RO112336B1 - Banca de biooligomeri, metoda de obtinere si metoda pentru determinarea unei secvente - Google Patents

Banca de biooligomeri, metoda de obtinere si metoda pentru determinarea unei secvente Download PDF

Info

Publication number
RO112336B1
RO112336B1 RO93-00398A RO9300398A RO112336B1 RO 112336 B1 RO112336 B1 RO 112336B1 RO 9300398 A RO9300398 A RO 9300398A RO 112336 B1 RO112336 B1 RO 112336B1
Authority
RO
Romania
Prior art keywords
bio
oligomer
peptide
activity
bank
Prior art date
Application number
RO93-00398A
Other languages
English (en)
Inventor
Kit Sang Lam
Sydney Salmon
Victor J Mruby
Evan M Hersh
Fahad Al-Obeidi
Original Assignee
Bioligand Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioligand Inc filed Critical Bioligand Inc
Publication of RO112336B1 publication Critical patent/RO112336B1/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1075—Isolating an individual clone by screening libraries by coupling phenotype to genotype, not provided for in other groups of this subclass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C07K1/047—Simultaneous synthesis of different peptide species; Peptide libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/70—Enkephalins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1062—Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00585—Parallel processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/0059—Sequential processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00592—Split-and-pool, mix-and-divide processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
    • B01J2219/00702—Processes involving means for analysing and characterising the products
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00722—Nucleotides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00725—Peptides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00729—Peptide nucleic acids [PNA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
    • Y10S530/817—Entrapped within the carrier, e.g. gel, hollow fibre

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Heterocyclic Compounds That Contain Two Or More Ring Oxygen Atoms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Polyethers (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Description

Prezenta invenție se referă la o bancă de bio-oligomeri, la metoda de obținere a acesteia, precum și la metode pentru determinarea unei secvențe, utilizând această bancă, și anume biooligomerii din bancă fiind utilizați pentru identificarea și caracterizarea liganzilor capabili de legare a unei molecule acceptor sau pentru medierea unei activități biologice de interes. Bio-oligomerii băncii pot, de asemenea, cataliza o reacție chimică.
Recunoașterea și legarea liganzilor. reglează aproape toate procesele biologice, ca, de exemplu, recunoașterea imunologică, semnalarea celulară și comunicarea, transcripția și translația, semnalizarea intracelulară și cataliza, adică reacțiile enzimatice. Există un interes mai vechi în ceea ce privește identificarea moleculelor ce acționează ca agonist sau care poate agoniza sau antagoniza activitatea liganzilor, ca, de exemplu, hormoni, factori de creștere și agenți neurotransmițători, care induc imunitatea celulei-Bfmediate cu anticorpi) sau celulei-T(mediate cu celule); care pot cataliza reacțiile chimice; sau care pot adapta expresia genei la nivelul transcripției sau translației.
De interes particular sunt liganzii de proteine sau peptide. Aceștia cuprind majoritatea hormonilor, a factorilor de creștere, a moleculelor neuroactive și epitopilor imuni. De altfel, conform celor discutate infra, cele mai multe eforturi pentru creearea antagoniștilor sau antagoniștilor activității biologice mediate prin receptor sau anticorp sau epitopi Tcelulari au fost concentrate pe peptide. Dezvoltarea agenților farmaceutici de fixare pe pozițiile de legare a receptorilor a fost totuși puternic împiedicată de dificultatea determinării secvenței liganzilor peptidici. Numărul real și varietatea unor astfel de secvențe peptidice au transformat această determinare într-o țintă de neatins, excepție făcând determinarea prin izolarea în laborator a unui complex specific, identificarea localizării epitopului și secvențarea acelui epitop. Problema este complicată în continuare, datorită faptului că deseori epitopul este reprezentat de reziduuri de amino acizi care nu sunt continuu în secvența primară.
Unii cercetători în domeniu au încercat să oprească acest îndelungat drum, prin determinarea secvenței de amino acid a unei proteine bazate pe secvența nucleotidică a complementului său. Proteinele sunt peptide mari, compuse din amino acizi; fiecare amino acid este codificat de unul sau mai mulți codoni a trei reziduuri de acizi nucleici. De exemplu, peptida A, conținând amino acid glutamină, poate fi decodată de un codon a trei reziduuri de acizi nucleici: citosină, adenină și guanină. Complementul acestui codon poate fi guanina (care se leagă la citozină), timină (care se leagă la adenină) și citozină, și poate codifica un amino acid în peptida B. Conform teoriei complementarității, peptida B se poate lega de peptida A. In particular (Bost și Blalock), s-a sugerat că orice peptida dată se va lega de o altă peptidă care este codificată de o secvență complementară a unui reziduu de acid nucleic și cu această informație s-a prezis secvența de amino acid a peptidei complementare. S-a folosit secvența pentru sintetizarea peptidei și pentru testarea capacității peptidei legate.
Această abordare nu a oferit soluția problemei, deoarece afinitatea de legare între peptidele complementare a fost în general scăzută și peptidele complementare necesare au fost mai numeroase decât 15 reziduuri. De altfel, această abordare necesită cunoștințe atât asupra secvenței de amino acid cât și a secvenței de acid nucleic a partenerului de legare a proteinei care interesează. De altfel, aceasta abordare nu este valabilă pentru epitopii ce constau în reziduuri de amino acizi care nu sunt contiguu în secvența primară.
Recent, s-a întocmit o serie de rapoarte asupra preparării băncilor de peptide și a utilizării lor în identificarea liganzilor peptidici ce se pot lega la acceptori. O abordare, utilizează bacte
RO 112336 Bl riofagia recombinată pentru a obține bănci mari. Utilizând “phage met hod” (Scott și Smith, 1990, Science 249:386-390; Cwirla și al., 1990. Proc. Matl. Acad. Sci., 87:63786382;Devlin și al., 1990, Science, 249:404-406) s-au construit bănci foarte mari (106 - 10a entități chimice), dar codul genetic și sistemul biologic impun diferite limitări inerente asupra versalității și diversității sistemului. O a doua abordare utilizează în primul rând metode chimice, ca, de exemplu, metoda Geysen, și de secvențe peptidice posibile, una sau mai multe din fiecare putând corespunde părților de legare dintre entitățile care interesează. Cu douăzeci de amino acizi comuni, cunoscuți, în orice secvență a cinci amino acizi înseamnă 205 sau aproape 3,2 106 de combinații posibile de amino acizi. Nici o procedură nu permite sinteza atâtor peptide în același timp. O multiplicitate ulterioară rezultă prin varierea lungimii catenei peptidei. In mod similar, sinteza convențională de peptidă, ca aceea descrisă de Stewart și Young, nu furnizează o metodă pentru sinteza miilor până la milioanelor de peptide în același timp. Suplimentar, nici o altă metodă de sinteză convențională de peptide nu asigură cu certidudine că băncile de peptide legate pe suport solid sunt random. O bancă certă de peptide random, este o bancă cu o distribuție statistică bună a tuturor speciilor moleculare astfel, încât banca să conțină aproximativ rapoarte echimolare din toate speciile individuale ale peptidei.
Sinteza unei peptide random adevărate nu poate fi, în general, însoțită prin adiționarea simultană a diferiților amino acizi într-un singur vas de reacție, deoarece gradul de cuplare a diferiților amino acizi diferă extraordinar în timpul sintezei în faza solidă a peptidei (SPPS) (Ragnarson și al., 1971.Aca. Chem. Scad. 25, 1487, 1489; Ragnasson și al., 1974, J.0rg.Chem.39:3837-3842). De exemplu, viteza de cuplare a glicineiFmoc pe o peptidă în creștere este mult mai mare decât aceea a valinei-Fmoc, probabil datorită împiedicării sterice a părții voluminoase a catenei de valină. Când se amestecă o dată 20 de L-amino acizi eucariotici activați cu rășina, în timpul fiecărui ciclu de cuplare, amino acizii cu cea mai mare viteză de reacție, este de preferat, să fie încorporați în peptide fără a se mai obține rapoarte echimolare din fiecare specie de peptidă. In plus, fiecare din nucleofilele posibile va avea reactivitatea diferită.
Suplimentar, nici una din metodele de sinteză de până acum nu furnizează o sinteză a unei bănci mai mari de 105 peptide, în care o singură specie de peptidă să fie atașată la un singur suport în stare solidă. Reprezentarea unei singure specii pe un suport poate intensifica considerabil tehnicile curente de izolare a peptidelor.
Astfel, este nevoie în domeniul de specialitate de o bancă de secvențe reale de peptide random și secvențe de oligonucleotide, adică secvențe de boligomeri în care o singură specie de biooligomeri să poată fi cu rapiditate izolată din restul băncii. Este de asemenea nevoie, în domeniu, de o metodă rapidă și ieftină de sintetizare a sutelor și miilor de astfel de secvențe reale de bio-oligomeri.
Este cunoscută o metodă de sintetizare a unui amestec de peptide radom. Produsul dorit este înzestrat cu anumite funcționalități chimice, protejate prin grupări de blocare. Până când acestea nu sunt îndepărtate, oligomerul nu este biologic activ, de exemplu în mod frecvent, el este solubil în tampoane apoase. Atunci când grupele de protecție sunt îndepărtate, oligopeptidele sunt și ele simultan îndepărtate din suportul fază solidă pe care sunt sintetizate. înaintea îndepărtării peptidelor din suporturile în fază solidă, grupările funcționale (din reacție) ale catenelor laterale ale amino acizilor sunt protejate. Peptidele total protejate la un suport rășină, au părți aromatice sau alifatice conjugate cu fiecare dintre catenele laterale reactive, de exemplu sulfhidril, carboxil, hidroxil, amido, amino și guanil. Caracterul
RO 112336 Bl hidrofilic, cu atât mai puțin cel antigenic, al unor astfel de peptide protejate este puțin autoevident. Deci, peptidele sunt pe un suport fază solidă într-o formă protejată într-adevăr, toate grupările protectoare sunt îndepărtate în timpul ultimei faze a procedeuli de sinteză și, mai important, oligopeptidele sunt îndepărtate din suportul fază solidă pe care sunt sintetizate simultan cu îndepărtarea grupărilor protectoare. Astfel, procedeul conține diferite faze ca fiind necesare pentru sinteza unei peptide, adică neutralizarea deprotectoare și faze de cuplare care sunt repetate pentru fiecare din amino acizii succesivi, până când secvențele dorite sunt asamblate. (Furka et. Al., 14 The Internațional Congres of Biochemistry).
De asemenea, în literatura de specialitate s-a mai arătat că metodele generale care au fost folosite pentru sinteza peptidelor pe suporturi fază solidă, pot fi folosite pentru sinteza acelor tipuri de heteropolimeri. Catena laterală reactivă a amino acizilor, catenele laterale sulfhidril, carboxil, hidroxil, amido, amino și guanil sunt protejate prin grupări care sunt stabile în condițiile folosite pentru îndepărtarea grupării Nalfa-protectoare, grupare îndepărtată la începutul fiecărui ciclu de cuplare. Faza de “deprotejare” se referă la îndepărtarea grupării Nalfa-protectoare, iar ruperea din rășină și deprotejarea catenelor laterale sunt realizate în sinteza peptidelor convențională printr-o singură procedură care este numită “rupere și deprotejare cu HF”. Există două feluri diferite de protejare/ deprotejare care trebuie să fie îndeplinite în procedeul de sinteză a unei peptide, și anume: (1) protejarea/deprotejarea grupării Nalfa a capătului amino-terminal al catenei polipeptidice crescătoare care este acilat prin funcția acidă a unui amino acid Nalfa protejat, care devine astfel noul capăt amino-terminal. Această fază trebuie îndeplinită în timpul fiecărui ciclu de cuplare al unui amino acid, și (2) protejarea/deprotejarea grupărilor catenelor laterale ale amino acizilor care urmează a fi adăugați la lanțul polipeptidic. Această fază trebuie să aibe loc numai la sfârșitul procesului de sinteză. Astfel, se obțin peptide cu catene laterale protejate, legate în suportul solid ( R. Merrifield, Angewandte Chemie,).
Banca de bio-oligomeri, în conformitate cu prezenta invenție, cuprinde o complexitate de specii de bio-oligomeri biologic activi deprotejați și o complexitate de suporturi fază solidă care sunt complet mixabili și corespunzători pentru condițiile de reacție ale sintezei chimice a bio-oligomerilor; în care o singură specie de bio-ligomeri este atașată la fiecare suport fază solidă pentru a forma o combinație bio-oligomeri/suport fază solidă și în care pentru fiecare specie din bancă identitatea unei subunități a bio-oligomerului prezent la fiecare poziție neuniformă dată a speciei de bio-oligomer este statistic independentă de identitatea subunităților în alte poziții ale speciei de bio-oligomer. Bio-oligomerii sunt peptide deprotejate. Subunitățile sunt selectate din gurpa constând din glicină, L-amino acizi, D-amino acizi, amino acizi nonclasici și peptidomimetice. Peptidele cuprind cel puțin doi amino acizi capabili de legare încrucișată și au fost tratate astfel, încât ele să se lege încrucișat și să formeze peptide constrânse (tensionate], ciclicizate sau rigidizate. Suportul de fază solidă conține un element de legătură. Bio-oligomerii mai pot fi oligonucleotide deprotejate, iar subunitățile sunt selectate din grupa constând din ribonucleozide, deoxiribonucleozide și derivați de nucleozide.
Metoda de obținere a băncii de bio-oligomeri constă din: (a) asigurarea a cel puțin atâția alicoți ai suportului fază solidă cât numărul speciilor diferite de subunități de bio-oligomeri ce urmează a fi adăugate, dar nu mai puțin de două, pentru a forma bio-oligomerii; (b) introducerea separată a unui set de subunități la alicoții suportului fază solidă, astfel încât o subunitate este introdusă la fiecare alicot; (c) cuplarea completă a
RO 112336 Bl subunităților la aproape toate pozițiile suportului fază solidă pentru a forma combinație suport fază solidă/subunitate nouă; (d) evaluarea cuplării complete și, dacă este necesar, forțarea reacției până la completa ei producere; (e) amestecarea completă a alicoților combinației suport fază solidă/ subunitate nouă și, după repatarea fazelor (a) ... (e) de un număr dorit de ori, o fază finală de (f) eliminarea grupelor de protecție astfel, încât fiecare bio-oligomer să rămână legat la suportul fază solidă. Suportul fază solidă este polidimetilacrilamidă și este selectat din grupul constând din rășină polistirenică, rășină polihip, rășină poliamidică, rășină polistirenică grefată cu polietilenglicol și rășină polidimetilacrilamidică. Suportul fază solidă este siliciu și conține un element de legătură care este selectat din grupa constând din acid aminobutilic, acid aminocaproic, acid 7-aminoheptanoic, etilenglicol și acid B-aminocaprilic. Elementul de legătură cuprinde acid aminocaproic. Banca de bio-oligomeri este astfel preparată încât cel puțin pentru o fază, aceeași subunitate este cuplată la toți suporții fază solidă și în cel puțin în altă fază, cel puțin două subunități diferite sunt separat cuplate ceu cel puțin doi alicoți ai suportului fază solidă. Fazele (a)...(e) sunt îndeplinite o dată sau mai mult decât o dată.
Metoda pentru determinarea unei secvențe a ligandului unui bio-oligomer pentru o moleculă acceptoare cuprinde următoarele faze: (a) introducerea în bancă de bio-oligomeri care s-a arătat mai sus, a unei molecule acceptoare de interes astfel, încât această moleculă acceptoare va recunoaște și se va lega la una sau mai multe specii bio-oligomer/suport fază solidă din cadrul băncii; (b) izolarea unei specii biooligomer/suport fază solidă care pune în evidență legarea cu molecula acceptoare și (c) determinarea secvenței bio-oligomerului din bio-oligomer/suportul fază solidă în faza 6B7. Molecula acceptoare este selectată din grupa constând din anticorpi, receptori, viruși, bacterii, proteine, carbohidrați, acizi nucleici, lipide, medicamente, metale și molecule mari. Molecula acceptoare este un anticorp sau un receptor.
Metoda pentru determinarea unei secvențe a unui ligand bio-oligomer biologic activ cuprinde următoarele faze: (a) eliberarea, in situ, a unei porțiuni de biooligomeri din banca de bio-oligomeri descrisă mai sus; (b) detectarea, in situ, a activității biologice a bio-oligomerului eliberat; (c) izolarea unui bio-oligomer/ suport, fază solidă având atașat specia de bio-oligomer care pune în evidență activitatea biologică de interes, și (d) determinarea secvenței speciei de biooligomer rămasă pe suportul fază solidă izolat în faza (c). Suportul solid este sensibil-acid, sensibil-bazic, sensibil-nucleofilic. fotosensibil, sensibil electrofilic, sensibil la oxidare sau reducere. Suportul fază solidă conține un element de legătură care este sensibil-acid, sensibilbazic, sensibil-nucleofilic, sensibil-electrfilic, fotosensibil, sensibil la oxidare sau reducere. Eliberarea, in situ, din faza (a) este afectată prin clivaj enzimatic, clivaj chimic sau clivaj fotochimic. Activitatea biologică detectată în faza 6B7 este selectată din grupul constând citotoxicitate, activitate antitumorală, activitate antibacteriană, activitate antivirală, activitate antifungică, activitate antiparazitară, activitate a factorului de creștere, activitate de inhibare a creșterii, activitate hormonală, activitate de neurotransmițător, activitate imunomodulatorie și activitate regulatorie. Activitatea biologică detectată în faza (b) este o inhibare a unei enzime. Ligandul biooligomer este un agent terapeutic, un agent de diagnostic, se compune dintr-o secvență peptidică, având activitate citotoxică, se compune dintr-o secvență peptidică, având activitate antitumorală, se compune dintr-o secvență peptidică, având activitate antimicorbiană, se compune dintr-o secvență peptidică, având activitate de forțare a factorului de creștere, se compune dintr-o secvență peptidică, având activitate antagonică factorului de creștere, se compune dintr-o
RO 112336 Bl secvență peptidică, având activitate antagonică hormonală, se compune dintr-o secvență peptidică, având activitate eritropoetică mărită, se compune dintr-o secvență oligonucleotidică, având activitate citotoxică, se compune dintr-o secvență oligonucleotidică, având activitate antitumorală, se compune dintr-o secvență oligonucleotidică, având activitate antimicrobiană sau se compune dintr-o secvență peptidică cuprinsă într-un vaccin.
Metoda pentru determinarea unei secvențe a unui bio-oligomer care catalizează o reacție cuprinde următoarele faze: (a) adăugarea la banca de biooligomeri descrisă mai sus, a unui substrat astfel, încât un produs de reacție să fie detectabil; (b) izolarea unui suport fază solidă având o specie de biooligomeri care pune în evidență activitatea de interes și (c) determinarea secvenței bio-oligomerului atașat la suportul izolat în faza (b). Ligandul biooligomerului având activitate de inhibare a unei enzime este o oligonucleotidă.
In cadrul metodei pentru determinarea unei secvențe a unui ligand biooligomer activ, bio-oligomerul este un ligand având activitate de inhibare a unei enzime, și este o peptidă care constă din amino acizi selectați din grupa constând din glicină, amino acizi nenaturali, Dizomeri ai amino acizilor naturali, analogi de amino acizi și peptidomimetice.
Avantajul prezentei invenții este că banca de bio-oligomeri poate fi separată și analizată, fără ruperea peptidei de suportul fază solidă. Banca conține biooligomeri deprotejați atașați la suporturi fază solidă, în care fiecare suport fază solidă este atașat la un singur tip de biooligomer biologic activ deprotejat. Banca poate fi folosită pentru a identifica secvențe bio-oligomerice folositoare sau molecule, atât timp cât peptidele sunt atașate la suporturile fază solidă.
Deci, prezenta invenție se referă la o bancă de bio-oligomeri ce conține toate posibilitățile de combinații ale subunităților, metode de obținere a băncii și metode de utilizare a acesteia.
In particular, invenția prezintă o metodă de obținere a băncii ce cuprinde: repetarea etapelor de obținere a cel puțin două părți alicote ale unui suport în fază solidă; introducerea separată a unui set de subunități la părțile alicote ale suportului în fază solidă; cuplarea completă a subunității la toate părțile esențiale ale suportului în fază solidă pentru a forma o combinație de forma suport în state solidă/subunitate nouă; asistarea desăvârșirii cuplării și, dacă este necesar, forțarea reacției în vederea desăvârșirii; amestecarea perfectă ale combinației părții alicote ale suportului solid/subunitate nouă; și, după repetarea etapelor anterioare de un număr corespunzător de ori, îndepărtarea grupelor de protecție în așa fel încât biooligomerii să rămână legați pe suportul în fază solidă. Intr-unui din cazuri, subunitatea poate fi un amino acid, iar biooligomerul poate fi o peptidă. Intr-un alt caz, subunitatea poate fi o nucleozidă, iar bio-oligomerul poate fi o oligonucleotidă. Intr-un alt caz , nucleozidă este un acid deoxiribonucleic, într-un alt caz nucleozidă este un acid ribonucleic. Intrun alt caz, subunitatea poate fi un amino acid sau o nucleozidă, iar bio-oligomerul poate fi o himeră peptidică-oligonucleotidică.
Prezenta invenție se referă la o metodă de determinare a secvenței de ligand bio-oligomeric pentru o moleculă acceptor ce cuprinde etapele de generare a băncii random de bio-oligomeri atașați de suporturi în faza solidă în care fiecare suport solid este atașat de o singură specie de bio-oligomeri, iar toate combinațiile posibile de subunități monomerice din care sunt compuși biooligomerii sunt incluse în această colecție; introducerea în banca random a unei molecule acceptor sau a unui substrat molecular de interes, astfel ca molecula acceptor să recunoască și să lege una sau mai multe combinații de genul suport solid, specie de biooligomer în cadrul băncii sau ca substratul molecular să suporte o reacție chimică catalizată de una sau mai multe
RO 112336 Bl specii de tipul suport solid bio-oligomer în cadrul băncii, izolarea combinației suport solid/bio-oligomer care dovedește proprietățile dorite și, secvențarea bio-oligomerului de pe combinația suportului solid/bio-oligomer izolată. într-un alt caz o porțiune de bio-oligomer este eliberată in situ de combinația suport solid/biooligomer fiind detectată tot in situ și activitatea biologică de interes. Intr-un caz, bio-oligomerul este o peptidă. Intr-un alt caz, bio-oligomerul este o oligonucleotidă, în particular DNA și RNA. Intr-un alt caz, bio-oligomerul este o peptidă/oligonucleotidă himerică.
Prezenta invenție se referă, de asemenea, la agenți terapeutici și de diagnosticare ce conțin secvențe de biooligomer determinate prin metodele expuse mai sus.
Pentru o mai bună înțelegere a invenției, în continuare, se va face prezentarea în detaliu a obiectelor principale ale invenției.
După cum este utilizat în prezenta invenție, termenul de “bancă se referă la o colecție de bio-oligomeri random. Conform utilizării din prezenta invenție, termenul “bio-oligomer” se referă la un polimer cu cel puțin 100 de subunități. Un bio-oligomer, de exemplu poate fi o peptidă, adică conținând subunități de amino acid, sau o oligonucleotidă conținând subunități nucleotidice sau o himeră peptidico-oligonucleotidică.
După cum s-a prezentat mai înainte, invenția se referă la o metodă de obținere a unei bănci bio-oligomerice prin sintetizarea bio-oligomerilor din secvențe radom de subunități monomerice. După cum a fost utilizat termenul “secvență” random de subunitate monomerică se referă la secvențe în care oricare subunitate monomerică poate preceda sau urma oricare altă subunitate monomerică.
Intr-un anumit caz, subunitatea monomerică poate fi un amino acid, un analog de amino acid sau un peptidomimetic. Conform utilizării în prezenta invenție, termenul de “peptidomimetic” înseamnă o moleculă care se aseamănă chimic sau structural cu o peptidă din doi sau mai mulți amino acizi. In alt caz, unitatea monomerică poate fi o nucleozidă, iar nucleozida poate fi un acid ribonucleic sau poate fi un acid deoxiribonucleic. In alt caz, subunitățile monomerice pot fi amino acizi sau nucleoside. Bio-oligomerul poate fi o peptidă (conținând amino acizi), o oligonucleotidă RNA (conținând ribonucleozide), o oligonucleotidă DNA6 conținând dezoxiribonucleozide), o oligonucleotidă himerică DNA-RNA sau o himeră peptidică-oligonucleotidică. O bancă conținând peptide, oligonucleotide sau himere peptidiceoligonucleotidice poate fi obținută printr-o metodă ce cuprinde, repetitiv, următoarele etape:
i) obținerea a cel puțin două părți alicote de suport în fază solidă pentru secvențele de subunități random;
ii) introducerea separată a unui set de subunități la părțile alicote ale suportului în fază solidă;
iii) cuplarea completă a subunităților la toate părțile suportului în faza solidă, pentru a forma combinația suport în fază solidă/subunitate nouă;
iv) asistarea desăvârșirii cuplării și, dacă este necesar, forțarea reacției până la desăvârșire;
v) amestecarea perfectă a combinației părți alicote de suport în fază solidă/subunitate nouă, și după repetarea etapelor (i)-(v), de un număr suficient de ori, urmează etapa finală (vi) de îndepărtare a grupelor protectoare, în așa fel încât bio-oligomerii să rămână legați de suportul în faza solidă.
Intr-un alt caz, banca de biooligomeri radom poate fi obținută în așa fel încât, în cel puțin o singură etapă, aceeași subunitate să se cupleze pe toate suporturile în fază solidă și, în cel puțin în altă etapă, cel puțin două subunități să se cupleze la suportul în fază solidă.
O bancă de bio-oligomeri poate fi generată printr-o singură repetare a etapelor (i) - (v) arătate mai sus, iar întrun alt caz banca de bio-oligomeri random poate fi generată prin mai multe repetări
RO 112336 Bl ale etapelor (i) - (v), de mai sus. Un suport în fază solidă poate fi deja prevăzut cu una sau mai multe subunități deja cuplate.
bancă de bio-oligomeri poate fi alcătuită dintr-un număr predeterminant, limitat de subunități. Intr-un alt caz banca de bio-oligomeri random poate fi alcătuită din toate subunitățile valabile. Intr-un alt caz, un bio-oligomer de interes poate fi identificat într-un proces secvențial, prin prepararea inițial a băncii și identificarea secvenței de bio-oligomer care prezintă proprietățile care interesează. A fost preparat un suport în fază solidă ce cuprinde o secvență de bio-oligomer astfel identificată. Se adiționează un nou segment de subunitate monomerică, în secvența anterior identificată și se identifică o nouă secvență ce conține o secvență cunoscută și o secvență random ce prezintă proprietățile care interesează.
Această strategie secvențială de optimizare-randomizare permite identificarea rapidă a bio-oligomerului care interesează.
Bio-oligomerii din banca prezentei invenției pot fi, dar pot de asemenea să nu fie prezenți în bancă, în cantități echimolare efective. Pentru un specialist în domeniu, o cantitate molară reprezintă concentrația în care o greutate moleculară în grame (un mol) de substanță este dizolvată în suficient solvent pentru a obține un litru de soluție. După cum a fost folosit aici termenul “cantități echimolare efective” de bio-oligomeri, se referă la speciile de subunități monomerice care sunt prezente în aproximativ aceleași concentrații. Astfel, dacă într-o colecție de 15OOOO bio-oligomeri, biooligomerul A este prezent în concentrație de 200 pmol/litru, atunci tot restul de 150000 specii de bio-oligomeri va fi prezent la o concentrație de aproximativ 200 pmol/litru. Oricum, conform utilizării în prezenta invenție, termenul de cantitate echimolară efectivă este interpretat pentru a explica heterogenitatea dimensiunilor suportului în fază solidă. Heterogenitatea suportului în fază solidă rezultă în variația cantității de bio-oligomer ce se poate atașa de suportul dat.
In metoda din prezenta invenție, sunt prevăzute cel puțin două părți alicote ale suportului în fază solidă, iar numărul de suporturi în stare solidă în părțile alicote corespunde cel puțin cu numărul de bio-oligomeri ce trebuie sintetizați. Aceasta permite crearea unei bănci în care fiecare suport în fază solidă conține o singură specie de bio-oligomeri, adică o fracțiune (perlă) de biooligomer. După cum a fost folosit termenul de “alicot se referă la o parte care este o fracțiune definită din toată cantitatea de suporturi în fază solidă.
Intr-un caz particular banca de bio-oligomeri random poate conține peptide. Termenul de “peptidă” este utilizat în sensul său cel mai larg și se referă la un compus de două sau mai multe subunități de amino acizi, analogi de amino acizi sau peptidomimetici. Subunitățile pot fi legate prin legături peptidice. Intr-un alt caz subunitatea poate fi legată prin alte tipuri de legături, de exemplu de eter, ester etc.
După cum a fost folosit, termenul “amino acid” se referă atât la aminoacizii naturali sau nenaturali cât și sintetici, incluzând glicina atât izomerul optic D cât și L, analogi de amino acizi și peptidomimetici. O peptidă din trei sau mai mulți amino acizi este, de obicei, numită oligopeptidă dacă catena de peptidă este scurtă. Dacă catena peptidei este lungă, peptidă se numește o polipeptidă, sau o proteină.
Prezenta invenție are la bază chimia peptidei sintetice, și nu se bazează pe nici un sistem existent de amplificare sau screening. Băncile de peptide pot include amino acizi nenaturali. Astfel, peptidele din invenție pot conține D-amino acizi, o combinație de D și L-amino acizi, precum și diferiți amino acizi “desenați” (de exemplu β-metil amino acid C a - metil amino acid și N ametil amino acid etc.) care să transmită peptidelor din bancă proprietăți speciale. Suplimentar, prin repartizarea amino
RO 112336 Bl acizilor specifici în diferite etape ale cuplării se pot genera bănci de polipeptide a-elicoidale, β-răsucite, β-plate, γ-răsucite și peptide ciclice.
Băncile de peptide, din prezenta invenție, includ toate combinațiile posibile de amino acizi din care sunt compuse peptidele. Utilizând, ca de exemplu o dipeptidă obținută din cei doi amino acizi, glicină și prolină, sunt posibile patru combinații: glicină-glicină, glicină-prolină, prolină-glicină și prolină-prolină, iar banca random va conține toate cele patru combinații.
Un prim set de amino acizi este introdus la fiecare alicot. în general, amino acizii folosiți la sinteza peptidelor sunt amino acizii 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc) cu bază labilă, protejați cu N α-amină și care au fost pentru prima dată descriși de Carpino și Han.
Metoda din prezenta invenție poate, de asemenea, să folosească amino acizi Boc (Na t-butiloxicarbonil protejat cu Na amino). Atât amino acizii protejați cu Fmoc cât și cei protejați cu Boc Na- amino pot fi obținuți de companii cunoscute, ce lucrează în domeniu. Suplimentar, metoda din invenție poate fi utilizată cu grupe protectoare Na care sunt cunoscute specialiștilor în domeniu. Continuând cu exemplul dipeptidei descris mai sus, primul set de amino acizi introdus poate cuprinde glicină și prolină; fiecare alicot primește atât o Na-Fmocglicină cât și o Na-Fmoc-prolină. După introducere, primul set de amino acizi este complet cuplat la toate părțile suporturilor în fază solidă. După cum a fost folosit termenul de cuplare completă, înseamnă că reacția de cuplare este condusă spre desăvârșire indiferent de diferențele gradelor de cuplare ale amino acizilor individuali. Suplimentar, amono acizii sunt cuplați la toate părțile de cuplare disponibili ale suportuli, în fază solidă astfel, încât fiecare suport în fază solidă va conține, în principal, doar o specie de peptidă. Cuplarea completă va rezulta în combinația suport faza solidă/prim amino acid. Folosind exemplul descris mai sus cu dipeptidă, desă vârșirea cuplării va rezulta în combinația perlă-glicină și perlă-prolină.
Cuplarea amino acizilor poate fi realizată prin tehnici cunoscute specialiștilor în domeniu (ca de exemplu Stewart și Young). De asemenea, după cum este cunoscut specialiștilor în domeniu, procesul de sinteză a peptidei pe suporturi solide implică, în general, clădirea peptidei de la sfârșitul carboxilic sau C-terminal, în care amino acidul cu C-terminal împreună cu gruparea aamino protejată este atașat unui polimer în fază solidă.
Grupa protectoare este apoi scindată, și amino acidul următor, de asemenea protejat, este cuplat printr-o legătură peptidică la gruparea α-amino a amino acidului atașat suportului solid. Ciclul de deprotejate a amino acidului anterior și cuplarea amino acidului suplimentar este repetată până când peptida este completă. Oricare din părțile reactive ale catenelor de amino acizi sunt protejate de grupări chimice care se pot împotrivi cuplării și procedurii Na de protecție, dar care se pot îndepărta în finalul sintezei.
In scopul cuplării unui amino acid la catena obținută sintetic, grupa carboxil a amino acidului blocat trebuie să fie activată. In practicarea prezentei invenții se pot aplica multe metode de activare și includ, de exemplu anhidride simetrice preformate (PSA), anhidridă mixtă preformată (PMA), cloruri acide, esteri activi și activarea in situ a acidului carboxilic (Frelde și Noble,35; 161-214, “Sinteza peptidelor în formă solidă utilizând amino acizi 9-fluorenilmetoxicarbon/7 “On.J.Pept.Protein Res. 1990)
Utilizarea amino acizilor Fmoc este încă o strategie de sinteză a peptidelor. O strategie Boc (grupă amino protejată cu t-butiloxicarbonil) se poate de asemenea folosi pentru obținerea unei bănci de peptide legate de suportul în fază solidă (Geysen et al.,,, J.lmunnol. Methods 1997 102; 259-274).
Trebuie evaluată desăvârșirea cuplării. Pentru specialiștii în domeniu sunt cunoscute testele uzuale de monitorizare
RO 112336 Bl cantitativă, ca de exemplu ninhidrină (testul Kaiser), acid picric, 2,4,6-trinitrobenzensulfonic (TNBS), fluorescamină și cloranil, care se bazează pe reacția reactivului cu grupele amino libere pentru a produce compuși cromoforici. Dacă se utilizează acizi imino (de exemplu Pro și Hyp), monitorizarea isat in este metoda preferată, Fields și Noble supra. Coantificarea desăvârșirii reacției poate fi monitorizată în cursul desfășurării reacției, de exemplu după cum este descris de Salisburg et al. (Publicarea Cererii Internaționale nr.
WO91/03485).
La sinteza Fmoc, este preferat testul Kaiser. In testul Kaiser, o probă din fiecare tub poate fi testată cu reagent ninhidrin, obținut de Pierce Chemical, printr-o metodă enunțată de Sarin et al.,, Anal. Biochem., 1981, 117; 147-157).
Dacă reacția este incompletă, conform determinărilor prin acest test, reacția poate fi forțată spre desăvârșire prin diferite metode cunoscute în domeniu, incluzând; a) o cuplare secundară utilizând un exces de la unu până la cinci cicluri de amino acid protejat și b) o cuplare suplimentară utilizând solvenți diferiți sau adiționali (ca de exemplu trifluormetan). După ce reacția de cuplare este completă, părțile alicote ale combinației suport fază solidă/prim amino acid sunt perfect amestecate. Amestecarea este perfectată atunci când rezultă un amestec perfect al părților alicote și este de preferat amestecarea părților alicote într-un singur vas de reacție. Cu toate că orice mijloc de amestecare perfectă poate fi utilizat pentru scopul prezentei invenții, și o varietate largă de mijloace sunt cunoscute de specialiștii în domeniu, modalitățile preferate pot include, de exemplu, amestecarea cu vârtejuri, amestecarea în orice tip comercial de agitație cu motor sau barbotarea cu gaz inert, de exemplu azot sau argon.
