ES2207286T3 - Construcciones quimicas. - Google Patents
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Abstract
Una construcción química para uso en síntesis en fase sólida que comprende un soporte sólido Q que tiene unido a él mediante un grupo conector Y un sustrato R; el grupo conector Y teniendo un primer y un segundo sitios de escisión que se pueden escindir ortogonal y selectivamente; el segundo sitio de escisión pudiéndose escindir selectivamente para liberar el sustrato; y el primer sitio de escisión estando localizado en una posición entre el segundo sitio de escisión y el soporte sólido y pudiéndose escindir selectivamente para liberar un fragmento Fr que comprende el sustrato y al menos una porción del grupo de conexión Y; caracterizada porque la escisión del esqueleto de la construcción en el primer sitio de escisión forma o introduce en el fragmento Fr químico en el primer sitio de escisión un resto que comprende un grupo sensible G que sensibiliza el fragmento Fr para el análisis instrumental, por ejemplo, análisis de espectroscopia de masas.
Description
Construcciones químicas.
Esta invención se refiere a construcciones
químicas para uso en síntesis en fase sólida y a procedimientos de
detección y/o caracterización de los productos de síntesis en fase
sólida que usan las construcciones.
La síntesis en fase sólida se conoce desde hace
muchos años en el campo de la síntesis de péptidos y más
recientemente se ha usado cada vez más para la síntesis de los no
péptidos.
La síntesis en fase sólida ha encontrado
particular aplicación en el campo de la química combinatoria y la
preparación de bibliotecas químicas como fuentes potenciales de
nuevas directrices para descubrimiento de fármacos, véase por
ejemplo Anthony W. Czarnik, Analytical Chemistry News and
Features, Junio 1, 1998, pp 378A-386A y The
combinatorial Index, Barry A. Bunin, Academic Press, San Diego
1998. Una característica de los procedimientos químicos
combinatorios es que son capaces de preparar una cantidad muy
numerosa compuestos diferentes a partir de un número relativamente
limitado de bloques de construcción molecular en un número
relativamente pequeño de reacciones. La química combinatoria hace
uso del concepto "división y combinación" en el que una
suspensión de material de partida químico trabado al soporte sólido
se divide en N partes, cada una de las cuales se hace reaccionar con
un reactivo diferente. Después los productos de las N reacciones se
reúnen después y se mezclan completamente, la combinación resultante
se divide en N' partes y cada parte se hace reaccionar con un
reactivo diferente. Este procedimiento se puede repetir tantas veces
como etapas hay en la secuencia de reacción. De este modo, para una
secuencia de reacción de tres etapas, si la mezcla de reacción se
divide en diez partes en cada fase, cada una de las combinaciones se
hace reaccionar con un reactivo diferente antes de recombinarse con
las otras partes, el número total de compuestos formados mediante el
procedimiento será 10^{3} = 1000. De este modo se puede observar
que usando la técnica de división y combinación, se pueden
sintetizar un gran número de moléculas diferentes usando un número
mínimo de reacciones (treinta en el caso mencionado
anteriormente).
Cada uno de los soportes sólidos (por ejemplo,
una perla de resina) tendrá una sola molécula del producto trabada
a él y por lo tanto en principio cada uno de los productos de
reacción se puede analizar y separar o someter a ensayo biológico
aislando solamente cada soporte sólido individual y escindiendo el
producto del soporte. Sin embargo, la gran cantidad de compuestos
generados mediante procedimientos combinatorios significa que puede
ser impracticable para identificar y caracterizar cada uno de los
compuestos. Por consiguiente, los compuestos habitualmente primero
se ensayan, bien en el soporte sólido o después de la escisión del
soporte, y solamente aquellos compuestos, que muestran alguna
actividad biológica se identifican posteriormente. Con el fin de
minimizar el número de ensayos biológicos llevados a cabo, los
compuestos se pueden ensayar en combinaciones que contienen un
número predeterminado de compuestos, desechando las combinaciones
inactivas y sometiendo las combinaciones activas a investigación
adicional. Las actividades biológicas de los compuestos se pueden
analizar usando técnicas de ensayo automatizadas de alto
rendimiento que permiten analizar gran cantidad de compuestos en
poco tiempo.
Las perlas de resina típicamente usadas en la
síntesis de bibliotecas combinatorias se derivan de resina de
poliestireno reticulado y son habitualmente del orden de 90 \mum
y 250 \mum de diámetro (es decir apenas visible a simple vista).
El número de perlas en una masa o volumen dado de resina dependerá
del tamaño medio de perla pero, por ejemplo, con un tamaño de perla
de 150 \mum de diámetro, habrá aproximadamente 500 perlas por
miligramo de resina a granel. Típicamente las cargas de compuesto en
las perlas son del orden de 0,1 a 0,4 mmoles/g y por lo tanto las
perlas de las dimensiones dadas anteriormente tenderán a tener
cargas del compuesto individual de aproximadamente 1 nanomol de
compuesto por perla. Por lo tanto se apreciará que uno de los
problemas a los que se enfrenta el químico que trabaja con
construcciones en fase sólida es cómo identificar y caracterizar
los diversos compuestos en una biblioteca combinatoria ya que cada
compuesto puede estar presente en la biblioteca en cantidades muy
pequeñas, y normalmente habrá insuficiente compuesto presente en un
soporte sólido dado para permitir tanto el ensayo biológico como la
identificación del compuesto.
Un planteamiento conocido para el problema de
cómo identificar los compuestos en una biblioteca combinatoria es
proveer cada soporte sólido con una diana de codificación a partir
de la cual se puede determinar la identidad del compuesto. De este
modo, por ejemplo, se puede construir una diana de codificación en
etapas secuenciales sobre el soporte sólido en paralelo con la
construcción del compuesto diana deseado, la diana de codificación
reflejando la historia de síntesis del compuesto del producto y que
es única para cada compuesto de producto. La diana de codificación
se construye habitualmente sobre el soporte usando reacciones
químicas de un tipo que es ortogonal a la química usada para
construir el compuesto del producto, por lo tanto asegurando que
las unidades de codificación y los compuestos del producto no se
llegan a confundir. Una vez que se ha ensayado el compuesto del
producto, y se ha confirmado su actividad biológica, la diana de
codificación se puede entonces descodificar para permitir la
identificación del compuesto.
En un planteamiento alternativo, como se describe
en Geysen y col., Chemistry & Biology, 1996, Vol. 3; Nº 8, pp
679-688 y en el documento 97/37953, las dianas
codificadoras tales como marcadores isotópicos se pueden incorporar
en el interior de, entre otros, un grupo de engarce entre el
soporte sólido y el sustrato. Este planteamiento tiene la ventaja
de que no requiere la formación de una diana se codificación
separada que usa la química ortogonal y por lo tanto reduce el
número total de etapas de síntesis implicadas.
Un problema adicional a que hace frente el
químico de fase sólida es la dificultad de cuantificar los
productos de una secuencia de reacción dada. En cualquier
procedimiento de síntesis en fase sólida, si forma o no parte de un
procedimiento combinatorio, es importante que sea capaz de
determinar las condiciones óptimas de una etapa de reacción dada en
una serie de etapas. Es también importante que sea capaz de
controlar el progreso de una reacción de manera que se pueda
determinar si una reacción particular ha llegado a su finalización.
Es particularmente importante en una en una síntesis en fase sólida
de múltiples fases donde el fallo de una fase dada que precede a la
finalización puede conducir a la formación de productos secundarios
que, por lo tanto, complican lo que se otra manera es un
procedimiento de separación relativamente sencillo. Cuando se forman
múltiples productos en una etapa de reacción dada o secuencia de
etapas, o cuando una etapa de la reacción dada no ha llegado hasta
el final, puede ser extremadamente útil que tenga medios de
cuantificación de los productos de reacción, bien en términos
absolutos o en términos de las concentraciones relativas con
respecto a otros productos de reacción. Cuando se producen los
productos en cantidades de miligramos, la cuantificación se puede
llevar a cabo usando una diversidad de técnicas instrumentales, por
ejemplo espectroscopia de resonancia magnética nuclear
(abreviadamente RMN). Sin embargo, la cuantificación es mucho más
difícil cuando la cantidad de producto disponible para análisis
puede ser tan pequeña como un nanomol.
Aunque se conocen tanto los procedimientos
analíticos destructivos como no destructivos para determinar los
productos de síntesis en fase sólida (véase The Combinatorial
Index, idem) uno de los problemas reconocidos en la síntesis en
fase sólida es que es generalmente más difícil controlar las
reacciones llevadas a cabo sobre soportes sólidos que controlar las
reacciones en fase sólida convencionales; véase por ejemplo el
artículo de Czarnik mencionado anteriormente. Esto es
particularmente verdad con los productos de procedimientos de la
química combinatoria donde hay necesidad de usar técnicas rápidas
de alto rendimiento para analizar las cantidades grandes de
compuestos generados por dichos procedimientos. Las técnicas tales
como espectrometría de masas son potencial e idealmente adecuadas
como medio de proporcionar análisis de alto rendimiento, pero un
problema sustancial es que no todos los compuestos producen una
respuesta garantizada en condiciones de espectrometría de masas. De
hecho, muchos compuestos son "invisibles" a los llamados
procedimientos "suaves" de espectrometría de masas tales como
desorción / ionización
mediante láser asistida por matriz (abreviadamente en inglés MALDI) y espectrometría de masas por electro pulverización que tienen la intención de detectar iones moleculares sin producir fragmentación significativa de la molécula. En este contexto, el término "suave" significa procedimientos espectrales de masas que proporcionan iones moleculares y no solamente fragmentos. Una de estas razones para esto es que en condiciones de MALDI y de electropulverización, muchos compuestos, particularmente péptidos, no se ionizan suficientemente bien para dar una respuesta espectral de masas detectable.
mediante láser asistida por matriz (abreviadamente en inglés MALDI) y espectrometría de masas por electro pulverización que tienen la intención de detectar iones moleculares sin producir fragmentación significativa de la molécula. En este contexto, el término "suave" significa procedimientos espectrales de masas que proporcionan iones moleculares y no solamente fragmentos. Una de estas razones para esto es que en condiciones de MALDI y de electropulverización, muchos compuestos, particularmente péptidos, no se ionizan suficientemente bien para dar una respuesta espectral de masas detectable.
Geysen y col., (idem) solucionan este
problema sugiriendo la introducción de un centro básico fácilmente
ionizable tal como lisina en el engarce, y además sugiere que el
centro básico se puede cuaternizar mediante alquilación durante el
tratamiento con el fin de proporcionar un grupo cargado que
sensibilizaría la construcción para análisis por espectrometría de
masas. Sin embargo, un inconveniente de este planteamiento es la
necesidad de proteger el grupo amina durante las diversas etapas de
síntesis y la consiguiente necesidad de desproteger el grupo amina
antes del análisis.
Un desarrollo del planteamiento de Geysen se
describe en Carrasco y col., Tetrahedron Letters, 1997,
38, Nº 36, pp. 6331-6334. El procedimiento
de Carrasco incluye la formación de una construcción que comprende
una perla de resina unida mediante un grupo de engarce a un grupo
que los autores denominan "diana de ionización". La "diana
de ionización" a su vez se une mediante un segundo grupo de
engarce a un sustrato. El primero y segundo grupos de engarce se
pueden escindir ortogonalmente; es decir, se pueden escindir
selectivamente usando diferentes químicas.
En el ejemplo específico descrito en Carrasco y
col., el primer grupo de engarce se pueden escindir
fotoquímicamente mientras que el segundo grupo de engarce se
pueden escindir químicamente. La "diana de ionización" usada
por Carrasco es una cadena de tetrapéptidos que tiene la secuencia
(leyendo desde el extremo C) Gly–Phe–Lys-Ala, y que
tiene un grupo N-(2-trimetilamonio)acetilo
unido a la lisina. El propósito de la diana de ionización es doble.
Primero, proporciona un "grupo sensible" ya ionizado que
permite que la construcción se detecte mediante espectrometría de
masas de desorción / ionización mediante láser asistida por matriz
(abreviadamente en inglés MALDI) y en segundo lugar añade masa a la
construcción, por lo tanto, permitiendo que las moléculas de
sustrato se detecten sin que estén sumergidas o enmascaradas por
picos de bajo peso molecular en el espectro de masas.
Sin embargo, existen varios problemas potenciales
significativos con las construcciones de Carrasco y en particular la
"diana de ionización" usada en la construcción. Más
particularmente, se supone que el grupo sensible de amonio
cuaternario será incompatible con muchos de los tipos de química que
el químico pudiera desear para realizar en las construcciones. De
este modo, por ejemplo, el grupo trimetilamonio es potencialmente
químicamente activo y, además, el grupo catiónico puede funcionar
como un centro de intercambio iónico y complejrse con aniones.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un medio de controlar reacciones químicas en soportes
sólidos que evitan problemas inherentes en los procedimientos
conocidos y que proporciona un medio de detectar e identificar los
productos de técnicas de síntesis en fase sólida que usan
espectroscopia de masas.
Por consiguiente, en un primer aspecto, la
invención proporciona una construcción química para uso en síntesis
en fase sólida que comprende un soporte sólido Q que tiene unido
además mediante un grupo conector Y un sustrato R; el grupo conector
Y que tiene un primer y segundo sitios de escisión que se pueden
escindir ortogonalmente y selectivamente; el segundo sitio de
escisión que se puede escindir selectivamente para liberar el
sustrato; y el primer sitio de escisión estando localizado en una
posición entre el segundo sitio de escisión y el soporte sólido y
que se puede escindir selectivamente para liberar un fragmento Fr
que comprende el sustrato y al menos una parte del grupo de
conexión Y; caracterizado porque la escisión del esqueleto de la
construcción en el primer sitio de escisión forma o introduce en el
fragmento químico Fr en el primer sitio de escisión un resto que
comprende un grupo sensible G que sensibiliza el fragmento químico
Fr al instrumental, por ejemplo, análisis espectroscópico de
masas.
En las construcciones de la invención, el grupo
sensible G se forma o se introduce mediante la escisión del
"esqueleto" de la construcción. Esto está en contradicción con
las construcciones conocidas (véase por ejemplo, Carrasco y col.,
idem), cuando el grupo sensible está presente a lo largo de
toda la síntesis del sustrato, o cuando el grupo sensible se revela
mediante la escisión de una cadena lateral o eliminación de un grupo
protector del grupo sensible colgante.
El grupo sensible G produce el fragmento Fr, y
por lo tanto indirectamente el sustrato R, más sensible al análisis
mediante una técnica analítica dada, y en particular una técnica de
espectrometría de masas. De este modo el grupo sensible puede ser un
grupo que es fácilmente ionizable en las condiciones encontradas en
un espectrómetro de masas, y en particular espectrometría de masas
por electropulverización para proporcionar una señal fuerte.
El grupo sensible ionizable formado durante la
escisión selectiva a partir del soporte sólido del fragmento
químico Fr sirve para asegurar que el fragmento se ioniza
suficientemente en el espectrómetro de masas para dar una respuesta
fuerte. Esto evita un problema inherente en muchas moléculas
sintetizadas mediante procedimientos en fase sólida donde un grupo
ionizante adecuado no está presente y es problemático el análisis
mediante técnicas de espectrometría de masas de alto
rendimiento.
El grupo ionizable puede ser por ejemplo un grupo
amino básico o un grupo carboxilato, pero preferiblemente es un
grupo amino básico. Se apreciará que el término "grupo amino
básico" como se usa en esta memoria descriptiva se refiere en
particular a un grupo amino que se protona fácilmente.
El grupo amino básico puede ser un grupo amino
primario, un grupo amino secundario, o un grupo amino terciario.
Cuando el grupo amino básico es un grupo amino terciario, puede ser
por ejemplo, un grupo amino cíclico tal como piperidino,
piperazino, pirrolidino o morfolino, siendo actualmente preferidos
piperidino o piperazino (por ejemplo,
N-metilpiperazino).
De acuerdo con la invención, un resto que
comprende el grupo sensible G, tal como un grupo amino básico, se
forma o se introduce en el primer sitio de escisión como el
fragmento químico Fr (denominado de aquí en adelante fragmento
analítico) se escinde del soporte sólido. La ventaja de formar el
grupo sensible G de esta forma es que evita el potencial problema
de un grupo sensible preexistente o preformado que interfiere con
la química de la construcción. Además, evita la necesidad de tener
el grupo sensible protegido independientemente, por lo tanto,
eliminando el problema adicional de desprotección, un requerimiento
que podría limitar los tipos de química disponible para la escisión
en el primer y segundo sitios de escisión. De este modo, por
ejemplo, si un grupo sensible protegido colgante estuviera presente
y, por ejemplo, las condiciones requeridas para la desprotección
implicaran el uso de un ácido tal como ácido trifluoroacético,
entonces ésto evitaría eficazmente el uso de un sitio de escisión
ácido lábil como el segundo sitio de escisión que une el sustrato
al resto de la construcción. Las construcciones de la invención
evitan tales problemas.
Los átomos o grupo funcional que forman el grupo
sensible G pueden estar presente en forma enmascarada en la
construcción antes de la escisión del fragmento Fr de la resina,
las condiciones de escisión solamente sirven para no enmascarar el
grupo sensible G. Alternativamente, los átomos o grupo funcional
que forman o contienen el grupo sensible G se puede introducir en
el sitio de escisión durante la reacción de escisión. Por ejemplo,
cuando el grupo sensible es un grupo amino básico, el átomo de
nitrógeno del grupo amino puede estar presente en la construcción
antes de la escisión, o se puede introducir durante la reacción de
escisión.
Cuando el grupo sensible G se introduce desde una
fuente externa durante la reacción de escisión puede formar parte
de un resto químico mayor. Por ejemplo, el grupo G se puede
introducir como parte de un grupo X-G en el que X es
el residuo de un nucleófilo o electrófilo, por ejemplo un grupo
nunucleófilo de nitrógeno o a base de azufre, por ejemplo un grupo
de fórmula G-Alc-Nuc en el que Alc
es un grupo alquileno (por ejemplo, un
(C_{2}-C_{20}) y preferiblemente un grupo
alquileno (C_{2}-C_{6})) opcionalmente
interrumpido por uno o más heteroátomos seleccionados entre
oxígeno, nitrógeno y azufre, y Nuc es un nucleófilo, tal como una
amina (por ejemplo, NH o NR' en el que R' es un grupo alquilo
(C_{1}-C_{6}) o un grupo tiolato, y Nuc es un
nucleófilo, tal como una amina o un grupo tiolato.
Es preferible que el fragmento químico Fr
contenga un medio para impartir una firma característica al
espectro de masas del fragmento. La firma se puede ventajosamente
proporcionar mediante la incorporación en el fragmento de un
marcador isotópico de "división de picos".
El marcador isotópico de división de picos
comprende al menos un átomo que existe en numerosas formas
isotópicas. Mediante el marcaje isotópico de uno o más átomos
particulares en el fragmento Fr de tal forma que un átomo dado se
marque con una mezcla de isótopos, el espectro de masas de los
iones moleculares aparecerá como un patrón característico, el
patrón preciso dependiendo de las cantidades relativas de isótopos
individuales. Así, por ejemplo, si un átomo dado en el fragmento Fr
se marca de manera que 50% de los átomos son de una forma isotópica
y el 50% son de otra forma isotópica, el espectro de masas mostrará
el ion molecular en forma de un doblete característico en el que
los picos son de igual altura aproximadamente.
El propósito de el (los) átomo (s) de división de
picos es proporcionar un patrón característico que caracterizará
cualquier pico en el espectro de masas que se origina a partir del
fragmento analítico Fr, por lo tanto distinguiendo dichos picos de
los debidos a materiales extraños.
Los ejemplos que se pueden usar como marcadores
isotópicos de división de picos incluyen ^{1}H/^{2}H (D),
^{79}Br/^{81}Br, ^{12}C/^{13}C, ^{14}N/^{15}N y
^{16}O/^{18}O.
El fragmento Fr puede contener un solo marcador
isotópico de división de picos o más de uno de dicho marcador. Por
ejemplo, el marcador isotópico puede ser un solo átomo de boro en
cuyo caso el pico para el ion molecular del fragmento analítico Fr
liberado después de la escisión del soporte sólido aparecerá en
forma de un doblete. Mediante la introducción de un segundo o
posterior (es) marcador (es) de división de picos, un patrón de
picos más complejo se producirá para el ion molecular.
El (los) marcador (es) isotópico (s) de división
de picos preferiblemente se localiza (n) entre el primer y segundo
sitio (s) de escisión.
