосфат, използвайки BaculoGold комплект от PharMingen (San Diego, СА). Разкрита бе активността на активна μΙΙΚ в култивираната бактериална среда. Единичен рекомбинантен вирус (б. прев.: рекомбинант генетичен материал получен, когато сегменти на ДНК от различни източници са присъединени за да се получи рекомбинирана ДНК), експресиращ μΙΙΚ, бе пречистен на плака (чиста площ на бактериалната култура в лабораторен съд, където отсъстват клетки) чрез стандартни методи и бе получено голямо количество суров вирусен материал.
PCT/US99/04967
WO 99/45379 '· ···· .·*
Получена бе широкообхватна експресия на μΙΙΚ в инсектни клетки от друго естество, High-Five cells (Invitrogen, Carlsbad, AC), в суспенсия на израстване в свободна от серум среда Excell 405 (JRH Bioscience, LeneXa, KS), в двулитрова колба, при разбъркване 80 об/мин, 28°С, High-five клектите бяха израствани до 2х 106 клетки/милилитър, добавян бе рекомбинантен вирус на ju.UK с множественост на инфекция 0.1 и културата бе оставена да се развива в продължение на 3 дни. Супернатантът (плуващ на повърхността) на културата бе събран като изходен материал за пречистване. Активността на μΙΙΚ в супернатанта на културата бе измерена чрез амидолиза (химическо превръщане на скорбялата в захар) на хромогеничен (получаващ характерен, полезен за идентифициране цвят) субстрат на UK S2444, който бе с концентрация 6-10 мг/литър. (Claeson et al., Haemostasis, v.7, p. 76 (1978).
Експресиране на μΙΙΚ в Pichia pastoris
За да бъде експресирана μΙΙΚ в Pichia бе използван вектор на експерсия със синтетична водеща секвенция. Векторът на експресия в Pichia, pHill-D8, бе конструиран чрез модифициращ вектор, pHill-D2 (in-vitro ген), така че да включва синтетична водеща секвенция за секретиране на рекомбинантен протеин. Водещата секвенция 5' - ATGTTCTCTCCAAT f I IGTCCTTGGAAATTATTTTAGCTTTGGCTACTTTGCAATCTGTCTTCGTCCAGCCAGTTATCTGCACTACCGTTGGTTCCGCTGCCGAGGGATCC - 3' (SEQ ID Nos: 10) кодира секреционен сигнал на
РНО1 (показана е чрез единично подчертан шрифт), оперативно свързан с про пептидна секвенция (показана е чрез получерен шрифт) за разцепването на КЕХ2. За да се конструира pHill-D8 бе осъществена ПВР при използване на pHillS1 (in-vitro ген) като темплейт, тъй като този вектор съдържа секвенция, кодираща РН01, преден праймер (SEQ ID Nos: 11), съответстващ на нуклеотиди 509-530 на pHill-S1 и преобърнат праймер (SEQ ID Nos: 12), притежаващ нуклеотидна
WO 99/45379
PCT/US99/04967 «
секвенция, която кодира последната част на секреционния сигнал на РНО1 (нуклеотиди 45-46 на (SEQ ID Nos: 10), и пропептидната секвенция (нуклеотиди 67108 на (SEQ ID Nos: 10). Секвенциите на праймера (получен от Oregon
Thechnologies, Inc. Alameda, СА) бяха както следва:
Секв. ID # Секвенция на праймер, получен чрез ПВР
5' - GAAACTTCCAAAAGTCGCCTA - 3'
5' - ATTAATGAATTCCTCGAGCGGTCCGGGATCCCTCGG
CAGCGGAACCAACGGTAGTGCAGATAACTGGTCGAG
CGAAGACAGATTGCAAAGTA - 3'
Осъществено бе разширяване в условия на стандартна ПВР. Продуктът на тази реакция (приблизително 500 Ьр) бе пречистен гел, накъсан с S/pl и EcoRI и свързан лигатурно с pHill-D2, накъсан със същите ензими. ДНК бе преобразувана в НВ101 клетки на £ соН и чрез смилане на ограничителен ензим и секвенционен анализ бяха идентифицирани положителни клонирания. Конструиран бе един клониран продукт като pHill-D8, притежаващ свойствената секвенция.
Следващите два олигонуклеотидни праймери бяха след това изпозвани да развият μΙΙΚ за клониране в pHill-D8.
Секв, ID #
Секвенция на праймер, получен чрез ПВР
5' - ATTAATGGATCCTTGGACAAGAGGATTATTGGGGGAGAA
ТТСАССА - 3'
5' -ATTAATCTCGAGCGGTCCGTCACTTGGTGTGACTGCGAAT
CCAGGGT - 3'
| WO 99/45379 | PCT/US99/04967 |
| .••.•••зо .··..··. ·· ·· .·’ ·: : :: : ......... |
Продуктът на ПВР бе получен с SEQ ID Nos: 13 и 14, използвайки pJVPIOz-μ UK като темплейт. Разширеният продукт бе накъсан с BamHI и Xhol и свързан лигатурно с pHill-D8, накъсан от своя страна със същите два ензима. Резултантният плазмид (б. прев.: способена за генетична репликация верига на ДНК, която съществува независимо от хромозома в бактерии), ρΗΐΙΙ-ϋ8-μυΚ, бе закрепен чрез осъществяване на секвенция на ДНК и бе използван за преобразуване на щама Pichia GS115 (in-vitro ген) съгласно инструкциите на снабдителя-ген. Извършен бе скрининг за експресия на μΙΙΚΗβ в преобразуваните колонии на Pichia чрез израстване в BMGY среда и експресиране в BMMY среда, според
както е детайлизирано чрез снабдителя (In-vitro ген). С хромогеничен субстрат (получаващ характерен, полезен за идентифициране цвят) S2444 бе измерена активността на μΙΙΚ. Нивото на експресия на μυκ в Pichia бе по-високо от това, наблюдавано в бактериовирус-High Five клекти в областта от 30 до 60 мг/литър.
Пречистване на μΙΙΚ
Надутаечна култура от High-Five клетки или Pichia бе налята в 20 литров контейнер. Протеазни инхибитори, йодоацетамид, бензамидин и ЕДТК (етилен-
диаминтетраоцетна киселина) бяха добавени към крайна концентрация от около милимола, 5 милимола и 1 милимол, респективно. Надутаечният разтвор бе разреден след това петкратно чрез добавяне на 5 милимола буферен разтвор
Hepes с рН=7.5 и филтриран през мембрани с размери съответно 1.2 и 0.2 микрона. Микроурокиназата (μυκ) бе' уловена върху мембранен адсорбер
Sartorius S100 (Sartorius, Edgewood, NY) чрез преминаване през мембраната със скорост на потока от 50-100 милилитра/мин. След интензивно промиване с буферен разтвор 10 милимола Hepes с рН=7.5,10 милимола йодоацетамид, 5 милимола бензамидин, 1 милимол ЕДТК, μυκ бе извлечена от адсорбентната мембрана S100 с градиентен разтвор на NaCI (от 20 до 500 милимола, 200 милилитра) в буферен
WO 99/45379 PCT/US99/04967
разтвор 10 милимола Hepes с рН=7.5, 10 милимола йодоацетамид, 5 милимола бензамидин и 1 милимол ЕДТК. Елюатът («100 милилитра) бе разреден 10 пъти в 10 милимолов буферен разтвор Hepes, съдържащ инхибитори, и поставен в колона
S20 (BioRad, Hercules, СА). gUK бе извлечена с 20х обема на колоната градиентен
разтвор на NaCI (от 20 до 500 милимола). При извличането на адсорбента не бяха използвани инхибитори в буферните разтвори. Елюатът бе след това петкратно разреден с 10 милимолов буферен разтвор Hepes, рН=7.5, и бе поставен в колона (Sigma) от хепарин-агароза, от която μυκ бе извлечена с градиентен разтвор на NaCI от 10 до 250 милимола. Елюатът μΙΙΚ от хепариновата колона (»50 милилитра) бе поставен в колона (40 милилитра) с бензамидин-арагоза (Sigma, St. Louis, МО), приведен в равновесие с 10 милимолов буферен разтвор Hepes, рН=7.5, 200 милимола NaCI. Колоната бе след това промита с равновесен буферен разтвор и елюирана с 50 милимола NaOAc (натрийоксиацетат) с рН=4.5 и 500 милимола NaCI. μΙΙΚ-елюатът («30 милилитра) бе концентриран до 4 милилитра чрез ултрафилтриране и бе поставен в колона Sephadex G-75 (2.5x48 см; Pharmacia® Biotech, Uppsala, Sweden) в равновесие с 20 милимола NaOAc, рН=4.5, 100 милимола NaCI. Съдържащият μυκ концентрат, съответстващ на единичния найсъществен пик, бе събран и лиофилизиран като краен продукт. Пречистеният материал се появява на SDP-PAGE като единична голяма ивица.