Amestecul rezultat este divizat în cel puțin două părți alicote. Aceste părți alicote sunt egale în volum, iar dacă amestecarea a fost perfectă și părțile alicote vor conține cantități egale din combinația suport fază solidă/prim amino acid. Utilizând exemplul dipeptidei, fiecare parte alicotă va conține cantități egale din combinația perlă-glicină și din combinația perlă-prolină.
In fiecare paete alicotă se introduce, separat, un al doilea set de amino acizi. Acest al doilea set de amino acizi constă din: a) aceeași amino acizi adiționali din primul set, adică glicină sau prolină, b) un set diferit de amino acizi, de exemplu triptofan sau leucină și c) doar un singur tip de amino acid, de exemplu izoleucină. La fel ca și cu primul set de amino acizi, cel de al doilea set de amino acizi este cuplat complet, individual la combinația suport în fază solidă/prin amino acid al fiecărei părți alicote, pentru a se forma peptidele alcătuite dintr-un prim amino acid și un al doilea amino acid. La fel ca în cazul cuplării anterioare, cuplarea poate fi realizată prin orice tehnică cunoscută în domeniu pentru astfel de reacții. Utilizând exemplul cu dipeptida descris mai înainte: a) prin adiția aceluiași set de amino acid, peptidele rezultante sunt fie glicină-glicină, glicină-prolină, prolină-glicină, prolină-prolină; b) prin adiția unui set diferit de amino acizi peptidele rezultate sunt fie Gly-Trp, fie Gly-Leu, ProTrp, Pro-Leu; c) prin adiția unui singur tip de amino acid, peptidele rezultate sunt Gly-lle sau Pro-lle.
Acestă metodă se poate repeta de câte ori sunt amino acizi de adiționat. Dacă peptida de interes este o tetrapeptidă X-X-X-Trp, în care X este de exemplu fie valina, fie serina sau alanina, metoda se poate repeta de trei ori pentru a se obține X-X-X-Tpr-.tetrapeptida. In prima, a doua și a treia introducere de amino acizi se adiționează la părțile alicote ale suportului în fază solidă, fie Na-Fmoc valină, fie Na-Fmoc serină (O-Bu’J, fie Na - Fmoc alanină pentru a se obține 27 de peptide diferite în cantități echimolare (fig. 1). Dacă se dorește o hexapeptidă, procesul se repetă de șase ori. Dacă hexapeptida
RO 112336 Bl trebuie să fie alcătuită din cinci amino acizi diferiți, metoda se poate folosi utilizând cinci părți alicote, fiecare conținând un amino acid diferit, în fiecare etapă de cuplare. Dacă totuși, hexapeptida trebuie să fie alcătuită din orice set de bază de douăzeci de amino acizi, metoda se poate aplica utilizând douăzeci de părți alicote în fiecare etapă de cuplare.
Metoda de sinteze a peptidelor din prezenta invenție, poate fi aplicată folosind suporturi în fază solidă pe care un amino acid poate fi sau nu deja atașat. Suplimentar, o metodă poate utiliza un linker care a fost deja atașat la suportul în fază solidă. Un suport obișnuit pe care amino acidul este deja legat este β-alanina-PAM-rășină. Aceste rășini sunt disponibile din diferite surse comerciale sau pot fi obținute în laborator printr-o metodă cunoscută în domeniul sintezei peptidelor.
Dacă se folosește ca reactiv inițial o combinație suport în fază solidă/ suport cu linker, acesta se divide în cel puțin două părți alicote, fiecare dintre ele primind câte un amino acid dintr-un prim set de amino acizi. Conform celor descrise mai înainte, primul set de amino acizi este complet cuplat la toate părțile de legare ale combinației suport în fază solidă/amino acid sau suport în fază solidă/linker, iar părțile alicote ce conțin acești noi amino acizi adiționați sunt amestecate complet și perfect. Conform celor descrise, amestecul este divizat în cel puțin două părți alicote, fiecare parte primind un amino acid dintr-un al doilea set de amino acizi, iar reacția de cuplare se repetă pentru a forma o peptidă în creștere. Conform celor descrise mai sus, procesul se poate repeta de câte ori este necesar pentru a se obține peptida de interes. Această metodă se poate folosi pentru sinteza peptidelor random cât și pentru sinteza unei bănci de peptide ce conține secvențe predeterminate. Sintezele secvențelor predeterminate implică utilizarea în timpul etapelor specifice de cuplare a amino acizilor specifici Na -Boc, Na -Fmoc sau a altor amino acizi protejați. De exemplu, o sinteză poate selecta amino acizi în treaptă specifică de cuplare astfel, încât peptidele rezultante să aibe o probabilitate sau o preferință pentru o structură particulară, de exemplu β-plană, aelicoidală, β-răsucită etc. De exemplu, aelicoidală poate fi preferată dacă Glu, Ala, Leu, His, Trp sunt utilizați ca amino acizi preferați; pe de altă parte, structura β- plană este preferată dacă se utilizează Val, lle, Tyr și Met. In mod alternativ, dacă se utilizează Gly, Asn, Ser, Pro, Asp se preferă o structură βrăsucită. Pot fi date și alte exemple, și anume amino acizi acidici lângă Nterminal și amino acid bazic lângă Cterminal pentru a stabiliza o structură a - elicoidală. D-amino acizii pot stabiliza anumite răsuciri putându-se încorpora alte active structurale (așa cum se va arăta în continuare). Este posibil chiar să se prepare bănci de peptide ciclice cu disulfură, lactam, lactoză sau alte părți de închidere a inelului (cum se va prezenta în continuare).
Este de subliniat că metoda prezentei invenții permite sinteza peptidelor, astfel, încât fiecare suport în fază solidă, ca de exemplu o porțiune (picătură), numită în continuare “perlă” să conțină doar o singură specie de peptidă. Metoda permite, ca individual, fiecare perlă din rășină să fie în contact doar cu un amino acid Fmoc, în timpul fiecărui ciclu de cuplare, iar cuplarea să fie dirijată spre desăvârșire: Sinteza de perlă de peptidă, permite creșterea sensitivității și eficienței izolării peptidei ce este specifică cantității de care este legată.
Metoda se poate aplica rapid, permițând sinteza unor fonduri de peptide random, conținând un număr de 105 până la 107 specii diferite de peptide.
Intr-una din prezentările invenției, peptidele dintr-o bancă pot conține un amino acid special la C-terminal care încorporează fie o parte de catenă C02H, fie C0NH2 pentru a stimula o glicină liberă sau un grup glicină-amidă. O altă cale de considerare a acestui reziduu special poate fi sub forma unui D-amino
RO 112336 Bl acid sau L-amino acid analog cu o parte de catenă ce constă din linker-ul sau legătura cu perla. Intr-un caz, reziduul pseudoliber de C-terminal poate avea o configurație optică D sau L; într-un alt caz se poate utiliza un amestec racemic de izomeri D și L.
Intr-un caz suplimentar, piroglutamatul poate fi inclus ca rezidual Nterminal al peptidelor bănci. Deși piroglutamatul nu este răspunzător de secvențare prin degradarea Edman, prin limitarea substituției cu piroglutamat Nterminal la doar 50% din peptidele de pe o perlă dată, rămâne pentru secvențare suficientă peptidă non-glutamat pe perla respectivă. Orice specialist în domeniu va recunoaște cu rapiditate că această tehnică poate fi utilizată pentru secvențarea oricărei peptide ce încorporează un reziduu rezistent la degradare Edman la N-terminal. Alte metode care caracterizează individual peptidele ce prezintă activitate dorită, sunt descrise în detaliu infra. Activitatea specifică a peptidei ce cuprinde o grupă N-terminală blocată, de exemplu piroglutamat, atunci când grupa N-terminală particulară este prezentă în 50% din peptide, va fi demonstrată prin compararea activității unei peptide complet blocate (100%) cu o peptidă neblocată (□%].
Intr-un alt caz, se vor alege subunități de peptide ce conferă proprietăți chimice și structurale utile. De exemplu, peptidele ce conțin D-amino acizi vor fi rezistente in vivo la proteaze specifice cu L-amino acid. Suplimentar, această invenție prezintă prepararea băncilor de peptide care au proprietăți structurale bine definite, precum și utilizarea peptidomimeticilor și legăturilor peptidomimetice, ca, de exemplu, legături esterice pentru prepararea băncilor cu proprietăți noi. Intr-un alt caz, poate fi generată o bancă de peptide ce înglobează o legătură peptidică redusă, adică Rn - CH2 - NH - R2, în care Rt și R2 sunt reziduuri de amino acizi sau secvențe. O legătură de peptidă poate fi introdusă ca subunitate dipeptidică. □ astfel de moleculă poate fi rezistentă la hidroliză legăturii peptidice, de exemplu activitate proteazică.
Astfel de bănci pot furniza lianți cu funcție și activitate unică, ca de exemplu timpul de înjumătățire extins in vivo datorat rezistenței la epuizare metabolică sau la activitate proteazică. Mai mult decât atât este bine cunoscut că,în anumite sisteme, peptidele nesaturate prezintă o activitate funcțională crescută. Prezenta invenție furnizează o metodă de obținere a unei peptide nesaturate ce înglobează secvențe random la toate celelalte poziții.
Peptide nenaturale și peptide ciclice □ peptidă nenaturală, ciclică sau rigidizată poate fi preparată conform metodei descrise supra, cu condiția ca cel puțin două poziții în secvența tuturor peptidelor din bancă să fie inserate un amino acid sau un analog de amino acid, care să formeze o grupare chimică funcțională capabilă de ramificarea peptidei nenaturale, ciclice sau rigidizate care după tratament să formeze ramificația. Ciclizarea va fi favorizată atunci când se încorporează un amino acid răsucit. Exemple de amino acizi capabili de ramificarea peptidei sunt cisteina pentru a forma disulfuri, acid aspartic pentru a forma lactonă sau lactam și un chelat, ca de exemplu acid-p-carboxil-glutamic (Gla) pentru a lega un metal de tranziție și a forma o ramificație. Acidul y-carboxilglutamic poate fi preparat modificând sinteza descrisă de Zec-Cheng și Olson. O bancă de peptide în care secvența peptidică conține cel puțin doi amino acizi capabili de ramificare poate fi tratată, de exemplu, prin oxidarea reziduurilor de cisteină pentru a forma disulfură, sau prin adiționarea unui ion metalic pentru a forma un chelat care să ramifice peptida și pentru a forma peptidă nenaturală, ciclică sau rigidizată.
Prezenta invenție furnizează un set de motive (forme) generale pentru prepararea băncilor, și care sunt descrise în cadrul prezentei invenții. In unul din cazuri (prezentat în fig. 2a, care se va arăta în continuare] două perechi de
RO 112336 Bl reziduuri ramificate sunt aranjate pentru a creea un motiv tip “coș”. Un astfel de motiv tip “coș” poate avea o aplicabilitate particulară, ca de exemplu catalizator sub formă de plic, suplimentar noilor proprietăți de legare rezultate din configurația sa forțată. Intr-un alt caz, cu două perechi de reziduuri ramificate se poate aranja un motiv “scară” (conform fig. 2b care se va prezenta în continuare). Prin utilizarea alternativă a Damino acizilor și L-amino acizilor, într-un motiv “scară” se poate prepara o peptidă în care toate catenele laterale se vor orienta către o suprafață, analog formei β-butoi regăsite în gramicidină. O astfel de suprafață poate furniza în mod potențial un unic loc catalitic. Intr-un alt caz un motiv simplu “lasso” poate fi creat, în care două reziduuri formează o ramificație (conform fig. 2c care se va prezenta în continuare). Suplimentar, la obținerea unei bule peptidice, poate rezulta un motiv scurt de “lasso” într-o peptidă lineară nenaturală, stabilizând astfel structura secundară, de exemplu o formă a-elicoidală.
Este preconizat că ramificațiile interpeptidice pot fi formate ca rezultând dintr-o matrice peptidică rigidă.
Prezenta invenție furnizează strategii de preparare sistematică a ramificațiilor. De exemplu, dacă patru reziduuri de cisteină sunt, încorporate în secvența peptidică, se pot utiliza diferite grupuri de protecție. Prima pereche de cisteine poate fi deprotejată și oxidată, apoi al doilea set poate fi deprotejat sau oxidat. In acest fel se poate forma un set definit de ramificații de disulfură. Alternativ, se pot, incorpora o pereche de cisteine și o pereche de analogi de amino acizi astfel, încât ramificațiile să fie de natură chimică diferită.
Amino acizi neclasici care provoacă forțări conformaționale.
Următorii amino acizi- neclasici pot fi incluși în banca de peptide random, pentru a introduce motive conformaționale particulare: 1,2,3,4-tetrahidroizochinolin-3-carboxilat; (2S, 3S]-metilfenilalanină; (2S, 3R)-metil-fenialanină; (2R,
3S)-metil-fenilalanina și (2R, 3R]-metilf enilalanină; acid-2-aminotetrahidronaftalen-2-carboxilic;hidroxi-1,2,3,4terahidroizochinolin-3-carboxilat; β-carbolina (D și L); HIC6 acid histidin izochinolin carboxilic) și HIC (histidin uree ciclică).
Următorii analogi de amino acizi și peptidomimetici pot fi incluși într-o bancă, pentru a provoca sau furniza structuri secundare specifice: LL-Acp (aci LL-3-amino-2-propendiona-6-carboxilix); analog de dipeptidă cu răsucire -β; analogi ce provoacă structură β-plană; analogi ce provoacă structură βrăsucită; analogi ce provoacă structură α-elicoidală; analogi ce provoacă structură γ-răsucită și alți analogi cunoscuți în domeniul de specialitate, precum și un analog răsucit Gly-Ala; de asemenea izosteri de legătură amidică; tetrazol; DTC și alți analogi descriși în literatura cunoscută și utilizați în domeniu de specialitate.
Deși peptidele neclasice de mai sus și peptidomimeticii nu pot fi verificați prin analiza clasică Edman de degradare a secvenței, se pot utiliza pentru determinarea structurii peptidei cu activitate dorită, prin combinarea degradării Edman urmată de analiza amino acidului din catena reziduală. Alternativ, se poate folosi analiza prin spectroscopie de masă.
Peptide derivate și peptide modificate
Prezenta invenție are în vedere modificarea și derivatizarea peptidelor într-o bancă. Modificările peptidelor sunt bine cunoscute de specialiștii în domeniu și includ fosforilarea, carboximetilarea și acilarea. Modificările pot fi efectuate pe căi chimice sau enzimatice.
Se pot, de asemenea, prepara derivați peptidici glicozilați și acilați cu grăsimi. Prepararea de peptide glicozilate sau acilate cu grăsimi este bine cunoscută de specialiștii în domeniu, iar obținerea acestora se face în conformitate cu datele cunoscute în literatura de specialitate.
Sunt două clase mari de legături peptidă-carbohidrat.
RO 112336 Bl
Prima, în care legăturile de eter unesc serina sau hidroxil threonina la un hidroxil al zahărului. A doua, în care legăturile amidice unesc grupări de glutamat sau asparat carboxilice la o grupare amino a zahărului. In particular, se cunosc metode de preparare a peptidelor-carbohidraților cu legături eterice sau amidice. Legăturile acital și ketal pot, de asemenea, lega carbohidratul de peptide.
Se pot prepara, de asemenea, derivați peptidici acilați cu grăsimi. De exemplu, fără a prezenta o limitare, o grupara amino liberă (N-terminal sau lisil) poate fi acilată, de exemplu miristoilat. Intr-un alt caz, un amino acid ce conține o catenă laterală alifatică a structurii (CH2)2CH3 poate fi înglobată în peptidele băncii. Acest conjugat și alți conjugați de peptidă-acid gras corespunzători utilizării în prezenta invenție sunt dezvăluiți în literatura de specialitate.
Bănci de oligonucleotide random
Metoda de sinteză a unei bănci de selecție, alcătuită din acizi nucleici poate fi adaptată din sinteză în fază solidă a DNA prin metoda de fosforamidare, cunoscută în domeniul de specialitate.
Atât suportul polimeric insolubil pe bază de silice cât și dezoxinucleozidele protejate sunt disponibile comercial. Exemple de dezoxinucleozide protejate sunt: 5Odimetoxitritildeoxitimidină; 5Όdimetoxitritil-4-N-benzoildeoxicitidină; 5'O-dimetoxitritil-N-benzoildeoxiadenozină și 5'-O-dimetoxitritil-N-izobutildeoxiguanozină. Funcție de utilizare, se pot utiliza și alte grupe specifice de protecție. Dezoxinucleozida 3'-fosforamidina corespunzătoare pentru a fi sintetizată și apoi cuplată pe un suport solid, conform celor arătate în domeniu, supra. Prima dezoxinucleozidă poate fi fixată, de exemplu, ca dezoxiadenozină. După detritilare și spălare cu diclormetan și apoi cu acetonitril, suportul solid este separat cu patru părți alicote, transferate apoi în patru vase de reacție separate. Cele patru dezoxinucleozid 3-fosforamidine sunt apoi adiționate individual în cele patru vase de reacție. După desăvâr șirea cuplării, suporturile solide din cele patru vase de reacție sunt amestecate împreună, spălate bine și apoi supuse oxidării cu un amestec de l2/H20/ lutidină/THF. După oxidare, suportul solid este spălat perfect cu acetonitril, repetându-se apoi ciclul de mai sus. După ce sinteza catenei de polidezoxinucleotidă random a fost completă, grupările de metil ester au fost scindate cu tiofenol, iar grupările DMT au fost scindate cu acid tricloracetic. Catenele de polinucleotidă deprotejată pot rămâne legate covalent de suportul solid (atunci când sunt aleși linkeri corespunzători), gata pregătite pentru a fi utilizate în metodologia de vizualizare selectivă descrisă infra.
Prezenta invenție prevede că se pot utiliza oligonucleotide cu alte legături decât legăturile fosforodiesterice. De exemplu, o oligonucleotidă poate îngloba o legătură de fosforotionat. Sunt bine cunoscute în domeniu și alte legături modificate fosforodiesterice sau legături analoage. Astfel de legături modificate sunt cunoscute a fi rezistentă la activitatea exonucleazei sau endonucleazei.
Când într-o bancă cu 12 baze nucleozideice sunt doar patru nucleozide DNA sau RNA per etapă de cuplare, atunci vor fi posibile 412 secvențe polinucleotidice, adică un total de 1,68 χ 1O7 posibilități. Pe lângă acestea, o oligonucleotidă poate fi sintetizată utilizând atât nucleozide DNA cât și RNA. Un specialist în domeniu va recunoaște că în afară de majoritatea nucleozidelor se pot utiliza și nucleozide necomune și nucleozide modificate. Nucleozidele necomune și nucleozidele modificate pot fi: inozina, purin nucleozida metilată, derivații de uridină și 2'-O-metilriboza, care pot acționa cu orice ribonucleozidă.
Suporturi în fază solidă și linkeri pentru utilizare într-o bancă de biooligomeri random.
Un suport solid pentru utilizare în prezenta invenție va fi inert față de condițiile de reacție ale sintezei bio-oligomerilor, de exemplu ale sintezei peptidei sau ale sintezei oligonucleotidei sau ale
RO 112336 Bl ambelor. Un suport în fază solidă pentru utilizare în prezenta invenție trebuie să aibă grupări reactive pentru a atrage o subunitate monomerică, sau pentru atragerea și atașarea unui linker sau ligand ce poate servi drept punct inițial de legare a unei subunități monomerice. Intr-un caz, suportul în fază solidă poate fi corespunzător utilizării in vivo, adică poate servi drept suport pentru aplicările directe ale băncii de bio-oligomeri. Intr-un caz particular, suportul în faza solidă poate fi bun la gust și bun de consumat pe cale orală. Intr-un alt caz, suportul în fază solidă poate fi utilizat ca suport cromatografic.
După cum este prezentat în invenție, suportul în fază solidă nu este limitat la un tip specific de suport. Un număr larg de suporturi sunt disponibili și cunoscute specialiștilor în domeniu. Suporturile în fază solidă pot include gelurile de siliciu, rășinile, peliculele de plastic modificate, perlele de sticlă, bumbac, perle de plastic, gelurile de alumină. Un suport solid corespunzător, poate fi selecționat funcție de utilizarea finală dorită și potrivirea acestuia cu diferitele metode de sinteză. De exemplu, pentru sinteza peptidei, suportul în fază solidă poate fi rășină, ca de exemplu polistirenă (de exemplu rășină PAM), rășină POLYHIPElR), rășină polistirenîcă grefată cu polietilenglicol sau rășină polidimetilacrilamidică. Intr-un caz particular, pentru sinteza peptidei, suportul în fază solidă poate fi o rășină polidimetilacrilamidică.
Suporturile în fază solidă din prezenta invenție pot, de asemenea, conține un linker. După cum a fost utilizat în prezenta invenție, un linker se referă la orice moleculă ce asigură o distanță spațială între suportul și peptidă ce trebuie sintetizată. Linkerii pot fi atașați covalent pe suportul solid, înaintea cuplării cu un Na -Boc sau NaFmoc sau cu un alt amino acid protejat, adecvat. Pot fi folosiți diferiți linkeri pentru atașarea oligomerului pe suportul în fază solidă. Exemplele de linkeri includ acid aminobutiric, acid aminocaproic, acid aminoheptonic și acid 8-aminocaprilic. Acidul Fmoc-aminocaproic este disponibil comercial și este cazul preferat. Intr-un alt caz, linkerii pot conține suplimentar una sau mai multe p-alanine ca agent de spațiere. Suplimentar, suportul solid poate fi modificat pentru a îndeplini condițiile specifice scopurilor particulare ale bioanalizei sau detecției. Modificările suportului în fază solidă pot fi realizate prin înglobarea unui linker specific. De exemplu, un suport în fază solidă poate fi făcut acid-senzitiv, bazăsenzitivă, nucleofilic-senzitiv, electrofilicsenzitiv, foto-senzitiv, senzitiv la oxidare sau senzitiv la reducere. In afara linkerilor descriși mai sus, se pot folosi linkeri selectiv scindabili. Utilizarea unui linker Onb, sensibil la lumină ultravioletă este descris în literatura de specialitate. Alți linkeri scindabili necesită hidrogenoliză sau fotoliză. Exemple de linkeri fotosenzitivi (fotoscindabili) sunt date în literatura de specialitate.
Este cunoscută metoda care utilizează acidul formic apos pentru scindarea legăturilor Asp-Pro. Această abordare a fost utilizată pentru a caracteriza determinanții T-celulari în legătură cu metoda de sinteză. Alți linkeri scindabili, în condiții bazice, îi includ pe aceia pe bază de acid p-hidroxilmetil]-benzoic, precum și acid hidroxiacetic. S-a raportat scindarea peptidei printr-un mecanism diketopiperazinic. 0 enzimă poate scinda, în mod specific un linker ce conține o secvență care este senzitivă sau un substrat pentru scindare enzimatică, de exemplu(scindarea proteazică a unei peptide, scindarea endonucleazică a unei oligonucleotide. In anumite situații, una poate derivatiza 10 ... 50% dintr-o rășină, prin substituție cu linkerul scindabil, iar restul de 50 ..·. 90% substituit cu un linker nescindabil, pentru a avea siguranța că după scindarea limkerului va rămâne suficientă peptidă pentru secvențare. Combinații de linkeri scindabili pot fi, de asemenea, utilizate, pentru a permite sindarea secvențială dintr-o singură perlă.
Un suport în fază solidă, pentru
RO 112336 Bl utilizarea în prezenta invenție, poate să mai conțină un bio-oligomer de interes, la care să fie adiționat o secvență de subunitate random. Bio-oligomerul preatașat poate fi selectat funcție de metodele descrise în prezenta invenție, sau poate conține o secvență cunoscută ce întruchipează proprietățile dorite.
In sinteza oligonucleotidelor, este preferat un suport în fază solidă. După cum s-a arătat mai înainte, suporturile în faza solidă pe bază de silice sunt disponibile comercial.
Metode de detecare și identificare a bio-oligomerilor de interes
In afară de băncile random de biooligomeri și de metode de sinteză a acestora, prezenta invenție furnizează, de asemenea, și metode de analizare a băncilor de bio-oligomeri pentru identificarea bio-oligomerilor dintr-o bancă, care dovedesc o activitate biologică de interes, ca de exemplu legare, stimulare, toxicitate, gust etc. Alți bio-oligomeri pot fi analizați conform metodelor descrise, infra pentru activitate enzimatică, activitate enzimatică inhibitorie și proprietăți chimice sau fizice de interes.
Bio-oligomerii de interes descoperiți în perioada unei analize inițiale nu este necesar să fie liganzii finali. De fapt, este de preferat să se sintetizeze o bancă secundară pe baza secvențelor comune ale liganzilor selectați în timpul primei analize. Pe această cale, este posibil să se identifice liganzi cu activitate mai mare, cu condiția ca cea de a doua analiză să se desfășoare în condiții mult mai riguroase.
Testele legării
Prezenta invenție permite identificarea liganzilor bio-oligomerici care leagă molecule acceptor. După cum a fost utilizat, termenul de moleculă acceptor” se referă la orice substanță care se leagă de un ligand bio-oligomeric. Moleculele acceptor pot fi, ca de exemplu, molecule biologice, fără însă a limita posibilitățile, pot fi anticorpi, receptori sau viruși. Suplimentar, moleculele acceptor pot fi, ca de exemplu, compuși chimici, dar fără a limita posibilitățile, pot fi proteine, carbohidrați, acizi nucleici, lipide, medicamente, metale sau molecule mici.
Banca de bio-oligomeri din prezenta invenție poate reacționa potențial cu diferite molecule acceptor. Prin identificarea speciei particulare de bio-oligomer pe care se poate lega o moleculă acceptor specifică este posibilă izolarea fizică a speciei de bio-oligomer de interes.
Datorită faptului că un număr mic de perle va fi îndepărtat în timpul fiecărei etape de izolare/detectare/analiză majoritatea perlelor vor rămâne în fondul comun. Prin urmare, banca de bio-oligomeri random poate fi reutilizată de mai multe ori. Dacă se utilizeauă diferite scheme coloristice sau de identificare pentru diferite molecule acceptor (de exemplu grupări fluorescente ca fluoresceina (verde), Texas Red (roșu) și DAP1 (albastru) care au fost marcați pe acceptor) și filtre de excitație corespunzătoare în microscopul de fluorescență sau detector de fluorescență, se pot adiționa diferiți acceptori (receptori) la o bancă de peptide și se poate face o evaluare simultană, facilitând o analizare rapidă a liganzilor specifici. Aceste strategii nu numai că reduc costul, dar cresc, de asemenea, și numărul de molecule acceptor ce poate fi analizat.
In metoda din prezenta invenție, o moleculă acceptor de interes este introdusă în banca de bio-oligomeri în care se va recunoaște și se va lega de una sau mai multe specii de bio-oligomeri. Fiecare specie de bio-oligomeri la care se leagă molecula acceptor se va găsi pe un singur suport în fază solidă, astfel că suportul și bio-oligomerul poate fi rapid identificat și izolat.
Bio-oligomerul poate fi izolat prin orice mijloc convențional cunoscut de specialiștii în domeniu, astfel invenția nefiind limitată prin metoda de izolare. De exemplu, fără însă a limita posibilitățile, este posibil să se izoleze fizic o combinație suport fază solidă/bio-oligomer care prezintă cea mai puternică
RO 112336 Bl interacțiune fizico-chimică cu molecula acceptor. Intr-un caz, pe baza interacțiunii fizico-chimice, o soluție de moleculă acceptor specifică se adiționează la o bancă de peptide random care este echivalentă cu aproximativ 105 până la 107 suporturi în fază solidă.
Molecula acceptor este incubată cu rășina, un timp suficient pentru a permite cuplarea între peptidă și anticorp, de exemplu, timp de o oră la temperatura de 22°C. După această incubare se izolează combinația bio-oligomer acoperit cu moleculă acceptor/suport în fază solidă.
Cazuri specifice sunt prezentate în următoarele metode, care descriu utilizarea anticorpului monoclonal ca moleculă acceptor solubilă. Este clar că aceste metode sunt rapid adaptabile pentru detectarea legăturii oricărei molecule acceptor. In continuare, deși referirile se fac la bănci de peptide, trebuie să se înțeleagă că se pot analiza de asemenea bănci de oligonucleotide sau himere peptidice-oligonucleotidice.
(i) Anticorpul monoclonal este la început marcat cu o parte fluorescentă sau “fluoresceinated”, prin tehnici care sunt cunoscute specialiștilor în domeniu. Anticorpul, la o concentrație de 1pg/ml este apoi introdus în banca de peptide și după o amestecare ușoară, la temperatura de 22°C și timp de o oră, suportul în fază solidă a fost spălat, și sau identificat și recuperat cu un sorter celular activat prin fluorescență combinațiile anticorp/fluorescent pe suport în fază solidă/peptide. Alternativ, combinațiile anticorp fluorescent în fază solidă/peptidă sunt identificate și adunate fizic sub un microscop de analiză, cu adaptor de fluorescență, prevăzut cu micromanipulator. Intensitatea relativă a reacției de cuplare este, în general, proporțională cu afinitatea peptidei pentru anticorpul monoclonal în cauză.
(ii) Anticorpul monoclonal este la început conjugat pe perle fero-magnetice, prin tehnici cunoscute în domeniu. Anticorpul conjugat la o concentrație de 1 pg/ml este apoi incubatîn bancă, timp de o oră și la temperatura de 22°C. Perlele magnetice vor forma o rozetă în jurul combinației suport în fază solidă/peptidă de interes, care apoi va fi fizic izolată cu ajutorul unui magnet puternic.
(iii) Anticorpul monoclonal este la început conjugat cu o enzimă, ca de exemplu fosfatază alcalină, prin tehnici cunoscut în domeniu. Acest conjugat anticorp-enzimă este apoi incubat cu banca de peptide random timp de 30 min. până la o oră, la temperatura de 22°C. După spălare, întreaga bancă este turnată într-o cutie Petri ce conține un substrat pentru fosfatază alcalină, ca de exemplu 5-brom-4-clor-3-indoil fosfat (BCIP) și albastru nitro-tetrazoleum (NBT). După o incubare de câteva minute, combinația anticorp-suport în fază solidă/peptidă își schimbă culoarea (devine albastră) datorită precipitării pe substratul transformat de pe suportul în fază solidă și poate fi ușor identificat și izolat fizic sub un microscop de analiză cu un micromanipulator. Intensitatea relativă a reacței de cuplare este, în general, proporțională cu afinitatea peptidei pentru anticorpul monoclonal în cauză.
(IV) Anticorpul monoclonal este la început conjugat cu o enzimă, ca de exemplu peroxidază din hrean, prin tehnici de rutină în domeniu., Acest conjugat anticorp-enzimă, este apoi incubat în banca de peptide random, timp de 30 min. până la o oră și la temperatura de 22°C. După spălare, întreaga bancă este trecută într-o cutie Petri ce conține un substrat pentru peroxidază, ca de exemplu 3,3', 4,4' -diaminobenzidină (DAB); 3,3', 5,5' - tetrametibenzidină (TMB) sau 4-clor-1-naftol (4CN). După incubare, timp de câteva minute, combinația anticorp-suport în fază solidă/peptidă își schimbă culoarea și poate fi identificată și izolată fizic sub un microscop de analiză cu un micromanipulator. Intensitatea relativă a reacției de culoare este, în general, proporțional cu afinitatea peptidei față de anticorpul monoclonal în cauză.
(V) Anticorpul monoclonal este la
RO 112336 Bl început marcat cu biotină sau biotinilat”, prin tehnici de rutină în domeniu și apoi este incubat cu banca de peptide random, timp de 30 min. până la o oră, la temperatura de 22°C. După spălare, un complex streptavidin-fosfatază alcalină sau un complex streptavidin-peroxidază din hrean este adiționat și incubat timp de 30 min.. Suportul este apoi spălat, iar culoarea este developată, conform celor arătate la punctul (iii) de mai sus, prin metoda enzimatică. Combinația de interes peptidă/suport în fază solidă este fizic izolată ca mai sus.
Alături de utilizarea moleculelor, acceptor solubile, într-un alt caz, este posibilă detectarea bio-oligomerilor care se leagă pe suprafețele celulare ale receptorilor utilizând celule intacte. Utilizarea celulelor intacte este preferată în cazul utilizării cu receptori care sunt multi-subunitari sau labili sau cu receptori care neceistă ca domeniul lipidic al membranei celulare să fie funcțional. Celulele utilizate în această tehnică pot fi atât celule vii cât și celule fixate. Celulele vor fi incubate cu banca de peptide random și se vor lega de anumite peptide în bancă, pentru a forma o “rozetă” între celulele etichetate și combinația relevantă suport în faza solidă/peptidă. Rozeta poate fi apoi izolată prin centrifugare diferențiată sau îndepărtată fizic sub un microscop de analiză.
Alternativ, printr-o metodă se poate analiza o bancă, utilizând o procedură cu linii celulare, ca de exemplu, (i) o linie celulară “parental” în care receptorul de interes este absent de pe suprafața celulară și (ii) o linie celulară receptor-pozitivă, de exemplu i o linie celulară care este derivată prin transfecția liniei parentale cu gene ce codifică receptorul de interes. Este posibilă, apoi analizarea băncii prin următoarea strategie: (i) golirea băncii de perlele sale nespecifice, care se vor lega de celulele lipsite de receptor, prin introducerea unui strat de linie celulară parentală, prin tehnica de lucru standard pentru abandonarea perlelor ce nu leagă specific un receptor sau a perlelor nerelevante care nu leagă; (ii) îndepărtarea perlelor care nu leagă, care vor include atât perlele specifice receptorului cât și perlele irelevante, și așezarea lor într-un monostrat de linie celulară receptor pozitivă în care perla specifică receptorului se va lega de linia celulară receptor pozitivă; (iii) îndepărtarea perlelor irelevante rămase prin spălarea ușoară și decantare și [iv] îndepărtarea perle(lor) specifică receptorului cu un micromanipulator.
Ca o alternativă la toate testele celulare privind receptorii legați de membrană sau receptorii ce necesită funcționalitatea domeniului lipidic al membranei celulare, moleculele receptoare pot fi reconstituite în lipozomi, la care se pot atașa grupările prezentate sau enzime.
Deși exemplele de mai sus se referă la liganzi peptidici, se pot utiliza în practica prezentei invenții orice bio-oligomer care a fost descris mai sus, supra. Astfel, moleculele acceptor se pot lega la peptide neclasice ciclice, influențate conformațional sau forțate structural, la oligonucleotide sau la himere peptidice-oligonucleotidice.
Intr-un caz, molecula acceptor poate fi marcată direct. Intr-un alt caz, un reactiv secundar marcat poate fi utilizat pentru a detecta legătura moleculei acceptor pe un suport în fază solidă ce conține un bio-oligomer de interes. Legătura poate fi detectată prin formarea in situ a unui cromofor cu un marcator enzimatic. Enzime corespunzătoare pot fi, fără a limita posibilitățile, fosfatază alcalină și peroxidază din hrean. Intr-un alt caz, se poate utiliza un test cu două culori, folosind două substraturi cromogenice cu doi marcatori enzmatici pe diferite molecule acceptor de interes. Printr-un test cu două culori se pot identifica liganzi reactivi în mod separat sau sub formă combinată. Alți marcatori pentru utilizare, în prezenta invenție, includ perle de latex, perle magnetice, marcatori fluorescenți (de exemplu izotiocianat de fluorescență (FITC), ficoeritrin (PE), roșu Texas (TR), rodamină, serii de săruri chelate de lanta
RO 112336 Bl nide, în special Eu3+, pentru a denumi câțiva fluorofori], molecule chemiluminiscente, radio-izotopi sau marcatori puși în evidență prin rezonanță magnetică. Testele biocoloristice se pot desfășura cu două sau mai multe perle colorate de latex sau fluorofori, care emit la diferite lungimi de undă. Perlele marcate pot fi izolate manual sau prin mijloace mecanice. Mijloacele mecanice includ sortarea prin activarea fluorescenței, adică analog cu FACS și mijloace de îndepărtare cu micromanipulator.
