JP2000510454A

JP2000510454A - カルシウム依存性結合タンパク質の改変されたリガンド

Info

Publication number: JP2000510454A
Application number: JP09537861A
Authority: JP
Inventors: ネリ，ダリオ; ポールウィンター，グレゴリー
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1996-04-25
Filing date: 1997-04-25
Publication date: 2000-08-15
Also published as: AU729591B2; EP0938547A1; AU2398997A; US6316409B1; WO1997040142A1; GB9608510D0; CA2250921A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、カルシウム依存性結合タンパク質についての野生型リガンドのアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を含み、カルシウム依存性結合タンパク質についてのリガンドの親和性の増強をもたらす改変を有する、カルシウム依存性結合タンパク質に結合し得るリガンドに関する。

Description

【発明の詳細な説明】カルシウム依存性結合タンパク質の改変されたリガンド緒言本発明は、結合対を用いての分子の標的化、検出、固定化、および精製に関する。詳細には、本発明は、カルシウム依存性結合タンパク質およびそのリガンドの使用に関する。本発明は、カルシウム依存性結合タンパク質についての改善された親和性を有するリガンドを提供する。本発明の結合対は、生物学的手順に利用される現在利用可能な結合対系に対して魅力的な選択肢を提供する。発明の背景用語「結合対」は互いに高い親和性で結合する２つの分子をいう。多くの結合対系は、現在、タグ化された化合物の精製および標的化のために存在する。現在最も広く使われている系は、インビボでの腫瘍標的化方法にも用いられてきたビオチン-ストレプトアビジン結合対である(Paganelliら，1991)。さらに、mycあるいはFlagタグを発現している組換え融合タンパク質が、これらのタグに対する抗体を使って単離および精製されている(MunroおよびPelham,1986;Hoppら，1988 )。ポリhisペプチドテールは組換えタンパク質に遺伝的に融合され、そしてニッケルでコートされたアガロースまたはアフィニティーカラムを使って精製されている(Skerraら，1991)。ストレプトアビジン結合strepタグ(SchmidtおよびSkerr a，1993)は同様の適用で使われている。しかし、上記の例のそれぞれの適用は限られている。アフィニティー精製のような技術は、厳しい溶出プロトコルで組換えタンパク質の機能を損なうことのないように、特異的だが低い親和性相互作用を必要とする。逆に、標的化および特異的固定化は、両方とも、長い半減期の相互作用での結合対とタグとの高い親和性結合を必要とする。結合対を使う従来技術で記載された系はこの融通性を有さず、従って、普遍的に適用し得ない。カルモジュリンは、広範囲の酵素を調節するカルシウム依存性結合タンパク質であり、そして細胞内シグナル伝達において重要な役割を担う。それはまた、高い親和性でリガンドに結合し得る小さなタンパク質の、わずかな例のうちの１つである。それらの大きさが小さいために、カルモジュリン-リガンド複合体は、タンパク質の会合および解離の研究で便利なモデルとして使われてきた。高親和性リガンド基質との複合体におけるカルモジュリンの３次元構造の解明以来、この系は、タンパク質が高い親和性の相互作用において互いを認識する機構の研究のために扱い易い。係属中の特許出願WO95/12672は、組換えポリペプチドの検出、固定化、標的化、および精製のための、カルモジュリンおよびカルモジュリンリガンドを含む結合対の使用を開示する。この系は、結合相互作用が、カルシウムキレート剤の使用を通して容易に制御され得るカルシウム濃度の変化により改変され得るので、魅力的である。このことは、実験または治療の道具としての結合対の適用性を大いに広げる。 Stofko-Hahnら,(1992)は、ウサギ骨格筋ミオシン軽鎖キナーゼ(sMLCK)のC末端由来のカルモジュリン結合リガンドタグと組換えタンパク質との融合物を作製した。彼らは、これを親和性支持体上での精製ストラテジーにおいて使用した。高レベルのカルシウムの存在下で、この系は特異的な高い親和性相互作用を示し、その結合対の解離定数は３nMのオーダーである。