CN104520315A - Perforin 2 对侵袭性且多药耐受的病原体的防御 - Google Patents

Perforin 2 对侵袭性且多药耐受的病原体的防御 Download PDF

Info

Publication number
CN104520315A
CN104520315A CN201380033237.3A CN201380033237A CN104520315A CN 104520315 A CN104520315 A CN 104520315A CN 201380033237 A CN201380033237 A CN 201380033237A CN 104520315 A CN104520315 A CN 104520315A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
perforin
activity
expression
molecule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380033237.3A
Other languages
English (en)
Inventor
L·德阿马斯
K·利亚皮切夫
R·麦科马克
E·波达克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Miami
Original Assignee
University of Miami
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Miami filed Critical University of Miami
Publication of CN104520315A publication Critical patent/CN104520315A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A01K2217/077—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out heterozygous knock out animals displaying phenotype
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0337—Animal models for infectious diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)

Abstract

Perforin-2(P2)由成纤维细胞、小胶质细胞以及巨噬细胞表达并发现可负责杀死细菌，例如，耻垢分枝杆菌(Mycobacteria smegmatis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、沙门氏菌(Salmonellae)、MRSA(耐药性葡萄球菌(Stapholococci))、大肠杆菌(E coli)。由筛选检测鉴定出的化合物，是基于这些化合物对P2的作用进行选择的。本发明还涉及这些化合物在用于治疗感染性疾病，特别是治疗细菌以及抗生素耐受的细菌中的用途。

Description

PERFORIN 2 对侵袭性且多药耐受的病原体的防御
对通过EFS-Web提交的作为文本文件的序列表的引用
遵照美国信息交换标准编码(ASCII)，与本说明书一起作为文本文件通过EFS-Web提交了序列表的正式文本，其文件名为“430333seqlist.txt”，创建于2013年3月12日，并且大小为2KB。通过EFS-Web提交的所述序列表是本说明书的一部分并且通过整体引用并入本申请。
联邦资助声明
本发明是在国家卫生研究院授予的拨款号CA109094的政府支持下完成的。美国政府具有本发明的某些权利。
发明领域
本发明涉及抗生素以及药物开发领域。更具体地，其涉及有利于增强机体针对微生物感染的天然防御能力的方法及化合物。
背景技术
Perforin是在CD8T细胞及NK细胞颗粒中发现的细胞溶解蛋白。在脱颗粒时，perforin将其自身插入靶细胞的质膜，形成孔。发明人的实验室对Perforin的克隆(Lichtenheld,M.G.,et al.,1988.Nature 335:448-451；Lowrey,D.M.,et al.,1989.Proc Natl Acad Sci USA 86:247-25 1)and by Shinkai et al(Nature(1988)334:525-527)证明了补体成分C9与perforin的假定的同源性(DiScipio,R.G.,et al.,1984.Proc Natl Acad Sci USA81:7298-7302)。
Perforin-1与Perforin-2(P2)两者都是孔形成物，其作为亲水的、水溶性的前体被合成。两者都能插入脂双层并在其中进行多聚化，以形成大的充水的跨膜孔。充水的孔由圆柱体蛋白多聚体形成。
所述圆柱体内部必然具有亲水性表面，因为它形成了充水的孔；而圆柱体外部需要呈疏水性，因为它锚定于脂质核心体中。所述核心体结构被认为是由两亲性螺旋体(螺旋转角螺旋)形成的。正是这部分被称为MAC-Pf(膜攻击复合物/Perforin)结构域的蛋白结构域，在Perforin与C9及其它形成补体的膜攻击复合物(MAC)的 补体蛋白间最保守。
Spilsbury最先描述了(Blood(1995)85:1620-1629)在人类和鼠类巨噬细胞(称之为Mpg 1或Mpeg 1巨噬细胞表达基因)中表达的mRNA，其预测具有MAC/Pf结构域的蛋白。随后，发现相同的mRNA(命名为MPS-1)在实验朊病毒疾病中上调。利用2D-凝胶电泳及质谱法，Desjardin的团队分析了从喂有乳胶珠的巨噬细胞中分离的吞噬体膜的蛋白组分(J Cell Biol 152:165-180,2001)。这些作者发现了与MPS-1蛋白对应的蛋白质点。Mah等分析了鲍鱼软体动物并在其血液中发现了与Mpeg1基因家族同源的mRNA(Biochem Biophys Res Commun 316:468-475,2004)，并提示预测的蛋白具有与CTL perforin相似的功能，不同之处在于它是软体动物先天性免疫系统的一部分。
发明概述
本申请描述了涉及调节P2表达或活性的组合物及方法，包括那些对治疗微生物感染有益的组合物及方法。
附图简述
图1A-1C显示了Perforin-2增强ROS和NO的杀菌作用。用10mM NAC阻断ROS、用10mM L-NAME阻断NO、或用3种P2特异性的siRNA池阻断P2，都抑制了细胞内的杀伤作用。如图2A-2F所示开展了庆大霉素保护试验。在转染了P-2siRNA或杂乱(scramble)siRNA后24h，用(图1A)大肠杆菌、(图1B)鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimuriu)或(图1C)耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)感染了PEM。在感染前1h加入了抑制剂并在测试期间保持。于感染后1h和5h裂解了细胞并确定了CFU。显示的数据代表了重复2次的3个实验；星号代表基于学生t检验的显著性(p<0.05)。
图2A-2F显示了Perforin-2是成孔蛋白。(图2A)P-2结构域的结构；TM，跨膜结构域；Cyto，胞质结构域。经中性钠磷钨酸负染的聚合perforin-2膜损伤的电镜照片。(图2B)膜结合的、聚合perforin-2的概观。需要注意的是，充满染液的孔的内径为9.2nm。(图2C)在更高放大倍数下观察到的不完全聚合的复合物(如箭头所示)。(图2D)箭头指向了较为罕见的、从斜位角度观察的聚-P2复合物斜视图，该成像描述了三维形状。(图2E，2F)膜相关的聚-P2的两种侧面图。(图2G)用铀酸盐对源自CTL 3的膜结合Perforin-1(P-1)进行了染色，用于比较，并且其放大倍数与图2A中 的Perforin-2相同；需要注意的是，与P-2的孔径(9.2nm)相比，P-1的孔径(16nm)更大。
图3A-3I显示了Perforin-2在巨噬细胞和小胶质细胞内杀死耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(S.aureus(MRSA))、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、鸟分枝杆菌(M.avium)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、以及大肠杆菌(E.coli)。如方法中所示，感染细胞，将其洗涤以去除残留的细胞外细菌，并加入庆大霉素。在所示时间裂解细胞并确定菌落形成单位(CFU)，以测量细胞内存活情况(图3A-3D)：在RAW、PEM以及BV-2小胶质细胞中，P-2siRNA池对P-2的抑制允许本该被杀死的病原性细菌在细胞内存活。(图3E)：P-2抑制，Western blot分析了在P-2siRNA处理后，P-2在RAW细胞内的蛋白表达。(图3F和3G)：与载体对照相比，过量表达P-2-RFP融合蛋白导致对细菌的杀伤作用增强。(图3H)：在巨噬细胞内抑制内源性P-2并用P-2-RFP融合蛋白进行补充，恢复了针对耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)的杀伤活性。(图3I)：用Western blot法分析了P-2-补充试验中，RAW细胞内P-2以及P-2-RFP的表达。显示的图表代表3个或更多的实验，每个实验设3个复孔。星号代表由学生t检验确定的显著性(p<0.05)差异。
图4A-4D显示了Perforin-2-GFP在巨噬细胞中的胞内定位。用P-2-GFP转染了RAW细胞，并于24h后固定、染色多种细胞器。P-2-GFP与ER(图4A)以及高尔基体膜和反面高尔基体管网状结构(图4B)共定位，但不与质膜(图4C)或溶酶体(图4D)共定位。图像中的下图以单独的彩图形式显示了叠加图(左图)中的所示区域。在该叠加图中，共定位显示为黄色。
图5A、5B显示了在RNA以及蛋白水平上对P-2的抑制进行定量。在图5A的RAW细胞以及图5B的PEM细胞内，将siRNA介导的P2抑制与杂乱siRNA对照进行比较。柱状图显示了用定量的TAQMANTM RT-PCR确定的在各种细胞内P-2相对的mRNA表达水平。将P-2的mRNA水平对GAPDH进行了基准化。Western blot分析显示了在处理组的样品中，蛋白水平与mRNA表达相对应。在转染后24hr收获了细胞，用于分析。
图6显示了ROS以及NO的抑制剂并非直接抑制细菌生长。在存在或不存在NAC(10mM)或L-NAME(10mM)的条件下，使大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、或耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)于IMDM+10％FBS中生长5小时。在培养基中加入抑制剂后1小时和4小时，用分光光度计在OD值为600nM的条件下， 测量细菌生长情况。
图7显示了Perforin-2在系统进化过程中的保守性。将来自多物种的预测性蛋白序列进行了比对(Vector NTI,Invitrogen)。MACPF和P-2的结构域用方框突出，用方框突出跨膜结构域并以黄色高亮显示。以粉色高亮和灰色高亮分别突出了胞质结构域中保守的酪氨酸和丝氨酸。红色字体以及黄色高亮表明所有物种间的一致性，蓝色高亮表明在四个或多个序列间的一致性，绿色表明保守性替换。
图8显示了对P-2-GFP的转染及蛋白表达的确认。用Western blot法分析了转染的P-2-GFP在293细胞内的表达；用针对P-2的胞质结构域制备的多克隆抗血清(P-2cyto)、市售的肽抗血清(P-2Abcam)、以及抗GFP的抗体，检测P-2-GFP。P-2-GFP迁移至约110kD预期大小的位置。
图9A-9D显示了在巨噬细胞、树突及小胶质细胞和细胞系中，P-2介导细胞内杀菌活性。在存在GM-CSF的条件下，使BMDM/DC从鼠类骨髓中分化10天，并随后用(图9A)LPS(1mg/ml)以及IFNγ(100U/ml)或(图9B)poly(I:C)(3mg/ml)对所得的BMDM/DC进行48hr的刺激。(图9C)用IFNγ(100U/ml)对BV2小胶质细胞进行24hr的刺激。(图9D)用LPS(1ng/ml)以及IFNγ(100U/ml)对RAW细胞进行24hr的刺激。于所示的时间点收获细胞，并用TAQMANTM RT-PCR分析P-2相对于GAPDH的信使表达。
图10A-10E显示了对P2的抑制抑制了细胞内杀菌活性。(图10A-10C)在MOI为10的条件下用耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、MRSA、以及鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)分别感染经P-2siRNA(虚线柱)或杂乱siRNA对照(实心黑柱)处理的RAW细胞。(图10D和10E)用P2siRNA或杂乱siRNA对照处理PEM以及BMDM/DC，并在MOI为10的条件下用耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)对其感染。于所示时间点，用庆大霉素保护试验确定存活的细胞内细菌，并用CFU检测进行计数。显示的图表代表每例细胞：细菌组合的至少3次实验。误差线代表2-3次重复产生的s.e.m.。星号代表利用学生t检验得到的显著性差异。
图11A-11F显示了P-2-RFP的过量表达提升细胞内杀伤活性。如材料与方法中所述，用包含所述P-2-RFP融合蛋白的载体(黑柱)或对照的空白载体(阴影柱)转染所示细胞，并在MOI为10的条件下用所示细菌感染所述细胞。于所示时间点对存活的细菌进行计数。显示的图表代表每例细胞：细菌组合的至少3次实验。误差线代表2-3次的技术重复产生的s.e.m.。星号代表利用学生t检验得到的显著性差异。
图12A，12B显示了P-2-RFP转染进内源性P-2抑制的细胞内，恢复了细胞内杀菌活性。如材料与方法中所述，将靶向P-2的3’UTR的siRNA和包含P-2-RFP融合蛋白的载体或单独的空白载体，共转染入BMDM/DC(图12A)或RAW细胞(图12B)，并用所示细菌感染该细胞。红线指示了与对照的RFP载体相比，P2RFP对细胞内细菌存活的效应；以及黑线代表与同实验中的杂乱siRNA对照相比，P2siRNA的处理(仅靶向3’UTR)对细菌存活的效应。误差线代表3-4次单独实验的s.e.m.，每次实验设2-3个复孔。
图13A-13C显示了P-2未与早期内涵体的标记物或细胞核共定位。(图13A)瞬时转染入RAW细胞并在其内表达的P2-GFP(左图)和GFP(右图)，两者的染色模式具有差异性。P-2-GFP不与(图13B)早期内涵体(EEA-1，红色)或(图13C)细胞核(Hoechst，红色)共定位。用Leica SP5倒置共聚焦显微镜，并在40X物镜下，采集了图像。