In exemele specifice, infra, se pot utiliza marcatori enzimă-cromogen sau marcatori fluorescenți (FITC).
Perlele reactive pot fi izolate pe baza intensității marcării adică intensitatea culorii, intensitatea fluorescenței, intensitatea magnetică pentru a menționa doar câteva criterii. Cele mai intens marcate, perlele pot fi selectate și secvențate sau caracterizate funcție de structură, de exemplutprin analiză spectroscopică de masă. Intr-un alt caz, se poate selecta și secvența o selecție random de perle, cu o intensitate de marcare deasupra unui prag arbitrar. Se poate folosi o analiză microscopică modernă a imaginii pentru a măsura intensitatea culorii și prin urmare pentru a defini precis afinitatea relativă a ligandului pentru molecula acceptor înaintea analizei secvențiale a perlei. Similar, se poate aplica microscopia cantitativă prin imunofluorescență, dacă acceptorul este însemnat cu un marcator fluorescent. Intr-un alt caz, perlele ce dovedesc o anumită intensitate de marcare sunt selectate pentru analiza compozițională, de exempluide terminarea compoziției de amino acid. Se poate prepara și vizualiza o bancă selectă conținând un set restrâns de subunități monomerice identificate ca importante, prin analiza compoziției.
Intr-un alt caz, bio-oligomerul (i) cu cea mai mare afinitate de legare, adică legare constantă, poate fi identificat prin diluarea progresivă a moleculei acceptor de interes, până când este detectată legarea doar de câteva suporturi în faza solidă din bancă. Alternativ, se poate crește rigurozitatea soluției de legare sau în cazul acizilor nucleici, a hibridizării cu acid nucleic însemnat, adică moleculă acceptor. Un specialist în domeniu înțelege că această rigurozitate a legării sau a hibridizării poate fi crescută prin (i) creșterea concentrației ionice a soluției; (ii) creșterea concentrației de compuși denaturați, ca de exemplul ureea; (iii) creșterea sau descreșterea apH-ului relativ la un pH neutru; (iv) în cazul acizilor nucleici, apropierea de Tm (temperatura de topire). Sunt bine cunoscute în domeniu, și alte mijloace de modificare a condițiilor soluțiilor pentru limita de legare doar la interacții cu afinitate ridicată.
Diluarea puternică sau legarea riguroasă a unei molecule acceptor pe o combinație suport în fază solidă/biooligomer poate fi utilizată pentru a detecta un ligand de interes într-o bancă random, conținând toate sau aproape toate subunitățile monomerice, sau într-o bancă selectă limitată.
Intr-un alt caz, pot fi interesați biooligomerii ce prezintă o afinitate de legare scăzută. Aceștia pot fi selectați la început prin îndepărtarea tuturor biooligomerilor cu afinitate mare de legare și apoi prin detectatea legăturii sub condiții de stringență scăzută sau de diluare scăzută.
Intr-un alt caz preferat, se poate utiliza analiza cu marcator dublu. Primul marcator poate fi utilizat pentru a detecta legăturile nespecifice ale moleculelor de interes pe perle, în prezența unui ligand solubil. Perlele marcate sunt apoi îndepărtate din bancă, iar ligandul solubil se îndepărtează. Apoi, este detectată molecula acceptor care se leagă specific de perlele rămase. Bio-oligomerii de pe astfel de perle, este de așteptat, să se lege de molecula acceptor în aceleași zone de legare ca și ligandul de interes, mimând astfel ligandul de interes. Analiza cu marcator dublu asigură avantajul că molecula acceptor de interes nu trebuie să fie purificată până ce prima etapă a analizei permite înde
RO 112336 Bl părtarea perlelor cu reacție pozitivă nespecifică.
Testele bioactivității
Prezenta invenție furnizează teste pentru activitatea biologică a unui biooligomer dintr-o bancă, tratat astfel, încât să se îndepărteze orice moleculă toxică rămasă de la sinteză, de exemplu prin neutralizarea și spălarea extensivă cu solvent, apa distilată sau mediu de cultură. Activitățile biologice ce pot fi testate includ toxicitatea și provocarea morții, stimularea și asistarea creșterii și schimbarea fiziologică.
Intr-un caz preferat, bio-oligomerii din bancă sunt scindabili selectiv din suportul în fază solidă, denumit în prezenta invenție “perlă”. Intr-un caz, perlele sunt preparate astfel, încât doar o fracțiune din bio-oligomeri să fie scindabilă. Bio-oligomerii scindabili selectiv, linkerii și perlele, sunt discutați, în continuare, în prezenta invenție, supra. O bancă este tratată cu un agent de scindare astfel, încât să aibă loc scindarea unei fracțiuni de bio-oligomeri. Exemplele de agenți de scindare includ, fără a limita posibilitățile, lumina ultravioletă, acidul, baza, enzima sau catalizatorul. Intr-un caz, banca este tratată astfel, încât să se elibereze 10 ... 90% din biooligomeri. Intr-un caz preferat, sunt eliberați 25 ... 50% din bio-oligomeri. In cazul în care toți bio-oligomerii sunt scindabili, scindarea necantitativă poate fi realizată prin limitarea agentului de scindare. Intr-un caz, se limitează timpul de expunere și intensitatea luminii ultraviolete, într-un alt caz, se limitează concentrația reactivului. După tratament pentru efectuarea scindării, banca poate fi tratată mai departe, de exemplu prin neutralizare, pentru a o face compatibilă biologic cu testul dorit. In practică, un specialist în domeniu poate să determine rapid condițiile de scindare corespunzătoare pentru scindarea parțială, atunci când toți bio-oligomerii băncii sunt atașați de faza solidă prin linkeri scindabili sau legături. Un specialist în domeniu va înțelege mai departe că, concentrația relativă a bio-oligomerului elibe rat poate fi influențată de condițiile de scindare.
In timp ce perlele din bancă sunt imobilizate, se va forma un gradient de concentrație a uni bio-oligomer particular. Concentrații mari de bio-oligomeri se vor găsi în apropierea perlei din care au fost eliberați aceștia. Astfel, punerea în evidență a activității biologice de interes, în apropierea perlei va permite identificarea și izolarea perlei și secvențarea sau caracterizarea bio-oligomerului. Identificarea bio-oligomerului este posibilă deoarece a rămas suficient biooligomer pe perlă după scindarea parțială, pentru secvențare sau altă caracterizare. Intr-un alt caz, perlele pot fi repartizare în cavități de microtitrare (de exemplu 10 perle/cavitate], eliberânduse un procent de bio-oligomer și testându-se pentru activitatea biologică, eliminând astfel problema posibilă a difuziei.
Conform celor descrise mai jos, diferite fracțiuni de bio-oligomer se pot atașa la suportul în fază solidă sau perla diferiților linkeri scindabili pentru testele secvențiale. In cadrul acestor exemple termenul “perlă” se referă la suportul în fază solidă.
Următoarele exemple sunt date pentru a ilustra în ce fel se pot realiza testele biologice, fără însă a limita posibilitățile.
(I] O populație de celule dintr-o suspensie unicelulară este depusă peste un mediu lichid sau o matriță semisolidă conținând banca de bio-oligomeri random. Intr-un caz, această procedură se desfășoară pe plăci de cultură de țesut cu 96 de cavități, cu una sau mai multe perle per cavitate plus suspensia celulară. Intr-un alt caz, o matriță barieră sau sub formă de “cuțit de bucătărie” este aplicată la o suspensie de celule și perlelor băncii, pentru a creea spații individuale. O proporție de peptide de pe fiecare perlă este legată cu un linker scindabil în apă (de exemplu diketopiperazină] sau fotoscindabil. Se pot elibera suficiente peptide pentru a se exercita un efect biologic, rămânând, de
RO 112336 Bl asemenea, suficiente peptide legate de perlă pentru secvențare. Suspensia celulară poate fi în soluție sau poate fi ea însuși într-o matriță semisolidă. După o perioadă corespunzătoare de incubație, populația celulară este examinată din punct de vedere al creșterii și proliferării, de exemplu, prin identificarea coloniilor. Intr-un alt caz, se poate adiționa sare de tetrazolium MTT (bromură de 3(4,5-di m eti ltazol-2-i I )-2,5-d if e ni I tetrazolin).
Succinatul de hidrogenează, existent în mitocondria celulelor vii transformă MTT-ul în albastru formazon. Astfel, culoarea albastră concentrată va indica celule active metabolic. Intr-un alt caz, înglobarea de radio marcator, de exemplu .timidină tritiată poate fi folosită pentru indicarea proliferării celulelor.
Similar, sinteza proteinei poate fi vizualizată prin încorporarea de 35Smetionină. Perlele ce eliberează peptide, care fie stimulează, fie inhibă creșterea celulei, pot fi apoi recuperate și secvențate cu secvențele peptidice care sunt apoi identificate, retestate în soluție de culturi confirmatorii împotriva tipului de indicator celular.
(ii) Intr-o altă variantă a punctului (i), supra, perlele dintr-o bancă sunt distribuite în cavități de microtitrare astfel, încât fiecare cavitate să conțină 10 perle. Perlele sunt suspendate într-o soluție. Este eliberată suficientă peptidă de pe fiecare perlă, pentru a exercita un efect biologic, rămânând, de asemenea, suficientă peptidă pe perlă pentru secvențare. Supernatantul conținând peptidă eliberată poate fi transferat pe o placă de replicare sau lăsat în cavități cu perlele. Este determinată activitatea biologică, de exemplu, creșterea sau proliferarea liniei celulare. Perlele din cavități cu activitate biologică sunt secvențiate și fiecare secvență este preparată și testată pentru a se demonstra care dintre secvențe dovedesc activitate biologică.
(iii) Intr-un alt caz al punctului (ii), supra, bio-oligomerii sunt atașați de perle astfel că aproape 1/3 din biooligomeri pot fi eliberați în prima etapă, aproape 1/3 în a doua etapă și restul de 1/3 rămânând pe perlă. Eliberarea secvențială poate rezulta din utilizarea a doi linkeri scindabili diferiți sau prin limitatea agentului de scindare pentru a elibera doar o porțiune de bio-oligomer în fiecare etapă. Pentru ultimul, este de preferat iradierea controlată a linkerului fotoscindabil, deși timpul de expunere la un agent chimic sau la un agent enzimatic de scindare poate însoți scindarea parțială. O bancă de bio-oligomeri scindabili secvențial este preparată și distribuită în cavitățile plăcilor de microtitrare, astfel că fiecare cavitate conține mai mult de 50, și de preferat între 50 și aproape 250 perle per cavitate. Perlele sunt tratate astfel, încât să se scindeze aproape 1/3 din biooligomeri. Supernatantul este testat pentru activitate biologică într-un test replică. Perlele din fiecare cavitate care dovedesc activitate biologică sunt apoi suspendate și distribuite în cavitățile unei plăci de microtitrare, astfel că fiecare cavitate conține de la 1 la aproape 10 perle. Perlele sunt tratate pentru a se elibera o altă treime de bio-oligomeri, iar supernatantul se testează pentru activitate biologică. Perlele din cavități care au activitate biologică sunt izolate, iar bio-oligomerul atașat este secvențat. Acolo unde este găsită mai mult decât o perlă, se prepară toate secvențele identificate și se testează individual pentru activitate biologică. Aceste două etape de test biologic secvențial furnizează o metodă eficientă și puternică de caracterizare a unei bănci foarte mari de bio-oligomeri cu activitate biologică mărită.
(iv) Stimularea eliberării citokinei poate fi testată prin adiționarea unei suspensii unicelulare imobilizată într-o matriță semisolidă, de exemplu gel de agaroză.
In cazul în care bio-oligomerul din prezenta invenție induce eliberarea de citokină, de exemplu limfokină, factor de creștere, hormon etc., prezența citokinei poate fi detectată prin activitatea unei linii celulare indicatoare.
Testele specifice cu o linie celu
RO 112336 Bl
Iară indicatoare pot fi realizate conform descrierii de la punctul (i), supra.
Intr-un alt caz, citokina eliberată de către celulele stimulate poate fi impregnată pe o membrană, de exemplu nitroceluloză, iar citokina detectată prin test imunologic sau printr-un test al legăturii receptorului.
(v) Intr-un alt caz, poate fi observată toxicitatea bio-oligomerului. Zonele sau plăcile lipsite de creștere, de exemplu a unei linii celulare transformate sau a unei linii celulare cancerigene în strat, peste o bancă de bio-oligomeri, pot indica activitate citotoxică. Intr-un aspect particular, se pot așeza în straturi, una peste alta, două populații celulare într-o matrice semisolidă. In acest fel se poate identifica un bio-oligomer citotoxic pentru celula marcată, dar necitotoxic pentru o celulă trecătoare. Un astfel de test permite identificarea rapidă a bio-oligomerului pentru utilizare ca drept agenți chemoterapeutici. Bio-oligomerii citotoxici includ peptide toxice și oligonucleotide anti-senzitive.
(vi) Se poate testa de asemenea schimbarea fiziologică.
Intr-un caz, o suspensie celulară miocardică este așezată în strat peste o bancă de peptide. Pot fi observate “bătăile” celulelor stimulate de un bio-oligomer. Intr-un alt caz, reglarea în creștere a unei enzime particulare poate fi testată prin detectarea creșterii activității specifice a enzimei, dacă se utilizează un substrat corespunzător, ca de exemplu un cromogen (de exemplu MTT, (i), supra), un fluorofor sau un agent chemiluminiscent. Alternativ, reglarea creșterii unei enzime poate fi detectată printr-un test imunologic. Intr-un alt caz, tehnicile histologice pot indica schimbările fiziologice sau morfologice efectuate de un bio-oligomer din bancă.
(vii) Prezenta invenție asigură o metodă de testare a activității unui biooligomer într-o bancă pe celule polarizate, de exemplu celule cu o suprafață basolaterală și o suprafață a lumenului. Culturile de celule polare pot fi preparate pe o membrană semipermeabilă, cores punzând lumenului. 0 bancă este adiționată într-o matriță semisolidă la suprafața lumenului sau la suprafața basolaterală. Se pot testa diferite efecte ale unui bio-oligomer din invenție, ca de exemplu transportul polar, proliferarea, comunicarea intracelulară etc. în particular, prin marcarea bio-oligomerului, de exemplu, cu un radiomarcator sau un fluorofor, se pot identifica bio-oligomeri transportabili. Este o nevoie stringență în domeniu de molecule care se absorb în mod specific. In particular, astfel de molecule sunt utile pentru administrarea orală sau nazală a medicamentelor, atunci când este necesar transportul de la suprafața lumenului la suprafața basolaterală a epitelului.
Sunt avute în vedere, de asemenea, și testele biologice ale bio-oligomerilor nescindabili. Activitatea biologică a perlelor integral acoperite cu bio-oligomer poate fi apoi caracterizată. Intr-un caz, o bancă poate fi introdusă într-un animal. Perlele de interes pot fi izolate dintr-un țesut specific. Pot fi izolate perlele care au fost absorbite specific după administrarea orală, nazală sau cutanată. Intr-un caz preferat, astfel de perle sunt magnetice sau au altă caracteristică de identificare, putând fi astfel rapid izolate de pe țesut.
Este lesne de înțeles pentru un specialist în domeniu că toate testele biologice precedente se aplică bio-oligomerilor ce conțin peptide, oligonucleotide sau himere peptidico-oligonucleotidice. Peptidele și analogii peptidelor sunt bine cunoscute ca promotori de creștere, inhibitori de creștere sau molecule regulatoare. Peptidele pot acționa ca regulatori de gene prin agonizarea sau antagonizarea efectelor proteinelor promotoare, intensificatoare și reglatoare. Similar, acizii nucleici pot acționa ca inhibitori asupra determinanților expresiei genei la nivelul transcrierii prin (de exemplu t legarea sau blocarea promotorilor, intensificatorilor, a zonelor de stopare a transcripției etc.), procesare (de exemplu, prin interferarea sau sprijinirea procesului și mRNA) și translație.
RO 112336 Bl
Este binecunoscută în domeniu utilizarea unei oligonucleotide sau un analog de oligonucleotidă pentru blocarea translației unei mRNA specifice. Oricare dintre băncile descrise în cele arătate mai sus, supra, poate fi testată pentru activitate biologică.
Este de înțeles pentru un specialist în domeniu, că orice celulă ce se poate menține în cultura de țesut, fie pentru un scurt timp, fie pentru termen lung, poate fi utilizată într-un test biologic. Termenul “celulă” include celule procariotice (de exemplu t bacterii) și eucariotice, drojdie, mucegai sau fungi. Se pot folosi celule primare sau linii menținute în cultură. Mai mult decât atât, specialiștii consideră că testele biologice pe viruși pot fi realizate prin infectarea sau transformarea celulelor cu viruși. De exemplu, fără a limita posibilitățile, abilitatea bio-oligomerului de inhibare a activității lizogenice a bacteriofagului lambda poate fi analizată prin identificarea coloniilor transferate de E.coli, care nu formează plăci clare când sunt infectate.
Metodele din prezenta invenție, de testare a activității unui bio-oligomer dintr-o bancă de bio-oligomeri, nu sunt limitate la exemplele anterioare. Orice sistem de testare poate fi modificat, astfel încât să se includă în prezenta invenție dezvăluită.
Biotest pentru un agonist de eritropoietină
Intr-un caz particular, prezenta invenție furnizează un test pentru un agonist bio-oligomeric de eritropoietin. Trebuie recunoscut că metoda particulară descrisă asigură o strategie utilă pentru identificarea oricărui agonist, de exemplu, agonist al factorilor de creștere, hormonilor, citokinelor, limfokinelor și al altor mesageri intercelulari, ca cei descriși mai înainte, supra.
In exemplu prezent, banca biooligomerică poate fi alcătuită din pentapeptide preparate cu cei 19 amino acizi comuni (exemplu» excluzând cisteina). Numărul teoretic de peptide distincte este 247BD99. Banca poate fi produsă în 19 etape pentru a facilita efortul de caracterizare. Acestea vor fi însoțite de selecția unui singur amino acid pentru Cterminal în fiecare etapă, astfel încât doar celelalte patru poziții ale amino acidului să se randomizeze. Astfel, secvența pentru fiecare etapă va fi XXXYliker-rășină în care Y este selectat pentru acea etapă, iar X reprezintă înglobarea random a amino acidului. Această abordare reduce numărul peptidelor potențiale pentru fiecare etapă la 130321. Distribuit ca 1 □ perle (peptide) la fiecare cavitate din cele 96 de cavități ale plăcilor de microtitrare, numărul de plăci necesar este de 136 (o placă suplimentară este necesară pentru standardul biotestului și pentru control), deci se obține un total de 137 de plăci necesare. Metoda permite distribuția integrală a băncii peste acest număr de plăci într-o singură zi de lucru.
□ proporție majoritară (50 ... 80%) din peptidele sintetizate pe perle poate fi scindabilă pentru utilizarea în biotest, astfel că cel puțin 50 pmol peptide se vor elibera de pe fiecare perlă. Drept linker scindabil este preferată legătura diketopiperazinică deci se poate utiliza, de asemenea, și un linker fotoscindabil. Legătura este suficinet de stabilă în condiții de aciditate slabă (pH = 8,5) pentru a permite distribuția perlelor pe o perioadă de 6 ... 8 h. Scindarea este provocată prin adiționarea de 20 pl de 1,0 ... 10 mM tampon HEPES (pH 8,5) în fiecare cavitate. Scindarea are loc pe parcursul nopții (12 ... 18 h) potrivit cu menținerea volumului final al cavității. Evaporarea poate fi controlată prin stoparea plăcilor într-o cameră cu umiditate.
Soluția peptidică rezultată în urma scindării perlelor băncii trebuie să fie aseptică, dacă nu se poate să fie sterilă. Condițiile aseptice sunt necesare deoarece soluția conține 25% din volumul final al culturii și deoarece timpul de realizare al culturii va fi de cel puțin 24 h. Condițiile aseptice se pot realiza prin, (1) hidratarea perlelor cu apă distilată, după sinteză; (2) diluarea suspensiei inițiale de perle în apă distilată acidulată
RO 112336 Bl și (3) utilizarea tehnicilor sterile de distribuire a perlelor pe plăcile sterile de cultură. Suspensia finală a perlei poate conține mai puțin de 20% DMSO, pentru ajutarea solubilizării peptidelor hidrofobe. DMS, trebuie să fie adiționat devreme, în procesul de hidratare, pentru a facilita solubilizarea. Suspensia finală de perlă trebuie să aibe o concentrație de 10 perle/50 μΙ. Menținerea perlelor în suspensie, în timpul pipetării, poate fi însoțită de adiționarea de metilceluloză în proporție de 0,8 ... 3,2%. Utilizarea metilcelulozei poate permite reducerea necesarului de DMSO în vederea influențării solubilității. Concentrația finală de metil celuloză în culturi este menținută sub 0,8%, astfel să nu interfereze cu biotestul.
Peptidele eliberate pot fi transferate pe plăcile cu culturi ale biotestului ca probe de 50 μΙ, menținând cu exactitate corespondența între plăcile de probă și plăcile cu cultură. Este important să se mențină condițiile de sterilitate în timpul transferării. Se poate adiționa EPO uman recombinat la cavitățile selecționate ale plăcilor, pentru a servi drept control pozitiv (fiecare placă] și pentru a servi la trasarea curbelor standar (prima și ultima placă). In cavitățile de control se poate adăuga 0,1 U.l. EPO, iar curbele standard se obțin din șase seturi de cavități duplicate ce conțin 1,0 ... 100 miliunități EPO.
Biotestul poate fi făcut cu o linie celulară (EPO-R). Aceste celule sunt dependente de prezența. fie a interleukinei-3 (IL-3], fie a EPO. Cultura acestor celule în prezența de 10% IL-3 (v/v) mediu de cultură condiționat WHEI poate preveni posibila interferență a EPO din mediul cu biotestul. Mediul de bază pentru dezvoltarea celulelor Ba/F3-T este mediul RPMI 1640 ce conține 2,0 g/1 NaHC03, 10% (v/v) ser de fetus bovin, 1 x pencilin-streptomicin, 5 μΙ β-mercaptoetanol și 10 mM HEPES (concentrație finală] ajustat la pH = 7,4. Acest mediu trebuie suplimentat cu 10% (v/v] mediu condiționat cu WHEI care furnizează IL3. Mediul condiționat cu WHEI este pre parat prin cultivarea celulelor WHEI în scopul aglomerării în același mediu de bază. Mediul condiționat este centrifugat în vederea îndepărtării celulelor, trecut printr-un filtru de 0,22 pm și înghețat. Celulele Ba/F3-T sunt cultivate pentru a se obține 1,31 x 107 celule, ce vor fi distribuite ca 1 x103 celule/cavitate și într-un volum de 150 μ1, după cum este descris în literatura de specialitate.
Celulele Ba/F3-T sunt transferate din recipiente cilindrice în recipiente largi (250 ml) sterile de centrifugare. Celulele vor fi colectate prin centrifugare, la aproximativ 500 x g și timp de 5 min. Celulele sunt apoi resuspendate în 200 ml de mediu bazic proaspăt, fără IL-/ pentru contorizare celulară. Volumul final este apoi ajustat, cu mediu suplimentar, pentru a da 6,67 x 103 celule/ml (1 x 103 celule/150 μΙ). Este necesar ca suspensia finală (celulară) să fie împărțită în 4 ... 8 părți alicote, pentru a fi stocate în incubator în timpul procesului lung de distribuție. Numărul celulelor și viabilitatea poate fi determinată pe probe care au fost luate la începutul și sfârșitul procesului de distribuție pentru a avea siguranța că numere similare de celule viabile sunt prezente în primele și ultimile plăci de cultură. Celulele sunt distribuite în plăcile de cultură ce conțin supernatanții peptidici eliberați. Plăcile sunt incubate timp de trei zile, așa cum s-a arătat mai sus, supra.
Punctul final al biotestului este numărul de celule vii prezente în fiecare cavitate de cultură. Acesta poate fi determinat utilizând testul MTT modificat. Acest test modificat permite măsurarea numărului de celule vii, fără îndepărtarea mediului de cultură.
MTT (bromură de 3(4,5-dimetiltiazol-2-il)2,5-difenil tetrazolin este preparat într-o soluție de 5 mg/ml în PBS ( un necesar de aproape 270 ml). Fiecare cavitate a plăcii de biotestare primește câte 20 μΙ din această soluție, și apoi placa este incubată timp de 4 h la temperatura de 37°C. După această perioadă, se adiționează la fiecare cavitate 100 μΙ de soluție de extracție și
RO 112336 Bl placa este plasată într-un sonicator cu baie, timp de 120 s. Soluția de extracție conține 50% (v/v) de N,N-dimetilformamida într-o soluție de 20% (v/v) dodecilsulfat de sodiu (SDA) și este ajustată la pH = 4,7 cu amestec de acid clorhidricacid acetic, conform celor descrise în literatura de specialitate. Acest tratament solubilizează produsul formazan al metabolismului lui MTT, pentru măsurarea densității optice la 57 nm, cu un cititor de microplacă.
Valoarea densității optice (OD) obținută din biotest este mediată pentru toate cavitățile de probă pentru a se determina cu o singuranță de 95% intervalul pentru valoarea medie. Valorile OD ale cavităților, în afara acestui interval, sunt utilizate pentru o determinare pein testul Students a semnificației. Valorile seminificative vor fi comparate cu curba EPO standard pentru a obține o estimare eficace ca IU relativ la EPO. Curba standard este determinată prin analiza regresiei neliniare, utilizând ecuația logistică. Datele din ambele curbe standard vor fi analizate, împreună și separat, pentru a determina dacă este o diferență semnificativă în răspunsul măsurat în ambele puncte finale ale procedurii de biotestare. Pentru a determina dacă există o diferență esențială în răspunsul la test, se va utiliza o comparație a valorilor de control măsurate pentru fiecare placă, pe întreg parcurs al testului. Este important să se recunoască că sunt doi factori de creștere ai receptorilor (IL-3 și EPO-R) prezenți în celulele Ba/F3-T și activarea fiecăruia va produce un răspuns pozitiv la biotest. Astfel, biotestul descris mai înainte se va selecționa, atât pentru IL-3, cât și pentru agoniștii receptoruli EPO. Sunt două soluții la această problemă. Una este de a utiliza o linie celulară diferită sau poate celule de splină de la șoareci tratați cu fenilhidrazină. O a doua soluție este de a testa peptide sintetice, atât pentru activitatea EPO.cât și a IL-3 într-un test secundar sau prin metode de legare cu radioliganzi.
Mimetici enzimatici/inhibitori enzimatici.
Prezenta invenție furnizează, de asemenea, bio-oligomeri ce catalizează reacții, adică bănci de enzime ce servesc drept co-enzime, sau care inhibă reacțiile enzimatice. Astfel, invenția prezintă metode de testare pentru activitatea enzimatică sau co-enzimatică, sau pentru inhibarea activității enzimatice.
Activitatea enzimatică poate fi observată prin formarea unui produs de reacție detectabil. Intr-un caz particular, un bio-oligomer dintr-o bancă catalizează reacția enzimatică a substratului de fosfatază alcalină, de exemplu 5-bromo-4clor-3-irîdoil fosfat (BCIP) și formează un produs de reacție insolubil de culoare albastră, pe suportul în fază solidă [vezi exemplul de realizare nr.8, infra).
Intr-un alt caz, se poate forma într-o matriță semisolidă o zonă a produsului de observat, de exemplu culoare sau fluorescență. O bancă este depusă în strat într-o matriță semisolidă, de exemplu gel de agaroză și se adiționează un substrat cromogenic sau un alt indicator. Acolo unde un bio-oligomer/ suport în fază solidă dovedește activitate enzimatică dorită, se va forma o zonă a produsului. De exemplu, fără a limita însă posibilitățile, se poate identifica un analog al peroxidazei din hrean prin adiționarea unei soluții de aminoantipiren (0,25 mg/ml], fenol (8 mg/ml) și H202 (0,005%) într-un tamon 0,1 IVI fosfat de pH = 7,0. Perlele cu activitate enzimatică vor forma zone de culoare purpurie. Intr-un alt caz, bio-oligomerii/perle cu activitate proteazică pot fi identificați prin adiția substratelor proteazice colorimetrice.
Activitatea co-enzimatică poate fi observată prin testarea activității enzimatice mediate de o co-enzimă, acolo unde lipsește co-enzima naturală sau coenzima obișnuită.
Activitatea co-enzimatică inhibitorie poate fi detectată cu un bio-oligomer parțial eliberat. Eliberarea bio-oligomerilor a fost arătată în cele prezentate mai sus, supra. Intr-un exemplu, fără a limita însă posibilitățile, o bancă bio-oligomerică este depusă în strat într-o
RO 112336 Bl matriță semisolidă ce conține o enzimă. Banca este tratată cu un bio-oligomer parțial eliberat. Acolo unde bio-oligomerul inhibă activitatea enzimatică, se poate identifica o zonă liberă de produs. Intr-un caz, substratul enzimatic este cromogenic și se formează un produs colorat. Astfel, prezența unui indicator enzimatic poate rezulta în formarea unei zone fără culoare. Intr-un alt caz, inhibarea unei proteolize a hemoglobinei sau a unei enzime indicator, ca de exemplu fosfatază alcalină, poate fi identificată prin prezența unei zone opace în matrița semisolidă. Aceasta este deoarece prezența inhibitorului de proteoliză va preveni degradarea hemoglobinei sau a enzimei indicator.
Este lesne de înțeles pentru un specialist în domeniu, că un bio-oligomer ce prezintă activitate enzimatică, activitate co-enzimatică sau care inhibă activitatea enzimatică poate fi peptidă, o oligonucleotidă sau o himeră peptidică-oligonucleotidică. De interes particular sunt peptidele nenaturale sau ciclice, ce pot crea o rețea catalitică unică sau o suprafață (cum s-a arătat mai sus, supra). De asemenea, este de așteptat că o himeră peptidică-nucleotidică să prezinte proprietăți chimice unice, ca de exemplu activitate enzimatică sau co-enzimatică, datorită juxtapunerii unice a grupelor funcționale. Mai mult decât atât, se consideră că bio-oligomerul/suport în fază solidă poate demonstra activitatea enzimatică sau co-enzimatică în timp ce biooligomerul liber nu are nici o activitate. Aceasta se întâmplă deoarece vecinătatea unei densități mai mari de biooligomer poate conferi proprietăți chimice unice combinației bio-oligomer/ suport în fază solidă. Se consideră, de asemenea, că un bio-oligomer poate prezenta activitate enzimatică sau coenzimatică când se eliberează de pe o perlă. Se consideră că, co-enzime cunoscute (co-factori) pot fi încorporate chimic în bio-oligomerul nenatural pentru a stimula o enzimă simplă sau complexă, incluzând, de exemplu, o catenă transportoare de electron.
Metoda de caracteirzare a unui bio-oligomer.
O dată ce o perlă conținând un bio-oligomer de interes este selectată în conformitate cu una din metodele arătate mai sus, supra, invenția de față prezintă un mijloc de determinare a structurii și a secvenței bio-oligomerului.
In cazul în care care bio-oligomerul este o peptidă, metoda preferată de secvențare este degradarea Edman. O metodă preferată particulară folosește secvențatorul proteinic 477 A aplicat biosistemelor. Secvența de amino acid a peptidelor poate fi, de asemenea, determinată fie prin spectroscopie de masă cu bombardament atomic rapid (FABMS), fie prin alte metodologii analitice cunoscute în domeniul de specialitate.
Peptidele pot fi secvențate fie atașate la suportul în fază solidă, fie scindate de suportul în fază solidă. Pentru scindarea peptidei, combinația peptidăperlă izolată este tratată cu agenți tradiționali de scindare, cunoscuți specialiștilor în domeniu, pentru capacitatea de separare a polimerului de pe suporturile în fază solidă. Alegerea agentului de scindare selectat va depinde de suportul în fază solidă folosit. De exemplu, pentru scindarea peptidelor de pe rășina Wang este preferabil să se folosească 50% acid trifluoracetic (TFA) în solvent de diclormetan.
Alternativ, într-un alt caz ce întruchipează scopul prezentei invenții, este posibil să se izoleze un singur suport în fază solidă, ca de exemplu, o perlă, cu bio-oligomerul său atașat și apoi să se supună perla la un secventator fără scindare prealabilă a bio-oligomerului de pe suport. De exemplu, dacă bio-oligomerul este o peptidă se estimează că o singură rășină cu diametrul de 100 pm, cu o substituție de 0,5 mEq/gram rășină conține aproximativ 200 pmol peptide.
O singură rășină PAM cu diametrul 250 pm cu o substituție de rășină de 0,5 mEq/gram conține aproximativ 3125 pmol peptide. Cu un secvențator peptidic care este cunoscut din stadiul
RO 112336 Bl tehnicii este nevoie doar de 5 ... 10 pmol pentru o secvențare adecvată. Prin urmare, o dimensiune standard, un singur suport de rășină PAM de 100 pm diametru conține mai mult decât cantitatea adecvată de peptide pentru secvențare.
în cazul în care peptidele conțin amino acizi sau peptidomimetici care nu pot fi secvențați prin metoda EDMAN, perla poate fi preparată astfel, încât 10 ... 50% din peptide să nu încorporeze reziduul nesecventabil. Secvența rămasă poate fi determinată în secvența care include reziduul nesecvențiabil și care este extrapolat de acolo.
□ altă soluție pentru reziduurile nesecvențiabile este de a acoperi temporar o porțiune din peptidă înaintea încorporării reziduului nesecventabil în timpul sintezei băncii. In timpul identificării structurale care urmează, se poate folosi degradarea Edman, pentru reziduul nesecventabil și apoi să se deprotejeze temporar, porțiunea acoperită și să rezume secvențarea distalului (adică C-terminal) la reziduul nesecvențiabil.
In cazul oligonucleotidelor, secvențarea se poate realiza cu un secvențator oligonucleotidic automat. Se poate, de asemenea, utiliza și altă metodă de secvențare, care este cunoscută în domeniu. Spectrografia de masă prin bombardament ionic rapid, furnizează probabil analiza structurală cea mai riguroasă. Prin detectarea fragmentelor cât și a speciilor de bio-oligomeri însăși, se poate reconstitui o secvență. Spectroscopia de masă prin electropulverizare poate furniza atât date structurale <cât și ale secvenței. □ dată ce secvența biooligomerului este determinată, se poate sintetiza chimic o cantitate mare, folosind un sintetizator automatic de peptide sau alte mijloace de biosinteză sau de sinteză chimică. Suplimentar, o dată ce a fost identificată o secvență de bio-oligomer se pot substituit subunități analoage pentru a crește activitatea bio-oligomerului specific.
Agenți terapeutici și de diagnos ticare din băncile bio-oligomerice random.
O dată ce o secvență bio-oligomerică de interes a fost determinată, prezenta invenție furnizează molecule ce conțin secvența bio-oligomerică pentru utilizarea în tratarea și diagnosticarea bolilor. Secvența bio-oligomerică singură poate fi un agent terapeutic sau de diagnosticare sau poate fi încorporată într-o moleculă mai mare. O moleculă conținând o secvență de bio-oligomer cu activitate biologică sau de legare poate fi definită ca “moleculă efector”. Invenția se referă, de asemenea, la bănci utilizate în diferite cazuri. Funcția “efector” a numitei molecule efector poate fi oricare din funcțiile descrise în prezenta invenție, sau cunoscute în domeniul de specialitate.
