ES2204910T3

ES2204910T3 - Bibliotecas quimicas combinatorias complejas codificadas con señales.

Info

Publication number: ES2204910T3
Application number: ES94900350T
Authority: ES
Inventors: W. Clark Still; Michael H. J. Ohlmeyer; Michael H. Wigler; Lawrence W. Dillard; John C. Reader
Original assignee: Cold Spring Harbor Laboratory; Columbia University in the City of New York
Current assignee: Cold Spring Harbor Laboratory; Columbia University in the City of New York
Priority date: 1992-10-01
Filing date: 1993-10-01
Publication date: 2004-05-01
Anticipated expiration: 2013-10-01
Also published as: PT665897E; KR100310939B1; EP0665897B1; AU5536994A; EP0665897A1; NO951230D0; DE69333087D1; WO1994008051A1; AU686579B2; HU9500952D0; IL107166A0; IL107166A; CA2143848C; DK0665897T3; CA2143848A1; DE69333087T2; HUT72495A; NO951230L; EP0665897A4; ATE244769T1

Abstract

SE PRESENTA UNA QUIMICA COMBINACIONAL CODIFICADA, EN LA QUE LOS ESQUEMAS SINTETICOS, SECUENCIALES ESTAN GRABADOS UTILIZANDO MOLECULAS ORGANICAS, QUE DEFINEN LA ELECCION DEL REACTIVO, Y LA ETAPA COMO EL MISMO O UN BIT DEFERENTE DE INFORMACION. PUEDEN PRODUCIRSE PRODUCTOS DIFERENTES EN LA SINTESIS MULTIETAPA, TALES COMO OLIGOMEROS Y MOLECULAS ORGANICAS, SINTETICAS, NO REPETITIVAS. CONVENIENTEMENTE, PUEDEN EMPLEARSE FAMILIAS ANIDADAS DE COMPUESTOS COMO IDENTIFICADORES, EN DONDE EL NUMERO Y/O POSICION DE UN SUBSTITUYENTE DEFINEN LA ELECCION. ALTERNATIVAMENTE, PUEDEN EMPLEARSE FUNCIONALIDADES DETECTABLES, TALES COMO RADIOISOTOPOS, FLUORESCENTES, HALOGENOS Y SIMILARES, EN DONDE LA PRESENCIA Y PROPORCIONES DE DOS GRUPOS DIFERENTES PUEDEN UTILIZARSE PARA DEFINIR LA ETAPA O LA ELECCION. PARTICULARMENTE, PUEDEN USARSE PLURALIDADES DE IDENTIFICADORES PARA SUMINISTRAR UN CODIGO BINARIO O MAYOR, DE FORMA QUE SE DEFINA UNA PLURALIDAD DE ELECCIONES CON SOLO UNAS POCAS MARCAS SEPARABLES. LAS PARTICULAS PUEDEN SELECCIONARSE POR UNA CARACTERISTICA DE INTERES, PARTICULARMENTE AFINIDAD DE UNION, EN DONDE LOS PRODUCTOS PUEDEN SEPARARSE DE LAS PARTICULAS O PERMANECER RETENIDOS SOBRE LAS PARTICULAS. LA HISTORIA DE LA REACCION DE LAS PARTICULAS QUE SEAN POSITIVAS PARA LA CARACTERISTICA, PUEDE DETERMINARSE MEDIANTE LA LIBERACION DE LAS MARCAS Y ANALISIS PARA DEFINIR LA HISTORIA DE LA REACCION DE LA PARTICULA.

Description

Bibliotecas químicas combinatorias complejas codificadas con señales.

Introducción Campo técnico

El campo de esta invención se refiere a la química combinatoria que implica síntesis que tienen una pluralidad de etapas, implicando cada etapa una pluralidad de elecciones, donde se obtienen grandes números de productos que tienen composiciones variables.

Antecedentes de la invención

Existe un interés substancial en inventar métodos fáciles para la síntesis de un gran número de diversos compuestos que después pueden seleccionarse para diversas actividades fisiológicas posibles y para otras actividades. Típicamente, tal síntesis implica etapas sucesivas, cada una de las cuales implica una modificación química de la molécula existente. Por ejemplo, la modificación química puede implicar la adición de una unidad, por ejemplo un monómero o sintón, a una secuencia en crecimiento o la modificación de un grupo funcional. Empleando síntesis donde la modificación química implica la adición de unidades, tales como aminoácidos, nucleótidos, azúcares, lípidos o compuestos heterocíclicos donde las unidades pueden ser naturales, sintéticas o combinaciones de las mismas, se puede crear un gran número de compuestos. De esta manera, aunque se restrinja la síntesis a unidades o bloques de construcción que existen de forma natural, el número de elecciones sería muy grande, 4 en el caso de los nucleótidos, 20 en el caso de los aminoácidos comunes y esencialmente un número ilimitado en el caso de los azúcares.

Un inconveniente de lo anterior intrínseco a la producción de un gran número de diversos compuestos, donde en cada etapa de la síntesis hay un número significativo de elecciones, es el hecho de que cada compuesto individual estará presente en una cantidad muy pequeña. Aunque puede determinarse una característica de un compuesto particular, por ejemplo una actividad fisiológica, normalmente es imposible identificar la estructura química del compuesto particular presente.

Además, los compuestos fisiológicamente activos se han descubierto históricamente ensayando caldos brutos usando técnicas edisonianas o estocásticas, donde únicamente se ensayan relativamente pocos compuestos a la vez, o donde se ensaya un número limitado de homólogos estructurales similares de compuestos fisiológicamente activos que existen de forma natural. Dos de los problemas principales se han asociado con el uso de tales caldos brutos, particularmente, la necesidad de purificar la mezcla de reacción en compuestos componentes individuales y el esfuerzo de consumo de tiempo requerido para establecer la estructura del compuesto una vez purificado.

Para tratar estos inconvenientes y problemas, se han desarrollado técnicas en las que se añaden unidades individuales como parte de una síntesis química secuencialmente, de manera controlada o aleatoria, para producir todos o una proporción substancial de los posibles compuestos que pueden resultar de las diferentes elecciones posibles en cada etapa secuencial de la síntesis. Sin embargo, para que estas técnicas sean satisfactorias, es necesario que los compuestos obtenidos por ellas sean susceptibles a métodos que permitan determinar la composición de un compuesto particular obtenido de esta manera que muestra una característica de interés.

Una de tales estrategias implica usar un chip que permite el análisis separado en sitios físicamente separados sobre la superficie del chip (Fodor et al., Science 251:767 [1991]). Conociendo qué reactivo se añade secuencialmente en cada uno de tales sitios, se puede registrar la secuencia de sucesos y, de esta manera, la serie de reacciones. Si después se somete el chip a un método de selección para una característica particular deseada y detecta la característica, se puede determinar realmente el compuesto sintetizado en el sitio que demuestra esa característica.

Otra de tales técnicas implica la síntesis teórica de oligonucleótidos en paralelo con la síntesis de oligopéptidos como compuestos de interés (Brenner y Lerner, PNAS USA [1992] 81: 5381-5383).

También se describen técnicas adicionales en las siguientes publicaciones: Amoto, Science (1992) 257, 330-331 describe el uso de marcadores de ADN cosintetizados para identificar polipéptidos. Lam, et al., Nature (1991) 354, 82-84 describe un método para fabricar grandes bibliotecas de péptidos. Houghton, et al., Nature (1991) 354, 84-86 y Jung y Beck-Sickinger, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1992) 91, 367-383 describe una metodología para fabricar grandes bibliotecas de péptidos. Kerr et al., J. Amer. Chem. Soc., (1993) 115, 2529-31 enseñan un método para sintetizar bibliotecas de oligómeros codificadas por cadenas peptídicas.

En el documento WO 93/06121 se proporciona un método estocástico general para sintetizar oligómeros aleatorios que pueden usarse para sintetizar compuestos para seleccionar las propiedades deseadas. Se notifica el uso de señales de identificación en los oligómeros para facilitar la identificación de los oligómeros con propiedades deseadas. En el proceso de identificación, las señales se leen sobre un soporte sólido o se amplifican mientras están sobre el soporte sólido.

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En el documento WO 93/09668 se describe un método y un dispositivo para formar grandes series de polímeros sobre un substrato. De acuerdo con un aspecto preferido de la invención, el substrato está en contacto con un bloque de canales que tiene canales en su interior. Los reactivos seleccionados se liberan a través de los canales, el substrato se hace girar mediante una etapa de rotación y el proceso se repite para formar series de polímeros sobre el substrato. El método puede combinarse con luces dirigidas a los puntos principales del método. La historia de la reacción se retiene en virtud de la localización de las moléculas.

En el documento WO 93/22684 se proporciona un método y una biblioteca para determinar la secuencia de monómeros en un polímero que es complementario a un receptor. El método proporciona medios para la formación de productos reunidos y separados. Los productos separados se someten únicamente a etapas de acoplamiento combinadas posteriores. Cada producto reunido se divide posteriormente para la formación de grupos y productos separados. La biblioteca de polímeros resultante incluye grupos de productos poliméricos. Un primer grupo de productos se usa para identificar el monómero en una primera localización en un polímero que es complementario a un receptor. Un segundo grupo de productos se usa para identificar el monómero en una segunda localización en un polímero que es complementario a un receptor.

En el documento WO 93/20242 se describe una biblioteca química combinatoria codificada que comprende una pluralidad de moléculas bi-funcionales que tienen tanto un polímero químico como una secuencia oligonucleotídica identificadora que define la estructura del polímero químico. También se describen las moléculas bi-funcionales de la biblioteca y métodos de uso de la biblioteca para identificar estructuras químicas dentro de la biblioteca que unen dos moléculas biológicamente activas en interacciones de unión preseleccionadas.

En el documento WO 93/19205 se describe un método de exploración de electroforesis multicolor que comprende marcar fragmentos de secuenciación de ADN seleccionados con diferentes fracciones molares de fluoróforos, someter a electroforesis los fragmentos de secuenciación marcados en una sola franja para ocasionar la separación por tamaños, y determinar la posición de dichos fragmentos en la secuencia total detectando la relación de intensidad de fluorescencia y dos longitudes de onda de detección procedentes de dichos fragmentos marcados.

En el documento US 4.755.558 se describe un método para controlar cuantitativamente las reacciones de desprotección y acoplamiento empleadas en la fase sólida en la síntesis de péptidos. El método implica sintetizar un péptido sobre una matriz de soporte que tiene un primer marcador asociado. Los aminoácidos empleados en el procedimiento de síntesis de péptidos tienen un segundo marcador unido, que puede ser el grupo bloqueante usado para el aminoácido. Después de la etapa de acoplamiento o de desprotección, se procesa una porción de la matriz de soporte para liberar un primer y un segundo identificador a partir del primer y segundo marcador, respectivamente. La finalización de la etapa de acoplamiento o desprotección puede determinarse comparando las cantidades relativas del primer y el segundo identificadores detectados. También se describen nuevas composiciones de materia usadas o producidas usando el método, incluyendo matrices de soporte que tienen marcadores pirolizables unidos.

En Trends in Analytical Chemistry (1983) 2, 166-168 se revisaron señales de liberación electroforéticas.

En Clinical Chemistry (1982) 28/9, 1844-1847 se describe el uso de señales de liberación como reactivos analíticos.

Sin embargo, como los métodos tales como los anteriores típicamente requieren la adición de restos similares, existe un interés substancial en descubrir métodos para producir compuestos que no estén limitados a la adición secuencial de restos similares. Tales métodos encontrarían aplicación, por ejemplo, en la modificación de esteroides, antibióticos, azúcares, coenzimas, inhibidores enzimáticos, ligandos y similares, que frecuentemente implican una síntesis de múltiples etapas en la que se desearía variar los reactivos y/o condiciones para proporcionar una diversidad de compuestos. En tales métodos, los reactivos pueden ser reactivos orgánicos o inorgánicos, donde las funcionalidades pueden introducirse o modificarse, los grupos laterales unirse o retirarse, los anillos abrirse o cerrarse, la estereoquímica cambiarse, y similares. (Véase, por ejemplo, Bunin y Ellman, JACS 114, 10997 [1992]). Para que tal método sea viable, sin embargo, se necesita que exista una forma conveniente para identificar las estructuras del gran número de compuestos que resultan de una gran diversidad de modificaciones diferentes. De esta manera, existe la necesidad de encontrar un modo por el que pueda registrarse la historia de la reacción, y deseablemente, puedan identificarse las estructuras del compuesto resultante.

Finalmente, según aumenta el tamaño de una biblioteca de compuestos sintetizados de esta manera, las técnicas conocidas de esclarecimiento de estructuras y de segregación de productos introducen ineficacias e incertidumbres que dificultan la determinación precisa de la estructura de cualquier compuesto identificado como un compuesto de interés. De esta manera, existe una necesidad substancial de nuevos métodos que permitan la síntesis de bibliotecas químicas combinatorias complejas que faciliten la determinación estructural precisa de los compuestos individuales dentro de la biblioteca que se identifican como compuestos de interés.

Finalmente, las solicitudes de patente internacionales WO 91/17823 y WO 92/09399 se refieren a bibliotecas combinatorias.

Muchos de los inconvenientes de los métodos descritos previamente, así como muchas de las necesidades no satisfechas por los mismos, se tratan por la presente invención que, como se describe con más detalle más adelante, proporciona ventajas con respecto a estos métodos descritos previamente.

Sumario de La invención

En un primer aspecto, la invención proporciona un método para registrar la historia de reacción de un soporte sólido que es uno de una pluralidad de soportes sólidos, pluralidad de soportes sólidos que se somete a una serie de reacciones de al menos dos etapas que requieren diferentes agentes y/o diferentes condiciones de reacción, dando como resultado diferentes modificaciones, obteniéndose un producto final diferente, respectivamente, sobre diferentes soportes sólidos, comprendiendo dicho método

(a) en la primera etapa o en una etapa intermedia de dicha serie de reacciones, dividir dicha pluralidad de soportes sólidos en una pluralidad de grupos, comprendiendo cada grupo al menos uno de dichos soportes sólidos, y hacer reaccionar diferentes grupos de dichos soportes sólidos con un agente diferente y/o empleando una condición de reacción diferente;

(a^{1}) mezclar dichos grupos; y

(b) repetir dicha división y reacción al menos una vez durante una etapa intermedia adicional o final, para proporcionar una pluralidad de productos finales diferentes, conteniendo cada soporte sólido individual el producto de una sola combinación de agentes y/o condiciones de reacción;

donde, durante las etapas (a) y (b), el soporte sólido tiene unida una combinación de identificadores que tienen señales, estando unida cada señal a través de un enlazador escindible, difiriendo las señales de los identificadores entre sí, pudiendo separarse del soporte por escisión del enlazador y, una vez separadas, pudiendo separarse entre sí, definiendo dicha combinación de identificadores, para tal soporte sólido, la combinación individual de agente y/o condiciones de reacción que comprende la historia de reacción del soporte sólido.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un método para determinar la estructura de un compuesto, que comprende proporcionar un soporte sólido que comprende un compuesto que se sintetizó por una serie de reacciones realizadas en una pluralidad de soportes sólidos, comprendiendo dicha síntesis en la primera etapa o en una etapa intermedia de dicha serie de reacciones, dividir dicha pluralidad de soportes sólidos en una pluralidad de grupos, comprendiendo cada grupo al menos uno de dichos soportes sólidos, y hacer reaccionar diferentes grupos de dichos soportes sólidos con un agente diferente y/o empleando una condición de reacción diferente, mezclar dichos grupos, y repetir dicha división y reacción al menos una vez durante una etapa intermedia adicional o final, teniendo también el soporte sólido unida una combinación de identificadores que tienen señales, estando unida cada señal a través de un enlazador escindible, difiriendo las señales de los identificadores entre sí, pudiendo separarse del soporte y, una vez separadas, pudiendo separarse entre sí, definiendo dicha combinación de identificadores, para tal soporte sólido, la elección del agente y/o de las condiciones de reacción para cada etapa de dicha serie de reacciones,

separar las señales del soporte sólido de tal manera que se forme una mezcla de señales solubles;

separar las señales mezcladas entre sí; y

detectar cada una de las señales separadas, con lo que se determina el agente y/o la condición de reacción para cada etapa de dicha serie de reacciones para tal soporte sólido.

En un tercer aspecto, la invención proporciona un soporte sólido que comprende

un compuesto sintetizado sobre dicho soporte sólido por una serie de reacciones realizadas sobre una pluralidad de soportes sólidos, comprendiendo dicha síntesis en una primera etapa o en una etapa intermedia de dicha serie de reacciones, dividir dicha pluralidad de soportes sólidos en una pluralidad de grupos, comprendiendo cada grupo al menos uno de dichos soportes sólidos, y hacer reaccionar los diferentes grupos de dichos soportes sólidos con un agente diferente y/o empleando una condición de reacción diferente y repetir dicha división y reacción al menos una vez durante una etapa intermedia adicional o una etapa final,

teniendo señales una primera combinación de identificadores, estando unida cada señal a través de un enlazador escindible, estando unido cada identificador directamente al soporte, difiriendo las señales de los identificadores entre sí, pudiendo separarse del soporte y, una vez separadas, pudiendo separarse entre sí, definiendo dicha combinación de identificadores, para tal soporte, la elección del agente y/o de las condiciones de reacción para la primera etapa o la etapa intermedia de dicha serie de reacciones, y

teniendo señales una segunda combinación de identificadores, estando unida cada señal a través de un enlazador separable, estando cada identificador unido directamente al soporte, difiriendo las señales de los identificadores entre sí, pudiendo separarse del soporte y, una vez separadas, pudiendo separarse entre sí, definiendo dicha segunda combinación de identificadores, para tal soporte, la elección del agente y/o de las condiciones de reacción para la etapa intermedia o final de dicha serie de reacciones.

En un cuarto aspecto, la invención proporciona un proceso para identificar un compuesto que tiene una característica de interés, que comprende:

a) proporcionar una biblioteca de una pluralidad de soportes sólidos individuales, teniendo cada soporte sólido unido de forma separable un compuesto y una primera y una segunda combinación de identificadores que tienen señales, de acuerdo con el tercer aspecto de la invención,

b) o bien

(i): primero seleccionar la biblioteca de la etapa (a) en un ensayo para detectar la presencia de un compuesto de interés en la biblioteca y después separar el compuesto detectado de esta manera, todavía unido al soporte sólido, de la biblioteca,

o bien

(ii): primero tratar cada soporte sólido en la biblioteca de la etapa (a) para liberar una porción del compuesto del soporte sólido mientras que quedan retenidos en cada uno de tales soportes sólidos las combinaciones de identificadores unidas al mismo, y después seleccionar cada compuesto liberado de esta manera en un ensayo para detectar la presencia de un compuesto de interés;

c) tratar

(i): el soporte sólido, al que está unido el compuesto de interés, de la etapa b) (i) o bien

(ii): el soporte sólido, a partir del cual se ha liberado el compuesto de interés de la etapa b) (ii),

para provocar la separación de las señales separables de cada uno de los identificadores;

d) separar y analizar las señales separadas de la etapa c); y

e) determinar los agentes o condiciones de reacción en las etapas de la serie de reacciones mediante la que se sintetizó el compuesto a partir del análisis de las señales de la etapa d), identificando de esta manera el compuesto de interés.

En un quinto aspecto, la invención proporciona un método para sintetizar un soporte sólido que comprende:

(a) proporcionar una pluralidad de soportes sólidos, estando dicha pluralidad de soportes sólidos sometida a una serie de reacciones de al menos dos etapas que requieren diferentes agentes y/o diferentes condiciones de reacción, dando como resultado diferentes modificaciones, obteniéndose un producto final diferente, respectivamente, sobre diferentes soportes sólidos;

(b) en una primera etapa o en una etapa intermedia de dicha serie de reacciones dividir dicha pluralidad de soportes sólidos en una pluralidad de grupos, comprendiendo cada grupo al menos uno de dichos soportes sólidos, y hacer reaccionar grupos diferentes de dichos soportes sólidos con un agente diferente y/o empleando una condición de reacción diferente;

(c) mezclar dichos grupos; y

(d) repetir dicha división y reacción al menos una vez durante una etapa intermedia adicional o una etapa final, para proporcionar una pluralidad de productos finales diferentes, conteniendo cada soporte sólido individual el producto de una sola combinación de agentes y/o condiciones de reacción,

donde, durante las etapas (b) y (d), el soporte sólido tiene unida una combinación de identificadores que tienen señales, estando unida cada señal a través de un enlazador escindible, difiriendo las señales de los identificadores entre sí, pudiendo separarse del soporte por escisión del enlazador y, una vez separadas, pudiendo separarse entre sí.

Se proporcionan métodos para el uso en química combinatoria codificada, con lo que en cada etapa de la síntesis, a un soporte tal como una partícula sobre la cual se está sintetizando un compuesto se le añade una señal característica para definir un suceso particular, normalmente químico, asociado con la síntesis del compuesto sobre el soporte. La señalización se realiza usando moléculas identificadoras que registran los sucesos secuenciales a los que se expone la partícula de soporte durante la síntesis, proporcionando de esta manera una historia de reacción para el compuesto producido sobre el soporte.

Cada molécula identificadora se caracteriza por ser estable en las condiciones de síntesis empleadas, permaneciendo asociada con los soportes durante la etapa de la síntesis, definiendo de forma única un suceso particular durante la síntesis que refleja una elección de reacción particular en una etapa dada de la síntesis, al poder distinguirse del resto de los componentes que pueden estar presentes durante el ensayo, y al permitir la separación de un componente señal que se puede reconocer por una técnica analítica conveniente.

Los identificadores para uso en esta invención se usan en combinación entre sí para formar un sistema de codificación binario o de orden superior que permite usar un número de identificadores relativamente pequeño para codificar un número relativamente grande de productos de reacción. Por ejemplo, cuando se usan en un código binario, N identificadores pueden codificar de forma única hasta 2^{N} compuestos diferentes.

Además, los identificadores usados sobre el soporte sólido de la invención no se unen en serie a través de un identificador previo, sino que se unen individualmente al substrato. Los identificadores no son secuenciables. Además, los identificadores contienen un miembro o resto escindible que permite la separación de un componente señal que puede analizarse fácilmente.

De forma conveniente, la síntesis combinatoria emplea soportes sólidos definibles sobre los que se realizan reacciones y a los que se unen los identificadores. Los soportes sólidos individuales o substratos que llevan los compuestos del producto final pueden seleccionarse con respecto a una característica de interés y la historia de reacción puede determinarse analizando las señales identificadoras asociadas.

Descripción detallada de la invención

Como se usa en esta solicitud, el término "señal" o "T" significa un resto químico que posee dos propiedades. Primera, puede distinguirse de todos los demás restos químicos. Segunda, puede detectarse cuando está presente a 10^{-18} a 10^{-9} mol. Estas dos propiedades pueden incorporarse en una sola estructura química. Como alternativa, estas propiedades pueden incorporarse en estructuras químicas separadas que están unidas entre sí. En este último caso, una de las estructuras químicas, que puede designarse C (o en el caso de más de una estructura, C, C', etc.) proporciona la propiedad de convertir la señal en distinguible del resto del resto de las señales, mientras que la otra estructura química, E, proporciona la propiedad de convertir la señal en detectable y opcionalmente puede proporcionar la propiedad de convertir la señal en separable de otras señales.