Висококачествените кристали на μυκ улесняват определянето на неговата апо-триизмерна структура чрез рентгеноструктурен анализ с разделителна способност до 1.0 А. Кристалите бяха получени чрез метода на дифузия на пари от (
висяща капка. При този метод, типичните разтвори на източника в апаратурата се състоят от 0.15 мола Li2SO4, 20% полиетиленгликол с молекулно тегло 4000 и сукцинатен буфер с pH 4.8-6.0. Върху плъзгаемия капак бяха смесени 2 микро| литра от разтвора на източника с 2 микролитра протеинов разтвор и това коли! чество бе херметизирано над източника. Кристализацията се осъществяваше при i
WO 99/45379
PCT/US99/04967 ··· · •••32
приблизително 18-24°C в продължение на 24 часа. Протеиновият разтвор съдър жаше 6 мг/мл (0.214 милимола) μΙΙΚ в 6 милимола цитрат с рН=4.0, 3 милимола ε аминокапронова киселина, р-карбетоксифенил хлоридов естер (инхибитор) с 1%
ДМСО (диметилфулфоксид) съвместен разтворител. Използваният при съвместната кристализация инхибитор се предполага да ацилира (да въвежда ацилна група) сериновата активна позиция 195 и е впоследствие деацилиран по отношение на ензима, защото триизмерният ренгеноструктурен анализ на кристали, израстнали в присъствието на това съединение, показва, че в активната позиция на ензима не остава инхибитор. (Menegatti et al., J. Enzyme Inhibition, v.2, pp.249259 (1989)). Единствената плътност, която се констатира е тази, дължаща се на свързаните молекули на разтворителя. Тъй като μΙ_ΙΚ няма да кристализира в отсъствие на инхибитор, то се се предполага, че метастабилният комплекс (инхибиториК) е обектът на кристализация. От голямо значение е, че получените μΙΙΚ кристали са образувани от ензим с незаета активна позиция, което е идеалният случай за практическо осъществяване на метода CrystalLEAD™.
Кристали получени при тези условия принадлежат към пространствената група Ρ2ι2-|2ι с размери на единичната клетка а=55.16А, b=53.00А, с=82.30А и α=β=χ=90°. Те дифрактират извън границата на 1.5 на ротиращ аноден източник. Освен това е бил събран комплект от присъщи данни с разделителна способност 1.0 А при Cornell High Energy Synchrotron Source в Ithaca, New York. Кристалната структура бе определена чрез метода на молекулно заместване като се използва програмата AMORE, Navaza, J, Acta Cryst.. А50:157-163 (1994), с ниска разделителна способност за структурата на урокиназа като проба за търсене (Spraggon et al., Structure, v.3, pp. 681-691 (1995)); PDB entry 1LMW. Структурата бе усъвършенствана като се използваше програмния продукт XPLOR (A.Brunger, XPLOR (version 2.1) Manual. Yale University, New Haven CT (1990)).
«Μ
WO 99/45379 ··
PCT/US99/04967 ·· · · ·
Скрининг на Слаби Бази
Осъществен бе скрининг на μΙΙΚ на фона на структурно-насочена библиоека, за да се намери нова първоначална матрица, която би притежавала предпочитаеми фармакокинетични свойства. Тъй като активната позиция на урокиназата е съставена от един първоначален джоб, който съдържа свободен карбоксилатен фрагмент във формата на аспарагинова киселина (Asp189), повечето добре известни матрици са силно базисни и съдържат амидинен или гуанидинен фрагмент, (бел. прев.: база - произволни пиринови или пирамидинови
съединения, съставляващи част от нуклеотидната молекула на ДНК или РНК). Установено е било, че базисната група е свързана солево с водородна връзка с
Asp189. Това би могло да се окаже проблем за фармакологията, тъй като е известно, че силните бази понижават степента, до която приеманият през устата лекарствен препарат може да бъде усвоен от тялото. Съобразно с това бяха подбрани съединения от слаба базисна библиотека, които не са предварително известни като свързващи се с урокиназата.
Слаба базисна библиотека, съдържаща 61 съединения с рКа между около 1
и 9, бе локализирана в директорията на достъпни химикали (ДДХ). Библиотеката бе разделена на 9 смеси от по 6 до 7 различими по форма съединения, както това бе определно чрез визуално проучване на двуизмерната химическа структура. На смесите на съединенията бе извършен скрининг по описания по-горе метод. Поспециално, всеки компонент бе разтворен в 100% ДМСО до крайна концентрация от около 2 мола (или до насищане за по-слабо разтворимите съединения). Еднакви обеми за всеки от 6-те или 7-те компоненти, съдържащи се в сместа, бяха смесвани до крайна индивидуална концентрация на компонента 0.33 мола. Единични кристали от ц1Ж бяха поставени в 50 милилитра на 27% PEG4000, 15.6 милимола сукцинат с рН=5.4, 0.17 милимола Li2SO4 и 0.5-0.8 милилитра от сместа
WO 99/45379 ..... PCT/US99/04967 • .: .*34 .:.. 'J? ’: :: :
·· ·· ·· ·· на съединенията, добавени да дадат от 1 до 1.6% ДМСО и от 3.3 до 5.2 милимола крайна индивидуална концентрация на съединението. При тези условия се очаква чувствителността на експеримента да разкрие свързващи субстанции с Kd<1.0 милимол. На кристалите бе дадена възможност да достигнат равновесие в продължение на 8-24 часа.
Данните бяха събирани на ротиращ аноден източник Rigaku RTP 300 RC с
RAXISII или с MAR аноден детектор на изображение. Типични данни се състояха
от 45-50 2° осцилации с експозиции от 2 до 5 минути. Типични данни бяха комплектувани на 70-90% при разделителна способност 2.0-3.0 А с разсейващи Rфактори от 13 до 26%. Следователно качеството на данните се колебаеше в границите от добро до незадоволително, което се дължи на бързото събиране на записваните входящи данни. Все пак бе показано, че това качество на данните е подходящо за намиране на свързващи субстанции, което се дължи преди всичко на високото качество на пусковия модел, усъвършенстван до достигане на разделителна способност 1.5 A (R=20.7%, Rfree=25.3%). Данните бяха обработвани с програмния продукт DENZO (Otwinowski et al., Methods in Enzymology, 276 (1996)), а картите на електронната плътност бяха изчислявани чрез програмния продукт
XPLOR.
Картите на електронната плътност бяха проучени с помощта на мощен компютър Silicon Graphics INDIGO2 с висока разделителна способност, прилаган при интензивни графични процеси, като се използваше програмния продукт QUANTA 97 (Molecular Simulations Inc., Quanta Generating and Displaying Molecules. San Diego: Molecular Simulations Inc., 1997). формата на електронната плътност в активната позиция бе идентифицирана визуално като резултантна или от едно (или повече) от съединенията в сместа, показващо положителено попадение, или от подредени водни молекули, показващи отсъствие на свързване. За \N0 99/45379 PCT/US99/04967 ·· : ·: :’·····’ ;; :
....... ..· ·..··..· експерименти, чиито резултат е положително попадение, съответното съединение бе визуално премествано в електронната плътност. Картите на електронната плътност бяха също така проверени по отношение на произволни промени в протеиновата структура, и ако такива бяха наблюдавани, то бяха осъществени съответните преобразувания. Следователно триизмерната структура на комплекса съединение-протеин бе известна след проучването на картата/етапа на пригаждане на съединението. При примера с урокиназа се използваше визуално преместване на съединението в електронната плътност тъй като скринингът бе все още в малък мащаб. Когато скринингът на съединението се разширяваше до голям мащаб, търговски програми, такива като модулът XFIT на програмния продукт QUANTA, ще улесняват автоматичното пригаждане на съединението към електронната плътност.
| N | .JCCOv I | |
| 2456-81-7 | 123333-56-2 | 62298-43-5 |
| 1 | 2 | 3 |
| Ο | ||
| φ N | N-4 #“Вг νΑ | ¢¢- Ν Ν |
| Х-001 | 2753-71-9 | 42712-64-1 |
WO 99/45379 ·· ···· • · · .·’ 3δ · ···· ·
.. PCJ7US99/04967 • · · · • · · · • · · · • · · ·
Фигура 6 показва пример на положително попадение. Съединенията, които бяха подложени на скрининг, са отбелязани по-горе с числата от 1 до 6 и Fo-Fc картата на електронната плътност в активната позиция е показана на фигура 6А. формата на електронната плътност идентифицира като свързващо съединение това с N 5. Фигура 6В показва в детайли начина на свързване на съединението в специфичността на първичния джоб според както е получен при непосредстве ното интерпретиране на картата на електронната плътност чрез метода
CrystalLEAD™. Амино групата с азот и водород се свързва с Азр189-карбоксила, а пирамидалната група с азот и водород се свързва с подобния на гръбначен стълб карбонил (Gly218). Структурата показва също така, че позиция, идеална за модификация, би била тази при пиридилметила.
N
N
51-78-5
N
104-94-9 / о
22013-33-8
N
Вг
1072-97-5
WO 99/45379 ·» • · ····
PCT/US99/04967 • · · · • · · ·
Друга смес от съединения (съединения от 7 до 13) не предизвиква каквито и да е попадения. Резултиращите карти на електронната плътност след всмукване на тази група не съответства на което и да е от изпитваните съединения от тази смес. Вместо това тези съединения съответстват на свързани молекули на разтворителя. Виж фигура 6С.