El primer y segundo sitios de escisión se pueden
definir mediante el primer y segundo grupos de engarce L^{1} y
L^{2}. Un "grupo espaciador" A se puede interponer entre los
dos grupos de engarce L^{1} y L^{2}, el grupo espaciador A
típicamente contiene un marcador isotópico de división de picos. De
acuerdo con lo anterior, en una realización preferida de la
invención, se proporciona una construcción química como se ha
definido anteriormente en esta memoria descriptiva en la que el
grupo de conexión Y tiene la fórmula
L^{1}-A-L^{2}; en la que L^{1}
es un primer grupo de engarce que define el primer sitio de
escisión; A es un grupo químico (el grupo espaciador) que contiene
un marcador isotópico de división de picos; y L^{2} es un segundo
grupo de engarce que define el segundo grupo de escisión.
El primer y segundo sitios de escisión se pueden
escindir ortogonal y selectivamente; es decir, las condiciones
usadas para efectuar la escisión en uno de los sitios de escisión
no escindirá el otro. Se puede usar una amplia diversidad de
diferentes tipos de reacción de escisión, los ejemplos son
reacciones seleccionadas de escisión catalizada por ácidos,
escisión catalizada por bases, escisión catalizada por metales,
escisión oxidante, escisión reductora, desplazamiento nucleofílico,
escisión por 1,2 bis nucleófilos, desplazamiento
electrofílico y escisión térmica, fotoquímica y enzimática.
Los ejemplos de grupos de engarce que se pueden
escindir selectivamente en condiciones fotoquímicas que revelan o
introducen un grupo sensible G (por ejemplo, un grupo amina)
incluyen grupos carbamato tales como grupos
o-nitrobencilcarbamato en los que la escisión inicial tiene
lugar entre el grupo metileno benzílico y el átomo de oxígeno
adyacente, seguido de una pérdida de dióxido de carbono para dar un
grupo amino básico.
Los ejemplos de los grupos de engarce que se
pueden escindir mediante desplazamiento nucleofílico (por ejemplo,
para revelar o introducir un grupo sensible G) incluyen grupos de
engarce sulfonamida en los que el anillo arilo (por ejemplo,
fenilo) de la sulfonamida contiene un grupo saliente electrónico tal
como un grupo nitro, preferiblemente en la posición orto del
anillo arilo (véase por ejemplo, Kay y col., Tetrahedron
Letters-1997, 38 (39)). La escisión del engarce
entre los restos amino y sulfonilo se pueden efectuar mediante un
nucleófilo tal como un nucleófilo tiol o tiolato en presencia de
una base tal como
1,8-diazobiciclo[5.4.0]undec-7-eno
(abreviadamente en inglés DBU), morfolina o carbonato sódico.
Además los ejemplos de grupos que se pueden escindir mediante
desplazamiento nucleofílico incluyen engarces de "enganches de
seguridad" a base de mercaptopirimidina tal como
5-carboxi-2-ercaptopirimidina,
donde la escisión se puede efectuar haciendo reaccionar en
condiciones oxidantes generar un enlace sulfóxido o sulfona,
seguido de la reacción con un grupo amino nucleofílico para formar
una 2-aminopirimidina. Dichos engarces se pueden
escindir, por ejemplo, mediante reacción con una amina cíclica tal
como piperidina o una piperazina N sustituida (por ejemplo,
N-metilpiperazina) o un grupo amino que contiene un
nucleófilo tiolato (por ejemplo, dimetilaminoetiltiolato) después
de oxidar primero con un agente oxidante, preferiblemente un agente
oxidante relativamente suave tal como un perecido o una persal tal
como peroximonosulfonato de potasio (por ejemplo "Oxone").
Tanto el primer como el segundo sitios de
escisión / engarces, o ambos, pero preferiblemente el primero,
pueden ser de la variedad "enganches de seguridad"; es decir
el sitio de escisión o grupo de engarce se puede modificar
químicamente en una primera etapa antes de que se pueda someter a
escisión en una segunda etapa (por ejemplo para revelar o
introducir un grupo sensible G). Una ventaja de dicha disposición es
que previene o reduce significativamente la posibilidad de que la
escisión tenga lugar inadvertidamente. Un ejemplo de un mecanismo
de "enganche de seguridad" implica la oxidación de un grupo
funcional (por ejemplo, el engarce de "enganche de seguridad" a
base de mercaptopirimidina descrito anteriormente) en una primera
etapa, la oxidación sirviendo para hacer el grupo funcional más
dispuesto al desplazamiento mediante un nucleófilo en la posterior
etapa de escisión. El nucleófilo puede variar considerablemente en
estructura. Por ejemplo, en una realización, el nucleófilo puede ser
un nucleófilo que contiene un grupo amino), el grupo amino
participando en la acción del desplazamiento nucleofílico de manera
que el grupo amino (grupo sensible G) se une directamente al sitio
de escisión. Alternativamente, en otra realización, el grupo amino
(u otro grupo sensible) puede estar presente en un grupo (por
ejemplo un anión tiolato de dialquilaminoalquilo) que contiene otro
nucleófilo tal como un nucleófilo de azufre que se llega a unir al
sitio de escisión.
Otra clase de grupos de engarce adecuado para uso
en las construcciones de la presente invención es la clase de
grupos de engarce que se pueden escindir mediante 1,2 bis
nucleófilos tales como hidrazinas e hidroxilaminas. Dichos
bis nucleófilos se pueden usar para escindir el enlace entre
el átomo de nitrógeno y el átomo de carbono adyacente en ciertos
sistemas de enaminas, por ejemplo los sistemas de enaminas en los
que la enamina se conjuga a un grupo carbonilo. Los ejemplos de
dichos grupos son grupos a base de anillos de cicloalquilideno
oxosustituidos tal como el grupo
1-[4,4-dimetil-2,6-dioxo-ciclohexilideno]etilo
(abreviadamente en inglés de) acoplado a un átomo de nitrógeno
amino. Las construcciones se instalan preferiblemente de manera que
el sistema define el primer sitio de escisión, rompiendo en enlace
entre el átomo de nitrógeno y el átomo de carbono adyacente como se
ha descrito anteriormente revelando un grupo amina que funciona como
un sensor de espectrometría de masas.
Tanto el primero como el segundo, pero
preferiblemente el primer, sitio de escisión se puede definir
mediante grupos de engarce que se pueden escindir con la acción de
los metales de transición, preferiblemente paladio (0). Los ejemplos
de dichos grupos de engarce incluyen grupos aliloxicarbonilamino
que, cuando se escinden, liberan un grupo amina capaz de actuar
como un sensor de espectrometría de masas.
Los ejemplos de engarces que se pueden escindir
selectivamente en condiciones ácidas incluyen grupos
benciloxicarbonilo sustituidos apropiadamente y grupos
difenilmetilamino sustituidos, que se pueden escindir ambos mediante
la acción de ácido trifluoroacético.
Los ejemplos particulares de los grupos de
engarce que se pueden escindir son los expuestos en The
Combinatorial Index, A. Bunin, Academic Press, San Diego 1998,
la descripción de la cual se incorpora en esta memoria descriptiva
como referencia. Los engarces de tipo "Rink" o "Knorr"
comprenden típicamente un resto
1-amino-1,1-difenilmetano
N-protegido, cuando el grupo amino está desprotegido
permitiendo la unión a un sustrato, uno de los anillos fenilo
estando sustituido por ejemplo con grupos dimetoxi y el otro
teniendo un sustituyente carboxialquiloxi proporcionando un segundo
punto de unión. La escisión con TFA da lugar a un compuesto de
sustrato que tiene un grupo carboxamido terminal. Los engarces de
tipo "Wang" contienen típicamente un grupo fenoxiacetilo
sustituido, proporcionando el grupo acetilo un punto de unión, y un
grupo bencílico hidroxilo en el anillo fenilo que forma un segundo
punto de unión. Los ésteres se pueden formar entre un grupo
carboxilo de un sustrato y el grupo bencílico hidroxilo, los grupos
éster se pueden posteriormente con TFA para liberar un compuesto de
sustrato que tiene un grupo carboxilato terminal.
Los ejemplos de engarces que se pueden escindir
selectivamente en condiciones básicas incluyen grupos que contienen
enlaces éster.
En una realización, se proporciona una
construcción química como se ha definido anteriormente en esta
memoria descriptiva en la que el primer sitio de escisión se puede
escindir selectivamente para formar o introducir un grupo sensible G
(en particular un grupo amino) y la escisión se efectúa mediante un
tipo de química seleccionada entre un grupo de químicas que
consisten en escisión en condiciones ácidas, escisión catalizada
por bases, escisión catalizada por paladio (0), escisión oxidante,
oxidación seguida de desplazamiento nucleofílico, escisión
reductora, desplazamiento nucleofílico, escisión por 1,2
bis nucleófilos, desplazamiento electrofílico y escisión
térmica, fotoquímica y enzimática, y el segundo sitio de escisión
se puede escindir selectivamente mediante un tipo de química
seleccionada entre dicho grupo.
Aunque los grupos que se pueden escindir en
condiciones ácidas se pueden usar para formar el primer sitio de
escisión, actualmente se prefiere que el primer sitio de escisión
sea estable a condiciones ácidas. Sin embargo, el segundo sitio de
escisión puede ser escindible ventajosamente en condiciones
ácidas.
En una realización preferida, el primer sitio de
de escisión se puede escindir para formar o introducir el grupo
sensible G, efectuándose la escisión mediante un tipo de química
seleccionada entre:
- (i)
- escisión fotoquímica, por ejemplo, escisión fotoquímica de un grupo carbamato tal como un grupo nitrobencilcarbamato;
- (ii)
- oxidación seguida de escisión mediante desplazamiento nucleofílico, por ejemplo, oxidación de una tiopirimidina seguida de desplazamiento nucleofílico por una amina (por ejemplo amina secundaria tal como N-metilpiperazina);
- (iii)
- escisión de una sulfonamida por un desplazamiento nucleofílico, por ejemplo, mediante un nucleófilo de tiolato (por ejemplo, mercaptoetanol en presencia de una base fuerte tal como DBU);
- (iv)
- escisión de grupos enamina (particularmente los que contienen un resto de enamina conjugado a un grupo carbonilo; por ejemplo como 1-[4,4-dimetil-2,6-dioxocicloexilideno]etilamina) con un 1,2 bis nucleófilo tal como hidrazina o hidroxilamina o derivados de los mismos; y
- (v)
- escisión catalizada por un metal de transición de grupos aliloxicarbonilamino, por ejemplo la escisión catalizada por paladio (0) de grupos aliloxicarbonilamino.
En la realización preferida anteriormente
mencionada, el segundo sitio de escisión se puede, por ejemplo,
escindir en condiciones ácidas o mediante fotólisis.
En una realización preferida, el primer sitio de
escisión se define mediante un engarce de sulfonamida, y el segundo
sitio de escisión se define opcionalmente mediante un grupo, tal
como un engarce Rink, que se puede escindir en condiciones
ácidas.
En otra realización preferida, el primer sitio de
escisión se define mediante un engarce de tiopirimidina susceptible
a escisión mediante oxidación seguido de desplazamiento
nucleofílico, y el segundo sitio de escisión se define
opcionalmente mediante un grupo, tal como un engarce Rink, que se
puede escindir en condiciones ácidas.
En una realización preferida, el primer sitio de
escisión se define mediante un grupo dde como se ha descrito
anteriormente en esta memoria descriptiva, y el segundo sitio de
escisión se define opcionalmente mediante un grupo, tal como un
engarce Rink, que se puede escindir en condiciones ácidas.
Todavía en una realización preferida adicional,
el primer sitio de escisión se define mediante un grupo carbamato
que se puede escindir fotoquímicamente como se ha descrito
anteriormente en esta memoria descriptiva, y el segundo sitio de
escisión se define opcionalmente por un grupo, tal como un engarce
Rink, que se puede escindir en condiciones ácidas.
Todavía en una realización preferida adicional,
el primer sitio de escisión se define mediante un grupo tal como
aliloxicarbonilamino que se puede escindir mediante un metal de
transición tal como paladio (0), y el segundo sitio de escisión se
define opcionalmente mediante un grupo, tal como engarce Rink, que
se puede escindir en condiciones ácidas.
Mediante la realización del primer y segundo
sitios de escisión, por ejemplo como se define por el primer y
segundo grupos de engarce L^{1}, L^{2}, que se pueden escindir
ortogonalmente, es posible separar selectivamente de la construcción
bien el fragmento químico Fr o el sustrato R, simplemente usando
diferentes condiciones de escisión. Esto significa que durante los
experimentos diseñados para optimizar las condiciones de una etapa
de reacción particular, el químico puede someter la construcción a
condiciones adecuadas para eliminar la escisión del fragmento
analítico Fr, por lo tanto, permitiendo que el análisis se lleve a
cabo para determinar el resultado de cada reacción de ensayo. De
manera similar, durante una reacción preparativa (por ejemplo, la
preparación de una biblioteca combinatoria de reacciones
preparativas posteriores tales como las reacción a escala o la
producción comercial), se puede llevar a cabo control de calidad
(abreviadamente en inglés QC) eliminando uno o más soportes sólidos
del recipiente de reacción, escindiendo las construcciones en el
primer sitio de escisión y analizando el fragmento resultante Fr
para ver si ha funcionado una etapa de reacción particular. Por
otra parte, mediante la escisión en el segundo sitio de escisión,
por ejemplo, en el segundo grupo de engarce, en lugar del primero,
el producto de reacción R se libera del soporte sólido. De este
modo una ventaja de las construcciones de la presente invención es
que se pueden usar tanto a nivel experimental para optimizar una
etapa particular del procedimiento como a nivel preparativo sin
modificar los grupos de engarce.
En una realización de la invención, el fragmento
Fr, y más preferiblemente el grupo espaciador A contiene un grupo
alquilendiamina o grupo aminoalcoxi. El tamaño preciso del grupo
alquileno y su grado de sustitución no se considera actualmente que
sea importante, pero a modo de ejemplo la cadena podría ser de entre
2 y 30 átomos de carbono de longitud, por ejemplo hasta 20 átomos
de carbono, más típicamente inferior a 10 átomos de carbono, siendo
los ejemplos particulares etilen- o propilendiamina que pueden ser
sustituidos o no sustituidos. El grupo alquilendiamina o
aminoalcohol típicamente contiene un marcador isotópico de división
de picos como se ha definido en esta memoria descriptiva
anteriormente. Los dos grupos amino se pueden cada uno unir al
primer y segundo grupos de engarce respectivamente. Con el fin de
incrementar la masa del grupo espaciador A, el grupo
alquilendiamina se puede sustituir con un grupo arilo, o por
ejemplo, un grupo N-arilo tal como un grupo
N-bencilo. El grupo N-arilo se puede
sustituir opcionalmente con uno o más grupos sustituyentes.
Cuando, según se prefiera, el grupo espaciador
contiene uno o más marcadores isotópicos de división de picos de
espectros de masas, estos se pueden localizar bien en la cadena de
alquileno o en un grupo sustituyente unido a la cadena de alquileno.
Así, por ejemplo, un grupo N-bencilo unido a uno de
los dos grupos amino en un alquilendiamina puede tener un grupo
metileno que se sustituye con el átomo de deuterio de la división
de picos. Alternativamente, un anillo arilo (por ejemplo un grupo
N-bencilo) presente en un sustituyente en el
alquilendiamina se puede sustituir con un átomo de bromo de de
división de picos, siendo un ejemplo particular de un grupo arilo un
grupo N-o-bromobencilo.
Aunque los grupos alquilendiamina y aminoalcohol
se proporcionan como ejemplos específicos de grupos espaciadores,
se pueden usar los grupos espaciadores alternativos. Por ejemplo,
los grupos espaciadores se pueden formar a partir de cadenas de
hidrocarburos que contienen hasta treinta o más átomos de carbono en
la cadena que se puede interrumpir opcionalmente con uno o más
heteroátomos tales como oxígeno, nitrógeno o azufre. Como una
alternativa adicional, el espaciador puede ser por ejemplo una
cadena peptídica que contiene uno o más aminoácidos. La naturaleza
y longitud precisas del espaciador no se considera actualmente que
sea importante con tal que el espaciador no interfiera con la
química de la construcción.
El fragmento químico Fr, y en particular el grupo
espaciador A, además de proporcionar un medio de identificación que
usa espectrometría de masas, se puede también proporcionar con uno
o más sensores adicionales para permitir la caracterización
mediante otras técnicas analíticas. Por ejemplo, el grupo espaciador
puede contener un cromóforo que permita la caracterización mediante
espectroscopia ultravioleta (abreviadamente U. V.) o de
fluorescencia.
Más particularmente, con el fin de permitir el
análisis cuantitativo que se lleva a cabo para determinar bien la
cantidad relativa (por ejemplo, relativo a otro sustrato R) o
cantidad absoluta de sustrato presente en una mezcla de reacción, el
grupo de conexión Y y el fragmento Fr pueden contener un cromóforo
C^{u} que facilita el análisis de fragmento Fr por
espectrofotometría ultravioleta, visible o de fluorescencia y
preferiblemente mediante espectrofotometría ultravioleta.
De acuerdo con lo anterior, en otro aspecto, la
invención proporciona un procedimiento de análisis del fragmento Fr
de la presente invención, que comprende someter el fragmento Fr a
análisis de espectrofotometría ultravioleta, visible o de
fluorescencia para cuantificar el sustrato R.
De acuerdo con el aspecto de los procedimientos
de la invención anteriormente mencionados, el análisis
espectrofotométrico se puede usar para determinar bien la cantidad
absoluta de sustrato R presente en una muestra dada, o se puede usar
para determinar la cantidad relativa (por ejemplo, en términos de
una relación molar) de sustrato R presente relativa a otro
componente (por ejemplo, cuando más de un sustrato está presente)
en la muestra. Las referencias a los procedimientos de
cuantificación del sustrato R en esta solicitud incluyen tanto la
determinación absoluta como la determinación relativa, salvo que el
contexto indique otra cosa.
Con el fin de asegurar que cualquiera de los
cromóforos presentes en el sustrato R no interfiere con el
análisis, el cromóforo se selecciona típicamente de manera que
tiene una banda de absorción sustancial que lo distingue del
sustrato. Así, por ejemplo, la banda de absorción puede está
apartada de cualquier otra banda de absorción significativa en el
sustrato. Alternativamente, la banda de absorción en el cromóforo
puede ser de tal intensidad que oculte eficazmente cualquier banda
de superposición en el sustrato. Se prefiere que el cromóforo
C^{u} tenga un valor de log E_{max} principal de al menos 2,5.
Se prefiere además que el valor de log E_{max} principal sea al
menos 1,5 veces mayor que el valor de log E_{max} principal del
sustrato R.
La relación entre la absorción de la radiación
visible o ultravioleta por un compuesto en solución y la
concentración del compuesto se define mediante la ley de
Beer-Lambert que se puede expresar por la fórmula
E = A/cl en la que A es la absorbancia o densidad
óptica de una solución de la muestra, c es la concentración
molar, l es la longitud de recorrido de la muestra, y
E es la absortividad molar. La absortividad molar es
constante para un compuesto dado en una longitud de onda dada y
habitualmente se expresa como E_{max} - la absortividad molar en
un máximo de banda de absorción. Los valores para E o E_{max} se
expresan típicamente en unidades 10^{-2} m^{2} mol^{-1} y,
salvo que se indique otra cosa, las referencias a los valores de E o
E_{max} en esta memoria descriptiva se referirán a dichas
unidades. Ya que los valores de E o E_{max} pueden ser muy
grandes, se usa a menudo el equivalente logarítmico y dichos
equivalentes logarítmicos se denominan en esta memoria descriptiva
como valores de log E_{max}.
Un compuesto dado tendrá a menudo picos o bandas
de absorción significativas a varias longitudes de onda diferentes
y por lo tanto a menudo se pueden definir con referencia a varios
valores de E_{max}. En el contexto de la presente invención, el
término "E_{max} principal" se usa para designar la E_{max}
en la longitud de onda a la que se produce la mayor absorbancia. De
esta manera, en las construcciones de la presente invención, el
cromóforo C^{u} tiene preferiblemente un valor de log E_{max} de
principal de al menos 2,5 y típicamente tiene un valor de log
E_{max} principal que es al menos 1,5 veces mayor que el
E_{max} principal del sustrato R. Sin embargo, más típicamente el
cromóforo C^{u} tiene un log E_{max} principal que es al menos
2, más usualmente 2,5, y más preferiblemente 3 veces mayor que el
log E_{max} principal del sustrato R.
Aunque los análisis de los compuestos se pueden
efectuar midiendo la absorbancia en un máximo principal, se puede
usar la medición de bandas secundarias o máximos más pequeños en
lugar de determinar la cantidad del compuesto presente. En general,
la longitud de onda a la que se hace la medición dependerá de las
características de absorción precisas de los sustratos R y el
cromóforo C^{u}, y se puede determinar basándose en un estudio
caso por caso.
El cromóforo C^{u} se puede distinguir de
cualquier cromóforo en el sustrato R porque puede poseer una banda
de absorción que está apartada de cualquier banda de absorción
significativa. Esto significa que la banda de absorción del
cromóforo está apartada y no se superpone en ningún grado
significativo (por ejemplo, menos de 5% de superposición con
relación al área bajo la curva (abreviadamente en inglés a. u. c.)
de los picos de absorción respectivos) con cualquier absorción
significativa debida al estrato R. Una absorción significativa en
el presente contexto significa una absorción que tiene un valor de
log E de 1 o más.