Como se usa en esta solicitud, el término "enlazador" o "L" significa un resto químico que posee tres propiedades. Primera, puede unirse a un soporte sólido. Segunda, puede unirse a una señal. Tercera, cuando está unido a un soporte sólido y a una señal, es escindible, de tal forma que la señal puede liberarse del soporte sólido. Estas tres propiedades pueden incorporarse en una sola estructura química. Como alternativa, estas propiedades incorporan en tres estructuras químicas que están unidas entre sí. En este último caso, una de las estructuras químicas, que puede designarse como F^{1}, proporciona la propiedad de hacer que el enlazador pueda unirse al soporte sólido; la segunda estructura química, que puede designarse como V, proporciona la propiedad de hacer que el enlazador sea escindible; y la tercera estructura química que puede designarse como A', proporciona la propiedad de hacer que el enlazador pueda unirse a la señal. Deseablemente, las estructuras químicas V y A' son sólo una, en cuyo caso V-A' puede designarse como F^{2}.

Como se usa en esta aplicación, el término "identificador" significa una entidad química que incluye una señal y un enlazador. De esta manera, en el sentido más amplio un identificador puede representarse mediante la fórmula L-T, mientras que las realizaciones específicas del identificador pueden representarse mediante las fórmulas F'-V-A'-T; F'-V-A'-C-E (o F'-V-A'-E-C); L-C-E (o L-E-C); y L-C-E-C'.

Como se usa en esta solicitud, el término "identificador de enlace" se refiere a un identificador unido a un soporte sólido.

Como se usa en este documento, el término "elección" se refiere a las variables alternativas para una etapa dada en una síntesis combinatoria, tal como reactivos, condiciones de reacción y combinaciones de los mismos. Donde el término "etapa" se refiere a una etapa en la síntesis secuencial de un compuesto o ligando; siendo el compuesto o ligando el producto final de una síntesis combinatoria.

El término "alquilo" incluye estructuras lineales, ramificadas y cíclicas y combinaciones de las mismas. De esta manera, el término incluye metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec- y terc-butilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 2-metilciclopropilo y similares. Alquilo inferior es alquilo con 1 a 6 átomos de carbono. Alquenilo inferior es alquenilo con 2 a 6 átomos de carbono de una configuración lineal, ramificada o cíclica y combinaciones de las mismas.

A menos que se indique otra cosa, se entiende que las definiciones de cualquier substituyente (por ejemplo, R^{1}, R^{2}, Z, etc.) en una molécula particular son dependientes de sus definiciones en otra parte de la molécula. De esta manera, NR^{4}R^{4} representa NHH, NHCH_{3}, NHCH_{2}CH_{3}, N(CH_{3})_{2}, etc.

Algunos de los compuestos descritos en este documento contienen uno o más centros de asimetría y por lo tanto pueden dar lugar a enantiómeros, diastereoisómeros y otras formas estereoisoméricas. Se entiende que la presente invención incluye todos tales estereoisómeros posibles, así como sus formas racémicas y ópticamente puras. Pueden prepararse isómeros ópticamente activos (R) y (S) usando sintones quirales, reactivos quirales, o resolverse usando técnicas convencionales. Cuando los compuestos descritos en este documento contienen dobles enlaces olefínicos, se entiende que incluyen los isómeros geométricos E y Z.

Los materiales sobre los que se realiza la síntesis combinatoria asociada con esta invención se mencionan en este documento indistintamente como perlas, superficies sólidas, substratos (sólidos), partículas, soportes, etc. Estos términos pretenden incluir:

a): soportes sólidos tales como perlas, gránulos, discos, capilares, fibras huecas, fibras sólidas, perlas de celulosa, perlas de cristal poroso, geles de sílice, perlas de poliestireno opcionalmente reticuladas con divinilbenceno, perlas co-poli injertadas, perlas de poli-acrilamida, perlas de látex, perlas de dimetilacrilamida opcionalmente reticuladas con N,N'-bis-acriloiletilenodiamina, partículas de cristal recubiertas con un polímero hidrófobo, etc., es decir, un material que tiene una superficie rígida o semi-rígida; y

b): soportes solubles tales como poliestireno no reticulado de bajo peso molecular.

Estos materiales deben contener funcionalidades o deben ser capaces de funcionalizarse de forma que los identificadores o intermedios de productos pueden unirse a ellos.

Además, las siguientes abreviaturas tienen los significados indicados:

AcOH	=	ácido acético
BSA	=	bis(trimetilsilil)acetamida
CAN	=	nitrato de cerio (iv) y amonio
DEAD	=	azodicarboxilato de dietilo
DCM	=	diclorometano
DIC	=	diisopropilcarbodiimida
DMF	=	N,N-dimetilformamida
Fmoc	=	9-fluorenilmetoxicarbonilo
HOBt	=	1-hidroxibenzotriazol
PhMe	=	tolueno
t.a.	=	temperatura ambiente
TFA	=	ácido trifluoroacético
THF	=	tetrahidrofurano

La presente invención se refiere a la producción de bibliotecas de productos, es decir, compuestos, donde los productos individuales o compuestos presentes en las bibliotecas pueden separarse físicamente del resto y pueden seleccionarse para una característica de interés unida a, o separada de, un soporte sólido. En la síntesis en serie, cuando en cada etapa de una síntesis cada uno de los intermedios individuales se trata en una diversidad de formas, se produce un gran número de productos, cada uno de los cuales está presente en una pequeña cantidad, frecuentemente menor de 100 pmol, más frecuentemente menor de 10 nmol. Debido a la pequeña cantidad de producto final o compuesto producido de esta manera, generalmente no sería factible identificar estos productos por medio del aislamiento y el esclarecimiento de la estructura de los productos. Además, en la síntesis secuencial que implica de otra manera la adición de unidades similares, el análisis sería arduo si no imposible usando la cantidad de producto típicamente disponible. Sin embargo, asociando cada etapa o combinación de etapas (por ejemplo, "añadir reactivo A" o "añadir reactivo A, después reactivo B y calentar a 100ºC durante 2 horas") de la síntesis en serie con un identificador que define la elección de variables tales como los reactivos, las condiciones de reacción o una combinación de estos, pueden usarse los identificadores para definir la historia de reacción de cada substrato definible y separable. El análisis de señales separadas de los identificadores permite la fácil identificación de la historia de reacción, en concentraciones picomolares o inferiores, por ejemplo, femtomolares o inferiores. Puede determinarse una característica de un producto de una síntesis, normalmente una característica química o biológica mediante diversas técnicas de selección, y después identificarse la historia de reacción y por lo tanto la estructura de ese producto, que tiene la característica deseada, en virtud de las señales asociadas con el producto.

El uso del sistema de señales múltiples instantáneo evita la necesidad de realizar un cosíntesis complicada que reduce los rendimientos y requiere múltiples grupos protectores, y evita la necesidad de usar señales secuenciables que son necesariamente químicamente lábiles. Tanto la necesidad de múltiples grupos protectores como la inestabilidad intrínseca de todas las moléculas de señalización secuenciable (es decir, ácido nucleico u oligómeros peptídicos) limitan fuertemente la química que puede usarse en la síntesis del elemento o ligando de la biblioteca.

Además, el uso de un sistema de múltiples señales, binario o superior, reduce enormemente el número de señales necesarias para codificar la elección de reactivo en cualquier etapa de una síntesis. Por ejemplo, si pudiera realizarse una etapa sintética particular con 125 selecciones diferentes para el reactivo, el sistema binario requeriría únicamente 7 señales. Esto puede marcar la diferencia entre un sistema de codificación práctico y otro que no lo es, ya que puede no ser factible obtener y usar el gran número de señales distinguibles requerido por otros sistemas. Con el sistema binario de la invención, están disponibles 30 señales distinguibles y son suficientes para codificar > 10^{9} síntesis diferentes.

Es importante señalar que los métodos a los que se refiere la invención emplean señales que son detectables en un ligando o compuesto sintetizado también para el propósito de decodificación. Tal detectabilidad también permite que las señales sean distinguibles basándose en más de un elemento; en particular, pueden separarse (por ejemplo, basándose en el tiempo de retención cromatográfico) y después analizarse (por ejemplo, basándose además en una propiedad espectral tal como espectroscopía de masas m/e o electroforicidad). Basándose en distintos elementos para la distinción, se permite la codificación de grandes cantidades de información con un pequeño número de señales.

La separación adicional permite que las señales se detecten en niveles muy bajos, debido a que pueden retirarse de la matriz de soporte sobre la que se realiza la síntesis y del ligando sintetizado, cuya presencia podría proporcionar señales de fondo falsas, por ejemplo, interrumpiendo la fluorescencia o similar.

Las señales separables también son susceptibles de un análisis rápido mediante sistemas de muestra automatizados, y permiten la derivación selectiva para la detección mediante grupos funcionales, eliminando cualquier incompatibilidad entre el resto de detección y las condiciones de reacción usadas en la síntesis.

En cualquier esquema de señalización es inherente el requisito de que las características químicas de las señales y las etapas químicas para su incorporación sean compatibles con las características del ligando y las etapas en su síntesis, y viceversa. La ventaja de las señales que generalmente no son reactivas, como se ejemplifica más adelante en este documento mediante los restos de ariloxipropilmetileno-substituido, es un grado mayor de transformaciones químicas y funcionalidad química que puede emplearse en la síntesis de los ligandos.

Una ventaja adicional de las señales químicamente estables empleadas en esta invención es su compatibilidad con una gran variedad de métodos convenientes y rápidos de separación y análisis, tales como cromatografía de gases y espectrometría de masas. Además, las señales orgánicas empleadas en estas invenciones generalmente no interactúan específicamente con receptores biológicos. De esta manera, las señales generalmente no darán falsos resultados en ensayos biológicos y generalmente no se modificarán por enzimas u otras moléculas biológicas.

Finalmente, la estabilidad química de las señales de la presente invención permite que sean separables mediante una gran variedad de métodos que mejoran la sensibilidad de sus análisis como se ha descrito anteriormente.

De esta manera, la invención proporciona métodos para síntesis combinatoria codificada, por lo que en cada etapa de la síntesis se proporcionan uno o más identificadores que codifican un hecho asociado con una etapa particular en la síntesis de un compuesto sobre un soporte o una partícula. Este hecho comprende la elección del reactivo y/o de las condiciones de reacción en cada etapa de las reacciones donde cada una de tales etapas puede implicar uno o más reactivos que son iguales o diferentes en las mismas o en diferentes condiciones, por ejemplo, reacciones parciales, adiciones múltiples, velocidad de adición, diferenciación de las combinaciones de reactivos, etc. Además, pueden aislarse grupos de partículas de los otros grupos de partículas y someterse a una serie diferente de hechos en cualquier momento durante el transcurso de la síntesis secuencial.

Proporcionando N identificadores, teniendo cada uno M estados distinguibles, pueden definirse únicamente M^{N} síntesis diferentes. En el caso de que M = 2, pudiendo estar los dos estados en presencia o ausencia de identificador, la síntesis podría definirse de esta forma mediante un código en base 2 o binario. En el caso de que M = 3, pudiendo estar los tres estados en presencia de un identificador a dos concentraciones distinguibles o ausencia, la síntesis podría definirse mediante un código en base 3. En este documento, tales códigos en base M, donde M > 2 se denominan códigos de orden superior. La ventaja de los códigos de orden superior sobre un código binario es que se requieren menos identificadores para codificar la misma cantidad de información sobre la síntesis. Los productos producidos se definirán como resultado de una síntesis en serie. En cada etapa de la síntesis, está disponible una pluralidad de reactivos y/o condiciones, que producen una característica del producto en relación con una entidad identificable y normalmente separable, por ejemplo, una señal. Haciendo referencia a los reactivos, se entiende que el reactivo, en la mayoría de los casos, se incorpora en el producto, por ejemplo un aminoácido, nucleótido, nucleófilo, electrófilo, dieno, agente de alquilación o acilación, diamina o cualquier otro sintón, etc., aunque otros reactivos pueden o no incorporarse en el producto, por ejemplo base, ácido, calor, agente oxidante o reductor, aunque ambos se incluirán en el término "agente". La síntesis puede implicar reactivos individuales que se incorporan en el producto. Como alternativa, una etapa puede implicar una o más reacciones que dan como resultado una modificación de un intermedio de reacción. En muchos casos, se producirán combinaciones de estas posibilidades.

Usando un código binario o de base 2 (M = 2) y tres identificadores (N = 3), pueden identificarse hasta 8 (2^{3}) agentes para una etapa dada en una síntesis. Si los tres identificadores se representan como T1, T2 y T3 y la presencia o ausencia de cada identificador se representa como un "0" o "1" respectivamente, entonces podrían representarse ocho agentes diferentes en un código binario como se indica a continuación:

	Agente 1	Agente 2	Agente 3	Agente 4
T1, T2, T3	0, 0, 0	1, 0, 0	0, 1, 0	1, 1, 0
	Agente 5	Agente 6	Agente 7	Agente 8
T1, T2, T3	0, 0, 1	1, 0, 1	0, 1, 1	1, 1, 1

De forma similar, con más identificadores puede codificarse incluso más información sobre la síntesis. Por ejemplo, 9 identificadores (N = 3) y un código en base 2 (M = 2) permitiría hasta 2^{9} o 512 elecciones de agentes diferentes para codificar. Usando un código en base 3 (M = 3) y tres identificadores (N = 3) se permitirían hasta 27 (3^{3}) selecciones de agentes para codificar. Si los tres identificadores se representan como T1, T2 y T3, y la ausencia de un identificador se representa como un "0", su presencia en una cantidad de \sim0,5 pmol/perla como un "1" y su presencia en una cantidad de \sim1,0 pmol/perla como un "2", entonces los 27 agentes diferentes podrían representarse mediante tres identificadores en un código en base 3 como se indica a continuación:

	Agente 1	Agente 2	Agente 3	Agente 4
T1, T2, T3	0, 0, 0	1, 0, 0	2, 0, 0	0, 1, 0
	Agente 5	Agente 6	...	Agente 27
T1, T2, T3	1, 1, 0	2, 1, 0	...	2, 2, 2

Para hacer práctico tales esquemas de codificación de orden superior, podría añadirse un identificador adicional en una cantidad dada (por ejemplo, \sim1,0 pmol/perla) a todos los miembros de la biblioteca para proporcionar un patrón con respecto al cual puedan medirse las cantidades de todos los identificadores. Las cantidades de los identificadores podrían medirse mediante cromatografía de gases o HPLC con una diversidad de métodos de detección. En el caso de la HPLC, las cantidades podrían medirse convenientemente por recuento de centelleo si los identificadores se marcadas radiactivamente por cantidades diferentes de un radionúclido tal como tritio (^{3}H). Sería particularmente conveniente realizar la cuantificación midiendo la relación ^{3}H-a-^{14}C, usando de esta manera ^{14}C como patrón. De esta manera, podrían distinguirse hasta diez cantidades de ^{3}H para crear un código decimal o en base 10 (M = 10) que podría codificar enormes cantidades de información con muy pocos identificadores.

Productos y estrategias sintéticas

Para la mayoría, los productos de los métodos relacionados con esta invención serán compuestos orgánicos y eliminación de unidades químicas, reacciones que implican la modificación o introducción de una o más funcionalidades, apertura de anillo, cierre de anillo, etc. Las unidades químicas pueden tomar muchas formas, tanto naturales como sintéticas, tales como nucleófilos, electrófilos, dienos, agentes de alquilación o acilación, diaminas, nucleótidos, aminoácidos, azúcares, lípidos, o derivados de los mismos, monómeros orgánicos, sintones, y combinaciones de los mismos. Como alternativa, pueden estar implicadas reacciones que dan como resultado la alquilación, acilación, nitración, halogenación, oxidación, reducción, hidrólisis, substitución, eliminación, adición, y similares. Este proceso puede producir no oligómeros, oligómeros o combinaciones de los mismos en cantidades extremadamente pequeñas, donde la historia de reacción, y la composición en los casos apropiados, pueden definirse mediante las señales de la presente invención. Los no oligómeros incluyen una gran diversidad de moléculas orgánicas, por ejemplo, heterocíclicas, aromáticas, alicíclicas, alifáticas y combinaciones de las mismas, que comprenden esteroides, antibióticos, inhibidores enzimáticos, ligandos, hormonas, fármacos, alcaloides, opioides, terpenos, porfirinas, toxinas, catalizadores, así como combinaciones de los mismos. Los oligómeros incluyen oligopéptidos, oligonucleótidos, oligosacáridos, polilípidos, poliésteres, poliamidas, poliuretanos, poliureas, poliéteres, derivados de polifósforo, por ejemplo fosfatos, fosfonatos, fosforamidas, fosfonamidas, fosfitos, fosfinamidas, etc., derivados de poliazufre, por ejemplo sulfonas, sulfonatos, sulfitos, sulfonamidas, sulfenamidas, etc., donde en el caso de los derivados de fósforo y azufre, el heteroátomo indicado estará unido principalmente a C, H, N, O o S, y combinaciones de los mismos.

Las reacciones pueden implicar modificaciones en una diversidad de sitios aleatorios de una estructura molecular de núcleo central o modificaciones en un sitio específico. Por ejemplo, puede bromarse un compuesto policíclico, pudiéndose producir la bromación en una pluralidad de sitios o usar un agente de bromación que sea específico para un sitio particular, por ejemplo, N-bromosuccinimida. En la mayoría de los casos, las reacciones implicarán sitios únicos o sitios equivalentes, por ejemplo, uno o dos grupos hidroxilo de un glicol.

En la mayor parte de los casos, la síntesis de la presente invención tendrá al menos dos etapas en las que otros grupos bifuncionales distintos se unen usando la misma funcionalidad de unión, por ejemplo, aminoácidos y enlaces amida, nucleótidos y enlaces de éster de fosfato, o compuestos miméticos de los mismos, por ejemplo, aminoisocianatos y enlaces de urea.

Los métodos relacionados con la invención permiten la variación en la reacción en cada etapa, dependiendo de la elección de agentes y las condiciones implicadas. De esta forma, para los aminoácidos, puede haber hasta 20 aminoácidos implicados usando los aminoácidos comunes codificados de forma natural y una elección mucho más amplia, si se desean usar otros aminoácidos, tales como D-aminoácidos, aminoácidos que tienen el grupo amino en otra posición diferente a la posición \alpha, aminoácidos que tienen substituyentes diferentes en la cadena lateral o substituyentes en el grupo amino, y similares. Para los diferentes ácidos nucleicos, habrá hasta 4 ácidos nucleicos naturales usados para el ADN o el ARN y es posible un número mucho mayor si se elige usar los ácidos nucleicos particulares. Para los azúcares y lípidos, hay un número grande de compuestos diferentes, compuestos que pueden incrementarse adicionalmente mediante diversas substituciones, pudiéndose usar todos estos compuestos en la síntesis. Para compuestos orgánicos individuales la elección puede ser astronómicamente grande. Además, puede haber análogos miméticos, donde las ureas, uretanos, grupos carbonilmetileno y similares pueden substituir el enlace peptídico; diversos grupos orgánicos e inorgánicos pueden substituir el enlace fosfato; y nitrógeno y azufre pueden substituir al oxígeno en un enlace de éter o viceversa.

Las estrategias sintéticas variarán con la naturaleza del grupo de productos que se desea producir. De esta manera, la estrategia debe tener en cuenta la capacidad para cambiar de una forma por etapas la naturaleza del producto, permitiendo mientras la retención de los resultados de las etapas previas y anticipando las necesidades de las etapas futuras. Cuando las diversas unidades son de la misma familia, tales como nucleótidos, aminoácidos y azúcares, las estrategias sintéticas están relativamente bien establecidas y frecuentemente será posible la química convencional. De esta manera, para nucléotidos, puede emplearse la química de fosforamidita o fosfito; para los oligopéptidos, puede emplearse la química Fmoc o Boc, en la que se usan grupos protectores convencionales; para azúcares, las estrategias pueden ser menos convencionales, pero se han establecido un gran número de grupos protectores, funcionalidades reactivas y condiciones para la síntesis de polisacáridos. Para otros tipos de química, se comprobará la naturaleza de la unidad individual y las oportunidades sintéticas serán conocidas o se idearán, según sea apropiado.

En algunos casos, puede desearse tener los mismos o diferentes bloques introducidos en las mismas o en diferentes etapas. Por ejemplo, puede desearse tener una unidad funcional peptídica común, por ejemplo, la unidad de enlace de fibronectina (RGDS), un polisacárido, por ejemplo Le^{x}, un grupo orgánico, por ejemplo una lactama, una lactona, un anillo de benceno, una olefina, un glicol, un tioéter, etc. introducida durante la síntesis. De esta manera puede conseguirse un contexto molecular en el que se introduce la variación. Estas situaciones pueden implicar únicamente unas pocas etapas que tienen la pluralidad de elecciones, donde se producen un gran número de productos en relación con una entidad funcional particular. Esto podría tener una aplicación particular cuando se tiene interés en un gran número de derivados relacionados con una molécula central o unidad conocida por tener una característica de interés.

En el desarrollo de las estrategias sintéticas, puede proporcionarse la síntesis discontinua de varios compuestos que se prepararían durante el transcurso de la síntesis combinatoria. Tomando ejemplos extremos, por ejemplo, síntesis que podrían implicar impedimento estérico, interacciones de carga y/o dipolo, rutas de reacción alternativas, o similares, se pueden optimizar las condiciones para proporcionar mejores rendimientos de compuestos que, de otra forma, no se podrían formar o se formarían sólo con bajos rendimientos. De esta manera, pueden permitirse una diversidad de condiciones de reacción durante la síntesis combinatoria que implican diferencias en el disolvente, temperaturas, tiempos, concentraciones, y similares. Además, puede usarse la síntesis discontinua, que proporcionará concentraciones mucho mayores de productos particulares que la síntesis combinatoria, para desarrollar ensayos para caracterizar la actividad de los compuestos.

Soportes: Unión y separación

El protocolo sintético requiere que se proporcione una pluralidad de reacciones diferentes, incluyendo reactivos diferentes, dando como resultado una pluralidad de intermedios diferentes en cada etapa de la síntesis. Aunque estén disponibles otras técnicas, esto puede realizarse convenientemente empleando pequeños substratos sólidos definibles, disponibles en el mercado como perlas, que pueden mezclarse fácilmente, separarse, y servir como un substrato sólido para la síntesis secuencial. Los substratos sólidos pueden ser sólidos, porosos, deformables o duros, y tener cualquier estructura y forma conveniente. En algunos casos, pueden ser útiles perlas magnéticas o fluorescentes. Las perlas generalmente serán de al menos 10-2000 \mum, normalmente al menos de 20-500 \mum, más normalmente de al menos 50-250 \mum de diámetro.