EGTA（カルシウムキレート剤の１つ）の添加は、相互作用の親和性を低下させて非常に温和な溶出プロトコルを可能にし、そして天然のタンパク質構造の変性または破壊がありそうにないことを意味する。しかし、カルモジュリンリガンドへのカルモジュリンの親和性は高いとはいえ、多くの標的化、固定化、特に治療的適用に充分なほど高くはない。多くの治療的適用、ナノモルより小さいかまたはピコモルより小さい解離定数、高い会合速度定数および極度に低い解離速度定数は、複合体の効率的な標的化および結合相互作用の十分に長い半減期を確実にするために必要である。ビオチン-ストレプトアビジン結合対は、実験的および治療的の両方で、タンパク質の標的化、精製、および固定化のために広く使用される。この系の主な魅力は、結合対の相互作用の高い親和性（Ｋ_d=10^-15Ｍ）にある。しかし、この結合対を使用することの著しい不利益は、ヒトの体におけるストレプトアビジンの免疫原性である。これは、治療的適用へのこの系の有用性を大きく制限する。このように、高い親和性相互作用および低い免疫原性の両方を有する、実験的に扱い易い結合対系についての大きな要求がある。発明の説明本発明によれば、カルシウム依存性結合タンパク質に結合し得るリガンドが提供される。このリガンドは、カルシウム依存性結合タンパク質の野生型リガンドの配列に相当するアミノ酸配列を含み、カルシウム依存性結合タンパク質へのリガンドの増強された親和性をもたらす改変を有する。野生型リガンドとは、カルシウム依存性結合タンパク質に結合し得る、天然に存在するリガンドを意味する。本発明により定義されるすべてのリガンドは、カルシウム依存性結合タンパク質と相互作用する、天然に存在するペプチドリガンドの結合ドメインの改変を含むペプチドである。適切なリガンドが誘導され得る野生型リガンドの例は、骨格のミオシン軽鎖キナーゼ、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼ、マストパラン、メリチン、AC-28、およびNO-30であり、それらはすべてカルモジュリンに対して高い親和性結合を示す。好ましくは、本発明のリガンドは、改変された骨格ミオシン軽鎖キナーゼリガンドを含む。上記の改変は、カルシウム依存性結合タンパク質へのリガンドの親和性の改善をもたらす、野生型リガンドにおける１つ以上のアミノ酸の置換、挿入、または欠失からなり得る。本発明のリガンドは、20個まで、好ましくは10個まで、さらに好ましくは５個までの改変を野生型リガンドのアミノ酸配列に含み得る。挿入および欠失とは、それぞれ、１つ以上のアミノ酸を導入または省略して野生型リガンドのアミノ酸配列を伸長するかまたは短縮すること、従ってカルシウム依存性結合タンパク質へのその親和性を改変することを意味する。好ましくは、改変は、野生型リガンドにおける１つ以上のアミノ酸の置換を含む。置換は、野生型ペプチド配列における天然に存在するアミノ酸の代用残基での置き換えを含む。好ましい代用残基はアラニンまたはバリンである。これらのアミノ酸は両方とも、比較的無害の側鎖を有して疎水性であり、従って両方ともペプチド構造の混乱を最小限にしてのらせん状ペプチド内での置換に理想的である。このような分子の生成、同定、および操作を記載する十分に研究された実施例が本明細書中に開示される。好ましくは、代用残基はアラニンである。個々のアラニン残基は既にタンパク質の配列中に挿入されている。ClacksonおよびWells,(1995)は、ヒト成長ホルモンレセプター（hGHbp）の配列における接触残基の系統だった置換を、近年報告した。この「アラニンスキャニング」技術により、これらの変異タンパク質によって示される結合親和性の減少の定量化を通して、結合相互作用に関与する残基が同定された。バーネース（barnase:Bacillus amylolique-faciensの細胞外RNase）の生理学的阻害剤であるバースター（barstar）もまたこのような実験的な操作に供されている。バーネース-バースター複合体により所有される非常に高い会合速度定数（3.8×10⁹s^-1M^-1）は、４つの酸性側鎖アミノ酸残基に起因する。これらがすべて個々にアラニンへと変異した場合、これは会合速度定数の減少を引き起こす。同時に、バースターの安定性においてわずかな増加がみられ、従って、タンパク質は第一にそれらの安定性よりも機能を最適化するように進化すると仮定されている(Schrieberら,1994)。驚くべきことに、本発明の改変されたリガンドは、増加した結合親和性および会合定数を示す。カルシウム依存性結合タンパク質に結合可能なリガンドは、結合親和性を最大にすることは出来なかったが、十分に高い結合親和性を達成することにより、それらの生物学的機能を果たすように進化してきたようである。複数のアミノ酸置換もまた本発明で請求され、そして本明細書中に記載される。個々の単一アミノ酸置換の組合せは異積効果を与え得、カルシウム依存性結合タンパク質についてのリガンドのずっと増強された親和性を導く。