о
14268-66-7
70125-16-5
Фигура 7 показва друг пример за положително попадение. От скрининга на 7 съединения (с номера 14-20 по-горе) Fo-Fc картата на електронната плътност показана на фигура 7А сочи, че е свързано съединение 19. Начинът на свързване изобразен на фигура 7В показва, че 2-аминът е свързван с водородни връзки с
WO 99/45379
• · ···· ·
PCT/US99/04967 ·· ·· • · · · • · · · • · · · • · · · ·· ·· позицията Asp189 във веригата, и че 8-хидроксилът е идеална позиция за заместване, за да се получи достъп до прилежащите подджобове (означени като S1 β на фигура 7В). Фигура 8 представя друго попадение, при което бе установено, че съединение 22, 5-аминоиндол, (фигура 8А) се свързва с урокиназа чрез водородни връзки на амино групата с Asp189 (Фигура 8В). Скринингът бе извършен за съединения, означени по-долу с номера 21 - 27.
| Хг | N 0 V | ||
| • | 0 | ||
| 615-50-9 | 65795-92-8 | 83527-99-5 | |
| 21 | 22 | 23 |
| N | n_0-0 | ч |
| 89323-10-4 | 2359-60-6 | 74784-70-6 |
| 24 | 25 | 26 |
71026-66-9
Фигура 9 показва пример, за който бе установено, че две съединения от една и съща смес (съединения 28 - 34 представени по-долу) се свързват без
WO 99/45379 ♦ · ···· • · · .· .39.
• ·
.. P.QT/US99/04967 • · · · • · · · • · · · 9 • · · 9 проблемите на множествено заемане на позиция. В началния експеримент, при който кристалът бе всмукван в присъствието на цялата смес от горните седем съединения, бе констатирано свързване за съединението 28 (фигура 9А). В допълнение бе също констатирано, че когато по-слабосвързващото съединение 31 бе всмуквано индивидуално (базирано върху предварително установеното чрез метода CrystalLEAD™ взаимоотношение на структурната активност), то това съединение се свързва с урокиназата (фигура 9В). В по-типично приложение на метода би следвало да бъде всмуквана повторно библиотека от съединения в
отсъствие на по-здравосвързващото съединение, за да се изяви по-слабосвръзващото съединение в сместа, ако това е желателно.
| 580-22-3 28 | 329-89-5 29 | По k 132-32-1 30 | |
| • | Ν-θ— | N Ν_Ο~° | |
| 1603-41-4 | 137-09-7 | 24313-88-0 | |
| 31 | 32 | 33 |
2491-71-6
| WO 99/45379 | PCT/US99/04967 |
| * * · · · · — ’ : .‘40: ; ϊ · ί · ..... ·· .· |
В таблица 1 са обобщени инхибиторните константи за всяко от попаденията на метода CrystalLEAD™, според както са определени чрез хромогенна активност на pyro-Glu-Gly-Arg-pNA/HCI (S-2444, Chromogenix) (те са идентифицирани по характерното им оцветяване). Извършени бяха опити и за двете стойности на pH: 6.5 (0.1 мола NaPO4) и 7.4 [50 милимола Tris (трифенилфосфин)хлорородий]. Другите условия на опита бяха 150 милимола NaCI, 0.5% детергент Pluronic F-68, 200 милимола S-2444, с крайна концентрация на ДМСО
2.5%. Km на субстрата бе определен да бъде 55 микромола.
Таблица 1. Инхибиторни константи и рКа за попадения, определени чрез метода CrystalLEAD™
| Съединение (CAS #) | Ki (рН=6.5) | Ki (рН=7.4) | рКа |
| 5 (42753-71-9) | » 500 микромола | » 500 микромола | 6.0* |
| 19 (70125-16-5) | 56 микромола | 137 микромола | 7.3 |
| 22 (65795-92-8) | 200 микромола | > 500 микромола | 6.0* |
| 28 (580-22-3) | 71 микромола | 136 микромола | 7.3 |
| 31 (1603-41-4) | » 500 микромола | » 500 микромола | 7.0* |
* - показва изчислена стойност на рКа.
Основавайки се на активността и на структурната информация, съединение 19 бе избрано като водещо първостепенно съединение. Кристалографската информация сочи, че заместване в 8-те позиции би позволило достъп до прилежащите хидрофобни джобове (Sip) и следователно би довело до увеличаване на ефикасността на процеса. Основавайки се на кристалографската информация и тази за свързването, получена от амидин-базисните серии, бе синтезирано съединение 35 (8-аминопиримидинилов аналог на съединение 19). Тази модификация имаше за резултат 200 кратно нарастване на свързващата ефикасност при
PCT/US99/04967
WO 99/45379
pH=6.5 (Ki при pH=7.4 e 2.5 микромола, докато Ki при pH=6.5 e 0.32 микромола).
Експериментът свидетелства, че методът CrystalLEAD™ може да обезпечи и двете - както водеща структурна матрица, така и детайлната структурна информация, необходими за доразработване на тази матрица посредством структурно-базирано конструиране на лекарствен препарат в по-ефикасно съединение.
N
На фигура 10 са показани наложени един над друг кристала на комплекса (съединение 35:урокиназа) и родителското съединение 19. Налагането им показва, че както бе предсказано, аминопиридиновият пръстен е свързан в хидрофобния под-джоб (Sip), и че това заместване има за резултат преместване на куинолиновия пръстен в направление към тази позиция (бел. прев.: куинолинът, C9H7N, представлява безцветна течност на азотна основа с неприятна миризма).
Съединението 35,8-аминопиримидинил-2-аминокуинолин, също бе изпитано за неговата орална биоусвояемост (степен на използваемост от тялото като лекарство). Определено бе, че то има 30-40% орална биоусвояемост в плъха, когато е било приемано като доза от 10 мг/кг. Следователно успешното осъществяване на метода CrystalLEAD™ има за резултат нова водеща структурна матрица, който обезпечава чрез един цикъл на структурно-базирано конструиране на лекарствен препарат произвеждане на съединение, притежаващо 200
PCT/US99/04967
WO 99/45379 ·· •••Ил • · 42 • ·
·· пъти по-висока ефективност на свързване, и за което бе установено, че е с орална биоусвояемост.
Пример 2: УапХ
Ванкомицинът е алтернативен лекарствен препарат при инфекции, предизвикани от бактериални породи на стрептококи или стафилококи, които са устойчиви на β-лактам антибиотици. Все пак бактериални щамове, резистентни към ванкомицина, са били понастоящем установени за този лекарствен препарат като последна възможност за лечение с него. Някои изследователи са асоциирали VanX, металопротеиназа, с устойчивостта на ванкомицина. VanX е част от серийна последователност от ензимно катализирани реакции, която има за резултат заместване на завършващия фрагмент D-аланин-О-аланин от веригата бактериални пептидогликани (свързващата позиция за ванкомицина) с D-аланинD-лактат. Това води до 1000-кратна понижена активност при свързването на ванкомицина. Единствените известни инхибитори за VanX са пептиди или техни производни, такива като фосфонатови или фосфинатови аналози на О-аланин-Оаланин субстрати. Като такива те не са подходящи лекарствени препарати, тъй като са метаболизирани или се разпадат in-vivo. Началните опити да се намерят подходящи лекарствени препарати посредством обикновенните методи на скрининг не доведоха до разкриване на подходящ лиганд. Впоследствие заявителите на проучването се обърнаха към метода CrystalLEAD™, за да се намери непептидно водещо съединение, подходящо за разработване на лекарствен препарат в посока към обработване на тези устойчиви щамове.
Получаване на VanX
Е. coli W3110, съдържащ плазмида pGW1, в който генът на vanX е под контрола на IPTG закачащия промотер (генна секвенция), увеличаващ експресията на гена и активиращ неговото копиране, бе израстван при 37°С в съдържаща
WO 99/45379 PCT/US99/04967 ·’*:& ·*’····.
: : ··: ·: :: :
......... ·..··..· ампицилин (100 мг/мл) LB среда, за да се достигне спектрална поглъщателна способност от около 1.3 - 1.5 единици при дължина на вълната 595 нанометра. Промотерът IPTG бе добавен след това до достигане на крайна концентрация от 0.8 милимола и клетките бяха израствани допълнително 1.5 часа.
Събирани бяха клетки чрез центрофугиране при 6000 об/мин в продължение на 10 минути. След това полученото топче бе повторно суспенсирано в ледено студен 20 милимола Tris-HCI (рН=8.0), съдържащ 0.01% NaN3, 1 милимол MgCI2> 1 милимол фМСф (фенилметилсулфонат хлорид), 1 милимол ДТТ (1.4 дитиотретитол - буфер А) и 25 единици/мл от бензоназ (Nicomed Pharma, Copenhagen, Denmark). Клетките бяха лизинирани (разтворени чрез лизини) като към лизинната смес се добавяха циркониеви керамични зрънца с размери 0.1 микрона в съотношение 1:1 (обемни части) и субстратът бе оставен да циркулира 1 - 3 минути в ултразвукова топкова мелница, Bead Beater (Biospec). Тази мелница работеше с леденопакетиран резервоар, за да се поддържа охладена лизинната смес. След това лизатът бе декатиран (внимателно излят) от утаените стъклени зрънца и те бяха изплаквани с 1 - 2 обема лизинен буфер, след което промивките бяха обединени с оригиналния лизат. Лизатът бе центрофугиран при 25000д
(д=981 см/сек2) в продължение на 30 минути, за да се утаи (разслои) клетъчният продукт. Образуваният след утаяването повърхностен горен слой бе диализиран през цялата нощ при 4°С в 50 милимола Tris-HCI (рН=7.6), 1 милимол ЕДТК (етилендиаминтетраоцетна киселина) и 1 милимол ДТТ (буфер В).