Puede usarse cualquier composición conveniente para las partículas o perlas, composición de perla que mantendrá su integridad mecánica durante las diversas etapas de proceso, puede funcionalizarse, tiene grupos funcionales o permite la reacción con una especie activa, permite la síntesis en serie así como la unión de los identificadores, puede mezclarse y separarse fácilmente, y permitirá la separación conveniente de las señales y productos. Las perlas que pueden emplearse incluyen perlas de celulosa, perlas de vidrio poroso, gel de sílice, perlas de poliestireno, particularmente perlas de poliestireno reticulado con divinilbenceno, perlas de co-polímeros injertados tales como polietilenglicol/poliestireno, perlas de poliacrilamida, perlas de látex, perlas de dimetilacrilamida, particularmente reticuladas con N,N'-bis-acriloil etileno diamina y que comprenden N-t-butoxicarbonil-\beta-alanil-N'-acriloil hexametileno diamina, compuestos, tales como partículas de vidrio recubiertas con un polímero hidrófobo tal como poliestireno reticulado o un polímero de etileno fluorado al que se injerta poliestireno lineal; y similares. Pueden encontrarse artículos generales de soportes sólidos útiles (partículas) que incluyen una funcionalidad reactiva unida covalentemente en Atherton, et al., Prospective in Peptide Chemistry, Karger, 101-117 (1981); Amamath, et al., Chem. Rev. 77: 183-217 (1977); y Fridkin, The Peptides, Vol. 2, Capítulo 3, Academic Press, Inc., (1979), págs. 333-363.

Dependiendo de la naturaleza del procedimiento sintético o del ensayo del producto final, una u otra perla puede ser más o menos deseable. Aunque las perlas son especialmente convenientes, pueden usarse otros soportes sólidos, tales como capilares, fibras huecas, agujas, fibras sólidas, etc., donde el tamaño del soporte sólido permite la variación deseada en las historias de reacción.

Dependiendo de la naturaleza de la síntesis, las perlas pueden funcionalizarse de una diversidad de maneras para permitir la unión del reactivo inicial. Éste puede unirse mediante un enlace no lábil tal como un enlace de éster, un enlace de amida, un enlace de amina, un enlace de éter, o a través de un átomo de azufre, silicio o carbono, dependiendo de si se desea permitir la retirada del producto de la perla. Convenientemente, el enlace a la perla puede ser permanente, pero puede proporcionarse un enlazador entre la perla y el producto que sea escindible tal como se muestra en la Tabla 1. Pueden emplearse dos o más enlaces diferentes para proporcionar medios para la liberación diferencial de señales y/o productos.

Dependiendo de la naturaleza del grupo de unión unido a la partícula, pueden no ser necesarias las funcionalidades reactivas sobre la perla cuando la manera de enlazar permite la inserción en enlaces sencillos o dobles, tal como se puede hacer con carbenos y nitrenos u otras especies altamente reactivas. En este caso, el enlace escindible se proporcionará en el grupo de unión que une el producto o la señal con la perla.

Deseablemente, cuando el producto está unido permanentemente, la unión a la perla se extenderá, de forma que la perla no interfiera estéricamente con la unión del producto durante la selección. Pueden emplearse diversos enlaces, en particular enlaces hidrófilos, tales como polietilenoxi, sacáridos, polioles, ésteres, amidas, combinaciones de los mismos y similares.

Las funcionalidades presentes en la perla pueden incluir hidroxi, carboxi, iminohaluro, amino, tio, halógeno activo (Cl o Br) o pseudohalógeno (por ejemplo, -CF_{3}, -CN, etc.), carbonilo, sililo, tosilo, mesilatos, brosilatos, triflatos o similares. En la selección de la funcionalidad, debe considerarse el hecho de que los identificadores normalmente también se convertirán en uniones a la perla. La consideración se incluirá si la misma o una funcionalidad diferente se asociase con el producto y el identificador, así como si las dos funcionalidades fuesen compatibles con el producto o las etapas de unión al identificador y de separación de la señal, según sea apropiado. Pueden emplearse diferentes grupos de unión para el producto, de forma que pueda liberarse selectivamente una cantidad específica del producto. En algunos casos, la partícula puede tener funcionalidades protegidas que pueden estar parcial o totalmente desprotegidas antes de cada etapa, y en el último caso, reprotegidas. Por ejemplo, un grupo amino puede protegerse con un grupo carbobenzoxi como en la síntesis de polipéptidos, un grupo hidroxi con un éter bencílico, etc.

Cuando se desea la separación del producto, hay numerosas funcionalidades y reactivos que pueden usarse. Convenientemente, pueden usarse éteres, donde los éteres bencílicos o derivados de los mismos, por ejemplo benzhidril éter, indanil éter, etc. pueden escindirse mediante condiciones reductoras ácidas o suaves. Como alternativa, se puede emplear eliminación \beta, donde una base suave puede servir para liberar el producto. Pueden emplearse acetales, incluyendo los análogos tio de los mismos, donde un ácido suave puede ser adecuado, particularmente en presencia de un compuesto de captura de carbonilo. Combinando formaldehído, HCl y un resto alcohólico, se forma un \alpha-cloroéter. Después, éste puede acoplarse con una funcionalidad hidroxi sobre la perla para formar el acetal. Pueden emplearse varios enlaces fotolábiles, tales como o-nitrobencil, 7-nitroindanil, 2-nitrobenzhidril éteres o ésteres, etc. Los ésteres y amidas pueden servir como enlazadores, en cuyo caso se forman ésteres o amidas semi-ácidos, particularmente con anhídridos cíclicos, seguido de la reacción con funcionalidades hidroxilo o amino sobre la perla, usando un agente de acoplamiento tal como una carbodiimida. Pueden usarse péptidos como enlazadores, en cuyo caso la secuencia se somete a hidrólisis enzimática, particularmente cuando la enzima reconoce una secuencia específica. Pueden prepararse carbonatos y carbamatos usando derivados de ácido carbónico, por ejemplo fosgeno, carbonil diimidazol, etc. y una base suave. El enlace puede escindirse usando ácido, base o un agente reductor fuerte, por ejemplo, LiAlH_{4}, particularmente para los ésteres carbonato. Para una lista de enlaces separables, véase, por ejemplo, Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2ª ed. Wiley, 1991. La versatilidad de los diversos sistemas que se han desarrollado permite una gran variación en las condiciones para la unión de productos e identificadores y la separación diferencial de los productos y señales, según se desee.

La siguiente tabla indica varias unidades de unión ilustrativas (es decir, F^{2} en la Fórmula I) y la manera en la que se escinden:

TABLA 1 Diversas unidades de unión ilustrativas y la manera en la que escinden

1

2

6

10

L es la señal o el producto unido directamente al átomo indicado o unido indirectamente a través de un grupo de unión tal como C(O)O, grupo de unión que puede proporcionar una funcionalidad conveniente.

R es H o alquilo inferior.

Enlazador

La elección del enlazador para el enlace será parte de la estrategia sintética, ya que el grupo de unión puede dar como resultado una funcionalidad residual sobre el producto. Normalmente será difícil, pero posible, modificar adicionalmente el producto después de la separación de la perla. En el diseño de la estrategia sintética, puede usarse una funcionalidad para retenerse en el producto como el punto de unión para el grupo de enlace. Como alternativa, cuando se permita por la naturaleza del producto, podría usarse un método de escisión o separación que retire la funcionalidad de enlace, por ejemplo, un ariltioéter o sililo con un hidruro metálico o ácido. Ya que en muchos casos la estrategia sintética podrá incluir un sitio funcionalizado para la unión, la funcionalidad puede ser ventajosa en la elección del grupo de enlace. En algunos casos puede desearse tener funcionalidades diferentes en el sitio de enlace del producto al soporte, lo cual puede necesitar usar diferentes modos de enlace, que deben adaptarse al mismo método de separación o a métodos de separación diferentes que puedan realizarse simultáneamente o consecutivamente, por ejemplo, irradiación con luz e hidrólisis ácida.

Son de particular interés para la unión de los identificadores con la partícula los carbenos y nitrenos que pueden insertarse entre un átomo de carbono e hidrógeno para formar un enlace covalente, o en un enlace olefínico para formar un ciclopropano (en el caso del carbeno) o una aziradina (en el caso del nitreno).

Con los grupos de enlace de carbeno o nitreno pueden usarse varios bencenos substituidos, donde el benceno está substituido con un grupo capaz de proporcionar un carbeno: CHN_{2}, COCHN_{2}, SO_{2}CHN_{2}; o nitreno: N_{3}, NO_{2}, NO, SO_{2}N_{3}. Los carbenos pueden generarse a partir de derivados de diazolalcano mediante fotólisis, termólisis o mediante tratamiento con especies metálicas de transición de baja valencia, por ejemplo, Rh(OAc)_{2}. El nitreno puede generarse mediante fotólisis o termólisis a partir de azidas; y a partir de nitro, nitroso y azidas usando compuestos de fósforo trivalente o metales de transición de baja valencia.

Un grupo de restos enlazadores (F^{1}-F^{2}-) de particular interés incluye restos 2-nitro-4-carboxibenciloxi, 2-nitro-4-diazoacetilbenciloxi, 4 ó 5 azidometilcarbonil-2-metoxifenoxi y 2-metoxi-4, o 5-carboxifenoxi.

Los compuestos ilustrativos en los que T representa la señal, Z representa un precursor de carbeno o nitreno o un grupo carboxi y R es H o alquilo inferior son los siguientes. Para la separación fotoquímica de la señal (por ejemplo, con luz ultravioleta a aproximadamente 350 nm): T 3-Z-2-nitrobencil éter, T 4-Z-2-nitrobencil éter, T 5-Z-2-nitrobencil éter, T 6-Z-2-nitrobencil éter, T 2-Z-4-nitrobencil éter, T 3-Z-4-nitrobencil éter, T 3-Z-2-nitrobencil carbonato, T 4-Z-2-nitrobencil carbonato, T 5-Z-2-nitrobencil carbonato, T 6-Z-2-nitrobencil carbonato, T 2-Z-4-nitrobencil carbonato y T 3-Z-4-nitrobencil carbonato. Para la separación oxidativa (por ejemplo, usando nitrato amónico cérico): 1-OT-2-OR-3-Z-benceno, 1-OT-2-OR-4-Z-benceno, 1-OT-2-OR-5-Z-benceno, 1-OT-2-OR-6-Z-benceno, 1-OT-4-OR-2-Z-benceno y 1-OT-4-OR-3-Z-benceno. Para la separación reductora o alquilante (por ejemplo, con litio/amoniaco o yoduro de metilo): T (2-Z-fenil)tioéter, T (3-Z-fenil)tioéter y T (4-Z-fenil)tioéter. Para la separación desililante (por ejemplo, usando fluoruro de tetrabutilamonio o ácido): T dialquil-(2-Z-fenil)silil éter, T dialquil-(3-Z-fenil)silil éter, T dialquil-(4-Z-fenil)silil éter, T-dialquil-(2-Z-fenil)silano, T-dialquil-(3-Z-fenil)silano y T-dialquil-(4-Z-fenil)silano.

Síntesis combinatoria

La síntesis normalmente implicará etapas que incluyen al menos 2 elecciones, frecuentemente al menos 4 elecciones, y pueden implicar 10 elecciones o más. Generalmente, el número de elecciones por etapa no excederá de aproximadamente 100 y lo más habitual es que no exceda de aproximadamente 50. El número de etapas normalmente será de al menos aproximadamente 3, más normalmente de al menos aproximadamente 4, frecuentemente de al menos 5, y no más de aproximadamente 30, más normalmente no más de aproximadamente 25, preferiblemente no más de aproximadamente 20, más preferiblemente no más de aproximadamente 10, frecuentemente no más de aproximadamente 8.

El número de elecciones y etapas normalmente dará como resultado al menos un número de compuestos que facilite una diversidad suficiente para proporcionar una probabilidad razonable de que al menos un compuesto tenga la característica de interés. La metodología de la presente invención permite una producción mayor de 25.000 compuestos, normalmente mayor de 50.000 compuestos, preferiblemente mayor de 200.000 compuestos, y pueden producirse un millón o más. Esto normalmente significará al menos 20 compuestos, pero pueden ser 10^{6} o más.

En algunas síntesis, una etapa puede implicar únicamente una o dos elecciones, pero esta situación normalmente estará limitada en relación con el número de compuestos que uno desea producir y la estrategia sintética particular. En muchas de estas estrategias, el número restringido de elecciones, es decir, menos de 5 elecciones, más habitualmente 2 elecciones o menos, estará limitado a más del 40% del número total de etapas o a aproximadamente 2 etapas en la síntesis secuencial, más habitualmente estará limitado al 20% del número total de etapas.

Procedimiento de reacción

En la realización de la síntesis, se puede comenzar inicialmente con un número de perlas, normalmente al menos 10^{3}, más normalmente al menos 10^{4} y deseablemente al menos 10^{5}, mientras que generalmente no exceda de al menos 10^{15}, más normalmente no exceda de al menos 10^{10}. Dependiendo del número de elecciones en la primera etapa, se dividirán las partículas en un número concreto de recipientes. Pueden usarse placas de pocillos de microtitulación, recipientes individuales,, columnas, geles, placas de Terasaki, matraces, recipientes de síntesis de Merrifield, etc. Las partículas normalmente se dividirán en grupos de al menos una partícula cada uno, normalmente una pluralidad de partículas, generalmente 1000 o más, y puede ser de 10^{5} o más dependiendo del número total de partículas y elecciones implicadas en la etapa.

Después, se añadirían los agentes apropiados a cada uno de los recipientes individuales para procesarlos en etapas y añadir los identificadores que codifican el reactivo y la etapa. Cada etapa proporcionaría la reacción deseada. Una vez que se completa la(s) reacción(es), puede ser deseable lavar las perlas de cualquier reactivo, seguido de la combinación de todas las perlas en una única mezcla y después separando las perlas de acuerdo con el número de elecciones para la siguiente etapa. Este procedimiento de división de perlas, seguido de las etapas de señalización y síntesis (o viceversa), y después de la combinación de nuevo de las perlas se repite hasta que se completa la síntesis combinatoria.

En algunos casos, puede realizarse la misma reacción en 2 o más recipientes para mejorar la proporción de producto que tiene una reacción particular en una etapa particular en comparación con las otras elecciones. En otros casos, una o más de las etapas pueden implicar que una porción de las perlas se pongan por separado y no experimenten reacción, para mejorar la variabilidad asociada con el producto final. En otras situaciones, pueden obtenerse lotes por diferentes rutas sintéticas.

Con el fin de registrar o codificar la historia de la síntesis en las perlas, en una realización pueden estar presentes C o C^{1} o ambos y la unión posterior de C excluye la presencia de C^{1} en cada etapa, de forma que se podrían señalar las perlas asociadas con cada elección y etapa con su propia combinación única de identificadores. Como alternativa, puede usarse una única señal para registrar o codificar la historia de la síntesis. Dependiendo de las químicas implicadas, esta señalización puede hacerse antes, después, o concomitantemente con las reacciones que comprenden cada elección. Además, como control, pueden seleccionarse perlas de muestra en cualquier etapa y retirarse por escisión una porción de sus señales y decodificarse para verificar que las señales correctas están unidas a las perlas de muestra.

Como se ha indicado previamente, en algunos casos, se segregarán porciones de las partículas en subgrupos, donde cada uno de los subgrupos después experimentaría una serie de reacciones diferentes. En cualquier momento, las porciones pueden recombinarse en una única mezcla para la siguiente reacción. Por ejemplo, si en una etapa se introduce insaturación, podrían proporcionarse dos subgrupos, donde en un subgrupo la insaturación se reduce, mientras que en el otro subgrupo la insaturación se epoxida. Después, estos dos subgrupos podrían someterse a una serie de reacciones diferentes.

Después de que se complete la síntesis de los productos, éstos se seleccionan para una propiedad deseada después de la separación del ligando de la perla o mientras aún está unida. En el último caso, las perlas pueden, por ejemplo, incubarse en tampón acuoso con anticuerpo monoclonal de ratón Y. Después de la incubación y el lavado, las perlas se incuban con anticuerpo policlonal de conejo (o cabra) conjugado con fosfatasa alcalina dirigido contra anticuerpos de ratón. Usando un reactivo de desarrollo de precipitación fluorescente, las perlas fluorescentes con anticuerpo monoclonal unido se identifican y se separan manualmente de la mayoría de las perlas transparentes no teñidas. Como alternativa, las perlas fluorescentes pueden separarse usando un separador de células activadas por fluorescencia, siempre que las señales queden retenidas en la perla en las condiciones de separación. Cada perla fluorescente seleccionada se somete a un medio para liberar al menos algunas de las señales de la perla.

En caso de que la síntesis no implique la adición por etapas de unidades análogas, o cuando se forman subproductos de reacción, puede haber casos en los que haya una pluralidad de compuestos sobre una única perla o la estructura del compuesto activo no pueda conocerse a partir de su historia de reacción. De acuerdo con la presente invención, conociendo la historia de reacción puede repetirse la síntesis a gran escala para obtener una cantidad suficiente de producto(s) para aislar el/los producto(s) e identificar estructuralmente el compuesto activo.

La metodología de la presente invención puede ilustrarse usando diversas secuencias de reacción. Por ejemplo, pueden prepararse barbituratos combinando un aldehído o cetona con un éster de acetato para preparar un crotonato en condiciones de Claisen para proporcionar un crotonato de no substituido a tetrasubstituido. Después, el crotonato puede combinarse con un acetato secundario en condiciones de Michael, por lo que puede obtenerse un glutarato que tiene hasta 6 substituyentes. Después, el glutarato combinarse con amoniaco o amina monosubstituida para proporcionar el barbiturato. Variando los aldehídos y cetonas, los acetatos y las aminas, puede obtenerse una gran variedad de barbituratos. Cuando están presentes funcionalidades sobre uno o más de los substituyentes, tales como amino, carboxi, hidroxi, tiol y similares, estos grupos pueden protegerse o modificarse según se desee.

En otro ejemplo descrito por Bunin y Ellman, J. Am. Chem. Soc., 114, 10997 (1992), se producen benzodiacepinas. Se inicia la síntesis con diferentes 2-aminobenzofenonas substituidas amino-protegidas unidas a partículas individuales a través de, por ejemplo, un grupo 4'-oxi. A cada grupo diferente de partículas en recipientes diferentes, después de la desprotección, se le añade un \alpha-aminoácido protegido con Fmoc, natural o sintético, en condiciones en las que se forma un enlace peptídico. Después de la desprotección, se provoca la ciclación interna, seguido de la alquilación sobre nitrógeno con un agente de alquilación. En sólo tres etapas, puede prepararse un gran número de benzodiacepinas y seleccionarse las bibliotecas con respecto a actividades tranquilizantes u otras actividades.

Puede producirse una gran variedad de análogos de fármacos, tales como análogos de agentes antihipertensores, por ejemplo enalapril; \beta-bloqueantes, por ejemplo propanolol; fármacos para úlceras (antagonistas del receptor de H_{2}) por ejemplo cimetidina y ranitidina; agentes antifúngicos (inhibidores de colesterol-dimetilasa) por ejemplo isoconazol; ansiolíticos, por ejemplo diazepam; analgésicos, por ejemplo aspirina, fenacetamida y fentanilo; antibióticos, por ejemplo vancomicina, penicilina y cefalosporina; antiinflamatorios, por ejemplo, cortisona; anticonceptivos, por ejemplo progestinas; abortivos, por ejemplo RU-456; antihistaminas, por ejemplo clorfenamina; antitusivos, por ejemplo codeína; sedantes, por ejemplo barbitol; etc.

\newpage

Una síntesis ilustrativa de análogos de cimetidina podría implicar histidinas substituidas con hidroximetilo, y liberar heterociclos, donde los átomos de carbono o átomos de nitrógeno restantes podrían estar adicionalmente substituidos o no substituidos, \alpha,\omega-aminoalquiltioles, y ésteres de tioamidina substituidos, donde los grupos sobre el nitrógeno podrían variar, tales como nitro, ciano, hidroxi, alquilo, combinaciones de los mismos y similares.

Identificador

Los identificadores para el uso en esta invención pueden representarse mediante la Fórmula I:

IF^{1}-F^{2}-\underline{C}-E-\underline{C}'

en la que F^{1}-F^{2}' es un enlazador que permite la unión a un soporte y la separación de la señal del soporte; y

C-E-C' es la señal que es capaz de la detección y distinción;

E es un componente señal que (a) permite la detección, tal como un grupo electrofórico que puede analizarse por cromatografía de gases o espectroscopía de masas o (b) permite la detección y la separación;

C y C' son componentes señal que tienen en cuenta la distinción individual de una señal del resto de las señales, permitiendo normalmente la separación como resultado de la longitud variable o substitución, por ejemplo, variación del tiempo de retención cromatográfico o de la relación m/e de la espectroscopía de masas;

F^{2} es un componente de unión capaz de separarse selectivamente para liberar el componente señal; y

F^{1} es un grupo funcional que se proporciona para la unión al soporte; o

F^{2} es un enlace cuando F^{1} es un grupo de escisión tal como OH o carboxi.

Aunque los identificadores de Fórmula I se añaden típicamente en cada etapa y elección apropiada durante la síntesis combinatoria, la parte E puede añadirse al final de la síntesis antes o después de la escisión (preferiblemente fotoquímica u oxidativamente) del substrato. Específicamente, cuando C contiene OH, NHR^{4} o SH, E puede unirse a C antes de la escisión. Como alternativa, si E se une después de la escisión, el punto de unión a C puede ser en el que se une F^{2}. Esto se muestra en el siguiente esquema:

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en el que	S = substrato y
	n = 1-40

La unión del identificador con el substrato puede representarse como se indica a continuación:

F^{1}-F^{2}-\underline{C}-E-\underline{C}' + S \rightarrow S-F^{1}'-F^{2}-\underline{C}-E-\underline{C}'

donde F^{1}'-F^{2}-C-E-C' representa el resto identificador unido al substrato. Por ejemplo, cuando la perla se funcionaliza con un grupo aminometilo y F^{1} es CO_{2}H, entonces F^{1}' es -C(O)-; cuando la perla contiene un enlace insaturado y F^{1} es N_{2}CH-C(O)-, entonces F^{1}' es N_{2}CH-C(O)-, o -CH_{2}-C(O).

Son compuestos de fórmula I de particular interés para el uso como identificadores los compuestos de la Fórmula Ia:

IaF^{1}-F^{2}-(\underline{C}(E-\underline{C}')_{a})_{b}

donde:

F^{1} es CO_{2}H, CH_{2}X, NR^{1}R^{1}, C(O)R^{1}, OH, CHN_{2}, SH, C(O)CHN_{2}, S(O_{2})Cl, S(O_{2})CHN_{2}, N_{3}, NO_{2}, NO, S(O_{2})N_{3}, OC(O)X, C(O)X, NCO o NCS;

F^{2} es

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A es -O-, -OC(O)O-, -OC(O)- o -NHC(O)-;

C es un enlace, alquileno con 1 a 20 átomos de carbono opcionalmente substituido con 1-40 F, Cl, Br, alcoxi con 1 a 6 átomos de carbono, NR^{4}R^{4}, OR^{4} o NR^{4}, o -[(C(R^{4})_{2})_{m}-Y-Z-Y-(C(R^{4})_{2})_{n}Y-Z-Y]_{p}-; con la condición de que el número máximo de átomos de carbono en C+C' sea preferiblemente 20;

C' es H; F; Cl; alquileno con 1 a 20 átomos de carbono opcionalmente substituido con 1-40 F, Cl, Br, alcoxi con 1 a 6 átomos de carbono, NR^{4}R^{4}, OR^{4}, o NR^{4}, o -[(C(R^{4})_{2})_{m}-Y-Z-Y-(C(R^{4})_{2})_{n}Y-Z-Y]_{p}-;

E es alquilo con 1 a 10 átomos de carbono substituido con 1-20 F, Cl o Br; o Q-arilo, donde el arilo está substituido con 1-7 F, Cl, NO_{2}, SO_{2}R^{5}, o fenilo substituido, donde el substituyente es 1-5 F, Cl, NO_{2} o SO_{2}R^{5};

R^{1} es H o alquilo con 1 a 6 átomos de carbono;

R^{3} es C=O, C(O)O, C(O)NR^{1}, S, SO o SO_{2};

R^{4} es H o alquilo con 1 a 6 átomos de carbono;

R^{5} es alquilo con 1 a 6 átomos de carbono;

a es 1-5;

b es 1-3;

cada uno de m y n es 0-20;

p es 1-7;

Q es un enlace, O, S, NR^{4}, C=O, -C(O)NR^{5}, -NR^{5}C(O)-, -C(O)- o -OC(O)-;

X es un grupo saliente tal como Br, Cl, triflato, mesilato, tosilato o OC(O)OR^{5};

Y es un enlace, O, S o NR^{4};

Z es un enlace; fenilo opcionalmente substituido con 1-4 F, Cl, Br, alquilo con 1 a 6 átomos de carbono; alcoxi con 1 a 6 átomos de carbono, alquilo con 1 a 6 átomos de carbono substituido con 1-13 F, Cl o alquiloxi con 1 a 6 átomos

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de carbono substituido con 1-13 F, Cl o Br; (C(R^{4})_{2})_{1-20}; o (CF_{2})_{1-20}; con la condición de que cuando Z es un enlace, uno de sus Y adyacentes también es un enlace; y

arilo es un anillo aromático mono- o bi-cíclico que contiene hasta 10 átomos de carbono y hasta 2 heteroátomos seleccionados entre O, S y N.