カルシウム依存性結合タンパク質とは、リガンドに結合し得るタンパク質であって、ここでリガンドの解離定数がカルシウムイオンの存在下で減少する、すなわち、結合がカルシウムイオンの存在下でずっと強いタンパク質を意味する。本発明のリガンドは、多くの生物学的な適用、例えば、タンパク質の精製および検出、二機能性の（巨大）分子の条件的形成、顕微鏡法、FACS分析、マイクロセンサーチップ上へのタンパク質の固定化、ならびに腫瘍標的化に適切である。これらの適用の多くでは、カルシウム依存性結合タンパク質-ペプチドリガンド結合対が、会合の早いon速度および非常に遅いoff速度（すなわち解離速度定数）とともに非常に高い親和性を有することが望ましい。本明細書中に記載される適用では、結合タンパク質が、そのカルシウムイオン部位の10分の１を占有している場合に、結合親和性におけるカルシウム依存性の減少は少なくとも10倍であることが好ましい。好ましくは、解離定数はpH６〜９、20℃で10nMより大きく、そして50μＭカルシウムイオンの存在下で10nM以下であり、最も好ましくは１nM以下である。いくつかのカルシウム依存性結合タンパク質では、他の類似のイオンは、カルシウムを例えばストロンチウムに置き換え得る。好ましいカルシウム依存性結合タンパク質は、カルモジュリンである。このタンパク質は比較的小さく（148残基）、従って、結合対の一員として使用するために適切である。カルモジュリンと他のタンパク質とのハイブリッド組換えタンパク質は、遺伝子融合によって容易に作製され得る；小さなタンパク質のタグとしての使用は、融合相手のタンパク質構造を混乱させる危険性を減少させ、そしてまた立体障害を通してその相手の機能を妨害する機会を減少させる。トロポニンＣ、カルシニューリン、パルブアルブミン、およびオンコモジュリンのような他のカルシウム依存性結合タンパク質もまた、本発明で使用され得ることが理解される。いくつかのタンパク質、ペプチド、または有機化合物は、カルモジュリンに高い親和性（nMまたはnMよりも小さい解離定数で）で結合する。実際、カルモジュリンおよびペプチドリガンドの三次元構造が利用可能である（Ikuraら,1992;Mea dorら,1992,1993）。カルモジュリンと骨格のミオシン軽鎖キナーゼ（sMLCK）由来の26アミノ酸ペプチドとの複合体のNMR構造は、中央の19マーの配列、RWKKNFI AVSAANRFKKISのみがカルモジュリンと接触することを示している（Ikuraら,1992 ）。本発明において、好ましい野生型ペプチドリガンドは、本明細書中でさらに記載されるように、この配列の改変を含む。本発明のリガンドが、野生型リガンドに対して少なくとも10の係数で、好ましくは少なくとも100の係数で、さらに好ましくは少なくとも1000の係数で、Ｋ_dの減少を示すことが好ましい。ここで、Ｋ_d＝ｋ_off／ｋ_on ただし、ｋ_off＝反応の速度解離定数、およびｋ_on＝反応の速度会合定数。解離定数の減少は、ｋ_offもしくはｋ_on値のいずれかの改変、または両方の速度の値における改変の組合せに由来し得る。好ましくは、解離定数の低下により反映される結合親和性の改善は、少なくとも10の係数で、さらに好ましくは少なくとも100で、最も好ましくは少なくとも1000の係数で低下したｋ_off値によって支配される。結合親和性はまた、相互作用の半減期（ｔ_1/2）にも反映される。ここで、ｔ_1/2＝１／ｋ_off である。相互作用の半減期は、好ましくは少なくとも15分、さらに好ましくは少なくとも１時間である。添付の表１におけるペプチド６、10、および17は、野生型ペプチドに対してＫ_d で最大の改善を示す。特に、ペプチド６はえり抜きのリガンドである。本発明のさらなる局面によれば、野生型カルシウム依存性結合リガンドの結合親和性を増強する方法が提供され、この方法は野生型カルシウム依存性結合リガンドのアミノ酸配列を改変する工程を含む。本発明のリガンドは、固相オリゴペプチド合成および組換えDNA技術を含む、従来のペプチド合成技術により合成され得る。ロボットのマルチウェルペプチド合成機は、複数のアミノ酸置換を含む多くの異なるペプチドの１〜２日での生成を可能にする。マルチウェル装置でのペプチドの脱保護、切断、および蛍光標識の平行法は、生成したぺプチドの迅速な分析を可能にする。競合実験による速度解離定数の測定のために本明細書で使用される未変性ゲル電気泳動法はまた、複数のマルチウェルゲルを使用して、ペプチド生成と平行して使用され得る。さらに、組換えDNA技術（Smithら,1985）によりペプチドのライブラリーが、設計され、そして繊維状ファージの表面上に発現され得る。適切なストリンジェントの選択／増殖およびスクリーニング技術（例えば平行蛍光未変性ゲル電気泳動）は、改善されたリガンドを同定するために使用され得る。