JP5403681B2 - 新規核内移行ペプチド - Google Patents
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Description
これまでに同定されたPTDとしては、HIVのTat由来ペプチド(E.Vives et al.,J.Biological Chemistry,272(25),16010,(1997)参照)、Penetratin(D.Derossi et al.,J.Biological Chemistry,271(30),18188,(1996)参照)、単純ヘルペスウイルス・タイプ1の外皮タンパク質VP22(G.Elliot et al.,Cell,88,223,(1997)参照)などが挙げられる。
中でも、tatペプチドは最も良く知られたPTDであり、例えば、米国特許第565211号明細書には、β−ガラクトシダーゼまたは西洋わさびペルオキシダーゼを、tatペプチドを用いて細胞内輸送したことが開示されている。また、M.Zhao et al.,Bioconjugate Chem.,13,840,(2002)には、tatペプチドと超常磁性酸化鉄ナノ粒子との複合体を用いたMRIによる細胞内イメージングについて報告されている。
さらに、Y.Mukai et al.,Biol.Pharm.Bull.29(8),1570,(2006)には、tatペプチドの機能向上を目的とした研究の過程で、tatペプチドよりも約3倍の細胞内移行能を示す「YM−3」が発見されたことも報告されている。
一方、本発明者らは、先に、HIV−1のアクセサリー遺伝子の1つであるVpr由来のタンパク質より、強い移行機能を有するアミノ酸配列:D T W A G V E A I I R I L Q Q L L F I H F R I G C R Hで示される27アミノ酸残基のペプチドC45D18を同定し、C45D18およびその酵素タンパク質複合体は、細胞質内だけでなく、核内にまで移行することができるペプチドであること、tatペプチドよりその移行機能が優れていることなどを報告した(T.Taguchi et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,320,18,(2004)参照)。しかし、この文献には、移行機能の発現に必要なアミノ酸配列については何ら言及されていない。
このように、いくつかのPTDが同定・改良され、DDSキャリアをはじめとした幅広い分野で利用することが試みられているが、その細胞内移行能力が未だ十分でないなどの理由で、産業上実用化されるに至っていない。
本発明の目的は、また、それによって、機能性分子の細胞内および核内移行量を産業利用上有効な量まで引き上げることである。
本発明者らは、C45D18の核内移行機能を利用する研究の過程で、陰性対象のつもりでアミノ酸配列:R I L Q Q L L F I H F R I G C R H S R Iで示される20アミノ酸残基のペプチドを合成し、その移行性を調べたところ、全く意外にも、C45D18よりも格段に優れた移行性を示すことが発見した。この発見を契機に、上記の目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、今回、C45D18のアミノ酸配列の一部が、従来のPTDよりも細胞内移行能力および核内移行能力ともに格段に優れており、しかもC45D18よりも細胞毒性が低いペプチドを同定し、本発明を完成するに至った。
かくして、本発明は、アミノ酸配列R IおよびF IおよびR I G Cを含んでなり、アミノ酸残基数が25以下であるペプチドを提供するものである。
本発明のペプチドによれば、単独では細胞内および核内移行が困難なタンパク質、遺伝子、糖、その他の高分子化合物などの運搬において、従来のPTDを使用した時よりも、数倍ないし数十倍高い細胞内および核内移行性を付与することが可能である。そのため、本発明のペプチドを利用することにより、これまで移行機能の低さから実用化が困難であった分野においても実用化が期待される。
また、本発明のペプチドは、母ペプチドであるC45D18に比較して細胞毒性が低いため、医療用途に適用する際にも、安全性の観点から有利である。
さらに、本発明のペプチドは、アミノ酸残基数が少ないので、産業上利用する場合に、細胞毒性の低減に加え、コスト削減にも有利である。
図2は、LR17−CMDM複合体の粒子直径の違いによるHeLa細胞内および核内移行能を比較した試験結果を示すグラフである。
図3は、各種ペプチド−CMDM複合体の神経細胞内および核内移行能試験結果を示すグラフである。
図4は、各種ペプチド−CMDM複合体の末梢血単核球細胞移行能試験結果を示すグラフである。
図5は、LR15DL−Qdot複合体のHeLa細胞内および核内移行能試験結果を示すグラフである。
図6は、LR15DL−EGFP複合体のHEK293T細胞内移行試験結果を示すFACS解析図である。
図7は、(His)6−LR15DL−EGFPキメラタンパク質のHEK293T細胞内移行試験結果を示すFACS解析図である。
図8は、LR20とC45D18及びVprの細胞毒性を試験し比較した細胞の顕微鏡写真である。
図9は、LR20−CMDM複合体を細胞に取り込ませ、高周波磁場照射した後に、細胞の生存率を調べた結果を示す細胞染色後のシャーレを撮影した写真である。
以下、本発明のペプチドについてさらに詳細に説明する。
発明の詳細な記述
以下、本発明のペプチド(以下、本ペプチドと略記することもある)およびその製造法、本ペプチドと組み合わせ得る機能性分子の例示、本ペプチドと機能性分子との複合体の合成法、該複合体の細胞内および核内移行能などの性質の評価、対象となる細胞などについて順次説明する。