En las definiciones de F^{2} en la Fórmula Ia, el enlace de la izquierda se representa unido a F^{1}.

También son útiles como identificadores los compuestos de la Fórmula Ia';

IaF^{1}-(\underline{C}(E-\underline{C}')_{a})_{b}

donde:

F^{1} es OH o COOH; y

el resto de las definiciones son como en la Fórmula Ia.

Los compuestos preferidos de Fórmula Ia son aquellos en los que;

F^{1} es CO_{2}H, OH, CHN_{2}, C(O)CHN_{2}, C(O)X, NCS, OI, CH_{2}X;

F^{2} es

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cada uno de C y C' es independientemente alquileno con 1 a 20 átomos de carbono sin substituir o substituido con 1-40 F o Cl, o [O-(CH)_{2-3}]_{p};

E es alquilo con 1 a 10 átomos de carbono substituido con 1-20 F o Cl; Q-arilo, donde arilo es un anillo aromático bi-cíclico substituido con 1-7 F o Cl; o Q-fenilo substituido con 1-5 F, Cl, NO_{2} o SO_{2}R^{5}; y

Q es un enlace, O, -NR^{5}C(O)- o -OC(O)-.

Los compuestos preferidos de Fórmula Ia son aquellos en los que

-C(E-C')_{a} se representa por -(CH_{2})_{3-15}-(CF_{2})_{1-15}F, -(CH_{2})_{3-15}-(CCl_{2})_{1-15}Cl, -(CH_{2}CH_{2}-O)_{1-5}-Ar, -(CH_{2}CH_{2}CH_{2}O)_{1-5}-Ar o -(CH_{2})_{1-12}-O-Ar;

donde Ar es pentafluoro-, pentacloro- o pentabromofenilo, 2,3,5,6-tetrafluoro-4(2,3,4,5,6-pentafluorofenil)fenilo, 2,4,6-triclorofenilo, 2,4,5-triclorofenilo, 2,6-dicloro-4-fluorofenilo o 2,3,5,6-tetrafluorofenilo.

Otros compuestos preferidos de Fórmula Ia se representan por las fórmulas:

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donde Ar es pentafluoro-, pentacloro- o pentabromofenilo, 2,3,5,6-tetrafluoro-4(2,3,4,5,6-pentafluorofenil)fenilo, 2,4,
6-triclorofenilo, 2,4,5-triclorofenilo, 2,6-dicloro-4-fluorofenilo o 2,3,5,6-tetrafluorofenilo.

Otros compuestos preferidos de fórmula Ia son aquellos en los que E-C' es H, OH o NH_{2}. Tales compuestos son particularmente útiles para la reacción con un E al final de la síntesis combinatoria, especialmente con un E detectable por fluorescencia o captura de electrones, tal como cloruro de dansilo o haluro de polihalobenzoílo.

Los compuestos de Fórmula I pueden prepararse de acuerdo con los siguientes esquemas ejemplares u otros medios conocidos por los especialistas en la técnica.

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Esquema 1

Preparación de la señal identificadora

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Esquema 2

Identificadores con enlazadores de escisión fotolítica

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Esquema 3

Identificadores con Enlazadores de Escisión Oxidativa

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Esquema 4

Identificadores con enlazadores de liberación oxidante alternativos

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Esquema 5

Señales E-C'

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Esquema 6

Identificadores con enlazadores de escisión fotolítica

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Esquema 7

Identificadores con enlazadores de escisión oxidante

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El identificador puede comprender una o una pluralidad de señales idénticas. Los identificadores serán uno o más compuestos químicos individuales que pueden distinguirse entre sí y que identificarán de forma única las diferentes elecciones y etapas. De esta manera, pueden prepararse bibliotecas combinatorias muy grandes con un número relativamente pequeño de identificadores, normalmente con menos de 50 señales.

Durante cada etapa, se añadirá una combinación de identificadores, que define la etapa y la elección. Cada identificador se unirá, de forma covalente o no covalente a la perla o al producto, normalmente a la perla. Las combinaciones de identificadores se usan para proporcionar un código binario u otro código en cada etapa, con lo que pueden definirse la elección y la etapa. La combinación de identificadores puede incluir cero o sólo un identificador.

Señales

Por lo que respecta a las señales (C-E-C'), las señales que se emplean se caracterizarán como se indica a continuación: por poder retirarse de la perla por medios que dependen de F^{2}, preferiblemente por fotolisis u oxidación; por poderse diferenciar, normalmente separar, individualmente; por ser estables en las condiciones de síntesis; y por codificar tanto la etapa como la elección para definir de forma única la elección del agente usado en cada etapa de la síntesis; deseablemente, debería haber una forma sencilla para identificar las diversas señales con un equipo adquirible fácilmente que no requiera capacidades técnicas sofisticadas para funcionar; deben ser relativamente económicas y proporcionar una señal fuerte basada en relativamente pocas moléculas; y las señales deben proporcionar suficiente sensibilidad como para permitir la distinción de las señales de los demás componentes que pueden estar presentes durante las determinaciones de las señales.

Las señales pueden estar relacionadas estructuralmente o no, como en una serie homóloga, grupos funcionales repetidos, miembros relacionados de la Tabla Periódica, isótopos diferentes, combinaciones de los mismos o similares. Las señales pueden usarse como elementos de un código binario, de forma que una señal pueda definir dos elecciones, dos señales puedan definir cuatro elecciones, tres señales puedan definir ocho elecciones, cinco señales puedan definir treinta y dos elecciones, etc. De esta forma, en cada etapa de la síntesis, un número relativamente pequeño de señales puede designar un número mucho mayor de elecciones. Las señales que comprenden los identificadores para cada etapa pueden o no estar relacionadas con otras etapas. Cada señal para cualquier síntesis combinatoria debe poder distinguirse de todas las demás señales. De esta manera, pueden prepararse bibliotecas combinatorias muy grandes con un número relativamente pequeño de señales, normalmente menor de 60 señales, más habitualmente menor de aproximadamente 50 señales.

Para cada perla, normalmente habrá al menos 0,01 femtomoles, más habitualmente de 0,001 a 50 pmol, de cada señal, aunque pueden usarse cantidades menores o mayores en circunstancias especiales. La cantidad de producto también puede estar al menos en el mismo intervalo y puede ser de hasta 10^{4} o mayor, siendo normalmente de al menos 0,01 pmol, más habitualmente de al menos 1,0 pmol y generalmente no mayor que aproximadamente 10 nmol. Dependiendo del número de perlas, el número de etapas y el número de elecciones por etapa, el número de productos producidos normalmente excederá de 10^{2}, más habitualmente de 10^{3}, y puede exceder de 10^{10}, normalmente sin exceder de aproximadamente 10^{8}, estando preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 10^{4} a 10^{8}, más habitualmente de 10^{5} a 10^{8}.

Las señales serán, en su mayor parte, moléculas orgánicas. Cada señal normalmente tendrá menos de aproximadamente 100 átomos, más habitualmente menos de aproximadamente 80 átomos, generalmente menos de aproximadamente 60 átomos, distintos de hidrógeno, excluyendo el resto de unión que no queda retenido tras la liberación de la señal desde la perla. El resto de unión puede ser de cualquier tamaño, teniendo normalmente menos de aproximadamente 30 átomos, más habitualmente menos de 20 átomos, distintos de hidrógeno. El tamaño del resto de unión no es crítico, pero puede ser conveniente un tamaño concreto. Las señales pueden formar familias de compuestos donde todos los compuestos son de naturaleza similar o pueden ser combinaciones de diferentes familias, donde los compuestos pueden ser alifáticos, alicíclicos, aromáticos, heterocíclicos o combinaciones de los mismos. Las características de distinción pueden ser el número de unidades repetidas, tales como grupos metileno en un resto alquilo, grupos alquilenoxi en un resto polialquilenoxi, grupos halo en un compuesto polihalogenado, etilenos \alpha- y/o \beta-substituidos, donde los substituyentes pueden incluir grupos alquilo, oxi, carboxi, amino, halo o similares; isótopos; etc.

Análisis de señales

Las señales pueden retirarse de la perla usando condiciones reductoras, oxidantes, termolíticas, hidrolíticas o fotolíticas, dependiendo de la naturaleza del grupo F^{2}; por ejemplo, por oxidación de un éter de catecol con nitrato cérico amónico o por fotolisis de un éter, éster o amida de nitrobencilo, o por otros métodos, por ejemplo, los mostrados en la tabla 1.

La diferenciación de señales puede conseguirse con diferencias físicas, por ejemplo, el peso molecular de las señales o el tiempo de retención cromatográfico usando cromatografía de gases o líquida. Los isómeros posicionales pueden tener diferentes tiempos de retención. Si los isómeros posicionales o estereoisómeros son inadecuados para la separación física, se podrían usar números variables de substituyentes, por ejemplo, halógenos, tales como flúor, grupos metilo, grupos oxi u otras cadenas laterales junto con diferentes números de unidades, por ejemplo, grupos metileno o grupos etilenoxi, para proporcionar la separación deseada. Podrían usarse relaciones de radioisótopos donde los radioisótopos proporcionan emisiones diferenciales, por ejemplo ^{14}C y ^{3}H. Las diferencias físicas, particularmente el número másico, pueden proporcionar información sobre la elección y la etapa.

En lugar de relaciones ^{14}C/^{3}H, se podrían usar combinaciones de isótopos no radiactivos, por ejemplo -CH_{m}D_{n}, donde m es 0 y hasta 3 y n es 3 menos m. Por ejemplo, por medio de la detección de cantidades variables de hasta cuatro grupos metilo diferentes usando espectroscopía de masas, se podría definir un gran número de elecciones.

Cuando E es un enlace y C' es H, las señales obtenidas tras la liberación desde el soporte tienen una funcionalidad activa para la reacción con un reactivo marcador que introduce un componente E de señal detectable. Convenientemente, la funcionalidad podría ser un doble enlace, particularmente un doble enlace activado, hidroxi, tio, amino, carboxi, etc. Después, la señal reaccionaría con un exceso del reactivo marcador para proporcionar el producto (E-C) para el análisis. De esta manera, podría usarse una gran diversidad de reactivos marcadores como parte del sistema de identificación, lo cual puede no ser compatible con la estrategia de síntesis para el producto de interés. Los reactivos marcadores que pueden usarse para la detección incluyen haloaromáticos (por ejemplo, bromuro de perfluorobencilo), fluorescentes (por ejemplo, cloruro de dansilo), radioisótopos, quimioluminiscentes, etc.

Aunque se han proporcionado señales y reacciones ilustrativas, debe entenderse que podrían emplearse muchas otras combinaciones.

Dependiendo de la naturaleza química y física de las señales, se selecciona un método apropiado para la separación, deseablemente uno de varios procedimientos cromatográficos que incluyen cromatografía de gases (GC), cromatografía líquida (LC), particularmente cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía de capa fina (TLC), electroforesis, etc. En lugar del procedimiento cromatográfico, puede emplearse espectrometría de masas para la separación por el número másico. Las señales incluyen:

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para GC: moléculas orgánicas químicamente inertes que tienen diferentes pesos moleculares, incluyendo alcanos, alquenos, arenos, halocarburos, éteres, alcoholes, silanos, tioéteres, etc., particularmente compuestos halogenados, con o sin otras funcionalidades, para la detección de la captura de electrones o la detección de espectroscopía de masas (MS) con separación por GC capilar, y para compuestos con elementos no encontrados normalmente en química orgánica (por ejemplo, Sn, Ge) para la detección de la emisión de átomos con separación por GC capilar;

para LC, HPLC o TLC: véase lo anterior para GC, convenientemente éteres o hidrocarburos lineales con substitución con radioisótopos o combinaciones de radioisótopos para la detección por radioensayo o grupos adecuados para la detección de fluorescencia después de la separación;

para electroforesis: véase lo anterior, particularmente moléculas cargadas funcionalizadas, por ejemplo catiónicas o aniónicas, particularmente grupos de ácidos orgánicos o inorgánicos, donde la molécula puede estar modificada adicionalmente teniendo un radioisótopo detectable o un grupo emisor de fluorescencia para la detección en la electroforesis;

para espectroscopía de masas: véase lo anterior, particularmente distintos números másicos debidos a diferentes isótopos, diferentes números de la misma funcionalidad o diferentes funcionalidades, diferentes miembros de una serie homóloga o combinaciones de los mismos.

La separación de las señales entre sí puede implicar técnicas individuales o combinaciones de técnicas, por ejemplo, cromatografía y electroforesis; cromatografía de gases y espectroscopía de masas; etc.

Las señales para uso en la presente invención tendrán una propiedad que permite la detección a muy bajos niveles, normalmente no superiores al intervalo nanomolar, preferiblemente picomolar o menor, más preferiblemente femtomolar o menor, en presencia de otros compuestos que pueden estar presentes a niveles significativamente mayores. Por esta razón, pueden usarse substituciones atómicas específicas para hacer que los marcadores se puedan detectar fácilmente. Tales substituciones incluyen:

(a) substitución con elementos electronegativos, por ejemplo flúor o cloro, para la detección por captura de electrones junto con la detección por GC capilar o por espectroscopía de masas de ion negativo;

(b) substitución con un elemento no común (excluyendo C, H y O) para la detección de emisión atómica junto con GC capilar;

(c) substitución con varios elementos no comunes para la detección de emisión atómica para determinar la relación entre los elementos;

(d) substitución con un elemento radiactivo, por ejemplo ^{3}H, para la detección por autorradiografía o recuento de centelleo junto con LC, TLC o electroforesis; y

(e) substitución con una multiplicidad de elementos radiactivos que tienen diferentes emisiones, por ejemplo ^{3}H y ^{14}C, para la detección por autorradiografía o recuento de centelleo para determinar la relación de los diferentes elementos radiactivos.

Para la substitución de un solo elemento (a., b. y d. anteriores), una mezcla separable de señales A cuya simple presencia o ausencia puede detectarse codificaría hasta 2^{A} síntesis diferentes. Para la substitución de múltiples elementos (véanse c. y e. anteriores) una mezcla separable de señales A que tienen cada una B estados distinguibles (por ejemplo, diferentes relaciones de ^{3}H/^{14}C, o diferentes relaciones de Si/Sn) sería capaz de codificar hasta B^{A} síntesis diferentes.

Existe una gran diversidad de isótopos, donde la presencia o la relación de los isótopos puede proporcionar información sobre la etapa y la elección. Los isótopos pueden ser radiactivos o no radiactivos. Los isótopos de particular interés incluyen deuterio, tritio, ^{14}C, ^{32}P, ^{131}I, etc.

Al emplear mezclas de compuestos modificados con isótopos, se puede expandir en gran medida la información obtenida a partir de un solo compuesto señal que se distingue únicamente por la presencia de isótopos. Por ejemplo, se podría preparar una mezcla de relaciones entre hidrógeno y deuterio, pudiendo diferir las diversas relaciones tan sólo en un 10% cada una. Al reemplazar hidrógenos por otros átomos, tales como flúor, se tendría una mezcla variable de átomos de hidrógeno, deuterio y flúor, proporcionando un gran número de señales diferentes diferenciables.

Otros grupos que pueden incluirse podrían ser anillos aromáticos, que están substituidos de manera diferencial, en cuanto a la posición y la funcionalidad. De esta manera, al tener anillos de benceno substituidos, donde pueden determinarse la posición de la substitución y la naturaleza de la substitución, se puede proporcionar una pluralidad de moléculas que pueden distinguirse y pueden proporcionar información tanto de la etapa como de la elección. Por ejemplo, si C fuera constante, se podría detectar y discernir por medio del modelo de substitución en E, cuándo E es un anillo aromático polihalogenado.

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También existe la posibilidad de usar señales fluorescentes. Aunque las señales fluorescentes solas pueden no ser suficientes para definir un número significativo de etapas con un número significativo de elecciones, como se ha indicado anteriormente, al proporcionar medios para separar las moléculas de señalización fluorescente basadas en variaciones de C y C', se pueden detectar individualmente las señales por su fluorescencia.

La mezcla de señales asociada con una perla particular puede separarse y someterse a una separación inicial, siendo deseable detectar cada una de las señales por separado. Una vez que se ha separado el grupo de señales, cada una de las señales puede analizarse basándose en sus funcionalidades particulares y propiedades distintivas. Las diversas técnicas que pueden usarse para detectar las señales particulares incluyen autorradiografía o recuento de centelleo, detección de captura de electrones, espectroscopía de masas de ion negativo o positivo, espectroscopía de infrarrojos, espectroscopía ultravioleta, espectroscopía de resonancia de espín electrónico, fluorescencia, y similares.

Ensayos

Para determinar la característica de interés del producto, puede emplearse una amplia diversidad de ensayos y técnicas.

A menudo, en la selección de las perlas, se usarán perlas individuales o mezclas de perlas y se determinará si la perla o las mezclas muestran actividad. De esta forma, las mezclas pueden incluir 10, 100, 1000 o más perlas. De esta manera, pueden seleccionarse rápidamente grandes grupos de compuestos y segregarse en cantidades más pequeñas de compuestos.

Una técnica es una en la que interesa la unión a una biomolécula particular, tal como un receptor. El receptor puede ser una sola molécula, una molécula asociada con un microsoma o célula, o similar. Cuando interesa la actividad agonista, se puede desear usar un organismo o célula intacta, donde puede medirse la respuesta a la unión del producto objeto. En algunos casos, puede ser deseable separar el producto de la perla, particularmente cuando interesa la actividad fisiológica por transducción de una señal. Se dispone de diversos dispositivos para detectar la respuesta celular, tales como un microfisiómetro, disponible en Molecular Devices, Redwood City, CA. Cuando interesa la unión, se puede usar un receptor marcado, donde el marcador es un agente fluorescente, enzima, radioisótopo, o similar, pudiéndose detectar la unión del receptor a la perla. Como alternativa, se puede proporcionar un anticuerpo contra el receptor, estando el anticuerpo marcado, lo cual puede permitir la amplificación de la señal y evitar el cambio del receptor de interés, que podría afectar a su unión al producto de interés. La unión también puede determinarse mediante el desplazamiento de un ligando unido al receptor, estando marcado el ligando con un marcador detectable.

En algunos casos, es posible realizar una selección de dos etapas, con lo que primero se usa la unión como una selección inicial, seguido de la actividad biológica con una célula viable en una segunda selección. Por medio del empleo de técnicas recombinantes, se puede variar en gran medida la capacidad genética de las células. Entonces, se pueden producir genes exógenos o secuencias reguladoras de la transcripción exógenas, con lo que la unión a una proteína de la membrana superficial producirá una señal observable, por ejemplo, una señal intracelular. Por ejemplo, se puede introducir un leuco-colorante en la célula, donde se expresará una enzima que transforma el leuco-colorante en un producto coloreado, particularmente un producto fluorescente, después de la unión apropiada a la membrana superficial, por ejemplo, \beta-galactosidasa y digalactosidilfluoresceína. De esta manera, por medio de la asociación de una célula o células particulares con una partícula particular, puede determinarse la naturaleza fluorescente de la célula usando FACS, de forma que pueden identificarse las partículas que llevan compuestos activos. Pueden emplearse diversas técnicas para asegurar que la partícula permanece unida a la célula, incluso cuando el producto se libera de la partícula. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos sobre la partícula contra una proteína de la membrana superficial, se puede unir avidina a la superficie de la célula teniendo biotina la partícula, etc.

Los ensayos pueden realizarse por etapas usando partículas individuales o grupos de partículas o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, después de realizar la síntesis combinatoria, pueden segregarse grupos de aproximadamente 50 a 10.000 partículas en recipientes separados. En cada recipiente, para cada partícula, se libera una porción del producto unido a la partícula. La liberación fraccionada puede ser el resultado de la unión diferencial del producto a la partícula o el uso de una cantidad limitada de un reactivo, condición o similar, de forma que el número medio de moléculas de producto liberadas por partícula es menor que el número total de moléculas de producto por partícula. Entonces, se tendría una mezcla de productos en un volumen pequeño. Después, la mezcla podría usarse en un ensayo de unión, donde el suceso de unión podría ser la inhibición de la unión de un ligando de unión conocido a un receptor, la activación o inhibición de un proceso metabólico de una célula, o similares. Pueden usarse diversas condiciones de ensayo para la detección de la actividad de unión como se describirá posteriormente. Una vez que se ha demostrado que un grupo es activo, pueden seleccionarse las partículas individuales por el mismo ensayo o por un ensayo diferente. Por supuesto, se podría tener un procedimiento de tres o cuatro etapas, donde los grupos grandes se dividen en grupos más pequeños, etc. y finalmente se seleccionan partículas individuales. En cada caso, se liberarían porciones de los productos presentes en las partículas y la mezcla resultante se usaría en un ensayo apropiado. Los ensayos podrían ser iguales o diferentes, usándose los ensayos más sofisticados y que consumen más tiempo en las etapas posteriores o en la última etapa.

También se pueden proporcionar series espaciales, donde las partículas pueden distribuirse sobre una placa alveolar, teniendo cada pocillo de la estructura alveolar 0 ó 1 partícula.

La presente metodología puede usarse para encontrar compuestos químicos con propiedades catalíticas, tales como actividad hidrolítica, por ejemplo, actividad esterasa. Para este fin, se podrían incrustar perlas en una matriz semisólida rodeada por substratos de ensayo difundibles. Si la actividad catalítica puede detectarse localmente por procesos que no perturban la matriz, por ejemplo, por cambios en la absorción de luz o por detección de fluorescencia debida a un substrato escindido, pueden aislarse las perlas de la zona de la actividad catalítica y pueden decodificarse sus marcadores.