本発明のさらなる局面によれば、カルシウム依存性結合タンパク質と本発明によるリガンドとを含む結合対が提供される。本発明によれば、結合対としてのカルシウム依存性結合タンパク質に関連して、本発明によるリガンドの使用が提供される。本発明のカルシウム依存性結合タンパク質-リガンド結合対は、高い親和性の結合対を必要とする任意の適用において用いられ得る。本発明による結合親和性の改変は、結合対の結合親和性を特定の適用の必要条件に合わせるのを可能にする。本発明のさらなる局面によれば、本発明のリガンドは別の部分と連結され得る。例えば、Medical Research Councilの名称で1996年４月25日に出願された、同時係属中の英国特許出願「酵素の単離」は、酵素に連結したカルモジュリンの使用を開示する。さらに、カルモジュリンリガンドは、この酵素によって触媒される特定の反応の基質に連結される。カルモジュリン-酵素部分とリガンド-基質部分との結合、および酵素による基質から生成物への変換に続いて、生成物が活性部位から解離した後に、生成物は（カルモジュリン-カルモジュリンリガンド結合対を介して）酵素に連結したままである。このことから、酵素反応の生成物の選択により、酵素ライブラリーからの活性酵素の単離が可能である。酵素がそれをコードしているDNAに連結される場合（例えばファージの表面上に提示されることにより）、コードしているDNA種の単離もまた可能である。本発明は、結合親和性、従って上記の手順で使用されるカルモジュリン-カルモジュリンリガンド結合対の相互作用の半減期を増加させるために使用され得る。これは特に、低い反応速度を有する酵素の場合に有利である。これらの酵素では、カルモジュリン-リガンド相互作用は、酵素から基質を解離させないように、酵素反応の完了を可能にするために十分に長い半減期を示さなければならない。本発明のリガンドの使用は、この「酵素選択」技術の適用を広げる。連結部分は、タンパク質であり得る。好ましくは、リガンド-タンパク質融合物は遺伝子融合物から生成される。このような融合物をコードする核酸は、本発明のさらなる局面を形成する。このような組換え融合タンパク質をコードしている発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は培養中に増殖し得、そしてこのような分子の生成に使用され得る。次いで、リガンドは、（カルモジュリン）アンタゴニストカラムでのアフィニティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーのような方法により、組換え分子の単離および精製のために使用され得る。溶出ではリガンドへのカルモジュリンの親和性を低めるためにカルシウムキレート剤を使用し得る。あるいは、連結部分は非共有結合的にまたは化学的修飾によりリガンドに付加され得る。化学的修飾は、例えば、リガンドに存在するチオール基、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基、またはアリール基のような反応性官能基と、連結部分に存在する反応性官能基との結合を含む。例えば、システイン基はリガンドのC-末端に組み込まれ得、そしてタンパク質は、SPDP(N-スクシンイミジル３（２−ピリジルジチオ）プロポイネート)のようなヘテロ二機能性架橋剤を用いてカップリングされる。非共有的連結のためには、二量体の形成に好都合なペプチド（例えば、ロイシンジッパーまたはJunおよびFosのタンパク質結合ドメイン）が、ペプチドおよび組換えタンパク質に付加され得る。従って、複合体はタンパク質とリガンドとの混合の際に形成される。連結部分はまた、標識であり得る。標識は、蛍光（例えばフルオレセイン）、抗体標識、または放射標識であり得る。これは、蛍光活性化セルソーティング（ FACS）、共焦点蛍光顕微鏡法、またはブロッティングのような方法による、カルシウム依存性結合タンパク質を含む組換え融合タンパク質の検出および単離を可能にする。カルシウム依存性結合タンパク質の検出のための他の高感度な方法は、例えば近年オンコモジュリンに関して記載されたように、Ca²⁺イオンをTb³⁺イオンで置換した後のTb³⁺発光によって開発され得る（Clarkら,1993）。本発明の標識リガンドの使用を通して、結合親和性の測定もまた、同時係属中の特許出願 WO95/12672に記載されるようなバンドシフトアッセイを用いて行われ得る。癌治療の効力およびその腫瘍細胞特異性を改善するために、様々な技術が開発中である。化学療法は、低い治療指数を示し、正常器官に受容しがたい損傷を起こし、そして安全に投与され得る薬物の用量を制限することが証明されている。長年の間、抗体は、標的細胞を殺傷するために細胞傷害性タンパク質を送達するための手段として研究されてきた。