图14A-14J显示了1型以及2型干扰素上调Perforin-2的mRNA。用100U/ml的干扰素-α、干扰素-β、以及干扰素-γ对鼠类胚胎成纤维细胞(图14A)、结肠癌细胞系(图14B)、成肌细胞系(图14C)、以及卵巢细胞系(图14D)处理14小时。用1ng/ml LPS，10U/mlIL-1α，1ng/ml IL-1β，以及20ng/mL TNFα进行处理。用150U/ml的IFN-α，100U/ml的IFN-β以及IFN-γ处理人类胚胎肾细胞系(图14E)以及宫颈癌细胞系(图14F)。用100U/ml的鼠类干扰素-γ刺激BV2小胶质细胞系14小时，以上调P-2的mRNA以及蛋白质水平。用IFN-γ处理mEF 14小时(mEF)，或处理完后接着用25mM的MG-132(mEF+MG132)处理1小时(图14G)。对经所示的重组型人IFN处理过的人类原代角质形成细胞进行蛋白质表达分析(图14H)。用大肠杆菌(E.coli)或耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)处理mEF。于所示时间点，收获细胞，并用TAQMANTM PCR法分析P-2的mRNA水平并将其与未感染的对照组进行比较。(图14I)对mEF不刺激，或者经100U/ml的IFN-γ刺激14小时。在刺激之后，用耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)感染mEF，并于所示时间点分析菌落形成单位。
图15A-15F显示了在细菌上的聚-perforin-2孔。用鼠源干扰素-γ处理mEF 14小时，并随后用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(S.aureus)(图15A,15B)或耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)(图15D,15E)感染所述mEF。于感染后5小时，用去垢剂裂解mEF，收获完整的细菌并将其负染以进行透射电子显微镜检查。将过量表达的P-2cDNA的HEK293细胞膜进行加工，以作为阳性对照使用(图15C)。显示了位于大 肠杆菌(E.coli)上的补体孔的膜攻击复合物(MAC)，用于比较19(图15F)。
图16A-16L显示了抑制内源Perforin-2增强了细胞内的细菌生长。用P-2siRNA池，或P-2-RFP瞬时转染小鼠直肠癌CMT-93细胞。还转染并分析了杂乱siRNA或RFP，以分别用作P-2siRNA和P-2-RFP的对照。所有转染于感染前24小时进行。在感染前14小时，将细胞与100U/ml的物种特异性的IFN-γ孵育。于所示感染后的时间点，裂解细胞并铺板以进行CFU分析。(图16A-16D)用P-2siRNA转染mEF，并于感染前24小时补充siRNA耐受的P-2–RFP cDNA。于感染前14小时，加入干扰素γ。用处于后对数期的鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)感染mEF。于所示时间点裂解mEF并进行菌落形成单位分析。于感染前24小时，用物种特异性的P-2siRNA或杂乱siRNA转染小鼠星形胶质细胞(图16F)、人胰腺癌(图16G)、人膀胱癌(图16H)、小鼠成肌细胞(图16I)、人宫颈癌(图16J)、小鼠卵巢癌(图16K)、人脐带静脉内皮细胞(图16L)，并于感染前14小时，用物种特异性的IFN-γ刺激这些细胞。用所示细菌感染细胞，并于所示时间点裂解所述细胞以确定CFU。
图17A-17J显示了P-2提升细胞内细菌对溶酶体的易感性。(图17A-17C)由相位光学显微镜(放大倍数：50x)拍摄的、在Middlebrook 7H11琼脂板上铺板的耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)微菌落的代表性图像。(图17A)与mEF孵育前铺板的耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)(图17B)对用IFN-γ预活化的mEF感染5小时，在冰上对照(无溶菌酶)孵育30min然后铺板的耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)。(图17C)对用IFN-γ预活化的mEF感染5小时，在冰上用溶菌酶孵育30min然后铺板的耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)。(图17D)溶菌酶对于经耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)感染的mEF的效应的定量分析，百分数来自于在感染5小时之时的各个铺板样品。结果由5次实验组成，每次均进行了技术性重复。计数了1000个细菌，并在饱满形态与正常形态间进行区别，并显示饱满形态的细菌的百分比。(图17E-17G)：在感染前24小时，用杂乱siRNA(图17E)、P-2siRNA(图17F)、以及P-2-RFP(图17G)转染mEF，并用IFN-γ对所述mEF刺激14小时，随后用MRSA感染所述mEF。于所述时间点，裂解真核细胞以收获细胞内细菌，并将其分为六等份。对这些细菌裂解物的等份，一半用溶菌酶处理，剩余的给予缓冲液处理。在冰上处理30分钟以允许溶菌酶发挥活性之后，将细菌铺板以分析溶菌酶的作用。(图17H-17J)将杂乱siRNA(图17H)、P-2siRNA(图17I)、或P-2-RFP(图17J)瞬时转染小鼠直肠癌细胞系CMT-93，并用IFN-γ刺激所述细胞。处理之后，用耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)感染这些细胞。 于所示时间点，裂解所述真核细胞并分析溶菌酶介导的杀伤作用。
图18A-18I显示了在人体及小鼠组织中，可用1型及2型干扰素诱导产生P-2。(图18A-18D)经1型及2型干扰素处理后，可在结肠细胞癌(图18A)、黑色素瘤(图18B)、原代脑膜成纤维细胞(图18C)、原代星形胶质细胞(图18D)中诱导产生鼠类P-2mRNA的转录子。(图18E-18I)经1型及2型干扰素处理后，在膀胱癌(图18E,18F)、胰腺癌(图18G)、原代角质形成细胞(图18H)、以及脐带静脉内皮细胞(图18I)中诱导产生人P-2mRNA。
图19A-19G：显示了用P-2siRNA进行mRNA抑制的效率。在以下条件下，测量了P-2转录子：未转染、转染了P-2siRNA、或转染了杂乱siRNA。用100U/ml的IFN-γ对所有细胞刺激14小时。(图19A-19D)以下的小鼠细胞系为对siRNA处理后的P-2抑制的代表性取样。这些包括：mEF(图19A)、直肠癌(图19B)、脑膜成纤维细胞(图19C)、以及星形胶质细胞(图19D)。此外，以下的人细胞系也将作为使用人P-2特异性的siRNA进行P-2转录子抑制的代表性取样。这些包括HUVEC(E)、胰腺癌(图19F)、以及膀胱癌(图19G)。￥表明经过qRT-PCR 45个循环后，未检测出P-2转录子。
图20A,20B显示了对P-2的抑制使得细菌在细胞内的复制不受阻碍，这导致真核细胞死亡。用台酚蓝排除法确定经siRNA处理的mEF在被耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)感染后的绝对活细胞计数(图20A)和生存力(图20B)。显示的数据来自4次单独的实验。
图21A-21AF显示了对Perforin-2的抑制在多种细胞类型上增强细胞内细菌的生长。于感染前24小时，用P-2siRNA或杂乱siRNA瞬时转染以下细胞：(图21A-21C)鼠类C2C12成肌细胞、(图21D-21F)鼠类卵巢MOVAC 5009、(图21G-21I)人HeLa宫颈癌、(图21J-21L)人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)、(图21M-21P)鼠类卵巢MOVAC5447、(图21Q-21T)CT-26结肠癌、(图21U-21X)鼠类B16F10黑色素瘤、(图21Y-21AB)人MIA-PaCa-2胰腺癌、(图21AC-21AF)人UM-UC-9膀胱癌。于感染前14小时，将细胞与物种特异性的100U/ml的IFN-γ孵育。于所示感染后的时间点，裂解细胞并铺板以分析CFU。
图22A-22C显示了补充P-2恢复了内源P-2被抑制的细胞的杀伤活性。用P-2siRNA转染、并且用抗siRNA的P-2cDNA共转染的mEF细胞能够恢复针对(图22A)耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、(图22B)大肠杆菌(E.coli)、以及(图22C)MRSA的杀伤活性。
图23A-23C显示了单独的溶菌酶未降低CFU。处理了MRSA(Figure 23A)、大肠杆菌(E.coli)(Figure 23B)、以及耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)(Figure 23C)，以确定这些细菌各自对溶菌酶效应的易感性。三个分别的实验在在冰上孵育30分钟之前以及之后、在有或没有溶菌酶添加的条件下以CFU计数显示。
图24A-24L显示了溶菌酶增强Perforin-2的杀菌作用。Perforin-2能够调节溶菌酶针对之前无应答的细菌的杀菌活性。对于经大肠杆菌(E.coli)感染的mEF(图24A-24C)、经耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)感染的mEF(图24D-24F)、经大肠杆菌(E.coli)感染的CMT-93(图24G-24I)、以及经MRSA感染的CMT-93，溶菌酶呈现出增强的活性。
图25A-C显示了缺乏P-2导致致死性的细菌生长失控。(a)每天测量P-2+/+(□),P2-/-(□)以及P-2+/-(□)同窝小鼠体重。给予小鼠20mg的链霉素，并于24h后，经口胃管饲法给予105或102个鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)RL144。n＝10和15(分析方法：对每排数据进行多次非配对t检验)。(b)鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)自肠向血液、肝脏以及脾脏扩散(分析方法：Kruskal–Wallis检验)。(c)与siRNAP-2抑制的PEM(□)相比，在P2-/-基因型的PEM(□)中，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)的复制不受控制；如材料与方法中所述，进行了CFU检测(分析方法：非配对t＝检验)。
图26A-F显示了P-2被广泛表达，并且P-2针对鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)和鸟分枝杆菌(M.avium)、以及MRSA具有杀菌作用。(a).对来自人类血液的PMN以及巨噬细胞进行了Western blot分析，并对经siRNA处理的、HL60-来源的PMN进行了western blot分析以及CFU测试。如方法中所述，用所示细菌感染经P-2特异性的(□)以及杂乱对照的(□)siRNA转染的HL60/PMN细胞，并于所示时间分析了CFU。(b)对经IFN□诱导后用所示细菌感染的肠内皮CMT93细胞进行CFU测试。用P-2特异性的(□)或杂乱对照的(□)siRNA，连同P-2-RFP(□)或RFP(□)的质粒-cDNA，转染细胞，并于感染前用IFN-γ对所述细胞进行过夜刺激。(c)(d)在原代人脐带内皮细胞(HUVEC)或宫颈上皮细胞(HeLa)内，IFN-γ诱导的P-2杀死了耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)(及其它细菌—未在本申请中显示)。(e)P-2-RFP转染的RAW巨噬细胞中鸟分枝杆菌(M.avium)的彻底清除。(f)用P-2-RFP补充了MEF中内源性抑制的P-2。对经P-2siRNA和P-2-RFP转染并经IFN-γ活化、随后用沙门氏菌(Salmonella)感染的MEF进行CFU测试以及western blot分析；P-2siRNA+RFP(□)，P-2siRNA+P-2-RFP(□)，以及 杂乱siRNA+RFP(▲)。用t检验进行统计学分析。
图27A-E显示了细菌具有阻断P-2的机制。(a)沙门氏菌(Salmonella)阻断了初始MEF(未经IFN活化)内对P-2mRNA的诱导。在经所示的沙门氏菌(Salmonella)以及大肠杆菌(E.coli)菌株感染后，P-2mRNA的相对水平。(b)沙眼衣原体(C.trachomatis)阻断了HeLa细胞内由IFN-□介导的、对P-2mRNA表达的诱导。经氯霉素(Cm)处理的衣原体诱导了P-2mRNA。数据以来自3个重复性样品的均数±标准差给出。(c)肠致病性大肠杆菌(EPEC)若携带CIF质粒，能阻断P-2介导的杀伤作用。(d)切自未愈的慢性溃疡组织边缘的真皮及表皮上的P-2的信使水平。按照与慢性皮肤溃疡的距离，将所述皮肤样品一半分成邻近组，一半分成远距组，并描述了临近组P-2mRNA对远距组P-2mRNA水平的比值。用t检验进行了统计学分析；n＝10。
图28A-D显示了P-2易位至含有细菌的液泡。(a).蛋白质结构域的结构，预测的膜囊泡内P-2的跨膜方向，以及胞质结构域在哺乳动物种属间的序列保守性。(b)在经沙门氏菌(Salmonella)感染后5min，经P-2siRNA和瞬时P-2-GFP(绿色)转染的BV2细胞的代表性共聚焦图像；DNA经DAPI染色以假色白色显示。显示了代表整个细胞的三个的垂直的1.2μ的切片。(c)在大肠杆菌-GFP(绿色)感染5min的、经P-2siRNA和瞬时P-2-GFP(红色)转染的并随后固定及成像的BV2小胶质细胞的代表性共聚焦图像。(d)P-2-GFP在未被感染的细胞内定位于核周；显示了荧光图像以及对应的相位图像。
图29A-C显示了Perforin-2形成的孔。(a)poly-P-2孔在Hek-293细胞膜上的电子显微镜成像。白色箭头显示了典型的聚合环结构，充满染液的孔的内径为9.2±0.5nm。黑色箭头指向了聚合不完全且不规则的复合物。用中性钠磷钨酸盐进行了负染。(c,d)在感染了IFN-γ诱导的MEF细胞后，在耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)(c)以及MRSA(d)上的聚合化P-2膜损伤的电子显微镜图像。如方法中所述，分离了细菌膜，并对其进行负染以进行透射电子显微镜检测。白色箭头指向由白色窄界围绕的细菌细胞壁上环状黑色的、充满染液的孔，所述白色窄边推测是在聚合过程中的P-2形成的。黑色箭头指向不规则聚合物。