En lugar de la actividad catalítica, pueden desarrollarse compuestos con actividad inhibidora o activadora. Se pueden buscar compuestos que inhiban o activen una enzima o bloqueen una reacción de unión. Para detectar perlas que inhiben una enzima, teniendo las perlas un producto unido con esta propiedad deseable, es ventajoso poder liberar los productos de las perlas, permitiendo su difusión al interior de una matriz semisólida o sobre un filtro donde pueda observarse esta inhibición, activación o bloqueo. Después, pueden recogerse las perlas que forman una zona de inhibición, activación o bloqueo visualizada o detectable de otra forma, y las señales decodificarse. En este caso, es necesario que una porción de los productos sintetizados esté unida a las perlas por enlaces separables, preferiblemente un enlace fotolábil, mientras que una porción de las señales permanece unida a la perla, pudiendo liberarse después de la recogida por un medio diferente al indicado anteriormente.

Puede emplearse una membrana de diálisis donde se separa una capa de perlas de una capa de pares ligando radiomarcado/receptor. La capa de perlas podría irradiarse con luz ultravioleta y el producto liberado de la perla se difundiría en la capa de pares, liberándose el ligando radiomarcado en proporción a la afinidad del compuesto por el receptor. El ligando radiomarcado se difundiría de nuevo a la capa de perlas. Como el radiomarcador estaría próximo a la perla, se analizarían las perlas asociadas con la radioemisión.

Tiene un interés particular encontrar productos que tengan actividad biológica. En algunas aplicaciones, es deseable encontrar un producto que tenga un efecto sobre las células vivas, tal como la inhibición del crecimiento microbiano, la inhibición del crecimiento viral, la inhibición de la expresión génica o la activación de la expresión génica. La selección de los compuestos sobre las perlas puede realizarse fácilmente, por ejemplo, incrustando las perlas en un medio semisólido y permitiendo que difundan al medio circundante los compuestos de la biblioteca de moléculas de producto liberadas desde las perlas (mientras que las perlas quedan retenidas). Pueden observarse los efectos, tales como placas con un césped bacteriano. Después pueden visualizarse zonas de inhibición de crecimiento o de activación de crecimiento o efectos sobre la expresión génica y pueden recogerse y analizarse las perlas del centro de la zona.

Un esquema de ensayo implicará geles en los que la molécula o el sistema, por ejemplo, la célula sobre la que se va a actuar, puede incrustarse de una forma substancialmente homogénea. Pueden usarse diversos agentes gelificantes tales como poliacrilamida, agarosa, gelatina, etc. Después, las partículas pueden extenderse sobre el gel de manera que haya suficiente separación entre las partículas como para permitir la detección individual. Si el producto deseado tiene actividad hidrolítica, en el gel estará presente un substrato que proporcionaría un producto fluorescente. Después, se seleccionaría el gel con respecto a la fluorescencia y se seleccionarían mecánicamente las partículas asociadas con la señal fluorescente.

Se podrían tener células incrustadas en el gel, creando así un césped celular. Las partículas se extenderían como se ha indicado anteriormente. Por supuesto, se podría poner una rejilla sobre el gel definiendo áreas de una o ninguna partícula. Si el criterio fuera la citotoxicidad, se podría liberar el producto y se podría incubar durante un periodo de tiempo suficiente, seguido de la extensión de un colorante vital sobre el gel. Después podrían distinguirse las células que absorben el colorante o no absorben el colorante.

Como se ha indicado anteriormente, las células pueden tratarse por ingeniería genética para indicar cuándo se ha transducido una señal. Hay muchos receptores para los que los que se conocen los genes cuya expresión está activada. Por medio de la inserción de un gen exógeno en un sitio en el que el gen está bajo el control transcripcional de un promotor que responde a tal receptor, puede producirse una enzima que proporcione una señal detectable, por ejemplo, una señal fluorescente. Después puede analizarse la partícula asociada con la célula o células fluorescentes para determinar su historia de reacción.

Bibliotecas y kits

Por conveniencia, pueden proporcionarse bibliotecas y/o kits relacionados con la invención. Las bibliotecas comprenderían las partículas a las que se ha añadido una biblioteca de productos y señales para permitir la selección de los productos unidos a la perla o las bibliotecas comprenderían los productos retirados de la perla y agrupados individualmente o en una serie de 10 a 100 a 1000 miembros para la selección. Los kits proporcionarían diversos reactivos para el uso como señales en la realización de la síntesis de la biblioteca. Los kits normalmente tendrán al menos 4, normalmente 5, compuestos diferentes en recipientes separados, más habitualmente al menos 10, y pueden comprender al menos 10^{2} compuestos orgánicos separados diferentes, normalmente no más de aproximadamente 10^{2}, más habitualmente no más de aproximadamente 36 compuestos diferentes. Para determinaciones binarias, el modo de detección normalmente será común para los compuestos asociados con el análisis, de forma que puede haber un cromóforo común, un átomo común para la detección, etc. Cuando cada uno de los identificadores se ha preparado previamente, cada uno se caracterizará por tener una composición distinguible que codifica la elección y la etapa, que puede determinarse por una medición física y que incluye grupos o todos los compuestos que comparten al menos una funcionalidad común.

Como alternativa, el kit puede proporcionar reactivos que pueden combinarse para proporcionar los diversos identificadores. En esta situación, el kit comprenderá una pluralidad de primeros compuestos orgánicos funcionales, frecuentemente bifuncionales, separados, normalmente cuatro o más, generalmente uno para cada etapa de la síntesis, donde los compuestos orgánicos funcionales comparten la misma funcionalidad y se pueden distinguir por al menos una característica determinable. Además, se dispondría de al menos uno, normalmente al menos dos, segundos compuestos orgánicos capaces de reaccionar con una funcionalidad de los compuestos orgánicos funcionales y capaz de formar mezclas que se pueden distinguir por la cantidad de cada uno de dichos segundos compuestos orgánicos. Por ejemplo, se podría disponer de un glicol, aminoácido o ácido glicólico, donde los diversos compuestos bifuncionales se distinguen por el número de átomos de flúor o cloro presentes, para definir la etapa, y se podría disponer de yodometano, donde un yodometano no tiene ningún radioisótopo, otro tiene ^{14}C y otro tiene uno o más ^{3}H. Usando dos o más de los yodometanos, se podría proporcionar una diversidad de mezclas que podrían determinarse por sus radioemisiones. Como alternativa, se podría tener una pluralidad de segundos compuestos orgánicos, que podrían usarse en un código binario.

Como se ha indicado previamente, se podrían hacer reaccionar las señales después de su liberación con una molécula que permita la detección. De esta manera, las señales podrían ser bastante sencillas, teniendo la misma funcionalidad para la unión a la partícula que para la unión al resto detectable. Por ejemplo, al estar unida a un grupo hidroxicarboxilo, se liberaría un grupo hidroxilo, que después podría esterificarse o eterificarse con la molécula que permite la detección. Por ejemplo, por medio del uso de combinaciones de grupos fluoro- y cloroalquilo, en el modo binario, el número de grupos flúor y/o cloro podría determinar la elección, mientras que el número de átomos de carbono indicaría la etapa.

Los grupos de compuestos de un interés particular incluyen enlazadores unidos a un grupo orto-nitrobenciloxi substituido, un grupo indaniloxi o fluoreniloxi, u otro grupo que permita la escisión fotolítica u otra escisión selectiva. El grupo de unión puede ser un grupo alquileno de 2 a 20 átomos de carbono, polialquilenoxi, particularmente alquilenoxi de 2 a 3 átomos de carbono, un grupo cicloalquilo de 4 a 8 átomos de carbono, un grupo haloalquilo, particularmente fluoroalquilo de 2 a 20 átomos de carbono, uno o más anillos aromáticos y similares, donde el enlazador proporciona medios para la discriminación entre los diversos grupos, al tener diferentes números de unidades y/o substituyentes.

Podrían proporcionarse partículas individuales o una pluralidad de partículas como artículos comerciales, particularmente donde la(s) partícula(s) ha(n) mostrado una característica de interés. Basándose en las señales asociadas, puede decodificarse la historia de la reacción. Después, el producto puede producirse en una síntesis grande. Cuando la historia de reacción define inequívocamente la estructura, puede usarse la misma serie o series de reacción análogas para producir el producto en un lote grande. Cuando la historia de reacción no define de forma inequívoca la estructura, se repetiría la historia de reacción en un lote grande y se usaría el producto resultante para el análisis estructural. En algunos casos, puede descubrirse que la serie de reacción de la química combinatoria puede no ser la forma preferida para producir el producto en grandes cantidades.

De esta manera, una realización para el uso junto con esta invención es un kit que comprende una pluralidad de compuestos orgánicos separados, estando caracterizado cada uno de los compuestos por tener una composición distinguible, que codifican al menos un bit de información diferente que puede determinarse por una medición física, y que comparten al menos una funcionalidad común. Una realización preferida es un kit que comprende al menos 4 compuestos orgánicos funcionales diferentes.

Se prefiere un kit en el que dichos compuestos orgánicos funcionales son de la fórmula:

IF^{1}-F^{2}-\underline{C}-E-\underline{C}'

en la que F^{1}-F^{2} es un enlazador que permite la unión a una partícula sólida y la separación de la misma; y

C-E-C' es un miembro de señal que puede determinarse por una medición física, especialmente donde dichos compuestos orgánicos funcionales difieren por el número de grupos metileno y/o halógenos, nitrógenos o azufres presentes.

También se prefiere un kit en el que la porción C-E-C' se retira fotoquímicamente o un kit en el que la porción C-E-C' se retira de forma oxidativa, hidrolítica, termolítica o reductora.

Los compuestos de estructuras determinadas usando métodos de esta invención pueden ser útiles como analgésicos y/o para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, especialmente en el caso de los azotricíclicos que actúan como antagonistas del receptor de neuroquinina 1/brandiquina. Los miembros de la biblioteca de benzodiacepinas pueden ser útiles como relajantes musculares y/o tranquilizantes y/o como sedantes. Los miembros de la biblioteca de 23 millones de amidas mixtas pueden ser de utilidad en el tratamiento de la hipertensión con antagonistas de endotelina o en el tratamiento del síndrome de Raynaud.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Una realización relacionada con la invención es una composición que comprende al menos 6 componentes diferentes, teniendo cada componente un resto distinguible. Los componentes pueden caracterizarse porque cada resto es substancialmente estable o inerte químicamente y tiene una característica identificable diferente de cada uno de los demás restos. Cada resto está unido a un grupo de unión que tiene una funcionalidad activa capaz de formar un enlace covalente, a través del grupo de unión, con superficies sólidas separables individualmente, o está unido a un grupo que es detectable a una concentración menor que 1 nanomol. Cuando los restos están unidos al grupo de unión, los componentes se segregan físicamente. Preferiblemente, los soportes sólidos son perlas.

En una realización cada componente comprende moléculas de diferentes compuestos unidas a superficies sólidas separables individuales, estando las moléculas sobre las superficies sólidas. Preferiblemente, los restos de la invención definen una serie homóloga y/o una serie de substituciones sobre una molécula de núcleo.

La invención también se refiere a una biblioteca de compuestos que comprende al menos cien soportes sólidos únicos. En esta biblioteca de compuestos, cada soporte sólido tiene (1) un compuesto individual unido al soporte sólido como compuesto principal unido al soporte; y (2) una pluralidad de señales, por ejemplo, señales incapaces de secuenciarse, donde las señales son moléculas señal individuales que son distinguibles físicamente al ser físicamente separables y están substituidas para ser detectables a una concentración menor que aproximadamente un nanomol o tienen un grupo funcional para unirse a un substituyente que es detectable a una concentración menor que aproximadamente un nanomol. Preferiblemente, en la biblioteca de compuestos, cada soporte sólido tiene al menos aproximadamente 6 señales. En otra realización, en la biblioteca de compuestos las señales definen un código binario que codifica el protocolo sintético usado para la síntesis del compuesto sobre el soporte sólido.

También está asociado con esta invención un método para determinar un protocolo sintético codificado por señales diferentes físicamente separables en una serie y que definen un código binario. En este método se emplean al menos dos señales para definir cada etapa del protocolo sintético, habiendo al menos seis señales. La etapa del método comprende separar las señales por medio de sus diferencias físicas y detectar las señales para definir una línea binaria que codifica el protocolo, determinándose el protocolo sintético de esta manera de acuerdo con la línea binaria.

Los compuestos de estructuras determinadas usando métodos de esta invención pueden ser útiles como analgésicos y/o para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, especialmente en el caso de los azatricíclicos que actúan como antagonistas del receptor de neuroquinina 1/brandiquina. Los miembros de la biblioteca de benzodiacepinas pueden ser útiles como relajantes musculares y/o tranquilizantes y/o como sedantes. Los miembros de la biblioteca de 23 amidas mixtas pueden ser de utilidad en el tratamiento de la hipertensión con antagonistas de endotelina o en el tratamiento del síndrome de Raynaud.

Ejemplo 1 Biblioteca de péptidos

Para codificar hasta 10^{9} síntesis diferentes, se podrían preparar 30 identificadores diferentes que tengan señales individuales capaces de separarse entre sí por GC capilar. Para codificar un número menor de síntesis, se usarían menos identificadores. Las señales normalmente se prepararían a partir de compuestos químicos disponibles en el mercado como se indica por la siguiente ilustración. Se harían reaccionar \omega-hidroxialquenos-1, donde el número de grupos metileno varía de 1 a 5, con un yodoperfluoroalcano, donde el número de grupos CF_{2} es de 3, 4, 6, 8, 10 y 12. Empleando un catalizador de radicales libres, el yodoperfluorocarbono se añadiría al doble enlace, pudiendo entonces reducirse el grupo yodo con hidrógeno y un catalizador o un hidruro de estaño. De estas manera, podrían prepararse 30 señales diferentes. El procedimiento químico se describe por Haszeldine y Steele, J. Chem. Soc. (Londres), 1199 (1953); Brace, J. Fluor. Chem., 20, 313 (1982). Las señales altamente fluoradas pueden detectarse fácilmente por captura de electrones, tienen diferentes tiempos de retención en GC, de forma que se separan fácilmente por GC capilar, son químicamente inertes debido a su estructura de hidrocarburo fluorado y cada una lleva un solo grupo hidroxilo funcional para la unión directa o indirecta a las partículas.

Antes de la unión a precursores de compuestos, las señales (referidas como T1-T30) se activarían de un modo apropiado para los intermedios químicos a usar en la síntesis combinatoria. Por apropiado se entiende que se añadiría una funcionalidad que permita la unión rápida mediante un enlace químico a un precursor de compuesto o a la propia matriz de perlas. El proceso de activación se aplicaría a cada una de las 30 señales diferentes y permitiría que estas señales se unieran químicamente, directa o indirectamente, a intermedios de la síntesis combinatoria de compuestos. Por ejemplo, podría usarse un derivado de carboxi para el acoplamiento y, tras la activación, el grupo carboxi resultante se uniría a la partícula.

En el caso de una síntesis combinatoria de un compuesto peptídico o de otra estructura hecha de fragmentos orgánicos unidos a amida, el proceso de codificación podría constar de la adición de un enlazador equipado con ácido carboxílico. Por ejemplo, la señal se acoplaría al éster terc.-butílico de bromuro de o-nitro-p-carboxibencilo en presencia de hidruro sódico. El éster después se hidrolizaría en ácido trifluoroacético diluido.

En cada etapa de la síntesis combinatoria de compuestos, se acoplarían identificadores activados a intermedios. La parte de orto-nitrobencil éter de los identificadores activados se usa para permitir la separación fotoquímica de las señales después de completar la síntesis combinatoria y seleccionar los compuestos más deseables. Las señales separadas después se decodificarían usando GC capilar con detección por captura de electrones para producir una historia de las etapas sintéticas usadas para preparar el compuesto seleccionado.

Aunque hay una serie casi ilimitada de etapas y métodos químicos que podrían usarse para preparar bibliotecas combinatorias de compuestos, nosotros usaremos el acoplamiento de \alpha-aminoácidos para obtener una biblioteca combinatoria de péptidos como ejemplo de una aplicación de la metodología de codificación. En este ejemplo, describiremos la preparación de una biblioteca de pentapéptidos que tiene todas las combinaciones de 16 aminoácidos diferentes en cada una de las cinco posiciones de restos. Tal biblioteca contendría 16^{5} miembros. Para codificar de forma única todos los miembros de esta biblioteca, se requerirían 20 señales separables (T1-T20) como se ha descrito anteriormente.

Para preparar la biblioteca codificada, comenzaríamos con un gran número (>10^{6}) de perlas poliméricas del tipo usado para la síntesis en fase sólida de Merrifield y funcionalizadas por grupos amino libres. Dividiríamos las perlas en 16 porciones iguales y pondríamos una porción en cada uno de 16 recipientes de reacción diferentes (un recipiente para cada \alpha-aminoácido diferente a añadir). Después, añadiríamos una pequeña porción (por ejemplo, un 1% en moles) de identificadores a cada uno de los derivados de aminoácido (por ejemplo, Fmoc aminoácidos) a acoplar en la primera etapa de la síntesis combinatoria. La combinación específica de las señales incorporadas en los identificadores añadidos representaría un código binario sencillo que identifica el aminoácido usado en la primera etapa de la síntesis. Los 16 aminoácidos añadidos se indicarían por los números 1-16, y cualquiera de tales números podría representarse químicamente por combinaciones de las cuatro primeras señales (T1-T4). En las tablas 2 y 3, se muestra un esquema de codificación típico en el que la presencia o ausencia de una señal se indica por un 1 o un 0, respectivamente. La letra T puede representar la señal o el identificador que incorpora esa señal.

TABLA 2 Un esquema de codificación típico

Aminoácido añadidos en la primera etapa	T4	T3	T2	T1
Número 1 (por ejemplo, glicina)	0	0	0	0
Número 2 (por ejemplo, alanina)	0	0	0	1
Número 3 (por ejemplo, valina)	0	0	1	0
Número 4 (por ejemplo, serina)	0	0	1	1
Número 5 (por ejemplo, treonina)	0	1	0	0
.
.
Número 16 (por ejemplo, triptófano)	1	1	1	1

Después, realizaríamos un acoplamiento de péptidos de diciclohexilcarbodiimida (DCC) convencional en cada uno de los 16 recipientes usando los Fmoc aminoácidos mezclados con pequeñas cantidades de identificadores activados de codificación como se ha indicado anteriormente. Durante los acoplamientos, los aminoácidos, así como las pequeñas cantidades (por ejemplo, 1%) de los identificadores, se unirían químicamente a los intermedios unidos a las perlas.

Después, las perlas se mezclarían meticulosamente y se separarían de nuevo en 16 porciones. Cada porción se pondría de nuevo en un recipiente de reacción diferente. Se añadiría un segundo aminoácido mezclado con nuevos identificadores activados apropiados (T5-T8) a cada recipiente y se realizaría el acoplamiento DCC como antes. La mezcla particular de las señales incorporadas (T5-T8) representaría de nuevo un código binario sencillo para el aminoácido añadido en esta segunda etapa de la síntesis combinatoria.

TABLA 3 Un esquema de codificación típico

Aminoácido añadido en la segunda etapa	T8	T7	T6	T5
Número 1 (por ejemplo, glicina)	0	0	0	0
Número 2 (por ejemplo, alanina)	0	0	0	1
Número 3 (por ejemplo, valina)	0	0	1	0
Número 4 (por ejemplo, serina)	0	0	1	1
Número 5 (por ejemplo, treonina)	0	1	0	0
.
.
Número 16 (por ejemplo, triptófano)	1	1	1	1

Después de completarse los 16 acoplamientos de la etapa 2, las perlas se mezclarían de nuevo y después se dividirían en 16 nuevas porciones para la tercera etapa de la síntesis. Para la tercera etapa, se usarían T9-T12 para codificar el tercer aminoácido unido a las perlas usando el mismo esquema que se ha usado para las etapas 1 y 2. Después del tercer acoplamiento, el procedimiento se repetiría dos veces más usando los cuartos aminoácidos con T13-T16 y los quintos aminoácidos con T17-T20 para proporcionar la biblioteca entera de 1.048.576 péptidos diferentes unidos a las perlas.

Aunque las perlas anteriores serían visualmente indistinguibles, puede elegirse cualquier perla (por ejemplo, mediante una selección basada en las propiedades químicas o biológicas de interés de su péptido unido u otra molécula diana) y su historia sintética puede averiguarse separando y decodificando las señales asociadas.

El método preciso usado para separar las señales dependerá del enlazador particular usado para unirlas químicamente a los intermedios en la síntesis combinatoria del compuesto diana. En el ejemplo anterior, los enlazadores de carbonato de orto-nitrobencilo, que se sabe que son inestables a la luz de \sim300 nm (Ohtsuka, et al., J. Am. Chem. Soc., 100, 8210 [1978]), se escindirían por irradiación fotoquímica de las perlas. Las señales después se difundirían desde las perlas a la solución libre que se inyectaría en una cromatografía de gases (GC) capilar equipada con un detector de captura de electrones sensible. Como previamente se determinó el orden en el que emergían las señales (T1-T20) de la GC y sus tiempos de retención en condiciones convencionales, la presencia o ausencia de cualquiera de T1-T20 se determinaría directamente por la presencia o ausencia de sus picos en el cromatograma de GC. Si 1 y 0 representan la presencia y ausencia, respectivamente, de picos correspondientes a T1-T20, entonces el cromatograma puede considerarse un número binario de 20 dígitos que puede representar de forma única cada síntesis posible que conduce a cada miembro de la biblioteca de péptidos. El uso de señales de halocarburo que son seguras, económicas y detectables a niveles por debajo del intervalo picomolar mediante detección por captura de electrones hace de este método de GC capilar un esquema de codificación particularmente conveniente para este fin.

Como ejemplo del uso del esquema de codificación para la biblioteca de pentapéptidos anterior, se irradia una perla particular con luz para separar las señales, se inyectan los marcadores solubilizados en una GC capilar y se obtiene el siguiente cromatograma (línea "Pico"):

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La línea "Marcador" representa el cromatograma GC donde se van a encontrar los picos T20-T1 (|) (obsérvese que la inyección se presenta a la derecha y que el cromatograma se lee de derecha a izquierda). La línea "Pico" representa la presencia de marcadores (T20-T1) como picos en el cromatograma. La línea "Binario" indica la presencia (1) o ausencia (0) de picos como un número binario. La línea "Etapa" fragmenta el número binario en las cinco partes diferentes que codifican las cinco etapas diferentes de la síntesis. Finalmente, la línea "AA" proporciona la identidad del aminoácido que se añadió en cada etapa y se proporciona por el código binario en la línea "Binario" anterior.

Ejemplo 2 Señales radio-marcadas

En la siguiente ilustración, las señales empleadas son monometiléteres de alquil-\alpha,\omega-dioles lineales. El diol tendría N + 2 átomos de carbono, donde N designa la etapa. El grupo metilo sería un reactivo radiomarcado que tendría cualquiera de una diversidad de relaciones de ^{3}H/^{14}C de 1/1 a m/1, donde m es el número de elecciones. El radiomarcador doble permite la cuantificación precisa del tritio presente en la señal. Al tener 10 grupos alquileno diferentes y 10 relaciones de marcadores radiactivos diferentes, se generan 10^{10} series únicas de diez miembros de señales. Las señales se unirían primero haciéndolas reaccionar con agentes activadores, por ejemplo fosgeno para formar un cloroformiato, seguido de la reacción con el componente F^{1}-F. En este caso, F^{1}-F^{2} es el o-nitro-p-carboxi-bencil alcohol protegido como el éster t-butílico. Cada vez que se realiza una etapa sintética, el identificador desesterificado se añade directamente a la perla, que tiene grupos amina o hidroxilo unidos covalentemente, para formar amidas o ésteres con el ácido activado usando una química convencional, por ejemplo, la metodología de acoplamiento de carbodiimida. Al final de la síntesis secuencial, las perlas se seleccionan con una diversidad de receptores o enzimas para determinar una característica particular. Las perlas que demuestran la característica después pueden aislarse, y las señales pueden quitarse y separarse por HPLC para proporcionar una serie de glicol monometil éteres que después pueden analizarse con respecto a la radiactividad por métodos de identificación de radioisótopos convencionales. Por ejemplo, si la primera y la segunda señales a eluir de la columna de HPLC tuvieran relaciones de ^{3}H/^{14}C de 5:1 y 7:1 respectivamente, entonces el producto que muestra actividad se habría sintetizado por el número de reactivo 5 en la etapa 1 y el número de reactivo 7 en la etapa 2.