По-нататък диализираният лизат бе поставен в бързо отточна колона Qsepharose, предварително сбалансирана в буфер А при скорост 4 милиметра за минута. Колоната бе обилно промита с буфера А, последвано от прилагане на линнеен градиент от буфер В до буфер В+0.5 мола NaCI. Активните фракции на VanX от този етап бяха обединени, концентрирани и след това приложени към
PCT/US99/04967
WO 99/45379
φ
44: :
• · · • φ φφ
φ «
Superose-75 колона в буфер В. Фракции на VanX от колоната Superose-75 бяха приложени към Source-Q колона в буфер А при скорост на потока 2 мл/мин.
Колоната бе промита с пусков буфер с обем няколко пъти обема на колоната.
След това VanX-протеинът бе елюиран (екстрахиран от абсорбента) със слабо изявен градиент от буфер А до буфер А+25 милилитра NaCI. Активните фракции на VanX от този краен етап бяха концентрирани до крайна концентрация приблизително 15 мг/мл в буфер А с помощта на филтри Amicon. Гореописаната процедура бе осъществена при 4°С, ако не е била предписана друга спецификация. Пречистен по този начин протеинът на VanX бе с чистота 95% и бе готов за
кристализиране.
Кристална структура на VanX
Кристалната структура на VanX бе определена при разделителна способ«
Мост 2.2 А чрез множествено изоморфно заместване (Bussiere et al., Molecular Cell. Vol.2, pp. 75-84 (1998)). Генетически рекомбинираният протеин, получен по-горе, бе оставен да кристализира в пространствената група Ρ2ι чрез метода на дифузия на пара от стояща капка. Типични кристали имаха размери на единичната клетка а=83.4 А, Ь=45.5 А, с=171.4 А, α=χ=90°, β=104°, с 6 молекули в асиметричната секция. Типични разтвори на източника при кристализирането се състоят от 0.1 мола Mes с рН=6.4, 0.24 мола амониев сулфат и 20% РММЕ 5000.
Върху микромоста на стоящата капка (Hampton USA) бяха смесени 2 милилитра протеин с 2 милилитра от разтвор на източника в камерата и тя бе херметически затворена с плъзгаем капак. Кристализацията се извършва при 18’°С и кристалите растат до пълен размер за около 2-3 дни. Протеиновият разтвор е съставен от 12 -15 мг/мл (0.5 - 0.6 молимола) VanX и 10 милимола Tris, 15 милимола ДТТ с рН=7.2. Триизмерната структура на кристали, израстнали при тези
| WO 99/45379 | ........ PCT/US99/04967 ’ .·’ 45 : :;·%.·% . : ·.· · ··*.: :: : ..... ··· ·..··..· |
условия, показва съществуване на незаета активна позиция, което прави това система, подходяща във висока степен за прилагане на метода CrystalLEAD™.
Активната позиция на VanX има разширен джоб, способен да подслони субстрата О-аланин-О-аланин. Джобът съдържа също така и каталитичен цинк. При това положение, за този случай, бе извършен скрининг на VanX за библиотеки, насочени към цинк, за да се намерят матрици на множествено свързване, които могат да бъдат обединени в едно единствено водещо съединение. Осъществен бе скрининг за три, насочени към цинка библиотеки, използва щи аминокиселина, тиол, хидроксамова киселина или карбоксилатни фрагменти.
Скрининг
Библиотеката на аминокиселините се състои от 102 съединения от оптически чисти, търговско достъпни, намиращи или отсъстващи в природата аминокиселини. Библиотеката е разделена на 12 смеси от по 8 до 10 на брой, различими по форма съединения, на които е извършен скрининг по описания по горе метод. По-специално, всеки компонент бе разтворен в 100% ДМСО до крайна концентрация 2 мола (или до насищане за по-слабо разтворимите съединения).
Еднакви обеми от всеки компонент на всяка една от смесите бяха смесени до крайна концентрация 0.33 мола за отделно съединение. Единични кристали на
VanX бяха поставени в 50 милилитра разтвор Mes от 0.1 мола с рН=6.4, 0.24 мола амониев сулфат, 20% РММЕ 5000 и 0.5 - 0.8 милилитра от сместа на съединенията, добавени да дадат от 1 до 1.6% ДМСО и от 3.3 до 5.2 милимола крайна концентрация за отделното съединение. На кристалите бе дадена възможност да достигнат равновесие за 3 - 4 часа. По подобен начин бе извършен скринингът и за библиотеките на тиола, хидроксамовата киселина и карбоксилата.
WO 99/45379 фф • φ • • φ φφφφ φφφφ ·*46
Φ φ^ φ
φ .fCT/us99/04967 • φ φ · • · · φ • · φ · · • φ φ · • Φ Φ·
Данните бяха събирани на ротиращ аноден източник Rigaku RTP 300 RC с
RAXISII, MAR аноден детектор на изображение или MAR CCD детектор. За системата с анодно изображение типичните данни се състояха от 90 1.25°
осцилации с 15 минутни експозиции, докато при използване на детектора CCD 100 1.0° осцилации бяха експозирани за 2 минути. Типични използваеми данни бяха завършени на повече от 90% при разделителна способност 2.6-2.8 А с разсейващи R-фактори от 10 до 20%. Това се изискваше за адекватно визуализиране и идентифициране на инхибитори в Fo-Fc или 2Fo-Fc картите. За тези карти отправният модел бе усъвършенстван до разделителна способност 2.1 A (R=25%, Rf]-ee=28%). Данните бяха обработени с програмен продукт DENZO, а картите на електронната плътност бяха пресметнати с продукта XPLOR. Показано бе, че в присъствието на някои съединения от карбоксилатната библиотека пространвената група се измества от P2-J до С2 (а=170.6 А, Ь=47.5 А, с=83.6 А, α=χ=90°, β =104°). За тази форма асиметричният сегмент съдържаше тример (молекула, съставена от идентични прости молекули), редуцирайки по този начин броят на степените на свобода, така че данни с по-ниска разделителна способност (3.0 А.) се оказаха подходящи за визуализиране на свързването.
С помощта на мощен компютър Silicon Graphics INDIGO2 с висока разделителна способност, прилаган при интензивни графични процеси, бяха проучени карти на електронната плътност като за целта се използваше програмния продукт QUANTA 97. формата на електронната плътност при активната позиция бе идентифицирана визуално чрез формата на едно или повече съединения в сместа за посочване на положително попадение на свързване или чрез подредени водни молекули, свидетелствуващи за отсъствие на такова свързване. За експерименти, които имат за резултат положително попадение, съответното съединение бе визуално преместено в електронната плътност. Картите на електронната плътност бяха проверени също така за произволни изменения в
| WO 99/45379 | PCT/US99/04967 |
| *· ·· ·· ·· ·· • · · · · · · · · · • · · · · · ···· * · ·· ······ ·· · |
протеиновата структура, и ако такива бяха наблюдавани, то бяха осъществени съответстващи структурни видоизменения. Следователно след проучването на картата/етапа на пригаждане на съединение стана известна детайлизираната триизмерна структура на комплекса съединение-протеин.
| СЯ ' он | СЯ4“ ОЯ |
| 580-22-3 | 329-89-5 132-32-1 |
| © 36 | 37 38 |
| ‘ о^он | И H2N OH , H,N ОН |
| 1603-41-4 | 137-09-7 24313-88-0 |
| 39 | 40 41 |
Общо са били установени 6 попадения при скрининга на VanX (съединения 36 - 41). Фигура 11 показва начина на свързване на представителните попадения. Във всички случаи формата на електронната плътност идентифицира свързващото съединение. Фигура 11А показва съединение 39, свързано координационно с карбоксилата в активната позиция на цинка. Фигура 11В показва съединение 36, свързано с карбоксилата, посочвайки в посока на активната позиция на цинка. Във фигура 11С бе също установено, че съединение 37 се свързва чрез карбоксилата. Свързването на съединение 39 и на съединение 41 (не показани тук) предполага, че активната позиция на цинка предпочита координация на карбоксилат пред свободен тиол. Това доведе до извършване на скрининг на карбоксилатна библиотека, при което бяха установени допълнителни попадения. При
WO 99/45379
PCT/US99/04967
| •У/.8:::··: Г::: ···· · ..· · · ·· · ·· ·· ·· · · |
всички случаи скринингът на съединенията бе извършван в смеси от по 7 до 10 съединения и попадението бе пряко идентифицирано чрез формата на картата на електронната плътност. Тези попадения бяха въведени непосредствено в цикъла на структурно-базираното конструиране на лекарствен препарат по начин, подобен на този, описан в примера за урокиназа.