图30：(A)在直肠上皮癌细胞中的P-2siRNA抑制导致了鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA，临床分离株)和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的细胞内的复制；P-2-RFP的过量表达升高了对细胞内细菌的杀伤作用。(B)当内源性P-2被抑制时，转染P-2-RFP恢复了mEF内的杀伤活 性，而转染RFP无此效应。(C)用western blots法对P-2的抑制以及补充P-RFP进行检测。于感染前24小时，将特异性针对P-2的3’UTR的P-2-siRNA或杂乱siRNA，连同RFP或缺失内源性P-23’UTR的P-2-RFP，转染细胞。在-16h时，将细胞与100U/ml的IFN-γ孵育，以诱导产生P-2-RNA。在0h时，在MoI为30的条件下将细胞与细菌孵育1h，洗涤细胞以去除外部的细菌，并与庆大霉素一起再次铺板，以阻止细胞外细菌生长。于所示时间，用NP40裂解宿主细胞并在所述裂解物中确定CFU。需要注意的是，P-2siRNA对P-2的抑制升高了细胞内的CFU，表明P-2的阻断准许细菌复制并杀死宿主细胞(如本申请所示，沙门氏菌除外)。用P-2-RFP(P-2C端与RFP的融合物)而非RFP进行转染升高了对细胞内细菌的杀伤作用(左侧3图)，或者在当P-2被抑制时恢复P-2的活性。
图31：在P-2被抑制、并且只有ROS和NO存在(红色圆圈)的条件下，细胞内细菌的复制。当P-2、ROS以及NO都存在时，具有良好的杀伤作用(绿色球)。在P-2+NO(黑色实心三角)或P-2+ROS(菱形)条件下，杀伤作用呈中间水平。P-2抑制的效率(右图)。细胞：经IFN处理的、由巯基乙酸盐促发的腹膜巨噬细胞，以及鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)。
图32：(a)P-2-GFP、RASA2以及LC3-RFP共定位于被内吞的细菌上。顶端两图：IFN活化的BV2细胞经DAPI(DNA)、RASA-2抗体染色，并用P-2-GFP和LC3-RFP转染。所有其它图：BV2细胞以比例100:1感染鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)5min，并随后用多聚甲醛进行固定。荧光的标记分子如图中所示。需要注意一个细胞外细菌(箭头)以及若干被杀死的细胞内细菌(星号)如DAPI染色和P-2-GFP所示。RASA2与LC3-RFP共定位。(b)在对经IFN活化的BV-2细胞感染的5分钟内，P-2-RFP向包含大肠杆菌-GFP的液泡易位(相位图像中的箭头)。
图33：在转染了P-2-GFP并用RASA2抗体染色的未被感染的静息RAW细胞内，P-2与RASA2在核周膜内或核周膜上的共定位。
图34：(a)IFN对mEF的活化升高了P-2mRNA的表达(左图，Taqman PCR)并增强了针对分枝杆菌(Mycobacteria)的细胞内杀伤作用(右图，庆大霉素保护试验)。(b)活的野生型沙门氏菌(Salmonella)抑制了mEF内的P-2诱导。热灭活的和PhoP突变的沙门氏菌(Salmonella)，以及大肠杆菌(E.coli)K12，诱导产生P-2。感染mEF并于1h后洗涤并在庆大霉素中铺板。
图35：(a)siRNA对RASA2的抑制作用抑制了BV2对分枝杆菌(Mycobacteria) 的细胞内杀伤作用，并允许细胞内复制(实心柱)。(b)在转染了P-2-GFP的RAW细胞中，用抗GFP对P-2-GFP进行免疫沉淀，并捕获RASA2。
图36：mEF杀死了细胞内MRSA并产生了与真核细胞膜上的poly P-2类似的细胞壁损伤。左图：于感染后4小时，通过用去垢剂裂解mEF，获得了MRSA细胞壁；用甲酸双氧铀进行负染。右图：HEK293膜上的poly P-2复合物；用钠磷钨酸盐进行负染。比例尺：需要注意的是，细胞壁/细胞膜具有类似大小的孔径
图37：siRNA对Atg14L或P-2的抑制阻断了杀伤作用并使得细胞内细菌能够在BV2小胶质细胞内复制。用庆大霉素保护试验确定了对分枝杆菌(mycobacteria)的细胞内杀伤作用或其存活力。
图38：siRNA对(a)P-2,(b)Atg14L,(c)Atg16L,(d)Atg5的抑制使得沙门氏菌(Salmonella)能在mEF内复制。在mEF内，P-2抑制沙门氏菌(Salmonella)在细胞内的复制，当P-2被抑制时，沙门氏菌(Salmonella)可以复制。据报道，对自噬水平的抑制能产生同样的效应，这与我们在本申请中公开的数据是一致的。
图39：3-MA抑制了vps34并允许沙门氏菌(Salmonella)在mEF内产生与P-2抑制相似(a-c中的红线)的复制(c中的蓝线)。与杂乱siRNA(图a中的蓝色)相似，巴弗洛霉素(Bafilomycin)(图b中的蓝色)能抑制P-2介导的对沙门氏菌(Salmonella)的抑菌作用。
图40：Perforin-2作用机制的模型。
发明详述
定义
在详细描述本发明之前，给出以下定义，以说明并明确用于描述本申请中的发明的术语的含义及范围：
术语“调节”，意味着任何一种提及的活性被升高、增强、激动(作为激动剂发挥作用)、促进、上调、降低、减少、抑制、阻断、下调、或拮抗(作为拮抗剂发挥作用)。调节作用可以将活性相对于基线值“升高”或“上调”多于1倍、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍等。调节作用也可以将活性降低或下调至低于基线值。本申请所使用的“降低”或“下调”意味着相对于合适的对照，至少降低了1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。调节作用还可以将活性基准化至基线值。
本申请所使用的“药学上可接受的”成分/运载体等，是适合用于人类和/或动物、且 无过度的副作用(例如毒性、刺激、以及过敏反应)并相应具有合理的收益/风险比的一类成分/运载体等。 
本申请所使用的术语“安全并有效的量”是指在以本发明所述的方式使用时，能足以产生所需要的治疗性应答、且无过度的副作用(例如毒性、刺激、或过敏反应)并相应具有合理的收益/风险比的成分的量。“治疗有效量”是指本发明中能有效产生所需要的治疗性应答的成分的量。
本申请中互换使用术语“患者”或“个体”，所述术语是指治疗的哺乳动物受试者，优选人类患者。在一些情况下，本发明所述方法用于实验性动物中、兽医应用中(例如在猫、狗、马、牛、羊、及猪中)、以及在开发疾病的动物模型中(包括，但不限于，啮齿类动物(包括小鼠、大鼠、以及仓鼠)；以及灵长类动物)。
“治疗”是一种干预，意图防止疾病的病理或症状发展或改变。据此，“治疗”是指治疗性处理及预防性或防范性措施。
“靶分子”包括影响或调节Perforin-2的表达、功能或活性的任意分子。这包括例如表1中的分子，以及与那些尚待鉴定的分子。
依据本发明，在本领域的范围内，可以采用常规的分子生物学、微生物学、重组DNA、免疫学、细胞生物学以及其它相关技术。可参阅如下文献：如Sambrook et al.,(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,New York；Sambrook et al.,(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,New York；Ausubel et al.,eds.(2005)Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,NJ；Bonifacino et al.,eds.(2005)Current Protocols in Cell Biology.John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,NJ；Coligan et al.,eds.(2005)Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,NJ；Coico et al.,eds.(2005)Current Protocols in Microbiology,John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,NJ；Coligan et al.,eds.(2005)Current Protocols in Protein Science,John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,NJ；Enna et al.,eds.(2005)Current Protocols in Pharmacology John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,NJ；Hames et al.,eds.(1999)Protein Expression:A Practical Approach.Oxford University Press:Oxford；Freshney(2000)Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique.4th ed.Wiley-Liss；等等。以上列出的最新实验方案每年更新数次。
治疗性组合物 
实施方式涉及在体外以及在体内鉴定调节Perforin-2的表达、功能、或活性的化合物。所采取的途径之一是鉴定调节P2的表达、功能、或活性的分子。基于酵母杂交系统鉴定了这些分子，这在后面的实施例部分有详细描述。候选治疗剂对Perforin-2的表达、功能或任何活性的调节将有效地预防或治疗病原性生物感染，尤其是那些对抗生素已经发展出以及有可能发展出耐药性的生物，例如，细菌。
在一个实施方式中，公开了一种在体外或在体内调节Perforin-2(P2)的功能、活性、或表达的方法包括：在体外接触细胞或向患者施用有效量的至少一种试剂，所述试剂调节与P2的表达、功能或活性相关的一个或多个靶分子的功能、活性或表达。
在另一个实施方式中，公开了鉴定调节Perforin-2的表达、功能或活性的至少一种试剂的方法，包括：将表达与Perforin-2的表达、功能、或活性相关的一个或多个靶分子的细胞与所述的至少一种试剂接触；测定所述与Perforin-2的表达、功能、或活性相关的一个或多个靶分子的表达、功能、或活性；以及将所述一个或多个靶分子的表达、功能、或活性与对照组比较，其中，与所述至少一种试剂的接触调节所述一个或多个靶分子的表达、功能、或活性，从而鉴定调节Perforin-2的表达、功能或活性的试剂。
在一些实施方式中，所述与P2的功能、活性或表达相关的一个或多个靶分子包括：src、泛素结合酶E2M、GAPDH、P21RAS/gap1m、半乳凝集素3、泛素C(UCHL1)、蛋白酶、vps34、ATG5、ATG7、ATG9L1、ATG14L、ATG16L、LC3、Rab5、或上述分子的片段或相关分子。与所述靶分子相关的分子，可以是任何涉及这些靶分子参与的多种通路的细胞内分子，与这些分子、信号通路相关的分子，以及调节这些靶分子的转录和翻译的分子。
在其它实施方式中，所述至少一种试剂能上调与Perforin-2的表达、功能、或活性相关的一个或多个靶分子的表达、功能、或活性。或者，所述至少一种试剂下调与Perforin-2的表达、功能、或活性相关的一个或多个靶分子的表达、功能、或活性。
在一些实施方式中，通过施用所述至少一种试剂，能上调P2的表达、功能、或活性，所述试剂上调与P2的功能、表达或活性相关的所述一个或多个靶分子的功能、活性、或表达。
在一些实施方式中，通过施用所述至少一种试剂，能下调P2的表达、功能、或活性，所述试剂下调与P2的功能、表达或活性相关的所述一个或多个靶分子的功能、活性、或表达。
在一些情况下，可能需要上调一些所述的靶分子并抑制其它靶分子的功能、活性、或表达或使其保持不变。因此，在一些实施方式中，通过施用至少一种试剂来上调所述P2的表达、功能、或活性，所述试剂独立地上调或下调与P2的功能、表达、或活性相关的至少两种分子的功能、活性、或表达。
在其它实施方式中，通过施用至少一种试剂，下调所述P2的表达、功能、或活性，所述试剂能独立地上调或下调与P2的功能、表达、或活性相关的至少两种分子的功能、活性、或表达。
在另一实施方式中，通过施用至少两种试剂的组合，上调所述P2的表达、功能、或活性，所述试剂能独立地上调或下调与P2的功能、表达、或活性相关的至少两种分子的功能、活性、或表达。
在一些实施方式中，通过施用至少两种试剂的组合，下调所述P2的表达、功能、或活性，所述试剂能独立地上调或下调与P2的功能、表达、或活性相关的至少两种分子的功能、活性、或表达。
在其它实施方式中，对P2的表达、功能、或活性的调节包括施用能直接调节所述P2分子的表达、功能、或活性的试剂任选步骤。这样的分子，可以是那些抑制P2的转录或翻译的分子。例如，参见US专利公开号20090142768，其全部内容通过引用并入本申请。
在其它实施方式中，试剂包括：小分子、蛋白、肽、多肽、修饰的肽、修饰的寡核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、合成的分子、天然分子、有机或无机分子、或上述试剂的组合。
在其它方面，所述一个或多个与Perforin-2的表达、功能、或活性相关的靶分子来源于感染性生物。在一些实施方式中，所述感染性生物是细菌。在具体的实施方式中，所述细菌可以是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或大肠杆菌(Escherichia coli)。而在其它实施方式中，所述一个或多个靶分子可以是PhoP或脱酰胺酶。
在与Perforin-2的表达、功能、或活性相关的所述一个或多个靶分子来源于感染性生物的情形下，对一个或多个靶分子的表达、功能、或活性的下调作用，能上调Perforin-2的表达、功能、或活性。或者，对一个或多个靶分子的表达、功能、或活性的上调作用，能下调Perforin-2的表达、功能、或活性。
本发明的另一方面涉及筛选化合物或候选治疗剂的方法，所述化合物或候选治疗剂调节分子的表达、功能、或活性，进而调控Perforin 2的表达、功能、或活性。所述 化合物可以，例如，诱导细胞表达Perforin 2蛋白，允许所述P2蛋白组装，允许正确的组装，允许所述P2蛋白易位等。优选的候选治疗剂升高P2在免疫细胞例如巨噬细胞内的表达，从而增强它们的抗菌功效。
因此，这些实施方式涉及筛选化合物的方法，所述化合物能有效升高P2的表达、功能或活性，例如，提升细胞内P2mRNA的翻译。优选地，这样的化合物将靶向与P2相关的分子。在最基本形式下，这样的方法包括，将分别表达特定靶分子和内源性或外源性Perforin 2基因或cDNA的细胞暴露于待测化合物，并确定是否导致Perforin2蛋白产物的增加。
在一个实施方式中，鉴定候选治疗剂的方法包括：接触表达一个或多个靶分子的细胞，所述靶分子包括：src、泛素结合酶E2M、GAPDH、P21RAS/gap1m、半乳凝集素3、泛素C(UCHL1)、蛋白酶、或上述分子的片段；测量所述分子的表达、功能、或活性；将所述分子的表达、功能、或活性与对照比较。优选地，所述候选治疗剂调节一个或多个所述靶分子的表达、功能、或活性。在其它实施方式中，所述候选治疗剂调节多种靶分子的表达、功能、或活性。优选地，所述候选治疗剂上调一个或多个所述靶分子的表达、功能、或活性。在一些方面，所述候选治疗剂下调一个或多个所述靶分子的表达、功能、或活性。
在优选的实施方式中，对一个或多个靶分子的表达、功能、或活性的调节作用调节Perforin-2(P2)分子的表达、功能、或活性。优选地，对一个或多个靶分子的表达、功能、或活性的上调作用上调Perforin-2(P2)分子的表达、功能、或活性。在一些方面，对一个或多个靶分子的表达、功能、或活性的下调作用下调Perforin-2(P2)分子的表达、功能、或活性。