Ejemplo 3 Biblioteca de 2401 Péptidos

Los identificadores empleados fueron 2-nitro-4-carboxibencilo y carbonato de \omega-hidroxialquilo substituido con O-arilo, donde el alquilo tenía de tres a 12 átomos de carbono y el arilo era (A) pentaclorofenilo, (B) 2,4,6-triclorofenilo, o (C) 2,6-dicloro-4-fluorofenilo. Las señales se designan como NAr, donde N es el número de grupos metileno menos dos y Ar es el grupo arilo. De esta forma, la señal 2A tiene un grupo butileno unido al pentaclorofenilo a través de oxígeno. Estas señales pueden detectarse fácilmente usando cromatografía de gases de captura de electrones a una concentración de aproximadamente 100 fmol.

En el presente análisis, las moléculas de señalización se organizan en su orden de elución en la GC. De esta forma, la señal que se retiene más tiempo sobre la columna de GC se denomina T1 y se asocia con el bit menos significativo en el número del código de síntesis binario, la siguiente señal retenida más tiempo se denomina T2 y representa el siguiente bit binario menos significativo, y así sucesivamente. Usando una columna de GC capilar de metilsilicona de 0,2 mM x 20 M, se obtuvieron dieciocho señales bien resueltas donde T1 a T18 correspondían a 10A, 9A, 8A, 7A, 6A, 5A, 4A, 3A, 6B, 2A, 5B, 1A, 4B, 3B, 2B, 1B, 2C, y IC, respectivamente.

Se preparó una biblioteca combinatoria codificada de 2401 péptidos. Esta biblioteca tenía la secuencia de aminoácidos N-XXXXEEDLGGGG-perla, donde los restos variables X eran D, E, I, K, L, Q o S (código de una sola letra). Las 4 glicinas sirvieron como espaciador entre la secuencia de aminoácidos codificada y la perla. La biblioteca combinatoria incluía la secuencia H_{2}N-KLISEEDL, parte del epítopo de 10 aminoácidos que se sabe que se une a 9E10, un anticuerpo monoclonal dirigido contra el producto de gen C-myc humano. Para codificar esta biblioteca, fueron suficientes tres bits binarios para representar los siete reactivos alternativos para cada etapa. El código fue como se indica a continuación: 001 = S; 010 = I; 011 = K; 100 = L; 101 = Q; 110 = E; 111 = D.

La biblioteca se sintetizó preparando primero el segmento constante de la biblioteca H_{2}NEEDLGGGG-perla sobre 1,5 g de perlas de síntesis de poliestireno de 50-90 \mu funcionalizadas con 1,1 mequiv./g de grupos aminometilo, usando métodos convencionales de fase sólida basados en la protección de la cadena lateral con t.-butilo y en la protección de la cadena principal con Fmoc (Stewart y Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2ª edición, Pierce Chemical Co., 1984). Después de desproteger los grupos Fmoc con dietilamina, las perlas se dividieron en siete fracciones de 200 mg y cada fracción se puso en un recipiente de síntesis de Merrifield diferente montado sobre un solo agitador de muñeca. Las perlas de los siete recipientes se procesaron independientemente como se indica a continuación (véase la tabla 3-1). La letra T en este ejemplo se refiere a la señal o al identificador que incorpora esa señal.

TABLA 3-1

Nº de recipiente	Etapa 1	Etapa 2	Etapa 3	Etapa 4
1	T1 al 1%	DIC, lavado	Fmoc(tBu)S, Anh.	Lavado
2	T2 al 1%	''	FmocI, Anh.	''
3	T1, T2 al 1%	''	Fmoc(Boc)K, Anh.	''
4	T3 al 1%	''	FmocL, Anh.	''
5	T1, T3 al 1%	''	Fmoc(tritil)Q, Anh.	''
6	T2, T3 al 1%	''	Fmoc(t-butil)E, Anh.	''
7	T1, T2, T3 al 1%	''	Fmoc(tBu)D, Anh.	''

De acuerdo con el procedimiento anterior, se unió una cantidad suficiente de los identificadores indicados en la etapa 1 a través de sus ácidos carboxílicos usando diisopropilcarbodiimida para señalizar aproximadamente un 1% de los grupos amino libres sobre cada perla en el correspondiente recipiente. Después, los grupos amino libres restantes sobre cada perla se acoplaron en la etapa 3 a anhídridos de aminoácido N-protegidos. Después de lavar con cloruro de metileno, isopropanol y N,N-dimetilformamida, las perlas de los siete recipientes se combinaron y se mezclaron minuciosamente. En este momento, la biblioteca tenía siete miembros.

Después de la desprotección de Fmoc (dietilamina), las perlas se dividieron de nuevo en siete recipientes y se procesaron como antes con la excepción de que en lugar de los identificadores usados previamente, se usaron identificadores que representaban la segunda etapa (T4-6). Repitiendo el procedimiento dos veces más, usando los identificadores T7-9 y después T10-12 de forma análoga, se preparó la biblioteca codificada de forma única entera de 7^{4} = 2041 péptidos diferentes usando únicamente 12 identificadores.

Para leer el código de síntesis de una sola perla seleccionada, la perla primero se lavó cuatro veces en un pequeño tubo de centrífuga con porciones de 100 \mul de DMF, y después se resuspendió en 1 \mul de DMF en un tubo capilar Pyrex. Después de 2 h de fotolisis con una fuente de luz Rayonet de 350 nm, las señales liberadas de los identificadores unidos se sililaron usando aproximadamente 0,1 \mul de bis-trimetilsililacetamida y la solución se inyectó en una cromatografía de gases capilar Hewlett Packard equipada con una columna capilar de sílice fusionada a metilsilicona de 0,2 mM x 20 M y un detector de captura de electrones. El código de síntesis binario de la perla seleccionada se determinó directamente a partir del cromatograma de las señales que se obtuvieron.

Ejemplo 4 Biblioteca de benzodiacepina

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Una biblioteca de benzodiacepina combinatoria que comprende 30 compuestos de la fórmula VIII

en la que:

R es CH_{3}, CH(CH_{3})_{2}, CH_{2}CO_{2}H, (CH_{2})_{4}NH_{2}, CH_{2}C_{6}H_{4}OH o CH_{2}C_{6}H_{5} y

R^{1} es H, CH_{3}, C_{2}H_{5}, CH_{2}CH=CH_{2} o CH_{2}C_{6}H_{5}

se construye mediante el siguiente esquema.

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Las benzodiacepinas VIII se construyen sobre perlas de poliestireno de forma similar al método de Bunin y Ellman (JACS, 114, 10997-10998 [1992]) con la excepción de que se incorpora un enlazador fotolábil entre la perla y la benzodiacepina (véanse las etapas A, B y C), permitiendo de esta forma que se retire la benzodiacepina en la etapa G de forma no hidrolítica por exposición a luz U.V. (350 nm en DMF durante de 10 minutos a 12 h). Además, se introducen códigos binarios en las etapas D y E que permiten una determinación precisa de la secuencia de reacción usada para introducir cada uno de los 6 R y 5 R^{1}'. Después de la retirada de las señales de acuerdo con la etapa H y el análisis por detección de captura de electrones, seguido de separación por GC, se determina la naturaleza de los grupos R y R^{1} individuales.

Las etapas D, E y F siguen esencialmente el procedimiento de Bunin y Ellman, pero también incluyen la incorporación de identificadores IXa-c en la etapa D e IXd-f en la etapa E. Todos los identificadores se representan por la fórmula IX,

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en la que:

IX_{a} indica n = 6;

IX_{b} indica n = 5;

IX_{c} indica n = 4;

IX_{d} indica n = 3;

IX_{e} indica n = 2; e

IX_{f} indica n = 1.

Los códigos para cada uno de R y R^{1} son los siguientes:

TABLA 4-1

IX	R
a	CH_{3}
b	CH(CH_{3})_{2}
a, b	CH_{2}CO_{2}H
c	(CH_{2})_{4}NH_{2}
a, c	CH_{2}-C_{6}H_{4}-4-OH
b, c	CH_{2}C_{6}H_{5}
IX	R^{1}
d	H
e	CH_{3}
d, e	C_{2}H_{5}
f	CH_{2}CH=CH_{2}
d, f	CH_{2}C_{6}H_{5}

Etapa A

A una solución de I (1 equiv.) en tolueno (conc. = 0,5 M) se le añaden 2-amino-5-cloro-4'-hidroxi-benzofenona protegida con Fmoc (1,3 equiv.), azodicarboxilato de dietilo (1,3 equiv.) y trifenilfosfina (1,3 equiv.). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 24 h. El disolvente se retira al vacío y el residuo se tritura con éter y se filtra y el disolvente se retira de nuevo al vacío. El producto resultante II se purifica por cromatografía sobre gel de sílice.

Etapa B

A una solución de II en DCM (0,2 M) en agitación a t.a. se le añade TFA (3 equiv.) y la solución se deja en agitación durante 12 h. La solución se evapora a sequedad al vacío y el residuo se disuelve en DCM, se lava una vez con salmuera y se seca (Na_{2}SO_{4}). La filtración y la evaporación del disolvente proporcionan III.

Etapa C

Se suspenden perlas de poliestireno reticuladas con DVB (divinilbenceno) al 1% (50 \mu) funcionalizadas con grupos aminometilo (1,1 mEquiv./g) en DMF en un recipiente de reacción de péptidos (recipiente de Merrifield). Se añaden III (2 equiv.) y HOBt (3 equiv.) en DMF y el recipiente se agita durante 10 min. Se añade DIC (3 equiv.) y el recipiente se agita hasta que los ensayos de ninhidrina negativos indican que la reacción se ha completado después de 12 h.

La DMF se retira y la resina se lava con más DMF (x 5) y DCM (x 5) antes de secar al vacío.

Etapa D

La resina seca se divide en 6 recipientes de reacción y se suspende en DCM. Se añaden combinaciones apropiadas de identificadores IX_{a-c} (véase la tabla 4-1) a los matraces y se agitan durante 1 h. Se añade el catalizador de Rh(TFA)_{2} (1% en moles) a cada matraz y se agita durante 2 h más. Los matraces se desecan y la resina se lava con DCM (x 5). Después, la resina se trata con una solución de TFA en DCM (0,01 M) y se agita durante 30 min y después se lava de nuevo con DCM (x 3) seguido de DMF (x 2). La resina se trata con una solución al 20% de piperidina en DMF y se agita durante 30 min y después se lava con DMF (x 3) y DCM (x 3).

A cada matraz se le añade el fluoruro de aminoacilo protegido con Fmoc (3 equiv.) (cuando se requieren grupos funcionales de cadena lateral se protegen como éster terc-butílico (Asp), éter terc-butílico (Tyr) o terc-butiloxicarbonilo (Lys)) con 2,6-di-terc-butil-4-metilpiridina (10 equiv.) y los matraces se agitan durante una noche o hasta que se consigue un ensayo de ninhidrina negativo. La resina se lava una vez (DCM) y después los seis lotes se combinan y se lavan de nuevo (DCM, x 5) antes de secar al vacío.

Etapa E

La resina seca se divide en cinco recipientes de reacción y se suspende en DCM. Se añaden las combinaciones apropiadas de identificadores IX_{d-f} (véase la tabla 4-1) a los matraces y se agitan durante 1 h. Se añade catalizador de Rh(TFA)_{2} (1% en moles) a cada matraz y se agitan durante 2 horas más. Los matraces se desecan y la resina se lava con DCM (x 5). Después, la resina se trata con una solución de TFA en DMF (0,01 M) y se agita durante 30 min y después se lava con DMF (x 3) y DCM (x 3).

A cada matraz se le añade una solución de ácido acético al 5% en DMF y las mezclas se calientan a 60ºC y se agitan durante una noche. El disolvente se deseca y después la resina se lava con DMF (x 5).

Etapa F

Cada lote de resina se suspende en THF y los matraces se enfrían a -78ºC. A cada matraz se le añade una solución de 5-(fenilmetil)-2-oxazolidinona litiada (2 equiv.) en THF y las mezclas se agitan a -78ºC durante 1 hora. Después, se añade el agente de alquilación apropiado (tabla 4-2) (4 equiv.) a cada recipiente de reacción seguido de una cantidad catalítica de DMF. Los recipientes se dejan calentar a temperatura ambiente y se agitan a esta temperatura durante 5 horas. El disolvente se retira por filtración y la resina se lava con THF (x 1) y después se seca al vacío. Después, los lotes de resina se combinan y se lavan con THF (x 2) y DCM (x 2) y la resina combinada después se trata con una mezcla 95:5:10 de TFA:agua:dimetilsulfuro durante 2 h para retirar los grupos protectores de cadena lateral.

TABLA 4-2

Identificador	Agente de alquilación
e	H_{3}CI
d, e	C_{2}H_{5}Br
f	BrCH_{2}-CH=CH_{2}
d, f	BrCH_{2}C_{6}H_{5}

Etapa G

La benzodiacepina resultante puede escindirse de una perla de poliestireno suspendiendo la perla en DMF e irradiándola con U.V. (350 nm) durante 12 h.

Etapa H

Una perla de interés se pone en un tubo capilar de vidrio. En el tubo se introducen mediante una jeringa 1 \mul de una solución acuosa 1 M de nitrato de cerio (IV) y amonio (CAN), 1 \mul de acetonitrilo y 2 \mul de hexano. El tubo se sella con calor y después se centrifuga para asegurar que la perla está inmersa en los reactivos. El tubo se pone en un baño ultrasónico y se sonica de 1 a 10 h, preferiblemente de 2 a 6 h.

El tubo se abre rompiéndolo y se mezcla \approx1 \mul de la capa de hexano superior con \approx2 \mul de bis(trimetilsilil)-acetamida (BSA) antes de la inyección en la GC y cada miembro señal se determina usando detección por captura de electrones, como se muestra en el siguiente esquema.

49

Ejemplo 5 Biblioteca de 117.649 Péptidos

Se preparó una biblioteca codificada de 117.649 péptidos. Esta biblioteca tenía la secuencia H_{2}N-XXXXXXEEDL
GGGG-perla, donde el resto variable X era D, E, I, K, L, Q o S. Esta biblioteca se codificó usando las 18 señales definidas en el ejemplo 3; siendo suficientes tres bits binarios para representar los siete aminoácidos usados en cada etapa. El código fue: 001=S; 010=I; 011=K; 100=L; 101=Q; 110=E; y 111=D, donde 1 indica la presencia y 0 indica la ausencia de una señal.

El segmento constante de la biblioteca (H_{2}NEEDLGGGG-perla) se sintetizó sobre 1,5 g de perlas de síntesis de poliestireno de Merrifield de 50-80 \mu funcionalizadas con 1,1 mEquiv./g de grupos aminometilo usando métodos convencionales de fase sólida basados en la protección de la cadena lateral con t-Bu y en la protección de la cadena principal con Fmoc. Después de desproteger el extremo N del grupo protector Fmoc con dietilamina, las perlas se dividieron en siete porciones de 200 mg, poniendo cada porción en un recipiente de síntesis de Merrifield diferente montado sobre un solo agitador de muñeca.

\newpage

Las perlas de los siete recipientes se procesaron como en la tabla 3-1 para unir las series de identificadores (T1-T3) y el correspondiente aminoácido a cada porción, con la excepción de que en lugar de DIC, se usó cloroformiato de i-butilo para la activación.

Este procedimiento primero unió químicamente pequeñas cantidades de identificadores apropiados a través de sus ácidos carboxílicos a las perlas de síntesis. Esta unión se realizó activando los grupos carboxilo del enlazador como anhídridos carbónicos mixtos usando cloroformiato de isobutilo, y después añadiendo una cantidad de identificador activado correspondiente al 1% de los grupos amino libres unidos a las perlas. De esta manera, se terminaron aproximadamente el 1% de los grupos amino libres para cada identificador añadido. Los grupos amino libres restantes después se acoplaron de la manera habitual a los correspondientes aminoácidos protegidos activados como sus anhídridos simétricos.

Después del lavado, las siete porciones se combinaron y los grupos amino protegidos con Fmoc se desprotegieron por tratamiento con dietilamina. Las perlas se dividieron de nuevo en siete porciones y se procesaron como antes, con la excepción de que a los recipientes de reacción se les añadieron los identificadores adecuados que tenían las señales T4, T5 y T6.

El procedimiento de división, marcaje, acoplamiento de la combinación de aminoácidos y desprotección de la cadena principal se realizó un total de seis veces usando identificadores que tenían las señales T1-T18, produciendo una biblioteca de péptidos codificada de 117.649 miembros diferentes.

Preparación de un identificador típico

A una solución de 8-bromo-1-octanol (0,91 g, 4,35 mmol) y 2,4,6-triclorofenol (1,03 g, 5,22 mmol) en DMF (5 ml) se le añadió carbonato de cesio (1,70 g, 5,22 mmol) ocasionándose un desprendimiento de gas y la precipitación de un sólido blanco. La reacción se agitó a 80ºC durante 2 h. La mezcla se diluyó con tolueno (50 ml) y se vertió en un embudo de separación, se lavó con NaOH 0,5 N (2 x 50 ml), HCl 1 N (2 x 50 ml) y agua (50 ml) y la fase orgánica se secó (MgSO_{4}). La retirada del disolvente por evaporación dio 1,24 g (rendimiento del 87%) de señal en forma de un aceite transparente.

La señal anterior (0,81 g, 2,5 mmol) se añadió a una solución 2 M de fosgeno en tolueno (15 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. El exceso de fosgeno y el tolueno se retiraron por evaporación y el cloroformiato bruto resultante se disolvió en DCM (5 ml) y piridina (0,61 ml, 7,5 mmol). Se añadió 4-hidroxi-metil-3-nitrobenzoato de terc-butilo (Barany y Albericio, J. Am. Chem. Soc., (1985), 107, 4936-4942) (0,5 g, 1,98 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. La solución se diluyó con acetato de etilo (75 ml) y se vertió en un embudo de separación. Después de lavar con HCl 1 N (3 x 35 ml), NaHCO_{3} saturado (2 x 35 ml) y salmuera (35 ml), la fase orgánica se secó (MgSO_{4}). El disolvente se retiró por evaporación y el residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (acetato de etilo del 5% al 7,5% en éter de petróleo) produciendo 0,95 g (rendimiento del 79%) del éster terc-butílico del identificador en forma de un aceite transparente.

Se añadió ácido trifluoroacético (3 ml) a una solución del éster terc-butílico del identificador (0,95 g, 1,57 mmol) en DCM (30 ml) para proteger el ácido del enlazador (es decir, F^{1}-F^{2} de fórmula I) y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 7 horas. La mezcla después se evaporó a sequedad y el residuo se redisolvió en DCM (30 ml). La solución se lavó con salmuera (20 ml) y la fase orgánica se secó (MgSO_{4}). La retirada del disolvente por evaporación dio 0,75 g (rendimiento del 87%) del identificador (6B) en forma de un sólido amarillo pálido. (La nomenclatura de la señal es la misma que en el ejemplo 3).

Etapa de síntesis de la biblioteca codificada típica

Se suspendió N\alpha-Fmoc-E(tBu)-E(tBu)-D(tBu)-L-G4-NH-resina en DMF (20 ml) y se agitó durante 2 min. Después de filtrar, se añadió 1:1 de dietilamina:DMF (40 ml) para retirar los grupos protectores Fmoc y la resina se agitó durante 1 h. La resina se separó por filtración y se lavó con DMF (2 x 20 ml, 2 min cada vez); 2:1 de dioxano:agua (2 x 20 ml, 5 min cada vez), DMF (3 x 20 ml, 2 min cada vez), DCM (3 x 20 ml, 2 min cada vez) y después se secó al vacío a 25ºC. (Se descubrió que la resina tenía 0,4 mmol/g de grupos amino por trituración con ácido pícrico en esta etapa).

Se pusieron en siete recipientes de Merrifield porciones de 150 mg de la resina y se suspendieron en DCM (5 ml). Los identificadores apropiados se activaron como sus carbonatos de acilo como se indica a continuación (para el primer acoplamiento): T1 (6,6 mg, 0,0098 mmol) se disolvió en éter anhidro (2 ml) y se añadió piridina (10 \mul). Se añadió cloroformiato de isobutilo (1,3 \mul, 0,0096 mmol) como una solución en éter anhidro (0,1 ml). La mezcla resultante se agitó a 25ºC durante 1 h, tiempo durante el cual se formó un precipitado blanco fino. La agitación se interrumpió y el precipitado se dejó sedimentar durante 30 min. Se prepararon soluciones de los acilcarbonatos de T2 y T3 de la misma manera. Se mezclaron alícuotas (0,25 ml) de la solución sobrenadante de identificadores activados para proporcionar los códigos de señal binarios de 3 bits apropiados y se añadieron las mezclas de codificación apropiadas de identificadores a cada uno de los siete recipientes de síntesis. Los recipientes se agitaron en la oscuridad durante 12 h, y después cada uno se lavó con DCM (4 x 10 ml, 2 min cada vez). Después se añadió una solución del anhídrido simétrico de un N\alpha-Fmoc aminoácido en DCM (3 equivalentes en 10 ml) al lote codificado de resina correspondiente y se agitó durante 20 min. Se añadió N,N-diisopropiletilamina al 5% en DCM (1 ml) y la mezcla se agitó hasta que la resina dio un resultado negativo en el ensayo de Kaiser.

Los lotes de resina se filtraron y se combinaron, y después se lavaron con DCM (4 x 20 ml, 2 min cada vez), isopropanol (2 x 20 ml, 2 min cada vez), DCM (4 x 20 ml, 2 min cada vez). El siguiente ciclo de marcaje/acoplamiento se inició mediante desprotección de Fmoc como se ha descrito anteriormente.

Después de la desprotección de Fmoc de los restos en la última posición del péptido, la funcionalidad de la cadena lateral se desprotegió suspendiendo la resina en DCM (10 ml), añadiendo tioanisol (2 ml), etanoditiol (0,5 ml) y ácido trifluoroacético (10 ml) y después agitando durante 1 h a 25ºC. Después, la resina se lavó con DCM (6 x 20 ml, 2 min cada vez) y se secó.