そして実際のところ、研究の大半は、現在、抗体に関する治療に関している。抗体またはそれらの免疫反応性フラグメントの細胞特異性は、薬物、ラジオアイソトープ、タンパク質サイトトキシン、免疫系のエフェクター細胞、および標的化プロドラッグ活性化のための酵素さえも送達するために利用され得る。しかし、インビトロおよびインビボでの顕著な結果にもかかわらず、１つまたは複数の分子の免疫原性および全身毒性のような無視できない問題が残っており、これは有効な臨床試験の結果が得られ得る前に解決されなければならない。直接的な抗体媒介送達に関連した全身毒性を解決する試みの１つの方法は、ストレプトアビジンおよびビオチンに基づく結合体を使用した治療薬剤の予備標的化送達である。標的特異的薬剤（通常は抗体）はストレプトアビジンに融合され、そして哺乳動物に投与される。適切な局在化時間の後、毒素またはラジオアイソトープに連結したビオチンを含む２番目の結合体が投与される。従って、細胞傷害性薬剤の標的化率および／または活性用量は、標的器官において増加する。さらに、非標的組織（特に骨髄）への露出は減少し、そしてより大用量の送達および効率的な利用が可能になる。非標的化標識は腎臓を通って全身から効率的に排出される。しかし、この治療の効力の度合いはストレプトアビジン、従ってまたその結合体の免疫原性によって顕著に減少する。これは免疫抑制剤の同時投与を必要とし、これは治療に関連した外傷の度合いを上げる効率の悪い方法である。従って、哺乳動物の身体において、高い結合親和性および低い免疫原性の両方を示す結合対を含む類似の系の必要性がある。従って、カルモジュリンのようなカルシウム依存性結合タンパク質およびそのためのペプチドリガンドは、哺乳動物の身体においてそれらが自然発生し、従って低免疫原性であるために、このような治療レジメのための理想的候補である(V anEldikおよびLucas，1987)。さらに、カルモジュリンは有毒でなく、いずれの器官においても選択的に蓄積せず、そして尿中に迅速に分泌されることが示されている。しかし、カルモジュリンと天然に存在するペプチドリガンドとの相互作用は、この適用において有効に使用するためには親和性が低すぎる。本発明は、カルモジュリンへの改善された親和性のペプチドリガンドを提供する。従って、別の実施態様は、毒素に連結された本発明のリガンドを含む分子である。この毒素は、薬剤、ラジオアイソトープ、タンパク質サイトトキシン、免疫系のエフェクター細胞、プロドラッグ活性化のための酵素、Pseudomonas毒素、腫瘍壊死因子α、または化学療法作用を有する別の毒素を含み得る。任意の適切な毒素が、治療薬剤の予備標的化送達のために、本発明において融合相手として使用され得ることが理解される。放射標識へのリガンドの融合物を含むのみの同様の技術が、腫瘍の診断およびイメージングのために免疫シントグラフィー（immunoscintography）において使用され得る。上記の実施態様における標識分子または結合分子としてのリガンドの使用に加え、毒素または標識に融合した部分がカルシウム依存性結合タンパク質分子であり、そしてこの分子が標的化する実体は本発明のペプチドであるように、その形式は逆転し得る。従って、上記の概念は全て、生来可逆的である。さらに、結合活性を保持したこれらのリガンドおよびカルシウム依存性結合タンパク質分子のフラグメントは、それらの誘導体であろうと、使用され得る。用語「誘導体」は、物理的または化学的な分子特性の変化を導く、欠失、置換、または挿入を含むアミノ酸変異体を含む。カルシウム依存性結合タンパク質とペプチドリガンドとの強力な結合相互作用はまた、二量体または多量体を作製する手段を提供し得る。二量体ペプチドリガンドは、組換えカルシウム依存性結合タンパク質融合分子を二量体化するために使用され得る。同様に、多量体ペプチドリガンドは、多量体を生成し得る。このことは腫瘍標的化の効率、従って免疫応答の効力を増加させるために使用され得るこのようなリガンドを使って形成されるカルモジュリン-抗体多量体の場合に特に適応可能である。本発明の様々な局面および実施態様が、以下の実施例において図を参照して示される。本発明のさらなる局面および実施態様は、当業者に明らかである。本明細書で言及するすべての文献は、参考として援用される。図１は、未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるカルモジュリンとフルオレセイン標識ペプチドとの複合体の検出を示す。レーンの番号はペプチド番号に対応する。置換の位置は、ゲルのレーンとアミノ酸配列とを結ぶ線で示される。図２は、ペプチド１〜17に結合しているカルモジュリンの典型的なセンソグラムを示す。ここでペプチド１およびペプチド５の結果を示す。図３は、カルモジュリンに対するペプチド１〜17のｋ_off定数の測定のための競合実験を示す。