在另一个实施方式中，所述鉴定能调节Perforin-2的表达、功能、或活性的候选试剂的方法包括：使检测表面与一个或多个靶分子接触，所述靶分子包括src、泛素结合酶E2M(Ubc12)、GAPDH、P21RAS/gap1m(RASA2)、半乳凝集素3、泛素C(UCHL1)、蛋白酶、vps34、ATG5、ATG7、ATG9L1、ATG14L、ATG16L、LC3、Rab5、上述分子的片段或相关分子；将所述靶分子与一个或多个候选治疗剂接触并鉴定与一个或多个靶分子或其相关分子结合或杂交的试剂；以及检测所述一个或多个候选试剂对Perforin-2的表达、功能、或活性的调节作用，进而鉴定候选试剂。
一旦通过测量治疗剂在所述靶分子上的作用而认为该治疗剂是候选者，则将所述试剂针对Perforin-2分子进行进一步的筛选。这些可以是置于测试表面(如生物芯片)上的肽或寡核苷酸，或可以是表达P2的细胞的形式。优选的候选治疗剂上调P2分子的表达、功能、或活性，并且还升高对感染性生物(如细菌)的杀伤作用。在一些方面，被鉴定的候选治疗剂下调P2分子的表达、功能、或活性。
在其它实施方式中，所述检测P2分子的表达、功能、或活性的检测方法包括：细胞测试法、免疫测试法、酵母杂交系统测试法、杂交测试法、基于核酸的测试法、高通量筛选测试法或上述测试法的组合。在一些方面，还测试了所述被鉴定的候选剂对感染性生物(如细菌)的复制抑制，生长抑制，或死亡的作用。
在使用细胞的方法中，公开了对照细胞、包括一种或多种表达靶分子的载体的待测细胞、所述靶分子对其而言是内源性的细胞、具有Perforin 2表达载体的细胞、或上述细胞的任意组合。在这个方法中，将所述待测细胞与待测化合物接触，而对照细胞则不做此操作。当在没有待测化合物存在的条件下生长时，如果与对照细胞相比，所述待测细胞产生更多的报告蛋白，技术人员随即可将所述待测化合物鉴定为候选治疗剂，如果在鉴定潜在的或候选的治疗剂时将所述靶分子的表达作为输出读数参数的话。推断这样的待测化合物是有效的抗生素类或甚至抗癌类化合物，在机体抵抗微生物及肿瘤细胞时，所述化合物能增强机体自身的免疫系统。所述检测还可以包括在功能性水平进一步的确定，据此检测细胞针对与其共培养的微生物(如细菌)的杀伤作用的能力。
感染性细菌的例子包括但不限于：大肠杆菌(Escherichia coli)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、鸟胞内分枝杆菌(M.avium)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(BCG)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、卡他莫拉菌(Moraxella catharralis)，肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium  perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、多杀性巴氏杆菌(Pasturella multocida)、大肠杆菌(E.coli)和梅毒螺旋体(Treponema pallidum)；感染性真菌如：新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、白色念珠菌(Candida albicans)；以及感染性原生生物如：恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)和弓形虫(Toxoplasma gondii)；以及那些如引起组织胞浆菌病、念珠菌病、隐球菌病、芽生菌病和球孢子菌病(eocidiodomycosis)的感染性真菌；以及假丝酵母属多个转化型(即，白色假丝酵母、近平滑假丝酵母、克鲁斯氏假丝酵母、光滑假丝酵母、热带假丝酵母、或葡萄牙假丝酵母(C.lusitaniae)；球拟酵母属多个转化型(即，光滑球拟酵母菌多个转化型(T.glabrata))；曲霉属多个转化型(即，烟曲霉菌(A.fumigalus))，组织胞浆菌属多个转化型(即，荚膜组织胞浆菌)；隐球菌属多个转化型(即，新生隐球菌)；芽生菌属多个转化型(即，皮炎芽生菌(B.dermatilidis))；镰刀菌属多个转化型；毛癣菌属多个转化型，波氏假阿利什霉菌属，粗球孢子菌属，以及申克孢子丝菌属。
筛选试验
用于确定Perforin 2(P2)的表达、功能、或活性的药物筛选试验是基于鉴定能升高或降低P2抗菌作用的分子。因此，任何分子只要影响任意与P2相互作用并影响P2的抗菌活性的分子，都是能用于治疗的候选试剂。
在一个实施方式中，筛选过程包括将每个表达所述靶分子的细胞培养物与成员化合物的多样化库接触。所述化合物或“候选治疗剂”或“试剂”可以是任意有机的、无机的、小分子、蛋白质、抗体、适配体、核酸分子、或合成的化合物。
候选试剂包括多种化学类别，尽管通常它们是有机化合物(包括小分子有机化合物)、核酸(包括寡核苷酸)、以及肽。小分子有机化合物适宜地具有大于约40或50但小于约2500的分子量。候选试剂可以包含与蛋白质和/或DNA相互作用的官能化学基团。
候选试剂可获自多样来源，包括合成的或天然的化合物的文库。例如，有数种途径可用于随机及定向合成多种有机化合物及生物分子，包括表达随机的寡核苷酸。或者，可以获得或很容易地制得以例如细菌、真菌和动物提取物的形式呈现的天然化合物的文库。
化学文库：在组合化学方面的发展允许快速并经济地合成数百至数千种各异的化合物。这些化合物一般被排列在为有效筛选而设计的中等规模的小分子文库。可以使用组合 性的方法来产生适合鉴定新化合物的无偏文库。此外，可以产生更小的、多样化程度更低的文库，所述文库传承自生物活性已确定的单一的母体化合物。在上述任何一种情况下，由于缺乏有效的筛选系统来特异性地靶向由组合性化学方法产生的治疗相关性生物分子，例如，重要的酶的抑制剂，这阻碍了对这些资源进行最优化利用。
组合性化学文库是通过组合数个化学“积木”，例如反应物，经化学合成或生物合成而形成的多样的化学化合物的集合。例如，对于给定的化合物长度(即，多肽类化合物中的氨基酸数量)，通过以大量的组合形式、并几乎以每一种可能的方式，组合一组化学积木(氨基酸)，形成线性的组合化学文库，如多肽文库。通过对化学积木进行这样的组合性混合，可以生成百万级的化学化合物。
“文库”可以包括2至50,000,000种多样的成员化合物。优选地，文库包括至少48种多样化合物，优选96种或更多种多样的化合物，更优选384种或更多种多样的化合物；更优选地，文库包括10,000种或更多种多样的化合物，更优选超过100,000种多样的成员以及最优选大于1,000,000种多样的成员化合物。“多样的”意味着文库中有超过50％的所述化合物具有与所述文库的任何其它成员不一样的化学结构。优选地，文库中有超过75％的所述化合物具有与所述集合的任何其它成员不一样的化学结构，更优选超过90％以及最优选超过约99％。
组合性化学文库的制备是本领域技术人员所熟知的。对于综述，参见Thompson et al.,Synthesis and application of small molecule libraries,Chem Rev 96:555-600,1996；Kenan et al.,Exploring molecular diversity with combinatorial shape libraries,Trends Biochem Sci 19:57-64,1994；Janda,Tagged versus untagged libraries:methods for the generation and screening of combinatorial chemical libraries,Proc Natl Acad Sci USA.91:10779-85,1994；Lebl et al.,One-bead-one-structure combinatorial libraries,Biopolymers 37:177-98,1995；Eichler et al.,Peptide,peptidomimetic,and organic synthetic combinatorial libraries,Med Res Rev.15:481-96,1995；Chabala,Solid-phase combinatorial chemistry and novel tagging methods for identifying leads,Curr Opin Biotechnol.6:632-9,1995；Dolle,Discovery of enzyme inhibitors through combinatorial chemistry,Mol Divers.2:223-36,1997；Fauchere et al.,Peptide and nonpeptide lead discovery using robotically synthesized soluble libraries,Can J.Physiol Pharmacol.75:683-9,1997；Eichler et al.,Generation and utilization of synthetic combinatorial libraries,Mol Med Today 1:174-80,1995；and Kay et al.,Identification of enzyme  inhibitors from phage-displayed combinatorial peptide libraries,Comb Chem High Throughput Screen 4:535-43,2001。
还可使用其它化学剂来生成化学多样性的文库。这样的化学剂包括，但不限于，拟肽(PCT公开号WO 91/19735)；编码的肽(PCT公开号WO 93/20242)；随机的生物寡聚体(PCT公开号WO 92/00091)；苯二氮卓(U.S.专利号5,288,514)；变构体(diversomers),例如乙内酰脲、苯并二氮卓和二肽(Hobbs,et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,90:6909-6913(1993))；乙烯类似物(vinylogous)多肽类(Hagihara,et al.,J.Amer.Chem.Soc.114:6568(1992))；具有β-D-葡萄糖骨架的非肽类仿肽(Hirschmann,et al.,J.Amer.Chem.Soc.,114:9217-9218(1992))；小化合物文库的类有机合成物(Chen,et al.,J.Amer.Chem.Soc.,116:2661(1994))；寡聚氨基甲酸酯类(Cho,et al.,Science,261:1303(1993))；和/或肽基膦酸酯类(Campbell,et al.,J.Org.Chem.59:658(1994))；核酸文库(参见Ausubel,Berger and Sambrook,all supra)；肽核酸文库(参见，例如，美国专利号5,539,083)；抗体文库(参见，例如，Vaughn,et al.,Nature Biotechnology,14(3):309-314(1996)和PCT/US96/10287)；碳水化合物文库(参见，例如，Liang,et al.,Science,274:1520-1522(1996)和美国专利号5,593,853)；有机小分子文库(参见，例如，苯二氮卓,Baum C&E News,January 18,page 33(1993)；异戊二烯萜类(美国专利号5,569,588)；噻唑啉酮和间全氢噻口井酮(美国专利号5,549,974)；吡咯烷(美国专利号5,525,735和5,519,134)；吗啉化合物(美国专利号5,506,337)；苯二氮卓(美国专利号5,288,514)；等。
用于制备组合性文库的设备是市售的(参见如：357MPS,390MPS,Advanced Chem.Tech,Louisville Ky.,Symphony,Rainin,Woburn,Mass.,433A Applied Biosystems,Foster City,Calif.,9050Plus,Millipore,Bedford,Mass)。此外，众多组合性文库本身是市售的(参见如：ComGenex,Princeton,N.J.,Asinex,Moscow,Ru,Tripos,Inc.,St.Louis,Mo.,ChemStar,Ltd.,Moscow,RU,3D Pharmaceuticals,Exton,Pa.,Martek Bio sciences,Columbia,Md.，等)。
小分子：小分子测试化合物最初可以是有机的或无机的化学文库的成员。本申请所述的“小分子”是指有机的或无机的小分子，分子量低于约3,000道尔顿。所述小分子可以是天然产物，或是组合性化学文库的成员。一组多样性的分子应被用来涵盖多种功能，诸如电荷、芳香性、氢键、灵活性、尺寸、侧链长度、疏水性、以及刚性。适合用于合成小分子的组合性技术在本领域是已知的，如Obrecht和Villalgordo Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight  Compound Libraries,Pergamon-Elsevier Science Limited(1998)所做的示例，并包括那些诸如“裂池”或“平行”合成技术、固相和液相技术、以及编码技术(例如，参见Czarnik,Curr.Opin.Chem.Bio.,1:60(1997))。此外，一些小分子文库是市售的。
在优选的实施方式中，用高通量筛选在含有可被诱导的或不可被诱导的载体并表达一种或多种所述靶分子和/或P2的细胞上检测所述化合物。所述使用的细胞还可以是内源性表达所述靶分子和/或P2的细胞。所述报告分子可以是相同或不同的分子，但所述报告分子优选为不同的分子。
在另一方面，本发明涉及一种分析细胞的方法，包括提供包含多个细胞的位置的阵列，其中所述细胞包含一种或多种荧光分子或荧光素酶报告分子；在所述包含细胞的每个位置扫描多个细胞以得到来自所述细胞内的所述报告分子的信号；将所述信号转换成数字数据；并且利用所述数字数据来确定所述细胞内的所述报告分子的分布、环境或活性。
所述新药开发模式的一个主要组成是不断发展的荧光试剂以及发光试剂家族，所述试剂用以测量细胞内离子、代谢物、大分子、以及细胞器的时空分布，含量，以及活性。这些试剂的种类包括标记型试剂，其用以测量在活的以及被固定的细胞内的分子分布及数量；环境指示剂，其用以在时空上报告信号转导事件；以及荧光蛋白生物传感器，其用以测量活细胞内靶分子的活性。在单个细胞内结合多种试剂的多参数方式，是用于药物发现的有力的新工具。
这个方法依赖于荧光分子或发光分子针对特定细胞成分的高亲和力。所述针对特定成分的亲和力受控于物理力，例如离子相互作用、共价键(包括与基于蛋白的发色团、荧光团、以及发光团间的嵌合性融合)，还有疏水性相互作用，电势，以及在一些情况下的，在细胞成分内的简单滞留。所述发光探针可以是小分子，标记的大分子，或遗传改造的蛋白质，包括，但不限于绿色荧光蛋白嵌合体。