Lectura del código de cromatografía de gases de captura de electrones

Una sola perla seleccionada se puso en un tubo capilar Pyrex y se lavó con DMF (5 x 10 \mul). Después, la perla se suspendió en DMF (1 \mul) y el capilar se selló. La perla suspendida se irradió a 366 nm durante 3 h para liberar los alcoholes de señal, y el tubo capilar posteriormente se puso en un baño de arena a 90ºC durante 2 h. El tubo se abrió y se añadió bis-trimetilsililacetamida (0,1 ml) para trimetilsililar los alcoholes de señal. Después de centrifugar durante 2 min, la solución de señal por encima de la perla (1 \mul) se inyectó directamente en un cromatógrafo de gases capilar, de detección de captura de electrones, para el análisis. La cromatografía de gases se realizó usando un cromatógrafo de gases Hewlett Packard Serie II Modelo 5890 equipado con una columna capilar de sílice fusionada con metilsilicona de 0,2 mm x 20 m y un detector de captura de electrones. Las reacciones de fotolisis se realizaron usando una lámpara UVP "Black Ray" modelo UVL 56 portátil de 366 nm.

Métodos de afinidad de anticuerpos

Se preparó el anticuerpo monoclonal peptídico anti-C-myc 9E10 a partir de fluido ascítico como se describe en Evans et al., Mol. Cell Biol., 5, 3610-3616 (1985) y Munro y Pelham, Cell, 48, 899-907 (1987). Para ensayar las perlas con respecto a la unión a 9E10, se incubaron las perlas en TBST [Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl 500 mM y Tween-20 al 0,05%] que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 1% para bloquear los sitios de unión a proteínas no específicos. Después, las perlas se centrifugaron, se resuspendieron en una dilución 1:200 de fluido ascítico 9E10 en TBST + BSA al 1% y se incubaron durante una noche a 4ºC. Posteriormente, las perlas se lavaron tres veces en TBST y se incubaron durante 90 min a temperatura ambiente en anticuerpos IgG de cabra anti-ratón acoplados a fosfatasa alcalina (Bio-Rad Laboratories), diluidos a 1:3000 de TBST + BSA al 1%. Después de lavar las perlas dos veces en TBST y una vez en tampón fosfatasa (Tris-HCl 100 mM, pH 9,5, NaCl 100 mM y MgCl_{2} 5 mM), las perlas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente en tampón fosfatasa que contenía una centésima parte de cada uno de los Reactivos de Color AP A y B (Bio-Rad Laboratories). Para interrumpir la reacción, las perlas se lavaron dos veces en EDTA sódico 20 mM, pH 7,4. Las afinidades en fase de solución entre 9E10 y diversos péptidos se determinaron mediante una modificación del ensayo ELISA competitivo descrito por Harlow et al., Antibodies: a Laboratory Manual, 570-573, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

A partir de una muestra de 30 mg de la biblioteca combinatoria de péptidos, se identificaron 40 perlas individuales que se marcaron tras la exposición al anticuerpo monoclonal anti-C-myc. La decodificación de estas perlas de reacción positiva estableció la secuencia de reacción del ligando como el epítopo myc (EQKLISEEDL) o secuencias que diferían en uno o dos substituyentes entre los tres restos del extremo N.

Ejemplo 6 Biblioteca de 23.540.625 amidas mixtas

La técnica de codificación se ensayó adicionalmente mediante la preparación de una biblioteca combinatoria de 23.540.625 miembros que constaba de péptidos y otros compuestos de amida.

La síntesis se realizó usando 15 reactivos diferentes en 5 etapas y 31 reactivos diferentes en la sexta etapa. Se usaron cuatro identificadores para codificar cada una de las 5 etapas con 15 reactivos y se usaron cinco identificadores en la etapa final con 31 reactivos. Por lo tanto, se preparó una serie de marcadores de 25 identificadores. Se emplearon identificadores de 2-nitro-4-carboxibencilo y carbonato de \omega-hidroxialquilo substituido con O-arilo, donde los componentes señal comprendían un resto alquilo de 3 a 12 átomos de carbono y los restos arilo eran (A) pentaclorofenilo, (B) 2,4,5-triclorofenilo, (C) 2,4,6-triclorofenilo o (D) 2,6-dicloro-4-fluorofenilo. Se preparó una serie de 25 señales usando longitudes de cadenas alquilo apropiadas con A, B, C o D, separables usando una columna de GC de metilsilicona de 0,2 mM x 25 M. Las composiciones químicas de las señales T1-T25 (donde T1 representa la señal con el tiempo de retención más largo y T25 la señal con el tiempo de retención más corto) se resumen a continuación:

T1	10A	T6	10C	T11	7B	T16	5C	T21	2B
T2	9A	T7	9B	T12	7C	T17	4B	T22	2C
T3	8A	T8	9C	T13	6B	T18	4C	T23	1B
T4	7A	T9	8B	T14	6C	T19	3B	T24	1C
T5	10B	T10	8C	T15	5B	T20	3C	T25	2D

Las designaciones 10A, 9A, etc. son como se han descrito en el ejemplo 3.

A continuación se representan los quince reactivos usados en las primeras cinco etapas y el código de identificación de los mismos, representando 1 la presencia de señal y 0 la ausencia de la misma.

Reactivo	Código
L-serina	(0001)
D-serina	(0010)
ácido L-glutámico	(0011)
ácido D-glutámico	(0100)
L-glutamina	(0101)
D-glutamina	(0110)
L-lisina	(0111)
D-lisina	(1000)
L-prolina	(1001)
D-prolina	(1010)
L-fenilalanina	(1011)
D-fenilalanina	(1100)
ácido 3-amino-benzoico	(1101)
ácido 4-aminofenilacético	(1110)
ácido 3,5-diamino-benzoico	(1111)

A continuación se representan los 31 reactivos y el código de representación de los mismos en la sexta etapa:

Reactivo	Código(50mm)
L-serina	(00001)
D-serina	(00010)
ácido L-glutámico	(00011)
ácido D-glutámico	(00100)
L-glutamina	(00101)
D-glutamina	(00110)
L-lisina	(00111)
D-lisina	(01000)
L-prolina	(01001)
D-prolina	(01010)
L-fenilalanina	(01011)
D-fenilalanina	(01100)
ácido 3-amino-benzoico	(01101)
ácido 4-aminofenilacético	(01110)
ácido 3,5-diamino-benzoico	(01111)
anhídrido succínico	(10000)
ácido tíglico	(10001)
ácido 2-pirazinacarboxílico	(10010)
ácido (\pm)tióctico	(10011)
ácido 1-piperidinopropiónico	(10100)
ácido piperonílico	(10101)
ácido 6-metilnicotínico	(10110)
ácido 3-(2-tienil)acrílico	(10111)
yoduro de metilo	(11000)
cloruro de tosilo	(11001)
isocianato de p-toluenosulfonilo	(11010)
ácido 3-cianobenzoico	(11011)
anhídrido ftálico	(11100)
anhídrido acético	(11101)
cloroformiato de etilo	(11110)
cloruro de mesilo	(11111)

Se preparó un espaciador de seis unidades de glicina sobre las perlas usando métodos convencionales. La región variable se construyó usando protección de cadenas laterales con butilo, y los grupos amino se protegieron como derivados Fmoc. Los enlaces amida se formaron por activación del ácido carboxílico con DIC y HOBt.

Ejemplo 7 Heterobiblioteca de Diels-Alder

Se construyó una heterobiblioteca de Diels-Alder que comprendía 42 compuestos de la fórmula:

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en la que;

R^{1} es H, CH_{3}O, F_{3}C, F_{3}CO, H_{5}C_{6}O, o C_{6}H_{11};

R^{2} es H, CH_{3}, o CH_{3}O;

R^{3} es H, (cuando n = 2), o CH_{3} (cuando n = 1); y

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mediante el siguiente esquema:

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Los productos azatricíclicos (VI) se construyeron sobre perlas de poliestireno y se unieron a las perlas mediante un enlazador fotoescindible que permitía la retirada del azatriciclo (VII) de la perla mediante exposición a luz U.V. (350 nm en DMF). Los códigos binarios introducidos en las etapas C, D y E permitieron una determinación única de la secuencia de reacción usada para introducir ArR, R^{1}, R^{2} y R^{3}. Las señales de codificación se retiraron de acuerdo con la etapa G y se analizaron mediante detección de captura de electrones seguido de separación por GC.

Los identificadores usados en este esquema se representan mediante la fórmula X:

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en la que;

X_{a} indica n = 10

X_{b} indica n = 9

X_{c} indica n = 8

X_{d} indica n = 7

X_{e} indica n = 6

X_{f} indica n = 5

X_{g} indica n = 4

Los códigos para cada R, R^{1}, R^{2}, R^{3} son los siguientes:

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 7-1

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Etapa A

A una solución de I (2,03 g, 8 mmol), 4-hidroxibenzaldehído (1,17 g, 9,6 mmol) y trifenilfosfina (2,73 g, 10,4 mmol) en tolueno (20 ml) agitada a 0ºC se le añadió durante un periodo de 30 minutos azodicarboxilato de dietilo. La solución se dejó calentar y se agitó durante 1 hora una vez que se había alcanzado la temperatura ambiente. La solución se concentró por retirada de aproximadamente la mitad del disolvente al vacío y después se trituró con éter. La mezcla después se filtró y el residuo se lavó minuciosamente con éter. El disolvente se retiró al vacío y el residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (acetato de etilo al 125% en hexano), produciendo 1,3 g del éter IIa (rendimiento del 47%).

Se acoplaron 2-cloro-4-hidroxibenzaldehído y 2-hidroxi-1-naftaldehído a I de una forma análoga, produciendo los éteres IIb y c con rendimientos del 91% y del 67%, respectivamente.

Etapa B

A una solución de éter IIa (0,407 g, 1,14 mmol) en DCM (20 ml) agitada a temperatura ambiente se le añadió TFA (8 ml). La solución se dejó en agitación durante 6 h. La solución se evaporó a sequedad al vacío, produciendo 0,343 g del ácido IIIa (rendimiento del 100%). Los éteres IIb y IIc se desprotegieron de forma análoga, produciendo los ácidos IIIb y c con rendimientos del 92% y del 100% respectivamente.

Etapa C

En un recipiente de reacción de péptidos (recipiente de Merrifield) se midieron perlas de poliestireno (50-80 \mu) unidas a DVB (divinilbenceno) al 1% funcionalizadas con grupos aminometilo (1,1 mequiv./g) (200 mg de resina). La resina se suspendió en DMF (2 ml) y se agitó durante 20 minutos. Se añadieron el ácido IIIa (38 mg, 2 equiv.), 1-hidroxibenzotriazol (40 mg, 2 equiv.) y diisopropilcarbodiimida (38 mg, 2 equiv.) y la mezcla se agitó hasta que se consiguió un ensayo de ninhidrina negativo (22 h). La solución se retiró por filtración y la resina se lavó con DCM (8 x 10 ml).

La resina se suspendió de nuevo en DCM (5 ml), se añadió identificador Xa (15 mg) y el matraz se agitó durante 1 h. Se añadió catalizador de Rh(TFA)_{2} (1% en moles) y los matraces se agitaron durante 2 h. El disolvente se retiró por filtración y la resina se suspendió de nuevo en DCM (5 ml). Se añadió ácido trifluoroacético (1 gota) y el recipiente se agitó durante 20 min. El disolvente se retiró por filtración y la resina se lavó con DCM (8 x 10 ml).

De una forma análoga, se unieron los ácidos IIIb y IIIc a la resina y se codificaron con los identificadores apropiados, es decir, Xb para el ácido IIIb y Xa y Xb para el ácido IIIc. Los tres lotes de resina se combinaron, se mezclaron, se lavaron y se secaron.

\newpage

Etapa D

La resina seca se dividió en 7 porciones iguales (87 mg) que se pusieron en siete recipientes de reacción de péptidos (recipientes de Merrifield) que se envolvieron con cinta calefactora. La resina de cada recipiente se suspendió en tolueno (10 ml) y se agitó durante 20 min. Después se añadió una cantidad apropiada de una anilina a cada matraz (véase la tabla 7-2).

TABLA 7-2

Matraz	Anilina	Cantidad añadida
1	Anilina	3 ml
2	3,5-dimetilanilina	3 ml
3	3,4,5-trimetoxianilina	2 g
4	4-trifluorometilanilina	3 ml
5	4-fenoxianilina	2 g
6	4-trifluorometoxianilina	3 ml
7	4-ciclohexilanilina	2 g

La cinta calefactora se conectó y las mezclas de reacción se agitaron a 70ºC durante 18 h. La cinta caliente se desconectó y el disolvente se retiró por filtración y cada lote de resina se lavó con DCM seco (4 x 10 ml), éter (10 ml), tolueno (10 ml) y DCM (2 x 10 ml). Después, cada una de las porciones se suspendió en DCM (5 ml) y a cada matraz se le añadió el identificador apropiado o combinación de identificadores (Xc-e) (15 mg) (véase la Tabla 7-1). Los matraces se agitaron durante 1 h y después se añadió Rh(TFA)_{2} (1% en moles) a cada matraz y se continuó agitando durante 2 h.

Después, el disolvente se retiró y cada lote de resina se suspendió de nuevo en DCM (5 ml) a lo que se añadió TFA (1 gota). Esta mezcla se agitó durante 20 min y después el disolvente se retiró por filtración. Los lotes de resina después se lavaron (DCM, 1 x 10 ml) y se combinaron, se lavaron de nuevo con DCM (3 x 10 ml) y después se secaron minuciosamente al vacío.

Etapa E

La resina seca se dividió en dos porciones iguales (0,3 g) y cada una se puso en un recipiente de reacción de péptidos. Los lotes de resina se lavaron con DCM (2 x 10 ml) y después se suspendieron de nuevo en DCM (5 ml). A un matraz se le añadió el identificador Xf (15 mg) y al otro se le añadió Xg (15 mg). Los matraces se agitaron durante 1 h antes de la adición de catalizador de Rh(TFA)_{2} (1% en moles). Los matraces se agitaron durante 2 h y después el disolvente se retiró por filtración. Cada lote de resina se lavó con DCM (3 x 10 ml) y cada uno después se suspendió de nuevo en DCM (5 ml).

Se añadió el enol éter apropiado (1 ml) (véase la Tabla 7-1) a los matraces y los recipientes se agitaron durante 30 min. A cada matraz se le añadió una solución de BF_{3}\cdotOEt_{2} (0,5 ml de una solución al 5% en DCM) y los matraces se agitaron durante 24 h. La retirada del disolvente por filtración estuvo seguida del lavado de la resina con DCM (10 ml) y la resina después se combinó. Las perlas después se lavaron adicionalmente con DCM (5 x 10 ml), DMF (2 x 10 ml), metanol (2 x 10 ml) y DCM (2 x 10 ml). Después, la resina se secó minuciosamente al vacío.

Etapa F

Para confirmar la identidad de los productos producidos en la heterobiblioteca de Diels-Alder se completó un ejemplo a gran escala para permitir la confirmación de la estructura por medios espectroscópicos. El procedimiento seguido fue esencialmente el mismo método descrito para la biblioteca combinatoria. En la etapa A se acopló 4-hidroxibenzaldehído al grupo fotolábil. En la etapa D, se condensó anilina con el aldehído. En la etapa E, el enol éter se formó con 4,5-dihidro-2-metilfurano.

La fotólisis del compuesto (etapa F) se realizó suspendiendo 100 mg de las perlas en DMF (0,3 ml) e irradiando las perlas con una lámpara UVP "Black Ray" portátil modelo UVL 56 de 366 nm durante 16 h. La DMF se retiró mediante una pipeta y las perlas se aclararon con más DMF (2 x 3 ml). La solución original y los lavados se combinaron y el disolvente se retiró al vacío. El análisis por RMN de la mezcla de reacción mostró que contenía el azatriciclo deseado por comparación con la muestra auténtica.

Etapa G

Una perla de interés se puso en un tubo capilar de vidrio pirex sellado por un extremo. Se inyectó una solución 1 M (1 \mul) de nitrato de cerio (IV) y amonio y acetonitrilo (1:1) en el tubo, y después el tubo se centrifugó, de forma que la perla se pusiese en el fondo del capilar y se sumergiera completamente en la solución de reacción. Se añadió hexano (2 \mul) mediante una jeringa y el tubo se centrifugó de nuevo. El extremo abierto del capilar se selló con calor y se puso en un baño ultrasónico durante 4 h. El capilar después se dio la vuelta en una centrífuga y se giró de tal forma que la capa acuosa se forzó a través de la capa de hexano hasta el fondo del tubo. Este proceso de extracción se repitió 3 o 4 veces y el tubo después se abrió. La capa de hexano (1,5 \mul) se retiró mediante una jeringa y se puso en un capilar diferente que contenía BSA (0,2 \mul). Este tubo se selló y se centrifugó hasta que los reactivos se mezclaron minuciosamente. Se retiró una porción de la solución (aprox. 1 \mul) y se inyectó en una máquina de cromatografía de gases con una columna de sílice condensada con metilsilicona de 25 M x 0,2 mM con detección de captura de electrones para la separación e interpretación de las moléculas de señal.

La muestra se inyectó en la columna de GC a 200ºC y 25 psi (172,369 kPa) de gas vehículo (He_{2}). Después de 1 minuto la temperatura se incrementó a una velocidad de 20ºC por minuto hasta 320ºC, y la presión se incrementó a una velocidad de 2 psi (13,79 kPa) hasta 40 psi (275,790 kPa). Estas condiciones se muestran en el siguiente diagrama:

Condiciones de GC

58

Se obtuvieron los siguientes resultados con cuatro perlas seleccionadas de forma aleatoria:

Perla 1

	Señal detectada
	Xf	Xe Xd Xc	Xb Xa
Ar			2-hidroxi naftilo
R^{1}		C_{6}H_{11}
R^{2}		H
R^{3}	CH_{3} (n = 1)

Perla 2

	Señal detectada
	Xg	Xe Xd Xc	Xb
Ar			2-cloro-4-hidroxifenilo
R^{1}		C_{6}H_{11}
R^{2}		H
R^{3}	H (n = 2)

Perla 3

	Señal detectada
	Xg	Xe Xd	Xb Xa
Ar			2-hidroxi naftilo
R^{1}		F_{3}CO
R^{2}		H
R^{3}	H (n = 2)

Perla 4

	Señal detectada
	Xf	Xe Xd	Xb
Ar			2-cloro-4-hidroxifenilo
R^{1}		F_{3}CO
R^{2}		H
R^{3}	CH_{3} (n = 1)

Ejemplo 8 Biblioteca de benzodiacepina

Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4, se construye una biblioteca combinatoria de la fórmula X

59

en la que

R es un radical de un D o L aminoácido natural;

R^{1} es H, alquilo con 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo inferior, alquilamina con 1 a 6 átomos de carbono, carboxialquilo con 1 a 6 átomos de carbono, o fenilalquilo con 1 a 6 átomos de carbono, donde el fenilo está opcionalmente substituido con alquilo inferior, F, Cl, Br, OH, NH_{2}, CO_{2}H, u O-alquilo inferior;

R^{2} es H o CO_{2}H;

R^{3} es H o OH;

R^{4} es H o Cl;

con las condiciones de que cuando R^{3} es OH, R^{2} es H y cuando R^{2} es carboxi, R^{3} es H.

Esta biblioteca se libera desde una pluralidad de perlas codificadas de la fórmula general

60

en la que

IX_{n} es una pluralidad de identificadores de la fórmula Ia, en la que dicha pluralidad representa un esquema codificado;

S es un substrato;

F^{1}-F^{2} es el resto de un miembro enlazador de Fórmula Ia; y

R, R^{1}, R^{2} y R^{4} son como se han definido para la fórmula X.

Ejemplo 9 Preparaciones de identificadores típicos

Los identificadores de compuestos diazo que se unen a la resina mediante la formación de carbeno se preparan como se muestra.

Los compuestos de fórmula general

61

en la que n es 0-10 y

Ar es pentaclorofenol, 2,4,6-triclorofenol, 2,4,5-triclorofenol o 2,6-dicloro-4-fluorofenol se preparan como se indica a continuación.

A una solución de 1-hidroxi-4-(2,6-dicloro-4-fluoro-fenoxi)butano (0,38 g, 1,5 mmol), isovalinato de metilo (0,228 g, 1,5 mmol) y trifenilfosfina (0,393 g, 1,5 mmol) en THF (8 ml) se le añadió azodicarboxilato de dietilo (0,287 g, 1,7 mmol). La solución se agitó a t.a. durante 36 h. El disolvente se retiró al vacío y el residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (con una mezcla de acetato de etilo al 20% y éter de petróleo al 80%), produciendo 0,45 g del aldehído (rendimiento del 77%).

El aldehído (100 mg, 0,26 mmol) se disolvió en acetona (8 ml) y se trató con una solución de KmnO_{4} (61 mg, 0,39 mmol) en acetona (4 ml) y agua (4 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 13 h. La mezcla se diluyó con acetato de etilo (100 ml) y agua (50 ml) y las capas se separaron. La capa acuosa se extrajo con más acetato de etilo (2 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (50 ml) y se secaron (MgSO_{4}). La retirada del disolvente produjo 109 mg del ácido benzoico (rendimiento del 93%).

Se trató una solución del ácido (76 mg, 0,188 mmol) en cloruro de metileno (2 ml) con cloruro de oxalilo (36 mg, 0,28 mmol) y DMF catalítica. Después de agitar durante 10 min a temperatura ambiente se observó un desprendimiento de gas lento pero constante. Se continuó agitando durante 2 h, momento en el que la solución se diluyó con DCM (15 ml) y se lavó con una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico (5 ml). Las capas se separaron. La capa orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}) y el disolvente se evaporó, produciendo el cloruro de benzoílo en forma de cristales amarillos pálidos.

El cloruro de benzoílo se disolvió en cloruro de metileno (5 ml) y se añadió a una solución agitada de diazometano en éter a -78ºC. El baño frío se dejó calentar y la mezcla se dejó en agitación durante 5 h a temperatura ambiente. Los disolventes y el exceso de diazometano se retiraron al vacío y el residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice usando un método de elución en gradiente en el que la concentración de acetato de etilo varió del 10% al 40% en hexano, produciendo 48 mg del compuesto diazo (rendimiento del 60%).

Los compuestos de la fórmula general:

62

en la que;

n es 0-10 y

\newpage

Se disolvieron valinato de metilo (0,729 g, 4,0 mmol), 1-hidroxi-9-(2,3,4,5,6-pentaclorofenoxi)nonano (1,634 g, 4,0 mmol) y trifenilfosfina (1,259 g, 4,8 mol) en 20 ml de tolueno seco en una atmósfera de argón. Se añadió gota a gota DEAD (0,76 ml, 0,836 g, 4,8 mmol) y la mezcla se agitó a 25ºC durante una hora. La solución se concentró hasta la mitad del volumen y se purificó por cromatografía ultrarrápida eluyendo con DCM para dar 1,0 g (1,7 mmol, 43%) del producto en forma de un sólido cristalino blanco.

El éster metílico anterior (1,0 g, 1,7 mmol) se disolvió en 50 ml de THF, se añadieron 2 ml de agua seguido de hidróxido de litio (1,2 g, 50 mmol). La mezcla se agitó a 25ºC durante una hora y después se calentó a reflujo durante cinco horas. Después de enfriar a 25ºC, la mezcla se vertió en acetato de etilo (200 ml) y la solución se lavó con HCl 1 M (50 ml x 3) y después con NaCl acuoso saturado (1 x 50 ml) y se secó sobre sulfato sódico. El disolvente se retiró y el ácido bruto se destiló azeotrópicamente una vez con tolueno.

