JP2022510309A - ヒトｌｌｒｃ２４タンパク質由来の細胞膜透過ドメイン - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒトＬＲＲＣ２４タンパク質由来の細胞膜透過ドメインに関する。より具体的には、前記ヒトＬＲＲＣ２４タンパク質由来の細胞膜透過ドメイン（ＬＲＲＣ２４Ｐ細胞膜透過ドメイン）又は細胞透過ペプチド及びそれを含む細胞内送達システムに関するものである。本発明のヒトＬＲＲＣ２４タンパク質由来の細胞膜透過ドメイン及びそれを利用して化合物、生体分子及び様々なポリマー物質などのカーゴ（Cargo）物質を細胞内へ送達することができる。本発明のＬＲＲＣ２４Ｐ細胞膜透過ドメインは、従来の細胞透過ペプチドと比較して、さらに高い細胞透過効率を示し、且つヒトタンパク質由来であり、外来タンパク質由来のペプチドが引き起こす副作用及び免疫反応を避けることができるので、人体に適用される化合物、生体分子及び様々なポリマー物質を効果的に細胞内へ送達する方法として有用に使用することができる。
Description
本発明は、ヒトＬＲＲＣ２４タンパク質由来の細胞膜透過ドメイン及びそれを含む細胞内送達システムに関するものである。
疾患を治療するか、症状の緩和に使用される医薬品は、大きく低分子化合物医薬品とポリマーバイオ医薬品に分類される。バイオ医薬品には、治療用タンパク質、抗体、予防又は治療のためのワクチン、遺伝子治療剤、及び細胞治療剤などが含まれる。特に、組換えタンパク質医薬品は、生体を介した生産が難しい治療用タンパク質を遺伝子組換え技術を利用して大量生産した医薬品である。１９８０年代の初めに、糖尿病治療のための組換えヒトインスリン（Recombinant human insulin）が初めて米国ＦＤＡの承認を受けた後、成長ホルモン、エリスロポイエチン、インターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、血液凝固因子などの様々な組換えタンパク質の医薬品が発売されている。しかし、細胞膜を通過して細胞内部に入り込み活性を示すことが比較的容易な低分子化合物の医薬品に比べて、組換えタンパク質又は核酸などを含む多くのポリマー物質は、細胞内への送達がかなり難しく、医薬品としての効能が示されるには大きな困難があった。従って、ポリマー物質の細胞内送達のために、電気穿孔法（Electroporation）、微細注入法（Microinjection）、陽イオン性脂質小胞体（Cationic lipid vesicle）、ウイルスベクター（Viral vector）、ウイルス様粒子（Virus-like-particles）等を利用した方法が使用又は研究されてきた。しかし、前述のような方法は、生体に直接利用することが難しいか、生体から分離した細胞に送達後、再び生体へ注入しなければならない困難があり、それによる時間とコストの増加が大きくなるという困難がある。また、生体内でアポトーシス又は免疫反応などを誘導する副作用を引き起こすこともあり、適用に大な限界を有していた。
前述の問題を克服できる新しい薬物送達システム（Drug delivery system）及びポリマーバイオ医薬品の開発のための研究が活発に行われており、その中の代表的な方法は、タンパク質送達ドメイン（ＰＴＤ）又は細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）として知られている送達体である。細胞透過ペプチドは、ＨＩＶウイルスのＴＡＴタンパク質及びＴＡＴタンパク質内に存在するポリペプチド（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＧ、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）が細胞膜を通過する性質を有するものとして初めて明らかになった後、ショウジョウバエ由来のペネトラチン（Penetratin）（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）、ＨＩＶ糖タンパク質４１由来のＭＰＧ（ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ）、ウシのプリオンタンパク質由来のＢＰｒＰｒ（ＭＶＫＳＫＩＧＳＷＩＬＶＬＦＶＡＭＷＳＤＶＧＬＣＫＫＲＰ）、ヒトＨｐｈ－１タンパク質由来のＨｐｈ－１（ＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲ）、ヒトＮＬＢＰタンパク質由来のＮＰ２（ＫＩＫＫＶＫＫＫＧＲＫ）などの新しい細胞透過ペプチドが開発された。以後、前述のような細胞透過ペプチドを利用した研究が活発に行われてきており、これらにより、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＰＮＡ（Peptide nucleic acid）、タンパク質、リポソームナノ粒子のようなカーゴ物質を効果的に細胞内へ送達することができることが明らかになった。
先行研究によって、細胞透過ペプチドが直接透過（Direct penetration）を介してエネルギー非依存的であり、低い温度でもポリマー物質を細胞内へ送達可能であることが明らかになり、エンドサイトーシス（Endocytosis）を介した透過もまた可能であることが明らかになった。
現在の細胞透過ペプチドは、ＴＡＴ－ＪＢＤ２０を利用した脳血管疾患（Cerebral ischemia）及び変性脳疾患（Alzheimer's disease）の治療剤の開発、ＴＡＴ－ＢＨ４を利用したルー・ゲーリッグ病（amyotrophic lateral sclerosis）の治療剤の開発、ＭＰＧ－８／ｓｉＲＮＡ及びＴＡＴ－ＤＲＢＤ／ｓｉＲＮＡを利用した癌治療剤などの前臨床実験が行われている。また、ＴＡＴ－δＰＫＣ阻害剤を利用した心筋梗塞（Myocardial infarction）の治療剤の開発、ＴＡＴ－ＪＢＤ２０を利用した聴力損失及び炎症治療剤の開発、ｐ２８を利用した脳腫瘍治療剤などが臨床実験中にある。
前記のように、細胞透過ペプチドに関する研究及びこれを利用した様々な新薬候補物質の開発が活発に行われているが、克服しなければならない問題が存在し、そのために細胞透過効率を改善し、細胞透過ペプチド及びこれと結合されたカーゴ物質による生体内副作用と意図しない免疫反応を最小化することができる新しい細胞透過ペプチドの開発が必要とされている。
そこで、従来の細胞透過ペプチドがウイルスとショウジョウバエなどの非ヒト由来のタンパク質で主に発明されており、透過効率の低い短所を克服するために、ヒト由来のペプチドの中で、高い透過効率を有する細胞透過ペプチド、ヒトＬＲＲＣ２４（Leucine rich repeat containing 24）タンパク質由来細胞透過ペプチドを発明するに至り、ヒト由来タンパク質内に存在するペプチドを対象に従来の細胞透過ペプチドと類似性を確認し、これにより本発明を完成した。
先行技術文献として以下の文献を参照した。
先行技術文献として以下の文献を参照した。
Mutational analysis of a human immunodeficiency virus type 1 Tat protein transduction domain which is required for delivery of an exogenous protein into mammalian cells. J. Gen. Virol., 83 (2002), pp. 1173-1181
The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem., 269 (1994), pp. 10444-10450
A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells. Nucleic Acids Res. 14 (1997) pp. 2730-2736.