本领域技术人员会理解，本发明可使用很多种荧光报告分子，包括但不限于荧光标记的生物分子，如蛋白质、磷脂、RNA和DNA杂交探针。同样地，特别合成的具有特定结合或缔合的化学性质的荧光试剂已经被用作荧光报告分子(Barak et al.,(1997),J.Biol.Chem.272:27497-27500；Southwic430；Tsien(1989)in Methods in Cell Biology,Vol.29Taylor and Wang(eds.),pp.127-156))。荧光标记的抗体是特别有用的 报告分子，因为它们在如细胞或组织这样复杂的分子混合物中对单个分子靶点的结合具有高度的特异性。
所述发光探针可在活细胞内合成，或可通过若干非机械性模式(包括扩散、经促进的或主动转运、信号序列介导的转运、以及内吞性或胞饮性摄取)将其转运至所述细胞。还可利用本领域所公知的机械性批量装载方法，将发光探针装载入活细胞(Barber et al.(1996),Neuroscience Letters 207:17-20；Bright et al.(1996),Cytometry 24:226-233；McNeil(1989)in Methods in Cell Biology,Vol.29,Taylor and Wang(eds.),pp.153-173)。这些方法包括电穿孔及其它机械性方法如刮擦装载、珠球装载、冲击装载、注射器装载、高渗和低渗装载。此外，可将细胞进行遗传改造以表达与之前所述的目的蛋白偶联的报告分子，例如GFP(Chalfie and Prasher U.S.Pat.No.5,491,084；Cubitt et al.(1995),Trends in Biochemical Science 20:448-455)。
由于所述发光探针与所述靶结构域具有特异性且高亲和的相互作用，或由于诸如信号序列介导的转运等其它的分子靶向模式，发光探针一旦进入细胞，便在其靶结构域聚集。荧光标记的报告分子可用于确定所述报告子的位置、数量及化学环境。例如，可确定该报告分子是否处于亲脂性膜环境或者处于更加水性的环境(Giuliano et al.(1995),Ann.Rev.of Biophysics and Biomolecular Structure 24:405-434；Giuliano and Taylor(1995),Methods in Neuroscience 27.1-16)。可以确定所述报告子的pH环境(Bright et al.(1989),J.Cell Biology 104:1019-1033；Giuliano et al.(1987),Anal.Biochem.167:362-371)。可以确定具有螯合基团的报告子是否与离子结合，如Ca++(Bright et al.(1989),In Methods in Cell Biology,Vol.30,Taylor and Wang(eds.),pp.157-192；Shimoura et al.(1988),J.of Biochemistry(Tokyo)251:405-410；Tsien(1989)In Methods in Cell Biology,Vol.30,Taylor and Wang(eds.),pp.127-156)。
此外，生物体内的某些细胞类型可以包含能被特异性标记的成分，这些成分在其他细胞类型中可能不被标记。因此，可以将报告分子设计成不仅能标记特定细胞内的特定成分，还能在混合的细胞类型群体中标记特定的细胞。
本领域技术人员会理解测量荧光的多种方式。例如，一些荧光报告分子展现出激发光谱或发射光谱上的变化；一些展现出共振能量的转移，其中一个荧光报告子丢失荧光，而另一个则获得荧光；一些表现出荧光损失(淬灭)或荧光出现；而一些报告 旋转运动(Giuliano et al.(1995),Ann.Rev.of Biophysics and Biomol.Structure24:405-434；Giuliano et al.(1995),Methods in Neuroscience 27:1-16)。
整个程序可以是完全自动化的。例如，可以使用多个步骤完成对样品材料的取样，所述步骤包括从样品容器中抽取样品，并将所述抽取的样品的至少一部分加入待测细胞培养物中(例如，基因表达在其中被调控的细胞培养物)。取样也可包括额外的步骤，尤其优选样品制备步骤。在一种方式中，每次仅一个样品被抽取进入自动取样针，并且一次仅有一个样品在所述针内。在其他实施方式中，多个样品可被抽取进入所述自动取样针，之间以溶剂隔开。还在其他实施方式中，可以并行使用多个探针用于自动取样。
在通常情况下，可以以手动方式、半自动方式或以自动方式进行取样。可以手动从样品容器中抽取样品，例如，使用移液管或使用注射器型的手动探针，并随后将该样品手动递送至表征系统的装载端或注射端。在半自动方案中，所述方案的某些方面是自动进行的(例如，递送)，但某些其它方面需要人工干预(例如，从过程控制线抽取样品)。然而，优选以完全自动化的方式，例如，使用自动取样器，从样品容器中抽取所述样品(或某些样品)，并将其递送至所述表征系统。
根据本发明，使用一个或多个系统、方法、或其两者，鉴定多种样品材料。尽管手动化或半自动化的系统和方法都是可行的，优选采用自动化系统或方法。已有多种机器人或自动化系统，用于根据预定的方案，自动地或可编程地提供预定的动作进行处理、接触、分配、或对固体、流体、或气体形式的材料进行操作。可以调整或扩充这样的系统，使其包括多种硬件、软件或其两者，以协助所述系统确定材料的机械属性。用于扩充所述机器人系统的硬件和软件可以包括，但不限于传感器，换能器，数据采集及操作硬件，数据采集及操作软件等。CAVRO Scientific Instruments公司(例如，Model NO.RSP9652)或BioDot公司(Microdrop Model 3000)有市售的示例性的机器人系统。
通常，所述自动化系统包括合适的方案设计及执行软件，可以根据例如合成信息、组合信息、位置信息或其它根据底物定位的材料文库的相关信息，编码所述软件。所述方案设计及执行软件一般与控制机器人的机器人控制软件，或其它自动化装置或系统进行交互。所述方案设计及执行软件还与从应答测试硬件中收集数据的数据采集硬 件/软件进行交互。一旦将数据收集在数据库中，可使用分析软件来分析所述数据，并且更具体地，确定所述候选药物的属性；也可手动分析所述数据。
药物组合物 
本申请进一步涉及治疗患有受感染性疾病生物感染的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的试剂，所述试剂调节Perforin-2的表达、功能、或活性，或调节与Perforin-2的表达、功能、或活性相关的一个或多个靶分子的表达、功能、或活性。
在优选的实施方式中，治疗患有感染性疾病生物感染的患者的方法包括向所述患者施用治疗有效量的试剂，所述试剂调节一个或多个靶分子的表达、功能或活性，所述靶分子包括：src、泛素结合酶E2M(Ubc12)、GAPDH、P21RAS/gap1m(RASA2)、半乳凝集素3、泛素C(UCHL1)、蛋白酶、vps34、ATG5、ATG7、ATG9L1、ATG14L、ATG16L、LC3、Rab5、上述分子的片段或相关分子。
可以在本申请所公开的方法中使用src、泛素结合酶E2M(Ubc12)、GAPDH、P21RAS/gap1m(RASA2)、半乳凝集素3、泛素C(UCHL1)、蛋白酶、vps34、ATG5、ATG7、ATG9L1、ATG14L、ATG16L、LC3、Rab5、Perforin-2、或上述分子的任意相关分子的活性变体及片段。这样的活性变体可以包括与本申请公开的任意多种靶分子具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中所述活性变体保留生物学活性并因此调节Perforin-2的表达、功能或活性。
在另一优选的实施方式中，化合物包括本申请包含的所述方法鉴定的治疗剂。
本发明还包括含有一种或多种所述治疗剂的药物组合物。在一些实施方案中，所述组合物适于内部使用，并包括有效剂量的本发明所述的药理学活性的试剂，所述药理学活性试剂单独存在，或与一种或多种药学上可接受的运载体组合存在。所述试剂是特别有用的，因为它们即使具有毒性，也是非常低的。所述具有病理性的患者，例如，通过本发明所述的方法治疗的所述患者，可以是哺乳动物，尤其是人类。在实践中，所述试剂以足以发挥它们所需的生物学活性的量施用。
本发明的所述药物组合物可以包含例如一种以上的试剂，所述试剂可以彼此独立地作用于不同的靶分子。在一些实施例中，将包含本发明所述的一种或多种化合物的本发明所述的药物组合物，与另一个有用的组合物如抗炎剂、免疫刺激剂、化疗剂、 抗菌剂等，进行联合施用。此外，如上述，可将本发明所述的组合物与细胞毒性的、细胞抑制性的、或化学治疗性的试剂如烷基化剂、抗代谢剂、有丝分裂抑制剂或细胞毒性抗生素进行联合施用。一般情况下，可以在这样的联合中以目前可获得的剂型使用所述已知的治疗剂。
作为具体治疗方案的一部分，联合疗法(或“共同疗法”)包括施用治疗组合物以及至少一种第二试剂，旨在通过这些治疗剂的共同作用提供有益效果。所述联合的所述有益效果包括，但不限于，由联合治疗剂得到的药代动力学或药效学的共同作用。一般在明确的时间段内(通常为数分钟、数小时、数天或数周，取决于所选择的组合物)联合施用这些治疗剂。
虽然一般情况下并非如此，但是联合疗法还是可以囊括以下情况，即两种或多种这些治疗剂以单独的治疗方案施用但却巧合地和必然地导致本发明所述的联合。设计联合疗法以顺序的方式施用这些治疗剂，即，其中在不同的时间施用各个治疗剂，以及以基本同步的方式施用这些治疗剂，或至少施用所述治疗剂其中的两种。可以通过例如向所述受试者施用具有固定的各个治疗剂比例的单个胶囊，或者施用多个对应各个所述治疗剂的单个胶囊来实现基本同步的施用方式。对各个治疗剂的顺序施用或基本同步化的施用，可通过任何合适途径起作用，包括但不限于，局部途径、口服途径、静脉内途径、肌内途径，以及通过粘膜组织直接吸收的途径。可以相同途径或不同途径施用所述治疗剂。例如，可通过注射的方式施用选定组合的第一治疗剂，而用局部给药的方式施用所述组合的其它治疗剂。
可根据已知的制备药学上有用的组合物的方法配制所述试剂，由此在混合液中将所述化合物与药学上可接受的运载体载剂结合。通过将具有所需纯度的所述活性成分与任选的生理学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂混合(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))，以冻干制剂或水溶液的形式制备治疗性剂型，用于储存。可接受的运载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度时对接受者是无毒的，并且包括缓冲液体，例如磷酸盐、柠檬酸盐以及其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮、氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖以及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇类如甘露醇或山梨醇；形成盐的抗衡离子如钠离子；和/或非离 子表面活性剂如TWEENTM(ICI Americas Inc.,Bridgewater,N.J.)、PLURONICSTM(BASF Corporation,Mount Olive,N.J.)或PEG。
用于在体施用的所述剂型必须是无菌的并且是无热原的。在冻干以及重悬之前或之后，通过无菌滤膜的过滤，很容易实现这一点。
施用途径是与已知的方法一致的，例如，静脉注射或输注；腹膜内、脑内、肌内、眼内、动脉内或病灶内途径；局部施用；或通过缓释系统进行施用。
本发明的药物组合物的剂量以及所需的药物浓度可根据所设想的特定的使用而变化。确定施用合适的剂量或途径是在普通医师的能力范围内的。动物实验为确定用于人类治疗的有效剂量提供可靠的指导。可以遵照Mordenti,J.以及Chappell,W奠定的原则(“The use of interspecies scaling in toxicokinetics”In Toxicokinetics and New Drug Development,Yacobi et al.,Eds.,Pergamon Press,New York 1989,pp.42-96.)，对有效剂量进行物种间的放大。
本发明中用于口服施用的剂型可以以以下方式提供：离散单位，例如胶囊、扁囊剂或片剂，每种均包含预定量的所述活性试剂；粉末或颗粒；所述活性试剂在水性液体或非水性液体中形成的溶液或悬浮液；或水包油液体乳剂或油包水液体乳剂；或弾丸等。
对于用于口服施用的组合物(例如片剂或胶囊)，所述“可接受的运载体”术语包括载剂，例如常见的赋形剂如结合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、蔗糖以及淀粉；填充剂和运载体，例如玉米淀粉、明胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸二钙、氯化钠和褐藻酸；以及润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸钠及其它金属硬脂酸盐、硬脂酸甘油酯硬脂酸、硅油、滑石粉蜡、油和胶体二氧化硅。也可使用调味剂如薄荷、冬青油、樱桃调味剂等。可能需要加入着色剂以使剂型容易被识别。片剂也可通过本领域公知的方法对其进行包衣。
可以通过压制或模制，并伴有一种或多种任选的辅助成分，制成片剂。可通过在合适的机器中将所述活性试剂压缩成可自由流动的形式如粉末或颗粒，与结合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂任选混合，制备压缩片剂。可通过在合适的机器中，将经惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物进行成形，制备模 制片剂。对于所述片剂，可以任选地将其进行包衣或刻痕，并且可以将其制成能缓释或控释的活性试剂的形式。
适于口服施用的其它剂型包括将所述活性试剂包含在调味基质(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中的含片；将所述活性试剂包含在惰性基质(例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)中的锭剂；以及将所述活性试剂包含在合适的液体运载体中的漱口剂。
肠胃外剂型一般是无菌的。
控释或持续释放的组合物包括含于亲脂性贮库(如脂肪酸、蜡、油)中的剂型。本申请还包含了经聚合物(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)包衣的微粒组合物，以及与针对组织特异性受体、配体或抗原的抗体相偶联或与组织特异性受体的配体相偶联的所述化合物。本申请提及的对所述组合物的其它实施方式包括颗粒形式的保护性涂层，蛋白酶抑制剂或渗透增强剂，用于多种施用途径包括胃肠外途径、肺途径、鼻途径以及口服途径。