ここで、ペプチド１、２、３、６、９、および14の競合の結果を示す。インキュベート時間（分）はレーンの下に示す。以下の実施例は、例示のみのために示す。詳細の変更が本発明の範囲から逸脱することなく行われ得ることが理解される。実施例：実施例１：ペプチドの設計および合成骨格のミオシン軽鎖キナーゼにおいて、中央の19マーの配列RWKKNFIAVSAANRFK KISのみがカルモジュリンと接触することが以前に示されている。従って、このペプチドの改変を、カルモジュリン結合部位に対するペプチドの設計のモデルとして選択した。ペプチド１は野生型配列を含み、そしてチオール特異的試薬（例えば、ヨードアセトアミドフルオレセインまたはビオチン誘導体）での部位特異的ペプチド機能付与の標的として作用するように、Ｎ末端システインを使用して設計した。続く３つのアラニンはスペーサーであり、そしてＣ末端でアミド基が提供される。従って、このペプチドの配列は、CAAA-RWKKNFIAVSAANRFKKIS-CONH₂である。カルモジュリン認識配列における、アラニンでないすべての残基のアラニン変異に対応する16個のさらなるペプチドを合成した。これらのペプチド配列を表１に示し、これはまた、アラニンへの個々のアミノ酸置換による、カルモジュリンとカルモジュリン結合ペプチドとの間の相互作用の速度分析のデータを提供する。ペプチドを、Fmoc/t-ブチル保護基を利用するマルチペプチド合成機(Multisyn Tech，Bochum，Germany)を使用して、固相法で作製した。Fmoc基を、ジメチルホルムアミド中の40％(v/v)ピペリジンにより切断し、次のアミノ酸を、N-ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルとして添加した。ペプチドを脱保護し、そして、93％トリフルオロ酢酸；３％エタンジチオール；２％アニソール；２％水を使用して樹脂から切り離した。ペプチドを、Vydac C18カラム(10μＭ、100×250 mm)を使用したHPLCおよびアミノ酸分析(PICO TAG，Waters，Milford，MA)により分析した。実施例２：未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)による、カルモジュリンとフルオレセイン標識ペプチドとの間の複合体の検出。ウシ脳(1μＭ，Sigma)からのカルモジュリンとフルオレセイン標識sMLCK由来ペプチド（表１に記載）との間の複合体を、ゲル緩衝液(25％ゲル混合物[４ｇスクロース＋１mgブロモフェノールブルーを水に加えて10ml溶液にする]＋75％TBS C[50mM TRIS pH7.4，100mMNaCl+50μＭ CaCl₂])中で調製し、そして15％未変性P AGEゲル(30μｌ 25％過硫酸アンモニウムおよび９μｌ TEMEDで重合させた、５m l 30％アクリルアミド-ビスアクリルアミド溶液＋4.5ml水＋0.5ml 3M Tris,pH8. 8，+１μｌ 1M CaCl₂)上で、14.4g/lグリシン＋3g/l Tris塩基＋0.1mM CaCl₂を泳動緩衝液として用いて泳動した。ペプチドをヨードアセトアミドフルオレセイン（Molecular Probes）またはヨードアセトアミド-LC-ビオチン(Pirce)のいずれかを使用して、本質的にNeriら(1995)によって以前に記載されたように標識した。これらの条件において、正に荷電した標識ぺプチドの蛍光は、それらがカルモジュリンと安定な複合体を形成している場合にのみ検出され得る。図１は、未変性PAGEゲル中ですべての合成ペプチドがカルモジュリンに結合することを示す。このことは、１つのアラニン置換はカルモジュリン結合に深刻で有害な影響を全く与えないことを示唆している。レーンの番号はペプチド番号に対応する。置換の位置は、ゲルのレーンとアミノ酸配列とを結ぶ線で示される。関連のない標識ペプチドでは蛍光バンドは検出され得ない（データは示さず）。ゲルを化学ルミネセンス分析機LUANA(Neriら，1996)を使用して画像化した。実施例３：カルモジュリン結合ペプチドの異性化、会合、および解離の速度の測定。下記の式による二相性速度論で、平滑筋MLCK由来ペプチドがカルモジュリンへここで、Ｐはペプチドであり、Ｃはカルモジュリンであり、Ｐ−ＣはＰとＣとの会合により形成される第一の複合体であり、これは次いでＰ−Ｃ^★へ構造異性化を受ける。本発明のsMLCK由来ペプチドへのカルモジュリンの結合のストップトフロー分析は、二相性結合速度論を示す（データは示さず）。ウシ脳カルモジュリンへの本発明のペプチドの結合の速度論および熱力学的特徴付けのために、本発明らは速度論的な異性化、会合、および解離の定数（これらから解離定数が導き出され得る）を測定した。