N-terminal peptides from unprocessed prion proteins enter cells by macropinocytosis. Biochem. Biophys. Res. Commun., 348 (2006), pp. 379-385
Intranasal delivery of the cytoplasmic domain of CTLA-4 using a novel protein transduction domain prevents allergic inflammation. Nat Med, 12 (2006), pp. 574-579
dNP2 is a blood-brain barrier-permeable peptide enabling ctCTLA-4 protein delivery to ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Commun. 8244 (2015), pp. 1-13
本発明の目的は、高い細胞透過効率を示し、副作用を最小化することができる新規な細胞膜透過ドメインを提供することである。
本発明の別の目的は、ペプチドの末端に細胞内輸送対象のカーゴ（cargo）が結合されている細胞膜透過ドメインを含む細胞内送達システムを提供することである。
本発明のさらに別の目的は、ペプチドの末端に細胞内輸送対象のカーゴ（cargo）が結合されている細胞膜透過ドメインを細胞に接触させる工程を含むカーゴを細胞内へ輸送する方法を提供することである。
本発明は、前記目的を達成するために、ヒトＬＲＲＣ２４（Leucine rich repeat containing 24）タンパク質由来配列番号１～２２のいずれか一つのポリペプチドを含む細胞膜透過ドメインを提供する。
本発明において、用語「細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）」は、インビトロ及び／又はインビボ上で輸送対象のカーゴ（Cargo）を細胞内へ輸送できる能力を有するペプチドを意味し、用語「細胞膜透過ドメイン」と混用される。
また、本発明において、用語「ペプチド」又は「ペプタイド」は、ペプチド結合によって４個～１０００個のアミノ酸残基が互いに結合され形成された鎖状のポリマーを意味し、「ポリペプチド」又は「ポリペプタイド」と相互混用可能な意味である。
本発明では、人体内へ細胞透過ペプチドを介してカーゴ物質送達のときに生じる副作用を最小化するために、従来のウイルス又は別の種に由来する細胞透過ペプチドと違って、ヒト由来タンパク質内に存在するペプチドであるため、従来の細胞透過ペプチドと比較して、細胞内へ非常に高い送達効率を有し、人体に処理時の副作用を最小化することができる新規なヒト由来細胞膜透過ドメイン又は細胞透過ペプチドを提供する。
本発明は、前記細胞膜透過ドメイン及び前記細胞膜透過ドメインのＮ末端又はＣ末端に融合されたカーゴを含む細胞膜透過率が改善された組換えカーゴを提供する。
前記カーゴは、タンパク質、核酸、脂質又は化合物である組換えカーゴであってもよい。また、前記カーゴは、アジュバント又は抗原であってもよい。
前記カーゴは、タンパク質、核酸、脂質又は化合物である組換えカーゴであってもよい。また、前記カーゴは、アジュバント又は抗原であってもよい。
一実施形態によると、前記カーゴは、ホルモン、免疫グロブリン、抗体、構造タンパク質、シグナル伝達ペプチド、保存ペプチド、膜ペプチド、膜貫通ペプチド、内部ペプチド、外部ペプチド、分泌性ペプチド、ウイルスペプチド、天然（native）ペプチド、糖化タンパク質、断片化タンパク質、ジスルフィド（Disulfide peptide）、組換えタンパク質、化学的に修飾されたタンパク質及びプリオンからなる群から選ばれるいずれか一つである組換えカーゴであってもよい。
また、本発明において、用語「組換えカーゴ」は、細胞膜透過ドメイン及び一個以上のカーゴが遺伝的融合や化学結合によって再結合され形成された複合体を意味する。
さらに、本発明において、用語「接触」は、カーゴが真核又は原核細胞と接することを意味し、このような接触により前記カーゴが前記真核又は原核細胞内へ送達される。
また、本発明において、タンパク質、ペプチドなどを細胞内へ導入させることに対し、運搬、浸透、輸送、送達又は通過するという表現と相互混用する。
また、一実施形態によれば、前記カーゴは、核酸、コーディング核酸配列、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ分子、炭水化物、脂質及び糖脂質からなる群から選ばれるいずれか一つである組換えカーゴであってもよい。
さらに、一実施形態によれば、前記カーゴは、造影物質、薬物又は化学物質である組換えカーゴであってもよい。
本発明において、用語「造影物質」は、医学的映像撮影（Imaging）で生体構造又は流体の造影のために使用されるすべての物質を意味する。前記造影物質は、放射線非透過性造影物質、常磁性造影物質、超常磁性造影物質、ＣＴ造影物質又はその他の造影物質を含むが、これらに限定されない。例えば、放射線非透過金属及びその塩（例えば、金白金など）及びその他の放射線非透過化学物質（例えば、カルシウム塩、硫酸バリウムなどのバリウム塩、タンタル及び酸化タンタル）を含むことができる。常磁性造影物質（ＭＲ映像用）は、ガドリニウムジエチレントリアミン五酢酸及びその誘導体及びその他のガドリニウム、マンガン、鉄、ジスプロシウム（dysprosium）、銅ユーロピウム（europium）、エルビウム（erbium）、クロム、ニッケル及びコバルト錯体ヒドロキシベンジルエチレンジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）を含むことができる。超常磁性造影物質（ＭＲ映像用）は、磁鉄鉱（magnetite）、超常磁性酸化鉄、超小型超常磁性酸化鉄及び単結晶酸化鉄を含むことができる。その他の適した造影物質は、ヨード化及び非ヨード化、イオン性及びノニオン性ＣＲ組成物質及びスピン標識（spin-label）のような造影物質、又はその他の診断活性剤を含むことができる。細胞で発現する場合、容易に検出可能なタンパク質をコーディングするマーカー遺伝子を含むことができる。放射線核種、蛍光物質、酵素補助因子、酵素阻害剤などの多様な標識が利用され得る。