El material bruto anterior se disolvió en 100 ml de tolueno, se añadieron 10 ml (1,63 g, 14 mmol) de cloruro de tionilo, y la mezcla se calentó a reflujo durante 90 min. El volumen de la solución se redujo a aproximadamente 30 ml por destilación y después el tolueno restante se retiró por evaporación. El cloruro de ácido bruto se disolvió en 20 ml de DCM y se enfrió a -78ºC en una atmósfera de argón y se añadió una solución de aproximadamente 10 mmol de diazometano en 50 ml de éter anhidro. La mezcla se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 90 min. Se burbujeó argón a través de la solución durante 10 min y después los disolventes se retiraron por evaporación y el material bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida eluyendo con acetato de etilo al 10-20% en hexano. Se obtuvo la diacetona (0,85 g, 1,4 mmol, 82% en tres etapas) en forma de un sólido amarillo pálido.

Los siguientes identificadores se prepararon como se ha descrito anteriormente:

Escisión fotolábil

Se prepararon 50 identificadores de la fórmula:

63

en la que:

Ar es

64

y n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10.

Escisión oxidativa tipo I

Se prepararon 7 identificadores de la fórmula

65

en la que:

A es

66

y n es 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10.

Escisión oxidativa tipo II

Se prepararon 13 identificadores de la fórmula

67

en la que:

Ar es

68

y n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10;

y en la que:

Ar es

69

y n es 0, 3, y 9.

Por la descripción anterior, es evidente que la presente invención proporciona métodos sencillos y versátiles para uso en la identificación de compuestos, donde la cantidad de compuesto presente impide cualquier garantía de la capacidad de obtener una determinación precisa de su historia de reacción. El método permite la producción de números extraordinariamente grandes de productos diferentes, que pueden usarse en diversas técnicas de selección para determinar la actividad biológica u otra actividad de interés. El uso de señales que son químicamente inertes en las condiciones del proceso permite una gran versatilidad en una diversidad de medios producidos por las diversas técnicas sintéticas empleadas para producir los productos de interés. Las señales pueden sintetizarse fácilmente y permiten un análisis preciso, de forma que definen de forma precisa la naturaleza de la composición.

Claims

1. Un método para registrar la historia de reacción de un soporte sólido que es uno de una pluralidad de soportes sólidos, pluralidad de soportes sólidos que se somete a una serie de reacciones de al menos dos etapas que requieren diferentes agentes y/o diferentes condiciones de reacción, dando como resultado diferentes modificaciones, obteniéndose un producto final diferente, respectivamente, sobre diferentes soportes sólidos, comprendiendo dicho método

(a^{1}) mezclar dichos grupos; y

2. El método de la reivindicación 1, donde después de la etapa (a), todos los soportes sólidos se combinan en una sola mezcla, o algunos de los soportes sólidos se reservan y no experimentan ninguna reacción adicional.

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde cada pluralidad de grupos comprende al menos 100 soportes sólidos.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que cada identificador se une al soporte sólido a través de un componente distinto del componente señal de otro identificador.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el enlazador escindible comprende un orto-metoxifenil éter.

6. El método de la reivindicación 1, 2 ó 3, donde cada señal, después de la separación, comprende no más de 60 átomos, distintos de átomos de hidrógeno.

7. El método de la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que cada señal comprende un resto haloalquilo o haloarilalquilo.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el reactivo de cada etapa de la historia de reacción se registra por una señal unida al soporte o una combinación de señales unidas al soporte.

9. Un método para determinar la estructura de un compuesto, que comprende

proporcionar un soporte sólido que comprende un compuesto que se sintetizó por una serie de reacciones realizadas sobre una pluralidad de soportes sólidos, comprendiendo dicha síntesis en la primera etapa o en una etapa intermedia de dicha serie de reacciones, dividir dicha pluralidad de soportes sólidos en una pluralidad de grupos, comprendiendo cada grupo al menos uno de dichos soportes sólidos, y hacer reaccionar diferentes grupos de dichos soportes sólidos con un agente diferente y/o empleando una condición de reacción diferente, mezclar dichos grupos, y repetir dicha división y reacción al menos una vez durante una etapa intermedia adicional o final, teniendo también el soporte sólido unida una combinación de identificadores que tienen señales, estando unida cada señal a través de un enlazador escindible, difiriendo las señales de los identificadores entre sí, pudiendo separarse del soporte y, una vez separadas, pudiendo separarse entre sí, definiendo dicha combinación de identificadores, para tal soporte sólido, la elección del agente y/o de las condiciones de reacción para cada etapa de dicha serie de reacciones,

separar las señales mezcladas entre sí; y

10. El método de la reivindicación 9, en el que el reactivo de cada etapa de la serie de reacciones se registra por una señal unida al soporte o una combinación de señales unidas al soporte.

11. El método de las reivindicaciones 9 o 10, en el que la primera señal y la segunda señal se unen al soporte sólido a través de un enlazador escindible.

12. El método de la reivindicación 11, en el que el enlazador separable comprende un alquil orto-metoxifenil éter.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-12, donde, después de la separación, cada señal comprende no más de 100 átomos, distintos de átomos de hidrógeno.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-12, donde, después de la separación, cada señal comprende no más de 60 átomos, distintos de átomos de hidrógeno.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-12, donde cada señal comprende un resto haloalquilo o haloarilalquilo.

16. El método de registro de una historia de reacción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el método para determinar la estructura de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-15, donde el soporte sólido tiene unidos al menos cuatro identificadores diferentes que difieren entre sí, y cada uno de dicho identificadores se define por la fórmula:

-F^{1}'-F^{2}-\underline{C}-E-\underline{C}'

donde:

C-E-C' es una señal que puede analizarse, cuyos componentes proporcionan medios para la separación de otras señales y permiten la detección o la adición de un componente detectable;

F^{1}' es un grupo funcional que une -F^{2}-C-E-C' a dicho soporte sólido directamente o a través de un componente distinto del componente de señal de otro identificador;

F^{2} es un componente de unión capaz de escindirse selectivamente para liberar la señal; y

cada uno de dichos identificadores o una combinación de dichos identificadores registra un suceso de la reacción de la serie que produjo el compuesto unido al soporte.

17. El método de registro de una historia de reacción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el método para determinar la estructura de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-15, donde el soporte sólido tiene unido al menos cuatro identificadores que difieren entre sí y, cada identificador, antes de unirse al soporte sólido, se define por la fórmula:

F^{1}-F^{2}-(\underline{C}(E-\underline{C}')_{a})_{b}

donde:

F^{1} es -CO_{2}H, -CH_{2}X, -NHR^{1}, -OH, -CHN_{2}, -SH, -C(O)CHN_{2}, S(O_{2})CHN_{2}, -N_{3}, -NO_{2}, -S(O_{2})N_{3} o -C(O)X;

F^{2} es

70

71

72

73

74

75

A es -O-, -OC(O)O-, -OC(O)- o -NHC(O)-;

C es un enlace, o

alquileno con 1 a 20 átomos de carbono opcionalmente substituido con 1-40 F, Cl, Br, alcoxi con 1 a 6 átomos de carbono, NR^{4}R^{4}, OR^{4} o NHR^{4}, o

-((C(R^{4})_{2})_{m}-Y-Z-Y-(C(R^{4})_{2})_{n}Y-Z-Y]_{p}-;

con la condición de que el número máximo de átomos de carbono en C+C' sea 20;

C' es -H, -F, -Cl, o

alquilo con 1 a 20 átomos de carbono opcionalmente substituido con 1-40 F, Cl, Br, alcoxi con 1 a 6 átomos de carbono, NR^{4}R^{4}, OR^{4} o NHR^{4}, o

-(C(R^{4})_{2})_{m}-Y-Z-Y-(C(R^{4})_{2})_{n}Y-Z-Y]_{p}-;

E es alquilo con 1 a 10 átomos de carbono substituido con 1-20 F, Cl o Br, o

Q-arilo, donde el arilo es un anillo aromático mono- o bi-cíclico que contiene hasta 10 átomos de carbono y hasta 2 heteroátomos seleccionados entre O, S y N, que está substituido con 1-7 F, Cl, NO_{2}, SO_{2}R^{5}, o un fenilo substituido, que está substituido con 1-5 F, Cl, NO_{2} o SO_{2}R^{5}, y Q es un enlace, O, S, NHR^{4}, C=O, -C(O)NR^{5}, -NR^{5}C(O)-, -C(O)O- o OC(O)-;

E-C' puede ser -H, -OH o amino;

R^{1} es -H o alquilo con 1 a 6 átomos de carbono;

R^{3} es -C=O, -C(O)O, -C(O)NR^{1}, -S, -SO o -SO_{2};

R^{4} es -H o alquilo con 1 a 6 átomos de carbono;

R^{5} es alquilo con 1 a 6 átomos de carbono;

a es un número entero de 1 a 5;

b es un número entero de 1 a 3;

m y n son independientemente números enteros de 0 a 20;

p es un número entero de 1 a 7;

X es un grupo saliente;

Y es un enlace, -O, -S o -NHR^{4};

Z es un enlace;

fenileno, que está opcionalmente substituido con 1-4 F, Cl, Br, alquilo con 1 a 6 átomos de carbono, alcoxi con 1 a 6 átomos de carbono, alquilo con 1 a 6 átomos de carbono substituido con 1-13 F o Cl, o alquiloxi con 1 a 6 átomos de carbono substituido con 1-13 F, Cl o Br;

(C(R^{4})_{2})_{1-20} o (CF_{2})_{1-20},

con la condición de que cuando Z es un enlace, uno de sus Y adyacentes también es un enlace; y

cada uno de dichos identificadores está unido a dicho soporte sólido directamente o a través de un componente distinto del componente señal de otro identificador, y cada uno de dichos identificadores o una combinación de identificadores registra un suceso de reacción de la serie que produjo el compuesto unido al soporte.

18. El método de la reivindicación 16 ó 17, en el que E permite la detección o la adición de un componente detectable y C o C' permite la separación de las señales entre sí.

19. El método de la reivindicación 16 ó 17, donde el compuesto es un oligómero que es un oligopéptido, oligonucleótido, oligosacárido, polilípido, poliéster, poliamida, poliuretano, poliurea, poliéter, derivado de polifósforo que es un fosfato, fosfonatos, fosforamida, fosfonamida, fosfito o fosfinamida; derivado de poliazufre que es una sulfona, sulfonato, sulfito, sulfonamida o sulfenamida, donde en el caso de los derivados de fósforo y de azufre, los átomos de P o S están unidos a uno o más átomos de C, H, N, O o S.

20. El método de la reivindicación 16 ó 17, donde el compuesto es un no oligómero que es un compuesto heterocíclico, aromático, alicíclico, alifático o heteroalifático substituido o no substituido.

21. El método de la reivindicación 20, en el que el no oligómero es un compuesto diazabicíclico, un compuesto azatricíclico o un compuesto ramificado.

\newpage

22. El método de la reivindicación 16 ó 17, en el que el compuesto se une al soporte sólido a través de un enlace que no es lábil en condiciones oxidativas, hidrolíticas, termolíticas, ácidas, básicas, fotolíticas o reductoras.

23. El método de la reivindicación 16 ó 17, en el que el compuesto se une al soporte sólido a través de un enlace escindible.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que los identificadores comprenden compuestos que contienen isótopos, haloalquilo, haloariloxialquilo, o haloarilalquilo.

25. El método de la reivindicación 16 ó 17, en el que el soporte sólido es una perla de aproximadamente 10-2000 \mum de diámetro, y donde los identificadores comprenden señales que, después de la escisión desde la perla, pueden separarse entre sí por cromatografía de gases o cromatografía líquida y detectarse por captura de electrones, espectroscopía de masas, fluorescencia o técnicas de emisión atómica.

26. El método de la reivindicación 16 ó 17, donde los identificadores difieren entre sí isotópicamente, isométricamente o en el número o posición de grupos metileno o átomos de flúor, cloro, bromo, nitrógeno, oxígeno o azufre presentes.

27. El método de la reivindicación 16 ó 17, en el que F^{2} puede escindirse selectivamente por oxidación.

28. El método de la reivindicación 16 ó 17, en el que F^{2} puede escindirse selectivamente por exposición a nitrato de Ce(IV) amonio 0,25 M.

29. El método de la reivindicación 17, donde:

F^{1} es CO_{2}H, C(O)CHN_{2}, S(O_{2})CHN_{2}, COCl, OH, SH, CH_{2}X o NHR_{1};

F^{2} es

76

A es -O- o OC(O)-; y

C(E-C') es (CR^{4}_{2})_{1-15}-(O)_{0-1}-Ar, (CR^{4}_{2})_{0-15}-(CF_{2})_{1-15}-(CR^{4}_{2})_{0-15}-H o (CH_{2})_{1-20}-((O)_{0-1}(CH_{2})_{1-19})_{0-24}-(CH_{2})_{0-24}-(O)_{0-1}-Ar, y

Ar es pentafluorofenilo, pentaclorofenilo, pentabromofenilo, 2,3,5,6-tetrafluoro-4(2,3,4,5,6-pentafluorofenil)fenilo, 2,4,6-triclorofenilo, 2,4,5-triclorofenilo, 2,6-dicloro-4-fluorofenilo o 2,3,5,6-tetrafluorofenilo.

30. El método de la reivindicación 17, donde:

F^{1} es CO_{2}H, CHN_{2}, -C(O)CHN_{2}, C(O)X, NCS o CH_{2}X;

F^{2} es

77

78

cada uno de C y C' es independientemente alquileno con 1 a 20 átomos de carbono no substituido o substituido con 1-40 F o Cl, o [O-(CH_{2})_{2-3}]_{p}; y

E es alquilo con 1 a 10 átomos de carbono substituido con 1-20 F o Cl, o Q-arilo, donde arilo es un anillo aromático bicíclico substituido con 1-7 F o Cl, o Q-fenilo substituido con 1-5 F, Cl, NO_{2} o SO_{2}R^{5}, y Q es un enlace, O, -NR^{5}C(O)- o -OC(O)-.

31. El método de la reivindicación 17, en el que F^{1}-F^{2}-(C(E-C')_{a})_{b} es:

79

80

81

82

83

y Ar es pentafluorofenilo, pentaclorofenilo, pentabromofenilo, 2,3,5,6-tetrafluoro-4(2,3,4,5,6-pentafluorofenil)fenilo, 2,4,6-triclorofenilo, 2,4,5-triclorofenilo, 2,6-dicloro-4-fluorofenilo o 2,3,5,6-tetrafluorofenilo.

32. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 16-31, donde F' puede unirse al soporte sólido por exposición a un 1% en moles de catalizador de Rh(TFA)_{2}.

33. Un soporte sólido que comprende

34. El soporte sólido de acuerdo con la reivindicación 33, en el que el enlazador separable comprende un alquil orto-metoxifenil éter.

35. El soporte sólido de acuerdo con la reivindicación 33 ó 34, en el que cada señal, después de la separación, comprende no más de 100 átomos distintos de átomos de hidrógeno.

36. El soporte sólido de acuerdo con la reivindicación 33 ó 34, en el que cada señal, después de la separación, comprende no más de 60 átomos distintos de átomos de hidrógeno.

37. El soporte sólido de acuerdo con la reivindicación 33 ó 34, en el que cada señal comprende un resto haloalquilo o haloarilalquilo.

38. Un soporte sólido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 33-37, que tiene unido (i) un compuesto producido por una sola serie de sucesos de reacción, y (ii) al menos cuatro identificadores que difieren entre sí, donde cada uno de dichos identificadores se define por la fórmula:

-F^{1}'-F^{2}-\underline{C}-E-\underline{C}'

donde: C-E-C' es una señal que puede analizarse, cuyos componentes proporcionan medios para la separación de otras señales y permiten la detección o la adición de un componente detectable;

\newpage

39. Un soporte sólido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 33-37, que tiene unido (i) un compuesto producido por una sola serie de sucesos de reacción, y (ii) al menos cuatro identificadores que difieren entre sí, donde cada uno de dichos identificadores se define por la fórmula:

F^{1}-F^{2}-(\underline{C}(E-\underline{C}')_{a})_{b}

donde:

F^{2} es

84

85

86

87

88

89

A es -O-, -OC(O)O-, -OC(O)- o -NHC(O)-;

C es un enlace, o

-((C(R^{4})_{2})_{m}-Y-Z-Y-(C(R^{4})_{2})_{n}Y-Z-Y]_{p}-;

C' es -H, -F, -Cl, o

-(C(R^{4})_{2})_{m}-Y-Z-Y-(C(R^{4})_{2})_{n}Y-Z-Y]_{p}-;

E es alquilo con 1 a 10 átomos de carbono substituido con 1-20 F, Cl o Br, o

E-C' puede ser -H, -OH o amino;

R^{1} es -H o alquilo con 1 a 6 átomos de carbono;

R^{3} es -C=O, -C(O)O, -C(O)NR^{1}, -S, -SO o -SO_{2};

R^{4} es -H o alquilo con 1 a 6 átomos de carbono;

R^{5} es alquilo con 1 a 6 átomos de carbono;

a es un número entero de 1 a 5;

b es un número entero de 1 a 3;

m y n son independientemente números enteros de 0 a 20;

p es un número entero de 1 a 7;

X es un grupo saliente;

Y es un enlace, -O, -S o -NHR^{4};

Z es un enlace;

(C(R^{4})_{2})_{1-20} o (CF_{2})_{1-20},

cada uno de dichos identificadores está unido a dicho soporte sólido directamente o a través de un componente distinto del componente señal de otro identificador, y cada uno de dichos identificadores o una combinación de dichos identificadores registra un suceso de reacción de la serie que produjo el compuesto unido al soporte.

40. El soporte sólido de la reivindicación 38 ó 39, en el que E permite la detección o la adición de un componente separable y C o C' permite la separación de las señales entre sí.

41. El soporte sólido de la reivindicación 38 o 39, en el que el compuesto es un oligómero donde el compuesto es un oligómero que es un oligopéptido, oligonucleótido, oligosacárido, polilípido, poliéster, poliamida, poliuretano, poliurea, poliéter, derivado de polifósforo que es un fosfato, fosfonato, fosforamida, fosfonamida, fosfito o fosfinamida; derivado de poliazufre que es una sulfona, sulfonato, sulfito, sulfonamida o sulfenamida, donde en el caso de los derivados de fósforo y de azufre, los átomos de P o S están unidos a uno o más átomos de C, H, N, O o S.

42. El soporte sólido de la reivindicación 38 ó 39, donde el compuesto es un no oligómero que es un compuesto heterocíclico, aromático, alicíclico, alifático o heteroalifático substituido o no substituido.

43. El soporte sólido de la reivindicación 42, en el que el no oligómero es un compuesto diazabicíclico, un compuesto azatricíclico o un compuesto ramificado.

44. El soporte sólido de la reivindicación 38 ó 39, en el que el compuesto se une al soporte sólido a través de un enlace que no es lábil en condiciones oxidativas, hidrolíticas, termolíticas, ácidas, básicas, fotolíticas o reductoras.

45. El soporte sólido de la reivindicación 38 ó 39, en el que el compuesto se une al soporte sólido a través de un enlace escindible.

46. El soporte sólido de la reivindicación 38, en el que los identificadores comprenden compuestos que contienen isótopos, haloalquilo, haloariloxialquilo, o haloarilalquilo.

47. El soporte sólido de la reivindicación 38 ó 39, en el que el soporte sólido es una perla de aproximadamente 10-2000 \mum de diámetro, y donde los identificadores comprenden señales que, después de la escisión desde la perla, pueden separarse entre sí por cromatografía de gases o cromatografía líquida y detectarse por captura de electrones, espectroscopía de masas, fluorescencia o técnicas de emisión atómica.

48. El soporte sólido de la reivindicación 38 ó 39, donde los identificadores difieren entre sí isotópicamente, isométricamente o en el número o posición de grupos metileno o átomos de flúor, cloro, bromo, nitrógeno, oxígeno o azufre presentes.

49. El soporte sólido de la reivindicación 38 ó 39, en el que F^{2} puede escindirse selectivamente por oxidación.

50. El soporte sólido de la reivindicación 38 ó 39, en el que F^{2} puede escindirse selectivamente por exposición a nitrato de Ce(IV) amonio 0,25 M.

51. El soporte sólido de la reivindicación 39, donde:

F^{1} es CO_{2}H, -C(O)CHN_{2}, S(O_{2})CHN_{2}, COCl, OH, SH, CH_{2}X o NHR_{1};

F^{2} es

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A es -O- o OC(O)-; y

C(E-C') es (CR^{4}_{2})_{1-15}-(O)_{0-1}-Ar, (CR^{4}_{2})_{0-15}-(CF_{2})_{1-15}-(CR^{4}_{2})_{0-15}-H o (CH_{2})_{1-20}-((O)_{0-1}(CH-{2})_{1-19})_{0-24}-(CH_{2})_{0-24}-(O)_{0-1}-Ar, y

52. El soporte sólido de la reivindicación 39, donde:

F^{1} es CO_{2}H, CHN_{2}, -C(O)CHN_{2}, C(O)X, NCS o CH_{2}X;

F^{2} es

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53. El soporte sólido de la reivindicación 39, en el que F^{1}-F^{2}-(C(E-C')_{a})_{b} es:

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54. El soporte sólido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 39-53, donde F' puede unirse al soporte sólido por exposición a un 1% en moles de catalizador de Rh(TFA)_{2}.

55. Una biblioteca que comprende al menos 100 soportes sólidos únicos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 33-54.

56. Un proceso para identificar un compuesto que tiene una característica de interés, que comprende:

a): proporcionar una biblioteca de una pluralidad de soportes sólidos individuales, teniendo cada soporte sólido unido de forma separable un compuesto y una primera y una segunda combinación de identificadores que tienen señales, de acuerdo con la reivindicación 33,

b): o bien

(i): primero seleccionar la biblioteca de la etapa (a) en un ensayo para detectar la presencia de un compuesto de interés en la biblioteca y después separar el compuesto detectado de esta manera, todavía unido al soporte sólido, de la biblioteca, o

c): tratar

: para provocar la separación de las señales separables de cada uno de los identificadores;

d): separar y analizar las señales separadas de la etapa c); y

e): determinar los agentes o condiciones de reacción en las etapas de la serie de reacciones mediante la que se sintetizó el compuesto a partir del análisis de las señales de la etapa d), identificando de esta manera el compuesto de interés.

57. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 56, donde el soporte sólido es un soporte de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 54.

58. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 56, en el que cada identificador se define por la fórmula general:

F^{1}-F^{2}-(\underline{C}(E-\underline{C}')_{a})_{b}

en la que F^{1} es CHN_{2}, C(O)CHN_{2}, S(O)_{2}CHN_{2}, N_{3}, NO_{2} o S(O)_{2}N_{3}, y F^{2}, C, E, C', a y b son como se definen en la reivindicación 17.

59. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 58, donde el soporte sólido es un soporte de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 54.

60. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 58, en el que cada identificador se define por la fórmula general:

F^{1}-F^{2}-(\underline{C}(E-\underline{C}')_{a})_{b}

en la que F^{1} es CHN_{2}, C(O)CHN_{2}, S(O)_{2}CHN_{2}, N_{3}, NO_{2} o S(O)_{2}N_{3}, y F^{2}, C, E, C', a y b son como se definen en la reivindicación 29 ó 30.

61. Un método para sintetizar un soporte, que comprende:

(c) mezclar dichos grupos; y

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