Пример 3: Скрининг при смеси от 100 съединения
Препоръчително изпълнение на метода CrystalLEAD™ би било той да се използва за скрининг на смеси от 100 съединения, отколкото на смеси от 10 съединения. По този начин се цели да се увеличи броят на съединенията, на които може да се направи скрининг за единица време. Предимството в този случай е поголявият брой на изследваните съединения се съпътства с намаляваща чувствителност при детектиране на попадение на свързване. В допълнение, тъй като ще се свързва само съединението от сместта с най-мощен ефект на свързване, послабите попадения могат да бъдат пропуснати. Когато, например, се осъществява скрининг чрез метода CrystalLEAD™ на обща библиотека, която е напълно различна по размери, форма и функционалност, скоростта на попаденията се очаква да бъде ниска. Следователно в този случай е оправдано скрининтът да бъде по-непрецизен. В допълнение, тъй като попаденията при този скрининг биха изявявали най-ефикасно свързващите компоненти, то последните биха могли да служат като начални матрици при констуиране на структурно-базирани лекарствени препарати. Тъй като сместа ще бъде съставена от 100 съединения, тя би следвало да бъде внимателно конструирана за бъде осигурено, че всички нейни членове биха били различими по форма в достатъчна степен, за да се елиминира необходимостта от разплитане на съединенията. Следователно по време на
WO 99/45379
PCT/US99/04967
’ · ·· ·· ·· детектирането на попадение може да се окаже необходимо известно разплитане на сместа за идентифициране на попадението.
За да се изпита този специфичен метод, съединение, известно да се свързва с μΙΙΚ, бе добавено към група от 100 съединения. Такова е съединението N 19, открито първоначално чрез метода CrystalLEAD™ , за което бе показано, че се свързва към μΙΙΚ с Ki 56 микромола при рН=6.5 и с 137 микромола при рН=7.4. Стокомпонентната смес бе изтготвена чрез смесване на 10 смеси от по 10 съединения всяка. Характерно е, че всяка суха смес от 10 съединения бе разтворена в 100% ДМСО до крайна концентрация от около 80 - 240 милимола (или до насищане при по-слабо разтворимите съединения). Еднакви обеми за всяка от десеткомпонентните смеси бяха смесени до крайна концентрация на отделните съединения 8.0 - 24.0 милимола и сместа бе прибавена към 100% ДМСО на изходното съединение 19, така че крайната концентрация бе 18.0 милимола. Единични кристали на μΙΙΚ бяха поместени в 50 микролитра от 27%-ен PEG4000, 15.6 милимола сукцинат с рН=5.4,0.17 мола Li2SO4 и 0.5 микролитра от сместа на съединенията, добавени за да дадат 1% ДМСО. Крайната концентрация на всеки компонент в експеримента на всмукване бе в областта от 80 до 240 микромола, а концентрацията на компонента 19 бе 180 микромола. При тези условия чувствителността на експеримента се очаква да позволи установяването на свързващи съединения с Kd<20-60 микромола. На кристалите бе дадена възможността да достигнат рановесие за 4 часа и 15 минути.
Данни бяха събирани в националните лаборатории на Арагон с помощта на съвременен синхротронен протонен източник ID, с линия на протонния поток IMCA, съоръжен с MarCCD камера. Данните се състояха от 100 1° осцилации с 7 секунди експозиции. Данните бяха завършени на 87.4% при разделителна способност 1.6 А с общ разсейващ R-фактор от 5.4%. Данните бяха обработени с
WO 99/45379 PCT/US99/04967
..•••50 .··..·*.
.* j · ; · *··· · · · I I ····· ·· ··* · · · · програмния продукт DENZO (Otwinowski et al., Methods in Enzymology. 276 (1996)), а картата на електронната плътност бе изчислена с програмния продукт XPLOR.
Картата на електронната плътност бе проучена с помощта на мощен компютър Silicon Graphics INDIGO2 с висока разделителна способност, прилаган при интензивни графични процеси, като се използваше програмния продукт QUANTA 97 (Molecular Simulations Inc., Quanta Generating and Displaying Molecules. San Diego: Molecular Simulations Inc., 1997). формата на електронната плътност при активната позиция бе идентифицирана визуално като резултат от индикация на положително попадение за едно от съединенията на сместа, показано на фигура 12 като съединение 19.
Този метод е предпочитаем при отриване на водещи съединения. Такива съединения биха имали типични характеристики да бъдат по-здраво свързващи се с дадена биомолекула-мишена (например в областта на чувствителността на метода). Този метод позволява също така да се осъществи скрининг в интервала от 1 - 2 седмици на 10 000 съединения от ненасочена библиотека. Този метод би бил използан в комбинация с другите методи на скрининг на 10 - 20 съединения за време, когато по-слаби свързващи съединения биха били идентифицирани. Въпреки че тези свързващи съединения е по-малко вероятно да служат като водещи, те биха могли да бъдат прикрепени към водеща матрица, за да се увеличи ефикасността им на свързване.
Пример 4: Скрининг на ErmC1 чрез метода CrystalLEAD™
ErmC' е r-РНК метилтрансфераза, която пренася метилова група от Sаденозил-1_-метионин до N6 на аденина във вътрешността на пептидилтрансферазната затворена верига на 23S r-РНК. Това метилиране дава антибиотична устойчивост срещу голям брой макролидни антибиотици, такива като широко предписваният еритромицин. Би се очаквало, чрез инхибирането на ErmC' да се
\N0 99/45379
PCT/US99/04967 ·· ••••RI ·· • · · 1 ·· • · ·· • · · ·· • · ·· ··♦· · ·· • ·· · • · ·· • · ·· • · ·* • · ·· • ·· · анулира неговата устойчивост спрямо атибиотици. За да се конструира специфи чен и ефикасен ErmC инхибитор, нанацелена е била позицията на свързване за кофактора или 5-аденозил-1_-метионина. З-аденозил-Ь-метионинът е показан подолу като съединение 42.
Кристалната структура на ErmC' показва, че позицията на З-аденозил-Lметионина е съставена от два първостепенни джоба, в които се настаняват адениновият пръстен и метионинът. В допълнение има и трети джоб, в който може да се настани претърпяващият метилиране r-РНК аденин. За да се установи SAR в тази позиция, бе генерирана библиотека от аналози на аденозина, заместени при N6 и/или при 5 хидроксила. Тези позиции на вариация в библиотеката са представени по-долу като съединение 43.
WO 99/45379
PCT/US99/04967 • ♦ · ·
Експресия и пречистване на ErmC
Векторът на експресия pTERM31 бе конструиран чрез усилване посредством полимеризирана верижна реакция (ПВР) на гена ErmC' и на насочения срещу преместването на протеиновата молекула цистрон kdsB от pERM. Подклониране на продукта на ПВР в рЕТ24+ (Novagen, Madison, WI) бе осъществено като се използваха позициите и H/ndlll, включени в опашатите ПВР праймери. Този нов конструкт позволи експресията на ErmC1 чрез транслационно съчленяване с kdsB под контрола на промотера Т71ас. pTERM31 плазмид (спирала или верига на ДНК, способна за генетична репликация, транспортно средство в процедсите на рекомбиниране на ДНК) бе преобразуван в Е соН щама BL219(DE3)/pLysS (Novagen) и резултиращият щам бе използван за получаване на ErmC'. Преобразувани клетки бяха израствани при 27.5°С в New Brunswick Scientific (Edison, NJ) Micros ферментор, съдържащ 101 от Superbroth (BIO 101, La Jolla, СА), допълнен c канамицин, хлорамфеникол и глюкоза. Когато оптическата плътност на културата достигна 1.10, експресията на ErmC1 бе предизвикана чрез добавянето на 1 милимол изопропил β-dтиогалактопираносид (IPTG). Клетки бяха прибрани 400 минути след индукцията.
Активна маса от замразени клетки (200-250 г) бе размразена при стайна температура и наново суспензирана в 5 -10 обеми от студен лизисен (разграждащ клетките чрез лизини) буфер (50 милимола Tris, 5 милимола 1,4-дитиотреитол (ДТТ), 1 милимол фенилметилсулфонат флорид (фМСФ), 2 милимола етилендиаминтетраоцетна киселина (ЕДТК), 0.2% Triton Х-100 с рН=7.8. Клетките бяха лизирани с Френска преса и отпадъчните клетки - отстранени чрез центрофугиране. Повърхностният слой бе диализиран в продължение на цялата нощ на фона на 20 л Tris-ДТТ-глицерол-магнезиев (ТДГМ) буфер с рН=7.8 (50 милимола Tris, 5 милимола ДТТ, 10% глицерол, 10 милимола MgCI^· След това диализатът бе
| WO 99/45379 | PCT/US99/04967 |
| ... ...$3 .. .. .. .. .· .· .: . : :: ; |
поставен в Sepharose Fast Flow колона (Pharmacia), която бе предварително уравновесена в ТДГМ буфер. Бяха изпробвани фракции относно тяхната активност по отношение на трансаминазния пренос (от едно в друго съединение) на метил и фракциите, съдържащи ErmC,1 бяха изляти и поставени в TSK SP-5PW колона (TosoHaas, Montgomeryville, РА) и елюирани с помощта на градиент на
NaCI. Така пречистеният протеин бе концентриран на мембрана, YM-10 (Amicon).