なお、以下の説明において、アミノ酸配列は、簡単のために、下記表1に示すペプチド番号で表示することがある。
本発明のペプチド
本発明のペプチドは、細胞内および核内移行機能を発揮する最小必要部分として、アミノ酸配列R IおよびF IおよびR I G Cを含むアミノ酸残基数が25以下のペプチドであり、該ペプチド分子中における上記アミノ酸配列の順序としては、N末端から順にR I、F I、次いでR I G Cであることが好ましい。上記アミノ酸配列はあくまで移行機能を発揮するために必要な最小の配列であり、上記アミノ酸配列の前、後または間にさらに別のアミノ酸配列を付加することにより、さらに高い移行能をもたせることも可能である。
しかして、本発明によれば、好適態様として、アミノ酸配列F IとR I G Cの間にH Fを挿入したアミノ酸配列R IとF I H F R I G Cを含んでなり、アミノ酸残基数が25以下であるペプチドが提供される。そのようなペプチドとして、具体的には、ペプチド番号4(R I F I H F R I G C)で示されるペプチドが挙げられ、これは高い移行性を示す。また、例えば、上記配列中、R IとF I H F R I G Cの間にさらにXa Q Q Xb Xcが挿入されたアミノ酸配列R I Xa Q Q Xb Xc F I H F R I G Cで示されるペプチド(ここで、Xa、XbおよびXcは同一もしくは相異なり、各々標準アミノ酸を示す、なお、「標準アミノ酸」とは哺乳動物内で機能するタンパク質を構成する20種類のアミノ酸を意味する)、特にペプチド番号3(R I L Q Q L L F I H F R I G C)で示されるペプチドはさらに一層高い移行能を示す。
このような最小必要配列に特定アミノ酸を付加したペプチドは、従来のPTDであるtatペプチドやPenetratinの約十倍ないし数十倍高い移行量を示す。
製造法
本発明のペプチドは、それ自体既知のペプチド合成法により製造することができる。ペプチド合成法としては、例えば、固相合成法(Marrifield,J.Am.Chem.Soc.,85,2149−2154,1963)が挙げられ、本ペプチドは、現在、この原理を用いて自動化されかつ汎用されているペプチド合成機を使用して、比較的短時間かつ簡便に製造することができる。
また、本ペプチドは、例えば、文献(Methods in Enzymology,154,350,367−382,1987)などに示されるような遺伝子工学によるそれ自体既知の手法を利用して製造することもできる。
(b)機能性分子及び機能性粒子の例示
本発明のペプチドは、前述したとおり、優れた細胞内および核内移行能を有しているので、それをベクターとして使用し、例えば、本ペプチドと機能性分子または機能性粒子とが結合した複合体を製造し、それを細胞内もしくは核内に移行させ、そこで該分子または粒子がもつ機能を発現させることに応用することができる。本ペプチドと組み合わせることができる分子や粒子としては非常に広い範囲から選ぶことができる。
上記機能性分子としては、例えば、核酸類(DNA、RNAなど)、アミノ酸類(タンパク質、ペプチドなど)、脂質、糖類、その他の高分子化合物などの生理活性物質;蛍光物質などの機能性化合物などが挙げられ、また、機能性粒子としては、例えば、磁性粒子、蛍光粒子、リポソームなどが挙げられ、これらはそれぞれ単独でまたは2種もしくはそれ以上を組み合わせて使用することができる。特に、ナノサイズの粒子が好ましい。以下、便宜上、機能性分子および機能性粒子をまとめて機能性分子と呼ぶことがある。
次に、代表的な機能性分子および機能性粒子についてさらに具体的に説明するが、これらに限定されるものではない。
核酸類(DNA、RNA等)
本発明のペプチドとの結合に用い得る核酸類としては、プラスミドDNA、mRNA、siRNAなどの一般的な核酸全般を制限なく使用することができるが、例えば、本ペプチドをその1つの用途である形質転換用ベクターとして使用する場合には、細胞内で機能を発現できるような形態のものが好適に用いられる。例えば、DNAとしては、導入された細胞内でDNAが転写され、産生される生理活性物質が所期の機能を発現するようなものが適している。
そのような核酸類としては、例えば、サイトカイン系遺伝子(例えば、TNF−a、IL系など)、癌抗原ペプチド遺伝子(例えば、gp−100、MART−1など)、LDL受容体遺伝子などが挙げられる。その他、糖尿病、動脈硬化症、アルツハイマー病などの治療用遺伝子も挙げられる。
アミノ酸類(タンパク質、ポリペプチド)
本発明のペプチドとの結合に用い得るアミノ酸類としては、例えば、抗体や酵素などの、標的細胞内に運搬されることにより細胞内で何らかの生理活性を発現するものが好ましい。
そのようなアミノ酸類としては、例えば、抗原として使用可能なタンパク質が、細胞障害性T細胞を誘導することから全般的に使用可能であり、また、細胞サイクル調節タンパク質(例えば、サイクリン、サイクリン依存キナーゼなど)、抗体(例えば、HER2抗体)、酵素(例えば、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)、不死化タンパク質(例えば、SV40ラージT抗原、テロメラーゼなど)、抗アポトーシスタンパク質(例えば、突然変異体p53、BclxLなど)なども使用することができる。
このようなアミノ酸類と本発明のペプチドとの結合方法については、後述する「(c)本発明のペプチドと機能性分子との結合方法」の項にて詳しく説明するが、この他にもバクテリアなどを利用して本発明のペプチドのアミノ酸配列が予め組み込まれたアミノ酸類を生物的に合成することもできる。また、その結合位置はN末側、C末側のいずれであってもよい。