En una realización preferida de la invención, se
proporciona una construcción química para uso en síntesis en fase
sólida que comprende un soporte sólido Q que tiene unido a él
mediante un grupo de conexión Y un sustrato R en el que Q, Y y R son
como se ha definido en esta memoria descriptiva anteriormente; y el
grupo de conexión Y se puede escindir ortogonal y selectivamente
como se ha definido en esta memoria descriptiva anteriormente; en
el que el fragmento Fr comprende el sustrato y al menos una porción
del grupo de conexión Y, y dicha porción contiene un cromóforo
C^{u} que facilita el análisis del fragmento Fr^{u} mediante
espectroscopia ultravioleta, visible o de fluorescencia, teniendo
el cromóforo C^{u} un valor de log E_{max} principal de al menos
2,5 y en la que (i) el valor de log E_{max} principal es al menos
1,5 veces mayor que el log E_{max} principal del sustrato R, o
(ii), el cromóforo C^{u} tiene un pico de absorción a una longitud
de onda apartada de las absorciones debidas al sustrato R.
La presencia de un cromóforo UV en las
construcciones posibilita la cuantificación de los productos de una
síntesis a llevarse a cabo. Dicha cuantificación puede ser (i)
cuantificación absoluta o (ii) cuantificación relativa, o ambas.
Cuantificación absoluta quiere decir que se pueden determinar las
cantidades absolutas de una molécula o fragmento o construcción del
sustrato que contiene la molécula del sustrato, mientras que el
término "cuantificación relativa" se usa en esta memoria
descriptiva para significar la determinación de una cantidad de un
sustrato (o fragmento o construcción que contiene el sustrato)
relativa a otro componente (tal como un producto secundario o
material de partida u otro sustrato) en una mezcla de reacción.
El cromóforo UV se selecciona típicamente de
manera que tiene una absorción muy fuerte en una longitud de onda
única o característica, que habitualmente es distinta de las
longitudes de onda a la que se pudieran encontrar las absorbancias
máximas de una molécula de sustrato típica. Sin embargo, en casos
donde la absorción del cromóforo es muy grande con relación al
sustrato o sustrato R, la superposición de absorciones debida al
sustrato y al cromóforo pueden tener un impacto mínimo en la
exactitud de la medición de la cantidad de sustrato. En general,
las bandas de absorción superpuestas no deberían evitar los
análisis significativos a llevarse a cabo con tal que cualquier
error introducido no sea mayor que 10% y preferiblemente no mayor
que aproximadamente 5%. De acuerdo con lo anterior, como
alternativa para definir el cromóforo en términos de valores de
absorbancias relativas y absorbancias molares absolutas, el
cromóforo C, y su relación con la absorción debida al sustrato se
puede definir en términos del grado de error que surge de cualquier
solapamiento entre las bandas de absorción del sustrato R y el
cromóforo.
De este modo, en una realización adicional, la
invención proporciona una construcción química para uso en síntesis
en fase sólida que comprende un soporte sólido Q que tiene unido a
él mediante un grupo de conexión Y un sustrato R en el que Q, Y y
R son como se ha definido anteriormente en esta memoria descriptiva;
y el grupo de conexión Y se puede escindir ortogonal y
selectivamente como se ha definido en esta memoria descriptiva
anteriormente; en el que el fragmento Fr comprende el sustrato y al
menos una parte del grupo de conexión Y, y dicha porción contiene un
cromóforo C^{u} que facilita el análisis del fragmento Fr
mediante espectroscopia ultravioleta, visible o de fluorescencia,
en la que las características de absorción del cromóforo C^{u} y
el sustrato R son tales que en una longitud de onda de medición
dada, cualquier error en la medición cualquier error en la medición
de la cantidad de sustrato R (o cualquier fragmento o construcción
que contiene el fragmento) que surge de cualquier superposición
entre las bandas de absorción debida al cromóforo y bandas de
absorción debidas al sustrato R son inferiores al 10%,
preferiblemente inferiores al 5%.
Los ejemplos de cromóforos son grupos que
contienen un grupo arilo, preferiblemente un grupo arilo policíclico
condensado, por ejemplo un grupo arilo policíclico
(C_{6}-C_{30}) en el que uno o más (por ejemplo,
1, 2 ó 3) átomos de carbono del anillo se reemplazan opcionalmente
con un heteroátomo tal como nitrógeno, azufre u oxígeno. Los
ejemplos de grupos arilo policíclicos son hidrocarburos
policíclicos tales como grupos naftilo, fenantrilo y antracenilo, y
grupos heteroarilo policíclicos tales como acridina, o
fenantrolina. Dichos grupos arilo o grupos policíclicos se pueden
sustituir opcionalmente, preferiblemente con un sustituyente o
sustituyentes que es o son inerte (s) y/o que no interfiere (n) con
respecto a las condiciones de reacción empleadas en un esquema de
reacción dado.
Los ejemplos de tales grupos sustituyentes
incluyen alquilo y alcoxi (por ejemplo, alquilo y alcoxi que tiene
entre 1 y 20 átomos de carbono, preferiblemente entre 1 y 6
carbonos), cada uno de ellos conteniendo opcionalmente uno o más
enlaces no saturados y estando opcionalmente interrumpido por uno o
más heteroátomos seleccionados entre oxígeno, nitrógeno y azufre;
amino (preferiblemente amino protegido o amino mono- o
disustituido, por ejemplo dimetilamino); halógeno tal como fluoro,
cloro, bromo y yodo; alquiltio (por ejemplo alquiltio
(C_{1}-C_{20}), preferiblemente
(C_{1}-C_{6}), hidroxi, hidroxi protegido (por
ejemplo, acilado), tio, tio protegido (por ejemplo, acilado),
trifluorometilo, nitro, alquilsulfonilo, arilo (por ejemplo, fenilo,
tienilo, furanilo sustituido) y arilalquilo (por ejemplo, bencilo y
fenetilo).
Otros ejemplos de cromóforos incluyen sistemas
arilo o no arilo altamente conjugados, con la condición de que
dichos compuestos sean inertes en las condiciones de síntesis
empleadas en la química de fase sólida, y sistemas también llamados
"empuje-tirón" del tipo
G-J-M en los que G es un grupo dador
de electrones (por ejemplo, amino o alcoxi), J es un conjunto
conjugado de enlaces múltiples, por ejemplo dobles, enlaces, y M es
un grupo receptor de electrones (por ejemplo nitro o sulfonilo),
los grupos G y M estando electrónicamente unidos mediante el
conjunto conjugado de enlaces múltiples. Un ejemplo de dichos
cromóforos es el grupo dansilo
(1-dimetilamino-5-naftilsulfonilo).
La naturaleza exacta del cromóforo, sus
propiedades químicas y sus características de absorbancia, se
pueden determinar basándose en un estudio caso por caso que depende
del tipo de química a usar en una síntesis dada. Sin embargo, se
prefiere más que el cromóforo sea inerte a los reactivos y
condiciones de reacción empleadas en la síntesis.
Los cromóforos actualmente preferidos incluyen
grupos antracenilo y dansilo
(5-dimetilamino-1-naftilsulfonilo),
siendo el antracenilo particularmente preferido.
La cuantificación del sustrato R puede ser bien
cuantificación absoluta o cuantificación relativa en las que se
determinan las cantidades relativas del sustrato R y otro
componente en la mezcla de síntesis (por ejemplo, otro sustrato, o
material de partida, o un producto secundario por ejemplo). La
cuantificación relativa hace uso del hecho de que el cromóforo
C^{u} confiere a cada sustrato un conjunto común de absorbancias
características que se pueden usar como la base para análisis
espectrofotométrico.
En una realización de la invención, la
caracterización y/o análisis de las construcciones de la invención
se lleva a cabo en una sola perla, o un número pequeño de perlas,
por ejemplo entre 1 y 20 perlas, más habitualmente menos de diez
perlas. Dichas perlas tienen típicamente un diámetro medio en el
intervalo entre 90 \mum y 250 \mum y una carga de compuesto
entre 0,1 mmoles/g y 0,4 mmoles/g, la carga media de una sola
perla es inferior a 10 nanomoles, a menudo menos de 5 nanomoles, por
ejemplo, aproximadamente 1 nanomol.
Una ventaja significativa del uso de las
construcciones que contienen cromóforos de UV de la presente
invención es que se pueden usar para proporcionar información
cuantitativa en cantidades muy pequeñas de compuestos de sustrato,
por ejemplo, cantidades del orden de 1 nanomolar típicamente
disponibles de las perlas de resina individuales del tamaño usado
en los procedimientos combinatorios de división y mezcla. En
bibliotecas combinatorias formadas por el procedimiento de división
y mezcla, cada perla típicamente contendrá solamente un solo
compuesto del sustrato, pero una biblioteca contendrá una
pluralidad de perlas que soportan diferentes sustratos. El análisis
de la mezclas de perlas que soportan diferentes sustratos es
problemática y por lo tanto generalmente es necesario llevar a cabo
el análisis sobre las perlas solas. Las construcciones de la
presente invención permiten que el análisis se lleve a cabo
eficazmente y con precisión a nivel de una sola perla, y en
particular con perlas de un tamaño del orden entre 90 \mum y 250
\mum de diámetro con cargas del orden de 0,1-0,4
mmoles/g.
En las construcciones en las que el primer y
segundo sitio de escisión se definen mediante el primer y segundo
grupos de engarce L^{1} y L^{2}, y un "grupo espaciador" A
se interpone entre los dos grupos de engarce L^{1} y L^{2}, el
grupo espaciador A puede contener o tener unido a él el cromóforo
de UV C^{u}. De este modo, en una realización de la invención, se
proporciona una construcción química, como se ha definido en esta
memoria descriptiva anteriormente, en la que el grupo de conexión Y
tiene la fórmula L^{1}-A-L^{2};
en la que L^{1} es un primer grupo de engarce que define el primer
sitio de escisión; A es un grupo químico (el grupo espaciador) que
contiene o tiene unido a él el cromóforo de UV C^{u}, y
opcionalmente conteniendo un marcador isotópico de división de
picos; y L^{2} es un segundo grupo de engarce que define el
segundo sitio de escisión.
El cromóforo C^{u} se puede formar como una
parte integral de la estructura principal del esqueleto del
fragmento Fr^{u} (por ejemplo, como parte del grupo espaciador
A), o puede ser un grupo colgante. De este modo, por ejemplo, cuando
es un grupo colgante, se puede unir a A bien directamente o
mediante una cadena alquileno (por ejemplo de 1 a 6 átomos de
carbono) opcionalmente interrumpido por uno o más átomos de oxígeno,
nitrógeno o azufre, o por medio de un enlace éter, tioéter, amida,
sulfonamida o éster. Cuando el grupo espaciador A contiene un grupo
alquilendiamina o grupo aminoalcoxi, el cromóforo C^{u} puede,
por ejemplo, unirse (directamente o mediante una cadena alquileno
opcionalmente interrumpida como se ha definido en esta memoria
descriptiva anteriormente) al átomo de nitrógeno del, o uno de los
grupos amino. Por ejemplo, el cromóforo C^{u} se puede unir al
átomo de nitrógeno por medio de una cadena de etileno o de propileno
o mediante un grupo sulfonilo.
En los compuestos en los que un sustituyente tal
como un grupo bencilo se une a uno de los grupos amino de un grupo
espaciador alquilendiamina A, el cromóforo C^{u} se puede unir,
directa o indirectamente al otro de los grupos amino. En una
realización actualmente preferida, el cromóforo C^{u} es un grupo
arilo policíclico tal como un grupo antracenilo o fenantrenilo
unido mediante una cadena de propileno a un átomo de nitrógeno en
un extremo del grupo espaciador diamina.
El soporte sólido Q puede ser cualquier tipo de
soporte sólido adecuado para uso en la síntesis en fase sólida, y
en la química combinatoria particular. De este modo, solamente a
modo de ejemplo, el soporte sólido puede tomar la forma de perlas,
una superficie sólida, sustratos sólidos, partículas, gránulos,
discos, capilares, fibras huecas, agujas, fibras sólidas o geles
orgánicos o inorgánicos tales como geles de sílice, y partículas
orgánicas insolubles tales como partículas formadas a partir de
fulerenos.
Los ejemplos de perlas son perlas poliméricas
tales como perlas de celulosa o perlas de resinas, los ejemplos
particulares de materiales a partir de los que se pueden preparar
las perlas de las resinas incluyendo resinas poliméricas
funcionalizadas tales como resinas de poliestireno, resinas de
poliacrilamida y resinas de dimetilacrilamida. Los ejemplos de
soportes adecuados se enumeran en The Combinatorial Index de
Barry A. Bunin, mencionado anteriormente. Los ejemplos de resinas
funcionalizadas incluyen resinas de poliestireno modificadas para
proporcionar grupos amino o grupos hidroxilo en las superficies de
los mismos: véase, por ejemplo, Combinatorial Chemistry de
Nicholas K. Terrett, Oxford University Press, 1998.
Con el fin de permitir simplificar la
determinación de la historia de síntesis de un soporte sólido, y
proporcionar un medio de controlar la mezcla de soportes sólidos en
las síntesis combinatorias de división y conjunto, los soportes
sólidos (por ejemplo, los grupos de perlas) se pueden confinar en
recipientes marcados permeables durante toda la secuencia de
reacción, en la que la síntesis tiene lugar como resultado de los
reactivos y disolventes que fluyen a través de las permeaciones en
el recipiente. Una mezcla de reacción dada puede contener una
pluralidad de recipientes y, al final de cada etapa de reacción,
los recipientes se pueden retirar e identificar mediante el marcador
que puede ser, por ejemplo, un marcador de radiofrecuencia. Los
ejemplos de dichos recipientes son los recipientes de la malla de
polipropileno "Kan" ^{TM} disponibles de Irori de La Jolla,
California, Estados Unidos que contienen marcas de radiofrecuencia
miniaturizadas.
En otro aspecto, la invención proporciona un
procedimiento de análisis de las construcciones definidas
anteriormente en esta memoria descriptiva; el procedimiento
comprendiendo la escisión de la construcción de la escisión en el
primer sitio de escisión para liberar el fragmento químico Fr, la
reacción de escisión generando en el fragmento químico Fr un grupo
sensible a la espectrometría de masas (por ejemplo, un grupo que se
puede ionizar en condiciones de espectroscopia de masas), y después
sometiendo el fragmento químico a espectrometría de masas, por
ejemplo, espectrometría de masas por electropulverización.
El análisis del fragmento Fr proporciona
información sobre la historia de reacción de la construcción. De
este modo, mediante análisis de espectrometría de masas, se puede
determinar fácilmente si se ha formado o no el sustrato deseado en
una secuencia de reacción dada. Por lo tanto, el análisis del
fragmento Fr se puede usar no solamente para caracterizar el
sustrato o producto de la secuencia de reacción en fase sólida,
sino también para seguir el progreso de las reacciones.
La invención también proporciona un procedimiento
de análisis de las construcciones definidas anteriormente en esta
memoria descriptiva; el procedimiento comprende la escisión de la
construcción en el primer sitio de escisión para liberar el
fragmento F^{u} químico y someter el fragmento a análisis de
espectrometría UV, visible o de fluorescencia, por ejemplo análisis
cuantitativo de UV.
Los productos de escisión se pueden someter a
cromatografía, preferiblemente una técnica de cromatografía líquida
tal como HPLC, usando un detector UV que se puede establecer para
proporcionar un medio de determinar concentraciones de los varios
compuestos a medida que eluyen de la columna de cromatografía. La
columna de cromatografía puede, a su vez, unirse a otro medio
instrumental de análisis para el propósito de identificación del
sustrato. Un medio preferido de análisis instrumental es el
análisis espectroscópico de masas, y de este modo, el procedimiento
y las construcciones de la invención proporcionan un medio de
llevar a cabo tanto la identificación como la cuantificación del
sustrato en una sola serie unida de procedimientos de análisis.
En un aspecto adicional, la invención proporciona
una construcción química intermedia para uso en la preparación de
una construcción química como se ha definido anteriormente en esta
memoria descriptiva, teniendo la construcción intermedia la fórmula
Q-Y' en la que Y' es una forma reactiva o protegida
del grupo Y, y Q e Y son como se ha definido anteriormente en esta
memoria descriptiva.
Todavía en otro aspecto adicional, la invención
proporciona una construcción intermedia de fórmula
Q-L^{1}-A^{p} en la que Q y
L^{1}son como se ha definido anteriormente en esta memoria
descriptiva y A^{p} es una forma reactiva o protegida del grupo
espaciador A que contiene un marcador isotópico de división y
opcionalmente un cromóforo C^{u}. En una realización particular,
la construcción intermedia tiene la fórmula general
Q-L^{1}-N(Alc-C^{u})-Alc-NH-X^{1}
en la que Alc es un grupo alquileno y X^{1} es hidrógeno o un
grupo arilo. La construcción intermedia se marca isotópicamente
preferiblemente con una combinación de átomos de división de picos
tales como ^{1}H/H^{2} (D), ^{79}Br/^{81}Br,
^{12}C/^{13}C, ^{14}N/^{15}N y ^{16}O/^{18}O.
La invención proporciona además un procedimiento
de identificación de un sustrato farmacéuticamente útil que
comprende la preparación de una biblioteca que contiene una
pluralidad de construcciones químicas como se ha definido
anteriormente en esta memoria descriptiva y sometiendo la
biblioteca a ensayos biológicos para identificar sustratos
biológicamente activos. El procedimiento puede incluir la etapa
adicional de formular un sustrato biológicamente activo así
identificado con un vehículo farmacéuticamente aceptable para
formar una composición farmacéutica.
La figura 1 muestra el espectro de masas del
producto de fotólisis de la construcción descrita en el ejemplo
1;
La figura 2 muestra el espectro de masas de un
fragmento producido mediante la escisión del grupo de engarce de
tiopirimidina en la construcción descrita en el ejemplo 2;
Las figuras 3 a 8 muestran los espectros de masas
de los productos de fotólisis de las construcciones descritas en el
ejemplo 4;
Las figuras 9 y 10 muestran los espectros de
masas de los fragmentos analíticos producidos mediante la escisión
por paladio (0) de las construcciones que contienen el engarce de
"Alloc" del ejemplo 7; y
Las figuras 11 a 18 muestran los espectros de
masas comparativos bien de un sustrato o de un fragmento analítico
que contiene el sustrato, siguiendo la escisión en, bien el primer
o segundo sitio de escisión para cuatro de los miembros de la
biblioteca combinatoria descrita en el ejemplo 6.
Ahora la invención se ilustrará pero no se
limitará como referencia a los siguientes ejemplos.
En los ejemplos, se usan las siguientes
abreviaturas.
\newpage
| Abreviaturas | |
| AcOH | Ácido acético |
| DMF | Dimetilformamida |
| DCM | Diclorometano |
| DMAP | 4-dimetilaminopiridina |
| DIC | Diisopropilcarbodiimida |
| TFA | Ádido trifluoroacético |
| DIPEA | Diisopropiletilamina |
| HATU | Hexafluorofosfato de 2-(1H-9-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio |
| DMSO | Dimetilsulfóxido |
| PyBOP® | Hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidinofosfonio |
| HOBT | N-hidroxibenzotriazol |
| AA | Aminoácido |
Una construcción que se puede escindir
fotolíticamente se preparó siguiendo el esquema de reacción
mostrado en el esquema 1. En este ejemplo, la escisión fotolítica
de un grupo de engarce nitrobenciloxicarbonilo sustituido unido a un
grupo amino de una cadena de etilendiamina libera el grupo amino
libre de manera que sea capaz de someterse a una ionización en un
espectrómetro de masas, por lo tanto, permitiendo que se forme un
ion molecular característico. En este ejemplo, el grupo de conexión
de etilendiamina tiene un grupo bencilo marcado isotópicamente
unido al otro grupo amino, el efecto del cual es proporcionar un
pico de división característico en el espectro de masas del
producto de escisión para ayudar a la identificación.
El número de compuestos usado en la parte
experimental del ejemplo 1 se refiere al número de compuestos del
esquema 1.
(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
Esquema
1
TentaGel NH2 (Rapp Polymere) (resina 1) (30 g,
12,0 mmol), que tiene un diámetro de perla en el intervalo entre 130
\mum y 160 \mum y una carga de 0,4 mmoles/g, se hinchó con DMF
y a esto se añadió una solución de HOBT (9,3 g, 69,0 mmoles), DIC
(6,48 ml, 41,4 mmoles) y ácido
4-[4-(1-hidroxietil)-2-metoxi-5-nitrofenoxi)butanoico
(11,8 g, 39,4 mmoles) en DMF (420 ml) y se agitó la mezcla durante
16 h. Después la resina se drenó y se lavó con DMF seguido de MeOH
después con DCM y finalmente con MeOH. Después se secó a vacío para
proporcionar la resina 2.