Кристална структура на ErmC
Кристали на ErmC' бяха израствани чрез метода на дифузия на пари от висяща капка. Капки, съдържащи 5 - 8 мгс/милилитър ErmC' в 25 милимола Tris/CI, 100 милимола NaCI, 2 милимола ДТТ, 10 обемни% глицерол с рН=7.5, бяха поставени в равновесие на фона на резервоар съдържащ 100 милимола Tris, 500 милимола NH4(SO)4,15% PEG 8000 с рН=7.8. Кристали се появиха в разтояние на един ден и растяха до пълния им размер в продължение на една седмица. Кристалите принадлежаха към пространствената група Р43212. Структурата на ErmC' в тази пространствена група бе определена чрез молекулярно заместване при разделителна способност 2.2 ангстрьома като се използваше кристалната структура на ErmC в пространствената група Р6 (Bussiere et al., Biochemistry, Vol. 37, pp. 7103 - 7112). Тризмерната структура на израстналите при тези условия кристали показва незаета активна позиция, правеща тази система подходяща във висока степен за прилагане на метода CrystalLEAD™.
Скрининг
Аденозинната библиотека се състои от 59 съединения. Библиотеката бе разделена на 7 смеси от по 8 - 9 различими по форма съединения и скринингът бе виеш·
WO 99/45379 PCT/US99/04967 ·· »··64 ·· .. ., ..
• ; .· ···· ··. , ,· ; · ; ;*··· · ί ί ϊ ί .
.........’ *..··..· извършен чрез CrystalLEAD™ метода. По-конкретно, всяко съединение бе разтворена в 100% ДМСО до крайна концентрация от 1 мол (иди до насищане за по-слабо разтворимите съединения). Еднакви обеми от всяко съединение бяха смесени да образуват смес от по 10. Единични кристали ErmC бяха поместени в 50 микролитра от 20%-ен PEG 8000, 0.3 мола амониев сулфат, 10% глицерол с рН=7.7 и 0.5 - 0.8 микролитра на сместа на съединенията, добавени да дадат от 1 до 1.6% ДМСО и 3.3 до 5.2 микромола крайна концентрация на индивидуално съединение. На кристалите бе дадена възможност да достигнат равновесие за 3 4 часа.
Данните бяха събирани на ротиращ аноден източник Rigaku RTP 300 RC с RAXISII, MAR аноден детектор на изображение или MAR CCD детектор. За системата с анодно изображение типичните данни се състояха от 15 - 20 2° осцилации с 20 - 30 минутни експозиции, докато при използване на детектора CCD15-20 2.0° осцилации бяха експозирани за 8 -15 минути. Типични използваеми данни бяха укомплектовани на 80 - 90% при разделителна способност 3.4-3.6 с разсейващи R-фактори от 7 до 16%. Това се изискваше за адекватно визуализиране и идентифициране на инхибитори в Fo-Fc или 2Fo-Fc картите. Отправният модел за тези карти е бил доусъвършенстван до разделителна способност 2.2 A (R=22%, Rfree=25%). Данните бяха обработени с програмен продукт DENZO, а картите на електронната плътност бяха пресметнати с продукта XPLOR.
С помощта на мощен компютър Silicon Graphics INDIGO2 с висока разделителна способност, прилаган при интензивни графични процеси, бяха проучени карти на електронната плътност като се използваше програмния продукт QUANTA 97. формата на електронната плътност при активната позиция бе идентифицирана визуално чрез формата на едно или повече съединения в сместа за посочване на положително попадение или чрез подредени водни
| WO 99/45379 | PCT/US99/04967 |
| .· .* .: : :: : |
молекули, свидетелстващи за отсъствие на свързване. За експерименти, които имат за резултат положително попадение, съответното съединение бе визуално преместено в електронната плътност. Картите на електронната плътност бяха проверени също така за произволни изменения в протеиновата структура, и ако такива бяха наблюдавани, то са осъществени съответстващи структурни видоизменения. Следователно след проучването на картата/етапа на пригаждане на съединение стана известна детайлизираната триизмерна структура на комплекса съединение: протеин.
Две попадения бяха установени при скрининга на ErrnC аденозинови аналози (съединения 44 и 45). Фигури 13 и 14 показват кристалната структура на комплексите на съединения 44 и 45 с ErmC1.
45
При всички случаи формата на електронната плътност идентифицира свързващото съединение. Намерено бе, че свързването при хидрофобната субституция се осъществява по дължината на частично експозирана хидрофобна повърхност, което подсказва за предпочитано взаимодействие, което може да е допринесло за свързването на горните две съединения, позволявайки им да бъдат извадени на показ като попадения. Не бяха установени попадения съдържащи субституция в позиция 5ΌΗ. Усилено съединение на съединения 44 и 45 съдържаше оптимизиран субституциент на индан в тази хидрофобна позиция.
Claims (4)
1. Процес за идентифициране на лиганд към биомолекула-мишена, характеризиращ се с това, че се състои от:
а) получаване на кристал на биомолекула-мишена;
Ь) подлагане на кристала на биомолекулата-мишена на въздействие в една или повече изпитателни проби и
с) получаване на дифрактограма на кристала за определяне дали е образуван лиганд/рецепторен комплекс.
2. Процесът съгласно претенция 1 се характеризира по нататък с това, че съдържа етап на получаване на дифрактограма на кристала на биомолекулата-мишена преди подлагането му на въздействие в изпитателните проби и сравняване на дифрактограмата на биомолекулата-мишена преди и след подлагането кристала на въздействие.
3. Процесът съгласно претенция 1 се характеризира по нататък с това, че съдържа етап на преобразуване на дифрактограмата в карта на електронната плътност.
4. Процесът съгласно претенция 3 се характеризира по нататък с това, че съдържа етап на преобразуване на картата на електронната плътност в структура.
WO 99/45379
PCT/US99/04967 .·*. ·* ·· ·· • · О/ · · · · · ·· • · · • · · ··
Процесът съгласно претенция 1 се характеризира с това, че биомолекулата-мишена е подложена на въздействие в изпитателна проба чрез всмукване на кристала на биомолекулата-мишена в разтвор, който съдържа изпитателната проба.
Процесът съгласно претенция 1 се характеризира с това, че биомолекулата-мишена е подложена на въздействие в изпитателните проби чрез всмукване на кристала на биомолекулата-мишена в разтвор, съдържащ смес от изпитателните проби.
Процесът съгласно претенция 1 се характеризира с това, че биомолекулната мишена е подложена на въздействие в изпитателната проба чрез съвместно кристализиране на биомолекулата-мишена с изпитателната проба.
Процесът съгласно претенция 1 се характеризира с това, че биомолекулната мишена е подложена на въздействие в изпитателните проби чрез съвместно кристализиране на биомолекулата-мишена със смес от изпитателни проби.
Процесът съгласно претенция 6 се характеризира с това, че изпитателните проби в сместа са различими по форма.
WO 99/45379
PCT/US99/04967 ·· фф • φ φ φ • φ φ φ φ · φ φ · • φ φ φ φφ Φ·
10. Процесът съгласно претенция 8 се характеризира с това, че изпитателните проби в сместа са различими по форма.
11. Процесът съгласно претенция 1 се характеризира с това, че лигандът е биологически активен фрагмент от комплекса.
12. Процесът съгласно претенция 1 се характеризира с това, че биомолекулата-мишена е полипептид.
13. Процесът съгласно претенция 1 се характеризира с това, че биомолекулата-мишена е полипептид, новосъздаден чрез генно инженерство.
14. Биологически активен фрагмент идентифициран чрез процеса съгласно претенция 11.
15. Процесът съгласно претенция 1 се характеризира с това, че гореказаният лиганд е водещо съединение.
16. Процес на конструиране на лиганд за биомолекула-мишена, характеризиращ се с това, че се състои от:
а) получаване на кристал на биомолекула-мишена;
WO 99/45379
PCT/US99/04967 ·· • · · * · • · · · • · · · ·· ·· fi |
20.
*!
fi
I
I
20.
i!
b) идентифициране на най-малко два лиганда за биомолекулата-мишена чрез рентгенографски скрининг;
c) определяне на пространствената ориентация на лигандите, когато те са свързани с биомолекулатамишена; и
d) съвместно свързване на лигандите съгласно тяхната пространствена ориентация за образуване на лиганда.
Процесът съгласно претенция 16 се характеризира с това, че пространствената ориентация на свързаните лиганди е опреде лена чрез образуване на комплекс мулти-лиганд/биомолекуламишена и изработване на рентгенографска кристална структура на комплекса мулти-лиганд/биомолекула-мишена.
Процесът съгласно претенция 16 се характеризира с това, че един лиганд е свързан с биомолекулата-мишена преди друг лиганд да е свързан с биомолекулата-мишена.
Процесът съгласно претенция 16 се характеризира се с това, че лигандът е биологически активен фрагмент.
Процесът съгласно претенция 16 се характеризира с това, че биомолекулата-мишена е полипептид.
WO 99/45379
PCT/US99/04967
21.
Процесът съгласно претенция 16 се характеризира с това, че биомолекулата-мишена е полипептид, новосъздаден чрез генно инженерство.