本発明のペプチドのアミノ酸配列が予め組み込まれたアミノ酸類を得る方法としては、例えば、一般に発現ベクターとして利用されているプラスミドに、運搬させたいアミノ酸類と本発明のペプチドのアミノ酸配列をコードするDNAを挿入した後、大腸菌などに発現させて得る方法が挙げられる。この方法によれば、目的のアミノ酸類を得る際に細胞内への運搬能も同時に付与することができるため、実用化の際にコスト面で有利であり、このようして得られる本発明のペプチド導入アミノ酸類及びこの方法も、本発明に包含される。
磁性粒子
本発明のペプチドとの結合に用い得る磁性粒子は、その形態、物性等から一般に多種多用なものが存在するが、本ペプチドに対して好適に使用される形態は、生体適合性に優れ且つナノメートルオーダー(ナノサイズ)の範囲内の全体直径を有する、いわゆる磁性ナノ粒子が好ましいが、これに限定されるものではない。
そのような磁性ナノ粒子としては、例えば、特公昭59−13521号公報、日本国特許第2939336号公報、米国特許第4452773号明細書などに記載の粒子が挙げられ、これらは一般にMRI造影剤や細胞磁気分離用として実用化されている。
中でも、日本国特許第2726520号公報に記載されているカルボキシアルキル多糖−磁性金属酸化物、特にカルボキシメチルデキストランマグネタイト(以下、CMDMと略記する)が、粒子表面上に別分子との結合に利用できる官能基を有しており、好都合に利用することができる。その具体的な合成法は同特許公報の引用を以って詳細な記述に代える。
上記磁性ナノ粒子は、用途にもよるが、一般に1〜500nm、好ましくは1〜200nm、さらに好ましくは1〜150nmの範囲内の全体直径を有することができ、用途に応じて適宜選択することができる。なお、本明細書において、全体粒子径は、レーザー光散乱測定装置により測定した時の値である。
また、磁性ナノ粒子の磁性については、その指標として、例えばT2緩和能力を挙げることができる。この数値は、MRIにおける検出感度や温熱療法における発熱性などの観点から、可能な限り高いことが望ましく、一般に1〜1000(mM・sec)−1、好ましくは20〜1000(mM・sec)−1、さらに好ましくは50〜1000(mM・sec)−1の範囲内が好適である。なお、本明細書において、T2緩和能力は0.47TにおいてパルスNMR装置で測定した時の値である。
リポソーム
本発明のペプチドとの結合に用い得るリポソームとしては、それ自体既知のリポソーム全般を使用することができ、例えば、本ペプチドの用途の1つである薬物DDSとして使用する場合、薬物内包のために適度な全体直径を有していることが好ましく、特に、細胞内へのデリバリーが完了した後に、必要に応じてリポソーム膜を破砕することができるように設計されたものが好ましいが、これらに限定されるものはない。かかるリポソームとしては、例えば、特開2006−306784号公報に記載の温度感受性リポソームなどが挙げられる。その合成法や好ましい物性については、同公開公報の引用を以って詳細な記述に代える。
蛍光粒子
本発明のペプチドとの結合に用い得る蛍光粒子としては、その蛍光波長や形態は特に限定されないが、サイズ的な面において、当然ながら細胞の大きさを超えないもの、好ましくはナノメートルオーダー以下のものであり、特に生態適合性が良好なものが好ましい。そのような粒子として、例えば量子ドットが挙げられる。中でも米国カンタムドット社が開発した「Qdot(登録商標)」が最もよく知られており、それを一例として挙げることができるが、これに限定されるものではない。
(c)本発明のペプチドと機能性分子との結合方法(複合体の製造法)
本発明のペプチドと機能性分子との結合は、直接に行ってもよく或いはリンカー分子を介して間接的に行ってもよい。さらに、機能性分子によっては本発明のペプチドと単に混合するだけで結合することもある。一般に、その結合は、それ自体既知の方法で行うことができ、具体的には、例えば、機能性分子としての生体分子の末端または内部に存在する官能基を利用して、化学的な結合方法で、直接的にまたは直接結合が困難な場合にはリンカー分子を介して間接的に行うことができる。その際の化学的な結合様式としては、例えば、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、S−S結合などの共有結合のほかに、イオン結合、静電的結合、分子間力結合、水素結合などの非共有結合が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、前記リンカー分子としては、両端に反応性基を有し、2分子を連結させうる構造の分子であれば、特に限定されるものではない。該反応性基としては、例えば、マレイミド基、N−コハク酸イミドエステル基、エポキシ基、アビジン基などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
また、本ペプチドとリポソームや磁性粒子との結合は、直接的に行ってもよいが、直接結合に利用できる反応性基を粒子表面上に有しているものは比較的少ないことから、通常は何らかのリンカー分子を介して間接的に行われる。前記磁性ナノ粒子と本ペプチドとの結合については、磁性ナノ粒子としてCMDMを用い、その表面カルボキシル基を利用してリンカーを導入し、さらにそのリンカーの末端にペプチドを結合させる方法が最適である。
以上述べたように、本ペプチドと機能性分子の組み合わせは幅広く、それらの結合方法は一義的には決められないが、それらの活性と構造相関を考慮し、当業者であれば、それ自体既知の結合方法の中から、本ペプチドと機能性分子のそれぞれの組み合わせに合った結合方法を実験的に容易に決めることができる。
(d)該複合体の性質(細胞内・核内移行能を含む)