La resina 2 (3 g, 11,9 mmoles) se trató con una
solución de carbonildiimidazol (19,3 g, 119 mmoles) en DCM (400 ml)
y el conjunto se calentó a 50ºC con agitación lenta durante 5 horas.
Después la resina se drenó y se lavó con DCM seguido de Et_{2}O,
DCM, Et_{2}O y se seca a vacío para proporcionar la resina 3.
La resina 3 (15 g, 4,35 mmoles) se hinchó con DMF
(200 ml) y a esto se añadió una solución de
1-bencil-1-tec-butoxicarbonil-1,2-diaminoetano
(17) (2,71 g, 10,9 mmoles) y
1-(dideuterobencil)-1-terc-butoxicarbonil-1,2-diaminoetano
(16) (2,71 g, 10,9 mmoles) en DMF (20 ml) y se calentó el conjunto
a 50ºC con agitación lenta durante 16 horas. Se drenó la resina y se
lavó con DMF seguido Et_{2}O, DCM y Et_{2}O. Después la resina
se secó a vacío. Después la resina se trató con una solución 1:4 de
TFA acuoso (95%) y DCM y se agitó durante 30 minutos. Después la
resina se drenó y se lavó con DCM seguido de Et_{2}O, DCM,
Et_{2}O y se secó la resina a vacío. Después se agitó la resina
con solución al 10% de DIPEA en DMF durante 1 hora y después se
drenó, después el lavado se repitió como se ha indicado
anteriormente para proporcionar la resina 4.
Una solución de HATU (0,96 g, 2,52 mmoles), DIPEA
(0,89 ml, 5,04 mmoles) y se añadió ácido
p-[(R,S)-\alpha-[1-(9H-fluoren-9-il)metoxiformamido]-2,4-dimetoxibencil]fenoxibutanoico
(1,42 g, 2,52 mmoles) en DMF (30 ml) a la resina 4 (3 g, 0,84
mmoles) y el conjunto se agitó durante 16 horas. Después la resina
se drenó y se lavó con DMF y DCM. Una solución de 20% de piperadina
en DMF (30 ml) se añadió a la resina y se agitó el conjunto durante
1 hora. Después se drenó a resina y se lavó con DMF, DCM seguido de
Et_{2}O, DCM y Et_{2}O y la resina se secó a vacío.
La resina 5 (20 mg, 0,004 mmoles) se trató con
una solución de HATU (15 mg, 0,04 mmoles), DIPEA (14 \mul, 0,08
mmoles) y ácido benzoico (5 mg, 0,04 mmoles) en DMF (1 ml) y se
agitó el conjunto durante 6 horas. Después la resina se drenó y se
lavó con DMF, DCM Et_{2}O, DCM y Et_{2}O y se secó a vacío para
proporcionar la resina 6. El análisis de la construcción de esta
resina mediante escisión fotolítica seguido de análisis por EM se
muestra en la figura 1 (véanse las condiciones generales de
escisión).
Como se puede ver en la figura 1, la presencia
del grupo amino sensible y grupo de división de picos en el
fragmento analítico escindido a partir de la resina manifiesta un
fuerte ion molecular con un patrón de doblete característico.
Una pequeña muestra de la resina (aproximadamente
0,5 mg) se suspende en DMSO (50 \mul) y se expone a luz UV durante
30 minutos. Después la solución se analiza mediante espectrometría
de masas. Alternativamente DMSO que contiene hidrato de hidrazina al
0,2% se puede usar como disolvente).
Los espectros de masas se obtuvieron en un
espectrómetro de masas de atrapamiento de iones Finnegan MAT LCQ en
modo de electropulverización positiva. Intervalo de barrido
100-1500 a. m. u. Duración de ciclo de barrido 1,4
segundos; tiempo de ionización 200 microsegundos.
Una construcción que contiene un engarce
"enganche de seguridad" de tiopirimidina en el primer sitio de
escisión se preparó según el esquema de reacción mostrado en el
esquema 2 más adelante. Los números de la construcción usados en
siguiente la descripción experimental se refieren a los números del
esquema 2.
(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
Esquema
2
Una solución de ácido
4-(clorometil)benzoico (0,27 g, 1,6 mmoles), PyBOP® (0,83 g,
1,6 mmoles) y DIPEA (0,56 ml, 3,2 mmoles) en DMF (8 ml) se agitó
durante 20 minutos, después esta solución se añadió a la resina 1
TentaGel NH2 (Rapp Polymere) (1 g, 0,32 mmoles), que tienen un
diámetro de perla en el intervalo entre 130 \mum y 160 \mum y
una carga de 0,32 mmoles/g, y se agitó el conjunto durante 5 horas.
Después la resina se drenó y se lavó con DMF, DCM Et_{2}O, DCM y
finalmente Et_{2}O. Después la resina (8) se secó a vacío.
Una suspensión de tiourea (0,58 g, 7,7 mmoles) en
dioxano (4 ml) y etanol (1 ml) se añadió a la resina 8 (1 g, 0,32
mmoles) y el conjunto se calentó a 80ºC durante 16 horas. Después la
resina se drenó y se lavó con DMF (x 5), DCM (x 5), Et_{2}O, DCM y
finalmente Et_{2}O para proporcionar la resina 9. Después la
resina se secó a vacío.
Una solución de 3-oxobutanoato de
metil-2-dimetilaminometileno (0,17
g, 0,96 mmoles) y trietilamina (65 \mul, 0,48 mmoles) en DMF (10
ml) se añadió a la resina 9 (1 g, 0,31 mmoles) y se calentó el
conjunto a 80ºC durante 16 horas. La resina se drenó y se lavó con
DMF, DCM Et_{2}O, DCM y finalmente Et_{2}O. Después la resina
(10) se secó a vacío.
Después la resina (10) (0,5 g, 0,15 mmoles) se
trató con una mezcla 1:1 de THF y NaOH acuoso 2N (4 ml) y se agitó
durante 2 horas. Después la resina se drenó y se lavó con
THF/H_{2}O, 10% de AcOH/THF, THF/H_{2}O, THF, DMF, DCM,
Et_{2}O, DCM, Et_{2}O y después se secó a vacío para
proporcionar la resina 11.
Una solución de PyBOP® (24 mg, 0,045 mmoles) y
DIPEA (16 \mul, 0,09 mmoles) en DMF (1 ml) se añadió a la resina
11 (50 mg, 0,015 mmoles) seguido de una solución de
1-terc-butoxicarbonil-1-(o-bromobencil)diaminoetano
(18) (15 mg, 0,045 mmoles) en DMF (1 ml) y se agitó el conjunto
durante 3 días. Se drenó la resina y se lavó con DMF, DCM Et_{2}O,
DCM y finalmente Et_{2}O. Después se añadió una solución de TFA
acuoso al 95% en DCM (20%, 1 ml) a la resina y se agitó durante 2
horas. Después la resina se drenó y se lavó con DMF, DCM Et_{2}O,
DCM y después se agitó con DIPEA al 10% en DMF durante 10 minutos.
La resina se drenó y se lavó con DMF, DCM Et_{2}O, DCM y
finalmente Et_{2}O. Después la resina (12) se secó a vacío.
Una solución de ácido
4-[4-(1-(Fmoc-amino)etil)-2-metoxi-5-nitrofenoxi)butanoico
(23 mg, 0,045 mmoles), DIPEA (16 \mul, 0,09 mmoles) y HATU (17 mg,
0,045 mmoles) en DMF (2 ml) se añadió a la resina 12 (50 mg, 0,015
mmoles) y se agitó el conjunto durante 3 horas. La resina se drenó y
se lavó con DMF, DCM Et_{2}O, DCM y finalmente Et_{2}O. Después
la resina se trató con piperidina al 20% en DMF (3 ml) y se agitó
el conjunto durante 1 hora. Después la resina (13) se drenó y se
lavó con DMF, DCM Et_{2}O, DCM y finalmente Et_{2}O y se secó a
vacío.
Una solución de ácido benzoico (11 mg, 0,09
mmoles), DIPEA (16 \mul, 0,09 mmoles) y HATU (17 mg, 0,045 mmoles)
en DMF (2 ml) se añadió a la resina 13 y se agitó el conjunto
durante 2 horas. Después la resina (14) se drenó y se lavó con DMF,
DCM Et_{2}O, DCM y finalmente Et_{2}O. En la figura 2 se
muestra el análisis de la construcción de esta resina mediante
condiciones de escisión de pirimidina (descritas más adelante)
seguido de análisis de EM.
Una pequeña muestra de la resina (aproximadamente
0,5 mg) se trata con ácido m-cloroperbenzoico (0,5
ml) durante 2 horas. Después la resina se drena y se lava con DCM
Et_{2}O y DCM. Después la resina se trata con
N-metilpiperazina 0,02 M en DMF (50 \mul) después
se añade y se agita durante 12 horas. Después la solución se retira
y se analiza mediante espectrometría de masas.
Se han preparado numerosos grupos diferentes de
división de picos espectrométricos de masas, y éstos se ilustran en
la tabla 1 más adelante.
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
En el ejemplo 1, el grupo de división de picos se
introduce mediante la mezcla de compuestos marcados con deuterio y
no marcados 16/17 en la tabla 1 (véase la referencia de la resina 4)
mientras que en el ejemplo 2, el grupo de división de picos se
introdujo mediante el compuesto 18 de bromobencilo (véase la
referencia de la resina
12).
12).
Las resinas que contienen grupos de división de
picos alternativos se prepararon usando los compuestos 19/20 y 21/22
descritos más adelante.
Una solución de
1-terc-butoxicarbonil-1,2-diaminoetano
(20) (110 mg, 0,68 mmoles) y
1-terc-butoxicarbonil-1,2-di(^{15}N)aminoetano
(19) doblemente marcado con ^{15}N (112 mg, 0,68 mmoles) en DMF
se añadió a la resina 3 (0,6 g, 0,18 mmoles) y el conjunto se
calentó a 50ºC durante 3 horas. Después la resina se drenó y se lavó
con DMF, DCM Et_{2}O, DCM y finalmente Et_{2}O. Después la
resina se secó a vacío.
Una solución de
1-terc-butoxicarbonil-1,5-diaminopentano
(21) (295 mg, 1,45 mmoles) y
1-terc-butoxicarbonil-1,2-di(^{15}N)aminopentano
(22) doblemente marcado con ^{15}N (295 mg, 1,45 mmoles) en DMF
se añadió a la resina 3 (1,66 g, 0,58 mmoles) y el conjunto se
calentó a 50ºC durante 4 horas. Después la resina se drenó y se lavó
con DMF, DCM Et_{2}O, DCM y finalmente Et_{2}O. Después se
añadió una solución de TFA acuoso al 95% en DCM (20%, 1 ml) a la
resina y se agitó durante 2 horas. La resina se drenó y se lavó con
DMF, DCM Et_{2}O, DCM y después se agitó con DIPEA al 10% en DMF
durante 10 minutos. Después la resina (23) se secó a vacío.
En los ejemplos 1 y 2, el sustrato o compuesto
diana en cada caso es la benzamida del compuesto modelo. En los
siguientes ejemplos, las construcciones se prepararon conteniendo
dipéptidos, como el sustrato, unido bien a cualquier engarce Rink o
a un engarce Wang como el segundo grupo de engarce. En cada caso, se
usó un primer grupo de engarce que se puede escindir
fotolíticamente. Los esquemas de reacción usados para preparar las
construcciones se muestran en los esquemas 3 y 4 más adelante.
Esquema
3
\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
Esquema
4
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución de ácido
p-[(R,S)-\alpha-[1-(9H-fluoren-9-il)metoxiformamido]-2,4-dimetoxibencil]fenoxibutanoico
(240 mg, 0,42 mmoles), DIC (65 \mul, 0,42 mmoles) y HOBT (57 mg, 0,42 mmoles) en DMF (1 ml) se añadió a la resina 23 (100 mg, 0,042 mmoles) y el conjunto se agitó durante 4 horas. Después la resina se drenó y se lavó con DMF, DCM Et_{2}O, DCM y finalmente Et_{2}O. Después la resina se trató con 20% de piperidina en DMF (2 ml) y se agitó durante 30 minutos. Después se drenó a resina (24) y se lavó con DMF, DCM Et_{2}O, DCM y finalmente Et_{2}O. Después la resina se secó a vacío.
(240 mg, 0,42 mmoles), DIC (65 \mul, 0,42 mmoles) y HOBT (57 mg, 0,42 mmoles) en DMF (1 ml) se añadió a la resina 23 (100 mg, 0,042 mmoles) y el conjunto se agitó durante 4 horas. Después la resina se drenó y se lavó con DMF, DCM Et_{2}O, DCM y finalmente Et_{2}O. Después la resina se trató con 20% de piperidina en DMF (2 ml) y se agitó durante 30 minutos. Después se drenó a resina (24) y se lavó con DMF, DCM Et_{2}O, DCM y finalmente Et_{2}O. Después la resina se secó a vacío.
Una solución de ácido
4-formilfenoxiacético (23 mg, 0,13 mmoles), DIC (20
\mul, 0,13 mmoles) y HOBT (17 mg, 0,13 mmoles) en DMF (1 ml) se
añadió a la resina 23 (100 mg, 0,042 mmoles) y el conjunto se agitó
durante 4 horas. Después la resina se drenó y se lavó con DMF, DCM
Et_{2}O, DCM y finalmente Et_{2}O. Después la resina se secó a
vacío. Después la resina se trató con una solución de borohidruro de
tetrabutilamonio (50 mg, 0,2 mmoles) en DCM y se agitó durante 16
horas. Después se drenó a resina (27) y se lavó con DCM, DMF, DCM
Et_{2}O, DCM y finalmente Et_{2}O. Después la resina se secó a
vacío.
La resina 25 y 28 se prepararon haciendo
reaccionar las resinas 24 y 27 respectivamente con los aminoácidos
protegidos con Fmoc deseados seguido de la desprotección y después
acoplamiento repetido al segundo aminoácido y desprotección (véase
procedimiento general). Después los grupos amino terminal se
acilaron usando anhídrido acético (véase procedimiento más
adelante).
El análisis de la construcción de estas resinas
mediante escisión fotolítica seguido de análisis por EM
proporcionaron los espectros de masas mostrados en las figuras según
la tabla 3.
| Resina analizada | Figura |
| 25a | 3 |
| 25b | 4 |
| 25c | 5 |
| 28a | 6 |
| 28b | 7 |
| 28c | 8 |
Una solución del aminoácido protegido con Fmoc
(0,14 mmoles, 10 Eq), DIC (22 \mul, 0,14 mmoles, 10 Eq) y HOBT
(19 mg, 0,14 mmoles, 10 Eq) en DMF (1 ml) se añadió a las resinas 24
y 27 requeridas (30 mg, aproximadamente 0,014 mmoles). Después el
conjunto se agitó durante 5 horas. Después la resina se drenó y se
lavó con DCM, DMF, DCM Et_{2}O, DCM y finalmente Et_{2}O.
Después los grupos protectores Fmoc se retiraron mediante el
tratamiento de las resinas con solución de piperidina al 20% en DMF
(2 ml) y agitando durante 30 minutos. Después la resina se drenó y
se lavó con DCM, DMF, DCM Et_{2}O, DCM y finalmente Et_{2}O.
Después la resina se secó a vacío.
Una solución de anhídrido acético (15 ml, 0,14
mmoles) en DCM (1 ml) se añadió a las resinas (30 mg,
aproximadamente 0,014 mmoles) seguido de DMAP (1 mg, 0,008 mmoles) y
el conjunto se agitó durante 2 horas. Después la resina se drenó y
se lavó con DCM, DMF, DCM Et_{2}O, DCM y finalmente Et_{2}O.
Después la resina se secó a vacío.
Como se puede ver en los ejemplos anteriores, las
construcciones de la invención permiten que se formen moléculas
pequeñas mediante los procedimientos en fase sólida para analizar
cómodamente y fácilmente mediante espectrometría de masas.
Proporcionando un grupo ionizable como un sensor de espectros de
masas y un isótopo de división de picos, el resultado en cada caso
ha sido una interpretación fácil del espectro de masas en el que el
ion molecular aparece como un doblete característico, y en el que
los picos debidos a fragmentos o materiales extraños son
inapreciables.
Una construcción que contiene ácido benzoico en
forma de un sustrato de modelo unido mediante un engarce de tipo
"Rink" ácido lábil a un grupo de división de picos de espectros
de masas de etilendiamina y a su vez mediante un engarce sulfonamido
a una resina se preparó como se muestra en el esquema 5 más
adelante. En este ejemplo, la escisión de la sulfonamida con
mercaptoetanol en presencia de una base fuerte libera un fragmento
analítico que tiene un grupo amino sensible a espectrometría de
masas
Esquema
5
A una solución agitada de cloruro de
2-nitro-4-metilbenzoatosulfonilo
1 (1,10 g, 3,90 mmoles) y trietilamina (0,39 g, 3,90 mmoles) en
diclorometano seco (40 ml), se añadió a 0ºC la amina 2a (1,00 g, 3,9
mmoles) en diclorometano seco (20 ml) durante 30 minutos. La mezcla
de reacción se agitó durante 2 horas adicionales a temperatura
ambiente, después se concentró a vacío para proporcionar un aceite
amarillo. La purificación mediante cromatografía con [MTBE:hexano
(1:1)] como eluyente seguido de recristalización con MTBE (5 ml) y
hexano (2 ml) proporcionó la sulfonamida 3a (1,53 g, 79%) en
forma de escamas; p. f. 129-130ºC; R_{f} 0,31
[MTBE:hexano (1:1)]; (encontrado C, 53,2; H, 5,6; N, 8,5; S, 6,4.
C_{22}H_{25}D_{2}N_{3}O_{8}S requiere C, 53,3; H, 5,5; N,
8,5; S, 6,5%); \delta_{H} (DMSO-d^{6}) 1,40 (9H,
s, H-18), 3,05 (2H, m, H-9), 3,20
(2H, dt, J3 y 13, H-10), 3,9 (3H, s,
O-Me), 7,10-7,35 (5H, m,
H-13, 14 y 15), 8,09 (1H, d, J8,
H-6), 8,35 (1H, d, J8,
H-5),8,40 (1H, m, H-8), 8,45 (1H, s,
H-3); \delta_{C} (DMSO-d^{6})
27,8 (C-18), 40,9 (C-9 y 10), 45,9
(C-11), 53,0 (O-Me), 79,1
(C-17), 124,8 (C-13), 127,0
(C-14 y 15), 128,3 (C-6), 130,0
(C-13), 132,9 (C-), 134,2 (C-12),
136,4 (C-1), 147,5 (C-4), 154,7
(C-2), 163,5 (C-16 y C = O); EM
(electropulverización + ve) m/z 496 (MH)^{+}; HPLC, R_{t}
6,07 min.
El éster 3a (0,40 g, 0,80 mmol) en metanol (2 ml)
se trató con hidróxido sódico acuoso 1 M (1,60 ml, 1,60 mmoles) y se
agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después la reacción se
concentró a vacío y se disolvió el residuo en agua (10 ml) después
se acidificó con ácido clorhídrico 1 M (1,80 ml, 1,80 mmoles) a 0ºC.
El precipitado blanco resultante se extrajo con diclorometano (3 x
10 ml). Los extractos orgánicos reunidos se lavaron con salmuera, se
secaron (Na_{2}SO_{4}) y se evaporaron a presión reducida al
ácido 4a (0,34 g, 88%) en forma de un sólido blanco; p. f.
143-145ºC; R_{F} 0,58 [MTBE:hexano (1:1)];
\delta_{H} (DMSO-d^{6}) 1,29 (9H, s,
H-18), 3,02 (2H, m, H-9), 3,20 (2H,
dt, J3 y 13, H-10),
7,10-7,40 (5H, m, H-13, 14 y 15),
8,06 (1H, d, J8, H - 6), 8,28 (1H, m, H-3),
8,30 (1H, d, J8, H-3); \delta_{C}
(DMSO-d^{6}) 27,9 (C-18), 40,9
(C-9 y 10), 45,9 (C-11), 79,1
(C-17), 124,5 (C-13), 127,1
(C-14 y 15), 128,4 (C-6), 129,5
(C-13), 132,5 (C-5), 139,2
(C-12), 147,3 (C-1), 155,1
(C-4), 164,8 (C-16 y C = O);
encontrado: MH^{+}, 482,156364
C_{21}H_{23}D_{2}N_{3}O_{8}S requiere MH+, 482,156615;
HPLC, R_{t} 5,65 min.