22. Биологически активен фрагмент конструиран чрез процеса съгласно претенция 19.
23. Процесът съгласно претенция 16 се характеризира с това, че гореказаният лиганд е водещо съединение.
24. Процес на конструиране на лиганд за биомолекула-мишена, характеризиращ се с това, че се състои от:
a) получаване на кристал на биомолекула-мишена;
b) идентифициране на лиганд към биомолекулата-мишена чрез рентгенографски скрининг;
c) изготвяне на производни на лиганда.
*
25. Процесът съгласно претенция 24 се характеризира с това, че гореказаният лиганд е водещо съединение.
26. Процесът съгласно претенция 24 се характеризира с това, че лигандът е биологически активно съединение.
WO 99/45379 ·· • · ···· • ·
PCT/US99/04967 ···· • · ·· • · ·· • · ·· • · ·· ··99
27. Процесът съгласно претенция 24 се характеризира с това, че биомолекулата-мишена е полипептид.
28. Процесът съгласно претенция 24 се характеризира с това, че биомолекулата-мишена е полипептид, новосъздаден чрез генно инженерство.
29. Водещо съединение идентифицирано чрез процеса съгласно претенция 25.
30. Биологически активно съединение конструирано чрез процеса съгласно претенция 25.
31. Биологически активно съединение конструирано чрез процеса съгласно претенция 26.
32. Процес на образуване на кристал, притежаващ лесно достъпна активна позиция от биомолекула, характеризиращ се с това, че съдържа:
a) съвместно кристализиране на биомолекулата с разградим лиганд; и
b) разграждане на лиганда след като кристала е формиран.
WO 99/45379 ···· • · ·· • · ·· • 9 ···· • ·9 »♦··
PCT/US99/04967 ·· ·· • · · · • · · · • · · · • · · · ·· ··
33. Процесът съгласно претенция 32 се характеризира с това, че активната позиция на биомолекулата разгражда лиганда.
34. Процесът съгласно претенция 32 се характеризира по- нататък с това, че съдържа допълнителни разграждащи агенти за разграждане на лиганда.
35. Процесът съгласно претенция 32 се характеризира с това, че гореказаният лиганд се разгражда спонтанно.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US3618498A | 1998-03-06 | 1998-03-06 | |
| PCT/US1999/004967 WO1999045379A2 (en) | 1998-03-06 | 1999-03-05 | Ligand screening and design by x-ray crystallography |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG104802A true BG104802A (bg) | 2001-04-30 |
Family
ID=21887121
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG104802A BG104802A (bg) | 1998-03-06 | 2000-09-27 | Скрининг и конструиране на лиганди чрез рентгеноструктурен анализ |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6297021B1 (bg) |
| EP (1) | EP1068531B1 (bg) |
| JP (1) | JP2002506206A (bg) |
| KR (1) | KR20010041653A (bg) |
| CN (2) | CN101221138A (bg) |
| AT (1) | ATE375510T1 (bg) |
| AU (3) | AU2887099A (bg) |
| BG (1) | BG104802A (bg) |
| BR (1) | BR9908563A (bg) |
| CA (1) | CA2321968A1 (bg) |
| DE (1) | DE69937292T2 (bg) |
| HU (1) | HUP0101959A3 (bg) |
| IL (1) | IL137758A0 (bg) |
| NO (1) | NO20004433L (bg) |
| PL (1) | PL343264A1 (bg) |
| SK (1) | SK13242000A3 (bg) |
| TR (4) | TR200101127T2 (bg) |
| WO (2) | WO1999045389A2 (bg) |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030049678A1 (en) * | 1999-03-05 | 2003-03-13 | Nienaber Vicki L. | Ligand screening and design by X-ray crystallography |
| US7214540B2 (en) * | 1999-04-06 | 2007-05-08 | Uab Research Foundation | Method for screening crystallization conditions in solution crystal growth |
| US20020164812A1 (en) * | 1999-04-06 | 2002-11-07 | Uab Research Foundation | Method for screening crystallization conditions in solution crystal growth |
| US7244396B2 (en) | 1999-04-06 | 2007-07-17 | Uab Research Foundation | Method for preparation of microarrays for screening of crystal growth conditions |
| US7250305B2 (en) | 2001-07-30 | 2007-07-31 | Uab Research Foundation | Use of dye to distinguish salt and protein crystals under microcrystallization conditions |
| US6630006B2 (en) * | 1999-06-18 | 2003-10-07 | The Regents Of The University Of California | Method for screening microcrystallizations for crystal formation |
| US7108970B2 (en) | 2000-01-07 | 2006-09-19 | Transform Pharmaceuticals, Inc. | Rapid identification of conditions, compounds, or compositions that inhibit, prevent, induce, modify, or reverse transitions of physical state |
| US6977723B2 (en) | 2000-01-07 | 2005-12-20 | Transform Pharmaceuticals, Inc. | Apparatus and method for high-throughput preparation and spectroscopic classification and characterization of compositions |
| GB0008563D0 (en) | 2000-04-07 | 2000-05-24 | Cambridge Discovery Chemistry | Investigating different physical and/or chemical forms of materials |
| US7037889B2 (en) * | 2000-09-13 | 2006-05-02 | Praecis Pharmaceuticals Inc. | Pharmaceutical compositions for sustained drug delivery |
| US7806980B2 (en) | 2000-12-23 | 2010-10-05 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Method for crystallizing human beta secretase in complex with an inhibitor |
| US7601528B1 (en) | 2000-12-23 | 2009-10-13 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Crystallization and structure determination of glycosylated human beta secretase, an enzyme implicated in alzheimer's disease |
| US7217556B1 (en) | 2000-12-23 | 2007-05-15 | Pfizer Inc | Crystallization and structure determination of glycosylated human beta secretase, an enzyme implicated in Alzheimer's disease |
| US7670429B2 (en) | 2001-04-05 | 2010-03-02 | The California Institute Of Technology | High throughput screening of crystallization of materials |
| GB2391941A (en) * | 2001-04-11 | 2004-02-18 | Emerald Biostructures Inc | Screening methods for identifying ligands |
| US7384773B1 (en) * | 2001-05-10 | 2008-06-10 | Pfizer Inc | Crystal of HIV protease-cleaved human beta secretase and method for crystallization thereof |
| US7524668B1 (en) * | 2001-05-10 | 2009-04-28 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Crystal of human beta secretase having monoclinic space group symmetry C2 and methods for crystallization thereof |
| US7130747B1 (en) * | 2001-05-31 | 2006-10-31 | Los Alamos National Security, Llc | High throughput screening of ligand binding to macromolecules using high resolution powder diffraction |
| IL151012A0 (en) * | 2001-08-03 | 2003-02-12 | Ribosomes Structure And Protei | Ribosomes structure and protein synthesis inhibitors |
| JP2005500853A (ja) * | 2001-08-22 | 2005-01-13 | ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト | ヒト３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼのモジュレーターの同定方法 |
| US20030211538A1 (en) * | 2001-12-03 | 2003-11-13 | Ming Luo | CAP-Gly domain structure and uses thereof |
| US20040171062A1 (en) * | 2002-02-28 | 2004-09-02 | Plexxikon, Inc. | Methods for the design of molecular scaffolds and ligands |
| US7469036B2 (en) * | 2002-04-19 | 2008-12-23 | Los Alamos National Security, Llc | Analysis of macromolecules, ligands and macromolecule-ligand complexes |
| US7442537B1 (en) | 2002-05-10 | 2008-10-28 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Crystals of unliganded beta secretase and/or beta secretase-like proteins and the use thereof |
| US6989392B2 (en) * | 2002-06-18 | 2006-01-24 | Abbott Laboratories | 2-Aminoquinolines as melanin concentrating hormone receptor antagonists |
| CN1668918A (zh) * | 2002-07-24 | 2005-09-14 | 基德姆生物科学有限公司 | 药物发现的方法 |
| EP1558751A4 (en) * | 2002-09-16 | 2007-08-22 | Plexxikon Inc | CRYSTALLINE STRUCTURE OF PROTEIN KINASE PIM-1 |
| WO2006078228A1 (en) * | 2002-09-16 | 2006-07-27 | Plexxikon, Inc. | Methods for the design of molecular scaffolds and ligands |
| AU2003290780B2 (en) * | 2002-11-14 | 2009-05-07 | The Scripps Research Institute | Crystalline form of fatty acid amine hydrolase (FAAH) |