在施用时，化合物通常被快速地从粘膜表面或循环中清除，因此可引发相对短期的药理学活性。因此，可能需要频繁施用相对大剂量的生物活性化合物，以维持治疗效果。在静脉注射后，与水溶性聚合物如聚乙二醇、聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸共价连接修饰的化合物，与相应的未被修饰的化合物相比，在血液中表现出更长的半衰期。这样的修饰还能提升所述化合物在水溶液中的溶解性，消除聚集，增强所述化合物的物理和化学稳定性，并极大地降低所述化合物的免疫原性和反应性。其结果是，通过与所述未经修饰的化合物相比较低频率地或以较低剂量施用这样的聚合物-化合物结合体，就可获得所需的体内生物学活性。
所述足够的量可以包括但不限于，从约1μg/kg至约100μg/kg，从约100μg/kg至约1mg/kg，从约1mg/kg至约10mg/kg，从约10mg/kg至约100mg/kg，从约100mg/kg至约500mg/kg，或从约500mg/kg至约1000mg/kg。所述的量可以是10mg/kg。所述组合物的药学上可接受的形式包括药学上可接受的运载体。
制备包含活性成分的治疗性组合物是本领域所公知的。一般地，将这样的组合物制成递送至鼻咽的所述多肽的气溶胶，或者制成液体溶液或悬浮液形式的可注射剂； 然而，还能制成适于在注射前溶于或悬于液体的固体形式。也可将所述制剂进行乳化。通常将所述的活性治疗成分与药学上可接受的、并与所述活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂是，例如，水、生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合。此外，如果需要的话，所述组合物可以包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂，以增强所述活性成分的功效。
活性成分可以以中性的、药学上可接受的盐形式制剂成所述治疗性组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(由所述多肽的游离氨基基团形成)，其由无机酸(例如，盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。从所述游离的羧基基团形成的盐也可来源于无机碱，例如，钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，以及有机碱，如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
可以通过肠胃外途径，经粘膜途径如口服、鼻途径、肺途径，或者直肠途径，或者经皮途径，引入本申请所述的治疗性组合物的成分或多种成分。优选肠胃外施用途径，例如，通过静脉内注射，并且还包括但不限于，微动脉内、肌内、皮内、皮下、腹腔、心室内以及颅内施用。当在描述本发明公开的治疗性组合物时，使用的所述“单位剂量”术语是指物理上适合作为单一剂量用于人类的分散单位，每个单位包含预定量的经计算可与所需的稀释剂(即运载体或载剂)产生所需的治疗效果的活性材料。
在另一个实施方式中，可将所述活性化合物置于囊泡内，特别是脂质体，进行递送(参见Langer(1990)Science 249:1527-1533；Treat et al.,在Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein and Fidler(eds.),Liss,New York,pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein,同上.,pp.317-327中；一般参阅同上)。
而在另一个实施方式中，可用控释系统递送所述治疗性化合物。例如，可以使用静脉输注、可植入渗透泵、透皮贴剂、脂质体、或其它施用方式，施用所述蛋白。在一个实施方式中，可以使用泵(参见Langer,supra；Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201；Buchwald et al.(1980)Surgery 88:507；Saudek et al.(1989)N.Engl.J.Med.321:574)。在另一个实施方式中，可以使用聚合材料(参见Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen and Ball(eds.),Wiley,New York(1984)；Ranger and Peppas(1983)J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；see also Levy et al.(1985)Science 228:190；During et al.(1989)Ann.Neurol.25:351；Howard et al.(1989)J.Neurosurg.71:105)。而在另一个实施方式 中，可将控释系统置于治疗靶点(即，脑或肿瘤)附近，因而仅需所述系统剂量的一部分(参见，如Goodson,in Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138(1984))。Langer在综述中讨论了其它的控释系统(Langer(1990)Science249:1527-1533)。
受试者优选为人类，但可以是任何动物，在所述受试者中施用上述的活性成分是针对感染性疾病生物感染的有效的治疗方案。因此，如本领域普通技术人员所容易理解的那样，本申请公开的所述方法及药物组合物特别适合施用于任何动物，尤其是哺乳动物，并包括，但绝非限于，家养型动物，例如猫或犬受试者；农场动物，例如但不限于牛、马、山羊、绵羊以及猪类受试者；野生动物(无论野外的或是在动物园的)；研究用动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、狗、猫等，即用于兽医医疗。
本申请所公开的所述治疗方法和组合物中，公开了所述活性成分的治疗性有效剂量。如本领域所公知的那样，可基于患者的特征(年龄、体重、性别、健康状况、并发症，其它疾病等)，由普通熟练的医疗工作者确定治疗性有效剂量。此外，随着进行进一步的常规研究，将出现更具体的关于适当的剂量水平的信息，以在多个患者中治疗多种状况；并且所述普通技术人员参考所述接受者的治疗背景、年龄以及一般健康状况后，能够确定合适的剂量。一般的，对于静脉内注射或输注，剂量可以比腹膜内、肌内、或其他施用途径低。所述的剂量方案可以根据循环半衰期以及所用的剂型而变化。以与治疗有效剂量的剂型相容的方式，施用所述组合物。施用活性成分所需的精确的量取决于医师的判断，并且是每个个体所特有的。然而，合适的剂量可以在约0.1至20之间，优选约0.5至约10之间，并且更优选地，根据个体的体重，每天每1千克体重施用1至数毫克的活性成分，并且合适的剂量依赖于施用的途径。适用于初始施用及加强注射的方案也是可变的，但由初始施用后，在一个或多个小时的间隔下，通过随后的注射或其它施用方式，进行重复剂量的施用而典型化。或者，考虑能足够将血液中的浓度维持在10纳摩尔至10微摩尔的连续静脉输注。
还考虑干粉剂型，所述干粉剂型包括至少一种本申请所公开的蛋白，以及另一种治疗有效的药物，例如抗生素或化疗剂。
本申请考虑使用口服的固体剂型，第18版的Remington's Pharmaceutical Sciences(1990)一书，在第89章对此加以了描述(Mack Publishing Co.Easton PA 18042)，其全部内容通过引用并入本申请。固体剂型包括片剂、胶囊、弾丸、锭剂或含片，扁 囊剂或丸剂。此外，可以使用脂质体或类蛋白包裹对本申请所述的组合物进行制剂(例如，美国专利号4,925,673中报道的类蛋白微球体)。可以使用脂质体包裹，并且所述的脂质体可以与各种聚合物衍生化(例如，美国专利号5,013,556)。Marshall,K给出了用于治疗的可能的固体剂型(Modern Pharmaceutics Edited by G.S.Banker and C.T.Rhodes Chapter 10,1979，其全部内容通过引用并入本申请)。一般的，所述剂型包括所述一种或多种成分(或其经化学修饰的形式)，以及惰性成分，所述惰性成分允许针对胃环境进行保护，以及在肠道内释放所述生物活性材料。
还具体考虑了上述一种或多种衍生成分的口服剂型。可以化学修饰一种或多种所述成分，使得口服递送所述衍生物有效。一般的，考虑的化学修饰是至少一个部分附着于所述成分分子本身，其中，所述的部分允许(a)抑制蛋白水解；以及(b)从胃或肠摄取入血液。还需要提升所述成分的整体稳定性，及其在体内的循环时间。此类部分的例子包括：聚乙二醇、乙二醇和丙二醇形成的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。Abuchowski and Davis(1981)“Soluble Polymer-Enzyme Abducts”In:Enzymes as Drugs,Hocenberg and Roberts,eds.,Wiley-Interscience,New York,NY,pp.367-383；Newmark,et al.(1982)J.Appl.Biochem.4:185-189.其它可用的聚合物是聚-1,3-二氧戊环和聚-1,3,6-三氧戊烷。如上述，优选用于药物使用的是聚乙二醇部分。
对于所述成分(或衍生物)，释放的位置可以是胃、小肠(十二指肠、空肠、或回肠)、或大肠。本领域技术人员具有不溶解于胃、但将在十二指肠或肠内其它地方释放所述材料的剂型。优选地，通过保护所述蛋白(或衍生物)，或者在胃环境外(如肠内)释放所述生物活性材料，实现避免胃部环境的有害作用的所述释放。
为了确保完全的抗胃液性，针对至少pH 5.0的不可渗透性的包衣是必不可少的。更常见的被用作肠溶包衣的惰性成份的示例是醋酸纤维素偏苯三酸酯(CAT)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、HPMCP50、HPMCP55、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、乙酸邻苯二甲酸纤维素(CAP)、Eudragit L、Eudragit S、以及Shellac。可以将这些涂层作为混合膜使用。
还可以将包衣或包衣混合物用于片剂上，但这并非是为了针对胃而进行保护。这可以包括糖衣，或使所述片剂更易吞咽的包衣。胶囊可以包括硬壳(例如明胶)，用于递送干的、即粉末状的治疗剂；对于液体形式，可以使用软明胶壳。扁囊剂的外壳 材料可以是厚的淀粉或其他可食用纸。对于丸剂、含片、模制片或模印片，可以使用湿法块化技术。
所述剂型可以包括所述肽类治疗剂，所述肽类治疗剂是颗粒或丸状形式的细微的多颗粒，粒径约为1mm。用于施用胶囊的材料的剂型还可以是粉末状的，轻微压缩旋塞或者甚至片剂。可通过压缩制备所述治疗剂。
可用惰性材料稀释或增加所述治疗剂的体积。这些稀释剂可包括碳水化合物，特别是甘露糖醇，a-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改性葡聚糖和淀粉。某些无机盐也可用作填充剂，包括三磷酸钙、碳酸镁以及氯化钠。某些市售的稀释剂是Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress以及Avicell。
所述治疗剂的剂型可以包括崩解剂以形成固体剂型。用作崩解剂的材料包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商品崩解剂，Explotab。羧甲基淀粉钠、Amberlite，羧甲基纤维素钠、ultramylopectin、海藻酸钠、明胶、橙皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵和膨润土都可以使用。所述崩解剂的另一种形式是不溶性阳离子交换树脂。可以将粉末状树胶用作崩解剂以及粘合剂，并且这些可包括粉末状树胶如琼脂、刺梧桐胶或黄蓍胶。海藻酸及其钠盐也可作为崩解剂。粘合剂可用于将治疗剂结合在一起，以形成硬片剂，并且包括来自天然产物的材料如阿拉伯胶、黄蓍胶、淀粉和明胶。其它包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)两者都能用于醇溶液中，从而将治疗剂制成颗粒。
所述治疗剂的制剂可以包括抗摩擦剂，以防止制剂过程中的粘连。可将润滑剂用作治疗剂与模具壁之间的层，并且这些可以包括但不限于：硬脂酸(包括其镁盐及钙盐)、聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油以及蜡。还可使用可溶性的润滑剂，例如，十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁、各种分子量的聚乙二醇、Carbowax 4000和6000。
助流剂可提高药物在制剂过程中的流动性，有助于在压制过程中重新排列。所述助流剂可包括淀粉、滑石粉、热解硅胶以及水合铝酸硅。
可将表面活性剂作为润湿剂加入，以辅助治疗剂溶解在水环境中。表面活性剂可以包括阴离子去污剂，如十二烷基硫酸钠，二辛基磺基琥珀酸钠以及二辛基磺酸钠。 可以使用阳离子去污剂，可包括苯扎氯铵或氯化苯乙胺(benzethomium chloride)。作为表面活性剂可以包括在制剂中的潜在非离子型去污剂的清单包括：聚桂醇400、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10，50和60、单硬脂酸甘油酯、聚山梨酯40，60，65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素以及羧甲基纤维素。这些表面活性剂可单独地，或以不同比例的混合物形式，存在于所述蛋白或衍生物的制剂中。
能潜在地增强对所述蛋白(或衍生物)的摄取的添加剂是，例如，油酸，亚油酸和亚麻酸等脂肪酸。
在一个实施方式中，所述方法包括使用病毒向受试者施用本申请公开的、与Perforin-2的表达、功能或活性相关的多种靶分子中的任何一种，或本申请公开的、调节一种或多种与Perforin-2的表达、功能或活性相关的靶分子的功能或活性的多种试剂中的任何一种。可通过使用表达本申请所公开的任何一种靶分子或试剂的病毒，进行施用，例如重组逆转录病毒、重组腺相关病毒、重组腺病毒，以及重组单纯疱疹病毒(例如参见Mulligan,Science 260:926(1993),Rosenberg et al.,Science 242:1575(1988),LaSalle et al.,Science 259:988(1993),Wolff et al.,Science 247:1465(1990),Breakfield and Deluca,The New Biologist 3:203(1991))。