\newpage
A una solución agitada de cloruro de
2-nitro-4-metilbenzoatosulfonilo
1 (1,10 g, 3,90 mmoles) y trietilamina (0,39 g, 3,90 mmoles) en
diclorometano seco (40 ml), se añadió a 0ºC la amina 2b (0,95 g, 3,9
mmoles) en diclorometano seco (20 ml) durante 30 minutos. La mezcla
de reacción se agitó durante 3 horas adicionales a temperatura
ambiente, después se concentró a vacío para proporcionar un aceite
amarillo. La purificación mediante cromatografía con [MTBE:hexano
(1:1)] como eluyente seguido de recristalización con MTBE (5 ml) y
hexano (2 ml) proporcionó la sulfonamida 3b (1,51 g, 79%) en
forma de escamas; p. f. 131-132ºC; R_{f} 0,28
[MTBE:hexano (1:1)]; (encontrado C, 53,7; H, 5,4; N, 8,4; S, 6,5.
C_{22}H_{27}N_{3}O_{8}S requiere C, 53,5; H, 5,5; N, 8,5;
S, 6,5%); \delta_{H} (DMSO-d^{6}) 1,38 (9H, s,
H-18), 3,10 (2H, t, J8, H-9),
3,24 (2H, t, J8, H-10), 3,95 (3H, s,
O-Me), 4,32 (2H, s, H11), 7,13-7,32
(5H, m, H-13, 14 y 15), 8,09 (1H, d, J8,
H-6), 8,29 (1H, s, H-3),8,32 (1H, d,
J8, H-3); \delta_{C}
(DMSO-d^{6}) 28,3 (C-18), 40,2
(C-9 y 10), 46,2 (C-11), 53,2
(O-Me), 79,3 (C-17), 125,1
(C-13), 127,2 (C-14 y 15), 128,6
(C-6), 130,3 (C-13), 133,1
(C-5), 134,4 (C-12), 136,6
(C-1), 147,6 (C-4), 163,7
(C-16 y C = O); EM (electropulverización - ve) m/z
492 (M-H)^{-}; HPLC, R_{t} 5,99 min.
El éster 3b (0,40 g, 0,80 mmol) en metanol (2 ml)
se trató con hidróxido sódico acuoso 1 M (1,60 ml, 1,60 mmoles) y se
agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después la reacción se
concentró a vacío y se disolvió el residuo en agua (10 ml) después
se acidificó con ácido clorhídrico 1 M (1,80 ml, 1,80 mmoles) a 0ºC.
El precipitado blanco resultante se extrajo con diclorometano (3 x
10 ml). Los extractos orgánicos reunidos se lavaron con salmuera, se
secaron (Na_{2}SO_{4}) y se evaporaron a presión reducida al
ácido 4b (0,36 g, 93%) en forma de un sólido blanco; p. f.
123,7-124,8ºC; R_{F} 0,59 [MTBE:hexano (1:1)];
\delta_{H} (DMSO-d^{6}) 1,42 (9H, s,
H-18), 3,12 (2H, m, H-9), 3,22 (2H,
m, H-10), 4,38 (2H, s, H11),
7,18-7,42 (5H, m, H-13, 14 y 15),
8,11 (1H, d, J8, H-6), 8,39 (1H, d,
J8, H-3), 8,45 (1H, s, H-3);
\delta_{C} (DMSO-d^{6}) 27,8
(C-18), 40,1 (C-9 y 10), 45,9
(C-11), 79,1 (C-17), 124,8
(C-13), 126,9 (C-14 y 15), 128,4
(C-6), 129,9 (C-13), 132,9
(C-5), 135,8 (C-12), 137,9
(C-1), 147,5 (C-4), 153,9
(C-2), 163,7 (C-16 y C = O); EM
(electropulverización - ve) m/z 478 (M - H)^{-}; HPLC,
R_{t} 5,56 min.
A una suspensión de resina de amina
(Argogel-NH_{2}) (0,37 g, 0,15 mmoles) que tiene
un diámetro medio de perla de 150 \mum y una carga de 0,4
mmoles/g, en DMF (4 ml) y diclorometano (2 ml) se añadió el ácido
benzoico (4a) (0,22 g, 0,45 mmoles) y el ácido benzoico (4b) (0,22
g, 0,45 mmoles), seguido de PyBOP (0,47 g, 0,9 mmoles) y HOBT (0,12
g, 0,90 mmoles) seguido, 4 minutos más tarde de base de Hünig (0,21
g, 1,80 mmoles). La reacción se agitó con nitrógeno durante 18 horas
y después la resina se lavó con diclorometano (6 x 10 ml), DMF (6 x
10 ml), diclorometano (6 x 10 ml), éter (2 x 10 ml) y se secó a
vacío para proporcionar la resina de sulfonamida 5 (0,43 g,
97%) en forma de un sólido amarillo; el ensayo de Kaiser fue
negativo; el ensayo con azul de bromofenol fue negativo.
La resina protegida (0,39 g, 0,13 mmoles) se
suspendió en diclorometano (2 ml) y se trató con ácido
trifluoracético (2 x 4 ml) durante 5 minutos. Se retiraron los
disolventes mediante filtración y se lavó la resina con solución de
DIPEA al 10% en DMF (3 x 5 ml), diclorometano (6 x 5 ml), DMF (6 x 5
ml), diclorometano (6 x 5 ml), éter (2 x 5 ml). Después la resina
amina se suspendió en DMF (4 ml) y diclorometano (2 ml), se añadió
el ácido de Rink (0,51 g, 0,90 mmoles), seguido de PyBOP (0,47 g,
0,9 mmoles) y HOBT (0,12 g, 0,90 mmoles). Después de 4 minutos se
añadió base de Hünig (0,21 g, 1,8 mmoles). Se agitó la reacción con
nitrógeno durante 18 horas y después se lavó la resina con
diclorometano (6 x 10 ml), DMF (6 x 10 ml), diclorometano (6 x 10
ml), éter (2 x 10 ml) y se secó a vacío para proporcionar la
resina de sulfonamida 6 (0,43 g, 100%) en forma de un sólido
amarillo; el ensayo de Kaiser fue negativo; el ensayo de azul de
bromofenol fue negativo; la carga de resina de 98% se estimó
mediante escisión cuantitativa del grupo
Fmoc.
La resina 6 (0,20 g, 0,06 mmoles) se trató con
20% de piperidina en solución de DMF (2 x 3 ml) durante 10 minutos.
Se retiraron los disolventes mediante filtración y se lavó la resina
con DMF (6 x 3 ml), diclorometano (6 x 3 ml), éter (2 x 3 ml). La
resina se suspendió en DMF (1 ml) y diclorometano (1 ml) y se
añadió ácido benzoico (12 mg, 0,01 mmoles), seguido de PyBOP (52 mg,
0,1 mmoles) y HOBT (13 mg, 0,1 mmoles). Después de 4 minutos se
añadió base de Hünig (26 mg, 0,2 mmoles). Se agitó la reacción con
nitrógeno durante 3 horas y después se lavó la resina con
diclorometano (6 x 1 ml), DMF (6 x 1 ml), diclorometano (6 x 1 ml),
éter (2 x 1) ml) y se secó a vacío para proporcionar la resina
de sulfonamida 7 (51 mg, 100%) en forma de un sólido amarillo;
el ensayo de Kaiser fue negativo; el ensayo con azul de bromofenol
fue negativo.
Una pequeña cantidad de resina (7)
(aproximadamente 0,5 mg) se trató con solución desprotectora A (0,5
ml) durante 1 hora. Se filtró la resina y después la solución
resultante se analizó mediante espectrometría de masas por
electropulverización; EM (electropulverización - ve) m/z 582/584
(M-H)^{-}; HPLC, Rt 4,49 minutos.
Solución A: Mercatoetanol (0,23 ml, 3,0 mmoles) y
DBU (0,67 ml, 4,5 mmoles) en MeCN (3 ml).
Una construcción que contenía un sustrato de
modelo de ácido benzoico unido mediante un engarce de tipo
"Rink" a un divisor de picos de espectros de masas de
etilendiamina y por lo tanto mediante un engarce "dde" a una
resina se preparó según el esquema de la reacción establecido en el
esquema 6 más adelante. La escisión de la construcción en el primer
sitio de escisión definido por el grupo dde usando hidrazina genera
un fragmento analítico que tiene un grupo amino libre en forma de un
grupo sensible a espectrofotometría de masas.
Esquema
6
La HPLC se llevó a cabo en un instrumento Hewlett
Packcard 1050 usando una columna de fase inversa C_{18} (Supelco,
Supelcosil ABZ+, 3,3 mm, 4,6 mm de \phi). Procedimiento A: 10 a
95% de gradiente de disolvente B (1 ml/min) como la fase móvil.
[Disolvente A: 1% de TFA en agua; disolvente B; 0,5% de TFA en
MeCN:agua (10:1), 8 minutos de duración de gradiente], o
procedimiento B: columna en fase inversa de C_{18} (Dynamax 60A,
25 mm, 6 mm de \phi) con 10 a 95% de gradiente de disolvente B (1
ml/min) como la fase móvil. [Disolvente A: 1% de TFA en agua;
disolvente B; 0,5% de TFA en MeCN:agua (10:1), 8 minutos de duración
de gradiente]. Los puntos de fusión se realizaron en un aparato de
punto de fusión automático Mettler FP5 en tubos abiertos calentando
desde 50ºC a 2ºC min^{-1} y están sin corregir.
4-Dimetilaminopiridina (4,03 g,
33 mmoles) se añadió a una solución de éster monoetílco del ácido
adípico (5,33 ml, 30 mmoles) en dimetilformamida (50 ml) seguido de
diisopropilcarbodiimida (5,17 ml, 33 mmoles). Después de 25 minutos,
se añadió una solución de dimedona (4,63 g, 33 mmoles) en
dimetilformamida (25 ml) y se agitó continuamente durante 48 horas.
La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (300 ml) y se
lavó con KHSO_{4} 0,5 M (2 x 100 ml) agua (100 ml) y salmuera
saturada (50 ml), después se secó (MgSO_{4}), se filtró y se
evaporó. La suspensión resultante se trituró con acetato de etilo
(250 ml), se filtró y el residuo se lavó con acetato de etilo. La
evaporación de los filtrados reunidos proporcionó una goma amarilla
que se purificó mediante extracción en fase sólida (columna de 1,5''
x 4'', eluyente: diclorometano) para proporcionar el compuesto
10 en forma de un aceite amarillo (7,43 g, 84%). \delta_{H}
(CDCl_{3}, 400 MHz): 4,04 (q, 2H, H_{2}, 7 Hz), 2,97 (t, 2H,
H_{4}, 7,5 Hz), 2,46 (s, 2H, H_{13}), 2,28 (s, 2H, H_{14}),
2,26 (d, 2H, H_{7}, 7,5 Hz), 1,60 (m, 4H, H_{5,6}), 1,00 (s,
6H, H_{16}). \delta_{C} (CDCl_{3}, 400 MHz): 205,15
(C-12), 197,58 (C-11), 195,08
(C-3), 173,47 (C-8), 112,02
(C-10), 60,27 (C-2), 52,67
(C-4), 46,80 (C-13), 40,04
(C-14), 34,15 (C-7), 30,72
(C-15), 23,23 (C-16), 24,64
(C-5), 24,01 (C-6), 14,31
(C-1). \nu_{max} (cm^{-1}): 2960 (OH), 1734 (C =
O éster), 1665 (C = O cetona), 1564, 1445, 1143. EM:
(electropulverización + ve) m/z 297 (MH)^{+}
(electropulverización - ve), 295 (M-H)^{-}.
Procedimiento de HPLC A: 5,31 minutos, 97%. 254 nm.
Una solución de hidróxido sódico 2M (2 ml, 4
mmol) se añadió a una solución del compuesto 10 en tetrahidrofurano
(5 ml). Después de 3 horas, la mezcla de reacción se vertió en ácido
clorhídrico acuoso al 10% (50 ml) y se extrajo con acetato de etilo
(2 x 50 ml). Las fases orgánicos reunidas se secaron (MgSO_{4})
se filtraron y se evaporaron para proporcionar el compuesto
11 en forma de un sólido blanquecino (498,5 mg, 95%).
\delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz): 2,99 (dd, 2H, H_{2}, 5 Hz),
2,47 (s, 2H, H_{10}), 2,34 (dd, 2H, H_{5}, 5 Hz), 2,29 (s, 2H,
H_{11}), 1,63 (m, 4H, H_{3,4}), 1,00 (s, 6H, H_{13,14}).
\delta_{C} (CDCl_{3}, 400 MHz): 205,15 (C-9),
197,58 (C-8), 195,08 (C-1), 173,47
(C-6), 112,02 (C-7), 52,96
(C-2), 47,11 (C-10), 40,40
(C-11), 33,92 (C-5), 30,72
(C-12), 28,23 (C-13,14), 24,64
(C-3), 24,01 (C-4). \nu_{max}
(cm^{-1}): 3030 (ácido OH), 1702 (ácido C = O), 1646 (cetona C =
O). Punto de fusión: 58,2ºC. EM: (electropulverización + ve) m/z 269
(MH)^{+} (electropulverización - ve), 267
(M-H)^{-}. Procedimiento de HPLC A: 4,15
minutos, 97%. 254 nm.
Una solución de
N-(terc-butoxicarbonil)-N-bencildiaminoetano
(187,3 mgl, 0,75 mmol) y
N-(terc-butoxicarbonil)-N-(\alpha-dideutero)bencildiaminoetano
(189,3 mg, 0,75 mmoles) en diclorometano (3 ml) seguido de
diisopropiletilamina (3,484 \mul, 2 mmoles) se añadió a una
solución del compuesto 11 (268,4 mg, 1 mmol) en diclorometano (2
ml). Después de agitar durante 20 horas, se evaporó la mezcla de
reacción, se redisolvió en acetato de etilo (25 ml) y se lavó con
solución de ácido cítrico al 10% (3 x 10 ml), agua (10 ml) y
salmuera saturada (10 ml). La fase orgánica se secó (MgSO_{4}),
se filtró y se evaporó, después se purificó mediante cromatografía
ultrarrápida (1 a 3% de metanol en cloroformo) para proporcionar
el compuesto 12 en forma de una goma amarilla (474,5 mg,
95%). \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz): 13,50 (s a, 1H, H_{20}),
7,30 (m, 5H, H_{17}), 4,45 (d a, 1H, H_{18}), 3,47 (d a, 4H,
H_{15,16}), 2,90 (m, 2H, H_{2}), 2,40 (t, 2H, H_{5}, 7,4 Hz),
2,30 (s, 4H, H_{10,11}), 1,75 (m, 2H, H_{4}), 1,45 (m, 11H,
H_{3,19}). \nu_{max} (cm^{-1}): 3030 (ácido OH), 1730 (C =
O, Boc, ácido), 1646 (cetona C = O), 1570 (enamina
conj)\cdot EM: (electropulverización + ve) m/z 503, 501
(MH)^{+} (electropulverización - ve), 502, 499
(M-H)^{-}. Procedimiento de HPLC A: 5,35
minutos, > 97%. 230, 254 nm.
A una solución de compuesto 12 (310 mg, 0,62
mmoles) en diclorometano (6 ml) se añadió
1-hidroxibenzotriazol (110,8 mg, 0,82 mmoles) y
PyBOP (426,6 mg, 0,82 mmoles). Después de 5 minutos, se añadió la
solución a una suspensión de aminometil Argogel® (500 mg, 0,205
mmoles, 0,41 mmoles/g de carga) que tiene un tamaño medio de perla
de 150 \mum, en diclorometano (1 ml).
La mezcla de reacción se agitó durante 5 minutos
después se añadió diisopropiletilamina (285,7 \mul, 1,64 mmoles) y
continuó la agitación durante 16 horas. La resina se añadió con DMF
(5 x) y DCM (5 x) después se secó a vacío para proporcionar la
resina 13 (573,5 mg). La resina dio un ensayo con azul de
bromofenol negativo.
\newpage
La resina 13 (475,5 mg) se hinchó con
diclorometano, después se trató con una solución de fenol (60 mg) en
diclorometano (1 ml) seguido de ácido trifluoro acético (3 ml). La
mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos, después se drenó y
se lavó con diclorometano (1 x), 20% de diisopropiletilamina en
dimetilformamida (3 x), dimetilformamida (5 x) y diclorometano (5 x)
para proporcionar el intermedio de la resina amino que dio un ensayo
con azul de bromofenol positivo. Se suspendió la resina en
diclorometano (2 ml) y se trató con una solución preformada del
ácido Rink en C-4 (351,5 mg, 0,62 mmoles),
1-hidroxibenzotriazol (110,8 mg, 0,82 mmoles) y
PyBOP (426,6 mg, 0,82 mmoles) en dimetilformamida (2 ml). Después de
5 minutos, se añadió diisopropiletilamina (285,7 \mul, 1,64
mmoles) y la mezcla de reacción se agitó durante 3 horas después de
los cual la resina dio un ensayo con azul de bromofenol negativo. Se
lavó la resina con DMF (5 x) y DCM (5 x), después se secó a vacío
para proporcionar la resina 14 (500,9 mg).
Una muestra pequeña muestra de la resina 14
(aproximadamente, 0,5 mg) se trató con hidrazina al 2% en
dimetilformamida durante 30 minutos. Después la solución se analizó
mediante espectrometría de masas por electropulverización para
proporcionar un ion 700/702.
La resina 14 (65 mg) se trató con piperidina al
20% en dimetilformamida (2 x 3 ml x 10 minutos), después se lavó con
dimetilformamida (5 x) y diclorometano (5 x). La resina dio positivo
en el ensayo de Kaiser y se suspendió en diclorometano (1 ml),
después se trató con una solución preformada de ácido benzoico (127
mg, 1,04 mmoles), 1-hidroxibenzotriazol (140 mg,
1,04 mmoles) y PyBOP (541 mg, 1,04 mmoles) en dimetilformamida (2
ml). Después de 5 minutos, se añadió diisopropiletilamina (541
mg\mul, 2,08 mmoles) y la mezcla de reacción se agitó durante 72
horas después de lo cual la resina dio negativo en el ensayo de
Kaiser. La resina se lavó con DMF (5 x) y DCM (5 x), después se secó
a vacío para proporcionar la resina 15 (60mg).
Una muestra pequeña muestra de la resina
(aproximadamente, 0,5 mg) se trató con 2% de hidrazina en
dimetilformamida durante 30 minutos. Después la solución se analizó
mediante espectrometría de masas por electropulverización para
proporcionar un ion 582/584.
La utilidad de las construcciones de la invención
en la creación de bibliotecas combinatorias se demostró preparando
una biblioteca de 64 miembros de construcciones que contienen
sustratos diferentes de diamina usando un procedimiento de síntesis
combinatoria 4 x 4 x 4. Con el fin de proporcionar un medio de
determinación de la historia de la síntesis de las perlas, y
permitir la clasificación y mezcla de las perlas que se controlan
positivamente (en lugar de determinarse simplemente mediante
distribución estadística sencilla) de manera que se formaron todos
los 64 miembros de la biblioteca, se cargaron cantidades de las
perlas de la resina en 64 recipientes Irori MicroKan ^{TM}
marcados con radiofrecuencia. Los recipientes de MicroKan ^{TM},
disponibles de Irori, de La Jolla, California, Estados Unidos, son
recipientes de polipropileno que tienen una pared secundaria de
malla de polipropileno, una capacidad de resina de hasta 30 mg y un
volumen interno de 330 \mul. El uso de los recipientes MicroKan
^{TM} proporciona los beneficios, en términos de números de
compuestos sintetizados, de una síntesis combinatoria de división y
reunión, pero evita la necesidad de construir construcciones
codificadoras en las perlas de la resina ya que los recipientes
MicroKan ^{TM} se proporcionan con marcas de radiofrecuencia que
permiten identificar cada recipiente y por lo tanto que se controle
mediante la secuencia de reacción. Por consiguiente, ya que cada
recipiente contiene un único sustrato al final de la secuencia de
reacción, y la historia de la síntesis del recipiente se ha
rastreado, se puede determinar la identidad del sustrato en cada
recipiente, asumiendo por supuesto que cada etapa de reacción ha
transcurrido según el plan.
Los sustratos de diamida se construyeron sobre un
soporte que contenía un engarce de enganche de seguridad de
tiopirimidina en el primer sitio de escisión, un grupo conector de
diaminoetano que lleva un grupo de división de picos
N-bencilo y un engarce fotolábil en el segundo sitio
de escisión uniendo el sustrato al grupo de conexión de
diaminoetano.
Una construcción intermedia que contiene el grupo
divisor de picos N-bencildiaminoetano y un grupo de
engarce de pirimidina fotolábil se preparó mediante la secuencia de
reacción mostrada en el esquema 7 mas adelante, las etapas de
síntesis posteriores y preparación de la biblioteca combinatoria se
muestran en el esquema 8. Los detalles experimentales de cada
esquema se establecen más adelante y el número de compuestos o
construcciones usados en las descripciones experimentales se
refieren a los números de construcciones/compuestos en los dos
esquemas.