| WO2004057340A1 (en) * | 2002-12-23 | 2004-07-08 | Astex Technology Limited | Synthesis and screening of ligands using x-ray crystallography |
| US20050170431A1 (en) * | 2003-02-28 | 2005-08-04 | Plexxikon, Inc. | PYK2 crystal structure and uses |
| AU2004230519A1 (en) * | 2003-04-11 | 2004-10-28 | Sgx Pharmaceuticals, Inc. | Compound libraries and methods for drug discovery |
| US20050079548A1 (en) * | 2003-07-07 | 2005-04-14 | Plexxikon, Inc. | Ligand development using PDE4B crystal structures |
| DE10336110B4 (de) * | 2003-08-06 | 2008-01-03 | Proteros Biostructures Gmbh | Vorrichtung und Verfahren zum Behandeln eines Proteinkristalls |
| WO2005017533A1 (de) * | 2003-08-06 | 2005-02-24 | Proteros Biostructures Gmbh | Verfahren zur identifizierung von schwach bindenden molekülfragmenten mit ligandeneigenschaften, wobei die molekülfragmente als mikrotropfen einer entsprechenden lösung auf den kristall aufgebracht werden |
| WO2005028624A2 (en) * | 2003-09-15 | 2005-03-31 | Plexxikon, Inc. | Molecular scaffolds for kinase ligand development |
| DE10343522B4 (de) * | 2003-09-19 | 2008-09-18 | Proteros Biostructures Gmbh | Verfahren und Speichermedium zur Steuerung der Behandlung eines Kristalls mit einer Flüssigkeit |
| EP1899370A4 (en) * | 2005-05-12 | 2009-11-11 | Cytopia Res Pty Ltd | CRYSTALLINE STRUCTURE AND USE THEREOF |
| US20090317850A1 (en) * | 2008-06-20 | 2009-12-24 | Tomoko Sunami | Crystal Structure of Human 70KD Ribosomal Protein S6 Kinase 1 Kinase Domain |
| CN101339167B (zh) * | 2008-08-27 | 2011-12-14 | 中国药科大学 | 基于靶蛋白亲和选择的活性成分高通量筛选方法 |
| DE102008049675A1 (de) | 2008-09-30 | 2010-04-01 | Markus Dr. Heinrich | Verfahren zur Herstellung von 3-Aminobiphenylen |
| WO2010100847A1 (ja) * | 2009-03-03 | 2010-09-10 | 独立行政法人国立高等専門学校機構 | 生体高分子の結晶化装置、生体高分子の結晶化溶液セル、生体高分子の配向制御方法、生体高分子の結晶化方法、及び生体高分子の結晶 |
| CN102101886A (zh) | 2009-12-18 | 2011-06-22 | 四川辉阳生命工程股份有限公司 | 构象改变的重组干扰素晶体、其三维结构及应用 |
| JP5598238B2 (ja) * | 2010-10-08 | 2014-10-01 | 株式会社リコー | 画像形成装置 |
| CN106033064B (zh) * | 2015-03-10 | 2019-05-07 | 上海上药信谊药厂有限公司 | 胆维丁测定方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5112755A (en) | 1982-04-15 | 1992-05-12 | Genentech, Inc. | Preparation of functional human urokinase proteins |
-
1999
- 1999-03-01 AU AU28870/99A patent/AU2887099A/en not_active Withdrawn
- 1999-03-01 WO PCT/US1999/004518 patent/WO1999045389A2/en active Application Filing
- 1999-03-05 CA CA002321968A patent/CA2321968A1/en not_active Abandoned
- 1999-03-05 BR BR9908563-1A patent/BR9908563A/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-03-05 IL IL13775899A patent/IL137758A0/xx unknown
- 1999-03-05 PL PL99343264A patent/PL343264A1/xx unknown
- 1999-03-05 AU AU29878/99A patent/AU767991B2/en not_active Ceased
- 1999-03-05 TR TR2001/01127T patent/TR200101127T2/xx unknown
- 1999-03-05 AT AT99911174T patent/ATE375510T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-03-05 JP JP2000534866A patent/JP2002506206A/ja active Pending
- 1999-03-05 CN CN200710181713.2A patent/CN101221138A/zh active Pending
- 1999-03-05 WO PCT/US1999/004967 patent/WO1999045379A2/en active IP Right Grant
- 1999-03-05 DE DE69937292T patent/DE69937292T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-05 TR TR2001/01200T patent/TR200101200T2/xx unknown
- 1999-03-05 EP EP99911174A patent/EP1068531B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-05 US US09/263,904 patent/US6297021B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-05 SK SK1324-2000A patent/SK13242000A3/sk unknown
- 1999-03-05 TR TR2001/01129T patent/TR200101129T2/xx unknown
- 1999-03-05 CN CNB998058866A patent/CN100354627C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-05 TR TR2000/02572T patent/TR200002572T2/xx unknown
- 1999-03-05 KR KR1020007009855A patent/KR20010041653A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-03-05 HU HU0101959A patent/HUP0101959A3/hu unknown
-
2000
- 2000-09-05 NO NO20004433A patent/NO20004433L/no not_active Application Discontinuation
- 2000-09-27 BG BG104802A patent/BG104802A/bg unknown
-
2003
- 2003-10-16 AU AU2003255167A patent/AU2003255167A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR9908563A (pt) | 2000-11-21 |
| US6297021B1 (en) | 2001-10-02 |
| PL343264A1 (en) | 2001-07-30 |
| CN101221138A (zh) | 2008-07-16 |
| DE69937292T2 (de) | 2008-07-03 |
| WO1999045389A3 (en) | 2000-02-10 |
| TR200101200T2 (tr) | 2002-02-21 |
| HUP0101959A2 (hu) | 2001-09-28 |
| EP1068531A2 (en) | 2001-01-17 |
| AU2003255167A1 (en) | 2003-11-13 |
| CA2321968A1 (en) | 1999-09-10 |
| TR200002572T2 (tr) | 2000-11-21 |
| WO1999045389A2 (en) | 1999-09-10 |
| CN100354627C (zh) | 2007-12-12 |
| AU767991B2 (en) | 2003-11-27 |
| NO20004433L (no) | 2000-11-06 |
| AU2987899A (en) | 1999-09-20 |
| SK13242000A3 (sk) | 2001-03-12 |
| DE69937292D1 (de) | 2007-11-22 |
| ATE375510T1 (de) | 2007-10-15 |
| IL137758A0 (en) | 2001-10-31 |
| TR200101129T2 (tr) | 2002-06-21 |
| KR20010041653A (ko) | 2001-05-25 |
| EP1068531B1 (en) | 2007-10-10 |
| AU2887099A (en) | 1999-09-20 |
| WO1999045379A2 (en) | 1999-09-10 |
| TR200101127T2 (tr) | 2002-06-21 |
| CN1299467A (zh) | 2001-06-13 |
| HUP0101959A3 (en) | 2003-10-28 |
| JP2002506206A (ja) | 2002-02-26 |
| WO1999045379A3 (en) | 1999-11-25 |
| NO20004433D0 (no) | 2000-09-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BG104802A (bg) | Скрининг и конструиране на лиганди чрез рентгеноструктурен анализ | |
| ES2668207T3 (es) | Descubrimiento innovador de composiciones terapéuticas, de diagnóstico y de anticuerpos relacionadas con fragmentos de proteínas de metionil-ARNt sintetasas | |
| JP2020101548A (ja) | 同位体によりコード化されたレポーターによる多重検出 | |
| JP6195858B2 (ja) | Ｔｆｐｉ阻害剤および使用方法 | |
| Rein et al. | Serpin–glycosaminoglycan interactions | |
| WO2009072726A1 (en) | Method for large scale preparation of the active domain of human protein tyrosine phosphatase without fusion protein | |
| US20070140967A1 (en) | Agents and methods for analyzing protein interactions | |
| JP2000510454A (ja) | カルシウム依存性結合タンパク質の改変されたリガンド | |
| Hayne et al. | We FRET so you don’t have to: New models of the lipoprotein lipase dimer | |
| Grintsevich et al. | Mapping the cofilin binding site on yeast G-actin by chemical cross-linking | |
| WO2009072728A1 (en) | Method for diagnosis of disease using quantitative monitoring of protein tyrosine phosphatase | |
| US20020015943A1 (en) | Assays, methods and means relating to the modulation of levels of nuclear beta-catenin | |
| Martin et al. | Molecular architecture and modifications of full-length myocilin | |
| JP4832291B2 (ja) | ラベル用物質とキメラ物質、これらの物質の作製方法、並びに該ラベル用物質を用いて生体物質を捕捉、構造解析又は／及び同定する方法 | |
| McPherson et al. | The X-ray crystal structure of human endothelin 1, a polypeptide hormone regulator of blood pressure | |
| JP2003510053A (ja) | ヘパラナーゼ蛋白質ファミリーの１種、ヘパラナーゼ−２ | |
| Trenker et al. | Structural dynamics of the active HER4 and HER2/HER4 complexes is finely tuned by different growth factors and glycosylation | |
| JP7011815B2 (ja) | がんの判定方法 | |
| US20030049678A1 (en) | Ligand screening and design by X-ray crystallography | |
| WO2002077623A1 (en) | Probe for visualizing phosphorylation/dephosphorylation of protein and method of detecting and quantifying phosphorylation/dephosphorylation of protein | |
| CZ20003246A3 (cs) | Způsob vyhledávání a navrhování ligandů rentgenovou krystalografií | |
| JP7370568B2 (ja) | 蛍光ポリペプチドの変異体、及びその利用 | |
| MXPA00008696A (en) | Ligand screening and design by x-ray crystallography | |
| Issaian | Mass Spectrometry Methods to Elucidate Protein-Protein Interactions, Biochemical and Structural Characterization of Olduvai Protein Domains, and the Role of Band 3 as a Master Regulator of Red Blood Cell Metabolism and Storage Quality | |
| Perry-Hauser | Arrestins: multifunctional regulators of signaling pathways |