本発明のペプチドと機能性分子との複合体が有すべき性質は、細胞内および核内移行を行う上で支障をきたさない限り、特に制限されない。ここで、移行に支障をきたす可能性のある性質としては、例えば、サイズ的なことが挙げられ、より具体的には、該複合体の全体直径が挙げられる。本発明のペプチドの細胞内および核内移行のメカニズムは、マクロピノサイトーシスによると考えられ、全体直径が小さい分には問題ないが、大きすぎる場合には、細胞膜や核膜を通過できなくなるおそれがある。そのため、上記複合体は、通常5〜500nm、特に5〜200nm、さらに特に5〜150nmの範囲内の全体直径を有することが好ましい。
上記の如くして製造される本発明において好適な本ペプチド−磁性ナノ粒子複合体は、以下に述べる如き性質を有することができる。
上記複合体は、製造条件にもよるが、一般に用いた磁性ナノ粒子のそれとおおむね同じであることが好ましく、用途にもよるが、通常5〜500nm、好ましくは5〜200nm、さらに好ましくは5〜150nmの範囲内の全体直径を有することができる。
T2緩和能力は、前述したとおり可能な限り高いことが好ましく、通常1〜1000(mM・sec)−1、好ましくは20〜1000(mM・sec)−1、さらに好ましくは50〜1000(mM・sec)−1の範囲内にあることができる。
以上に述べた本ペプチド−機能性分子複合体における本ペプチドの含有量は、複合体の用途や機能性分子の大きさなどにより変化させることができるが、本ペプチドの機能を十分に発揮させることができ且つ可能な限り少ないことが好ましく、機能性分子1個あたり、通常1〜30個、好ましくは1〜25個、さらに好ましくは1〜20個の範囲内であることができる。
細胞内および核内移行量
上記ペプチド−磁性ナノ粒子複合体の細胞内および核内移行量は、該複合体を培養細胞上に添加し、一定時間放置後に細胞質および核を分けて回収し、NMRによりT2緩和時間を測定することにより、取り込まれた磁性ナノ粒子の含量を測定することができ、それにより、本発明のペプチドと従来のPTDとの移行能力を比較することができる。
対象とする細胞
本発明のペプチド−機能性分子複合体を移行させることができる対象細胞としては、細胞壁を持たない細胞であれば、特に制限はなく、分裂・非分裂いずれのタイプのものであってもよく、用途によって任意に選択することができる。例えば、遺伝子導入試薬として基礎研究用途に使用する場合には、バクテリアから昆虫、哺乳類までの各種正常細胞、腫瘍細胞または不死化細胞が広範に挙げられ、また、ヒト疾病の治療に応用する場合には、哺乳類の各種正常細胞、腫瘍細胞または不死化細胞(例えば、CHO、COSなど)、好ましくはヒトの各種正常細胞、腫瘍細胞または不死化細胞(例えば、HeLa、Huh−7、293、MCF−7、神経系細胞、血球系浮遊細胞など)が挙げられる。
複合体の応用
本発明のペプチドを導入した機能性分子複合体は、細胞内、更には核内への移行性が格段に向上するため、こうした移行性に基づき、ベクターとして使用し、生理活性物質を細胞内および核内運搬するのに利用することができ、機能性分子の性質に応じて種々の用途に応用することができる。例えば、機能性分子として遺伝子を用いれば遺伝子導入に応用することができ、また、細胞毒性分子を用いればDDSとして応用することができるが、本発明のペプチドは、様々な機能性分子の細胞内・核内ベクターとしての機能を利用した応用化形態であれば、これらにとどまることなく広く使用することができる。
その際、本発明のペプチドを別の細胞内移行性分子と組み合わせて使用することも可能である。例えば、本発明のペプチドを遺伝子導入ベクターとして機能する陽性荷電高分子に結合することにより、非分裂細胞内への遺伝子導入が可能となる。また、本発明のペプチドを遺伝子発現用のウイルス粒子表面上に結合させることにより、ウイルス粒子を直接核内に運搬し、外来遺伝子を発現させることが可能となる。
一方、本発明のペプチドを高周波磁場照射により誘導加温が可能な上記磁性ナノ粒子に結合させて磁性ナノ粒子複合体とすることにより、細胞質だけでなく核内においても磁性粒子複合体が発熱し、温熱療法への応用が可能となる。また、上記磁性ナノ粒子複合体は、加温と同時に振動することから、核内でDNAや核膜機能を損傷するメカニカルな細胞障害性をも付与することが可能となる。かくして、本発明によれば、磁性ナノ粒子複合体で処理された細胞に高周波磁場照射することを特徴とする細胞処理方法が提供される。
なお、実施例および比較例では、日本国特許第2726520号公報に記載の方法に従って合成した次の1)および2)に示す性質をもつCMDM及び大粒子CMDMを用いた。
1)CMDMの性質
鉄濃度:44.2mg/ml(鉄収率83%)、磁性酸化鉄の粒子径:5.1nm、全体の粒子径:40nm、CMD/鉄重量比:0.7、T1緩和能力:32(mM・sec)−1、T2緩和能力:121(mM・sec)−1。
2)大粒子CMDMの性質
鉄濃度:20.4mg/ml、全体の粒子径:75nm、CMD/鉄重量比:0.6、T1緩和能力:38(mM・sec)−1、T2緩和能力:312(mM・sec)−1。
実施例1:LR20(ペプチド番号1)の合成
固相合成法の原理によるペプチド自動合成装置(Applied Biosystems社製、Pioneer型)を用い、標題のペプチドLR20のアミノ酸20残基配列のプログラミングを行い且つペプチドLR20の製造に必要なペプチド合成用アミノ酸試薬をセットし、自動合成を行った。合成が終了した後、TFAを用いて担体用樹脂からペプチドを切り離し、樹脂を除去後、エーテルを加えて遠心し(3000rpm×5min)、析出したペプチドを凍結乾燥することによりペプチドを得た。得られたペプチドについて、マススペクトル(Applied Biosystems社製、Voyager RP型)により分子量を測定し、また、HPLC(関東化学社製、Mightysil RP−18GPカラム、検出波長220nm、溶出液0.1%TFA/H2O)によるピーク面積から純度を測定し、得られたペプチドがLR20ペプチドであることを確認した。