Esquema
7
Una solución de ácido
4-(clorometil)benzoico (3,91 g, 23 mmoles), HATU (8,74 g, 23
mmoles) y DIPEA (7,95 ml, 46 mmoles) en DMF (40 ml) se agitó durante
20 minutos, después esta solución se añadió a la resina 1 Argogel (1
g, 0,46 mmoles), que tiene un diámetro medio de perla entre 150
\mum y una carga de 0,46 mmoles/g, y se agitó el conjunto durante
5 horas. Después la resina se drenó y se lavó con DMF, DCM
Et_{2}O, DCM y finalmente Et_{2}O. Después la resina (2) se
secó a vacío.
Una suspensión de tiourea (8,4 g, 110 mmoles) en
dioxano (80 ml) y etanol (20 ml) se añadió a la resina 2 y el
conjunto se calentó a 80ºC durante 16 horas. Después la resina se
drenó y se lavó con DMF (x 5), DCM (x 5), Et_{2}O, DCM y
finalmente Et_{2}O para proporcionar la resina 3. Después la
resina se secó a vacío.
Una solución de 3-oxobutanoato de
metil-2-dimetilaminometileno (2,4 g,
13,8 mmoles) y trietilamina (0,96 ml, 6,9 mmoles) en DMF (100 ml) se
añadió a la resina 3 y se calentó el conjunto a 80ºC durante 16
horas. La resina se drenó y se lavó con DMF, DCM Et_{2}O, DCM y
finalmente Et_{2}O. Después la resina (4) se secó a vacío.
Después la resina (4) se trató con una mezcla 1:1 de THF y NaOH
acuoso 2N (100 ml) y se agitó durante 2 horas. Después la resina se
drenó y se lavó con THF/H_{2}O, 10% de AcOH/THF, THF/H_{2}O,
THF, DMF, DCM, Et_{2}O, DCM, Et_{2}O y después se secó a vacío
para proporcionar la resina 5.
Una solución de PyBOP® (3,6 g, 6,9 mmoles) y
DIPEA (2,4 ml, 25 mmoles) en DMF (30 ml) se añadió a la resina 5 (5
g, 2,3 mmoles) seguido de una solución de
1-bencil-1-terc-butoxicarbonil-1,2-diaminoetano
(0,86 g, 3,5 mmoles) y
1-(dideuterobencil)1-terc-butoxicarboilo-1,2-diaminoetano
(0,86 g, 3,5 mmoles) en DMF (1 ml) y se agitó el conjunto durante 4
horas. Se drenó la resina y se lavó con DMF, DCM Et_{2}O, DCM y
finalmente Et_{2}O. Después una solución de TFA acuoso al 20% en
DCM (20%, 30 ml) se añadió a la resina y se agitó durante 2 horas.
Después la resina se drenó y se lavó con DMF, DCM Et_{2}O, DCM y
después se agitó con DIPEA al 10% en DMF durante 10 minutos. La
resina se drenó y se lavó con DMF, DCM Et_{2}O, DCM y finalmente
Et_{2}O. Después la resina (6) se secó a vacío.
\newpage
Esquema
8
El ácido de fotoengarce 11 (0,416 g, 1,47
mmoles), DIPEA (0,51 ml, 2,94 mmoles) y PyBOP (0,765 g, 1,47 mmoles)
se disolvieron en DMF (10 ml) y se dejó en reposo durante 10
minutos. Después esto se añadió a la resina 6 (0,7 g, 0,294 mmoles)
y se agitó durante 4 horas. Se drenó la resina y se lavó con DMF,
DCM Et_{2}O, DCM y después se agitó con DIPEA al 10% en DMF
durante 10 minutos. Se drenó la resina y se lavó con DMF, DCM
Et_{2}O, DCM y finalmente Et_{2}O. Después la resina (7) se
secó a vacío.
A una vasija que contiene 16 recipientes Irori
MicroKan ™ (cada uno conteniendo 10 mg, 0,004 mmoles de resina 7) en
DCM (30 ml) se añadió una solución premezclada de la amina (para ver
las cantidades, consúltese la tabla más adelante) y ácido acético
(46 \mul, 0,768 mmoles) en DCM (2 ml) y se agitó durante 20 min.
Después se añadió a la vasija una mezcla de borohidruro de
tetrametilamonio (0,404 mg, 1,54 mmoles) y ácido acético (46 \mul,
0,768 mmoles) en DCM (5 ml) y se agitó la vasija durante 16 horas.
Después las vasijas se drenaron y se lavaron los recipientes
MicroKan ™ con DCM, DMF, DCM y Et_{2}O (cada 3 veces).
A cada una de las 4 vasijas que contiene 16
recipientes Irori MicroKan ™ (cada uno conteniendo 10 mg, 0,004
mmoles de resina 8) en DCM (30 ml) se añadió una solución de PyBOP
(333 mg, 0,64 mmoles), DIPEA (224 \mul, 1,28 mmoles) y uno de los
aminoácidos (véase la tabla más adelante para cantidades) en DMF (5
ml) y se agitó la mezcla durante 16 horas. Después las vasijas se
drenaron y se lavaron los recipientes MicroKan ™ con DMF, DCM, DMF,
DCM y Et_{2}O (cada uno de ellos tres veces). A una vasija que
contiene los 64 recipientes MicroKan ™ se añadió después una
solución de piperidina (20%) en DMF y se agitó durante 3 horas.
Después los recipientes se drenaron y los recipientes MicroKan ™ se
lavaron con DMF, DCM, DMF, DCM y Et_{2}O (cada uno de ellos tres
veces).
A cada una de las 4 vasijas que contiene 16
recipientes Irori MicroKan ™ (cada uno conteniendo 10 mg, 0,004
mmoles de resina 9) en DCM (30 ml) se añadió una solución de PyBOP
(333 mg, 0,64 mmoles), DIPEA (224 \mul, 1,28 mmoles) y uno de los
ácidos (véase la tabla 3 más adelante para cantidades) en DMF (5 ml)
y se agitó la mezcla durante 16 horas. Después las vasijas se
drenaron y se lavaron los recipientes MicroKan ™ con DMF, DCM, DMF,
DCM y Et_{2}O (cada uno de ellos tres veces).
La resina 10 se trató con solución al 10% de
ácido meta-cloroperbenzoico (abreviadamente en inglés mcpba)
en DCM durante 4 horas. Después la solución se separó mediante
filtración y las perlas se lavaron con DCM. Después una sola perla
de cada uno de los 64 recipientes MicroKan ™ se trata con solución
al 10% de 1-metilpiperazina en DMSO y se dejó en
reposo durante 16 horas. Después la solución escindida resultante se
somete a un análisis de espectrometría de masas por
electropulverización. Los espectros de masas de las construcciones
analíticas escindidas se muestran en los espectros identificados en
la columna de encabezamiento "Escisión de la construcción" en
la tabla más adelante. Los espectros de masas de las cuatro primeras
combinaciones monoméricas se muestran en las figuras 11 a 14.
Una sola perla de cada uno de los 64 recipientes
MicroKan ™ se hincha en DMSO (que contiene 0,2% de
H_{2}NNH_{2}) y después se somete a fotólisis durante 4 horas y
la solución se somete a análisis mediante espectrometría de masas
por electropulverización. Los espectros de masas de los productos de
escisión por fotólisis de la biblioteca se muestran en los espectros
identificados en la columna con encabezamiento "Escisión por
UV" en la tabla más adelante. Los espectros de masas de las
primero cuatro combinaciones monoméricas se muestran en las figuras
15 a 18.
Como se puede ver de los espectros de masas
mostrados en las figuras, cuando las construcciones se escinden
fotolíticamente en el segundo sitio de escisión para liberar el
sustrato, la ausencia de cualquier grupo que se puede ionizar
fácilmente en el sustrato significa que el espectro de masas no
muestra un fuerte ion molecular y por lo tanto es difícil la
identificación del sustrato. Sin embargo, cuando las construcciones
de la perla se escinden en el primer sitio de escisión para liberar
un fragmento analítico que contiene el sustrato y los grupos
sensibles y de división de picos, se produce un ion molecular fuerte
de división característico y fácilmente identificable, por lo tanto
permitiendo que el sustrato se identifique. En la mayoría de los
casos, la identidad del sustrato del ion molecular en el espectro de
masas se correlaciona con la identidad predicha de la historia de
síntesis conocida de las perlas de las resinas en cada MicroKan ™.
Sin embargo, en ciertas reacciones, los sustratos formaban productos
de oxidación en condiciones de escisión usadas para desbloquear el
engarce del enganche de seguridad pero tales productos de oxidación
se podrían identificar fácilmente como iones M + 16 en el espectro
de masas. De este modo, una ventaja adicional de las construcciones
de la invención es que proporciona un medio para determinar cuando
una reacción particular ha transcurrido según al plan.
Las construcciones de engarce duales de la
invención permiten que la escisión se lleve a cabo bien para liberar
una construcción analítica que contiene un grupo sensible de
espectrometría de masas de masas, o para liberar el sustrato. De
este modo, la construcción permite que los procedimientos de
control de calidad se lleven a cabo a un solo nivel de perla de
manera que no habría sido posible si las construcciones hubieran
contenido solamente un solo engarce y ningún grupo sensible de
espectrometría de masas.
Un ejemplo de una construcción que contiene un
engarce aliloxicarbonilo (abreviadamente en inglés "Alloc") en
el primer sitio de escisión y un engarce Rink ácido lábil en el
segundo sitio de escisión se preparó según el esquema de reacción
mostrado en el esquema 9. En este ejemplo, paladio (0) se usa para
escindir el grupo aliloxicarbonilo del grupo amino del grupo
diaminoetano de manera que se libera un grupo amino libre que
después puede funcionar como un grupo sensible de espectrometría de
masas.
Esquema
9
En esta sección, los número de los compuestos se
refieren al número del compuesto en el esquema 9.
Todos los lavados se llevaron a cabo cinco veces
con los disolventes citados. El procedimiento de lavado habitual A:
DMF, DCM, DMF, ET2O, DCM y Et_{2}O, todos cinco veces cada
uno.
El ácido 2 comercialmente disponible (65 mg,
0,115 mmoles) (Neosystems) se disolvió en DMF (0,5 ml) y a éste se
añadió DIPEA (40 \mul, 0,23 mmoles) seguido de HATU (44 mg, 0,115
mmoles). Esta mezcla se dejó en reposo durante 5 minutos y después
se añadió a Argogel NH2 comercialmente disponible (resina 1) (50 mg,
0,023 mmoles), que tiene un diámetro medio de perla de 150 \mum y
una carga de 0,46 mmoles/g y se agita durante 2 horas. Después la
resina drenó y se lavó según el procedimiento de lavado habitual A y
después se secó a vacío. Después la resina se trató con una solución
de DCM, TFA y TES (1 ml, 95:2:5 respectivamente) durante 2 horas y
después se lavó como se ha indicado anteriormente y después se
repitió este tratamiento con DCM, TFA y TES durante 1 hora. La
resina se lavó y se drenó según el procedimiento de lavado habitual
A para dar la resina 3.
Después la resina 3 (50 mg, 0,023 mmoles) se
trató con una solución de cloroformiato de
4-nitrofenilo (23 mg, 0,115 mmoles) en DCM (1 ml) y
se agitó durante 16 horas. Después la resina se drenó rápidamente
con DCM y Et2O para dar la resina 4. A esto se añadió directamente
una solución de aminas 7 (50 mg, 0,2 mmoles) y 8 (50 mg, 0,2 mmoles)
y DIPEA (70 \mul, 0,4 mmoles) en DCM (1 ml) y se agitó durante 16
horas. Después la resina se drenó y se lavó según el procedimiento
habitual A y después se secó a vació. Después esta resina se trató
con una solución de TFA al 20% en DCM (1 ml) y se agitó durante 2
horas. Se drenó la resina, se lavó con una solución de DIPEA l 10%
en DCM (2 ml) y después se drenó y se lavó según el procedimiento de
lavado habitual A y se secó a vacío para proporcionar la resina
5.
El ácido Rink 9 (65 mg, 0,115 mmoles) se disolvió
en DMF (0,5 ml) y DIPEA (40 \mul, 0,23 mmoles) y se añadió HATU
(44 mg, 0,115 mmoles) a esta mezcla dejando en reposo durante 5
minutos. Después esta solución se añadió a la resina 5 (25 mg, 0,012
mmoles) y se agitó durante 2 horas. La resina se lavó y se drenó
según el procedimiento de lavado habitual A y se secó a vacío.
Después esta resina se trató con solución al 20% de piperidina en
DMF (1 ml) durante 1 hora. Se lavó la resina y se drenó según el
procedimiento de lavado habitual A y se secó a vacío. Se disolvió
ácido benzoico (14 mg, 0,115 mmoles) en DMF (0,5 ml) y DIPEA (40
\mul, 0,23 mmoles) y se añadió HATU (44 mg, 0,115 mmoles) y esta
mezcla se dejó en reposo durante 5 minutos. Después esta solución se
añade a la resina y se agita durante 2 horas. La resina se lavó
según el procedimiento de lavado habitual A y se secó a vacío para
proporcionar la resina 6.
Procedimiento
1
La resina 6 (0,5 mg) se hinchó en DCM y después
se añadió (Ph_{3}P)_{4}Pd(0) (2,7 mg, 2,3E^{-3}
mmoles) seguido de morfolina (10 ml, 0,11 mmoles) y se agitó la
mezcla durante 1 hora. Se retiró una muestra del líquido y se
analizó mediante espectrometría de masas por electropulverización
para proporcionar un análisis como se muestra en la figura 17. Como
en los ejemplos previos, la presencia de un grupo sensible de
espectrometría de masas y un grupo de división de picos permite que
se forme un fuerte ion molecular y que se identifique
fácilmente.
Procedimiento
2
La resina 6 (0,5 mg) se hinchó en una mezcla de
DMSO, THF y HCl 0,5 M (0,5 ml, 2:2:1 respectivamente) y después se
añadió (Ph_{3}P)_{4}Pd(0) (2,7 mg, 2,3E^{-3}
mmoles) seguido de morfolina (10 ml, 0,11 mmoles) y se agitó la
mezcla durante 1 hora. Se retiró una muestra del líquido y se
analizó mediante espectrometría de masas por electropulverización
para proporcionar un análisis como se muestra en la figura 18.
Con el fin de demostrar que la espectrometría de
UV se puede usar para proporcionar información cuantitativa exacta
sobre los productos de reacciones en fase sólida, se preparó una
construcción que contenía un cromóforo de UV antracenilo según la
vía de síntesis mostrada en los esquemas 10, 11 y 12 más adelante. A
la construcción se le proporcionó un engarce de sulfonamida en el
primer sitio de escisión y un engarce Rink en el segundo sitio de
escisión, una cadena etilendiamina que conecta los dos engarces y
los dos átomos de nitrógeno de la cadena diamina sirviendo como
puntos de unión del cromóforo de UV en cualquier grupo bencilo
marcado con deuterio de división de picos o un grupo de bencilo no
marcado.
El esquema 10 más adelante ilustra la síntesis de
una no resina unida a una construcción intermedia, el esquema 11
ilustra la unión de la construcción del esquema 10 a un soporte de
resina y las reacciones posteriores en la resina, y el esquema 12
ilustra la unión de diferentes grupos de sustrato a las
construcciones y los posteriores experimentos de escisión. En la
descripción experimental más adelante, los números de los compuestos
se usan para relacionar los compuestos identificados en los esquemas
10, 11 y 12.
\newpage
Esquema
10
Trietilamina seca (25 \mul, 0,2 mmoles) se
añadió a una solución de la amina (X = H, H) (11) (0,05 mmoles) en
diclorometano seco (1 ml). Después se añadió gota a gota una
solución de cloruro de
2-nitro-4-metilbenzoatosulfonilo
(10) (25 mg, 0,1 mmoles) en diclorometano seco (0,5 ml) y se agitó
la mezcla durante 15 minutos. Se evaporó el disolvente a vacío y se
purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida usando 2:1
de hexano:acetato de etilo como eluyente para proporcionar la
sulfamida (12) (23,3 mg, 95%) en forma de un aceite incoloro,
R_{f} 17/50 [hexano-acetato de etilo (2:1)];
(encontrado C, 53,7; H, 5,4; N, 8,4; S, 6,5.
C_{22}H_{27}N_{3}O_{8}S requiere C, 53,5; H, 5,5; N, 8,5;
S, 6,5%); \delta_{H} (DMSO-d^{6}) 1,38 (9H, s,
H-18), 3,10 (2H, t, J8,
H-9), 3,24 (2H, t, J8, H-10),
3,95 (3H, s, O-Me), 4,32 (2H, s, H11),
7,13-7,32 (5H, m, H-13, 14 y 15),
8,09 (1H, d, J8, H-6), 8,29 (1H, s,
H-3), 8,32 (1H, d, J8, H-3);
\delta_{C} (DMSO-d^{6}) 28,3
(C-18), 40,2 (C-9 y 10), 46,2
(C-11), 53,2 (O-Me), 79,3
(C-17), 125,1 (C-13), 127,2
(C-14 y 15), 128,6 (C-6), 130,3
(C-13), 133,1 (C-5), 134,4
(C-12), 136,6 (C-1), 147,6
(C-4), 163,7 (C-16 y C = O); EM
(electropulverización - ve) m/z 494 (M-H); HPLC,
R_{t} 6,8 min.
Trietilamina seca (25 \mul, 0,2 mmoles) se
añadió a una solución de la amina (X = ^{2}H, ^{2}H) (11) (0,05
mmoles) en diclorometano seco (1 ml). Después se añadió gota a gota
una solución de cloruro de
2-nitro-4-metilbenzoatosulfonilo
(10) (25 mg, 0,1 mmoles) en diclorometano seco (0,5 ml) y se agitó
la mezcla durante 15 minutos. Se evaporó el disolvente a vacío y se
purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida usando 2:1
de hexano:acetato de etilo como eluyente para proporcionar la
sulfamida (12) (23,5 mg, 94%) en forma de un aceite incoloro,
R_{f} 17/50 [hexano - acetato de etilo (2:1)]; (encontrado C,
53,2; H, 5,6; N, 8,5; S, 6,4.
C_{22}H_{25}D_{2}N_{3}O_{8}S requiere C, 53,3; H, 5,5; N,
8,5; S, 6,5%); \delta_{H} (DMSO-d^{6}) 1,40 (9H,
s, H-18), 3,05 (2H, m, H-9), 3,20
(2H, dt, J3 y 13, H-10), 3,9 (3H, s,
O-Me), 7,10-7,35 (5H, m,
H-13, 14 y 15), 8,09 (1H, d, J8,
H-6), 8,35 (1H, d, J8, H-5),
8,40 (1H, m, H-8), 8,45 (1H, s,
H-3); \delta_{C} (DMSO-d^{6})
27,8 (C-18), 40,9 (C-9 y 10), 45,9
(C-11), 53,0 (O-Me), 79,1
(C-17), 124,8 (C-13), 127,0
(C-14 y 15), 128,3 (C-6), 130,0
(C-13), 132,9 (C-5), 134,2
(C-12), 136,4 (C-1), 147,5
(C-4), 154,7 (C-2), 163,5
(C-16 y C = O); EM (electropulverización + ve) m/z
496 (M H)^{+}; HPLC, R_{t} 6,8 min.
Di-terc-bitilazodicarboxilato
(32,6 mg, 142 \mumoles) se disolvió en tetrahidrofurano seco (0,5
ml) en atmósfera de nitrógeno y se añadió gota a gota a una solución
de trifenilfosfina (37,1 mg, 142 \mumoles),
3-(9-antraceno)propanol (17,6 mg, 74
\mumoles) y sulfonamida 12 (X = H, H, y ^{2}H, ^{2}H) (35 mg,
71 \mumoles), disuelto en tetrahidrofurano seco (1 ml) en
atmósfera de nitrógeno. Después de 1 hora la reacción se consideró
que se había completado mediante TLC y se evaporó la solución hasta
casi sequedad. Se purificó el residuo mediante cromatografía
ultrarrápida
usando 2:1 de hexano/acetato de etilo que
contenía 10% de trietilamina para proporcionar la sulfonamida 13 (45
mg, 90%) en forma de un aceite incoloro, R_{f} 15/38
(hexano-acetato de etilo (2:1)); EM
(electropulverización + ve) m/z 612, 614 (MH - Boc)^{+}, EM
(electropulverización - ve) m/z 756, 758 (M-H +
formiato) HPLC, R_{f} 6,9 minutos. Se añadió gota a gota hidróxido
sódico acuoso 2M (0,35 ml, 0,7 mmoles) a una solución del éster 13
(0,25 g, 0,35 mmoles) en
metanol-1,4-dioxano (4:1) (2 ml).