一実施形態において、本発明によるカーゴがタンパク質又はペプチドである場合、移動対象を発現するＤＮＡに輸送ペプチドを発現するＤＮＡを結合させた後、これを発現させることによって、移動対象とペプチドの融合タンパク質形態で輸送ペプチドと移動対象を結合させることができる。融合タンパク質による結合の具体的な例は、以下の通りである：融合タンパク質を生産するためのプライマー（primer）作製時、移動対象を発現するヌクレオチドの前に、輸送ペプチドをコーディングするヌクレオチドを付けた後、得られたヌクレオチドを制限酵素でベクター（例：ＰＥＴベクター）に挿入し、ＢＬ－２１（ＤＥ３）を細胞に導入（transformation）して発現させる。このとき、ＩＰＴＧ（イソプロピールβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）のような発現誘導剤を処理し、融合タンパク質を精製した後、ＰＢＳを処理すれば、前記輸送ペプチドは、染色物質又は蛍光物質、具体的には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ；fluorescein isothiocyanate）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ；Green fluorescent protein）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ；enhanced green fluorescent protein）、ＴａｇＧＦＰ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ、ＰＡＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＰＳ－ＧＦＰ２、黄蛍光タンパク質（ＹＦＰ；Yellow fluorescent protein）、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ；enhanced Yellow fluorescent protein）、ＳＹＦＰ、ＴａｇＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、アズライト（Azurite）、ｍＫａｌａｍａｌ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ；Cyan fluorescent protein）、増強されたシアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ；enhanced Cyan fluorescent protein）、ＴａｇＣＦＰ、ＰＳ－ＣＦＰ２、赤蛍光タンパク質（ＲＦＰ；Red fluorescent protein）、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ６５７、ｍＲＦＰ１、ＰａＴａｇＲＦＰ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＲＦＰ６９３、ｔｄＲＦＰ、青蛍光タンパク質（ＢＦＰ；Blue fluorescent protein）、ｍＴａｇＢＦＰ、黄緑色蛍光タンパク質（ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ）、明るい蛍光タンパク質（Ｓｃａｒｌｅｔ－i；Bright monomeric fluorescent protein）、ｍｐｌｕｍ、ｍｃｈｅｒｒｙ（monomeric cherry fluorescent protein）、ＰＡｍｃｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ（monomeric strawberry fluorescent proteins）、ｍＯｒａｎｇｅ（monomeric orange fluorescent protein）、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＴＦＰ（monomeric teal fluorescent protein）、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ｍＲｕｂｂｙ、ｍＲｕｂｂｙ２、ｍＢａｎａｎａ、ＤＳＲｅｄ（Discosoma sp, red fluorescent protein）、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ｔ－サファイア（T-Sapphire）、ｍＡｐｐｌｅ、ｍｇｒａｐｅ、ビーナス（Venus）、Ｔｏｐａｚ、Ｊ－Ｒｅｄ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｓｉｅ２、ｍＫＯ、ｍＫＯ２、ｍＵＫＧ.ＩＦＰ１．４、ｍＥｏｓ２、ｍＥｏｓ４、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、Ｄｒｏｎｐａ、ｋａｔｕｓｈｋａ、Ｙｐｅｔ、ＣｙＰｅｔ、Ｃｌｏｖｅｒ、ｋａｅｄｅ、ＫｉｋＧＲ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、Ｚｓｇｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、セルーリアン（cerulean）、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β－ラクタマーゼ（ＢＬＡ）、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ又はペルオキシダーゼ（Peroxidase）と結合することができる。
本発明の別の実施形態によれば、本発明は、前記細胞膜透過ドメインをコーディングするポリヌクレオチドを含む遺伝子構造体（Gene construct）を提供する。
また、本発明は、遺伝子構造体を含む、細胞膜透過率が改善された組換えカーゴタンパク質発現用発現ベクターを提供する。