Metoda descrisă în prezenta invenție nu furnizează numai un nou instrument de căutare a liganzilor specifici pentru valorile terapeutice și de diagnosticare, dar și o informație importantă asupra unei serii de liganzi cu secvență primară foarte diferită sau o compoziție chimică care poate interfera fizic cu aceeași moleculă acceptor. Completând această informație cu modelarea moleculară și cu tehnicile modeme computerizate se poate furniza o înțelegere nouă fundamentală a interacțiunilor ligand-receptor.
Agenții terapeutici ai invenției conțin molecule receptor care se vor lega de părțile biologice active ale litokinelor, factorilor de creștere sau agenților hormonali, astfel sporind sau neutralizând acțiunea loc și care vor bloca sau spori transcripția și/sau translația.
Agenții terapeutici din prezenta invenție includ, de exemplu ( molecule efector care se leagă de un receptor de interes farmaceutic, ca de exmeplu, receptorii factorului de creștere, receptorii agentului neurotransmițător sau receptorii hormonali. Aceste molecule receptor pot fi utilizate, atât ca agoniști, cât și antagoniști ai acțiunii ligandului receptor natural.
O altă folosire a moleculelor efec
RO 112336 Bl tor care se leagă de receptori ar putea fi utilizarea legării pentru blocarea atașării virusului sau microbilor care au căpătat acces către celulă, prin etașarea la un receptor celular normal. Exemple ale acestui fenomen includ legarea virusului imunodeficitar uman la receptorul CD4 și a virusului herpes simplex la receptorul factorului de creștere fibroblast.
Moleculele efector ce ocupă receptorul pot fi uitilizate de agenți farmaceutici de blocare a infecției virale a celulelor marcate. Invaziile parazitare ale celulelor pot fi în mod similar inhibate, după ce moleculele efector corespunzătoare au fost identificate conform prezentei invenții. Intr-un alt caz, o moleculă efector conținând o secvență bio-oligomerică ce se leagă de o moleculă acceptor de interes poate fi utilizată pentru a însemna un medicament sau o toxină. Intr-un caz preferat, molecula acceptor de interes este un receptor sau un antigen găsit pe suprafața unei celule tumorale, unui parazit sau microb, de exemplu o bacterie, virus, parazit unicelular, patogen unicelular mucegai sau fungi.
Suplimentar, este posibil ca, câțiva din milioanele de bio-oligomeri din probă să furnizeze secvențe ce au activitate biologică. Unele pot izola biooligomerii ce posedă activitate antitumorală, antiparazitară sau antimicrobiană, de exemplu antifungică, antibacteriană, antiparazitară unicelulară, antipatogen unicelular sau activitate antivirală. Suplimentar, o parte din acești bio-oligomeri pot acționa ca angoniști sau antagoniști ai factorilor de creștere, de exemplu eritropoietic, factorului de creștere epidermic, factorului de creștere al fibromului, factorului de creștere tumoral, pentru a numi doar câțiva, cât și hormoni, agenți de neurotransmisie, imunomodulatori sau alte molecule modulatoare. Intr-un caz, bio-oligomerii sunt peptide.
Agenții terapeutici din prezenta invenție includ, de asemenea, molecule efector conținând o secvență de biooligomer, care are o afinitate mare pentru medicamente, de exemplu digoxina, benzodiazepam, heroina, cocaina sau teofilina. Astfel de peptide pot fi utilizate ca un antidot pentru supradozarea unor astfel de medicamente, similar, agenții terapeutici includ molecule efector care se leagă de molecule mici sau ioni metalici, incluzând metale grele. Bio-oligomerii cu afinitate mare pentru bilirubină se vor folosi în tratarea nou născuților cu hiperbilirubinemie.
In general, prezenta invenție furnizează metode de identificare a biooligomerilor pentru terapia afecțiunilor sau bolilor, după cum este arătat în literatura de specialitate. De exemplu, se pot identifica molecule efector cu activitate antiparazitară, anticoagulantă, anticoagulant antagonist, de agent antidiabetic, anticonvulsivă, antidepresantă, antidiareică, antidot, antigonodoprinică, antihistaminică, antihipertensivă, antiinflamatorie, antivomitivă, antimigrenă, antipiretică, antitoxină (de exemplu antivenin), bronhodilatatoare, vasodilatatoare, de agent de chelare, de relaxant muscular, agent antiglaucomatos sau sedativ.
Agenții terapeutici din prezenta invenție pot, de asemenea, să conțină purtători corespunzători capabili farmaceutic, diluanți și adjuvanți. Astfel de purtători pot fi lichide sterile, ca de exemplu apă și uleiuri vegetale, uleiuri animale sau petroliere, precum și uleiuri de natură sintetică, cum ar fi, de exemplu, ulei de arahide, ulei de soia, ulei mineral, ulei de susan și altele. Apa este purtătorul preferat atunci când compoziția farmaceutică se administrează intravenos. Soluțiile de sare, dextroza apoasă și soluțiile de glicerină pot, de asemenea, să fie folosite ca purtători lichizi pentru soluțiile injectabile. Purtătorii farmaceutici corespunzători mai includ drojdie, glucoză, lactoză, sucroză, gelatină, malț, orez, făină, talc, silicagel, carbonat de magneziu, stearat de magneziu, stearat de sodiu, talc, clorură de sodiu, glicerină monostearat, glicerină, propilenă, glicol, apă, etanol și altele. Aceste compoziții pot fi sub formă de
RO 112336 Bl soluții, suspensii, tablete, pilule, capsule, pulberi, formulări cu degajare retard și altele.
Purtătorii farmaceutici corespunzători sunt descriși în literatura de specialitate. Astfel de compoziții vor conține o cantitate efectivă terapeutică de compus activ împreună cu o cantitate corespunzătoare de purtător pentru a rezulta o formă propice administrării la pacient. Cu toate că injecțiile intravenoase sunt o formă foarte eficientă de administrare se pot folosi și alte modalități, ca de exmeplu injecția sau administrarea orală, nazală sau parentală.
□ moleculă conținând o secvență bio-oligomer determinată, conform prezentei invenții, poate fi, de asemenea, utilizată pentru formarea agenților de diagnosticare. Agentul de diagnosticare poate fi realizat din una sau mai multe secvențe din prezenta invenție, de exemplu mai mult decât o secvență de peptidă sau secvență de oligonucleotidă. Suplimentar, agentul de diagnosticare poate conține pe oricare din purtătorii descriși mai sus ca agenți terapeutici.
După cum este folosit aici, termenul de “agent de diagnosticare” se referă la un agent ce poate fi utilizat pentru detectarea afecțiunii, ca de exemplu, fără a limita posibilitățile, cancer, ca de exemplu celule limfom T sau B și infecții, ca cele prezentate mai înainte. Detectarea este utilizată în sensul său cel mai larg, pentru a conține indicația existenței afecțiunii localizării părții din corp implicată în numita afecțiune sau indicarea gravității afecțiunii. De exemplu, un complex peptidă-imunoperoxidază din hrean sau un agent imunohistochimic înrudit poate fi folosit pentru detectarea și evaluarea receptorului specific sau a moleculelor de anticorpi în țesuturi, ser sau fluide din corp. Agenții de diagnosticare pot fi folosiți corespunzător in vitro sau in vivo. In mod particular prezenta invenție furnizează reactivi utili de diagnosticare pentru imunoteste, hibridizare Southern sau Northen și teste in situ.
Suplimentar, agentul de diagnosticare poate conține unul sau mai mulți marcheri, ca de exemplu, fără a limita însă posibilitățile, radioizotop, marcator, fluorescent, substanțe paramagnetice și alți agenți care îmbunătățesc imaginea. Specialiștii în domeniu cunosc gama de markeri și metodele de încorporare a acestora în agent, pentru a forma agenții de diagnosticare.
Agenții terapeutici și agenții de diagnosticare din prezenta invenție pot fi folosiți pentru tratamentul și/sau diagnosticarea animalelor și cel mai preferat al omului ca de altfel și al câinilor, pisicilor, cailor, vacilor, porcilor, cobailor, șoarecilor și șobolanilor.
Bolile și afecțiunile care răspund la terapia și diagnosticarea cu biooligomeri, dezvăluiți conform prezentei invenții, sunt mai variate și mai largi ca gamă în funcție de permutabile structurilor într-o bancă de bio-oligomeri random. Următoarele exemple sunt prezentate cu scop ilustrativ, dar nelimitativ.
Compoziții citotoxice.
moleculă conținând o secvență de bio-oligomer poate avea o activitate citotoxică proprie. Astfel, un bio-oligomer care se leagă de un acceptor de interes se poate modifica prin tehnici cunoscute în domeniu, cum ar fi, de exemplu, prin conjugarea la compuși citotoxici, ca de exemplu medicamente sau radionuclide, pentru aceea molecule citotoxice. Biooligomerul, de exempluipeptida, poate ‘însemna” compusul citotoxic și să distrugă specific celulele ce prezintă o moleculă acceptor particulară. De exemplu, astfel de conjugați de peptidă citotoxică pot să elimine direct populațiile nedorite de celule B, de celule limfomas B, populații de celule T sau celule limfomas T ale unui pacient. Posibililele aplicații clinice includ tratarea bolilor autoimunitare, limfomas-ului și terapia · imunosupresivă specifică în cazul transplantului de organe. Se pot trata, de asemenea, în acest mod, altfel de forme de cancer în care celulele tumorale prezintă o legătură a ligandului mediată de receptor, ca de exemplu cancerul de sân sau cancerul ovarian, în care feceptorii factorului de creștere epidermic (EGF) se pare că
RO 112336 Bl joacă un rol important.
Agenții citotoxici specifici pentru o celulă însemnată, ca de exemplu.o celulă canceroasă sau o celulă infectată viral, dar care nu distrug celulele învecinate, țesuturile sau organele pot fi obținute conform metodelor prezentate. In plus, față de însemnarea celulelor dăunătoare, ca de exemplu tumori, aceste toxine specifice pot fi utile ca agenți antimicrobieni. în particular, astfel de agenți terapeutici pot prezenta activitate bacteriostatică, bactericidă, antivirală, antiparazitară sau fungicidă. Similar, toxinele pot fi identificate ca având activitate insecticidă sau erbicidă.
într-un caz, bio-oligomerul poate să fie peptidă. Peptida poate acționa ca agent de marcare la care este atașat o toxină. Peptida însăși poate marca o celulă și acționa ca o toxină. într-un alt caz, bio-oligomerul poate fi o olgonucleotidă. Această oligonucleotidă poate media efectul ei toxic prin interferare cu transcripția sau translația esențială pentru viabilitatea celulei.
Modificatori de imunitate
Prezenta invenție furnizează molecule și compoziții folosite ca modificatori de imunitate. Termenul “modificator de imunitate” se referă la molecule sau compuși capabili să efectueze schimbări în sistemul imunitar. în particular, modificatorii de imunitate pot stimula sau inhiba reacțiile celulelor T, reacțiile celulelor B, reacțiile imunitare nespecifice ca acelea care sunt mediate de acțiunea macrofagilor, neutrofilelor, fagocitelor polimorfonucleare, granulocitelor și altor celule de tip mieloid. Moleculele efector pot fi utilizate pentru a trata următoarele afecțiuni imunologice: (1) diferite afecțiuni autoimunitare, incluzând miastenia gravis, scleroza multiplă, boala lui Grave, artrite reumatoide, lupus sistemic eritematos (SLE), anemie hemolitică autoimunitară, trombocitopenie imunitară, (2) boala Hodkin (limfogranulomatoză malignă] și alte tipuri de cancer, [3] alergie, [4] afecțiuni complexe imunologice, (5] respingere la transplant de organe, (6) afecțiuni infecțioase și (7) afecțiuni diabetice.
Modificatorul de imunitate poate stimula activitatea imunitară prin mimarea activității unei limfokine stimulate, ca de exemplu interleukina IL-1, IL-2, IL-4, IL-B, factorul de stimulare al coloniei de granulocite (CSF), macrofagul-CSF și granulocita/macrofag-CSF, pentru a menționa doar câteva. Stimularea poate avea loc prin legarea peptidică a ligandului la un receptor limfokinic sau prin activitate mediată de oligonucleotidă a mecanismului transcripțional celular. Un modificator de imunitate poate acționa prin legarea la o leucocită sau limfocită, ca de exemplu receptor Fc, LAF-1, LAF-2 etc. și provocând activitatea, ca de exemplu fagocitoză sau degajarea de citotoxine. 0 moleculă efector din prezenta invenție poate acționa ca o chemotoxină.
într-un caz particular, o moleculă conținând un bio-oligomer poate mima antigenul ca atare, bio-oligomerul poate fi un vaccin util pentru a deduce activitatea celulelor T sau celulelor B specifice pentru un patogen particular. Alternativ, un antigen, adică mimic-epitopic poate fi util pentru a sprijini o reacție imunitară specifică.
Se consideră că moleculele efector din prezenta invenție vor fi efectuate în formă eliberată. Totuși, un bio-oligomer particular poate demonstra o eficacitate mai mare atunci când rămâne prins pe suportul în fază solidă. In particular, densitatea mare de mimiepitopic poate stimula mai eficient o reacție a celulei B prin legarea și fixarea membranei imunoglobulinice sau altă reacție mediată de receptor.
Se consideră mai departe, că o bancă limitată din invenția de față, poate fi folosită ca vaccin pentru un patogen ce se prezintă cu o diversitate de epitopi. De exemplu, este cunoscut că structura primară (secvența] a VSG6 glicoproteină cu suprafață variabilă) a tripanozomului variază pe durata infecției. Prin alterarea epitopului de VSG, tripanozomul evită recunoașterea imunologică. Similar, s-a găsit că paraziții malariei exprimă diverși
RO 112336 Bl epitopi asupra speciilor, în diferite stagii ale ciclului de viață și în cadrul subspeciilor. Astfel, o bancă de peptide de diversitate restrânsă poate imuniza împotriva diversității variabile de antigen prezentată de tripanozom sau paraziții malariei. O bancă limitată poate avea ca aplicabilitate ca vaccin în orice caz în care este necesară imunitatea la o gamă de antigeni.
Se consideră că moleculele de efector pot, de asemenea, inhiba reacția imunitară prin (1) blocarea recunoașterii imunologice specifice la nivelul anticorpului sau receptorului antigenului celulei T; (2) prin blocarea Fc sau a altor receptori imunologici; (3) prin legarea și inhibarea activității limfokinelor și citokinelor și (4) prin asigurarea semnalelor negative către celulele imune. Moleculele efector pot fi utilizate pentru a tolera sistemul imunitar, în particular pentru a autoimuniza antigenii. De exemplu, toleranța imunologică la DNA poate fi efectuată cu o oligonucleotidă sau o bancă de oligonucleotide și poate fi folosită pentru tratamentul SLE-ului. Inhibiția imunologică poate fi realizată prin mecanismele decise în cele prezentate mai sus, supra. Suplimentar, agenții terapeutici din invenție pot cuprinde peptide antigenice sintetice selectate, cu care este posibil să se manipuleze sistemul imunitar astfel, încât să se inducă toler7 ranța acelui antigen și prin urmare să se suprime sau să se trateze boala respectivă autoimunitară, similar cu peptide antigenice sintetice specifice este posibil să se inhibe formarea imunocomplecșilor multimerici, prin urmare să se prevină bolile imunocomplexe specifice.
Peptidele ce se leagă la anticorpii monoclonali specifici tumorali pot fi izolate, secvențate și sintetizate, pentru utilizarea ca imunogen pentru a induce imunitate activă împotriva tumorii. Peptide specifice ce au afinitate mare pentru receptorii Fc pot fi utilizate ca agenți terapeutici pentru a bloca receptorii Fc ai sistemului reticuloendotelial, care ar putea fi beneficii pentru pacienții cu afecțiuni autoimunitare, ca de exemplu trombocitopenia idiopatică și anemia hemolitică autoimunologică.
Posibilitățile de tratament cu astfel de peptide pot fi chiar și mai semnificative. Peptidele care seamnă cu epitopii de invadare ai organismului pot fi folosite pentru a bloca infecția dintr-un organism. De exemplu, studiile recente asupra bolii SIDA au arătat că infecția cu virusul SIDA începe cu recunoașterea și legarea dintre o glicoproteină specifică (gp 120) pe suprafața SIDA, cu receptorul de suprafață CD4 pe celulă. Administrând o peptidă ce se aseamănă cu gp 120 este suficient să se blocheze receptorul CD4 astfel că virusul SIDA nu se va mai putea lega și nu va mai putea infecta acea celulă. Similar poate fi inhibată invazia parazitară și infecția.
Agoniștii neuroactivi și antagoniști Se consideră că moleculele efector din prezenta invenție vor agoniza (mima) sau antagoniza(inhiba) efectele hormonilor, neurotransmițătoarelor, analzeticilor, anestezicilor, antipsihicelor, antidepresantelor sau narcoticelor. Astfel de molecule efector pot fi utile în descoperirea reglatorilor de apetit, medicamentelor psihiatrice, modulatorilor atenției, precum și studiului și ajutorul memoriei. Prezenta invenție arată, de asemenea, o sursă de analogi pentru gust și aromă, ca de exemplu.îndulcitori “artificiali” și arome.
Bănci limitate.
Se consideră, în continuare, că o bancă limitată din prezenta invenție poate furniza o aromă complexă, ca de exemplu,ca un codiment, care are un cost scăzut și care nu prezintă efecte alergice ocazionale provocate de arome. In acest fel se pot înlocui aromele scumpe, ca de exemplu, șofran. Sub un alt aspect, se poate crea o nouă clasă de arome.
într-un alt caz, o bancă limitată poate furniza un suport cromatografie unic. Se consideră că o bancă de biooligomeri, de exemplu, peptide care prezintă proprietăți chimice generale, dar au o varietate de secvențe, poate fi un suport cromatografie mult mai util decât
RO 112336 Bl cele ce sunt disponibile în prezent. Un astfel de suport cromatografic poate fi mult mai selectiv decât un suport schimbător de ioni sau un suport cu fază inversă. Pe deasupra, o moleculă acceptor poate fi purificată printr-o eluare rapidă de pe suport în condiții mult mai ușoare decât sunt posibile, utilizând, de exemplu, un suport cu afinitate imunologică, scăzând astfel posibilitatea denaturării. Intr-un caz, un suport poate fi preparat pe baza compoziției sau structurii bio-oligomerilor care s-a descoperit, că au o afinitate intermediară, de exemplu, intensitate intermediară de marcare, sau legare doar la o concentrație ridicată a moleculei acceptor specifică. Mai mult decât atât, un suport cu selectivitate mare și cu rigurozitate scăzută poate fi identificat fără material purificat (așa cum s-a arătat mai sus, supra).
într-un alt caz, se pot selecționa probele cu afinitate de legare scăzută și se poate prepara o bancă limitată pe baza compoziției perlelor selectate. întrun alt caz, un suport martor, cu afinitate scăzută sau cu afinitate ridicată conținând, una sau câteva secvențe de biooligomeri identificate din milioanele de secvențe furnizate de prezenta invenție, poate fi folosit pentru cromatografie.
Se dau în continuare nouă exemple de realizare a invenției, în legătură și cu fig. 1 ... 8, care reprezintă:
-fig.1, schema sintezei peptidei random, utilizând metoda de sinteză prin scindare pentru o tripeptidă random cu un triptofan terminal adiționat: X-X-X-W (în care X= S,A sau V, sunt 33 sau 27 de posibilități;
-fig.2, reprezentarea schematică a peptidelor ciclice n = 0,1,2, 3 ... și m = 1,2, 3 ...; o și m pot fi echivalenți, dar pot fi, de asemenea, să nu fie echivalenți. Liniile groase indică legăturile peptidei; liniile punctate indică ramificațiile. Perechile de subunități ramificabile sunt indicate cu A și B. A se înlățuie doar cu A, B se înlănțuie doar cu B. (a) motiv în formă de “coș”; (b) motiv sub formă de “scară”; (c) motiv sub formă de “lasso”;
-fig.3, cromatograme (HPLC cu formă reversă C18 - Vyac) ale tripeptidelor random (X-X-X-W în care X = S, A sau V) sintetizate prin: (A) printr-o abordare nouă (vezi textul] și (B) sinteza standard în fază solidă a peptidelor. Cromatograma a fost obținută prin eluarea coloanei cu un gradient liniar de acetonitril. Solvent A : 0,1% acid trifluoroacetic și 5% acetonitril; solvent B: 0,1% acid trifluoracetic și 100% acetonitril;
-fig.4, fotografia peptidei long vmos/ perle marcate cu anticorpul anti-vmos și un anticorp secundar;
-foto. 5, fotografia unui amestec de perle “long v-mos” cu perle “short vmos” marcate cu anticorp anti-v-mos și anticorp secundar;
-foto. 6, fotografia unui amestec de perle “long v-mos cu perle “short-vmos” marcate cu anticorp anti-v-mos și anticorp secundar;
-fig. 7, fotomicrografia unui screening tipic de bancă de liganzi peptidici în care o perlă pozitivă (de culoare albastru închis) poate fi identificată pe fondul mai multor mii de perle negative (care sunt incolore);
-fig.8, fotomicrografia ce ilustrează efectul inhibitor dependent de concentrație al biotinei asupra eliberării perlelor mimotope de rășină - LHPQF cu streptavidin-fosfatază alcalină. A: 100 nM; B: 10 nM; C: 1 nM și D: 0,1 nM biotină. Perlele goale (rășină - acid β-Alaaminocaproic) au fost amestecate 1:1 cu rășină - LHPQF, înaintea incubării cu streptavidin-fosfatază alcalină pentru a servi drept control intern al negativului.
Exemplul 1. Sinteza unei bănci de tetrapeptide
Metoda din prezenta invenție a fost utilizată pentru a sintetiza o familie de tetrapeptide cu formula X-X-X-Trp în care X poate fi valină, serină sau alanină, iar primul amino acid este întotdeauna un triptofan. Triptofanul a fost încorporat în carboxilul terminal pentru a facilita monitorizarea spectrofotometrică la 0^280 ·
Rășina N“' Fmoc-triptofan-alcoxi
RO 112336 Bl metil polistirenică, care este cunoscută din domeniul de specialitate, a fost pusă într-un recipient standard pentru sinteza peptidelor în fază solidă. Amino acizii care au fost adiționați, au fost, de asemenea, amino acizii Fmoc modificați, care și aceștia sunt cunoscuți din domeniul de specialitate. Ceilalți reactivi folosiți sunt, în special, aceeași cu cei folosiți în mod obișnuit în sinteza peptidelor în fază solidă.
Pentru reacțiile de cuplare au fost folosite vasele de reacție cu capace de Teflon™; vasul de reacție standard pentru sinteza peptidei servește drept cameră de amestecare, în care părțile alicote au fost amestecate după reacția de cuplare.
Aproximativ 0,5 g. de rășină Fmoc - Trp-alcoxilmetil, au fost umflate cu 20 ml diclormetan (DCM). Rășina a fost apoi spălată de două ori cu DCM, o dată cu un amestec (1:) DCM și dimetilformamidă (DMF) și de trei ori cu DMF. în continuare, rășina a fost deprotejată cu soluție 20% (v/v) DMF piperidină. După spălarea perfectă a rășinii deprotejate cu DMF (de trei ori), DMC (de trei ori) și amestec 1:1 de DMC și DMF (de două ori), rășina a fost resuspendată în aproximativ 7,5 mol de DMF și divizată în trei alicote, separate, de aproximativ 2,5 ml fiecare și distribuite în trei tuburi de cuplare care sunt numerotate.
Cantitatea de amino acid protejat ce trebuie adiționată, se calculează pe baza numărului de moli de triptofan, deja atașat la rășină. Pentru fiecare amino acid ce trebuie adiționat s-a adăugat, în fiecare vas (vasul de reacție în care rășina spălată a fost deja împărțită în părți alicote) un exces molar de amino acid, de cinci ori mai mare. Deci, fiecare vas de reacție primește un exces de cinci ori mai mare de amino acid diferit. în continuare, fiecare vas de reacție a fost agitat timp de două minute după care sa adiționat un exces molar, de cinci ori mai mare, de diizopropilcarbodiimidă (DIC) în 3 ml de DCM, după care a urmat agitarea timp de o oră.
Pentru a verifica desăvârșirea cuplării, s-a testat câte o probă din fiecare tub, cu reactiv de ninhidrină care a fost inclus ca referință. Deci, în urma determinării, prin acest test, reacția de cuplare a fost incompletă, în continuare această reacție a fost forțată pentru a fi terminată, utilizând câteva metode care sunt familare specialiștilor în domeniu, incluzând: (a) o cuplare secundară folosind un exces de unul până la cinci ori mai mare de amino acid protejat; (b) o cuplare adițională utilizând solvenți diferiți sau suplimentar (de exemplu , trifluoretanol) sau (c) adiția de săruri cheaotropice, de exemplu.NaCI04 sau LiBr.
După cuplare, rășinile din cele trei tuburi de cuplare au fost transferate cu atenție și combinate într-o singură cameră de amestecare. Rășina a fost spălată de două ori cu DCM/DMF (1:1), de trei ori cu DCM, de trei ori cu DMF și deprotejată cu soluție 20% (v/v) de DMF în piperidină. După spălare perfectă cu DMF și DCM, după cum a fost descris mai sus, amestecul a fost divizat în trei părți alicote și distribuit în cele trei vase de reacție separate. S-a adiționat un set secund de amino acizi. După ce cuplarea a fost completă, rășina a fost mai întâi deprotejată cu 20% piperidină, după care a urmat spălarea perfectă cu DCM și DMF, conform descrierii de mai sus. Un al treilea set de amino acizi a fost adiționat, în același fel.
Pentru scindarea peptidelor de pe suporturile în fază solidă s-au adiționat la rășină 30 ml de soluție 50% (v/v) acid trifluoracetic (TFA), plus 5% (v/v) anisol și 0,9% (v/v) etanditiol în DMC. Amestecul a fost agitat timp de patru ore, iar supernatantul peptidic a fost apoi concentrat cu un evaporator rotativ, iar peptidele au fost precipitate în eter. După o spălare perfectă, precipitatul peptidic a fost uscat și gata pregătit pentru a fi folosit în analizele următoare. Peptidele liofilizate (sub formă de pulbere) au fost păstrate la congelator, până la utilizare.
Exemplul 2. Compararea metodei din prezenta invenție cu metoda convențională de sinteză a peptidelor
Materiale și metode. □ bancă de
RO 112336 Bl tripeptide random a fost obținută în concordanță cu cele arătate în cadrul exemplului 1 de mai sus. Suplimentar, o bancă de tetrapeptide a fost obținută utilizând sinteza standard a peptidei în fază solidă “SPPS”, conform celor arătate mai sus, supra. Rășina Na-Fmoc-triptofan-alcoximetil a fost utilizată drept combinație suport în fază solidă/amino acid. Cantitatea echimolară de exces de cinci ori mai mare de N-Fmoc-valină, NFmoc-serină (O-’Bu) și N - Fmoc-alanină au fost adiționate în vadul de reacție în timpul fiecărei etape de cuplare. După trei etape consecutive de cuplare, tetrapeptidele au fost scindate în 50% (v/v) TFA, 5% (v/v) anisol și 0,9% (v/v) etanditiol în DCM, așa cum s-a descris mai sus.
Rezultate. Ambele bănci peptidice au fost analizate pe o coloană cromatografică (Vydac) HPLC cu fază inversă ΟΙ 8, pentru a demonstra numărul speciilor de peptide din bancă (numărul picurilor), concentrația relativă a peptidelor (suprafața picurilor) și natura hidrofilă relativă a peptidelor (eluarea rapidă sau lentă pe coloană). Rezultatele sunt redate în fig.3. Cromatograma din punctul superior reflectă modelul obținut cu banca de peptide, preparate conform metodei din invenție, iar cromatograma din panoul inferior reflectă modelul obținut cu SPPS.
Ambele metode prezintă 21 picuri distincte, care indică prezența a cel puțin 21 de specii de peptide diferite, în fiecare bancă. Oricum, modelul SPPS prezintă picuri în mod semnificativ, mai mari la 1, 2, 3, 4, 5, 6 și 7 care indică faptul că banca SPPS a conținut o concentrație mai mare de peptide 1 ... 7, decât de peptide 8 .... 21. Numărul scăzut de peptide 1 ... 7 demonstrează că aceste peptide au fost preferențial sintetizate mai mult decât restul celor 21 de peptide. Suplimentar, aceste picuri proeminente au fost eluate rapid, ceea ce arată că aceste peptide prezintă un timp de retenție mai scurt pe coloană, care indică faptul că peptidele au o natură mai hidrofilă.
Acest rezultat nu este surprinzător cu sistemul SPPS. Este cunoscut în domeniu că valina este hidrofobă și voluminoasă și are o viteză de cuplare semnificativ mai scăzută (datorită probabil împiedicării sterice), decât cea găsită fie cu alanină, fie cu serină. Astfel, în timpul unei sinteze convenționale de peptidă random, precum cea condusă aici; în care valina în mod esențial 12 concură cu alanina și serina pentru situsurile (locurile) de cuplare, peptidele sintetizate au fost sărace în valină, și banca de peptide produse nu a prezentat o distribuție echimolară a peptidelor random.
Dimpotrivă, modelul de bancă de peptide random produse în conformitate cu metoda din prezenta invenție, a indicat o distribuție echimolară a peptidelor. Cu toate că picurile 3, 6, 12, 13 și 18 au avut aproximativ de două ori aria celor două picuri, care indică prezența a două peptide în acel punct, multe din cele 16 picuri rămase au, de asemenea, modele identice. în mod suplimentar, toate cele 21 de picuri măsoară valoarea tipului de retenție, care, de asemenea, indică o distribuție echimolară a peptidelor.
Succesiunea picurilor selectate au constituit o probă suplimentară în sprijinul celor arătate: Picurile mai mici 8,9 și 21 și picul larg 6, au fost secvențializate (cu un secvențiator de Proteina Biosistemelor aplicare 477 A).
#S = Val-Ala-Ser-Trp;
#9 = Val-Ser-Ala-Trp;
#21 = Val-Val-Val-Trp;
#6 = (Ser-Val)-(Ser-Ala)-(Ser-Ala)Trp.
Aceste secvențe care conțin valină confirmă că, metoda conform invenției, nu permite sinteza la întâmplare a peptidelor, chiar și atunci când sunt utilizați amino acizii cunoscuți decuplarelentă. Secvența pentru picul 6 nu au fost concludentă, aparent, datorită prezenței a mai multor peptide pentru același pic. Cel mai verosimil, două picuri principale sunt Ser-Ala-Ala-Trp și Val-Ser-Ser-Trp.
Concluzie. Rezultatele demonstrează că metoda de sinteză de peptidă
RO 112336 Bl random, conform invenției, permite sinteza unei bănci de peptide random, în cantități echimolare, în contrast cu tehnica standard SPPS, în care predomină un set de peptide care conțin amino acizi cu o viteză de cuplare mai rapidă.
Exemplul 3. Izolarea unei peptide ligand care se leagă la o moleculă receptoare.
Pentru a demonstra utilizarea metodei, conform prezentei invenții, se arată că pentru a izola o peptidă particulară, a fost sintetizată o peptidă cu 12 amino acizi cu secvențe prestabilite, de la produsul genei v-mos. V-mos este o oncogenă izolată de la un sarcom de șoarece și este înrudită cu virusul sarcomei murine Maloney. Produsul genei vmos este cunoscut că are activitate chinază serină/treonină.
Materiale și metode. Secvența Leu-Gly-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Val-Tyr-Lys-Ala a fost sintetizată pe poliacrilamidă sub formă de perlă (diametrul de circa 3OO pm], utilizând reactivi și tehnici chimice N -Fmoc și reactivi și tehnici standard pentru sinteza peptidei în fază solidă. Grupele care protejează capătul lanțului sunt îndepărtate cu TFA 50% și peptidă rămasă, legată covalent la rășina poliacrilamidică prin intermediul unui linker, acid aminocaproic-etilendiamină, pentru a da structura finală: Leu-Gly-Ser-Gly-GlyPhe-Ser-Val-Tyr-Lys-Ala - acid aminocaproic-etilendiamină-rășină (menționată în continuare “perlă de peptidă lungă vmos” (long v-mos bend”).
Această secvență de peptidă corespunde la resturile 100 până la 111 din produsul genei v-mos.
Utilizând aceeași metodă, a fost sintetizată o peptidă mai scurtă a restului 106-111 din produsul genei v-mos (Gly-Ser-Val-Tyr-Lys-Ala), pe poliacrilamidă sub formă de perle, prin intermediul aceluiași linker, menționată în continuare “perlă de peptidă scurtă”. Această peptidă a servit drept control negativ.
O linie celulară hibridom care produce anticorp monoclonal de șoarece, specific împotriva peptidei v-mos lungă, cunoscut ca anti-v-mos (este cunoscută din literatura de specialitate) a fost și comercial pentru specialiștii în domeniu. In testul ELISA, acest anticorp detectează secvențe omoloage a produșilor genelor v-mos, MOS, neu/HER-1, HER2. Acest anticorp este cunoscut a avea o afinitate neglijabilă față de peptidă scurtă v-mos.
Un anticorp IgG secundar de capră anti-șoarece (lanț specific greu și ușor), marcat cu fosfatază alcalină a fost obținut în mod cunoscut, celor care lucrează în domeniu.
Utilizând tehnici convenționale pentru producerea anticorpului monoclonal, precum s-a arătat mai înainte, anticorpii monoclonali sunt produși în formă de ascite și ulterior purificați pe o coloană de Proteină G, obținută în mod cunoscut.
Rezultate. Perlele de peptidă lungă v-mos au fost amestecate cu un exces de 1000 de ori din perlele de peptidă v-mos scurtă.
ml de anticorp monoclonal antiv-mos purificat (1 pg/ml) în PBS cu 0,1% Tween 20 au fost adăugați la amestecul de peptidă v-mos lungă și scurtă și incubată la temperatura camerei timp de o oră, cu amestecare blândă. Perlele au fost apoi spălate pe o coloană mică, disponibilă, din polipropilenă unde perlele au fost reținute prin frită. Perlele au fost amestecate cu 2 ml dintr-un anticorp secundar, la diluție de 1:2000, timp de o oră. După spălare, perlele au fost turnate într-o cutie Petri din polistiren și au fost lăsate în repaus. S-a îndepărtat supernatantul, după care s-a adăugat, încet o soluție de 5-brom-4-clor-3-indol fosfat și albastru de nitro-tetrazolin, ca un substrat. După incubare, la temperatura camerei, timp de 15 min., perlele de peptidă v-mos scurtă rămân incolore.
Aceasta a făcut posibilă să se detecteze imediat o singură perlă închisă la culoare, pe un câmp de mii de perle incolore.
Distincția dintre perle este ilustrată în fig. 4 la 6, care sunt fotografii
RO 112336 Bl mărite de 40 ori de perlelor care sunt în cutiile Petri. Fig. 4 arată un câmp de perle de peptidă v-mos lungă marcate cu anticorp monoclonal. Fig. 5 arată un amestec de perle de peptidă v-mos lungă și scurăt, marcate cu anticorp monoclonal anti-v-mos, iar fig. 6 arată o detectare a unei singure perle albastre într-un câmp de perle incolore. In consecință, perlele care au conținut secvențe de peptidă care interesa, au fost ușor distruse și izolate de alte perle din banca de peptide. După izolare, s-a utilizat un aparat de secvențare de proteină, pentru a determina secvențele de amino acid N-terminal a unei singure perle rășină v-mos lungă.