このことは、カルモジュリンに対する親和性の増加を生じたこれらの変異体の評価を可能にする。ｋ_isom＝ｋ₊₂＋ｋ_-2 ［１］ｋ_on＝ｋ₊₁ ［２］ｋ_off＝ｋ_-1・ｋ_-2／（ｋ₊₂＋ｋ_-2）［３］ｋ_d＝ｋ_off／ｋ_on ［４］ｋ_isom定数は、ストップトフローにより測定されており、トリプトファン蛍光における、３（トリプトファンがアラニンにより置換されている）を除くすべてのペプチドについての変化を検出する。これらの値を表１に示す。析を、ｋ_onおよびｋ_off定数を決定するために使用した。結合したカルモジュリンの100〜200の表面プラズモン共鳴単位の表面容量を達成するために、ビオチン化されたペプチド１〜17を、ストレプトアビジンでコートされた市販のマイクロセンサーチップ(Pharmacia Biosensor)に結合した。種々の濃度のカルモジュリン（図２の順序で５、10、20、50および100nM）を注入し、ペプチドと結合させた。5μｌ TBS＋15mM EDTA（これはカルモジュリン-ペプチド複合体を解離する）の注入により、表面再生を達成した。図２はペプチド１および５のセンソグラムを示し、ここで２つのペプチド間のｋ_onおよびｋ_offにおける違いが視覚的に評価され得る。ｋ_onおよびｋ_off定数を、製造者(Pharmacia Biosensor)の説明書に従って、BIA評価ソフトウエアバージョン2.1を使用してセンソグラムから得た。BIAcore測定の結果を表１に列挙する。 sMLCK由来ペプチド１〜17の速度会合定数（ｋ_on）は、6.5×10⁵〜3.2×10⁶ｓ 994)の定数よりも100倍を超えて低い。野生型ペプチド１に対する、ｋ_onにおける最大の増加は、R5（ペプチド２）、W6（ペプチド３）およびK20（ペプチド14 ）のアラニンへの変異について観察された（４〜５倍の増加；表１）。従って、２つの正に荷電したアミノ酸残基（R5およびK20）のアラニン変異は、増加したo n速度に関連する。特定のアラニン変異は、ｋ_off値を、野生型ペプチド１に対して1000倍まで改善した（表1）。最大の改善は、置換された親水性残基（N９、S14、S23）に観察された。これらは、疎水性の環境のカルモジュリンコアにおいて安定でない。これらは、ペプチド６、10および17に対応する。実施例４：競合実験によるｋ_off定数の決定。 BIAcoreの結果の独立した実験的確認を得るために、カルモジュリンへのペプチド１〜17のｋ_off定数を競合実験により決定した。ゲル緩衝液中の30nMフルオレセイン標識ペプチド／カルモジュリン複合体を、30倍過剰の非標識ペプチドを用いて室温で種々の時間で競合させた。得られた混合物を未変性PAGEゲルで泳動し、そして上記のようにLUANAにより画像化した。得られた画像のバンドをLUANA ソフトウエアを用いて積算し(Neriら，1996)、そして対応する強度を時間に対してプロットし、そして１つの指数関数に当てはめ、これからｋ_off定数を求めた。ピペッティングエラーに対するバンドの強度を標準化するために、試料は6nM の遊離のフルオレセイン（これは前方で泳動する）を含んでいた。フルオレセインのバンドを積算し、そしてカルモジュリン／蛍光ペプチド複合体バンド強度を標準化するのに使用した。ペプチド１、２、３、６、９、および14の競合の結果を、この図３に示す。分でのインキュベーション時間をレーンの下に示す。 off速度が極端に速いと、ぺプチド１、２、３および９は数分以内にカルモジュリンから解離する。ペプチ14は中間的なoff速度の代表であるが、一方、ペプチド６は、1000分後、過剰の非標識ペプチドによりほとんど競合されない。バンドの量を競合時間に対してプロットし、そして１つの指数関数に当てはめ、これからｋ_off値を求めた。値を表１に示す。最も迅速な競合（ペプチド１〜４、９および13）は、カルモジュリン／蛍光ペプチド複合体がゲルの中に入る時間（モル過剰の非標識ペプチドをピペッティングしてから約５〜10分；図３）までに終了し、これによりoff速度定数ｋ_off＞１ ×10^-3s^-1の条件を求めた。これらの迅速なoff速度についてさえも、周知のゲル「かご効果」１（FriedおよびCrothers，1981;GarnerおよびRevzin，1981）のために、複合体は未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出され得る。競合およびBIAcoreによって測定されたｋ_off値は、実質的に一致している（表１）。２セットのデータ間の小さな違いは、競合実験が、TBS+50μＭ CaCl₂よりもむしろゲル混合緩衝液（図３）において行われたという事実によるかもしれない。実施例５：さらなる変異の構築試験された全ての他のペプチドを上まわる、ペプチド６によって示されたカルモジュリンへの増強された結合親和性のために、野生型ペプチドのアスパラギン残基９のさらなる単一点変異を構築した。