マススペクトル分析結果:測定分子量2506.7(理論分子量2507.3)、HPLC分析結果:リテンションタイム22.825min(93.6%)。
実施例2:LR20−CMDMの合成
(1) 全体直径40nmのCMDM 8ml(鉄濃度20mg/ml)に、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(以下EDC)623mg、N−ヒドロキシコハク酸イミド(以下NHS)187mgおよびN−エチルアミノマレイミド・トリフルオロ酢酸塩22mgの0.2M−ホウ酸ナトリウムバッファー溶液8mlを順次添加し、室温にて反応を行う。20時間後、限外濾過(分画分子量50,000ダルトン)を行い、不要な試薬類を除去し、リンカー結合CMDM水溶液28mlを得た。
(2) 上記(1)で得たリンカー結合CMDMの水溶液10mlに、LR20(ペプチド番号1)9.8mgを添加し、室温にて反応させる。20時間後、限外濾過(分画分子量50,000ダルトン)を行い、未結合のペプチドを回収し、定量する。上清を水で希釈した後、システイン1.0mgを添加し、室温にて反応させる。20時間後、限外濾過(分画分子量50,000ダルトン)を行い、上清を0.1M−ホウ酸ナトリウムバッファーで8mlに希釈し、LR20−CMDM水性ゾルを得た(複合体番号1)。
鉄濃度:7.6mg/ml、CMD/鉄重量比:0.60、全体粒子径:49nm(PH9)、T1緩和能力:28(mM・sec)−1、T2緩和能力:115(mM・sec)−1、磁性ナノ粒子1個あたりのペプチド結合数:10.0個。
実施例3:LR17(ペプチド番号2)の合成
実施例1において、配列のプログラミングおよび必要なアミノ酸試薬のセットをLR17の配列に合わせる以外は、実施例1と同様にして合成および分析を行い、LR17ペプチドを得た。
マス分析結果:測定分子量2150.25(理論分子量2150.670)、HPLC分析結果:リテンションタイム19.000min(100.0%)。
実施例4:LR17−CMDMの合成
実施例2において、添加するペプチドをLR17(ペプチド番号2)8.4mgとする以外は実施例2と同様に処理し、LR17−CMDM水性ゾルを得た(複合体番号2)。
鉄濃度:6.7mg/ml、CMD/鉄重量比:0.58、磁性ナノ粒子1個あたりのペプチド結合数:11.4個。
実施例5:LR15(ペプチド番号3)の合成
実施例1において、配列のプログラミングおよび必要なアミノ酸試薬のセットをLR15の配列に合わせる以外は、実施例1と同様にして合成および分析を行い、LR15ペプチドを得た。
マス分析結果:測定分子量1857.47(理論分子量1857.340)、HPLC分析結果:リテンションタイム19.600min(100.0%)。
実施例6:LR15−CMDMの合成
実施例2において、添加するペプチドをLR15(ペプチド番号3)7.2mgとする以外は実施例2と同様に処理し、LR15−CMDM水性ゾルを得た(複合体番号3)。
鉄濃度:7.5mg/ml、CMD/鉄重量比:0.60、磁性ナノ粒子1個あたりのペプチド結合数:10.0個。
実施例7:LR15DL(ペプチド番号4)の合成
実施例1において、配列のプログラミングおよび必要なアミノ酸試薬のセットをLR15DLの配列に合わせる以外は、実施例1と同様にして合成および分析を行い、LR15DLペプチドを得た。
マス分析結果:測定分子量1261.97(理論分子量1261.575)、HPLC分析結果:リテンションタイム16.992min(97.7%)。
実施例8:LR15DL−CMDMの合成
実施例2において、添加するペプチドをLR15DL(ペプチド番号4)2.5mgとする以外は実施例2と同様に処理し、LR15DL−CMDM水性ゾルを得た(複合体番号4)。
鉄濃度:7.6mg/ml、CMD/鉄重量比:0.55、磁性ナノ粒子1個あたりのペプチド結合数:10.1個。
実施例9:LR8DHF(ペプチド番号5)の合成
実施例1において、配列のプログラミングおよび必要なアミノ酸試薬のセットをLR8DHFの配列に合わせる以外は、実施例1と同様にして合成および分析を行い、LR8DHFペプチドを得た。
マス分析結果:測定分子量977.26(理論分子量977.27)、HPLC分析結果:リテンションタイム18.950min(98.5%)。
実施例10:LR8DHF−CMDMの合成
実施例2において、添加するペプチドをLR8DHF(ペプチド番号5)3.8mgとする以外は実施例2と同様に処理し、LR8DHF−CMDM水性ゾルを得た(複合体番号5)。
鉄濃度:7.5mg/ml、CMD/鉄重量比:0.52、磁性ナノ粒子1個あたりのペプチド結合数:10.1個。
比較例1:LR11(ペプチド番号6)GGC付加品の合成
実施例1において、配列のプログラミングおよび必要なアミノ酸試薬のセットをLR11+GGCの配列に合わせる以外は、実施例1と同様にして合成および分析を行い、LR11ペプチド(GGC付加品)を得た。
マス分析結果:測定分子量1645.05(理論分子量1645.05)、HPLC分析結果:リテンションタイム19.308min(94.1%)。
比較例2:LR11−CMDMの合成
実施例2において、添加するペプチドをLR11(ペプチド番号6)のC末端にGGCを付加したもの6.4mgとし、かつ添加する際にDMSOに溶解させておくこと以外は実施例2と同様に処理し、LR11−CMDM水性ゾルを得た(複合体番号6)。
鉄濃度:7.5mg/ml、CMD/鉄重量比:0.61、磁性ナノ粒子1個あたりのペプチド結合数:10.4個。
比較例3:LR8DHFRI(ペプチド番号7)の合成
実施例1において、配列のプログラミングおよび必要なアミノ酸試薬のセットをLR8DHFRIの配列に合わせる以外は、実施例1と同様にして合成および分析を行い、LR8DHFRIペプチドを得た。