Concluzie. Acest exemplu demonstrează capacitatea prezentei invenții de a selecta o perlă care conține un ligand bio-oligomer, în acest caz o peptidă de interes, dintr-un exces de 1000 ori de perle nelegate, nerelevante. In plus, acest exemplu demonstrează că o perlă reactivă poate fi izolată și secvența de peptidă poate fi determinată.
Exemplul 4. Izolarea unui ligand peptidic mai scurt care leagă o moleculă receptoare.
Pentru a demonstra în plus utilizarea metodei din prezenta invenție, izolarea unei peptide particulare, o hexapeptidă cu secvența prestabilită Gly-PheGly-Ser-Val-Tyr care a fost sintetizată pe rășină standard. 100 um PAM utilizând reactivi chimici Na-Fmoc și alți reactivi din sinteza standard a peptidei în fază solidă.
Materiale și metode. Reacțiile de cuplare au fost realizate precum este descris în literatura de specialitate, așa cum s-a arătat mai sus. Grupările de blocare α-amino au fost îndepărtate cu piperidina 20%, grupările de protecție a capătului de lanț au fost îndepărtate cu TFA 50% și peptidă rămasă s-a legat covalent la rășina polistirenică prin intermediul linkerului amino acid, acid aminocaproic-Ș-alanină, pentru a da structura finală: Gly-Phe-Gly-Ser-Val-Tyr-acid aminocaproic-|3-Ala-rășină. Această secvență de peptidă corespunde resturilor 104 și
109 al produsului genei v-mos descris în exemplul 3,
Ca și în exemplul 3, anticorpii antiv-mos au fost colectați dintr-o linie celulară hibridon, care produce anticorp monoclonal de șoarece, specific împotriva acestei peptide v-mos.
Anticorpul secundar marcat de capră, anti-șoarece IgG-fosfatază alcalină a fost obținut în mod cunoscut.
Rezultate. Aproximativ 0,1 mg peptidă v-mos/rășină PAM descrisă mai sus au fost amestecate cu un exces de 100 ori de perle de Np-Fmoc-alaninărășină PAM (obținută în mod cunoscut] în 2 ml de anticorp monoclonal purificat (1 pg/ml] în PBS și 0,1% Tween 20 au fost adăugați la amestecul suport/ peptidă și incubați la temperatura camerei, timp de 45 min., cu amestecare blândă.
Perlele au fost spălate pe o coloană mică de polipropilenă care conține perlele pe o frită. Perlele au fost apoi amestecate cu 2 ml anticorp secundar amestecat cu fosfatază alcalină (la diluție de 1:100] timp de o oră. După spălare, perlele au fost răspândite pe un filtru de sticlă și umectate cu 2,2'-azinobis (3etilbenztiazolin acid sulfonic] notat ca ABTS ca substrat și cu apă oxigenată. După incubare, la temperatura camerei, timp de 15 min., perlele de peptidă vmos/rășină PAM trec în culoare verde închis. Un mic halou de culoare verde mai deschis s-a format în jurul filtrului de sticlă. Majoritatea suporturilor fazei solide care au lipsă peptidă v-mos nu au reacționat cu anticorpul monoclonal și de aceea nu a arătat nici o schimbare a culorii. Perlele v-mos au fost ușor distruse.
Concluzie. Acest exemplu demonstrează că o moleculă acceptoare de interes nu va reacționa nespecific cu un suport în fază solidă, dar mai curând este specific pentru o combinație peptidă/suport în fază solidă.
Așa cum este dat în exemplul 3 de mai sus, o perlă care reacționează pozitiv poate fi izolată și atașată la peptida secvențată.
RO 112336 Bl
Exemplul 5. Determinarea liganziior pentru STREPTAVIDIN și anti-βendorfin MAB.
Acest exemplu ilustrează în plus, posibilități diferite pentru identificarea ligandului peptidic, conform cu prezenta invenție.
In scopul producerii de schimbări într-un sistem biologic (de exemplu fuziunea de fag filamentos), pentru a genera o bancă random (la întâmplare), metodele prezente folosesc sinteza chimică efectivă de bănci de peptide enorme, fiecare cu o peptidă diferită într-o perlă individuală. Perlele individuale de peptidă care leagă specific, sunt apoi izolate fizic în perlă și a fost determinată secvența de peptidă atașată.
Calea aleasă depinde de abilitatea pentru sintetizarea chimică a băncii de peptidă random-enormă și de abilitatea de a cupla la un sistem adecvat de detecție, izolare și determinare a structurii.
Calea eliminării acestei probleme, prevăzută de prezenta invenție, este de a separa perlele de rășină într-o serie de părți alicote egale și individuale, în timpul fiecărui ciclu de cuplare și de a permite fiecărei părți alicote de rășină să reacționeze complet cu un amino acid activat individual.
După cuplare completă, diferite părți alicote de rășină sunt amestecate complet, spălate, deprotejate și din nou separate în părți alicote, pentru un nou ciclu de cuplare.
Conform cu acestea, nici o perlă de rășină nu este expusă la mai multe de un amino acid în oricare ciclu de cuplare și la sfârșitul acestor etape, fiecare perlă va conține o singură secvență de peptidă unică. Banca de peptide generată prin această metodă va fi, teoretic, întradevăr la întâmplare (random). In mod suplimentar, vor fi obținute rapoarte echimolare din fiecare specie de peptide.
Numărul total de permutări și, deci, numărul de peptide va depinde de :numărul părților alicote și de amino acizii găsiți în fiecare etapă de cuplare și de numărul total de trepte de cuplare în sinteză (lungimea peptidei).
Noua cale pentru sintetizarea simultană a unei mulțimi vaste de peptide, nu prevede numai o bancă într-adevăr randomizată și echimolară, dar mai important, este faptul că rezultă o bancă de perle de rășină a peptidei în fază solidă, în care fiecare perlă conține doar o secvență de peptidă unică.
Această ultimă proprietate este certă, deoarece în timpul fiecărui ciclu al sintezei peptidei, fiecare perlă este în contact numai cu un amino acid individual, într-un anumit moment, și fiecare reacție de cuplare este condusă până la perfectare. Conceptul de peptidă-perlă, este de fapt de o importanță primară pentru succesul metodei dezvăluite în prezenta invenție.
Cu această metodă, din punct de vedere sintetic, în mod virtual, orice bancă de peptidă poate fi sintetizată cu o compoziție bine definită.
De exemplu, amino acizii naturali de la 20 în sus, în părți alicote, pot fi utilizați în fiecare treaptă de cuplare, sau poate fi utilizat numai un amino acid singur (deci, pot fi utilizați și mai mulți amino acizi).
Materiale și metode
Sinteza unei bănci de peptide. A fost sintetizată o bancă largă de peptide cu structură Χ-Χ-Χ-Χ-Χ-β-Ala-acid aminocaproic-etilendiamină-rășină (X = 19 din cei 20 de amino acizi comuni, dar și cisteina în fiecare treaptă de cuplare. Perlele de rășină în faza solidă alese pentru sinteza peptidei au fost polidimetilacrilamida (PDA). Metoda de sinteză, din punct de vedere chimic, a acestei peptide s-a efectuat în conformitate cu cele cunoscute din literatura de specialitate, în ceea ce privește sinteza peptidei în fază solidă.
g de rășină (aproximativ 3 milioane de perle) sunt agitate ușor cu etilendiamină, pe o perioară de 24h. După o spălare perfectă acidul aminocaproic, urmat de β-alanină, sunt cuplate cu rășina, folosind calea chimică Fmoc, dar fără un linker scindabil. Randomizarea a fost realizată în următoarele cinci etape de cuplare, și toți cei 19 amino acizi
RO 112336 Bl
Fmoc-OPfp, cu excepția cisteinei, sunt utilizați separat, în timpul fiecărei etape de cuplare. După cinci etape de cuplare complete, gruparea Fmoc a fost îndepărtată cu ajutorul piperidinei 20% (v/v) în DMF. Grupările care protejează capătul lanțului au fost îndepărtate cu un amestec de 90% TFA (v/v), 1% anisol (v/v) și 0,9 etanditiol (v/v). Rășina a fost neutralizată cu 10% cu diizopropiletilamidă (în DMF) și apoi păstrată în DMF, la temperatura de 4°C.
Linkerul β-alanină-acid aminocaproic-etilendiamină, constă dintr-un total de 11 atomi de carbon și 4 atomi de N, cu o lungime maximă a lanțului de 17,6 A. Când au fost utilizați 19 amino acizi diferiți la fiecare cele cinci etape de cuplare random (la întâmplare), numărul teoretic al peptidelor a fost de 195 sau 2476099 pentapeptide individuale în această bancă.
Așa cum s-a menținat mai înainte, schema generală a metodologiei, este de a sintetiza o bancă enormă de peptide random pe perle individuale de rășină în fază solidă, astfel că fiecare perlă de rășină să conțină o singură specie de peptidă. O perlă de rășină individuală ce reacționează cu o moleculă acceptoare poate apoi să fie identificată și izolată fizic și secvența de amino acid a linkerului peptidic va fi determinată prin degradare Edman. Succesul acestuia, din punct de vedere metodologic, este identificarea precisă a unei singure secvențe de peptidă pe o singură perlă. Se utilizează un secvențiator de proteină automat (Model 477A-01), și au fost recuperați 50 ... 500 pmoli de peptide, din fiecare perlă. Suplimentar, analiza prealabilă a datelor de secvențare, a arătat că cuplarea eficientă în sinteza peptidei în fază solidă a fost la un exces de 98%.
Identificarea și selectarea specifică, a liganzilor peptidici din bancă Identificarea și selectarea liganzilor specifici peptidici, din banca random, pot fi ușor identificate și efectuate prin tehnicile imunologice (metoda ELISA), testul imunoabsorbant al enzimei legate, imunofluorescența sau cu pele imunoma gnetice. Pentru experimentele descrise aici, tehnicile imunochimice au fost utilizate în sistemul de detectare. Moleculele acceptoare de legare, utilizate în acest studiu au fost: (i) Streptavidin - proteina care leagă biotina și (ii) un anticorp monoclonal de anti-[3-endorfin (Mab). Utilizând fuziunea epitopului filamentos, în sistem de bancă, liganzii peptidici au fost identificați cu succes cu ambele molecule aceptoare care au fost menționate mai înainte.
Tehnicile imunochimice au fost utilizate pentru detectarea perlelor care leagă streptavidinul. Banca random de perle de peptidă omogenizată blând cu o creștere suplimentară, dublă, de apă distilată a fost diluată cu DMF.
în continuare, perlele au fost spălate perfect (total) cu PBS și s-a utilizat gelatină 0,1% (v/v) pentru a bloca orice legătură nespecifică. O soluție diluată 1:20000 de streptavidin-fosfatază alcalină a fost adăugată la perle, însoțită de o amestecare blândă, timp de o oră. Perlele au fost apoi spălate perfect, după care s-a adăugat substrat standard albastru de nitro-tetrazolin/5brom-4-clor-3-indolil-fosfat. Perlele, împreună cu soluția substrat, au fost transferate în 15 capsule Petri din polistiren (100 x 20 mm), și reacția a fost condusă timp de până la două ore. Perlele cu legătură streptavidin-fosfatază alcalină trec în albastru închis, în timp ce majoritatea perlelor din bancă rămân incolore.
Determinarea afinităților ligandului peptidic. Afinitățile care leagă ligandul peptidic, pentru anticorpul monoclonal de anti-p-endorfina au fost determinate în fază de soluție. Testul de legarea anti-βendorfinei, a măsurat inhibarea ligandului peptidic, 5,0 nM (3H] [Leu) encefalină (activitate specifică de 39,0 Ci/mmoli), care se leagă la 125 ... 200 ng/ml antiβ-endorfină Mab în 1,0 ml de 40 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, soluție tampon cu pH=7,4 care ocnține 1,0 mg/ml albumină de ser de bovină, 0,1% (v/v) Tween 20 și 0,05% (v/v) azidă de sodiu. Legarea specifică a fost definită ca dife
RO 112336 Bl rența dintre legarea măsurată în prezența sau în absența (Leu) encefalinei 1,0 pM nemarcate. Radioligandul de legătură a fost precipitat prin adăugarea unui exces de 10 ori de Proteină-G Se- 5 faroză, urmată de incubarea peste noapte la temperatura de 23 ... 24°C. Proteina-G Sefaroza a fost colectată prin centrifugare (13000 x g), timp de 5 min., după care paletele suspendate în 10 25 pl acid acetic 5% (v/v) înainte de trasferulîn fiolă, pentru măsurarea scintilării în fază lichidă. Valoarea Kd (n=3) a fost determinată prin analiza de saturare, care utilizează cinci concentrații de 15 radioligand (1,87 - 30 nM) pentru [3H] [Leu] encefalină, cu dubluri pentru fiecare mostră care leagă total sau nespecific. Valoarea medie a lui Kd măsurată a fost de 9,97 + 4,63 nM. Curbele de 20 inhibare de ligand peptidic au fost trasate pentru opt concentrații de peptidă într-un interval mărit de 400 ori. Datele referitoare la legătură, obținute prin studiile de saturare sau inhibare au fost 25 analizate prin metode de evaluare, de regresie nelineară care utilizează una din metodele cunoscute din domeniu.
De asemenea, valoarea Ki, pentru constantele legăturii de inhibare au fost 30 calculate utilizând metoda care este cunoscută din domeniu. Fiecare valoare Ki a fost calculată din trei sau patru deter minări independente.
Rezultate. O bancă de peptide random întinsă, sintetică (X-X-X-X-X-rășină), unde X = 19 amino acizi comuni (cisteina nu a fost utilizată pentru un număr total de permutări 195 = 2476099) a fost examinată. Aproximativ două milioane de perle au fost prezente în porțiunea de bandă examinată. Intr-o primă etapă de examinare numai cu streptavidin-fosfatază alcalină 6, așa cum s-a arătat mai sus, aproximativ 75 perle au fost colorate cu diferite intensități de culoare și au fost selectate fizic și apoi îndepărtate cu un microscop de disecare cu ajutorul unui micromanipulator. Fiecare perlă a fost apoi spălată în clorhidratde guanidină de concentrație 8 M, pentru a îndepărta legătura conjugată de streptavidin-fosfatază alcalină. în continuare, fiecare perlă a fost, individual, încărcată într-un filtru de sticlă, pe un cartuș pentru secvențare de proteină (ABI). Secvențele de 28 din 75 de perle sunt indicate în tabelul 1.
Toate aceste perle au secvențe conform cu HPQ sau cu MPM. Fotomicrograful din fig. 7, ilustrează cum o perlă pozitivă (de culoare albastru intens) poate fi ușor identificată pe fundalul a mai multor mii de perle negative (incolore) în timpul examinării băncii de ligand peptidic.
Tabelul 1
Secvențe de peptide a perlelor individuale ce reacționează la Streptavidirf1
HPQFV (0,8b, 1120c) GHPQG (,044, 250] PLHPQ (2,5, 48]
HPQGP (0,35, 60) MYHPQ AIHPQ
HPQAG (1,5, 53) REHPQ (0,56, 112] AAHPQ (0,9, 476)
LHPQF (0,47, 286) IQHPQ (1,8, 192) dTPHPQ (0, 158)
FHPQG (0,23, 72 GNHPQ (0, 222) WNHPM (2,5, 59]
GHPQN (0,5, 44) TVHPQ (0,96) WTHPM (1,4, 202)
THPQN (0,5, 44) IGHPQ VHPMA (0,6, 21]
QHPOG (2,3, 60) WMHPQ (2,7, 257) dMHPMA (0,31, 140)
IHPQG (2,1, 57] GAHPQ
RO 112336 Bl
a) Acești liganzi sunt identificați prin examinarea băncii de 2476099 (195] peptidă.
b) Primul număr, în paranteză, indică procentajul prevăzut pentru cinci 5 cicluri de degradare Edman (cantitatea de reziduu a ciclului 4/ cantitatea de reziduu a ciclului 5).
c] Al doilea număr, în paranteză, indică cantitatea de peptidă (pmol] recu- 10 perată în timpul secvențării.
d] Au fost identificate două secvențe TPHPQ și două secvențe MHPMA; nu au fost detectate alte repetări.
Pentru a proba că secvențele 15 conform cu HPQ, actual, se leagă la biotină- la situsul de legare, la molecula de streptavidin, a fost sintetizată LHPQFβ-Ala acid aminocaproic-rășină etilendiamină (LHPQF-rășină).LHPQF-rășină a 20 fost apoi amestecată cu streptavidin-fosfatază alcalină, în prezența diferitelor concentrații de biotină. Rezultatele sunt indicate în fig. 8. Biotină, la concentrația de 100 nM a blocat complet colorarea 25 LHPQF-rășină. La concentrația 10 și 1,0 nM, biotină a inhibat parțial, și la concentrația de 0,1 nM nu a avut efect asupra colorării rășinei-LHPQF prin intermediul streptavidin-fosfatază alcalină. 30 Studiul inhibării stabilește că secvența conformă cu HPQ leagă, la biotină, locul de legătură al streptavidinei.
înainte de utilizarea aceleiași bănci de peptide random, pentru a analiza antiβ-endorină Mab, toate perlele albastre ce s-au colorat numai cu streptavidinfosfatază alcalină, au fost îndepărtate. Perlele rămase, sunt apoi tratate cu clorhidrat de guanidină de concentrație 8M pentru îndepărtarea oricărei proteine de legătură. Această bancă reciclată a fost apoi amestecată cu anti-βendorfină Mab biotinilată (anti-p-endorfină, clonă 3-E7 a fost obținută comercial, așa cum se cunoaște în domeniu), pentru 16 h. După spălare perfectă, este utilizată o etapă secundară cu streptavidin-fosfatază alcalină, pentru a declanșa reacția de culoare pentru testul ELISA. Șase petide cu secvența în același sens, ce au o asemănare limitată cu ligandul nativ, Leu-encefalină (YGGFL), sunt identificate în aceste determinări: YGGMV, IGALQ, YGGLS, YGGFA, YFGGFT și YGGFQ. Peptidele analoage cu diferite grupări carboxil terminale a acestor orientatori de ligand, sunt sintetizate, și afinitatea lor (Ki) a fost determinată utilizând [3H] [Leu]-encefalină, ca ligand marcat și peptide nemarcate, ca ligand care concură (testul anti-P-endorfină), așa cum s-a arătat mai sus.
Rezultatele acestor studii sunt arătate în tabelul 2.
Tabelul 2
Afinitatea liganzilor peptidici la anticorpul monoclonal anti-fi-endorfină
Ki nM
Carboxil terminal
Peptide -OH -nh2 -ΒΑ-ΟΗ -ba-nh2
aYGGFL 17,5 ± 3,2 27,9 ± 2,3 17,1 ± 1,8 13,7 ± 1,7
YGGFA 32,9 ± 2,0 72,0 ± 16,4 82,3 ± 8,8 93,6 ±34,7
YGGFT 36,9 ± 7,7 65,2 ± 16,8 50,6 ± 8,9 43,3 ± 2,3
YGGFQ 15,0 ± 1,7 40,1 ± 6,0 39,4 ± 2,3 45,4 ±11,6
YGGLS 726 ±134 991 ± 52 916 ± 182 1150±247
YGCLQ 1980 ± 303 2910 ± 695 1470±120 1910±504
YGGMV 8780 ± 1500 14000±1110 5140±885 7160±1010
RO 112336 Bl
a) YGGL este [Leu5] encefalină, ligand nativ pentru anti-P-endorfină Mab.
Discuții. Abilitatea de a sintetiza peptide individuale pe fiecare perlă, combinată cu o detectare sensibilă și specifică și un sistem de selecție este cheia succesului în metodologia prezentei invenții. Această nouă metodologie este denumită “proces de selecție”. O perlă de peptidă individuală selectată din bancă și tratată cu clorhidrat de guanidină 8M (pentru a îndepărta legătura proteinei) a fost purificată efectiv, cu restul peptidic legat covalent la rășină și pregătit pentru secvențare. Statutul secvențiatorilor peptidici automatici, din domeniu, permit secvențarea unei peptide la concentrații scăzute, de 5 ... 10 pmoli. Suplimentar, culoarea albastru ce se leagă ireversibil la perlă nu interferă cu secvențarea. In cursul fiecărui ciclu de cuplare a randomizării, fiecare efort a fost făcut pentru a optimiza metodologia sintetică, care include utilizarea unui mare exces de amino acizi N-Fmoc. Analiza prevăzută a datelor brute de secvențare a demonstrat că eficiența cuplării a fracțiilor sintetice, a depășit 98%.
Deoarece perlele rămân în mod vădit pe un fundal de perle colorate(de exemplu,fig. 7) este ușor de vizualizat, pe două milioane perle, sub un microscop de disecare, într-o serie de 10 ... 15 capsule Petri și apoi selectate perlele reactive pentru secvențare.
în mod suplimentar, se poate estima afinitatea relativă a diferiților liganzi, prin exmainarea intensității colorării relative, pentru fiecare perlă pozitivă. Această proprietate nu permite alegerea perlelor de intensitate a culorii, specifică, pentru secvențare.
în datele din literatura de specialitate (așa cum s-a arătat mai sus) se raportează importanța secvențelor de HPQ, HPM și HPN în cei 20 de liganzi care leagă streptavidin, izolați prin tehnica fuziunii fagului filamentos. In mod interesant, banca de peptide a dat 28 peptide diferite, din care 23 au o secvență în consens cu HPQ și din care 5 au o secvență în consens cu HPM (tabelul 1). Se pare că poziția secvenței HPQ/HPM în pentapeptidă nu a fost importantă pentru legarea streptavidin. Din toate secvențele de heptapeptidă HPQ sau HPM, numai două s-au repetat (TPHPQ și MHPMA). Aceasta este în contrast clar cu datele raportate, în conformitate cu cele arătate mai sus, unde au existat multiple repetări printre cei 20 izolați, care sugerează că selecția a avut loc preferențial. In sistemul anti-βenndorfină, au fost identificate șase peptide cu secvențe similare cu cea a ligandului nativ YGGfd. Aceste rezultate sunt similare cu cele obținute prin tehnica fuziunii fagului filamentos, care utilizează același anticorp monoclonal (clonă 3-E7), așa cum s-a arătat mai sus. Deși banca de peptidă a dat mai puține secvențe de ligand decât au fost obținute prin tehnicile cunoscute în domeniu, 50% din liganzii obținuți au avut o afinitate mult mai mare pentru anticorp decât oricare din acelea selectate prin tehnica fagului.
Exemplul 6. O bancă peptidică limitată
In alt mod de exprimare, prezenta invenție a fost testată cu alt sistem de anticorp, în care epitopul a fost localizat în mijlocul lanțului peptidic mai degrabă decât la N-terminal (așa cum s-a arătat mai jos, infra). Acest anticorp a fost prevăzut, prin imunizarea șoarecilor, cu o peptidă cu 12 amino acizi (LGSGGF GSVYKA) care corespund la resturile 100 și 111 a produsului oncogenic vmos. Peptidă a fost conjugată la o proteină purtătoare, înainte de imunizare. In testul ELISA, acest anti-v-mos Mab detectează secvențe omoloage ale produșilor genelor v-mos., MOS, neu/HER-1 și HER-2.
Materiale și metode. Utilizând un sistem mult-ac convenabil comercial, trusă de marcare a epitopului, pentru a sintetiza peptide parțial suprapuse (seturi de tetrapeptide, pentepeptide și hexapeptide), epitopul cu peptidă v-mos de 12 amino acizi, recunoscut de către anti-v-mos Mab a fost marcat la secvența de peptapeptidă (FGSVY), de
RO 112336 Bl exemplu restul 6 ... 10a dodecapeptidei v-mos.
în prezentul experiment a fost utilizată o bancă random restrânsă, în care amino acizii valină și serină, ce sunt prezenți în epitopul v-mos, au fost omiși în acest scop. Banca random restrânsă are următoarea compoziție: G-X-X-X-X-Xβ-Ala-acid aminocaproicetilendiamină. rășină, în care X = Glu, Pro, Asn, Phe, His, Thr, Lys, Leu, Gly, Tyr, Ala, Arg, Trp. Acești 14 amino acizi au fost astfel aleși, ca atât valina și serina să fie omise, și cu toate acestea grupările funcționale de la capătul lanțului au fost totuși incluse, adică: (i) Asn a fost selectată, dar Gin nu a fost selectată; (ii) Glu a fost selectată, dar Asp nu a fost selectată; (iii) Thr a fost selectată, dar Ser nu a fost selectată; (iv) Leu a fost selectată, dar lle sau Val nu au fost selectate și (v) Met a fost selectată, dar Cys nu a fost selectată. Deoarece au fost aleși 14 amino acizi la fiecare din cele cinci etape de cuplare random, numărul teoretic de peptide a fost 145 sau 537824 de peptide individuale.
O linie celulară hibridoma ce produce anticorpi monoclonali anti-vmos, a fost furnizată comercial.
Afinitatea ligandului peptidic pentru anti-v-mos Mab a fost măsurată prin studii de legătură în fază de soluție, utilizând [3H]-acetil v-mos-peptidă (adică (3H]-Ac-v-mos) ca radioligand. Radioligandul a fost preparat prin acetilarea Nterminal al peptidei v-mos, înainte de deprotejarea catenelor laterale, cu cantități echimolare de [3H] acetat de sodiu (activitate specifică = 2,52 Ci/mmol). Produsul [3H]-Ac-v-mos, care a fost separat din peptidă v-mos, nereacționată prin HPLCîn fază reversă, a avut o activitate specifică de 2,50 Ci/mmol. Activitatea de legare a [3H)-Ac-v-mos pentru anti-vmos Mab (=10 pg/ml) a fost măsurată în 1,0 ml soluție tampon PBS-gelatină (0,05%în PBS la 23 ... 24°C, după trei ore de incubare. Legarea specifică a fost definită cu diferența dintre legarea [3HJAc-v-mos în prezența (nespecifică) sau absența (totală) a 100 pM peptidă vmos-nemarcată, pentru fiecare concentrație de [3H]-Ac-v-mos. Radioligandul legat a fost separat prin centrifugare, utilizând un exces de 10 ori (capacitatea de legare relativă la imunoglobulina utilizată) de Proteină-G Sefaroză, pentru a precipita anticorpul. Analiza legării de saturație, de la cinci determinări, la o concentrație în domeniul 125...5000 nM a arătat că [3H]-Ac-v-mos a fost legat de anti-v-mos Mab, cu o valoare Kd de 85O±16O nM. Afinitățile de legare a liganzilor au fost determinate prin studii de inhibare alegăturii, care utilizează 7 concentrații de ligand peptidic la concurență pentru 10 pg/ml anti-v-mos Mab, cu 20 nM [3H)-Ac-v-mos, cu respectarea condițiilor de mai sus. Peste 50% din legarea totală a fost specifică în studiile de inhibare. Constantele legăturii de saturație și de inhibare au fost determinate pentru un singur situs (100) de legare, prin analiza regeresiei neliniare, așa cum s-a descris mai sus.
Rezultate. Aproximativ 230000 de perle au fost puse în evidență cu o cantitate de anti-v-mos-fosfatază alcalină conjugată. Până atunci, mai puțin de 43 procente de permutări au fost examinate. După incubare cu substratul, în jur de 50 de perle, s-au colorant intens în albastru și 24 din aceste perle au fost selectate fizic și au fost determinate secvențele de amino acizi din 11 perle. Suplimentar, 17 perle incolore au fost selectate la întâmplare pentru secvențare.
Rezultatele secvențării ligandului anti-v-mos sunt prezentate în tabelul 3.
RO 112336 Bl
Tabelul 3
Secvență peptidică a perlelor individuale ce reacționează cu anticorpul monoclonal anti-v-mos
A. Perle interactive GRRGME GRRPYG GRRAYE GRREGP GRYAKH GRKTYY GRYMPK GFRHMA GERYHN GHRYFH GWEEKE
B. Perle neinteractive
GKELAG GFEKHP
GPYLMW GWGAYP
GTKMNF GAARPP
GEKMEF GLFGME
GYEEPK GRLNTL
GKKPNP GMTHAY
GEYAPP GPYGMA
GGFMEF GHYNNL
GPKFMA
întrucât atât valina cât și serina 35 nu au fost incluse intenționat în banca peptidică, nu este surprinzător că nici una din cele 11 secvențe a ligandului peptidic nu se aseamănă cu epitopul nativ (FGSVI). Deși nu au existat repetări 40 în 11 liganzi peptidici, secvențele lor nu au fost la întâmplare (random). Atât arginina cât și tirozina au apărut frecvent în aceste secvențe. In plus, cel puțin una, și uneori și două, arginine sunt pre- 45 zente în poziția a doua și/sau a treia a fiecăruia din acești liganzi peptidici. Pe de altă parte, perlele negative selectate la întâmplare (randomizate) nu au prezentat nici un model comun de secvență 50 de amino acid.
Deși dimensiunea mostrelor este limitată, valoarea arătată de statisticile adecvate pentru secvențele de la perlele negative nu a fost semnificativă (X2 = 18,27, df = 13, P = 0,15), indicând că nu este o evidență pentru o distribuție neuniformă a amino acizilor pentru perlele de peptidă random necolorată.
Câțiva liganzi pozitivi au fost sintetizați și a fost determinată afinitatea lor pentru anti-v-mos MAb, prin studii de legare în formă de soluție (așa cum s-a arătat mai sus). Rezultatul acestor studii sunt arătate în tabelul 4.
RO 112336 Bl
Tabelul 4
Afinitatea legăturii ligandului de peptidă pentru anti-v-mos MAb
Peptidă Ki, pM
(1) (2)
A. LGSCGFGSVYKA (v-mos-peptidă) 3,2
GFGSVY-NH 2( v-mos-e p itop) 246 - 337
GFGSVY-OH 1OOO
GFGSVY^A-NH2 409-442
GFGSVY-pa-OH 529-770
B. GRRAYE-OH 6,78 ± 2,31
grraye-nh2 24,70 ± 7,00
GRRAYE-βΑ-ΟΗ 15,10 ± 0,50
GRRAYE^A-NH2 9,02 - 20,40
GRRGME-OH 100
GRRGME^A-NH2 24,00 ± 8,40
GRREGPH3A-NH2 26,90 ± 6,20
GRRPYG-OH 1000
GRRPYG^A-NH2 20,50 ± 4,50
Tabelul 4A, mai sus prezentat, 25 arată afinitățile de legare a epitopului vmos pentru anticorpul monoclonal anti-vmos. Efectul modificării grupării terminale carboxil, este de asemenea prezentat. 30
Tabelul 4B, expune afinitățile de legare a mitotopilor identificați din banca de peptidă, care nu are diferiți amino acizi în epitopul v-mos. β-alanin amidă a fost inclusă în unii liganzi testați pentru a 35 stimula structura ligandului identificat, la care anticorpul se leagă de perlă.
Afinitatea celui mai bun mimotop anti-v-mos, cum este prezentat în tabelul 4, este de aproximativ de 2,5 ori mai 40 mică decât cea a peptidei native. Deși, nici unul din liganzii testați nu a avut o valoare Ki tot atât de mică ca a ligandului v-mos nativ, rezultatele demonstrează cu claritate că, prin utilizarea 45 unei bănci random care este lipsită de anumiți amino acizi prezenți în epitopul nativ, pot fi identificați o serie de mimotopi diferiți din punct de vedere structural, cu afinitate pentru molecule accep- 50 toare.
Discuții. Anti-v-mos MAb utilizat în acest studiu a avut afinitate relativ scăzută față de peptidă v-mos (imunogenă). Serina și valina sunt prezente în epitopul linear v-mos (FGSVY), dar sunt intenționat omise de la examinarea băncii utilizate; cu toate acestea, metoda permite definirea unui mimotop linear cu o secvență și compoziție de amino acid diferită, dar cu afinitate comparabilă pentru anticorp. Aceasta ilustrează complexitatea și, la fel de bine, capacitatea multiplă de interacțiune a peptidei macromoleculare.
Exemplul 7. Un linker scindabil selectiv. ONb
Un set de patru peptide care incorporează un linker ONb scindabil - UV (vezi cele arătate mai sus) a fost preparat și apoi testat.
Materiale și metode. Următoarele patru peptide au fost preparate pe două rășini, utilizând tehnicile sintezei în fază solidă (așa cum s-a arătat mai sus).
I) Fmoc-Trp-Tyr(OBu’)-Phe-ONb-0Ala-ACA-EDA-PepSyn K ii) TRP-Tyr-Phe-ONb-(3-Ala-ACAEDA-PepSyn K
RO 112336 Bl iii] Fmoc-Typ-Tyr-(OBu’]-Phe-ONb-pAla-ACA-4-MBHA iv] Trp-Tyr-Phe-0Nb-p-Ala-ACA-4MBHA
Fiecare peptidă a fost iradiată de la 1 la 5 h, cu lumină ultravioletă (UV) și vizibilă (VIS) în 0,3 ml apă sau 3/4 amestec de cloretanokdiclormetan.
Un total de 16+ 16 experimente au rezultat și au fost analizate. După expunere, supernatantul a fost filtrat, liofilizat și redizolvat în volum egal de MeOH 6 0,3 ml. Produsele au fost analizate prin HPLC.
Rezultate. Analiza prin HPLC a arătat clar că nu se pun în libertate tripeptide prin iradiere VIS în apă, și aproape completa eliberare de tripeptidă prin iradiere UV, timp de o oră.
în particular, peptidă i, în apă a fost scindată la un singur produs. în câteva cazuri, deși produșii au fost observați la eluare din HPLC.
La o expunere îndelungată cu ultraviolete, a fost observată interconvertirea între cei doi produși, în cel puțin câteva cazuri.
Discuții. Linkerul sensibil UV, produce în mod clar eliberarea peptidei în soluție apoasă. Timpul de expunere de o oră este potrivit pentru obținerea unei eliberări incomplete de peptidă. Rezultatele arată, de asemenea, că rășina poliamidică este stabilă și compatibilă cu sistemele apoase.
Exemplul 8. Identificarea unei enzime mimice
Materiale și metode. O bancă de pentapeptidă, care cuprinde 19 din cei 20 de amino acizi comuni (excluzând cisteina), a fost preparată în conformitate cu prezenta invenție (vezi cele arătate mai sus).
Banca de peptidă a fost expusă la un substrat cromogenic de clorură de albastru de nitro-tetrazolin (NBT) în absența enzimei exogene, în condiții care favorizează producerea și identificarea perlelor care reacționează pozitiv. Aceste perle au fost selectate și apoi secvența te.
Rezultate. Secvențele - cinci perle care au apărut să catalizeze reducerea NTB la produsul sau albastru închis, diformazan, sunt prezentate în tabelul 5.
Tabelul 5
Secvență de perlă de peptidă ce pare să acționeze cu enzime
PNNNH WNNNM
PNNNG MNNNR QNNNR
Discuții. Rezultatele anterioare sugerează că peptidă PNNNH-perlă este capabilă de reducere a NBT la un pigment diformazan de culoare albastru închis, fie chimic, fie enzimatic. Astfel că, peptidă sau perla-peptidă manifestă activitate ca o “enzimă artificială” sau enzimă mimică.
Exemplul 9. Determinarea pentru o secvență peptidică anti-cancer
O bancă limitată care cuprinde pentapeptide cu compoziția tirozinei, urmată de o secvență random, care cuprinde 5 -amino acizi selectați din grupa amino acizilor constând din acid glutamic serină, valină, glicină, arginină și asparagină conține secvențe peptidice cu activitate de linie celulară anti-cancer (de exemplu antitumorală).