これらのペプチドの配列を、実施例３および４に記載した方法に従って測定されたＫ_D値とともに、表２に示す。疎水性ドナー残基（バリン、フェニルアラニン、およびロイシン）を選択した。なぜなら、これらの残基はカルモジュリンコアにおける疎水性環境の安定性に寄与し得ると仮定されたからである。設計されたペプチドはすべて、野生型sMLCKペプチドが有したのよりもカルモジュリンに対して大きな親和性を有したが、しかし、３つはいずれもペプチド６よりも大きな親和性を示さなかった。実施例６：複数の変異体の構築。カルモジュリンへの親和性で最大の改善を示す変異ペプチドは、それぞれ、９位、14位、および20位でのアラニン置換に対応するペプチド６、10、および14であった。複数の変異体を、これらの３つの残基がアラニンに変化したように構築した。配列は以下に示し、置換残基を太字で示す： CAAARWKKAFIAVAAANRFAKIA。実施例３および４の方法を使用して、カルモジュリンについてのこのペプチドの解離定数は１×10^-11M（ｋon=6.1×10⁵;ｋ_off=5.9×10^-6)であることが見出された。従って、カルモジュリンについてのこのペプチドの親和性はペプチド６の親和性に匹敵する。しかし、ペプチドにおける親水性残基のすべてを変異させても相乗効果はまったく達成されなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＧ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 33/68 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ウィンター，グレゴリーポールイギリス国シービー２１ティーキューケンブリッジ，トリニティカレッジ, ネビルスコート，ディー４

Claims

【特許請求の範囲】１．カルシウム依存性結合タンパク質に結合し得るリガンドであって、該カルシウム依存性結合タンパク質についての野生型リガンドのアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を含み、該カルシウム依存性結合タンパク質についての該リガンドの親和性の増強をもたらす改変を有する、リガンド。２．前記カルシウム依存性結合タンパク質がカルモジュリンである、請求項１に記載のリガンド。３．前記改変が、前記野生型リガンド配列における１つ以上のアミノ酸の置換、挿入、または欠失を含む、請求項２に記載のリガンド。４．前記改変が、前記野生型リガンド配列における１つ以上のアミノ酸の置換を含む、請求項３に記載のリガンド。５．前記改変が、前記野生型リガンド配列における単一のアミノ酸の置換を含む、請求項４に記載のリガンド。６．前記改変が、前記野生型リガンド配列における１つ以上のアミノ酸のアラニンでの置換を含む、請求項４または５に記載のリガンド。７．前記置換がバリンである、請求項４または５に記載のリガンド。８．前記野生型リガンドがミオシン軽鎖キナーゼである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のリガンド。９．前記改変が、ミオシン軽鎖キナーゼの配列における９位、１４位、または２０位での単一または複数のアミノ酸置換である、請求項８に記載のリガンド。１０．前記野生型リガンドがマスタポランである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のリガンド。１１．ii)別の部分、に化学的結合した、i)請求項１〜１０のいずれか１項に記載のリガンドを含む分子。１２．前記部分が化学的反応についての基質である、請求項１１に記載の分子。１３．前記部分が、標識、毒素、抗体、または他の標的化分子である、請求項１１に記載の分子。１４．カルシウム依存性結合タンパク質に結合し得るリガンドの結合親和性を増強する方法であって、野生型カルシウム依存性結合タンパク質のアミノ酸配列を改変する工程を包含する、方法。１５．カルシウム依存性結合タンパク質および請求項１〜１３のいずれか１項に記載のリガンドを含む結合対。１６．カルシウム依存性結合タンパク質と関連しての、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のリガンドの、結合対としての使用。１７．治療における使用のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のリガンド。１８．イメージング、診断、または腫瘍の処置のための薬学的組成物の製造における、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のリガンドの使用。