マス分析結果:測定分子量708.98(理論分子量707.91)、HPLC分析結果:リテンションタイム16.88min(96.1%)。
比較例4:LR8DHFRI−CMDMの合成
実施例2において、添加するペプチドをLR8DHFRI(ペプチド番号7)4.5mgとする以外は実施例2と同様に処理し、LR8DHFRI−CMDM水性ゾルを得た(複合体番号7)。
鉄濃度:7.1mg/ml、磁性ナノ粒子1個あたりのペプチド結合数:10.3個。
比較例5:LR8DRIHF(ペプチド番号8)の合成
実施例1において、配列のプログラミングおよび必要なアミノ酸試薬のセットをLR8DRIHFの配列に合わせる以外は、実施例1と同様にして合成および分析を行い、LR8DRIHFペプチドを得た。
マス分析結果:測定分子量708.40(理論分子量707.91)、HPLC測定純度:100.0%
比較例6:LR8DRIHF−CMDMの合成
実施例2において、添加するペプチドをLR8DRIHF(ペプチド番号8)4.5mgとする以外は実施例2と同様に処理し、LR8DRIHF−CMDM水性ゾルを得た(複合体番号8)。
鉄濃度:6.6mg/ml、磁性ナノ粒子1個あたりのペプチド結合数:10.7個。
比較例7:C45D18(ペプチド番号9)の合成
実施例1において、配列のプログラミングおよび必要なアミノ酸試薬のセットをC45D18の配列に合わせる以外は、実施例1と同様にして合成および分析を行い、C45D18ペプチドを得た。
マス分析結果:測定分子量3207.1
比較例8:C45D18−CMDMの合成
実施例2において、添加するペプチドをC45D18(ペプチド番号9)12.5mgとする以外は実施例2と同様に処理し、C45D18−CMDM水性ゾルを得た(複合体番号9)。
鉄濃度:7.4mg/ml、CMD/鉄重量比:0.58、全体粒子径:46nm(PH9)、T1緩和能力:29(mM・sec)−1、T2緩和能力:117(mM・sec)−1、磁性ナノ粒子1個あたりのペプチド結合数:10.3個。
比較例9:Penetratin(ペプチド番号10)GGC付加品の合成
実施例1において、配列のプログラミングおよび必要なアミノ酸試薬のセットをPenetratin+GGCの配列に合わせる以外は、実施例1と同様にして合成および分析を行い、Penetratinペプチド(GGC付加品)を得た。
マス分析結果:測定分子量2464.38(理論分子量2464.03)、HPLC分析結果:リテンションタイム19.28min(99.5%)。
比較例10:Penetratin−CMDMの合成
実施例2において、添加するペプチドをPenetratin(ペプチド番号10)のC末端にGGCを付加したもの9.5mgとする以外は実施例2と同様に処理し、Penetratin−CMDM水性ゾルを得た(複合体番号10)。
鉄濃度:7.7mg/ml、CMD/鉄重量比:0.60、磁性ナノ粒子1個あたりのペプチド結合数:9.8個。
比較例11:tat(ペプチド番号11)GGC付加品の合成
実施例1において、配列のプログラミングおよび必要なアミノ酸試薬のセットをtat+GGCの配列に合わせる以外は、実施例1と同様にして合成および分析を行い、tatペプチド(GGC付加品)を得た。
マス分析結果:測定分子量1834.3
比較例12:tatペプチド−CMDMの合成
実施例2において、添加するペプチドをtatペプチド(ペプチド番号11)のC末端にGGCを付加したもの7.0mgとする以外は実施例2と同様に処理し、tatペプチド−CMDM水性ゾルを得た(複合体番号11)。
鉄濃度:7.3mg/ml、CMD/鉄重量比:0.57、磁性ナノ粒子1個あたりのペプチド結合数:10.1個。
比較例13:YM−3(ペプチド番号12)GGC付加品の合成
実施例1において、配列のプログラミングおよび必要なアミノ酸試薬のセットをYM−3+GGCの配列に合わせる以外は、実施例1と同様にして合成および分析を行い、YM−3ペプチド(GGC付加品)を得た。
マス分析結果:測定分子量1777.78(理論分子量1777.10)、HPLC分析結果:リテンションタイム18.36min(99.1%)。
比較例14:YM−3−CMDMの合成
実施例2において、添加するペプチドをYM−3(ペプチド番号12)のC末端にGGCを付加したもの7.0mgとする以外は実施例2と同様に処理し、YM−3−CMDM水性ゾルを得た(複合体番号12)。
鉄濃度:7.3mg/ml、CMD/鉄重量比:0.59、磁性ナノ粒子1個あたりのペプチド結合数:10.6個。
実施例11:LR17−大粒子CMDMの合成
実施例4において、用いるCMDMを全体直径75nmのものとする以外は、実施例4と同様に処理し、LR17−大粒子CMDM水性ゾルを得た(複合体番号13)。
鉄濃度:7.5mg/ml、CMD/鉄重量比:0.34、磁性ナノ粒子1個あたりのペプチド結合数:16.2個。
実施例12:LR15DL−Qdotの合成
QdotITK705TM20μlにsulfo−SMCC 7μgを加え、25℃で30分反応させた。その後、サイズ排除クロマトグラフィー(セファデックスG50、溶出液:0.01M−PBS)に供し、不要な試薬を除去した。最後にLR15DLを2μg加え、25℃で反応することによりLR15DL−Qdot水性ゾルを得た(複合体番号14)。
実施例13:LR15DL−EGFPの合成
LR15DL(ペプチド番号4)とEGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)を、モル比1:1、3:1、10:1で混合し、4℃で1時間インキュベートし、結合量の異なる3種類のLR15DL−EGFPを得た(複合体番号15)。
実施例14:Hisタグ−LR15DL−EGFPキメラタンパク質の調製