Materiale și metode. O bancă de peptidă random în conformitate cu prezenta invenție, a fost sintetizată cu un linker diketopiperazinic hidrolizabil.
Au fost utilizate plăci cu 96 cavități, la determinarea ca medicamente anti-cancer (celulă antitumorală). După deprotejarea grupei care protejează catena laterală și grupa N-Fmoc, banca de perlă de peptidă a fost neutralizată cu DIEA (diizopropiletilamină) și spălată mult cu DMF pentru a îndepărta orice urme toxice potențiale de natură chimică remanente.
Apoi, banca a fost trecută treptat în 0,01 M HCI (condiție în care likerul este stabil) și, în final, spălată cu 0,001
RO 112336 Bl
N HCI. Aproximativ 10 bănci de perle au fost apoi transferate în fiecare cavitate a plăcii și 50 pl mediu RPMI (cu 25 mM soluție tampon HEPES] au fost apoi adăugați în fiecare cavitate pentru a neutraliza pH-ul soluției. La pH neutru sau slab alcalin peptidele vor fi puse în libertate [de exemplu după 16 24 h).
Așadar: (1) o porție, fie întreaga cantitate de mediu, este transferată întro placă separată cu o linie celulară canceroasă, sau (2) linia celulară canceroasă este adăugată direct în cavitățile cu perle. Au fost utilizate aproximativ 2500 celule canceroase de plămâni/ cavitate.
Plăcile au fost apoi incubate la temperatura de 37°C, timp de 7 zile, și un test MMTT a fost executat pentru a certifica cantitativ, relativa citotoxicitate a peptidelor eliberate în fiecare cavitate. Pentru determinări, pot fi utilizate diferite linii celulare, precum: carcinomul uman, mielomul și leucemia. Exemple sunt tumorile din panoul NCI: L1210 leucemia limfoidă, B16 melanoma, carcinomul de plămâni Lewis, M 5076 sarcomul, carcinomul 38 de colon, carcinomul de sân uman MX-1. Alte exemple sunt: carcinomul de sân MCF-7, linie celulară mielom 8226, linie celulară de leucocite 6 șoarece P388, linie celulară de cancer de plămân “non-small” Ha wkins.
Rezultate. O bancă care cuprinde aproximativ 8000 peptide cu secvența YXXXXX-perlă, unde Y este Tyr și X este Glu, Ser, Val, Gly, Arg sau Asn, a fost examinată. In două experimente, 3...4 supernatanți care conțin peptidă eliberată de câteva mii, au demonstrat inhibarea liniei celulare de celule de cancer de plămâni “non-small” Hawkins. Cum fiecare cavitate conține aproximativ 10 perle, în mod substanțial toate cele 8000 de secvențe posibile au fost testate și identificate cel mult 3 perle de peptidă activă.
Același tip de rezultat a fost văzut, atât prin incubarea directă a perlelor cu celule, cât și prin transferul supernatantului care conține peptidă eli berată.
Discuții. Aceste rezultate indică faptul că o bancă limitată de peptide poate induce câteva secvențe peptidice cu activitate citotoxică. In exemplul anterior, aproximativ 0,05% din secvențele posibile au demonstrat o activitate celulară anticancer.
Prin analizarea supernatanților care conțin peptidă eliberată, în multiple teste, poate fi determinată toxicitatea împotriva altor celule canceroase și împotriva celulelor țesutului normal. In acest mod, secvențele peptidice cu toxicitate extinsă pentru celulele tumorale sau cu toxicitate pentru o linie celulară tumorală specifică, pot fi identificate; aceste secvențe cu toxicitate scăzută pentru celule normale vor fi preferate ca agenți terapeutici. Această metodă poate fi aplicată pentru examinarea factorilor antimicrobieni, antiparazitari și factorilor antagonici de creștere.
O determinare (examinare) similară, abordată pentru un factor de creștere agonist utilizează o linie celulară dependentă de factor de creștere. Intr-un astfel de test, secvențele peptidice cu activitate agonistă a factorului de creștere, va stimula creșterea celulelor cultivate în absența factorului de creștere esențial.
Prezenta invenție nu este limitată în scopul său, prin exemplele de realizare descrise mai sus. Desigur, diferite modificări ale invenției, și legate de cele cuprinse în descriere, vor deveni evidente pentru cei ce lucrează în domeniu; folosindu-se și de figurile însoțitoare. Astfel de modificări sunt destinate să fie de acord și cu conținutul revendicărilor care fac obiectul prezentei invenții.

Claims (45)

  1. Revendicări
    1. Bancă de bio-oligomeri, caracterizată prin aceea că ea cuprinde o complexitate de specii de bio-oligomeri activi deprotejați și o complexitate de suporturi fază solidă, care sunt complet mixabili și corespunzători pentru condițiile de reacție ale sintezei chimice a
    RO 112336 Bl bio-oligomerilor; în care o singură specie de bio-oligomeri este atașată la fiecare suport față solidă, pentru a forma o combinație bio-oligomer/suport fază solidă și în care pentru fiecare specie din bancă identitatea unei subunități a biooligomerului prezent la fiecare poziție neuniformă dată a speciei de bio-oligomer este statistic independentă de identitatea subunităților în alte poziții ale speciei de bio-oligomer.
  2. 2. Bancă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că bio-oligomerii sunt proteine deprotejate.
  3. 3. Bancă, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că subunitățile sunt selectate din grupa constând din glicină, L-amino acizi, D-amino acizi, amino acizi nonclasici și peptidomimetice.
  4. 4. Bancă, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că peptidele cuprind cel puțin doi amino acizi capabili de legare încrucișată.
  5. 5. Bancă, conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că peptidele au fost tratate, astfel încât ele să se lege încrucișat și să formeze peptide constrânse (tensionate), ciclizate sau rigidizate.
  6. 6. Bancă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că suportul fază solidă conține un element de legătură.
  7. 7. Bancă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că bio-oligomerii sunt oligonucleotide deprotejate.
  8. 8. Bancă, conform revendicării 7, caracterizată prin aceea că subunitățile sunt selectate din grupa constând din ribonucleozide, deoxiribonucleozide și derivați de nucleozide.
  9. 9. Metodă pentru obținerea unei bănci de bio-oligomeri biologic activi caracterizată prin aceea că, constă din:
    (a) asigurarea a cel puțin atâția alicoți ai suportului fază solidă cât și numărul speciilor diferite de subunități de bio-oligomeri ce urmează a fi adăugate, dar nu mai puțin de două, pentru a forma bio-oligomerii;
    (b) introducerea separată a unui set de subunități la alicoții suportului fază solidă astfel, încât o subunitate este introdusă la fiecare alicot;
    (c) cuplarea completă a subunităților la aproape toate pozițiile suportului fază solidă pentru a forma o combinație suport fază solidă/subunitate nouă;
    (d) evaluarea cuplării complete și, dacă este necesar, forțarea reacției până la completa ei producere;
    (e) amestecarea completă a alicoților combinației suport fază solidă/ subunitate nouă și, după repetarea fazelor (a) ... (e) de un număr dorit de ori, (f) o fază de eliminarea grupelor de protecție astfel încât fiecare biooligomer să rămână legat la suportul fază solidă.
  10. 10. Metodă, conform revendicării 9, caracterizată prin aceea că suportul fază solidă este polidimetilacrilamidă.
  11. 11. Metodă, conform revendicării 9, caracterizată prin aceea că suportul fază solidă este selectat din grupul constând din rășină polistirenică, rășină polihip, rășină poliamidică, rășină polistirenică grefată cu polietilenglicol și rășină polidimetilacrilamidică.
  12. 12. Metodă, conform revendicării 9, caracterizată prin aceea că suportul fază solidă este siliciu.
  13. 13. Metodă, conform revendicării 9, caracterizată prin aceea că suportul fază solidă conține un element de legătură.
  14. 14. Metodă, conform revendicării 13, caracterizată prin aceea că elementul de legătură selectat din grupa constând din acid aminobutilic, acid aminocaproic, acid 7-aminoheptanoic, etilenglicol și acid 8-aminocaprilic.
  15. 15. Metodă, conform revendicării 13, caracterizată prin aceea că elementul de legătură cuprinde acid aminocaproic.
  16. 16. Metodă, conform revendicării 9, caracterizată prin aceea că banca de bio-oligomeri este astfel preparată
    RO 112336 Bl încât pentru cel puțin o fază, aceeași subunitate este cuplată la toți suporții fază solidă și în cel puțin altă fază, cel puțin două subunități diferite sunt separat cuplate cu cel puțin doi alicoți ai suportului fază solidă.
  17. 17. Metodă, conform revendicării 9, caracterizată prin aceea că fazele (a)...(e) sunt îndeplinite o dată.
  18. 18. Metodă, conform revendicării 9, caracterizată prin aceea că fazele (a)...(e) sunt îndeplinite mai mult decât o dată.
  19. 19. Metodă pentru determinarea unei secvențe a ligandului unui bio-oligomer pentru o moleculă acceptoare, caracterizată prin aceea că ea cuprinde următoarele faze:
    (a) introducerea în banca, conform revendicării 1, a unei molecule acceptoare de interes astfel. încât aceas tă moleculă acceptoare va recunoaște și se va lega la una sau mai multe specii bio-oligomer/suport fază solidă din cadrul băncii;
    (b) izolarea unei specii bio-oligomer/suport fază solidă care pune în evidență legarea cu molecula acceptoare;
    (c) determinarea secvenței biooligomerului din bio-oligomerul/suportu! fază solidă izolat în fază (b).
  20. 20. Metodă, conform revendicării 19, caracterizată prin aceea că molecula acceptoare este selectată din grupa constând din anticorpi, receptori, viruși, bacterii, proteine, carbohidrați, acizi nucleici, lipide, medicamente, metale și molecule mici.
  21. 21. Metodă, conform revendicării 19, caracterizată prin aceea că molecula acceptoare este un anticorp.
  22. 22. Metodă, conform revendicării 19, caracterizată prin aceea că molecula acceptoare este un receptor.
  23. 23. Metodă pentru determinarea unei secvențe a unui ligand bio-oligomer biologic activ, caracterizată prin aceea că ea cuprinde următoarele faze:
    (a) eliberarea, in situ, a unei porțiuni de bio-oligomer din banca de biooligomer din revendicarea 1, (b) detectarea, in situ, a activității biologice de interes a bio-oligomerului eliberat;
    (c) izolarea unui bio-oligomer/ suport fază solidă, având atașat specia de bio-oligomer care pune în evidență activitatea biologică de interes;
    (d) determinarea secvenței speciei de bio-oligomer rămasă pe suportul fază solida izolat în faza (c).
  24. 24. Metodă, conform revendicării 23, caracterizată prin aceea că suportul solid este sensibil-acid, sensibilbazic, sensibil-nucleofilic, fotosensibil, sensihil-electrofilic, sensibil la oxidare sau reducere.
  25. 25. Metodă, conform revendicării 23, caracterizată prin aceea că suportul fază solidă conține un element de legătură care este sensibil-acid, sensibilbazic, sensibil-nucleofilic, sensibil-electrofilic, fotosensibil, sensibil la oxidare sau reducere.
  26. 26. Metodă, conform revendicării 23, caracterizată prin aceea că eliberarea, in situ, din faza (a) este efectuată prin clivaj enzimatic sau clivaj fotochirnic
  27. 27. Metodă, conform revendicării 23, caracterizată prin aceea că activitatea biologică detectată în faza [b] este selectată din grupul constând din citotoxicitate, activitate antitumorală, activitate antibacteriană, activitate antivirală, activitate antifungică, activitate antiparazitară, activitate a factorului de creștere, activitate de inhibare a creșterii, activitate hormonală, activitate neurotransmițător, activitate imunomodulatoare și activitate regulatorie.
  28. 28. Metodă, conform revendicării 23, caracterizată prin aceea că activitatea biologică detectată în faza (b) este o inhibare a unei enzime.
  29. 29. Metodă, conform revendicărilor 19 sau 23, caracterizată prin aceea că ligandul bio-oligomer este un agent terapeutic.
  30. 30. Metodă, conform revendicărilor 19 sau 23, caracterizată prin aceea că iigandul bio-oligomer este
    RO 112336 Bl unagent de diagnostic.
  31. 31. Metodă, conform revendicărilor 19 sau 23, caracterizată prin aceea că ligandul bio-oligomer se compune dintr-o secvență peptidică având 5 activitate citotoxică.
  32. 32. Metodă, conform revendicărilor 19 sau 23, caracterizată prin aceea că ligandul bio-oligomer se compune dintr-o secvență peptidică având 10 activitate antitumorală.
  33. 33. Metodă, conform revendicărilor 19 sau 23, caracterizată prin aceea că ligandul bio-oligomer se compune dintr-o secvență peptidică având 15 activitate antimicrobiană.
  34. 34. Metodă, conform revendicărilor 19 sau 23, caracterizată prin aceea că ligandul bio-oligomer se compune dintr-o secvență peptidică având 20 activitate de forțare a factorului de creștere.
  35. 35. Metodă, conform revendicărilor 19 sau 23, caracterizată prin aceea că ligandul bio-oligomer se corn- 25 pune dintr-o secvență peptidică având activitate antagonică factorului de creștere.
  36. 36. Metodă, conform revendicărilor 19 sau 23, caracterizată prin 30 aceea că ligandul bio-oligomer se compune dintr-o secvență peptidică având activitate hormonală mărită.
  37. 37. Metodă, conform revendicărilor 19 sau 23, caracterizată prin 35 aceea că ligandul bio-oligomer se compune dintr-o secvență peptidică având activitate antagonică hormonală.
  38. 38. Metodă, conform revendicărilor 19 sau 23, caracterizată prin 40 aceea că ligandul bio-oligomer se compune dintr-o secvență peptidică având activitate eritropoetică mărită.
  39. 39. Metodă, conform revendicărilor 19 sau 23, caracterizată prin 45 aceea că ligandul bio-oligomer se com pune dintr-o secvență oligonucleotidică având activitate citotoxică.
  40. 40. Metodă, conform revendicărilor 19 sau 23, caracterizată prin aceea că ligandul bio-oligomer se compune dintr-o secvență oligonucleotidică având activitate antitumorală.
  41. 41. Metodă, conform revendicărilor 19 sau 23, caracterizată prin aceea că ligandul bio-oligomer se compune dintr-o secvență oligonucleotidică având activitate antimicrobiană.
  42. 42. Metodă, conform revendicărilor 19 sau 23, caracterizată prin aceea că ligandul bio-oligomer se compune dintr-o secvență peptidică cuprinsă într-un vaccin.
  43. 43. Metodă pentru determinarea unei secvențe a unui bio-oligomer care catalizează o reacție, caracterizată prin aceea că ea cuprinde următoarele faze:
    (a) adăugarea la banca de biooligomeri din revendicarea 1 a unui substrat, astfel (încât un produs de reacție să fie detectabil;
    (b) izolarea unui suport față solidă având o specie de bio-oligomer care pune în evidență activitatea de interes;
    (c) determinarea secvenței biooligomerului atașat la suportul izolat în fază (b).
  44. 44. Metodă, conform revendicării 28, caracterizată prin aceea că ligandul bio-oligomer având activitate de inhibare a unei enzime este o oligonucleotidă.
  45. 45. Metodă, conform revendicării 28, caracterizată prin aceea că biooligomerul este un ligand, având activitate de inhibare a unei enzime și este o peptidă care constă din amino acizi selectați din grupa constând din glicină, amino acizi nenaturali, □-izomeri ai amino acizilor naturali, analogi de amino acizi și peptidomimetice.
RO93-00398A 1990-07-02 1991-07-01 Banca de biooligomeri, metoda de obtinere si metoda pentru determinarea unei secvente RO112336B1 (ro)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US54684590A 1990-07-02 1990-07-02
US07/717,454 US5650489A (en) 1990-07-02 1991-06-19 Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
PCT/US1991/004666 WO1992000091A1 (en) 1990-07-02 1991-07-01 Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RO112336B1 true RO112336B1 (ro) 1997-08-29

Family

ID=27068387

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RO93-00398A RO112336B1 (ro) 1990-07-02 1991-07-01 Banca de biooligomeri, metoda de obtinere si metoda pentru determinarea unei secvente

Country Status (23)

Country Link
US (3) US5650489A (ro)
EP (1) EP0542770B1 (ro)
JP (1) JP3552718B2 (ro)
KR (2) KR100222146B1 (ro)
AT (1) ATE176330T1 (ro)
AU (3) AU659091B2 (ro)
CA (1) CA2086672C (ro)
CZ (1) CZ289365B6 (ro)
DE (1) DE69130828T2 (ro)
DK (1) DK0542770T3 (ro)
ES (1) ES2126572T3 (ro)
FI (1) FI107995B (ro)
GR (1) GR3029443T3 (ro)
HU (1) HU218007B (ro)
IE (1) IE912299A1 (ro)
IL (1) IL98682A (ro)
MX (1) MX9100052A (ro)
NO (1) NO315002B1 (ro)
NZ (1) NZ238805A (ro)
PL (2) PL169616B1 (ro)
RO (1) RO112336B1 (ro)
SK (1) SK281490B6 (ro)
WO (1) WO1992000091A1 (ro)

Families Citing this family (617)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5747334A (en) * 1990-02-15 1998-05-05 The University Of North Carolina At Chapel Hill Random peptide library
US5498538A (en) * 1990-02-15 1996-03-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Totally synthetic affinity reagents
US5639595A (en) * 1990-05-01 1997-06-17 Isis Phamaceuticals, Inc. Identification of novel drugs and reagents
US5650489A (en) * 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
US6197529B1 (en) * 1990-11-21 2001-03-06 Torrey Pines Institute For Molecular Studies Linear substituted oligoalkyleneimine libraries
US20050209121A1 (en) * 1990-12-05 2005-09-22 Novozymes A/S Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof
US5646001A (en) * 1991-03-25 1997-07-08 Immunivest Corporation Affinity-binding separation and release of one or more selected subset of biological entities from a mixed population thereof
JPH07501929A (ja) * 1991-08-23 1995-03-02 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド オリゴマーフラグメントの合成非ランダム化
WO1993005182A1 (en) * 1991-09-05 1993-03-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Determination of oligonucleotides for therapeutics, diagnostics and research reagents
US5639603A (en) * 1991-09-18 1997-06-17 Affymax Technologies N.V. Synthesizing and screening molecular diversity
EP0773227A1 (en) * 1991-09-18 1997-05-14 Affymax Technologies N.V. Diverse collections of oligomers in use to prepare drugs, diagnostic reagents, pesticides or herbicides
US6117974A (en) * 1991-10-02 2000-09-12 Peptor Limited Libraries of backbone-cyclized peptidomimetics
US20010021513A1 (en) * 1991-11-21 2001-09-13 Puijk Wouter Cornelis Test device comprising a plate containing a multiplicity of wells with an associated metering device, as well as a kit which comprises these devices and use of the devices
US5573905A (en) * 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
ES2156869T5 (es) * 1992-04-15 2008-07-01 The Johns Hopkins University Sintesis de colecciones diversas y utiles de oligonucleotidos.
US5541061A (en) * 1992-04-29 1996-07-30 Affymax Technologies N.V. Methods for screening factorial chemical libraries
WO1994002515A1 (en) * 1992-07-21 1994-02-03 Bunsen Rush Laboratories Inc. Oligomer library formats and methods relating thereto
US5565324A (en) * 1992-10-01 1996-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
ES2204910T3 (es) * 1992-10-01 2004-05-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Bibliotecas quimicas combinatorias complejas codificadas con señales.
US5721099A (en) * 1992-10-01 1998-02-24 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US6503759B1 (en) 1992-10-01 2003-01-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5807683A (en) * 1992-11-19 1998-09-15 Combichem, Inc. Combinatorial libraries and methods for their use
DE4243770A1 (de) * 1992-12-23 1994-06-30 Behringwerke Ag Verfahren zur Herstellung von rekombinanten und synthetischen Peptiden und deren Verwendung
US5605798A (en) * 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
WO1994020521A1 (de) * 1993-03-12 1994-09-15 Jerini Bio Chemicals Gmbh Verfahren zur synthese und selektionierung von sequenzen aus kovalent verbundenen bausteinen
US6864048B2 (en) 1993-04-28 2005-03-08 Affymetrix, Inc. Factorial chemical libraries
WO1994028028A1 (en) * 1993-05-27 1994-12-08 Selectide Corporation Topologically segregated, encoded solid phase libraries
US5840485A (en) * 1993-05-27 1998-11-24 Selectide Corporation Topologically segregated, encoded solid phase libraries
WO1994028424A1 (en) * 1993-05-28 1994-12-08 Chiron Corporation Method for selection of biologically active peptide sequences
US5846731A (en) * 1993-06-17 1998-12-08 Torry Pines Institute For Molecular Studies Peralkylated oligopeptide mixtures
US5480971A (en) * 1993-06-17 1996-01-02 Houghten Pharmaceuticals, Inc. Peralkylated oligopeptide mixtures
ATE210993T1 (de) * 1993-06-21 2002-01-15 Selectide Corp Selektiv spaltbare verbindungen, die auf iminodiessigsäure-ester-bindungen basieren
JPH09500625A (ja) 1993-07-09 1997-01-21 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 環状セミランダムペプチドライブラリー
AU7193494A (en) * 1993-07-21 1995-02-20 Oxford Glycosystems Ltd Saccharides, their synthesis and use
US6001982A (en) 1993-07-29 1999-12-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of oligonucleotides
KR960704064A (ko) * 1993-08-13 1996-08-31 죠나단 에스. 도르딕 생물학적 활성 화합물의 합성 및 검사를 위한 생체 촉매적 방법(Biocatalytic Methods for Synthesizing and ldentifying Biologically Active Compounds)
CN1525171A (zh) * 1993-10-01 2004-09-01 ŦԼ�и��ױ��Ǵ�ѧ���� 用标示物编码的多元组合化学库
US5922545A (en) * 1993-10-29 1999-07-13 Affymax Technologies N.V. In vitro peptide and antibody display libraries
US6165778A (en) * 1993-11-02 2000-12-26 Affymax Technologies N.V. Reaction vessel agitation apparatus
US5503805A (en) * 1993-11-02 1996-04-02 Affymax Technologies N.V. Apparatus and method for parallel coupling reactions
US6287787B1 (en) 1993-11-24 2001-09-11 Torrey Pines Institute For Molecular Studies Dimeric oligopeptide mixture sets
CA2175078A1 (en) * 1993-12-09 1995-06-15 Eduard Felder Process for the production of combinatorial compound libraries
ATE160223T1 (de) * 1993-12-15 1997-11-15 Combichem Inc Kombinatorische bibliotheken und verfahren zu ihrer verwendung
US5587471A (en) * 1994-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Method of making oligonucleotide libraries
ZA95260B (en) * 1994-01-13 1995-09-28 Univ Columbia Synthetic receptors libraries and uses thereof
US5593853A (en) * 1994-02-09 1997-01-14 Martek Corporation Generation and screening of synthetic drug libraries
US5541085A (en) * 1994-02-14 1996-07-30 Zymogenetics, Inc. Method for preparing orphan receptor ligands
US5539083A (en) * 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
EP0751765B1 (en) * 1994-03-11 2003-05-07 Pharmacopeia, Inc. Sulfonamide derivatives and their use
US6015880A (en) * 1994-03-16 2000-01-18 California Institute Of Technology Method and substrate for performing multiple sequential reactions on a matrix
US6936477B2 (en) 1994-04-13 2005-08-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5856083A (en) * 1994-05-06 1999-01-05 Pharmacopeia, Inc. Lawn assay for compounds that affect enzyme activity or bind to target molecules
US5846841A (en) * 1994-05-20 1998-12-08 Selectide Corporation Motif Libraries
IL109943A (en) * 1994-06-08 2006-08-01 Develogen Israel Ltd Conformationally constrained backbone cyclized peptide analogs
US6407059B1 (en) 1994-06-08 2002-06-18 Peptor Limited Conformationally constrained backbone cyclized peptide analogs
JPH10502102A (ja) * 1994-06-14 1998-02-24 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 固体合成用樹脂
US5663046A (en) * 1994-06-22 1997-09-02 Pharmacopeia, Inc. Synthesis of combinatorial libraries
AU2871195A (en) * 1994-06-23 1996-01-19 Affymax Technologies N.V. Methods for the synthesis of diketopiperazines
US5817751A (en) * 1994-06-23 1998-10-06 Affymax Technologies N.V. Method for synthesis of diketopiperazine and diketomorpholine derivatives
EP0772623A1 (en) * 1994-07-26 1997-05-14 The Scripps Research Institute Soluble combinatorial libraries
US5939268A (en) * 1994-07-26 1999-08-17 The Scripps Research Institute Combinatorial libraries of molecules and methods for producing same
US5948693A (en) * 1994-09-01 1999-09-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Solid phase synthesis of immunosuppressive agents
US5463564A (en) 1994-09-16 1995-10-31 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System and method of automatically generating chemical compounds with desired properties
US6558633B1 (en) 1994-09-21 2003-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chemical reaction apparatus and methods
US5604097A (en) * 1994-10-13 1997-02-18 Spectragen, Inc. Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags
US6280935B1 (en) 1994-10-13 2001-08-28 Lynx Therapeutics, Inc. Method of detecting the presence or absence of a plurality of target sequences using oligonucleotide tags
US5846719A (en) 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
USRE43097E1 (en) 1994-10-13 2012-01-10 Illumina, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
US5695934A (en) * 1994-10-13 1997-12-09 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel sequencing of sorted polynucleotides
AU3599895A (en) * 1994-10-14 1996-05-06 Chiron Mimotopes Pty Ltd Method and apparatus for efficient mimotope discovery
US6974666B1 (en) 1994-10-21 2005-12-13 Appymetric, Inc. Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US5688696A (en) * 1994-12-12 1997-11-18 Selectide Corporation Combinatorial libraries having a predetermined frequency of each species of test compound
DE4444260A1 (de) * 1994-12-13 1996-06-20 Hoechst Ag Cyclohexapeptide und deren Mischungen, Verfahren zur Herstellung sowie deren Verwendung
WO1996022067A2 (en) * 1994-12-27 1996-07-25 United Biomedical, Inc. Peptide ratchet libraries for ctl-inducing vaccines and therapeutics
GB9502225D0 (en) * 1995-02-04 1995-03-22 Zeneca Ltd Method
AU5487496A (en) * 1995-05-03 1996-11-21 Eli Lilly And Company Combinatorial process for synthesizing azetidinone analogs
US5759865A (en) * 1995-05-03 1998-06-02 Eli Lilly And Company Combinatorial process for synthesizing azetidinone analogs
US5834318A (en) * 1995-05-10 1998-11-10 Bayer Corporation Screening of combinatorial peptide libraries for selection of peptide ligand useful in affinity purification of target proteins
US5830655A (en) 1995-05-22 1998-11-03 Sri International Oligonucleotide sizing using cleavable primers
US5750674A (en) * 1995-05-23 1998-05-12 Hybridon, Inc. Methods and compounds for the stereoselective enrichment of oligonucleotide diastereomers and oligonucleotides thereby produced
AU5871196A (en) * 1995-05-23 1996-12-24 Hybridon, Inc. Methods and compounds for the synthesis of oligonucleotides and the oligonucleotides thereby produced
US20010053523A1 (en) * 1995-06-02 2001-12-20 M&E Biotech A/S. Method for identification of biologically active peptides and nucleic acids
US5770687A (en) * 1995-06-07 1998-06-23 Peptor Limited Comformationally constrained backbone cyclized somatostatin analogs
US6051554A (en) * 1995-06-07 2000-04-18 Peptor Limited Conformationally constrained backbone cyclized somatostatin analogs
PT839152E (pt) * 1995-06-21 2002-09-30 Martek Biosciences Corp Bibliotecas combinatorias de compostos bioquimicos marcados e metodos para as produzir.