可使用重组型病毒载体递送编码本申请公开的多种靶分子或试剂中的任何一种的基因，所述重组型病毒载体包括例如腺病毒载体(如Kass-Eisler et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 90:11498(1993),Kolls et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 91:215(1994),Li et al.,Hum.Gene Ther.4:403(1993),Vincent et al.,Nat.Genet.5:130(1993),and Zabner et al.,Cell 75:207(1993))、腺相关病毒载体(Flotte et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 90:10613(1993)),甲病毒如塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus)和辛德毕斯病毒(Sindbis Virus)(Hertz and Huang,J.Vir.66:857(1992),Raju and Huang,J.Vir.65:2501(1991),and Xiong et al.,Science 243:1188(1989))、疱疹病毒载体(如美国专利号4,769,331,4,859,587,5,288,641和5,328,688)、细小病毒载体(Koering et al.,Hum.Gene Therap.5:457(1994)),痘病毒载体(Ozaki et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.193:653(1993),Panicali and Paoletti,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 79:4927(1982))、痘病毒，例如金丝雀痘病毒或牛痘病毒(Fisher-Hoch et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:317(1989),and Flexner et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.569:86(1989))、以及逆转录病毒(如Baba et al.,J.Neurosurg 79:729(1993),Ram et al.,Cancer Res.53:83(1993),Takamiya et al.,J.Neurosci.Res 33:493(1992),Vile and Hart,Cancer Res.53:962(1993),Vile and Hart, Cancer Res.53:3860(1993),and Anderson et al.,美国专利号5,399,346)。在多种实施方式中，无论是所述病毒载体本身，还是包含所述病毒载体的病毒颗粒，都可用于以下描述的方法中。
作为对一种系统的说明，腺病毒(一种双链DNA病毒)是一种已被充分表征的基因转移载体，用于递送异源的核酸分子(综述参见Becker et al.,Meth.Cell Biol.43:161(1994)；Douglas and Curiel,Science&Medicine 4:44(1997))。所述腺病毒系统具有几个优点，包括：(ⅰ)能容纳相对较大的DNA插入片段，(ii)能生长至高滴度，(ⅲ)能广泛感染哺乳动物细胞类型，以及(ⅳ)能与许多不同的启动子一起使用，所述启动子包括普遍存在的、组织特异性的、可调节的启动子。此外，可经静脉注射施用腺病毒，因为所述病毒在血流中是稳定的。
在使用腺病毒载体时，其中所述腺病毒的基因组的部分已被缺失，通过直接连接或通过与共转染质粒同源重组，将插入物整合至所述病毒的DNA。在示例性系统中，将基本的E1基因从所述病毒载体中缺失，并且除非宿主细胞提供所述E1基因，否则所述病毒将不会复制。当向完整的动物静脉施用时，腺病毒主要靶向肝脏。尽管E1基因缺失的腺病毒递送系统不能在宿主细胞中复制，但所述宿主的组织将表达并处理被编码的异源蛋白。如果其相应的基因包括分泌信号序列，则宿主细胞还将分泌所述异源蛋白。分泌的蛋白质会从表达所述异源基因的组织(例如，高度血管化的肝脏)进入循环。
此外，可以使用含多种病毒基因缺失的腺病毒载体，以减少或消除针对所述载体的免疫应答。此类腺病毒是缺失E1的，并且还包含E2A或E4的缺失((Lusky et al.,J.Virol.72:2022(1998)；Raper et al.,Human Gene Therapy 9:671(1998))。据报道E2b的缺失也能降低免疫应答(Amalfitano et al.,J.Virol.72:926(1998))。通过缺失整个腺病毒基因组，可容纳很大的异源DNA插入片段。对于插入大的异源DNA的插入片段来说，产生所有病毒基因都被缺失的所谓的“无病毒基因的(gutless)”腺病毒是特别有利的(参见综述Yeh.and Perricaudet,FASEB J.11:615(1997))。
使用标准的方法，可从被感染的哺乳动物细胞中获得高滴度的、表达治疗性基因的重组病毒贮存。例如，如Brandt等(Brandt et al.,J.Gen.Virol.72:2043(1991),Herold et al.,J.Gen.Virol.75:1211(1994),Visalli and Brandt,Virology 185:419(1991),Grau et al.,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.30:2474(1989),Brandt et al.,J.Virol.Meth.36:209 (1992))以及Brown和MacLean(Brown and MacLean(eds.),HSV Virus Protocols(Humana Press 1997))所述，可在非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)中制备重组单纯疱疹病毒。
当用重组病毒治疗的受试者是人类时，则所述治疗优选为体细胞基因治疗。即，优选用重组病毒治疗人类不涉及将能形成人类种系的一部分、并被传递至连续世代的核酸分子引入细胞(即，人类种系基因治疗)。
感染性生物 
本申请所述的“感染性生物”可以包括，但不限于，例如，细菌、病毒、真菌、寄生虫以及原生动物(protozoa)。
特别优选的、导致严重的人类疾病的细菌是革兰氏阳性生物：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA))、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和屎肠球菌(E.faecium)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)以及革兰氏阴性生物：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、伯克霍尔德菌(Burkholdia cepacia)、嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophila)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic E.coil(EPEC))、肠杆菌属多个转化型(Enterobacter spp)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)、衣原体属多个转化型(Chlamydia spp)，包括沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和沙门氏菌多个转化型(Salmonella spp)。
在另一个优选实施方式中，所述细菌是革兰氏阴性细菌。示例包括，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、伯克霍尔德菌(Burkholdia cepacia)、嗜麦芽黄单胞菌属(Xanthomonas maltophila)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠杆菌属多个转化型(Enterobacter spp)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)、衣原体属多个转化型(Chlamydia spp)。
本发明还公开了用于治疗由包括由结核分枝杆菌属多个转化型(Mycobacterium spp.)、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、墨西哥利什曼原虫(Leishmania mexicana)、溶组 织梭状芽孢杆菌(Clostridium histolyticum)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、口蹄疫病毒和束状短膜虫(Crithidia fasciculata)感染的疾病的方法；以及骨质疏松症、自免疫病、血吸虫病、疟疾、肿瘤转移、异染性脑白质营养不良、肌营养不良、和肌肉萎缩症。
其它示例包括兽医学上的以及人类的病原性原生动物、顶复门或肉足鞭毛门、锥虫、疟原虫、利什曼原虫、巴贝斯虫(Babesia)以及泰勒虫(Theileria)、隐孢子虫、肉孢子虫、阿米巴变形虫、双孢子球虫(Coccidia)和毛滴虫目(Trichomonadia)的细胞内活性寄生虫。这些化合物还适用于治疗例如由恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)导致的热带疟疾、由间日疟原虫(Plasmodium vivax)或卵形疟原虫(Plasmodium ovale)导致的间日疟，以及用于治疗由疟原虫(Plasmodium malariae)导致的三日疟。它们还适用于治疗由弓形虫(Toxoplasma gondii)导致的弓形体病、由例如贝利等孢球虫导致的球虫病、由猪人肉孢子虫导致的肠肉孢子虫病、由溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)导致的痢疾、由隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)导致的隐孢子虫病、由克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)导致的南美锥虫病、由布氏罗得西亚锥虫(Trypanosoma brucei rhodesiense)或布氏冈比亚锥虫(gambiense)导致的昏睡病、皮肤和内脏及其它形式的利什曼病。它们还适用于治疗被兽医病原性原生动物感染的动物，比如引起牛东海岸热的病原体—小泰累尔氏梨浆虫(Theileria parva)；在非洲引起那加那牛病的病原体—刚果维虫(Trypanosoma congolense congolense)、锥虫间日疟原虫间日疟原虫(Trypanosoma vivax vivax)、或布氏布氏锥虫(Trypanosoma brucei brucei)病原体；引起苏拉病的布氏锥虫伊氏亚种(Trypanosoma brucei evansi)；在牛和水牛中引起德州热的病原体—二联巴贝虫(Babesia bigemina)；在狗、猫和羊中引起欧洲牛巴贝斯虫病以及巴贝虫病的病原体—牛巴贝虫(Babesia bovis)；在羊、牛和猪中引起肉孢子虫病的病原体—羊肉孢子虫(Sarcocystis ovicanis)和Sarcocystis ovifelis；在牛和鸟中引起隐孢子虫病的病原体—隐孢子虫(Cryptosporidia)；在兔、牛、羊、山羊、猪和鸟中，特别是在鸡和火鸡中，引起球虫病的艾美耳球虫和等孢球虫属。立克次氏体包括如猫属立克次体(Rickettsia felis)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)、伤寒立克次体菌(Rickettsia typhi)、康氏立克次体(Rickettsia conorii)、非洲立克次氏体(Rickettsia africae)，并导致疾病如斑疹伤寒、立克次氏体痘、南欧斑疹热、非 洲蜱咬热、落基山斑疹热、蜱澳大利亚斑疹伤寒、弗林德斯岛斑点热和昆士兰蜱斑疹伤寒。在治疗这些疾病时，可将本发明所述的化合物与其他试剂联合使用。
根据本发明，特别优选能引起人类疾病或与人类疾病相关的真菌，包括(但不限于)白色念珠菌(Candida albicans)、新型隐球菌组织胞浆(Histoplasma neoformans)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)以及马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)。
转基因动物 
可用转基因对Perforin-2的功能活性进行评估。在这个方面，可使用转基因小鼠模型。在使用转基因小鼠的补充研究中，可使用所述Perforin-2基因。可使用所述被分离的Perforin-2基因来构建转基因载体，包括病毒载体，或与候选基因的野生型基因座相对应的粘粒克隆(或噬菌体克隆)。可使用已公开的方法将粘粒引入转基因小鼠(Jaenisch(1988)Science 240:1468-1474)。在遗传的意义上来说，所述转基因作为抑制突变发挥作用。
或者，可通过对Perforin-2基因的表达进行破坏，制备转基因动物模型。评估基因产物的表型效应的一种标准的方法是使用基因敲除技术来缺失或灭活所述基因。本申请所使用的“破坏”或“敲除”术语，是指在细胞中，部分或完全地抑制由DNA序列编码的蛋白质的至少一部分的表达。“部分”抑制或灭活是指与未破坏所述基因时(即野生型)相比，将基因表达降低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。“完全抑制”是指的是没有功能性蛋白的表达(即对基因表达100％的抑制)。
敲除包括杂合性突变和纯合性突变。本文申请使用的“杂合性”基因破坏或敲除包括一个有缺陷的等位基因和一个野生型等位基因。“纯合性”基因破坏或敲除包括两个有缺陷的等位基因。例如，纯合性敲除小鼠包括对基因的两个等位基因的破坏，以及杂合性敲除小鼠包括对基因的一个等位基因的破坏。当描述基因或敲除时，本申请所使用的“野生型”指的是基因的天然、非突变或未被破坏的形式。
本申请公开了转基因动物，其中所述Perforin-2基因已被破坏。在一个实施方式中，公开了转基因小鼠，所述转基因小鼠包括对编码Perforin-2蛋白的基因的破坏。在一些实施方式中，对所述Perforin-2基因的所述破坏可以是杂合性的或是纯合性的。
在具体的实施方式中，所述纯合性破坏在所述转基因小鼠中，使所述Perforin-2基因失活，并抑制功能性Perforin-2蛋白的表达。
在另一个实施方式中，所述基因破坏使所述Perforin-2基因部分失活。在具体的实施方式中，所述基因破坏是杂合性的。
在这样的实施方式中，与野生型小鼠相比，Perforin-2敲除的转基因小鼠对细胞内病原体表现出更高的感染易感性。
本申请还公开了来源于转基因小鼠的器官、组织、细胞、或细胞系，所述转基因小鼠包括对Perforin-2基因的破坏。