ヒスチジン6個をタグとして発現する発現プラスミドDNAとしてpET15bプラスミドを用いた。まず、このベクターにEGFPをコードするDNA配列を挿入した。次いで、このDNA中のNdeI−BamHIサイトに、LR15DLをコードするDNA(AGG ATC TTC ATC CAC TTC CGG ATC GGC TGC)を挿入した組換え体を作製した。それぞれの発現プラスミドDNAを組み換え蛋白質発現用大腸菌であるBL21(ノバジェン社製)に導入し、発現させた。得られた粗タンパク質は、Hisタグと特異的にキレート結合するニッケルで表面処理したアフィニティーカラム(インビトロジェン社製、型番R901−15)にて精製することにより、(His)6−EGFP単独と(His)6−LR15DL−EGFPキメラタンパク質を得た(複合体番号16)。
試験例1(磁性粒子のHeLa細胞内および核内移行能)
実施例1〜11および比較例1〜15にて合成した各複合体について、HeLa細胞内および核内移行試験を実施した。その実験方法は以下のとおりである。
サイミジンにより細胞周期を止めたHeLa細胞2×106個に対し、実施例1〜11および比較例1〜15により得られた各種のペプチド−磁性ナノ粒子複合体(Fe濃度:0.7mg/mlに培養液で調整)を3ml添加した。18時間後、PBSで細胞を洗浄・回収し、遠心沈降(2000rpm×5min)によりペレット化した。これに700mlのPBSを加えて再懸濁後、ダウンスホモジナイザーにて細胞を破砕・遠心沈降(2000rpm×5min)した。この時、上清は細胞質画分であり、ペレットは核画分である(ペレットには0.5%Triton X−100/PBS溶液を加え、超音波破砕する)。このようにして得られたそれぞれの画分のT2緩和時間をNMRにて測定した。並行して同画分のタンパク質濃度をBSAプロテインアッセイ法にて測定しておく。
T2緩和時間と磁性体濃度の間には一定の関係式が成立するので、試験前後で試料のT2緩和能力は変化しないと仮定し、磁性体濃度を算出することができる。求めた濃度はさらにタンパク質濃度にて補正した。結果を図1及び図2に示す。
図1の結果から明らかなとおり、本発明により得られたペプチドからなる複合体番号1〜5は、既存のペプチドからなる複合体番号9〜12よりも、数倍〜数十倍高い移行機能を示した。
本発明のペプチドからなる複合体の中でも、複合体番号1〜3は、この順に機能が向上したことから、C末端側のアミノ酸配列R H S R Iは細胞内および核内移行には不要の部分であり、この部分を欠いたペプチド番号3のペプチドが最も優れた細胞内および核内移行機能を有することが示された。また、複合体番号4の結果から、アミノ酸配列L Q Q L Lを除去しても細胞内への移行はやや減じたものの、核内への移行は十分に保持していることが示された。さらに、複合体番号5〜8の結果からは、ペプチド番号5で示されるアミノ酸配列R IおよびF IおよびR I G Cが、細胞内および核内移行機能に必要な最小配列であることが示唆された。
図2の結果から、移行させるCMDMの粒子直径を増大させても、細胞内への移行量は変わらず、導入ペプチド量に左右されることが示唆された。
試験例2(磁性粒子の神経細胞内および核内移行能)
対象細胞として、マウス胎児の大脳皮質より調整した神経細胞を用いること以外は試験例1と同様の方法にて、複合体番号1、2、12の神経細胞内および核内移行試験を実施した。結果を図3に示す。
図3の結果から、本発明のペプチドは、神経細胞内および核内に対しても、既存のペプチドより数倍高い移行能を示した。
試験例3(磁性粒子の末梢血単核球細胞内移行能)
ヒト末梢血単核球細胞2×106個に対し、複合体番号2および12(Fe濃度:0.7mg/mlに培養液で調整)を添加した。ヒト末梢血単核球細胞は被験者の血液からLymphoprep(AXIS−SHIELD社)を用いて調製した。18時間後に細胞を回収し、PBSで3回洗浄した後に1% Triton X−100を含むPBS 0.6mlに懸濁し、超音波破砕した。得られたサンプルのT2緩和時間をNMRにて測定し、磁性体濃度を算出した。結果を図4に示す。
図4の結果から、本発明のペプチドは、末梢血単核球細胞に対しても、既存のペプチドより高い移行能を示した。
試験例4(量子ドットのHeLa細胞内および核内移行能)
実施例12で合成したLR15DL−Qdot(複合体番号14)について、細胞内および核内移行試験を以下の方法で実施した。
サイミジンにより細胞周期を止めたHeLa細胞4×105個に対し、実施例12で得られたLR15DL−Qdot複合体(複合体番号14)を終濃度6nMとなるように添加した。16時間後、PBSで細胞を3回洗浄し、スクレーパーで細胞を剥がし回収した。PBSで細胞を1回洗浄し、ダウンスホモジナイザーにて細胞を破砕・遠心沈降(2000rpm×5min)した。この時、上清は細胞質画分であり、ペレットは核画分である(ペレットには0.5%Triton X−100/PBS溶液を加え、超音波破砕する)。このようにして得られたそれぞれの画分の蛍光輝度を測定した。得られた画分の蛍光輝度を励起波長350nm、蛍光波長700nmの条件で測定した。結果を図5に示す。
図5の結果から、移行させる物質としてQdot(登録商標)を選択しても、同様に細胞内・核内移行することが確認できた。
試験例5(タンパク質の細胞内移行能1)
実施例13にて合成したLR15DL−EGFP(複合体番号15)について、細胞内移行試験を以下の方法で実施した。
実施例13により得られたLR15DL−EGFP(複合体番号15)をHEK293T細胞に対し10μg/mlの濃度になるように添加し、3℃ 4時間インキュベートした。細胞をトリプシンで処理し、EGFPの取り込みにより蛍光を発する細胞量をFACS(Fluorescence Activated Cell Sorting)解析にて測定した。結果を図6に示す。