SE9502286D0 (sv) * 1995-06-22 1995-06-22 Pharmacia Ab Process for detection, quantification and/or identification of a peptide
US6579848B1 (en) * 1995-06-23 2003-06-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Depigmenting activity of agouti signal protein and peptides thereof
GB9515070D0 (en) * 1995-07-22 1995-09-20 Zeneca Ltd Label
AU728668B2 (en) * 1995-09-11 2001-01-18 La Jolla Cancer Research Foundation Molecules that home to a selected organ or tissue in vivo and methods of identifying same
US6743892B1 (en) 1995-09-11 2004-06-01 La Jolla Cancer Research Foundation Molecules that home to a selected organ in vivo
EP0876611A1 (en) * 1995-09-11 1998-11-11 La Jolla Cancer Research Foundation Molecules that home to a selected organ or tissue in vivo and methods of identifying same
US6068829A (en) 1995-09-11 2000-05-30 The Burnham Institute Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo
US7026114B1 (en) * 1995-09-13 2006-04-11 Affymetrix, Inc. Methods and compositions for monitoring polymer array synthesis
US6841533B1 (en) 1995-12-07 2005-01-11 Peptor Limited Conformationally constrained backbone cyclized interleukin-6 antagonists
US6147205A (en) * 1995-12-15 2000-11-14 Affymetrix, Inc. Photocleavable protecting groups and methods for their use
US20110028350A1 (en) * 1995-12-15 2011-02-03 Affymetrix, Inc. Photocleavable protecting groups
DK0868427T3 (da) * 1995-12-18 2003-09-15 Praecis Pharm Inc Fremgangsmåder til at idenficere forbindelser, der binder til et mål
PT874625E (pt) * 1996-01-22 2005-07-29 Lilly Co Eli Derivados de indano para composicoes antipsicoticas
US6365344B1 (en) * 1996-01-23 2002-04-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for screening for transdominant effector peptides and RNA molecules
WO1997027213A1 (en) 1996-01-23 1997-07-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for screening for transdominant effector peptides and rna molecules
US6277583B1 (en) * 1996-02-07 2001-08-21 Conjuchem, Inc. Affinity labeling libraries and applications thereof
US6080719A (en) * 1996-02-23 2000-06-27 Hoechst Aktiengesellschaft Cyclohexapeptides and their mixtures, a process for preparing them, and their use
EP0886681A1 (en) 1996-03-04 1998-12-30 Genetrace Systems, Inc. Methods of screening nucleic acids using mass spectrometry
DE19610103A1 (de) 1996-03-15 1997-09-18 Basf Ag Cycloalkylderivate und ihre Synthese an fester Phase
AU740222C (en) * 1996-03-20 2002-10-10 Genzyme Corporation A method for identifying cytotoxic T-cell epitopes
CA2249290A1 (en) * 1996-03-21 1997-09-25 Rui Liang Carbohydrate-based ligand library, assay and method
US5866341A (en) * 1996-04-03 1999-02-02 Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Compositions and methods for screening drug libraries
WO1997040385A1 (en) 1996-04-25 1997-10-30 Bioarray Solutions, Llc Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces
US6387707B1 (en) 1996-04-25 2002-05-14 Bioarray Solutions Array Cytometry
US7144119B2 (en) 1996-04-25 2006-12-05 Bioarray Solutions Ltd. System and method for programmable illumination pattern generation
US5958342A (en) * 1996-05-17 1999-09-28 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Jet droplet device
DE19621177A1 (de) 1996-05-24 1997-11-27 Basf Ag Kohlenhydratderivate und ihre Synthese an fester Phase
US6300065B1 (en) 1996-05-31 2001-10-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US6699658B1 (en) 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US6696251B1 (en) * 1996-05-31 2004-02-24 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US6203978B1 (en) * 1996-05-31 2001-03-20 Du Vergier Ltd. Capture of single stranded nucleic acids
CN102286077A (zh) 1996-06-14 2011-12-21 明治乳业株式会社 T细胞表位肽
AU3307497A (en) * 1996-06-26 1998-01-14 Antigen Express, Inc. Immunotherapy by modulation of antigen presentation
DE19626762A1 (de) 1996-07-03 1998-01-08 Basf Ag Enzymatisch spaltbare Linker für Festphasensynthesen
US6355613B1 (en) 1996-07-31 2002-03-12 Peptor Limited Conformationally constrained backbone cyclized somatostatin analogs
US5922872A (en) * 1996-08-01 1999-07-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Meta-benzylic and alpha-amido compositions and methods for preparing same
US5817489A (en) 1996-08-01 1998-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Di-nitrogen heterocycle compositions
US6576239B1 (en) 1996-09-10 2003-06-10 The Burnham Institute Angiogenic homing molecules and conjugates derived therefrom
WO1998011437A1 (en) 1996-09-16 1998-03-19 Conjuchem, Inc. Affinity labeling libraries with tagged leaving groups
US5965363A (en) 1996-09-19 1999-10-12 Genetrace Systems Inc. Methods of preparing nucleic acids for mass spectrometric analysis
US5798035A (en) * 1996-10-03 1998-08-25 Pharmacopeia, Inc. High throughput solid phase chemical synthesis utilizing thin cylindrical reaction vessels useable for biological assay
US6838238B1 (en) * 1996-10-17 2005-01-04 Invitrogen Corporation Morphatides: novel shape and structure libraries
US20020022227A1 (en) * 1996-10-17 2002-02-21 Short Jay M. Morphatides: novel shape and structure libraries
US6042789A (en) * 1996-10-23 2000-03-28 Glaxo Group Limited System for parallel synthesis of organic compounds
US6149869A (en) * 1996-10-23 2000-11-21 Glaxo Wellcome Inc. Chemical synthesizers
US6413724B1 (en) 1996-10-28 2002-07-02 Versicor, Inc. Solid phase and combinatorial library syntheses of fused 2,4-pyrimidinediones
US6025371A (en) * 1996-10-28 2000-02-15 Versicor, Inc. Solid phase and combinatorial library syntheses of fused 2,4-pyrimidinediones
US6571227B1 (en) 1996-11-04 2003-05-27 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Method, system and computer program product for non-linear mapping of multi-dimensional data
US6453246B1 (en) 1996-11-04 2002-09-17 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System, method, and computer program product for representing proximity data in a multi-dimensional space
US6295514B1 (en) 1996-11-04 2001-09-25 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Method, system, and computer program product for representing similarity/dissimilarity between chemical compounds
US6054325A (en) * 1996-12-02 2000-04-25 Glaxo Wellcom Inc. Method and apparatus for transferring and combining distinct chemical compositions with reagents
US6083761A (en) * 1996-12-02 2000-07-04 Glaxo Wellcome Inc. Method and apparatus for transferring and combining reagents
WO1998024760A1 (en) * 1996-12-03 1998-06-11 Graybill Todd L Aminobenzenedicarboxylic acid-based combinatorial libraries
CA2274587A1 (en) 1996-12-10 1998-06-18 Genetrace Systems Inc. Releasable nonvolatile mass-label molecules
AU6682598A (en) * 1997-03-04 1998-09-22 Bio-Technology General Corporation Isolation of tissue specific peptide ligands and their use for targeting pharmaceuticals to organs
US6045755A (en) * 1997-03-10 2000-04-04 Trega Biosciences,, Inc. Apparatus and method for combinatorial chemistry synthesis
US7622294B2 (en) * 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US20030027126A1 (en) 1997-03-14 2003-02-06 Walt David R. Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US6177464B1 (en) 1997-03-14 2001-01-23 Sepracor, Inc. Ring opening metathesis of alkenes
JPH10260223A (ja) * 1997-03-19 1998-09-29 Fujitsu Ltd 半導体検査装置及びこれを用いた検査方法
WO1998046631A1 (en) * 1997-04-11 1998-10-22 Eli Lilly And Company Combinatorial libraries of peptidomimetic macrocycles and processes therefor
US6004823A (en) * 1997-05-07 1999-12-21 Smithkline Beecham Corporation Compounds
US5908960A (en) * 1997-05-07 1999-06-01 Smithkline Beecham Corporation Compounds
GB9710582D0 (en) 1997-05-22 1997-07-16 Oxford Glycosciences Uk Ltd A method for de novo peptide sequence determination
EP1003904B1 (en) * 1997-05-23 2007-07-11 BioArray Solutions Ltd. Color-encoding and in-situ interrogation of matrix-coupled chemical compounds
AU8147798A (en) * 1997-06-16 1999-01-04 University Of North Carolina At Chapel Hill, The Peptido oligonucleotides (pons) and their combinatorial libraries
NZ516848A (en) 1997-06-20 2004-03-26 Ciphergen Biosystems Inc Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine
EP1387390B1 (en) 1997-06-20 2009-02-18 Bio - Rad Laboratories, Inc. Retentate chromatography and protein chip arrays with applications in biology and medicine
US5874589A (en) * 1997-07-18 1999-02-23 Glaxo Wellcome, Inc. Methods for synthesizing diverse collections of tetramic acids and derivatives thereof
US6410342B1 (en) * 1997-08-19 2002-06-25 Pharmacopeia, Inc. Method and apparatus for controlled photoelution
US7252950B1 (en) 1997-09-04 2007-08-07 The Regents Of The University Of California Assays for detecting modulators of cytoskeletal function
US6960457B1 (en) 1997-09-04 2005-11-01 Stanford University Reversible immobilization of arginine-tagged moieties on a silicate surface
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
CA2305597C (en) 1997-11-07 2008-07-29 Conjuchem Inc. Affinity markers for human serum albumin
US6228579B1 (en) * 1997-11-14 2001-05-08 San Diego State University Foundation Method for identifying microbial proliferation genes
US6083682A (en) * 1997-12-19 2000-07-04 Glaxo Group Limited System and method for solid-phase parallel synthesis of a combinatorial collection of compounds
US6759243B2 (en) 1998-01-20 2004-07-06 Board Of Trustees Of The University Of Illinois High affinity TCR proteins and methods
US5968361A (en) * 1998-02-24 1999-10-19 Arqule, Inc. Rapid method for separation of small molecules using reverse phase high performance liquid chromatography
US6497820B1 (en) 1998-02-03 2002-12-24 Arqule, Inc. Rapid method for separation of small molecules using reverse phase high performance liquid chromatography
WO1999043409A1 (en) * 1998-02-27 1999-09-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Hplc fractionation of complex chemical mixtures
US6232287B1 (en) 1998-03-13 2001-05-15 The Burnham Institute Molecules that home to various selected organs or tissues
WO1999047923A2 (en) 1998-03-20 1999-09-23 The Rockefeller University Assays for screening compounds which interact with cation channel proteins, mutant prokaryotic cation channel proteins, and uses thereof
AU767185B2 (en) 1998-03-23 2003-11-06 President And Fellows Of Harvard College Synthesis of compounds and libraries of compounds
EP1144997A3 (en) * 1998-03-30 2002-08-28 The Regents of the University of California Methods and compounds for modulating nuclear receptor activity
US6316616B1 (en) 1998-04-02 2001-11-13 President And Fellows Of Harvard College Parallel combinatorial approach to the discovery and optimization of catalysts and uses thereof
US6872537B1 (en) 1998-04-14 2005-03-29 Regents Of The University Of California Assays for the detection of microtubule depolymerization inhibitors
JP2002522747A (ja) 1998-04-14 2002-07-23 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 微小管脱重合インヒビターを検出するためのアッセイ
US6699969B1 (en) 1998-04-14 2004-03-02 The Regents Of The University Of California Assays for the detection of microtubule depolymerization inhibitors
EP1075546A1 (de) 1998-05-04 2001-02-14 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren und vorrichtung zur isolierung von nukleinsäuren
DE19819889A1 (de) * 1998-05-04 1999-11-11 Fraunhofer Ges Forschung Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren
US6541211B1 (en) * 1998-05-20 2003-04-01 Selectide Corporation Apparatus and method for synthesizing combinational libraries
EP1138692A1 (en) 2000-03-29 2001-10-04 Erasmus Universiteit Rotterdam Fragments of human chorionic gonadotropin (hcg) as immunoregulator
US6872535B2 (en) 1998-05-20 2005-03-29 Aventis Pharmaceuticals Inc. Three-dimensional array of supports for solid-phase parallel synthesis and method of use
US7387779B2 (en) * 1998-06-17 2008-06-17 Beth Israel Deaconess Medical Center Anti-angiogenic proteins and fragments and methods of use thereof
US7402400B2 (en) 2001-07-03 2008-07-22 Regents Of The University Of California Mammalian sweet taste receptors
AU757955B2 (en) 1998-08-17 2003-03-13 Bristol-Myers Squibb Company Identification of compound-protein interactions using libraries of protein-nucleic acid fusion molecules
US6633543B1 (en) * 1998-08-27 2003-10-14 Intel Corporation Multicast flow control
US20040242521A1 (en) * 1999-10-25 2004-12-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Thio-siRNA aptamers
US6867289B1 (en) * 1998-10-26 2005-03-15 Board Of Regents, The University Of Texas Systems Thio-modified aptamer synthetic methods and compositions
AU1818400A (en) * 1998-11-12 2000-05-29 Eli Lilly And Company Aryloxime linkers in the solid-phase synthesis of 3-aminobenzisoxazoles
US20030027214A1 (en) * 1999-02-17 2003-02-06 Kamb Carl Alexander Methods for substrate-ligand interaction screening
US6649358B1 (en) 1999-06-01 2003-11-18 Caliper Technologies Corp. Microscale assays and microfluidic devices for transporter, gradient induced, and binding activities
IL146798A0 (en) 1999-06-14 2002-07-25 Genentech Inc A structured peptide scaffold for displaying turn libraries on phage
SE9902479D0 (sv) * 1999-06-30 1999-06-30 Amersham Pharm Biotech Ab Particle classification as marker
US7742877B1 (en) * 1999-07-22 2010-06-22 Becton, Dickinson & Company Methods, apparatus and computer program products for formulating culture media
ATE542916T1 (de) 1999-08-18 2012-02-15 Illumina Inc Methoden zur erzeugung von oligonukleotidlösungen
ATE479441T1 (de) 1999-09-03 2010-09-15 Brigham & Womens Hospital Verfahren und zusammensetzungen zur behandlung von entzündungskrankheiten unter verwendung von cadherin-11-modulierenden agenzien
JP2003511045A (ja) * 1999-10-04 2003-03-25 ユニバーシティー オブ メディシン アンド デンティストリー オブ ニュー ジャージー Ｒｎａ結合化合物の同定方法
US6569685B1 (en) * 1999-10-05 2003-05-27 The Molecular Sciences Institute, Inc. Protein fingerprint system and related methods
KR100378252B1 (ko) * 1999-11-12 2003-03-29 학교법인 포항공과대학교 니트로술포닐에톡시카르보닐-아미노산을 이용한 합성테트라펩티드 라이브러리의 제조방법
US6458538B1 (en) 1999-12-14 2002-10-01 Ptc Therapeutics, Inc. Methods of assaying for compounds that inhibit premature translation termination and nonsense-mediated RNA decay
US7452664B2 (en) 1999-12-15 2008-11-18 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying agents which alter histone protein acetylation
US8642284B1 (en) 1999-12-15 2014-02-04 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying agents that alter NAD-dependent deacetylation activity of a SIR2 protein
US6489116B2 (en) 2000-01-24 2002-12-03 Phylos, Inc. Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis
US7022479B2 (en) 2000-01-24 2006-04-04 Compound Therapeutics, Inc. Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis
CN1450922A (zh) 2000-02-03 2003-10-22 加利福尼亚大学董事会 用于检测影响认知的药剂的分析方法及装置
US7416524B1 (en) 2000-02-18 2008-08-26 Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development, L.L.C. System, method and computer program product for fast and efficient searching of large chemical libraries
AU2001241800A1 (en) 2000-02-29 2001-09-12 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Method and computer program product for designing combinatorial arrays
TW201006846A (en) 2000-03-07 2010-02-16 Senomyx Inc T1R taste receptor and genes encidung same
US7039621B2 (en) 2000-03-22 2006-05-02 Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development, L.L.C. System, method, and computer program product for representing object relationships in a multidimensional space
USRE43279E1 (en) 2000-03-29 2012-03-27 Biotemp B.V. Compositions capable of reducing elevated blood urea concentration
US20050037430A1 (en) * 2000-03-29 2005-02-17 Biotempt B.V. Methods and uses for protein breakdown products
WO2001075790A2 (en) 2000-04-03 2001-10-11 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Method, system, and computer program product for representing object relationships in a multidimensional space
WO2001096607A2 (en) 2000-06-13 2001-12-20 The Trustees Of Boston University Use of nucleotide analogs in the analysis of oligonucleotide mixtures and in highly multiplexed nucleic acid sequencing
EP1311839B1 (en) 2000-06-21 2006-03-01 Bioarray Solutions Ltd Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
US9709559B2 (en) 2000-06-21 2017-07-18 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
US6759510B1 (en) * 2000-06-30 2004-07-06 Becton, Dickinson And Company Peptides for use in culture media
US20020019010A1 (en) * 2000-07-07 2002-02-14 Stockwell Brent R. Methods for identifying combinations of entities as therapeutics
US20040253627A1 (en) * 2000-07-07 2004-12-16 Grant Zimmermann System and method for multidimensional evaluation of combinations of compositions
US20020051991A1 (en) * 2000-07-11 2002-05-02 Zhi Hong Rapid generation of diverse nucleoside and nucleotide libraries
WO2002014867A2 (en) * 2000-08-11 2002-02-21 Agilix Corporation Ultra-sensitive detection systems
US6963807B2 (en) 2000-09-08 2005-11-08 Oxford Glycosciences (Uk) Ltd. Automated identification of peptides
US7420030B2 (en) 2000-09-08 2008-09-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Aminopeptidase A (APA) targeting peptides for the treatment of cancer
US7452964B2 (en) 2001-09-07 2008-11-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods of use of targeting peptides against placenta and adipose tissues
US20040170955A1 (en) 2000-09-08 2004-09-02 Wadih Arap Human and mouse targeting peptides identified by phage display
WO2002020150A2 (en) * 2000-09-11 2002-03-14 Affymetrix, Inc. Photocleavable protecting groups
EP1332371A2 (en) * 2000-09-18 2003-08-06 Genzyme Corporation Method to identify antibody targets based on mass spectrometry (maldi-tof)
US7186521B2 (en) 2000-09-25 2007-03-06 The Regents Of The University Of California Determining the effect of a substance on sequestration, uptake, and accumulation of amyloid in brain cells
US20030045005A1 (en) 2000-10-17 2003-03-06 Michael Seul Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces
US7045283B2 (en) 2000-10-18 2006-05-16 The Regents Of The University Of California Methods of high-throughput screening for internalizing antibodies
AU2002220275A1 (en) * 2000-12-08 2002-06-18 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Mutated class ii major histocompatibility proteins
US7572575B2 (en) 2000-12-13 2009-08-11 Massachusetts Institute Of Technology SIR2 activity
JP2005502309A (ja) * 2000-12-23 2005-01-27 カイロン コーポレイション オリゴヌクレオチドトランスフェクションスクリーニング方法
TW201022287A (en) 2001-01-03 2010-06-16 Senomyx Inc T1R taste receptors and genes encoding same
WO2002061419A1 (en) 2001-01-29 2002-08-08 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Method, system, and computer program product for analyzing combinatorial libraries
DE10106339A1 (de) * 2001-02-09 2002-08-22 Hans-Joachim Mueller Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening von Kandidaten-Verbindungen über die Hochdurchsatz-Direktsynthese von rekombinanten Polypeptiden
US7883856B2 (en) 2001-04-05 2011-02-08 Senomyx Inc. Identification of bitter ligands that specifically activate human T2R receptors and related assays for identifying human bitter taste modulators
US20030191073A1 (en) 2001-11-07 2003-10-09 Challita-Eid Pia M. Nucleic acid and corresponding protein entitled 161P2F10B useful in treatment and detection of cancer
WO2002083837A1 (en) * 2001-04-11 2002-10-24 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for identifying small molecules that bind specific rna structural motifs
US20060228730A1 (en) * 2001-04-11 2006-10-12 Rando Robert F Methods for identifying small molecules that bind specific RNA structural motifs
WO2002083822A2 (en) * 2001-04-13 2002-10-24 Mitrovich Michael J Solid lubricant and composition
US6914123B2 (en) 2001-04-17 2005-07-05 Genentech, Inc. Hairpin peptides with a novel structural motif and methods relating thereto
US7803982B2 (en) 2001-04-20 2010-09-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of New York University T1R3 transgenic animals, cells and related methods
CZ20033143A3 (en) 2001-05-21 2004-04-14 Aclara Biosciences, Inc. Methods and compositions for analyzing proteins
US20050164515A9 (en) * 2001-06-05 2005-07-28 Belcher Angela M. Biological control of nanoparticle nucleation, shape and crystal phase
US20030148380A1 (en) * 2001-06-05 2003-08-07 Belcher Angela M. Molecular recognition of materials
US20030113714A1 (en) * 2001-09-28 2003-06-19 Belcher Angela M. Biological control of nanoparticles
EP1406493A4 (en) 2001-06-11 2006-06-14 Xenoport Inc ADMINISTRATION OF MEDIUM BY THE PEPT-2 TRANSPORTER
US7727713B2 (en) 2001-06-20 2010-06-01 Nuevolution A/S Templated molecules and methods for using such molecules
US7262063B2 (en) 2001-06-21 2007-08-28 Bio Array Solutions, Ltd. Directed assembly of functional heterostructures
EP2293067B1 (en) 2001-06-26 2016-04-20 Senomyx, Inc. T1R hetero-oligomeric taste receptors and cell lines that express said receptors and use thereof for identification of taste compounds
CA2453403C (en) 2001-07-09 2013-10-08 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of inhibiting amyloid toxicity
US6800449B1 (en) * 2001-07-13 2004-10-05 Syngenta Participations Ag High throughput functional proteomics
US7413870B2 (en) 2001-08-01 2008-08-19 Rigel Pharmaceuticals, Incorporated SAK: modulation of cellular proliferation for treatment of cancer
US6767731B2 (en) * 2001-08-27 2004-07-27 Intel Corporation Electron induced fluorescent method for nucleic acid sequencing
TW573125B (en) * 2001-08-29 2004-01-21 Combinatorx Inc A screening system for identifying drug-drug interactions and methods of use thereof
US20030073104A1 (en) * 2001-10-02 2003-04-17 Belcher Angela M. Nanoscaling ordering of hybrid materials using genetically engineered mesoscale virus
JP4377689B2 (ja) 2001-10-15 2009-12-02 バイオアレイ ソリューションズ リミテッド 同時尋問及び酵素仲介検出による多型遺伝子座の複合分析
DK1440083T3 (da) 2001-10-25 2013-03-25 Medical Res Council Molekyler
US6670142B2 (en) 2001-10-26 2003-12-30 The Regents Of The University Of California Method for screening combinatorial bead library, capturing cells from body fluids, and ligands for cancer cells
US7262269B2 (en) 2001-10-26 2007-08-28 The Regents Of University Of California Method for screening combinational bead library; ligands for cancer cells
WO2003056298A2 (en) * 2001-11-06 2003-07-10 Agilix Corporation Sensitive coded detection systems
CA2467836A1 (en) * 2001-11-20 2003-09-04 Duke University Interfacial biomaterials
US7871619B2 (en) 2001-11-30 2011-01-18 Chemocentryx, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diseases and conditions related to chemokine receptors
AU2002349905A1 (en) * 2001-12-17 2003-06-30 Ribapharm Inc. Nucleoside libraries and compounds by mcc combinatorial strategies on solid support
US7291456B2 (en) 2002-01-24 2007-11-06 The Regents Of The University Of California Method for determining differences in molecular interactions and for screening a combinatorial library
JP2005516336A (ja) * 2002-01-28 2005-06-02 バースタイン テクノロジーズ，インコーポレイティド 論理的なトリガのための方法および装置
WO2003064998A2 (en) * 2002-01-31 2003-08-07 Burstein Technologies, Inc. Method for triggering through disc grooves and related optical analysis discs and system
AU2003209054A1 (en) * 2002-02-07 2003-09-02 Discovery Genomics, Inc. Factors for angiogenesis, vasculogenesis, cartilage formation, bone formation and methods of use thereof
US7091331B2 (en) 2002-03-04 2006-08-15 Bristol-Myers Squibb Company Nucleic acid molecules and polypeptides encoding baboon TAFI
EP1487978B1 (en) 2002-03-15 2008-11-19 Nuevolution A/S An improved method for synthesising templated molecules
US7544767B2 (en) 2002-04-05 2009-06-09 Burnham Institute For Medical Research HMGN2 peptides and related molecules that selectively home to tumor blood vessels and tumor cells
US20060275753A1 (en) * 2002-04-15 2006-12-07 Hammond David J Recovery of analytes using combinatorial libraries
US7217507B2 (en) 2002-04-15 2007-05-15 The American National Red Cross Method for detecting ligands and targets in a mixture
WO2004037848A2 (en) * 2002-05-17 2004-05-06 Slanetz Alfred E Process for determining target function and identifying drug leads
US7893218B2 (en) 2003-06-16 2011-02-22 Stowers Institute For Medical Research Antibodies that specifically bind SOST peptides
US7291461B2 (en) * 2002-06-21 2007-11-06 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for identifying small molecules that modulate premature translation termination and nonsense mRNA decay
US20100168037A1 (en) * 2002-07-03 2010-07-01 Bio Science International, Inc. Peptides comprising aromatic d-amino acids and methods of use
DE60332115D1 (de) 2002-07-11 2010-05-27 American Nat Red Cross Verfahren zur identifizierung einzelner aktiver einheiten aus komplexen gemischen
US7301006B2 (en) * 2002-07-16 2007-11-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and materials for the synthesis of modified peptides
WO2004010106A2 (en) * 2002-07-24 2004-01-29 Ptc Therapeutics, Inc. METHODS FOR IDENTIFYING SMALL MOLEDULES THAT MODULATE PREMATURE TRANSLATION TERMINATION AND NONSENSE MEDIATED mRNA DECAY
US10730906B2 (en) 2002-08-01 2020-08-04 Nuevolutions A/S Multi-step synthesis of templated molecules
AU2003243151A1 (en) 2002-08-16 2004-03-03 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 251p5g2 useful in treatment and detection of cancer
EP1534340B1 (en) 2002-09-06 2011-11-16 Cerulean Pharma Inc. Cyclodextrin-based polymers for delivering the therapeutic agents covalently bound thereto
US7157228B2 (en) * 2002-09-09 2007-01-02 Bioarray Solutions Ltd. Genetic analysis and authentication
US20050064508A1 (en) * 2003-09-22 2005-03-24 Semzyme Peptide mediated synthesis of metallic and magnetic materials
CA2502610A1 (en) * 2002-10-16 2005-01-13 Board Of Regents Of The University Of Texas System Bead bound combinatorial oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer libraries
WO2004038415A1 (en) * 2002-10-24 2004-05-06 Biacore Ab Assay with co-immobilized ligands
CN106337046B (zh) 2002-10-30 2021-03-23 纽韦卢森公司 合成双功能复合物的方法
WO2004047007A1 (en) 2002-11-15 2004-06-03 Bioarray Solutions, Ltd. Analysis, secure access to, and transmission of array images
ES2375958T3 (es) 2002-12-03 2012-03-07 Pathogen Removal And Diagnostic Technologies, Inc. Ligandos de prote�?nas priones y procedimientos de uso.
US20040185473A1 (en) * 2002-12-17 2004-09-23 Affymetrix, Inc. Releasable polymer arrays
WO2004056994A2 (en) 2002-12-19 2004-07-08 Nuevolution A/S Quasirandom structure and function guided synthesis methods
US7736909B2 (en) * 2003-01-09 2010-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising capture agents
AT413945B (de) * 2003-01-14 2006-07-15 Mattner Frank Dr Impfstoff für die alzheimer-krankheit
EP1597395A2 (en) 2003-02-21 2005-11-23 Nuevolution A/S Method for producing second-generation library
GB0305448D0 (en) * 2003-03-10 2003-04-16 Tcp Innovations Ltd Immunoassay
US20100022414A1 (en) * 2008-07-18 2010-01-28 Raindance Technologies, Inc. Droplet Libraries
US20040185499A1 (en) * 2003-03-20 2004-09-23 Jolley Michael E. Method of epitope scanning using fluorescence polarization
WO2004087933A2 (en) * 2003-03-28 2004-10-14 The Regents Of The University Of California A novel encoding method for 'one-bead one-compound' combinatorial libraries
WO2004085049A2 (en) * 2003-03-28 2004-10-07 The Regents Of The University Of California Preparation and application of encoded bead aggregates in combinatorial chemistry
GB0307428D0 (en) * 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Compartmentalised combinatorial chemistry
US20040235027A1 (en) * 2003-03-31 2004-11-25 Regent Of The University Of California Preparation and application of ligand-biopolymer conjugates
US20060078893A1 (en) * 2004-10-12 2006-04-13 Medical Research Council Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control
GB0307403D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Selection by compartmentalised screening
JP4783727B2 (ja) 2003-04-04 2011-09-28 パソゲン リムーバル アンド ダイアグノスティック テクノロジーズ インコーポレーテッド プリオンタンパク質結合物質と使用法
US7510848B2 (en) 2003-04-04 2009-03-31 North Carolina State University Prion protein binding materials and methods of use
US20040210036A1 (en) * 2003-04-15 2004-10-21 Nanogen, Inc. Peptide substrate libraries
EP1641555B1 (en) 2003-04-30 2020-12-02 Nexus Biosystems, Inc. Multi-well plate providing a high-density storage and assay platform
WO2005037053A2 (en) * 2003-05-23 2005-04-28 Board Of Regents - The University Of Texas System High throughput screening of aptamer libraries for specific binding to proteins on viruses and other pathogens
EP1635765B1 (en) * 2003-05-23 2013-07-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Structure based and combinatorially selected oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer targeting ap-1 transcription factors
ES2384622T3 (es) 2003-05-30 2012-07-10 Agensys, Inc. Variantes del antígeno de células madre de próstata (PSCA) y subsecuencias de las mismas
US7672791B2 (en) * 2003-06-13 2010-03-02 International Business Machines Corporation Method of performing three-dimensional molecular superposition and similarity searches in databases of flexible molecules
WO2005010016A2 (en) * 2003-07-24 2005-02-03 Board Of Regents Thioaptamers enable discovery of physiological pathways and new therapeutic strategies
NZ545747A (en) 2003-08-06 2010-06-25 Senomyx Inc T1R hetero-oligomeric taste receptors, cell lines that express said receptors, and taste compounds
WO2005029705A2 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Bioarray Solutions, Ltd. Number coding for identification of subtypes of coded types of solid phase carriers
DK1670939T3 (da) 2003-09-18 2010-03-01 Nuevolution As Fremgangsmåde til opnåelse af strukturel information om et kodet molekyle og fremgangsmåde til udvælgelse af forbindelser
JP4564959B2 (ja) 2003-09-22 2010-10-20 バイオアレイ ソリューションズ リミテッド 生体分子に共有結合できる、複数の官能基を持つ表面固定化高分子電解質
WO2005035552A2 (en) * 2003-10-07 2005-04-21 Genzyme Corporation Transducing combinatorial peptide library
CA2899287A1 (en) 2003-10-28 2005-05-12 Bioarray Solutions Ltd. Optimization of gene expression analysis using immobilized capture probes
AU2004287069B2 (en) 2003-10-29 2009-07-16 Bioarray Solutions, Ltd. Multiplexed nucleic acid analysis by fragmentation of double-stranded DNA
EP2369348A1 (en) 2003-11-07 2011-09-28 Ciphergen Biosystems, Inc. Biomarkers for Alzheimer's disease
EP1701611B1 (en) 2003-12-24 2011-05-18 G2 Inflammation Pty Ltd Transgenic non-human mammal comprising a polynucleotide encoding human or humanized c5ar
US20050164167A1 (en) * 2004-01-28 2005-07-28 Buscher Benjamin A. Method of discovery and development of broad-spectrum antiviral drugs
US20050221339A1 (en) * 2004-03-31 2005-10-06 Medical Research Council Harvard University Compartmentalised screening by microfluidic control
EP2394662B1 (en) 2004-04-02 2018-03-21 The Regents of The University of California Methods and compositions for treating and preventing disease associated with alpha v beta 5 integrin
US7794713B2 (en) 2004-04-07 2010-09-14 Lpath, Inc. Compositions and methods for the treatment and prevention of hyperproliferative diseases
EP3167961A1 (en) 2004-04-08 2017-05-17 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
US20050239134A1 (en) * 2004-04-21 2005-10-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial selection of phosphorothioate single-stranded DNA aptamers for TGF-beta-1 protein
US7939251B2 (en) 2004-05-06 2011-05-10 Roche Molecular Systems, Inc. SENP1 as a marker for cancer
EP1759212B1 (en) * 2004-05-25 2008-12-17 2Curex Identification of compounds modifying a cellular response
EP1753871B1 (en) 2004-05-28 2015-07-15 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to psca proteins
EP2453024B1 (en) 2004-06-21 2017-12-06 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Genes and pathways differentially expressed in bipolar disorder and/or major depressive disorder
JP4507080B2 (ja) * 2004-07-30 2010-07-21 東亞合成株式会社 抗菌ペプチド及びその利用
US7848889B2 (en) 2004-08-02 2010-12-07 Bioarray Solutions, Ltd. Automated analysis of multiplexed probe-target interaction patterns: pattern matching and allele identification
KR101400505B1 (ko) 2004-08-20 2014-05-28 버크 인스티튜트 포 에이지 리서치 Ｐ５３ 기능을 대체하거나 작동시키는 소형 분자
US7968287B2 (en) * 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
US7850960B2 (en) 2004-12-30 2010-12-14 University Of Washington Methods for regulation of stem cells
US8338093B2 (en) * 2004-12-31 2012-12-25 Affymetrix, Inc. Primer array synthesis and validation
US7547775B2 (en) 2004-12-31 2009-06-16 Affymetrix, Inc. Parallel preparation of high fidelity probes in an array format
JP2008529035A (ja) * 2005-02-03 2008-07-31 パーキンエルマー エルエーエス，インク． 多次元シグナルを用いる超高感度検出システム
WO2006094014A2 (en) 2005-02-28 2006-09-08 The Regents Of The University Of California Methods for diagnosis and treatment of endometrial cancer
WO2006099386A2 (en) * 2005-03-11 2006-09-21 Massachusetts Institute Of Technology Synthesis and use of colloidal iii-v nanoparticles
JP2008532559A (ja) 2005-03-19 2008-08-21 メディカル リサーチ カウンシル ウイルス感染の治療及び予防又は治療及び予防の改善
EP1866328B1 (en) 2005-03-22 2011-01-12 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. Peptides which increase collagen or hyaluronic acid production
EP1869230B1 (en) 2005-03-23 2017-08-30 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for purifying proteins
CA2603093A1 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 161p2f10b proteins
US8318906B2 (en) 2005-04-15 2012-11-27 The Regents Of The University Of California EMP2 antibodies and their therapeutic uses
US20070099830A1 (en) 2005-04-21 2007-05-03 Massachusetts Institute Of Technology Sirt4 activities
WO2006124644A2 (en) * 2005-05-12 2006-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protein and antibody profiling using small molecule microarrays
US8486629B2 (en) 2005-06-01 2013-07-16 Bioarray Solutions, Ltd. Creation of functionalized microparticle libraries by oligonucleotide ligation or elongation
US20070021433A1 (en) 2005-06-03 2007-01-25 Jian-Qiang Fan Pharmacological chaperones for treating obesity
EP1904093B1 (en) 2005-07-19 2018-06-13 Stemgen S.P.A. Inhibition of the tumorigenic potential of tumor stem cells by bmp-4
EP1945809B1 (en) * 2005-08-16 2012-06-27 The Children's Mercy Hospital Quantification of microsphere suspension hybridization and uses thereof
US7943134B2 (en) 2005-08-31 2011-05-17 Academia Sinica Compositions and methods for identifying response targets and treating flavivirus infection responses
US7781209B2 (en) 2005-09-25 2010-08-24 Multispan, Inc. GPCR-expressing cell lines
EP1937718B1 (en) 2005-10-20 2017-12-06 Senomyx, Inc. Chimeric human sweet-umami and umami-sweet taste receptors
US8119572B2 (en) 2005-10-24 2012-02-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods for determining protein binding specificity using peptide libraries
JP2009514535A (ja) 2005-11-03 2009-04-09 レッドポイント バイオ コーポレイション Ｔｒｐｍ５イオンチャネルのためのハイスループットスクリーニングアッセイ
CN101500592A (zh) 2005-11-07 2009-08-05 斯克利普斯研究院 控制组织因子信号转导特异性的组合物和方法
US20090019557A1 (en) 2005-11-12 2009-01-15 Huda Akil Fgf2-related methods for diagnosing and treating depression
US7576037B2 (en) 2005-11-18 2009-08-18 Mei Technologies, Inc. Process and apparatus for combinatorial synthesis
DK2336315T3 (da) 2005-12-01 2017-11-06 Nuevolution As Fremgangsmåde til enzymatisk kodning ved effektiv syntese af store biblioteker
GB2433591A (en) * 2005-12-20 2007-06-27 Sharp Kk Method for functionalising a hydrophobic substrate
GB2433506A (en) * 2005-12-20 2007-06-27 Sharp Kk A method of producing a multimeric capture agent
GB2433505A (en) * 2005-12-20 2007-06-27 Sharp Kk Capture agents for binding a ligand
EP1976567B1 (en) 2005-12-28 2020-05-13 The Scripps Research Institute Natural antisense and non-coding rna transcripts as drug targets
EP3913375A1 (en) * 2006-01-11 2021-11-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microfluidic devices and methods of use in the formation and control of nanoreactors
US8859209B2 (en) * 2006-01-12 2014-10-14 Carviar Aps Reimmunization and antibody design
WO2007092777A2 (en) * 2006-02-02 2007-08-16 Wyeth Cloning, characterization, and application of tnfrsf19 in neurological disorders
EP2390666A1 (en) 2006-03-21 2011-11-30 The Regents of The University of California N-Cadherin as target for cancer diagnosis and therapy
US20100278821A1 (en) 2006-03-21 2010-11-04 The Regents Of The University Of California N-cadherin: target for cancer diagnosis and therapy
KR101387563B1 (ko) 2006-04-21 2014-04-25 세노믹스, 인코포레이티드 고효능의 조미용 향료를 포함하는 식품 조성물 및 이의 제조 방법
CA2649295A1 (en) * 2006-04-21 2007-11-01 Wyeth Methods for high-throughput screening of cell lines
US8859233B2 (en) * 2006-05-02 2014-10-14 Carviar Aps Method for immunizing an avian species
JP4785919B2 (ja) 2006-05-02 2011-10-05 学校法人帝京大学 グルタチオン増加物質のスクリーニング方法
EP2481815B1 (en) * 2006-05-11 2016-01-27 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
US7862812B2 (en) 2006-05-31 2011-01-04 Lpath, Inc. Methods for decreasing immune response and treating immune conditions
DE602006012460D1 (de) 2006-06-07 2010-04-08 Nutrinova Gmbh Verfahren zum Screening von Substanzen die die Aktivität von Gpcrs modulieren
US7572618B2 (en) 2006-06-30 2009-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding novel PCSK9 variants
WO2008013861A2 (en) 2006-07-27 2008-01-31 Redpoint Bio Corporation Screening assay for inhibitors of trpa1 activation by a lower alkyl phenol
WO2008021123A1 (en) 2006-08-07 2008-02-21 President And Fellows Of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
EP2423333A1 (en) 2006-08-25 2012-02-29 Oncotherapy Science, Inc. Prognostic markers and therapeutic targets for lung cancer
NZ575090A (en) 2006-09-06 2012-02-24 Univ California Molecular diagnosis and classification of malignant melanoma using RGS1, ARPC2, FN1, SPP1 and WNT-2 polypeptide markers
US20090252745A1 (en) * 2006-09-15 2009-10-08 Duke University Amino acids in the HCV core polypeptide domain 3 and correlation with steatosis
US20110294782A1 (en) 2006-11-10 2011-12-01 Massachusetts Institute Of Technology Small molecule pak inhibitors
WO2008067196A2 (en) 2006-11-16 2008-06-05 The Regents Of The University Of California Methods for identifying inhibitors of solute transporters
CA2672420A1 (en) 2006-12-29 2008-07-10 The Salk Institute For Biological Studies Methods for enhancing exercise performance
JP2010516625A (ja) 2007-01-24 2010-05-20 インサート セラピューティクス， インコーポレイテッド 制御された薬物送達のためのテザー基を有するポリマー−薬物コンジュゲート
WO2008097559A2 (en) 2007-02-06 2008-08-14 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
WO2008130623A1 (en) 2007-04-19 2008-10-30 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
US20080269065A1 (en) * 2007-04-30 2008-10-30 Syntrix Biosystems, Inc. Conformationally Constrained Analytical Probes
KR101440153B1 (ko) * 2007-05-09 2014-09-15 재단법인서울대학교산학협력재단 펩타이드 라이브러리를 이용한 단백질 인산화 효소의기질특이성 분석 방법
AU2008287542C1 (en) 2007-06-01 2015-01-22 The Trustees Of Princeton University Treatment of viral infections by modulation of host cell metabolic pathways
US10092524B2 (en) 2008-06-11 2018-10-09 Edge Therapeutics, Inc. Compositions and their use to treat complications of aneurysmal subarachnoid hemorrhage
WO2008154585A1 (en) * 2007-06-11 2008-12-18 Macdonald R Loch A drug delivery system for the prevention of cerebral vasospasm
US9364432B2 (en) 2007-06-11 2016-06-14 Edge Therapeutics, Inc. Intraventricular drug delivery system for improving outcome after a brain injury affecting cerebral blood flow
US8334239B2 (en) * 2007-07-10 2012-12-18 The Board Of Regents Of The University Of Texas System High affinity VEGF-receptor antagonists
WO2009021077A2 (en) * 2007-08-06 2009-02-12 THE GOVERMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA. as represented by THE SECRETARY OF THE NAVY Beta helical peptide structures stable in aqueous and non-aqueous media and methods for preparing same
US8703161B2 (en) * 2007-08-13 2014-04-22 Elc Management, Llc Skin repair compositions comprising circadian gene activators and a synergistic combination of Sirt1 gene activators
ES2477271T3 (es) 2007-08-13 2014-07-16 Baxter International Inc. Modulación por IVIG de quimioquinas para el tratamiento de la esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson
NZ583350A (en) 2007-08-21 2012-03-30 Senomyx Inc Heteroaryl-hydantoin derivatives as bitter taste inhibitors
US7875452B2 (en) 2007-10-01 2011-01-25 Redpoint Bio Corporation Non-desensitizing mutant of the transient receptor potential TRPM5 ion channel
ES2629440T5 (es) 2007-10-04 2020-11-20 Zymogenetics Inc zB7H6 miembro de la familia B7 y composiciones y métodos relacionados
WO2011063161A2 (en) 2009-11-20 2011-05-26 The Regents Of The University Of California Epithelial membrane protein-2 (emp2) and proliferative vitreoretinopathy (pvr)
CA2703165A1 (en) 2007-10-22 2009-04-30 The Regents Of The University Of California Biomarkers for prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus
JP2011514881A (ja) 2007-11-09 2011-05-12 ザ ソルク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ 免疫増強剤としてのｔａｍ受容体阻害剤の使用および免疫抑制剤としてのｔａｍ活性化剤の使用
WO2009079373A2 (en) 2007-12-14 2009-06-25 The Regents Of The University Of California Inhibitors of calcium-activated chloride channels
EP2077272A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-08 Affibody AB Polypeptide libraries with a predetermined scaffold
US9187535B2 (en) 2007-12-19 2015-11-17 Affibody Ab Polypeptide derived from protein A and able to bind PDGF
EP2072525A1 (en) 2007-12-21 2009-06-24 Affibody AB New polypeptides having affinity for HER2
PT2518509E (pt) 2008-03-05 2014-09-01 Univ California Diagnóstico molecular e classificação de melanoma maligno com base em marcadores seleccionados da listagem que consiste em rgs1, ncoa3, spp1, phip
RU2010139426A (ru) 2008-03-17 2012-04-27 Зе Скрипс Ресеч Инститьют (Us) Комбинация химического и генетического подходов к получению индуцированных плюрипотентных стволовых клеток
EP2278879B1 (en) 2008-04-21 2016-06-15 PATH Drug Solutions Compounds, compositions and methods comprising oxadiazole derivatives
WO2009132020A2 (en) 2008-04-21 2009-10-29 The Regents Of The University Of California Selective high-affinity polydentate ligands and methods of making such
JP2010043063A (ja) 2008-05-09 2010-02-25 Agency For Science Technology & Research 川崎病の診断及び治療
EP2300828B1 (en) 2008-07-01 2018-09-05 Genocea Biosciences Inc. Antigen screening system
US20110262485A1 (en) 2008-08-04 2011-10-27 University Of Miami Sting (stimulator of interferon genes), a regulator of innate immune responses
WO2010022249A2 (en) 2008-08-20 2010-02-25 Ensemble Discovery Corporation Macrocyclic compounds for inhibition of tumor necrosis factor alpha
CN102224254A (zh) 2008-09-23 2011-10-19 哈佛大学校长及研究员协会 Sirt4及其用途
WO2010036866A1 (en) 2008-09-25 2010-04-01 University Of Guelph Nitrogen responsive early nodulin gene
JP5390621B2 (ja) 2008-10-20 2014-01-15 グワンジュ・インスティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー 二座ペプチドバインダー
CA2779958A1 (en) 2008-11-06 2010-05-14 University Of Miami Role of soluble upar in the pathogenesis of proteinuric kidney disease
EP2352847B1 (en) 2008-11-10 2014-01-08 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Gene signature for predicting prognosis of patients with solid tumors
WO2010060599A1 (en) 2008-11-27 2010-06-03 Roche Diagnostics Gmbh Directed synthesis of oligophosphoramidate stereoisomers
CA2995883C (en) 2008-12-03 2023-01-24 The Scripps Research Institute Compounds and methods for stabilizing cell cultures
US8927511B2 (en) 2008-12-04 2015-01-06 Curna, Inc. Treatment of vascular endothelial growth factor (VEGF) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to VEGF
US20110294870A1 (en) 2008-12-04 2011-12-01 Opko Curna, Llc Treatment of tumor suppressor gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to the gene
US8921329B2 (en) 2008-12-04 2014-12-30 Curna, Inc. Treatment of erythropoietin (EPO) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to EPO
WO2010077894A2 (en) 2008-12-16 2010-07-08 Bristol-Myers Squibb Company Methods of inhibiting quiescent tumor proliferation
EP3312269A1 (en) 2008-12-17 2018-04-25 The Scripps Research Institute Generation and maintenance of stem cells
US20120165650A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 General Electric Company Her2 binders
CN101768213B (zh) 2008-12-30 2012-05-30 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种与植物分蘖数目相关的蛋白及其编码基因与应用
DK2396038T3 (en) 2009-02-12 2016-02-01 Curna Inc TREATMENT OF BRAIN-DERIVATED NEUROTROPHIC FACTOR- (BDNF) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENCE TRANSCRIPTION TO BDNF
CN101817879A (zh) 2009-02-26 2010-09-01 中国科学院遗传与发育生物学研究所 金属硫蛋白及其编码基因与应用
EP2408919B1 (en) 2009-03-16 2017-10-18 CuRNA, Inc. Treatment of nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (nrf2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nrf2
EP2408920B1 (en) 2009-03-17 2017-03-08 CuRNA, Inc. Treatment of delta-like 1 homolog (dlk1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dlk1
US8528589B2 (en) 2009-03-23 2013-09-10 Raindance Technologies, Inc. Manipulation of microfluidic droplets
TW201039841A (en) 2009-03-27 2010-11-16 Gojo Ind Inc Compositions and methods for screening and using compounds antagonizing spore-surface interactions
US8343976B2 (en) 2009-04-20 2013-01-01 Institute For Oneworld Health Compounds, compositions and methods comprising pyrazole derivatives
WO2010129746A2 (en) 2009-05-06 2010-11-11 Curna, Inc. Treatment of tristetraproline (ttp) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ttp
WO2010129799A2 (en) 2009-05-06 2010-11-11 Curna, Inc. Treatment of lipid transport and metabolism gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a lipid transport and metabolism gene
WO2010129861A2 (en) 2009-05-08 2010-11-11 Curna, Inc. Treatment of dystrophin family related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dmd family
DK2432881T3 (en) 2009-05-18 2018-02-26 Curna Inc TREATMENT OF REPROGRAMMING FACTOR-RELATED DISEASES BY INHIBITING NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPTS TO A REPROGRAMMING FACTOR
WO2010135695A2 (en) 2009-05-22 2010-11-25 Curna, Inc. TREATMENT OF TRANSCRIPTION FACTOR E3 (TFE3) and INSULIN RECEPTOR SUBSTRATE 2 (IRS2) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO TFE3
US8791085B2 (en) 2009-05-28 2014-07-29 Curna, Inc. Treatment of antiviral gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an antiviral gene
KR101702689B1 (ko) 2009-06-16 2017-02-06 큐알엔에이, 인크. Ｐｏｎ1에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 파라옥소나제 1(ｐｏｎ1) 관련된 질환의 치료
EP2443237B1 (en) 2009-06-16 2017-02-22 CuRNA, Inc. Treatment of collagen gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a collagen gene
WO2010151671A2 (en) 2009-06-24 2010-12-29 Curna, Inc. Treatment of tumor necrosis factor receptor 2 (tnfr2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to tnfr2
EP2446037B1 (en) 2009-06-26 2016-04-20 CuRNA, Inc. Treatment of down syndrome gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a down syndrome gene
KR20120093151A (ko) * 2009-07-15 2012-08-22 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 개선된 바이오폴리머의 스크리닝
US20120122711A1 (en) * 2009-07-15 2012-05-17 Heath James R Screening of biopolymers
CN102648312B (zh) 2009-07-22 2014-03-05 新加坡科技研究局 同质量氨基酸和其它物质的区分
JP5755647B2 (ja) 2009-07-24 2015-07-29 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア αｖβ５インテグリンに関連する疾患の処置および予防のための方法および組成物
US20120252869A1 (en) 2009-07-24 2012-10-04 Opko Curna, Llc Treatment of sirtuin (sirt) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a sirtuin (sirt)
WO2011017516A2 (en) 2009-08-05 2011-02-10 Curna, Inc. Treatment of insulin gene (ins) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an insulin gene (ins)
CA2770104C (en) 2009-08-11 2019-03-19 Opko Curna, Llc Treatment of adiponectin (adipoq) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an adiponectin (adipoq)
CN105911275B (zh) 2009-08-14 2018-06-29 加利福尼亚大学董事会 诊断自闭症的试剂盒
US20120148604A1 (en) 2009-08-20 2012-06-14 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Trp inhibitors and uses thereof
JP5943836B2 (ja) 2009-08-21 2016-07-05 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド ‘ｈｓｐ７０相互作用タンパク質ｃ末端’（ｃｈｉｐ）に対する天然アンチセンス転写産物の阻害によるｃｈｉｐ関連疾患の治療
US20120189578A1 (en) 2009-08-24 2012-07-26 St. Jude Children's Research Hospital Compositions and methods for potentiating interleukin-35
CA2771172C (en) 2009-08-25 2021-11-30 Opko Curna, Llc Treatment of 'iq motif containing gtpase activating protein' (iqgap) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to iqgap
NO2480669T3 (ro) 2009-09-25 2018-04-07
WO2011042564A1 (en) 2009-10-09 2011-04-14 Universite De Strasbourg Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof
ES2365343B1 (es) 2009-11-19 2012-07-10 Fundación Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii Uso de cd98 como marcador de receptividad endometrial.