Después de agitar a temperatura ambiente durante 1 hora (se añadió
adicionalmente el metanol-dioxano (aproximadamente 1
ml) necesario para asegurar una sola fase) se añadió suficiente HCl
2M para obtener la solución ligeramente ácida. La solución se
transfirió a un matraz de separación que contenía acetato de etilo
(50 ml) y agua (10 ml) y después de la repartición de la fase
acuosa se extrajo otra vez con acetato de etilo. Los extractos
orgánicos reunidos se secaron (MgSO_{4}) y se evaporó a presión
reducida para proporcionar el ácido 1 (0,23 g, 94%) en forma de un
aceite incoloro; R_{F} 2/40 [hexano-acetato de
etilo (2:1)]; \delta_{H} (CDCl_{3}) 1,40 (9H, d a,
tBu), 1,90 (2H, m a, CH_{2}),
3,3-3,7 (8H, m a, 4x CH_{2}),
7,10-8,30 (17H, m a, H Arom.); EM
(electropulverización + ve) m/z 697, 699 HPLC, R_{t} 7,2
min.
\newpage
Esquema
11
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
12
\vskip1.000000\baselineskip
Aminometil seco Argogel® (0,87 g, 0,35 mmoles),
que tiene un diámetro medio de 150 \mum y una carga de 0,4
mmoles/g, en un recipiente de reacción gaseado con nitrógeno seco se
hinchó con diclorometano secó (5 ml). En un matraz separado gaseado
con nitrógeno, el ácido benzoico (1) (0,67 g, 0,93 mmoles), PyBOP
(0,728 g, 1,4 mmoles) y 1-hidroxibenzotriazol (0,19
g, 1,4 mmoles) se disolvieron en dimetilformamida seca (2 ml) y la
solución resultante se agitó dos minutos antes de transferirse a la
suspensión de resina mediante una cánula. Se aspiró a través de la
solución una corriente lenta de nitrógeno durante cinco minutos
para asegurar la mezcla y después se añadió diisopropiletilamina
(0,49 ml, 2,8 mmoles). Se continuó la agitación durante 18 horas
después de lo cual la resina (2) se drenó, se lavó (diclorometano (3
x 7 ml), dimetilformamida (3 x 7 ml) y diclorometano (3 x 7ml) y se
secó a vacío. Una muestra de 2 dio negativo en el ensayo de
Kaiser.
La resina 2 (0,35 mmoles) se hinchó en
diclorometano (3 ml) y se añadió fenol (66 mg, 0,7 mmoles), seguido
de ácido trifluoroacético (4,5 ml). Se agitó la resina
cuidadosamente durante cinco minutos usando una corriente de
nitrógeno, después se drenó y se lavó con diclorometano (2 x 5 ml).
El procedimiento se repitió y después de drenar, la resina se lavó
(diclorometano (3 x 8 ml), diisopropilamina al 10% en diclorometano
(2 x 6 ml) y diclorometano (4 x 8 ml)) y se secó a vacío. Una
muestra analítica 2 dio negativo en el ensayo de Kaiser.
La resina, en un recipiente de reacción gaseado
con nitrógeno, se hinchó con diclorometano seco (5 ml). En un matraz
separado gaseado con nitrógeno ácido C-4 RINK (0,795
g, 1,4 mmoles), PyBOP (1,46 g, 2,8 mmoles) y
1-hidroxibenzotriazol (0,378 g, 2,8 mmoles) se
disolvieron en dimetilformamida seco (3 ml) y la solución
resultante se transfirió a la suspensión de resina mediante una
cánula. Se agitó esta mezcla suavemente aspirando una corriente
lenta de nitrógeno a través de la solución y después de cinco
minutos se añadió diisopropiletilamina seca (0,98 ml, 5,6 mmoles).
Se continuó la agitación en un agitador mecánico durante 18 horas
después de lo cual la resina (3) se drenó y se lavó (diclorometano
(3 x 8 ml), dimetilformamida (3 x 5 ml) y diclorometano (3 x 5 ml)
y se secó a vacío. Una muestra analítica dio negativo en el ensayo
de Kaiser.
Una muestra de la resina 3 (50 mg, 14 \mumoles)
se trató con piperidina al 20% v/v en 1:1 de
diclorometano/dimetilformamida (2 ml) durante 15 minutos. Se drenó
la resina y se lavó (diclorometano (3 x 2 ml), dimetilformamida (3 x
2 ml) y diclorometano (3 x 2 ml)) después se secó a vacío, dando
una muestra analítica positiva el ensayo con azul de bromofenol. El
recipiente de reacción que contenía la resina se gaseó con
nitrógeno y se añadió 1:1 de diclorometano/dimetilformamida (0,5 ml)
secos. En un matraz separado gaseado con nitrógeno PyBOP (57 mg, 110
\mumoles), 1-hidroxibenzotriazol (15 mg, 110
\mumoles) y el ácido adecuado (4a-d) (55
\mumoles) se disolvieron en 1:1 de
diclorometano-dimetilformamida secos (0,5 ml) y esta
solución se añadió en una porción a la suspensión de la resina, a
través de la cual se aspiró una corriente lenta de nitrógeno para
asegurar la uniformidad de la mezcla. Después agitar durante 18
horas la resina se drenó, se lavó (diclorometano (3 x 2 ml),
dimetilformamida (4 x 2 ml) y diclorometano (3 x 2 ml)) y se secó a
vacío para proporcionar las resinas 5a-d. Una
muestra analítica de cada una de ellas dio negativo en el ensayo de
Kaiser.
Una pequeña muestra de cada una de las cuatro
resinas se trató con DBU/mercaptoetanol en acetonitrilo para liberar
6a - d que se analizaron mediante HPLC y espectrometría de masas de
baja resolución:
6a (R = 3-dimetilaminobenzoílo)
HPLC R_{t} 4,51 minutos, EM (electropulverización + ve)
m/z 843,7 y 845,7;
6b (R = 2-naftilacetoílo) HPLC
R_{t} 5,41 minutos, EM (electropulverización + ve) m/z
863,4 y 865,4;
6c (R = 4-pentenoílo) HPLC
R_{t} 4,98 minutos, EM (electropulverización + ve) m/z
778,7 y 780,7;
6d (R = terc-butilacetoílo) HPLC R_{t}
5,18 minutos, EM (electropulverización + ve) m/z 795,0 y
797,0.
Cantidades aproximadamente iguales
(aproximadamente 50 mg) de las resinas 5a y 5b se reunieron y se
trataron con ácido 4-mercaptobenzoico (43 mg, 20
\mumoles) y morfolina (49 \mumoles) en diclorometano (2 ml).
Después de una hora la solución se drenó y se lavó la resina con
diclorometano (2 x 1 ml). Estos lavados reunidos se diluyeron con
acetato de etilo (10 ml) y se lavaron primero con bicarbonato sódico
acuoso saturado al 50% (3 ml), agua (3 ml) y salmuera (2 ml) y se
secaron en sulfato de magnesio. La solución filtrada se evaporó para
proporcionar aproximadamente 5 mg de una mezcla de 6a y 6b. La
relación de componentes en esta mezcla se valora primero mediante
HPLC, midiendo las áreas de los picos a 254 nm y 386 nm, que se
correlacionaron con la relación determinada a partir de la magnitud
de las integraciones de las resonancias características en el
espectro de ^{1}H RMN.
| 6a | 6b | |
| Relación de áreas (254 nm) | 1,00 | 1,30 |
| Relación de áreas (386 nm) | 1,00 | 1,26 |
| 6a | 6b | |
| Relación | 1,00 | 1,33 |
De la misma forma un mezcla de resinas 5c y 5d,
proporcionaron una mezcla de 6c y 6d, la relación de las cuales se
valoró mediante HPLC y se correlacionó con las relaciones medidas
usando espectroscopia de ^{1}H RMN.
| 6c | 6d | |
| Relación de áreas (254 nm) | 1,00 | 0,93 |
| Relación de áreas (386 nm) | 1,00 | 0,97 |
| 6c | 6d | |
| Relación | 1,00 | 0,96 |
Finalmente 6a, 6b, 6c y 6d se reunieron en una
solución, que se analizó usando HPLC y ^{1}H RMN como antes:
| 6a | 6b | 6c | 6d | |
| Relación de áreas (254 nm) | 0,87 | 1,35 | 1,00 | 1,00 |
| Relación de áreas (386 nm) | 0,84 | 1,30 | 1,00 | 0,99 |
| 6a | 6b | 6c | 6d | |
| Relación | 0,85 | 1,34 | 1,00 | 1,05 |
La resina 3 (214 mg, 59 \mumoles) se trató con
piperidina al 20% v/v en 1:1 de diclorometano/dimetilformamida (3
ml) durante 60 minutos. Se drenó la resina y se lavó (diclorometano
(3 x 3 ml), dimetilformamida (3 x 3 ml) y diclorometano (3 x 3 ml))
y se secó a vacío, dando una muestra analítica positivo un ensayo
con azul de bromofenol. Después el recipiente de reacción se gaseó
con nitrógeno y la resina se hinchó con 1:1 de
diclorometano/dimetilformamida secos (2 ml).
En un matraz separado gaseado con nitrógeno PyBOP
(245 mg, 470 \mumoles), 1-hidroxibenzotriazol (64
mg, 470 \mumoles) y una mezcla de ácido
4-pentenoico (60 \mul, 59 \mumoles), ácido
3-dimetilaminobenzoico (19,5 mg, 120 \mumoles) y
ácido terc-butilacético (23 \mul, 180 \mul) se
disolvieron en 1:1 de
diclorometano-dimetilformamida secos (1 ml) y se
añadió la solución en una porción a la suspensión de la resina. Se
pasó suavemente una corriente de nitrógeno a través de la mezcla y
después de cinco minutos se añadió diisopropiletilamina (165 \mul,
940 \mumoles). Después agitar durante 18 horas la resina (7) se
drenó, se lavó (diclorometano (3 x 4 ml), dimetilformamida (4 x 4
ml) y diclorometano (3 x 4 ml)) y se secó a vacío. Una muestra
analítica de 7 dio negativo en el ensayo de Kaiser.
Una muestra pequeña de la resina 7 se trató con
DBU/mercaptoetanol en acetonitrilo para liberar una mezcla de 6a, 6c
y 6d, valorando las cantidades relativas de estos componentes
mediante HPLC, midiendo las áreas de los picos a 254 y 386 nm
(tabla).
Después una sola perla de 7 se seleccionó y se
escindió de la misma forma. La relación de los componentes se midió
otra vez usando HPLC.
Aproximadamente 200 mg de la resina 7 (0,056
\mumoles) se hinchó con diclorometano y se drenó el exceso de
disolvente. Se añadió fenol (10,5 mg, 0,112 \mumoles) seguido de
ácido trifluoroacético al 80% en diclorometano de manera que este
volumen añadido constituía un tercio del total. Después de agitar
durante dos horas el disolvente rojo claro se drenó a un matraz de
fondo redondo y la resina se lavó con diclorometano destilado (3 x 3
ml). Los compuestos orgánicos combinados se evaporaron hasta
sequedad para proporcionar una mezcla de las aminas primarias 8a, 8c
y 8d. La relación de estos componentes se valoró midiendo la
magnitud de la integración de resonancias características en el
espectro de ^{1}H RMN.
| 6a | 6c | 6d | |
| Relación de áreas (254 nm) | 0,71 | 1,00 | 0,44 |
| Relación de áreas (386 nm) | 0,71 | 1,00 | 0,46 |
| 6a | 6c | 6d | |
| Relación de áreas (254 nm) | 0,71 | 1,00 | 0,42 |
| Relación de áreas (386 nm) | 0,69 | 1,00 | 0,41 |
| 8a | 8c | 8d | |
| Relación | 0,74 | 1,00 | 0,42 |
Los resultados establecidos en las tablas
ilustran que hay una correlación extraordinariamente buena entre las
relaciones obtenidas mediante el procedimiento de UV y las
relaciones obtenidas por el procedimiento bien establecido y probado
de análisis de RMN. De este modo, los datos demuestran que se pueden
usar la detección y análisis por UV para proporcionar un medio muy
exacto para dar informaciones cuantitativas sobre los productos de
reacción de las síntesis en fase sólida. Es particularmente
significante el hecho de que el análisis por UV se ha mostrado que
proporciona un medio exacto de proporcionar datos cuantitativos
incluso a nivel de perla individual cuando las cantidades de
compuesto disponible para análisis son del orden de solamente 1
nanomol.
Se preparó una segunda construcción que contenía
cromóforo de UV, pero esta vez incluyendo un grupo dansilo en forma
de cromóforo en lugar del grupo antracenilo. La secuencia de las
etapas que conducen a la construcción se muestra en el esquema 13
más adelante. Como se puede ver en el esquema 13, la construcción es
análoga a la construcción del ejemplo 8 en el que un grupo de
engarce de sulfonamida proporciona un primer sitio de escisión que
permite la liberación del fragmento analítico, y un engarce Rink
proporciona un segundo sitio de escisión que permite la liberación
del sustrato. Sin embargo, en este ejemplo, el cromóforo, en lugar
de estar unido al nitrógeno de sulfonamida, está unido a un grupo
lisina posicionado entre la cadena etilendiamina y el engarce
Rink.
Esquema
13
En los siguientes detalles experimentales, los
números de los compuestos o construcciones se refieren a los
compuestos y construcciones identificados en el esquema 13.
A una solución agitada de cloruro de
2-nitro-4-metilbenzoatosulfonilo
1 (1,10 g, 3,90 mmoles) y trietilamina (0,39 g, 3,90 mmoles) en
diclorometano seco (40 ml), se añadió a 0ºC la amina 2a (1,00 g, 3,9
mmoles) en diclorometano seco (20 ml) durante 30 minutos. La mezcla
de reacción se agitó durante 2 horas adicionales a temperatura
ambiente, después se concentró a vacío para proporcionar un aceite
amarillo. La purificación mediante cromatografía con [MTBE:hexano
(1:1)] como eluyente seguido de recristalización con MTBE (5 ml) y
hexano (2 ml) proporcionó la sulfonamida 3a (1,53 g, 79%) en
forma de escamas; p. f. 129-130ºC; R_{f} 0,31
[MTBE:hexano (1:1)]; (encontrado C, 53,2; H, 5,6; N, 8,5; S, 6,4.
C_{22}H_{25}D_{2}N_{3}O_{8}S requiere C, 53,3; H, 5,5; N,
8,5; S, 6,5%); \delta_{H} (DMSO-d^{6}) 1,40 (9H,
s, H-18), 3,05 (2H, m, H-9), 3,20
(2H, dt, J3 y 13, H-10), 3,9 (3H, s,
O-Me), 7,10-7,35 (5H, m,
H-13, 14 y 15), 8,09 (1H, d, J8, H - 6), 8,35
(1H, d, J8, H-5),8,40 (1H, m,
H-8), 8,45 (1H, s, H-3);
\delta_{C} (DMSO-d^{6}) 27,8
(C-18), 40,9 (C-9 y 10), 45,9
(C-11), 53,0 (O-Me), 79,1
(C-17), 124,8 (C-13), 127,0
(C-14 y 15), 128,3 (C-6), 130,0
(C-13), 132,9 (C-5), 134,2
(C-12), 136,4 (C-1), 147,5
(C-4), 154,7 (C-2), 163,5
(C-16 y C = O); EM (electropulverización + ve) m/z
496 (MH)^{+}; HPLC (procedimiento A), R_{t} 6,07 min.
El éster 3a (0,40 g, 0,80 mmol) en metanol (2 ml)
se trató con hidróxido sódico acuoso 1 M (1,60 ml, 1,60 mmoles) y se
agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después la reacción se
concentró a vacío y se disolvió el residuo en agua (10 ml), después
se acidificó con ácido clorhídrico 1 M (1,80 ml, 1,80 mmoles) a 0ºC.
El precipitado blanco resultante se extrajo con diclorometano (3 x
10 ml). Los extractos orgánicos reunidos se lavaron con salmuera, se
secaron (Na_{2}SO_{4}) y se evaporaron a presión reducida al
ácido 4a (0,34 g, 88%) en forma de un sólido blanco; p. f.
143-145ºC; R_{F} 0,58 [MTBE:hexano (1:1)];
\delta_{H} (DMSO-d^{6}) 1,29 (9H, s,
H-18), 3,02 (2H, m, H-9), 3,20 (2H,
dt, J3, H-10), 7,10-7,40
(5H, m, H-13, 14 y 15), 8,06 (1H, d, J8,
H-6), 8,28 (1H, s, H-3), 8,30 (1H,
d, J8, H-3); \delta_{C}
(DMSO-d^{6}) 27,9 (C-18), 40,9
(C-9 y 10), 45,9 (C-11), 79,1
(C-17), 124,5 (C-13), 127,1
(C-14 y 15), 128,4 (C-6), 129,5
(C-13), 132,5 (C-5), 139,2
(C-12), 147,3 (C-1), 155,1
(C-4), 164,8 (C-16 y C = O);
(encontrado: MH^{+}, 482,156364
C_{21}H_{23}D_{2}N_{3}O_{8}S requiere MH+, 482,156615);
HPLC (procedimiento A), R_{t} 5,65 min.
\newpage
A una solución agitada de cloruro de
2-nitro-4-metilbenzoatosulfonilo
1 (1,10 g, 3,90 mmoles) y trietilamina (0,39 g, 3,90 mmoles) en
diclorometano seco (40 ml), se añadió a 0ºC la amina 2b (0,95 g, 3,9
mmoles) en diclorometano seco (20 ml) durante 30 minutos. La mezcla
de reacción se agitó durante 3 horas adicionales a temperatura
ambiente, después se concentró a vacío para proporcionar un aceite
amarillo. La purificación mediante cromatografía con [MTBE:hexano
(1:1)] como eluyente seguido de recristalización con MTBE (5 ml) y
hexano (2 ml) proporcionó la sulfonamida 3b (1,51 g, 79%) en
forma de escamas; p. f. 131-132ºC; R_{f} 0,28
[MTBE:hexano (1:1)]; (encontrado C, 53,7; H, 5,4; N, 8,4; S, 6,5.
C_{22}H_{27}N_{3}O_{8}S requiere C, 53,5; H, 5,5; N, 8,5; S,
6,5%); \delta_{H} (DMSO-d^{6}) 1,38 (9H, s,
H-18), 3,10 (2H, t, J8, H-9),
3,24 (2H, t, J8, H-10), 3,95 (3H, s,
O-Me), 4,32 (2H, s, H11), 7,13-7,32
(5H, m, H-13, 14 y 15), 8,09 (1H, d, J8,
H-6), 8,29 (1H, s, H-3), 8,32 (1H,
d, J8, H-3); \delta_{C}
(DMSO-d^{6}) 28,3 (C-18), 40,2
(C-9 y 10), 46,2 (C-11), 53,2
(O-Me), 79,3 (C-17), 125,1
(C-13), 127,2 (C-14 y 15), 128,6
(C-6), 130,3 (C-13), 133,1
(C-5), 134,4 (C-12), 136,6
(C-1), 147,6 (C-4), 163,7
(C-16 y C = O); EM (electropulverización - ve) m/z
492 (M - H)^{-}; HPLC (procedimiento A), R_{t} 5,99
min.
El éster 3b (0,40 g, 0,80 mmol) en metanol (2 ml)
se trató con hidróxido sódico acuoso 1 M (1,60 ml, 1,60 mmoles) y se
agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después la reacción se
concentró a vacío y se disolvió el residuo en agua (10 ml) después
se acidificó con ácido clorhídrico 1 M (1,80 ml, 1,80 mmoles) a 0ºC.
El precipitado blanco resultante se extrajo con diclorometano (3 x
10 ml). Los extractos orgánicos reunidos se lavaron con salmuera, se
secaron (Na_{2}SO_{4}) y se evaporaron a presión reducida al
ácido 4b (0,36 g, 93%) en forma de un sólido blanco; p. f.
123,7-124,8ºC; R_{F} 0,59 [MTBE:hexano (1:1)];
\delta_{H} (DMSO-d^{6}) 1,42 (9H, s,
H-18), 3,12 (2H, m, H-9), 3,22 (2H,
m, H-10), 4,38 (2H, s, H11),
7,18-7,42 (5H, m, H-13, 14 y 15),
8,11 (1H, d, J8, H-6), 8,39 (1H, d,
J8, H-3), 8,45 (1H, s, H-3);
\delta_{C} (DMSO-d^{6}) 27,8
(C-18), 40,1 (C-9 y 10), 45,9
(C-11), 79,1 (C-17), 124,8
(C-13), 126,9 (C-14 y 15), 128,4
(C-6), 129,9 (C-13), 132,9
(C-5), 135,8 (C-12), 137,9
(C-1), 147,5 (C-4), 153,9
(C-2), 163,7 (C-16 y C = O); EM
(electropulverización - ve) m/z 478 (M - H)^{-}; HPLC,
R_{t} 5,56 min.