本発明はまた、前記細胞膜透過ドメインに生理活性ペプチドが結合されている結合体及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を個体に投与する工程を含む、子宮頸部癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮癌、膀胱癌、食道癌、頭頸部癌ウィルムス（Wilms）腫瘍、軟部組織の肉、胃癌、膵臓癌、乳癌、気管支癌などの疾患予防又は治療方法を提供する。
本発明による医薬組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップエアロゾルなどの経口製剤、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態に製剤化して使用することができる。組成物に含まれてもよい担体、賦形剤及び希釈剤には、ラクトース、テキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油が挙げられる。
製剤化する場合には、通常、使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を使用して調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれる。このような固形製剤は、前記抽出物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート、スクロース又はラクトース、ゼラチンなどを混合して調製される。また、単純な賦形剤の外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も使用される。経口のための液剤には、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが挙げられるが、よく使用される単純希釈剤である水、流動パラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤懸濁剤には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用される。坐剤の基剤には、ウィテップゾール、マクロゴール、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用される。
本発明の組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾患の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選ぶことができる。しかし、好ましい効果のために、本発明の組成物は、１日０．０００１～５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００１～２５０ｍｇ／ｋｇで投与すれば良い。投与は、１日に１回、又は数回に分けて投与することができる。前記投与量は、いかなる場合であっても本発明の範囲を限定するものではない。
本発明の別の実施形態によれば、前記細胞膜透過ドメインのＮ末端又はＣ末端にカーゴが融合された組換えカーゴを製造する工程；及び前記製造された組換えカーゴを分離された細胞と接触させる工程；を含む細胞内でのカーゴ送達方法を提供する。
また、本発明の別の実施形態によれば、前記細胞膜透過ドメインのＮ末端又はＣ末端にカーゴが融合された組換えカーゴを製造する工程；及び前記製造された組換えカーゴを、ヒトを除いた動物に投与する工程；を含む動物内でのカーゴ送達方法を提供する。
細胞膜透過ドメインと細胞膜の接触において特に求められる条件、例えば、制限的な時間、温度及び濃度などの条件はなく、当業界で細胞膜透過に適用される一般的な条件下で実施することができる。
本発明の細胞透過ペプチドは、従来のペプチドと比較して、大きく改善された透過効率又は細胞透過能を示し、輸送されたカーゴ又は生物学的活性分子を細胞内へ導入させ、効果的に活性を維持するようにし、費用もまた大きく節減させることができる。
また、細胞透過ペプチド又は細胞膜透過ドメインを介して送達されるカーゴ物質の効果を増大させることができる。
さらに、ヒトタンパク質由来の細胞透過ペプチドであるため、非ヒトタンパク質由来のペプチドが誘発する副作用を最小化することができる。
但し、本発明の効果は、前記で言及した効果に制限されなく、言及されていない別の効果は、下記記載から当業者に明確に理解できるであろう。
本明細書で特に定義していない限り、使用されるすべての技術及び科学用語は当業界で通常の技術者が通常的に理解する意味を有する。本明細書に含まれる用語を含む様々な科学的事象はよく知られており、当業界で利用可能である。
本発明は、ヒトＬＲＲＣ２４（Leucine rich repeat containing 24）タンパク質由来配列番号１～２２のいずれか一つのポリペプチドを含む細胞膜透過ドメイン又は細胞透過ペプチドを提供する。
従来の既存細胞透過ペプチドは、ウイルスとショウジョウバエなどの非ヒト由来のタンパク質で主に発明されるか、透過効率の低い短所を有している。これを克服するために、本発明者らは、ヒト由来のペプチド中細胞透過性を有すると予想されるヒトＬＲＲＣ２４タンパク質において４２７位から４３６位のアミノ酸配列からなるＬＲＲＣ２４Ｐペプチドを見出した。
前記配列番号１で示される細胞透過ペプチドは、ヒトＬＲＲＣ２４タンパク質において、４２７位から４３６位のアミノ酸配列からなるＬＲＲＣ２４Ｐの細胞透過ペプチドであり、発明のために使用されたアミノ酸及び塩基配列情報は以下の通りである。
１．ＬＲＲＣ２４Pペプチドアミノ酸配列（配列番号１）:ＲＲＲＲＲＲＫＫＡＲ
２.ＬＲＲＣ２４Ｐ発現遺伝子塩基配列（配列番号２３）:
ｃｇｃｃｇｇｃｇｃｃｇｃａｇｇｃｇａａａａａａｇｇｃｇｃｇｇ
３.ＬＲＲＣ２４P遺伝子合成塩基配列（配列番号２４）:
ｃｇｃｃｇｃｃｇｔａｇａａｇａｃｇｔａａａａａｇｇｃａａｇａ
１．ＬＲＲＣ２４Pペプチドアミノ酸配列（配列番号１）:ＲＲＲＲＲＲＫＫＡＲ
２.ＬＲＲＣ２４Ｐ発現遺伝子塩基配列（配列番号２３）:
ｃｇｃｃｇｇｃｇｃｃｇｃａｇｇｃｇａａａａａａｇｇｃｇｃｇｇ