BR112012012210B8 (pt) * 2009-11-23 2021-05-25 Cerulean Pharma Inc conjugado de (cdp)-taxano de polímero contendo ciclodextrina, composição, composição farmacêutica, forma de dosagem, kit e uso de um conjugado de cdp-taxano
JP6025567B2 (ja) 2009-12-16 2016-11-16 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド 膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ｍｂｔｐｓ１）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるｍｂｔｐｓ１関連性疾患の治療
WO2011079176A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic systems and methods for reducing the exchange of molecules between droplets
JP6031356B2 (ja) 2009-12-23 2016-11-24 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド Ｕｃｐ２に対する天然アンチセンス転写産物の阻害による脱共役タンパク質２（ｕｃｐ２）関連疾患の治療
EP2516648B1 (en) 2009-12-23 2017-11-08 CuRNA, Inc. Treatment of hepatocyte growth factor (hgf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to hgf
KR101853508B1 (ko) 2009-12-29 2018-06-20 큐알엔에이, 인크. 종양 단백질 63 (ｐ63)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 ｐ63에 관련된 질환의 치료
CA2785173A1 (en) 2009-12-29 2011-07-28 Curna, Inc. Treatment of nuclear respiratory factor 1 (nrf1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nrf1
CN102791862B (zh) 2009-12-31 2017-04-05 库尔纳公司 通过抑制胰岛素受体底物2(irs2)和转录因子e3(tfe3)的天然反义转录物而治疗irs2相关疾病
NO2521784T3 (ro) 2010-01-04 2018-05-05
CN102822342B (zh) 2010-01-06 2017-05-10 库尔纳公司 通过抑制胰腺发育基因的天然反义转录物而治疗胰腺发育基因相关疾病
US9200277B2 (en) 2010-01-11 2015-12-01 Curna, Inc. Treatment of sex hormone binding globulin (SHBG) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to SHBG
EP2525905B1 (en) 2010-01-19 2020-11-04 Illumina, Inc. Methods and compositions for processing chemical reactions
WO2011091435A2 (en) 2010-01-25 2011-07-28 Mount Sinai School Of Medicine Methods of treating liver disease
US8946182B2 (en) 2010-01-25 2015-02-03 Curna, Inc. Treatment of RNASE H1 related diseases by inhibition of natural antisense transcript to RNASE H1
WO2011094759A2 (en) 2010-02-01 2011-08-04 The Regents Of The University Of California Novel diagnostic and therapeutic targets associated with or regulated by n-cadherin expression and/or epithelial to mesenchymal transition (emt) in prostate cancer and other malignancies
US10351905B2 (en) 2010-02-12 2019-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
US9366632B2 (en) 2010-02-12 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
JP5934657B2 (ja) 2010-02-12 2016-06-15 レインダンス テクノロジーズ， インコーポレイテッド デジタル検体分析
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
EP2539452B1 (en) 2010-02-22 2016-07-27 CuRNA, Inc. Treatment of pyrroline-5-carboxylate reductase 1 (pycr1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to pycr1
KR101877065B1 (ko) 2010-04-02 2018-07-10 큐알엔에이, 인크. 집락 자극 인자 3 (ｃｓｆ3)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 집락 자극 인자 3 (ｃｓｆ3) 관련된 질환의 치료
RU2610661C2 (ru) 2010-04-09 2017-02-14 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с фактором роста фибробластов 21 (fgf21), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к fgf21
EP3540059A1 (en) 2010-04-16 2019-09-18 Nuevolution A/S Bi-functional complexes and methods for making and using such complexes
JP2013525483A (ja) 2010-05-03 2013-06-20 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド サーチュイン（ｓｉｒｔ）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるサーチュイン（ｓｉｒｔ）関連疾患の治療
TWI531370B (zh) 2010-05-14 2016-05-01 可娜公司 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病
US8895528B2 (en) 2010-05-26 2014-11-25 Curna, Inc. Treatment of atonal homolog 1 (ATOH1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ATOH1
WO2011150007A2 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Opko Curna Llc Treatment of methionine sulfoxide reductase a (msra) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to msra
EP2400304A1 (en) 2010-06-22 2011-12-28 Centro de Investigación Cooperativa En Biomateriales ( CIC biomaGUNE) Method for the characterization of intermolecular interactions
RU2588654C2 (ru) 2010-06-23 2016-07-10 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с альфа-субъединицей потенциалзависимого натриевого канала (scna), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена scna
EP2593547B1 (en) 2010-07-14 2017-11-15 CuRNA, Inc. Treatment of discs large homolog (dlg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dlg
EP2598660B1 (en) 2010-07-26 2017-03-15 Biomatrica, INC. Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
CA2806734A1 (en) 2010-07-26 2012-02-09 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
WO2012026887A1 (en) * 2010-08-27 2012-03-01 Agency For Science, Technology And Research Peptide libraries for screening and other applications
EP2622103B2 (en) 2010-09-30 2022-11-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Sandwich assays in droplets
CN103210086B (zh) 2010-10-06 2017-06-09 库尔纳公司 通过抑制唾液酸酶4(neu4)的天然反义转录物而治疗neu4相关疾病
WO2012052391A1 (en) 2010-10-19 2012-04-26 Glaxo Group Limited Polypeptide with jmjd3 catalytic activity
CN103180445B (zh) 2010-10-22 2018-02-16 库尔纳公司 通过抑制α‑L‑艾杜糖醛酸酶(IDUA)的天然反义转录物而治疗IDUA相关疾病
WO2012068340A2 (en) 2010-11-18 2012-05-24 Opko Curna Llc Antagonat compositions and methods of use
WO2012074855A2 (en) 2010-11-22 2012-06-07 The Regents Of The University Of California Methods of identifying a cellular nascent rna transcript
JP6071893B2 (ja) 2010-11-23 2017-02-01 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド Ｎａｎｏｇへの天然アンチセンス転写物の阻害によるｎａｎｏｇ関連疾患の治療
US9732319B2 (en) 2010-12-22 2017-08-15 Fate Therapeutics, Inc. Cell culture platform for single cell sorting and enhanced reprogramming of iPSCs
WO2012109495A1 (en) 2011-02-09 2012-08-16 Metabolic Solutions Development Company, Llc Cellular targets of thiazolidinediones
EP3859011A1 (en) 2011-02-11 2021-08-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods for forming mixed droplets
EP2675893B1 (en) 2011-02-18 2019-01-09 The Scripps Research Institute Directed differentiation of oligodendrocyte precursor cells to a myelinating cell fate
WO2012112804A1 (en) 2011-02-18 2012-08-23 Raindance Technoligies, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
WO2012119989A2 (en) 2011-03-04 2012-09-13 Oryzon Genomics, S.A. Methods and antibodies for the diagnosis and treatment of cancer
EP2681327B1 (en) 2011-03-04 2018-11-21 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing protein
US20120301904A1 (en) 2011-04-26 2012-11-29 Prosetta Antiviral, Inc Multiprotein assemblies
CA2835942C (en) 2011-05-19 2019-01-22 Sequenom, Inc. Products and processes for multiplex nucleic acid identification
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
EP3709018A1 (en) 2011-06-02 2020-09-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microfluidic apparatus for identifying components of a chemical reaction
WO2012170742A2 (en) 2011-06-07 2012-12-13 University Of Hawaii Treatment and prevention of cancer with hmgb1 antagonists
US9244074B2 (en) 2011-06-07 2016-01-26 University Of Hawaii Biomarker of asbestos exposure and mesothelioma
CN103620036B (zh) 2011-06-09 2016-12-21 库尔纳公司 通过抑制共济蛋白(fxn)的天然反义转录物而治疗fxn 相关疾病
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
US9725490B2 (en) 2011-07-29 2017-08-08 Tokushima University ERAP1-derived peptide and use thereof
EP2751112B1 (en) 2011-09-02 2019-10-09 The Regents of The University of California Substituted pyrazolo[3,4-d]pyrimidines and uses thereof
CN103874486A (zh) 2011-09-06 2014-06-18 库尔纳公司 用小分子治疗与电压门控钠通道的α亚基(SCNxA)相关的疾病
CN104023760A (zh) 2011-10-28 2014-09-03 普莱萨格生命科学公司 药物递送方法
EP2790687B1 (en) 2011-12-16 2018-08-29 Poseida Therapeutics, Inc. Trpc4 modulators for use in the treatment or prevention of pain
WO2013119845A1 (en) 2012-02-07 2013-08-15 Vibrant Holdings, Llc Substrates, peptide arrays, and methods
WO2013123305A1 (en) 2012-02-16 2013-08-22 The Penn State Research Foundation Modulators of acyl-coa lysocardiolipin acyltransferase 1 ( alcat1) and uses thereof
WO2013138463A1 (en) 2012-03-14 2013-09-19 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Neurofibromatoses therapeutic agents and screening for same
TR201815503T4 (tr) 2012-03-15 2018-11-21 Curna Inc Beyin kaynaklı nörotrofik faktör (bknf) ile ilişkili hastalıkların doğal antisens transkriptinin bknf'ye inhibisyonu ile muamelesi.
CN104379563B (zh) 2012-04-10 2018-12-21 加利福尼亚大学董事会 用于治疗癌症的组合物和方法
CN104520315A (zh) 2012-04-24 2015-04-15 迈阿密大学 Perforin 2 对侵袭性且多药耐受的病原体的防御
US9399019B2 (en) 2012-05-09 2016-07-26 Evonik Corporation Polymorph compositions, methods of making, and uses thereof
EP2855425A4 (en) 2012-06-04 2016-05-18 Scripps Research Inst NOVEL PHENYL GLYOXIC STOCKS
EP2877211A4 (en) 2012-07-25 2016-02-10 Salk Inst For Biological Studi REGULATION OF THE INTERACTION BETWEEN TAM LIGANDS AND LIPID MEMBRANES CONTAINING PHOSPHATIDYLSERIN
US9750705B2 (en) 2012-08-31 2017-09-05 The Regents Of The University Of California Agents useful for treating obesity, diabetes and related disorders
JP2015532287A (ja) 2012-09-26 2015-11-09 ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイー・オブ・カリフオルニア Ｉｒｅ１の調節
US10006909B2 (en) 2012-09-28 2018-06-26 Vibrant Holdings, Llc Methods, systems, and arrays for biomolecular analysis
WO2014055493A1 (en) 2012-10-02 2014-04-10 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for polymer precipitation and generation of particles
AU2013204200B2 (en) 2012-10-11 2016-10-20 Brandeis University Treatment of amyotrophic lateral sclerosis
EP2912194B1 (en) 2012-10-26 2019-05-08 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Androgen receptor variants and methods for making and using
US20140120116A1 (en) 2012-10-26 2014-05-01 The Chinese University Of Hong Kong Treatment of cancer using smad3 inhibitor
US10286376B2 (en) 2012-11-14 2019-05-14 Vibrant Holdings, Llc Substrates, systems, and methods for array synthesis and biomolecular analysis
AU2013359429A1 (en) 2012-12-10 2015-07-09 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods for screening
US9725703B2 (en) 2012-12-20 2017-08-08 Biomatrica, Inc. Formulations and methods for stabilizing PCR reagents
US20140288097A1 (en) 2013-02-07 2014-09-25 The Regents Of The University Of California Use of translational profiling to identify target molecules for therapeutic treatment
EP2956771B1 (en) 2013-02-15 2020-04-08 Vibrant Holdings, LLC Methods and compositions for amplified electrochemiluminescence detection
UY35464A (es) 2013-03-15 2014-10-31 Araxes Pharma Llc Inhibidores covalentes de kras g12c.
US9428537B2 (en) 2013-03-15 2016-08-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University tRNA derived small RNAs (tsRNAs) involved in cell viability
US20160083698A1 (en) 2013-04-19 2016-03-24 The Regents Of The University Of California Lone star virus
US10626178B2 (en) 2013-08-21 2020-04-21 Raz Yirmiya Treatment of mood and stress related disorders
US9950036B2 (en) 2013-08-21 2018-04-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Treatment of mood and stress related disorders
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
JO3805B1 (ar) 2013-10-10 2021-01-31 Araxes Pharma Llc مثبطات كراس جي12سي
US9644037B2 (en) 2013-10-18 2017-05-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibodies that specifically bind ataxia telangiectasia-mutated and RAD3-related kinase phosphorylated at position 1989 and their use
CN105979780A (zh) 2013-12-11 2016-09-28 斯隆-凯特林癌症研究院 治疗前列腺癌的糖皮质激素抑制剂
EP3080122B1 (en) 2013-12-11 2018-10-31 Biogen MA Inc. Biaryl compounds useful for the treatment of human diseases in oncology, neurology and immunology
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
WO2015103367A1 (en) 2013-12-31 2015-07-09 Raindance Technologies, Inc. System and method for detection of rna species
EP3805369A1 (en) 2014-03-04 2021-04-14 Fate Therapeutics, Inc. Improved reprogramming methods and cell culture platforms
WO2015136509A2 (en) 2014-03-14 2015-09-17 Genesis Theranostix Korlatolt Felelossegu Tarsasag Diagnostic and therapeutic targets for preeclampsia and closely related complications of pregnancy
EP3154338B1 (en) 2014-06-10 2020-01-29 Biomatrica, INC. Stabilization of thrombocytes at ambient temperatures
JO3556B1 (ar) 2014-09-18 2020-07-05 Araxes Pharma Llc علاجات مدمجة لمعالجة السرطان
WO2016049524A1 (en) 2014-09-25 2016-03-31 Araxes Pharma Llc Inhibitors of kras g12c mutant proteins
US10011600B2 (en) 2014-09-25 2018-07-03 Araxes Pharma Llc Methods and compositions for inhibition of Ras
CA2981530A1 (en) 2015-04-10 2016-10-13 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use thereof
EP3283462B1 (en) 2015-04-15 2020-12-02 Araxes Pharma LLC Fused-tricyclic inhibitors of kras and methods of use thereof
CN114350766A (zh) 2015-04-24 2022-04-15 基纳生物技术有限公司 检测和定量次要变体的并行式方法
WO2016172571A1 (en) 2015-04-24 2016-10-27 Agena Bioscience, Inc. Multiplexed method for the identification and quantitation of minor alleles and polymorphisms
WO2016195982A2 (en) 2015-06-01 2016-12-08 The Penn State Research Foundation Hepatitis b virus capsid assembly
US20160370380A1 (en) * 2015-06-16 2016-12-22 Pharmaseq, Inc. Combinatorial antibody diagnostic
WO2016209772A2 (en) 2015-06-22 2016-12-29 Proteovista Llc Snp arrays
WO2016207313A1 (en) 2015-06-24 2016-12-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and kits for detecting protein-protein interactions
US10144724B2 (en) 2015-07-22 2018-12-04 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use thereof
US10647981B1 (en) 2015-09-08 2020-05-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid library generation methods and compositions
US10689356B2 (en) 2015-09-28 2020-06-23 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
US10647703B2 (en) 2015-09-28 2020-05-12 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
US10730867B2 (en) 2015-09-28 2020-08-04 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
EP3356359B1 (en) 2015-09-28 2021-10-20 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
US10875842B2 (en) 2015-09-28 2020-12-29 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
US10858343B2 (en) 2015-09-28 2020-12-08 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
WO2017058915A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Araxes Pharma Llc Inhibitors of kras g12c mutant proteins
AU2016338680B2 (en) 2015-10-16 2022-11-17 Fate Therapeutics, Inc. Platform for the induction and maintenance of ground state pluripotency
EP3364977A4 (en) 2015-10-19 2019-09-04 Araxes Pharma LLC PROCESS FOR SCREENING INHIBITORS OF RAS
US10414757B2 (en) 2015-11-16 2019-09-17 Araxes Pharma Llc 2-substituted quinazoline compounds comprising a substituted heterocyclic group and methods of use thereof
CN108700498B (zh) 2015-12-08 2021-07-13 生物马特里卡公司 降低红细胞沉降速率
US9988357B2 (en) 2015-12-09 2018-06-05 Araxes Pharma Llc Methods for preparation of quinazoline derivatives
EP3413921A4 (en) 2016-02-09 2019-08-14 Alexander Krantz SELECTIVE PROTEIN SITE FUNCTIONALIZATION USING TRACE-FREE AFFINITY MARKERS
US10822312B2 (en) 2016-03-30 2020-11-03 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use
US10646488B2 (en) 2016-07-13 2020-05-12 Araxes Pharma Llc Conjugates of cereblon binding compounds and G12C mutant KRAS, HRAS or NRAS protein modulating compounds and methods of use thereof
WO2018036503A1 (en) 2016-08-25 2018-03-01 The Chinese University Of Hong Kong Fecal bacterial markers for colorectal cancer
EP3519402A1 (en) 2016-09-29 2019-08-07 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
US10726944B2 (en) 2016-10-04 2020-07-28 International Business Machines Corporation Recommending novel reactants to synthesize chemical products
US10377743B2 (en) 2016-10-07 2019-08-13 Araxes Pharma Llc Inhibitors of RAS and methods of use thereof
JP7191828B2 (ja) 2016-12-15 2022-12-19 ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイー・オブ・カリフオルニア がん治療のための組成物および方法
US11274093B2 (en) 2017-01-26 2022-03-15 Araxes Pharma Llc Fused bicyclic benzoheteroaromatic compounds and methods of use thereof
CN110382482A (zh) 2017-01-26 2019-10-25 亚瑞克西斯制药公司 稠合的杂-杂二环化合物及其使用方法
US11358959B2 (en) 2017-01-26 2022-06-14 Araxes Pharma Llc Benzothiophene and benzothiazole compounds and methods of use thereof
US11136308B2 (en) 2017-01-26 2021-10-05 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline and quinazolinone compounds and methods of use thereof
US11279689B2 (en) 2017-01-26 2022-03-22 Araxes Pharma Llc 1-(3-(6-(3-hydroxynaphthalen-1-yl)benzofuran-2-yl)azetidin-1 yl)prop-2-en-1-one derivatives and similar compounds as KRAS G12C modulators for treating cancer
EP3596117A4 (en) 2017-03-17 2021-01-13 The Johns Hopkins University TARGETED EPIGENETIC THERAPY AGAINST THE DISTAL EXPRESSION REGULATORY ELEMENT OF TGFB2
US11555031B2 (en) 2017-03-20 2023-01-17 The Broad Institute, Inc. Compounds and methods for regulating insulin secretion
CN110651036A (zh) 2017-03-20 2020-01-03 健诺西生物科学公司 治疗方法
CN110831933A (zh) 2017-05-25 2020-02-21 亚瑞克西斯制药公司 喹唑啉衍生物作为突变kras、hras或nras的调节剂
CA3063440A1 (en) 2017-05-25 2018-11-29 Araxes Pharma Llc Covalent inhibitors of kras
JP2020521741A (ja) 2017-05-25 2020-07-27 アラクセス ファーマ エルエルシー がんの処置のための化合物およびその使用の方法
US10538808B2 (en) 2017-05-26 2020-01-21 Vibrant Holdings, Llc Photoactive compounds and methods for biomolecule detection and sequencing
WO2019046791A1 (en) 2017-09-01 2019-03-07 The Johns Hopkins University TARGETED EPIGENETIC THERAPY FOR AERIAL CONDITION OF AERTICAL HERITATION
EP3692073A4 (en) 2017-10-03 2021-05-26 Cedars-Sinai Medical Center METHOD OF TARGETING THE IMMUNE CHECK POINT PD1 SIGNAL PATH FOR TREATMENT OF LUNG FIBROSIS
JP2021502418A (ja) 2017-11-04 2021-01-28 アドバンスト・プロテオーム・セラピューティクス・インコーポレイテッド ポリペプチドを修飾するための組成物及び方法
WO2020092379A1 (en) 2018-10-29 2020-05-07 Genocea Biosciences, Inc. Treatment methods
WO2020087107A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 The University Of Sydney Compositions and methods for treating viral infections
WO2020097261A1 (en) 2018-11-06 2020-05-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services New compositions and methods for treating beta-globinopathies
CN113365661A (zh) 2019-01-31 2021-09-07 新加坡科技研究局 用于治疗或预防癌症的cnx/erp57抑制剂
US20220249559A1 (en) 2019-05-13 2022-08-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
RU2699563C1 (ru) * 2019-05-29 2019-09-06 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт-ПИЯФ) Модифицированный синтетический аналог природного опиоидного пептида энкефалина
DE102020202529A1 (de) * 2020-02-27 2021-09-02 Robert Bosch Gesellschaft mit beschränkter Haftung Verfahren zur Identifikation einer Wirkstoffkombination
US11965162B2 (en) 2020-04-16 2024-04-23 The Johns Hopkins University MicroRNA and inhibitors thereof and methods of treatment
WO2023081167A2 (en) 2021-11-02 2023-05-11 The Regents Of The University Of California P-selectin mutants and modulation of integrin-mediated signaling
WO2023086969A2 (en) 2021-11-12 2023-05-19 Ichor Medical Systems Inc. Treatment methods
WO2023146807A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 The Regents Of The University Of California Vegf mutants and modulation of integrin-mediated signaling

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4392997A (en) * 1981-07-06 1983-07-12 Northwestern University Antigenic peptide compounds
US4618598A (en) * 1982-04-12 1986-10-21 Duke University Method of regulating hormone function or release
NZ207394A (en) * 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4703008A (en) * 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US4555101A (en) * 1984-03-13 1985-11-26 Stobb, Inc. Method and apparatus for separating signatures from a stack
US4590003A (en) * 1984-03-23 1986-05-20 Oncogen Platelet related growth regulator
US4569792A (en) * 1984-06-14 1986-02-11 Eli Lilly And Company Anti-diabetic compounds
US4625014A (en) * 1984-07-10 1986-11-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cell-delivery agent
DE3586772T2 (de) * 1984-07-24 1993-03-04 Coselco Mimotopes Pty Ltd Verfahren zur bestimmung von mimotopen.
US4798787A (en) * 1984-09-19 1989-01-17 Cetus Corporation Peptide antibodies and their use in detecting oncogene products
US4705777A (en) * 1985-02-25 1987-11-10 The Regents Of The University Of California Cationic oligopeptides having microbicidal activity
US4863857A (en) * 1985-03-01 1989-09-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Polypeptide complementary to peptides or proteins having an amino acid sequence or nucleotide coding sequence at least partially known
US4631211A (en) * 1985-03-25 1986-12-23 Scripps Clinic & Research Foundation Means for sequential solid phase organic synthesis and methods using the same
US4710489A (en) * 1985-04-22 1987-12-01 Cornell Research Foundation, Inc. Glutathione delivery system
NZ215865A (en) * 1985-04-22 1988-10-28 Commw Serum Lab Commission Method of determining the active site of a receptor-binding analogue
WO1986006487A1 (en) * 1985-04-22 1986-11-06 Commonwealth Serum Laboratories Commission Method for determining mimotopes
CS256960B1 (en) * 1985-11-16 1988-04-15 Viktor Krchnak Peptides with properties of antigenic determinants and method of their production
US4780421A (en) * 1986-04-03 1988-10-25 Sclavo Inc. Cleavable labels for use in binding assays
US4837304A (en) * 1987-05-22 1989-06-06 Merck & Co., Inc. Inhibitor of ribonucleotide reductase
IE81146B1 (en) * 1987-10-13 2000-05-03 Terrapin Tech Inc Method to produce immunodiagnostic reagents
NZ228482A (en) * 1988-03-24 1991-03-26 Terrapin Tech Inc Chromatography substrate containing a peptide paralog (active site mimicer) peptide
US5010175A (en) * 1988-05-02 1991-04-23 The Regents Of The University Of California General method for producing and selecting peptides with specific properties
WO1989011211A2 (en) * 1988-05-24 1989-11-30 Gesellschaft Für Biotechnologische Forschung Mbh ( Oligonucleotide bank and process for dna sequencing
US4988625A (en) * 1988-11-09 1991-01-29 Merck & Co., Inc. Method for determining the functionalization of a solid support
CA2009996A1 (en) * 1989-02-17 1990-08-17 Kathleen S. Cook Process for making genes encoding random polymers of amino acids
US5182366A (en) * 1990-05-15 1993-01-26 Huebner Verena D Controlled synthesis of peptide mixtures using mixed resins
US5650489A (en) * 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
SK281490B6 (sk) 2001-04-09
NO930011L (no) 1993-02-22
EP0542770A1 (en) 1993-05-26
JPH06500308A (ja) 1994-01-13
US5510240A (en) 1996-04-23
NO930011D0 (no) 1993-01-04
PL168354B1 (pl) 1996-02-29
KR100245767B1 (ko) 2000-03-15
IL98682A (en) 1997-02-18
ATE176330T1 (de) 1999-02-15
DK0542770T3 (da) 1999-09-13
US5858670A (en) 1999-01-12
NO315002B1 (no) 2003-06-23
CA2086672A1 (en) 1992-01-03
JP3552718B2 (ja) 2004-08-11
IE912299A1 (en) 1992-01-15
MX9100052A (es) 1992-02-28
FI107995B (fi) 2001-11-15
IL98682A0 (en) 1992-07-15
EP0542770A4 (en) 1993-09-15
NZ238805A (en) 1994-07-26
HU218007B (hu) 2000-05-28
HU9204179D0 (en) 1993-04-28
HUT63576A (en) 1993-09-28
US5650489A (en) 1997-07-22
KR100222146B1 (en) 1999-10-01
CZ407392A3 (en) 1993-10-13
AU2836995A (en) 1995-12-07
AU659091B2 (en) 1995-05-11
AU8238591A (en) 1992-01-23
AU683762B2 (en) 1997-11-20
DE69130828T2 (de) 1999-06-17
DE69130828D1 (de) 1999-03-11
GR3029443T3 (en) 1999-05-28
PL169616B1 (pl) 1996-08-30
FI925986A0 (fi) 1992-12-31
ES2126572T3 (es) 1999-04-01
EP0542770B1 (en) 1999-01-27
SK407392A3 (en) 1994-08-10
CZ289365B6 (cs) 2002-01-16
CA2086672C (en) 2005-04-12
AU2845495A (en) 1996-05-16
WO1992000091A1 (en) 1992-01-09
FI925986A (fi) 1992-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RO112336B1 (ro) Banca de biooligomeri, metoda de obtinere si metoda pentru determinarea unei secvente
KR101216008B1 (ko) 바이포달 펩타이드 바인더
US5846743A (en) Polyphoshoinositide binding peptides for intracellular drug delivery
JP2002530059A (ja) 輸送ベクター
AU729591B2 (en) Modified ligands of calcium-dependent binding proteins
KR20060036476A (ko) 뇌 이동 활성을 가지는 폴리펩티드 및 그 이용
KR20120125455A (ko) 세포내 타겟 결합용 바이포달 펩타이드 바인더
WO1994018345A1 (en) Receptor-binding antiproliferative peptides
Han et al. Investigations of azapeptides as mimetics of Leu-enkephalin
US6475806B1 (en) Anchor libraries and identification of peptide binding sequences
RU2145233C1 (ru) Неупорядоченная библиотека пептидов, способ ее получения и способ идентификации пептида, синтезированного твердофазным синтезом
CA2234723A1 (en) Generating d-peptides: methods and compositions
Darlot Design of modulatory peptides against chemokines
US20040185499A1 (en) Method of epitope scanning using fluorescence polarization
WO1998020887A1 (en) Polyphosphoinositide binding peptides for intracellular drug delivery
McKinney Studies of the Saccharomyces cerevisiae alpha-factor mating pheromone and its receptor (the STE2 gene product)