A una suspensión de resina de amina
(Argogel-NH_{2}) (0,80 g, 0,32 mmoles) que tiene
un diámetro medio de perla de 150 \mum y una carga de 0,4
mmoles/g, en DMF (4 ml) y diclorometano (4 ml) se añadió el ácido
benzoico (4a) (0,46 g, 0,96 mmoles) y el ácido benzoico (4b) (0,46
g, 0,96 mmoles), seguido de PyBOP (0,99 g, 1,92 mmoles) y HOBT (0,26
g, 1,92 mmoles) seguido, 4 minutos más tarde, de base de Hünig (0,49
g, 3,84 mmoles). La reacción se agitó con nitrógeno durante 18
horas y después la resina se lavó con diclorometano (6 x 10 ml), DMF
(6 x 10 ml), diclorometano (6 x 10 ml), éter (2 x 10 ml) y se secó a
vacío para proporcionar la resina de sulfonamida 5 (0,94 g,
97%) en forma de un sólido amarillo; el ensayo de Kaiser fue
negativo; el ensayo con azul de bromofenol fue negativo.
La resina protegida 5 (0,85 g, 0,34 mmoles) se
suspendió en diclorometano (2 ml) y se trató con ácido
trifluoracético (2 x 4 ml) durante 5 minutos. Se retiraron los
disolventes mediante filtración y se lavó la resina con solución de
DIPEA al 10% en DMF (3 x 5 ml), diclorometano (6 x 5 ml), DMF (6 x 5
ml), diclorometano (6 x 5 ml), éter (2 x 5 ml). Después la resina
amina se suspendió en DMF (4 ml) y diclorometano (2 ml), se añadió
FMoc-Lys(Dde)-OH (0,86 g,
1,62 mmoles), seguido de PyBOP (0,84 g, 1,62 mmoles) y HOBT (0,22 g,
1,62 mmoles). Después de 4 minutos se añadió base de Hünig (0,42 g,
3,24 mmoles). Se agitó la reacción con nitrógeno durante 18 horas y
después se lavó la resina con diclorometano (6 x 10 ml), DMF (6 x 10
ml), diclorometano (6 x 10 ml), éter (2 x 10 ml) y se secó a vacío
para proporcionar la resina de sulfonamida 6 (0,96 g, 100%)
en forma de un sólido amarillo; el ensayo de Kaiser fue negativo; el
ensayo con azul de bromofenol fue negativo; la carga de resina de
99% se estimó mediante la escisión cuantitativa del grupo Fmoc.
La resina 6 (0,93 g, 0,28 mmoles) se trató con
20% de piperidina en solución de DMF (2 x 5 ml) durante 10 minutos.
Se retiraron los disolventes mediante filtración y se lavó la resina
con DMF (6 x 5 ml), diclorometano (6 x 5 ml), éter 2 x 4 ml). La
resina se suspendió en DMF (5 ml) y diclorometano (5 ml) y se añadió
el engarce ácido Rink (0,92 g, 1,62 mmoles), seguido de PyBOP (0,84
g, 1,62 mmoles) y HOBT (0,22 g, 1,62 mmoles). Después de 4 minutos
se añadió base de Hünig (0,42 g, 3,24 mmoles). Se agitó la reacción
con nitrógeno durante 3 horas y después se lavó la resina con
diclorometano (6 x 5 ml), DMF (6 x 5 ml), diclorometano (6 x 5 ml),
éter (2 x 3 ml) y se secó a vacío para proporcionar la resina de
sulfonamida 7 (1,02 mg, 98%) en forma de un sólido amarillo; el
ensayo de Kaiser fue negativo; el ensayo con azul de bromofenol fue
negativo; la carga de resina 94% se estimó mediante la escisión
cuantitativa del grupo Fmoc.
La resina (7) (70 mg, 0,02 mmoles) se trató con
piperidina al 20% en solución de DMF (2 x 1 ml) durante 10 minutos.
Se retiraron los disolventes mediante filtración y se lavó la resina
con DMF (6 x 1 ml), diclorometano (6 x 1 ml), éter (2 x 1 ml). La
resina se suspendió en DMF (0,5 ml) y diclorometano (0,5 ml) y se
añadió el ácido apropiado (8a-d) (0,15 mmoles)
seguido de PyBOP (0,08 g, 0,15 mmoles) y HOBT (0,02 g, 0,15 mmoles).
Después de 4 horas se añadió base de Hünig (0,04 g, 0,30 mmoles). Se
agitó la reacción con nitrógeno durante 3 horas y después la resina
se lavó con diclorometano (6 x 1 ml), DMF (6 x 1 ml), diclorometano
(6 x 1 ml), éter (2 x 1 ml) y se secó a vacío para proporcionar las
resinas de sulfonamida 9a-d en forma
de un sólido amarillo; el ensayo de Kaiser y el ensayo con azul de
bromofenol fueron negativos en los cuatro casos.
Una pequeña muestra de cada una de las cuatro
resinas se trató con DBU/mercaptoetanol en acetonitrilo para liberar
10a-d que se analizaron mediante
espectrometría de masas de baja resolución y RP-HPLC
(procedimiento A):
10a (R' = Z-Gly-) EM
(electropulverización + ve) m/z 961 y 963 (MH)^{+}; HPLC,
R_{t} 4,01 minutos.
10b (R' = Boc-Abu-) EM
(electropulverización + ve) m/z 955 y 957 (MH)^{+}; HPLC,
R_{t} 4,09 minutos.
10c (R' = 1-naftilacetoílo) EM
(electropulverización + ve) m/z 938 y 939 (MH)^{+}; HPLC,
R_{t} 4,28 minutos.
10d (R' = Boc-Phe-) EM
(electropulverización + ve) m/z 1017 y 1019 (MH)^{+};
HPLC, R_{t} 4,42 minutos.
La resina (9a-d) (70 mg, 0,02
mmoles) se trató con 10% de hidrazina en solución de DMF (3 x 1 ml)
durante 30 minutos. Se retiraron los disolventes mediante filtración
y se lavó cada resina con DMF (6 x 1 ml), éter (2 x 1 ml). Después a
cada porción de resina se añadió cloruro de dansilo (40 mg, 0,15
mmoles) y trietilamina (15 mg, 0,15 mmoles) en diclorometano (1 ml).
Después de 4 horas de tiempo de reacción las resinas se lavaron con
diclorometano (6 x 1 ml), DMF (6 x 1 ml), diclorometano (6 x 1 ml),
éter (2 x 1 ml) y se secó a vacío para proporcionar las resinas
de sulfonamida 11a-d en forma de un sólido
amarillo; el ensayo de Kaiser y el ensayo con azul de bromofenol
fueron negativos en los cuatro casos.
Una pequeña muestra de cada una de las cuatro
resinas se trató con DBU/mercaptoetanol en acetonitrilo para liberar
12a-d que se analizaron mediante
espectrometría de masas de baja resolución y RP-HPLC
(procedimiento B):
12a (R' = Z-Gly-) EM
(electropulverización + ve) m/z 1030 y 1032 (MH)^{+}; HPLC,
R_{t} 4,77 minutos.
12b (R' = Boc-Abu-) EM
(electropulverización + ve) m/z 1024 y 1026 (MH)^{+};
HPLC, R_{t} 4,94 minutos.
12c (R' = 1-naftilacetoílo) EM
(electropulverización + ve) m/z 1007 y 1009 (MH)^{+};
HPLC, R_{t} 5,47 minutos.
12d (R' = Boc-Phe-) EM
(electropulverización + ve) m/z 1086 y 1089 (MH)^{+};
HPLC, R_{t} 5,82 minutos.
De los ejemplos anteriores se puede ver que la
inclusión de un cromóforo de UV, y un grupo sensible de
espectrometría de masas en las construcciones permite que se acometa
un análisis rápido y sencillo cualitativo y cuantitativo de los
productos de una síntesis en fase sólida mediante procedimientos
sencillos y bien establecidos de HPLC en combinación con la
detección por UV y espectrometría de masas.
Claims (49)
1. Una construcción química para uso en síntesis
en fase sólida que comprende un soporte sólido Q que tiene unido a
él mediante un grupo conector Y un sustrato R; el grupo conector Y
teniendo un primer y un segundo sitios de escisión que se pueden
escindir ortogonal y selectivamente; el segundo sitio de escisión
pudiéndose escindir selectivamente para liberar el sustrato; y el
primer sitio de escisión estando localizado en una posición entre el
segundo sitio de escisión y el soporte sólido y pudiéndose escindir
selectivamente para liberar un fragmento Fr que comprende el
sustrato y al menos una porción del grupo de conexión Y;
caracterizada porque la escisión del esqueleto de la
construcción en el primer sitio de escisión forma o introduce en el
fragmento Fr químico en el primer sitio de escisión un resto que
comprende un grupo sensible G que sensibiliza el fragmento Fr para
el análisis instrumental, por ejemplo, análisis de espectroscopia de
masas.
2. Una construcción química según la
reivindicación 1 en la que el fragmento químico Fr contiene un
medio de impartir una firma característica del espectro de masas del
fragmento.
3. Una construcción química según la
reivindicación 2 en la que la firma característica se proporciona
mediante la incorporación en el fragmento Fr un marcador isotópico
de división de picos.
4. Una construcción química según la
reivindicación 3 en la que el marcador isotópico de división de
picos está determinado por uno o más pares de isótopos seleccionados
de ^{1}H/^{2}H (D), ^{79}Br/^{81}Br, ^{12}C/^{13}C,
^{14}N/^{15}N y ^{16}O/^{18}O.
5. Una construcción química según una cualquiera
de la reivindicaciones 2 a 4 en la que los medios para dar a
conocer una firma característica para el espectro de masas del
fragmento se localiza entre el primer y segundo sitios de
escisión.
6. Una construcción química según una cualquiera
de la reivindicaciones precedentes en la que el primer y segundo
sitios de escisión se definen mediante el primer y segundo grupos de
engarce L^{1} y L^{2}.
7. Una construcción química según la
reivindicación 6 en la que un grupo espaciador A se interpone entre
los dos grupos de engarce L^{1} y L^{2}, el grupo espaciador A
conteniendo medios para dar a conocer una firma característica al
espectro de masas del fragmento Fr como se ha definido en una
cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.
8. Una construcción química según la
reivindicación 7 en la que el grupo de conexión Y tiene la fórmula
L^{1}-A-L^{2}.
9. Una construcción intermedia química según la
reivindicación 8 en la que el grupo A tiene la fórmula general
NH-Alc-NH-X^{1} en
la que X^{1} es hidrógeno o un grupo arilo, y Alc es un grupo
alquileno.
10. Una construcción química según una
cualquiera de la reivindicaciones precedentes en la que el grupo
sensible G es un grupo que se puede ionizar en condiciones de
espectrometría de masas.
11. Una construcción química según la
reivindicación 10 en la que el grupo G se puede ionizar para formar
un ion positivo en condiciones de espectrometría de masas, por
ejemplo condiciones de espectrometría de masas por
electropulverización.
12. Una construcción química según una
cualquiera de las reivindicaciones en la que el grupo G es un grupo
amino básico.
13. Una construcción química según la
reivindicación 12 en la que el grupo amino básico es un grupo amino
primario.
14. Una construcción química según la
reivindicación 12 en la que el grupo amino básico es un grupo amino
terciario.
15. Una construcción química según la
reivindicación 14 en la que el grupo amino terciario es un grupo
amino cíclico.
16. Una construcción química según la
reivindicación 15 en la que el grupo amino cíclico es
N-metilaminopiperazino.
17. Una construcción química según la
reivindicación 12 o reivindicación 13 en al que el grupo amino
básico se deriva de la escisión fotoquímica de un grupo
carbamato.
18. Una construcción química según una
cualquiera de las reivindicaciones 3 a 17 en la que el marcador
isotópico de división de picos está contenido en un grupo
alquilendiamina sustituido o no sustituido.
19. Una construcción química según la
reivindicación 18 en al que el grupo alquilendiamina se sustituye
con un grupo N-bencilo.
20. Una construcción química según la
reivindicación 19 en la que el grupo N-bencilo
tiene un grupo metileno que se sustituye con el átomo de deuterio de
división de picos.
21. Una construcción química según una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que el primer
sitio de escisión se puede escindir selectivamente mediante un tipo
de química seleccionada de un grupo de químicas que consisten en la
escisión en condiciones ácidas, escisión catalizada por bases,
escisión oxidante, oxidación reductora, desplazamiento nucleofílico,
escisión por 1,2 bis nucleófilos, desplazamiento
electrofílico, y escisión fotoquímica y enzimática, y el segundo
sitio de escisión se puede escindir selectivamente mediante un tipo
diferente de química seleccionada de dicho grupo.
22. Una construcción química según la
reivindicación 21 en la que el primer sitio de escisión es
escindible por un tipo de química seleccionado entre:
- (i)
- escisión fotoquímica, por ejemplo escisión de un grupo carbamato de nitrobencilo.
- (ii)
- oxidación seguida de la escisión mediante desplazamiento nucleofílico, por ejemplo oxidación de una tiopirimidina seguido de desplazamiento nucleofílico por una amina (por ejemplo, una amina secundaria tal como N-metilpiperazina.
- (iii)
- escisión de una sulfonamida por desplazamiento nucleofílico, por ejemplo por un nucleófilo de tiolato (por ejemplo mercaptoetanol I en presencia de una base fuerte tal como DBU).
- (vi)
- escisión de grupos enamina (particularmente los que contienen un resto enamina conjugado a un grupo carbonilo; por ejemplo, como 1-[4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno]etilamino) con un 1,2-bis nucleófilo tal como hidrazina o hidroxilamina o derivados de los mismos; y
- (vii)
- escisión catalizada por metales de transición de grupos aliloxicarbonilamino, por ejemplo, escisión catalizada por paladio (0) de grupos aliloxicarbonilamino.
23. Una construcción química según la
reivindicación 22 en la que el segundo sitio de escisión se escinde
en condiciones ácidas o mediante fotólisis.
24. Una construcción química según la
reivindicación 21 o reivindicación 22 en la que el primer sitio de
escisión se define mediante un grupo de engarce de sulfonamida, y el
segundo grupo de escisión se define opcionalmente por un grupo, tal
como un engarce Rink, que se puede escindir en condiciones
ácidas.
25. Una construcción química según la
reivindicación 21 o reivindicación 22 en la que el primer sitio de
escisión se define mediante un engarce de tiopirimidina susceptible
a escisión mediante oxidación seguida de desplazamiento
nucleofílico, y el segundo grupo de escisión se define opcionalmente
por un grupo, tal como un engarce Rink, que se puede escindir en
condiciones ácidas.
26. Una construcción química según la
reivindicación 21 o reivindicación 22 en la que el primer sitio de
escisión se define por un grupo dde y el segundo grupo de escisión
se define opcionalmente por un grupo, tal como un engarce Rink, que
se puede escindir en condiciones ácidas.
27. Una construcción química según la
reivindicación 21 o reivindicación 22 en la que el primer sitio de
escisión se puede escindir en condiciones fotoquímicas y el segundo
grupo de escisión se define por un grupo, tal como un engarce Rink,
que se puede escindir en condiciones ácidas.
28. Una construcción química según la
reivindicación 21 o reivindicación 22 en la que el primer sitio de
escisión se define por un grupo tal como aliloxicarbonilamino que se
puede escindir mediante un metal de transición tal como paladio (0),
y el segundo grupo de escisión se define opcionalmente por un grupo,
tal como un engarce Rink, que se puede escindir en condiciones
ácidas.
29. Una construcción química según la
reivindicación 21 o reivindicación 22 en la que el primer sitio de
escisión se escinde mediante oxidación seguida de desplazamiento
nucleofílico.
30. Una construcción química según la
reivindicación 29 en la que el nucleófilo es una amina.
31. Una construcción química según la
reivindicación 30 en la que la amina es una amina cíclica tal como
piperidina.
32. Una construcción química según una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que el
fragmento Fr contiene un cromóforo C^{u} que facilita el análisis
del fragmento Fr mediante espectrofotometría ultravioleta, visible o
de fluorescencia.
33. Una construcción química según la
reivindicación 32 en la que el cromóforo C^{u} tiene un valor de
log E_{max} principal de al menos 2,5.
34. Una construcción química según la
reivindicación 33 en la que el valor de log E_{max} principal es
al menos 1,5 veces mayor que el log E_{max} principal del
sustrato R.
35. Una construcción química según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 34, la construcción comprendiendo un
soporte sólido Q que tiene unido a él mediante el grupo de conexión
Y el sustrato R en el que el fragmento Fr comprende el sustrato y
al menos una porción del grupo de conexión Y, y dicha porción
contiene un cromóforo C^{u} que facilita el análisis del fragmento
Fr^{u} mediante espectroscopia UV, visible o de fluorescencia, el
cromóforo C^{u} teniendo un valor de log E_{max} principal de
al menos 2,5 y en la que (i) el valor de log E_{max} principal es
al menos 1,5 veces mayor que el de log E_{max} principal del
sustrato R; o (ii) el cromóforo C^{u} tiene un pico de absorción
a una longitud de onda apartada de las absorciones debidas al
sustrato R.
36. Una construcción química según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35 que comprende un soporte
sólido Q que tiene unido a él mediante el grupo de conexión Y el
sustrato R en el que el fragmento Fr comprende el sustrato y al
menos una porción del grupo de conexión Y, y dicha porción contiene
un cromóforo C^{u} que facilita el análisis del fragmento Fr^{u}
mediante espectroscopia UV, visible o de fluorescencia, en la que
las características de absorción del cromóforo C^{u} y el sustrato
R son tales que a una longitud de onda de medición, cualquier
error en la medición de la calidad del sustrato R (o cualquier
fragmento o construcción que contiene el fragmento) que surge de
cualquier superposición entre las bandas de absorción debidas al
cromóforo y bandas de absorción debidas al sustrato R son menor de
10%, preferiblemente menor de 5%.
37. Una construcción química según una
cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36 en la que el cromóforo es
un grupo que contiene un grupo arilo.
38. Una construcción química según la
reivindicación 37 en la que el grupo arilo es un grupo arilo
policíclico condensado, en el que uno o más átomos de carbono del
anillo se reemplazan opcionalmente con un heteroátomo.
39. Una construcción química según la
reivindicación 38 en la que el grupo arilo policíclico condensado
se selecciona del grupo constituido por grupos naftilo,
fenantrenilo, y antracenilo.
40. Una construcción química según la
reivindicación 39 en la que el grupo arilo policíclico condensado
es un grupo antracenilo.
41. Una construcción química según la
reivindicación 39 en la que el grupo arilo policíclico condensado
es un grupo dansilo
(1-dimetilamino-5-naftilsulfonilo).
42. Un procedimiento de análisis de las
construcciones de una cualquiera de la reivindicaciones anteriores;
el procedimiento comprendiendo la escisión de la construcción en el
primer sitio de escisión para liberar el fragmento químico Fr, la
reacción de escisión generando sobre el fragmento químico Fr en el
sitio de escisión un grupo que comprende un grupo sensible de
espectrometría de masas G (por ejemplo, un grupo que se puede
ionizar en condiciones de espectroscopia de masas) y después
sometiendo el fragmento químico a espectrometría de masas, por
ejemplo espectrometría de masas por electropulverización.
43. Una construcción química intermedia para uso
en la preparación de una construcción química como se ha definido
en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, la
construcción química teniendo la fórmula Q-Y' en la
que Y' es una forma reactiva o protegida del grupo Y, y Q e Y son
como se ha definido en esta memoria descriptiva anteriormente.
44. Una construcción intermedia de fórmula
Q-L^{1}-A^{p} en la que Q y
L^{1} son como se ha definido en las reivindicaciones precedentes
y A^{p} es una forma reactiva o protegida del grupo espaciador A
que contiene un marcador isotópico de división de picos.
45. Una construcción intermedia según la
reivindicación 44 que tiene la fórmula general
Q-L^{1}-NH-Alc-NH-X^{1}
en la que X^{1}es hidrógeno o un grupo aralquilo, y Alc es un
grupo alquileno.
46. Un procedimiento de análisis del fragmento
Fr derivado de una construcción química según cualquiera de las
reivindicaciones 32 a 41 que comprende someter el fragmento Fr a
análisis por espectrofotometría ultravioleta, visible o de
fluorescencia para cuantificar el sustrato R.
47. Un procedimiento de identificar un sustrato
farmacéuticamente útil que comprende la preparación de una
biblioteca que contiene una pluralidad de construcciones químicas
como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, y sometiendo la biblioteca a un ensayo biológico para
identificar sustratos biológicamente activos.
48. Un procedimiento según la reivindicación 47
que incluye la etapa adicional de formular un sustrato
biológicamente activo así identificado con un vehículo
farmacéuticamente aceptable para formar una composición
farmacéutica.
\newpage
49. Un procedimiento según la reivindicación 48
que incluye la etapa adicional de formular un sustrato
biológicamente activo así identificado con un vehículo
farmacéuticamente aceptable para formar una composición
farmacéutica.
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