３.ＬＲＲＣ２４P遺伝子合成塩基配列（配列番号２４）:
ｃｇｃｃｇｃｃｇｔａｇａａｇａｃｇｔａａａａａｇｇｃａａｇａ
遺伝子合成時には、コドン最適化のために、前記のように転換して用いた。細胞透過性を検証するために、ＬＲＲＣ２４Ｐペプチドを発現する塩基配列の後に連結されたＥＧＦＰ蛍光タンパク質（Enhanced Green fluorescent protein）を発現するＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質（２５３アミノ酸）塩基配列情報は、塩基配列２５と同様であり、配列番号２６として記載される実施例で用いたＬＲＲＣ２４Ｐ細胞透過ペプチド又は細胞膜透過ドメインとＥＧＦＰタンパク質と間にリンカー部分の塩基配列は、ｇｇａｇｇｔｇｇｇｇｇｃｔｃｇである。前記ＬＲＲＣ２４Ｐ細胞透過ペプチドは、１０個がアミノ酸であり、親水性であり、正電荷を有する。
本発明の配列番号２～２２で示される細胞透過ペプチド又は細胞膜透過ドメインは、前記ＬＲＲＣ２４Ｐ細胞透過ペプチドの変異（mutant）された細胞透過ペプチドであり、前記ＬＲＲＣ２４Ｐの９位アミノ酸であるアラニンを他のアミノ酸に置換したＬＲＲＣ２４Ｐ変異（mutant）及びＮ末端とＣ末端のアミノ酸をそれぞれ一つずつ欠失したＬＲＲＣ２４Ｐ変異（mutant）された細胞膜ドメイン又は細胞透過ペプチドである。本発明のヒトＬＲＲＣ２４タンパク質由来の細胞膜透過ドメイン又は細胞透過ペプチドは下記表１の通りである。
＜表１＞ヒトＬＲＲＣ２４タンパク質由来の細胞膜透過ドメイン又は細胞透過ペプチド
本発明の利点及び特徴、それらを達成する方法は、詳細に後記されている実施例を参照すれば、明らかになる。以下では、本発明を実施例によって詳細に説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を下記実施例に限定するものではない。
＜実施例１＞ヒトＬＲＲＣ２４タンパク質由来の細胞透過ペプチド（ＬＲＲＣ２４P）とＥＧＦＰ蛍光タンパク質が融合されたタンパク質を発現するプラスミドベクターの作製
ＬＲＲＣ２４の細胞透過効率を実験するために、以下のように人工遺伝子合成を行った。図１に示されように、５’－ＮｈｅＩ制限酵素認識配列－ＬＲＲＣ２４Ｐ塩基配列－リンカー塩基配列－ＥＧＦＰタンパク質塩基配列－終止コドン－ＸｈｏＩ制限酵素認識配列－３’を合成した。
ＬＲＲＣ２４の細胞透過効率を実験するために、以下のように人工遺伝子合成を行った。図１に示されように、５’－ＮｈｅＩ制限酵素認識配列－ＬＲＲＣ２４Ｐ塩基配列－リンカー塩基配列－ＥＧＦＰタンパク質塩基配列－終止コドン－ＸｈｏＩ制限酵素認識配列－３’を合成した。
特に、ＬＲＲＣ２４Ｐ塩基配列は、人工遺伝子合成時、コドン最適化によって同じペプチドを発現する塩基配列に転換しており、細胞透過性を検証するために、ＬＲＲＣ２４Ｐ細胞透過ペプチドの塩基配列の後にＥＧＦＰ蛍光タンパク質を発現する遺伝子を付けて合成した（図２）。また、細胞透過ペプチドとＥＧＦＰタンパク質と間にリンカー塩基配列を入れ、柔軟性を高めた。人工合成遺伝子をＮｈｅＩ制限酵素とＸｈｏＩ制限酵素を処理後、同様にＮｈｅＩ制限酵素とＸｈｏＩ制限酵素を処理したｐＥＴ２８ａ＋プラスミドベクターにＴ４連結酵素を通じて導入した。ここで使用されたｐＥＴ－２８ａプラスミドベクターは、Ｎ－末端に６個のヒスチジン（６×Ｈｉｓ）をＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質の前に発現して、Ｎｉ－ＮＴＡ Ｒｅｓｉｎによるタンパク質精製を可能にする。ＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質人工遺伝子が導入されたｐＥＴ２８ａ＋プラスミドベクターは、Ｔｏｐ１０受容細胞に形質転換後、カナマイシン（Kanamycin）を含むＬＢ寒天プレートで培養し、育ったコロニー（Colony）をＬＢ培地で約１６時間培養した。その後、ＤＮＡ抽出実験によってプラスミドを得た。これをＮｈｅＩ制限酵素とＸｈｏＩ制限酵素で処理した後、アガロースゲル電気泳動法によりＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質人工遺伝子がｐＥＴ－２８ａプラスミドベクターに成功裏に導入されたことを確認した（図３）。
＜実施例２＞ヒトＬＲＲＣ２４タンパク質由来の細胞透過ペプチド（ＬＲＲＣ２４Ｐ）とＥＧＦＰ蛍光タンパク質が融合されたタンパク質の発現条件の確立及び高純度精製
ヒトＬＲＲＣ２４タンパク質由来の細胞透過ペプチド（ＬＲＲＣ２４Ｐ）とＥＧＦＰ蛍光タンパク質が融合されたタンパク質の発現条件の確立するために、実施例１で作製されたプラスミドベクターをＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）受容細胞に形質転換後に、カナマイシン（Kanamycin）を含むＬＢ培地で約１６時間培養した。ここに再び１００倍のＬＢ培地を追加し、Ｏ．Ｄ値が０．４－０．６に達するまで培養した後、ＩＰＴＧ（イソプロピールβを最終濃度１ｍＭになるように添加した後、３７℃で５時間又は２０℃で１６時間培養した。その後、遠心分離で得られた細胞を超音波分解（Sonication）し、再び遠心分離で上清と細胞ペレットとに分離し、これをポリアクリルアミドゲル電気泳動法とクマシーブルー染色によってタンパク質の発現した量と水溶性を確認した（図４）。
ヒトＬＲＲＣ２４タンパク質由来の細胞透過ペプチド（ＬＲＲＣ２４Ｐ）とＥＧＦＰ蛍光タンパク質が融合されたタンパク質の発現条件の確立するために、実施例１で作製されたプラスミドベクターをＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）受容細胞に形質転換後に、カナマイシン（Kanamycin）を含むＬＢ培地で約１６時間培養した。ここに再び１００倍のＬＢ培地を追加し、Ｏ．Ｄ値が０．４－０．６に達するまで培養した後、ＩＰＴＧ（イソプロピールβを最終濃度１ｍＭになるように添加した後、３７℃で５時間又は２０℃で１６時間培養した。その後、遠心分離で得られた細胞を超音波分解（Sonication）し、再び遠心分離で上清と細胞ペレットとに分離し、これをポリアクリルアミドゲル電気泳動法とクマシーブルー染色によってタンパク質の発現した量と水溶性を確認した（図４）。