図6の結果から、本発明のペプチドは、タンパク質を細胞内移行する能力を持つことが確認できた。また、その移行能力は本ペプチドの結合量に依存することが示された。
試験例6(タンパク質の細胞内移行能2)
実施例14にて合成した(His)6−LR15DL−EGFPキメラタンパク質(複合体番号16)について、細胞内移行試験を以下の方法で実施した。
HEK293T細胞に、実施例14により得られた(His)6−LR15DL−EGFP(複合体番号16)を17.5μg/mlの濃度になるように添加し37℃ 4時間インキュベートした後、細胞をリンスして余分な複合体を除去した。翌日、細胞をトリプシンを用いて剥がし、EGFPの取り込みにより蛍光を発する細胞量をFACS解析にて測定した。結果を図7に示す。
図7の結果から、本発明のペプチドのアミノ酸配列が組み込まれたキメラタンパク質が、細胞内移行能力を持つことが確認できた。
試験例7(細胞毒性試験)
本発明のペプチドの、細胞内DNAに対する損傷を以下の方法で試験した。
(1日目) ディッシュ上に5×104個のHeLa細胞を播種し、10%FCS/DMEM培地(2ml)で培養した。
(2日目) リコンビナントVpr(Vpr由来タンパク質)、C45D18(ペプチド番号9)、LR20(ペプチド番号1)を添加し、2日間インキュベートした。
(4日目) 以降、次の順で処理した:ディッシュをPBSで洗浄→4%パラホルムアルデヒドで固定→氷上で20分インキュベートした後、PBSで洗浄→1%トライトンX100/2MHCl溶液を200ul添加後、室温で30分インキュベート→1%BSA200ulでブロッキング、室温1時間→anti−γH2AX溶液を添加し、切断されたDNA二重鎖を染色(37℃30分)→cy3−anti−mouselgG溶液を添加し、室温30分→DAPI/PBSTで核を染色(3分)→スライドグラス上にて検鏡した。
結果を図8に示す。図8において、染色された部分は切断されたDNAを示す。
図8の結果から、本発明のペプチド群における代表的な1つであるLR20は、DNAへの損傷度合いが低減していることがわかる。左上:バッファーコントロール、右上:リコンビナントVpr、左下:C45D18、右下:LR20。
また、LR15DLについても同様の試験を実施し、DNAの損傷が見られないことを確認した。
試験例8(本ペプチド−磁性ナノ粒子複合体を取り込ませた細胞の高周波磁場処理)
実施例1で得られたLR20−CMDM(複合体番号1)と、原料CMDM及びLR20ペプチド単体を、HeLa細胞に、Feとして800ug/ml添加し、12時間インキュベートした後の細胞に、周波数350kHzおよび磁場強度21mTの高周波磁場を1時間照射した。その3日後の細胞増殖の様子を図9に示す。染色された部分は生存細胞を示す。
図9の結果から、LR20−CMDM複合体は、磁場照射により細胞に損傷を与える傾向があることがわかる。
本ペプチドは、また、薬物または薬物包接化合物と結合することにより、目的細胞へのDOSとして利用することができる。
本ペプチドは、さらに、MRI撮影および磁場照射による発熱が可能な磁性粒子に結合することにより、分子イメージング、細胞磁気標識、または癌細胞を殺すための高周波磁場処理に利用することができる。
[配列表]
Claims (13)
- N末端から順にアミノ酸配列RIおよびFIおよびRIGCを含んでなるペプチドであって、
RILQQLLFIHFRIGCRHSRI、
RILQQLLFIHFRIGCRH、
RILQQLLFIHFRIGC、
RIFIHFRIGCおよび
RIFIRIGC
からなる群より選ばれる配列からなり、かつ、前記配列中のアミノ酸残基はα−アミノ酸の一文字記号である、ペプチド。 - アミノ酸配列RILQQLLFIHFRIGCRHSRIからなる請求項1に記載のペプチド。
- アミノ酸配列RILQQLLFIHFRIGCRHからなる請求項1に記載のペプチド。
- アミノ酸配列RILQQLLFIHFRIGCからなる請求項1に記載のペプチド。
- アミノ酸配列RIFIHFRIGCからなる請求項1に記載のペプチド。
- アミノ酸配列がRIFIRIGCからなる、請求項1に記載のペプチド。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のペプチドを有効成分とする、生理活性物質を細胞内または細胞核内に運搬するためのベクター。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のペプチドと機能性分子とが直接またはリンカー分子を介して間接的に連結してなる複合体。
- 機能性分子が核酸類、アミノ酸類、脂質、糖類およびその他の高分子化合物より選ばれる生理活性物質である請求項8に記載の複合体。
- 機能性分子が磁性ナノ粒子またはリポソームである請求項8に記載の複合体。
- 請求項10に記載の複合体であって、該複合体で処理された細胞が高周波磁場照射されることを特徴とする複合体。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のペプチドとサイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、HER2抗体、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ、SV40ラージT抗原、テロメラーゼ、突然変異体p53およびBclxLからなる群より選ばれるタンパク質またはポリペプチドとの結合体(コンジュゲート)を組み換え遺伝子を用いて作製する方法。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のペプチドをコードするDNAまたはRNA。
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