これにより、ＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質がＩＰＴＧを添加後、２０℃で１６時間培養した条件で、タンパク質の水溶性及び発現効率が高まることを確認した。従って、高純度のＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質を精製するために、同じ条件で形質転換されたＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）受容細胞を培養した後、培養液を遠心分離して、細胞ペレットを得て、溶解バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール）で懸濁した。これを超音波分解して、再び遠心分離で上清を回収し、４５μｍフィルターでろ過した後、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースカラムに上清を通過させて組換えタンパク質を結合させた。Ｎｉ－ＮＴＡアガロースカラムに非特異的に結合したタンパク質を除去するために、洗浄バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール）を利用してＮｉ－ＮＴＡアガロースカラムを洗浄した後、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースカラムに結合した組換えタンパク質を回収するために、溶出バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール）を利用して組換えタンパク質を溶出させた。ＰＤ－１０脱塩用カラムを利用してＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質を含む溶液をＰＢＳに交替した後、これをポリアクリルアミドゲル電気泳動法とクマシーブルー染色により確認した（図５）。
＜実施例３＞ＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質の細胞内送達効率の確認
ＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質の細胞内送達効率を研究するために、既知の細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）、ＴＡＴ（アミノ酸配列：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、 Diabetes 2001 Aug; 50(8): 1706-1713, Proteins Linked to a Protein Transduction Domain Efficiently Transduce Pancreatic Islets）、Ｈｐｈ－１（アミノ酸配列: ＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲ、Nature Medicine 12(5):574-9, June 2006, Intranasal delivery of the cytoplasmic domain of CTLA-4 using a novel protein transduction domain prevents allergic inflammation）、及びＮＰ２（アミノ酸配列：ＫＩＫＫＶＫＫＫＧＲＫ、Nature Communications volume 6, Article number: 8244 (2015), dNP2 is a blood-brain barrier-permeable peptide enabling ctCTLA-4 protein delivery to ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis）に、それぞれＥＧＦＰ蛍光タンパク質が融合されたタンパク質を発現するプラスミドベクターをＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質を発現するプラスミドベクターと同様の方法で作製した。既存のＣＰＰ－ＥＧＦＰ融合タンパク質の発現及び精製もまたＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質と同じ方法で行った。細胞実験のために、Ｊｕｒｋａt細胞を１．５×１０６／ウェルで２４ウェルプレートに分注した後、１０％ウシ胎仔血清と１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０培地２ｍＬに浮遊させ、ＣＰＰ－ＥＧＦＰ融合タンパク質を最終濃度５μＭで処理後、３７℃に維持される５％ＣＯ２培養器で２時間培養した。その後、細胞を含む培地を５ｍＬチューブに移した後、遠心分離して上清を除去し、ＰＢＳ溶液で洗浄することを３回繰り返した。その後、Ｊｕｒｋａｔ細胞を６５０μＬのＰＢＳに浮遊させた後、フローサイトメトリーを通じて細胞内に導入されたＣＰＰ－ＥＧＦＰ融合タンパク質の蛍光を測定し、細胞内導入効率を確認した（図６）。これにより、ＬＲＲＣ２４Ｐ細胞透過ペプチドが既存の細胞透過ペプチドと比較して、約３～５倍の効率を示していることを確認した（図６）。
ＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質の細胞内送達効率を研究するために、既知の細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）、ＴＡＴ（アミノ酸配列：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、 Diabetes 2001 Aug; 50(8): 1706-1713, Proteins Linked to a Protein Transduction Domain Efficiently Transduce Pancreatic Islets）、Ｈｐｈ－１（アミノ酸配列: ＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲ、Nature Medicine 12(5):574-9, June 2006, Intranasal delivery of the cytoplasmic domain of CTLA-4 using a novel protein transduction domain prevents allergic inflammation）、及びＮＰ２（アミノ酸配列：ＫＩＫＫＶＫＫＫＧＲＫ、Nature Communications volume 6, Article number: 8244 (2015), dNP2 is a blood-brain barrier-permeable peptide enabling ctCTLA-4 protein delivery to ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis）に、それぞれＥＧＦＰ蛍光タンパク質が融合されたタンパク質を発現するプラスミドベクターをＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質を発現するプラスミドベクターと同様の方法で作製した。既存のＣＰＰ－ＥＧＦＰ融合タンパク質の発現及び精製もまたＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質と同じ方法で行った。細胞実験のために、Ｊｕｒｋａt細胞を１．５×１０６／ウェルで２４ウェルプレートに分注した後、１０％ウシ胎仔血清と１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０培地２ｍＬに浮遊させ、ＣＰＰ－ＥＧＦＰ融合タンパク質を最終濃度５μＭで処理後、３７℃に維持される５％ＣＯ２培養器で２時間培養した。その後、細胞を含む培地を５ｍＬチューブに移した後、遠心分離して上清を除去し、ＰＢＳ溶液で洗浄することを３回繰り返した。その後、Ｊｕｒｋａｔ細胞を６５０μＬのＰＢＳに浮遊させた後、フローサイトメトリーを通じて細胞内に導入されたＣＰＰ－ＥＧＦＰ融合タンパク質の蛍光を測定し、細胞内導入効率を確認した（図６）。これにより、ＬＲＲＣ２４Ｐ細胞透過ペプチドが既存の細胞透過ペプチドと比較して、約３～５倍の効率を示していることを確認した（図６）。
＜表2＞実施例３で利用された組換えタンパク質
ＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質の濃度別導入効率を確認するために、ＥＧＦＰタンパク質及び現在の最もよく使用される細胞透過ペプチドであるＴＡＴとＥＧＦＰの融合タンパク質を利用して比較実験を行った。ＥＧＦＰ、ＴＡＴ－ＥＧＦＰ及びＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質をそれぞれ最終濃度０．５、１、２、５、１０μＭでＪｕｒｋａｔ細胞に処理した。前記実験と同じ過程で導入効率を確認した（図７）。これにより、ＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質が濃度依存的に細胞内に導入されることを確認した。ＴＡＴ－ＥＧＦＰ融合タンパク質と比較して、すべての濃度において格段に高い送達効率を示していることを確認した。
次に、ＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質の時間別導入効率を確認するために、ＥＧＦＰ、ＴＡＴ－ＥＧＦＰ融合タンパク質を利用して比較実験を行った。ＥＧＦＰ、ＴＡＴ－ＥＧＦＰ及びＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質をそれぞれ最終濃度５μＭでＪｕｒｋａｔ細胞に処理した後、それぞれ０．５、１、２、４、６時間培養した。前記実験と同じ過程で導入効率を確認した（図８）。これにより、ＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質が時間依存的に細胞内に導入されていることを確認した。ＴＡＴ－ＥＧＦＰ融合タンパク質と比較して、すべての時間において格段に高い送達効率を示していることを確認した。
＜実施例４＞ＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質の細胞内送達様相の確認
細胞内に導入されたＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質を共焦点顕微鏡で確認するために、まず、ＨｅＬａ細胞を２×１０４／ウェルで２４ウェル細胞培養しライドに分注した後、１０％ウシ胎仔血清と１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地５００μＬに浮遊させ、３７℃に維持される５％ＣＯ２培養器で１８時間培養した。その後、ＥＧＦＰ及びＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質をそれぞれ最終濃度１μＭで細胞に処理した後、１時間培養した。次に、培養液を除去した後、ＰＢＳ溶液で３回洗浄後、４％ＰＦＡ溶液を室温で３０分間処理して、固定した。ＰＦＡ溶液を除去した後、再びＰＢＳ溶液で３回洗浄した後、封入剤を処理して、カバースライドを覆い、共焦点顕微鏡で観察した（図９）。これにより、ＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質がＨｅＬａ細胞内に効果的に導入されたことを確認した。
細胞内に導入されたＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質を共焦点顕微鏡で確認するために、まず、ＨｅＬａ細胞を２×１０４／ウェルで２４ウェル細胞培養しライドに分注した後、１０％ウシ胎仔血清と１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地５００μＬに浮遊させ、３７℃に維持される５％ＣＯ２培養器で１８時間培養した。その後、ＥＧＦＰ及びＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質をそれぞれ最終濃度１μＭで細胞に処理した後、１時間培養した。次に、培養液を除去した後、ＰＢＳ溶液で３回洗浄後、４％ＰＦＡ溶液を室温で３０分間処理して、固定した。ＰＦＡ溶液を除去した後、再びＰＢＳ溶液で３回洗浄した後、封入剤を処理して、カバースライドを覆い、共焦点顕微鏡で観察した（図９）。これにより、ＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質がＨｅＬａ細胞内に効果的に導入されたことを確認した。
＜実施例５＞ＬＲＲＣ２４Ｐ変異(mutant)－ＥＧＦＰ融合タンパク質の細胞内送達効率の確認
ＬＲＲＣ２４Ｐ細胞透過ペプチド変異（mutant）の細胞内送達効率を確認するために、ＬＲＲＣ２４Ｐの９位アミノ酸であるアラニンを他のアミノ酸に置換したＬＲＲＣ２４Ｐ変異(mutant)及びＮ末端とＣ末端のアミノ酸をそれぞれ一つずつ欠失したＬＲＲＣ２４Ｐ変異(mutant)を設計した後、ＬＲＲＣ２４変異(mutant)－ＥＧＦＰ融合タンパク質を発現するプラスミドベクターを作製した後、タンパク質を発現させて精製した。本発明の前記ＬＲＲＣ２４Ｐ細胞透過ペプチド変異のうち、配列名称ＬＲＲＣ２４ＰＭ１～Ｍ８（配列番号２～７、又は配列番号２１及び２８）ペプチドを用いて細胞実験を行った。前記細胞実験のために、Ｊｕｒｋａｔ細胞を１．５×１０６／ウェルで２４ウェルプレートに分注した後、１０％ウシ胎仔血清と１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０培地２ｍＬに浮遊させ、ＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ及びＬＲＲＣ２４Ｐ変異－ＥＧＦＰ融合タンパク質を最終濃度５μＭで処理後、３７℃に維持される５％ＣＯ２培養器で２時間培養した。次に、細胞を含む培地を５ｍＬチューブに移した後、遠心分離して上清を除去し、ＰＢＳ溶液で洗浄することを３回繰り返した。その後、Ｊｕｒｋａｔ細胞を６５０μＬのＰＢＳに浮遊させた後、フローサイトメトリーを通じて細胞内に導入されたＬＲＲＣ２４Ｐ変異(mutant)－ＥＧＦＰ融合タンパク質の蛍光を測定し、細胞内導入効率を確認した（図１０）。これにより、ＬＲＲＣ２４Ｐ変異(mutant)が変異を介して導入効率の変化を示しているが、細胞透過能力が維持されることを確認した（図１０）。
ＬＲＲＣ２４Ｐ細胞透過ペプチド変異（mutant）の細胞内送達効率を確認するために、ＬＲＲＣ２４Ｐの９位アミノ酸であるアラニンを他のアミノ酸に置換したＬＲＲＣ２４Ｐ変異(mutant)及びＮ末端とＣ末端のアミノ酸をそれぞれ一つずつ欠失したＬＲＲＣ２４Ｐ変異(mutant)を設計した後、ＬＲＲＣ２４変異(mutant)－ＥＧＦＰ融合タンパク質を発現するプラスミドベクターを作製した後、タンパク質を発現させて精製した。本発明の前記ＬＲＲＣ２４Ｐ細胞透過ペプチド変異のうち、配列名称ＬＲＲＣ２４ＰＭ１～Ｍ８（配列番号２～７、又は配列番号２１及び２８）ペプチドを用いて細胞実験を行った。前記細胞実験のために、Ｊｕｒｋａｔ細胞を１．５×１０６／ウェルで２４ウェルプレートに分注した後、１０％ウシ胎仔血清と１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０培地２ｍＬに浮遊させ、ＬＲＲＣ２４Ｐ－ＥＧＦＰ及びＬＲＲＣ２４Ｐ変異－ＥＧＦＰ融合タンパク質を最終濃度５μＭで処理後、３７℃に維持される５％ＣＯ２培養器で２時間培養した。次に、細胞を含む培地を５ｍＬチューブに移した後、遠心分離して上清を除去し、ＰＢＳ溶液で洗浄することを３回繰り返した。その後、Ｊｕｒｋａｔ細胞を６５０μＬのＰＢＳに浮遊させた後、フローサイトメトリーを通じて細胞内に導入されたＬＲＲＣ２４Ｐ変異(mutant)－ＥＧＦＰ融合タンパク質の蛍光を測定し、細胞内導入効率を確認した（図１０）。これにより、ＬＲＲＣ２４Ｐ変異(mutant)が変異を介して導入効率の変化を示しているが、細胞透過能力が維持されることを確認した（図１０）。
Claims (10)
- ヒトＬＲＲＣ２４（Leucine rich repeat containing 24）タンパク質由来配列番号１～２２のいずれか一つのポリペプチドを含む細胞膜透過ドメイン。
- 請求項１に記載の細胞膜透過ドメイン及び前記細胞膜透過ドメインのＮ末端又はＣ末端に融合されたカーゴを含む細胞膜透過率が改善された組換えカーゴ。
- 前記カーゴは、タンパク質、核酸、脂質又は化合物である請求項２に記載の組換えカーゴ。
- 前記カーゴは、ホルモン、免疫グロブリン、抗体、構造タンパク質、シグナル伝達ペプチド、保存ペプチド、膜ペプチド、膜貫通ペプチド、内部ペプチド、外部ペプチド、分泌性ペプチド、ウイルスペプチド、天然（native）ペプチド、糖化タンパク質、断片化タンパク質、ジスルフィド（Disulfide peptide）、組換えタンパク質、化学的に修飾されたタンパク質及びプリオンからなる群から選ばれるいずれか一つである請求項２に記載の組換えカーゴ。
- 前記カーゴは、核酸、コーディング核酸配列、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ分子、炭水化物、脂質及び糖脂質からなる群から選ばれるいずれか一つである請求項２に記載の組換えカーゴ。
- 前記カーゴは、造影物質、薬物又は化学物質である請求項２に記載の組換えカーゴ。
- 請求項１に記載の細胞膜透過ドメインをコーディングするポリヌクレオチドを含む遺伝子構造体（Gene construct）。
- 請求項７に記載の遺伝子構造体を含む細胞膜透過率が改善された組換えカーゴタンパク質発現用発現ベクター。
- 請求項１に記載の細胞膜透過ドメインのＮ末端又はＣ末端にカーゴが融合された組換えカーゴを製造する工程；及び
前記製造された組換えカーゴを分離された細胞と接触させる工程；
を含む細胞内へのカーゴ送達方法。 - 請求項１に記載の細胞膜透過ドメインのＮ末端又はＣ末端にカーゴが融合された組換えカーゴを製造する工程；及び
前記製造された組換えカーゴを、ヒトを除いた動物に投与する工程；
を含む動物内へのカーゴ送達方法。
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