此外，可使用重组技术以引入突变，如无义突变和琥珀突变，或导致表达失活的蛋白的突变。在另一个实施方式中，可通过检测Perforin-2基因以反义方向在野生型动物体内表达时的表型效应，测试Perforin-2基因。以这种方法，抑制了所述野生型等位基因的表达，导致产生了突变表型。RNA×RNA双链的形成(反义-正义)阻止了对mRNA的正常处理，导致部分或完全消除了野生型基因效应。这个技术已被用于抑制组织培养物中的TK合成，并在果蝇中产生Kruppel突变的表型，以及在小鼠中产生Shiverer突变的表型(Izant et al.Cell(1984)36:1007-1015；Green et al.(1986)Annu.Rev.Biochem.55:569-597；Katsuki et al.(1988)Science 241:593-595)。这种方法的一个重要优点是，只需表达所述基因的一小部分，来有效抑制所述整个同源mRNA的表达。将所述反义转基因置于其自身启动子或表达在正确细胞类型中的另一个启动子的控制下，并置于SV40polyA位点的上游。将使用这个转基因，或通过使用基因敲除技术，制造转基因小鼠。
本申请仅描述了本发明所述的优选的实施方式，以及关于其多用途性的几个示例。但是应当知道，本发明能够在多种其他组合形式和环境中使用，并能在本申请所述的本发明的概念范围之内，做出变化或调整。因此，例如，本领域的技术人员将理解，或能确定，使用不超过常规的实验，以及使用本申请所述的具体的物质或步骤的多种对等物。这样的等同物被认为是在本发明的范围之内的。
本申请中引用的所有文献以及专利文档通过引用用于所有目的的相关部分并入本申请，其引用程度如同每一个参考文献或专利文档独立地通过引用并入。通过在 此文件中对各种参考文献的引用，申请者不承认任何特定的参考文献是针对他们的发明的已有技术。
本申请公开的非限制性方法和组合物的示例如下：
1.一种体外或体内调节Perforin-2(P2)的表达、功能或活性的方法，所述方法包括：将有效剂量的至少一种试剂在体外接触细胞或向患者施用，所述试剂调节与P2的表达、功能或活性相关的一种或多种分子的功能、活性或表达；以及调节P2的功能或表达。
2.根据实施方式1所述的方法，其中所述与P2的功能、活性或表达相关的一种或多种分子包括：src、泛素结合酶E2M、GAPDH、P21RAS/gap1m、半乳凝集素3、泛素C(UCHL1)、蛋白酶、或上述分子的片段。
3.根据实施方式2所述的方法，其中施用所述至少一种试剂上调了所述P2的表达、功能或活性，所述试剂上调与P2的功能、表达或活性相关的一种或多种分子的功能、活性或表达。
4.根据实施方式2所述的方法，其中施用所述至少一种试剂下调了所述P2的表达、功能或活性，所述试剂下调与P2的功能、表达或活性相关的一种或多种分子的功能、活性或表达。
5.根据实施方式2所述的方法，其中施用至少一种试剂上调了所述P2的表达、功能或活性，所述试剂独立地上调或下调与P2的功能、表达或活性相关的至少两种分子的功能、活性或表达。
6.根据实施方式2所述的方法，其中施用至少一种试剂下调了所述P2的表达、功能或活性，所述试剂独立地上调或下调与P2的功能、表达或活性相关的至少两种分子的功能、活性或表达。
7.根据实施方式2所述的方法，其中施用至少两种试剂的组合上调了所述P2的表达、功能或活性，所述试剂独立地上调或下调与P2的功能、表达或活性相关的至少两种分子的功能、活性或表达。
8.根据实施方式2所述的方法，其中施用至少两种试剂的组合下调了所述P2的表达、功能或活性，所述试剂独立地上调或下调与P2的功能、表达或活性相关的至少两种分子的功能、活性或表达。
9.根据实施方式2所述的方法，其中所述方法包括施用能直接调节所述P2分子的表达、功能或活性的试剂的任选的步骤。
10.根据实施方式9所述的方法，其中所述分子抑制P2的转录或翻译。
11.根据实施方式1所述的方法，其中试剂包括：小分子、蛋白质、肽、多肽、修饰的肽、修饰的寡核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、合成的分子、天然分子、有机或无机分子、或上述试剂的组合。
12.一种鉴定候选治疗剂的方法，所述方法包括：接触表达一个或多个靶分子的细胞，所述靶分子包括：src、泛素结合酶E2M、GAPDH、P21RAS/gap1m、半乳凝集素3、泛素C(UCHL1)、蛋白酶、或上述分子的片段；测定所述分子的表达、功能或活性；将所述分子的表达、功能或活性与对照进行比较；以及，鉴定候选治疗剂。
13.根据实施方式12所述的方法，其中所述候选治疗剂调节一个或多个所述靶分子的表达、功能或活性。
14.根据实施方式12所述的方法，其中所述候选治疗剂调节多种靶分子的表达、功能或活性。
15.根据实施方式12所述的方法，其中所述候选治疗剂上调一个或多个所述靶分子的表达、功能或活性。
16.根据实施方式12所述的方法，其中所述候选治疗剂下调一个或多个所述靶分子的表达、功能或活性。
17.根据实施方式12所述的方法，其中所述对一个或多个靶分子的表达、功能、或活性的调节作用调节Perforin-2(P2)分子的表达、功能或活性。
18.根据实施方式17所述的方法，其中所述对一个或多个靶分子的表达、功能、或活性的上调作用上调Perforin-2(P2)分子的表达、功能或活性。
19.根据实施方式17所述的方法，其中所述对一个或多个靶分子的表达、功能、或活性的下调作用下调Perforin-2(P2)分子的表达、功能或活性。
20.根据实施方式12所述的方法，其中所述靶分子是多聚核苷酸或其表达的产物。
21.一种鉴定候选治疗剂的方法，所述方法包括：使检测表面与一个或多个靶分子接触，所述靶分子包括src、泛素结合酶E2M、GAPDH、P21RAS/gap1m、半乳凝集素 3、泛素C(UCHL1)、蛋白酶、上述分子的片段或相关分子；将所述靶分子与一个或多个候选治疗剂接触并鉴定与一个或多个靶分子或其相关分子结合或杂交的试剂。
22.根据实施方式21所述的方法，其中检测所述鉴定的候选治疗剂对Perforin-2分子的表达、功能或活性的调节作用。
23.根据实施方式22所述的方法，其中鉴定的候选治疗剂上调P2分子的表达、功能、或活性。
24.根据实施方式22所述的方法，其中鉴定的候选治疗剂下调P2分子的表达、功能、或活性。
25.根据实施方式22所述的方法，其中用于检测P2分子的表达、功能、或活性的检测方法包括：细胞检测法、免疫检测法、酵母杂交系统检测法、杂交检测法、基于核酸的检测法，高通量筛选检测法或上述检测方法的组合。
26.根据实施方式22所述的方法，其中检测所述鉴定的候选治疗剂对感染性生物的复制抑制、生长抑制、或死亡的作用。
27.根据实施方式26所述的方法，其中所述感染性生物是细胞内或细胞外细菌。
28.一种治疗患有感染性疾病生物的患者的方法，所述方法包括，向所述患者施用治疗有效量的、由实施方式1或实施方式21中的方法鉴定的试剂。
29.由实施方式1或实施方式21中所述方法鉴定化合物。
30.包括实施方式29中的化合物的药物组合物。
31.一种鉴定有病原体感染风险的个体的方法，所述方法包括：获得患者的样品；检测一种或多种分子，包括：src、泛素结合酶E2M、GAPDH、P21RAS/gap1m、半乳凝集素3、泛素C(UCHL1)、蛋白酶、Perforin-2、上述分子的片段或相关分子；以及，将所述分子的表达、功能或活性与正常对照比较。
32.根据实施方式31所述的方法，其中与对照相比，被鉴定为具有表达水平下调、活性或功能降低的个体，会具有预后的感染风险。
33.一种鉴定至少一种能调节Perforin-2的表达、功能或活性的试剂的方法，所述方法包括：(a)将表达一种或多种与Perforin-2的表达、功能或活性相关的靶分子的细胞与所述至少一种试剂接触；(b)测量与Perforin-2的表达、功能或活性相关的所述一种或 多种靶分子的表达、功能或活性；以及(c)将所述一种或多种靶分子的表达、功能或活性与对照比较，其中与所述至少一种试剂的接触能调节所述一种或多种靶分子的表达、功能或活性，从而鉴定能调节Perforin-2的表达、功能或活性的所述试剂。
34.根据实施方式33所述的方法，其中所述与Perforin-2的表达、功能或活性相关的一种或多种靶分子包括：src、泛素结合酶E2M(Ubc12)、GAPDH、P21RAS/gap1m(RASA2)、半乳凝集素3、泛素C(UCHL1)、蛋白酶、vps34、ATG5、ATG7、ATG9L1、ATG14L、ATG16L、LC3、Rab5、或上述分子的片段。
35.根据实施方式33-34任意一项所述的方法，其中所述至少一种试剂上调所述与Perforin-2的表达、功能或活性相关的一个或多个靶分子的表达、功能或活性。
36.根据实施方式35所述的方法，其中所述对一个或多个靶分子的表达、功能或活性的上调作用上调Perforin-2的表达、功能或活性。
37.根据实施方式33-34任意一项所述的方法，其中所述至少一种试剂下调所述与Perforin-2的表达、功能或活性相关的一个或多个靶分子的表达、功能或活性。
38.根据实施方式37所述的方法，其中所述对一个或多个靶分子的表达、功能或活性的下调作用下调Perforin-2的表达、功能或活性。
39.根据实施方式33-34任意一项所述的方法，其中至少一种试剂上调了所述Perforin-2的表达、功能或活性，所述试剂独立地上调或下调至少两个与Perforin-2的表达、功能或活性相关的靶分子的表达、功能或活性。
40.根据实施方式33-34任意一项所述的方法，其中至少一种试剂下调了所述Perforin-2的表达、功能或活性，所述试剂独立地上调或下调至少两个与Perforin-2的表达、功能或活性相关的靶分子的功能、活性或表达。
41.根据实施方式33-34任意一项所述的方法，其中至少两种试剂的组合上调了所述Perforin-2的表达、功能或活性，所述试剂独立地上调或下调至少两个与Perforin-2的表达、功能或活性相关的靶分子的表达、功能或活性。
42.根据实施方式33-34任意一项所述的方法，其中至少两种试剂的组合下调了所述Perforin-2的表达、功能或活性，所述试剂独立地上调或下调至少两个与Perforin-2的表达、功能或活性相关的靶分子的表达、功能或活性。
43.根据实施方式33-42任意一项所述的方法，其中所述试剂包括：小分子、蛋白质、肽、多肽、修饰的肽、修饰的寡核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、合成的分子、天然分子、有机或无机分子、或上述试剂的组合。
44.根据实施方式33所述的方法，其中所述与Perforin-2的表达、功能或活性相关的一个或多个靶分子来自于感染性生物。
45.根据实施方式44所述的方法，其中所述的感染性生物是细菌。
46.根据实施方式44-45任意一项所述的方法，其中所述的至少一种试剂下调了所述一个或多个靶分子的表达、功能或活性。
47.根据实施方式44-45任意一项所述的方法，其中所述的至少一种试剂上调了所述一个或多个靶分子的表达、功能或活性。
48.根据实施方式46所述的方法，其中所述对一个或多个靶分子的表达、功能或活性的下调作用，上调了Perforin-2的表达、功能或活性。
49.根据实施方式47所述的方法，其中所述对一个或多个靶分子的表达、功能或活性的上调作用，下调了Perforin-2的表达、功能或活性。
50.根据实施方式44-45任意一项所述的方法，其中至少一种试剂上调了所述Perforin-2的表达、功能或活性，所述试剂独立地上调或下调与Perforin-2的表达、功能或活性相关的至少两个靶分子的表达、功能或活性。
51.根据实施方式44-45任意一项所述的方法，其中至少一种试剂下调了所述Perforin-2的表达、功能或活性，所述试剂独立地上调或下调与Perforin-2的表达、功能或活性相关的至少两个靶分子的表达、功能或活性。
52.根据实施方式44所述的方法，其中所述细菌是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或大肠杆菌(Escherichia coli)。
53.根据实施方式44-45任意一项所述的方法，其中所述与Perforin-2的表达、功能或活性相关的一个或多个靶分子包括：PhoP或脱酰胺酶。
54.一种鉴定能调节Perforin-2的表达、功能或活性的候选试剂的方法，所述方法包括：(a)使检测表面与一个或多个靶分子接触，所述靶分子包括src、泛素结合酶E2M、GAPDH、P21RAS/gap1m(RASA2)、半乳凝集素3、泛素C(UCHL1)、蛋白酶、vps34、ATG5、ATG7、ATG9L1、ATG14L、ATG16L、LC3、Rab5、PhoP、脱酰胺酶、上述分 子的片段或相关分子；(b)将所述靶分子与一个或多个候选试剂接触，并鉴定与一个或多个靶分子或其相关分子结合或杂交的试剂；以及(c)检测所述一个或多个候选试剂对Perforin-2的表达、功能或活性的调节作用，进而鉴定所述候选试剂。
55.根据实施方式54所述的方法，其中鉴定的候选试剂上调了Perforin-2的表达、功能或活性。
56.根据实施方式54所述的方法，其中鉴定的候选试剂下调了Perforin-2的表达、功能或活性。
57.根据实施方式54所述的方法，其中所述用于检测Perforin-2分子的表达、功能、或活性的检测方法包括：细胞检测法、免疫检测法、酵母杂交系统检测法、杂交检测法、基于核酸的检测法，高通量筛选检测法或上述检测方法的组合。
58.根据实施方式54所述的方法，其中检测了所述鉴定的候选试剂对感染性生物的复制抑制、生长抑制、或死亡的作用。
59.根据实施方式58所述的方法，其中所述感染性生物是细胞内细菌或细胞外细菌。
60.一种鉴定有病原体感染风险的个体的方法，所述方法包括：获得患者的样品；检测一种或多种分子，包括：src、泛素结合酶E2M、GAPDH、P21RAS/gap1m、半乳凝集素3、泛素C(UCHL1)、蛋白酶、Perforin-2、ps34、ATG5、ATG7、ATG9L1、ATG14L、ATG16L、LC3、Rab5、上述分子的片段或相关分子；以及，将所述分子的表达、功能或活性与正常对照比较。
61.根据实施方式60所述的方法，其中与对照相比，被鉴定为具有表达水平下调、活性或功能降低的个体，会具有预后的感染风险。
62.一种转基因小鼠，所述小鼠包括对编码Perforin-2蛋白的基因的破坏。
63.根据实施方式62所述的转基因小鼠，其中所述破坏包括对所述编码Perforin-2蛋白的基因的杂合性或纯合性破坏。
64.根据实施方式63所述的转基因小鼠，其中所述破坏包括纯合性破坏，其中所述纯合性破坏在所述转基因小鼠体内使所述基因失活，并抑制功能性Perforin-2蛋白的表达。
65.根据实施方式62-64任意一项所述的转基因小鼠，其中与野生型小鼠相比，所述转基因小鼠针对细胞内病原体感染表现出更高的感染易感性。
66.来源于实施方式62-64任意一项所述的转基因小鼠的器官、组织、细胞、或细胞系。
实施例
实施例1：巨噬细胞和小胶质细胞内的成孔蛋白杀死病原性的细胞内细菌。
所述实施例显示了Mpeg1编码一种新型的成孔蛋白，命名为Perforin-2(P-2)，所述P-2通过聚合作用形成跨膜孔。巨噬细胞内的P-2针对病原性细菌具有强效的细胞内杀伤活性，所述病原性细菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、鸟分枝杆菌(Ma)、耻垢分枝杆菌(Msm)、鼠伤寒沙门氏菌(St)和大肠杆菌。而且，P-2使活性氧簇(ROS)和一氧化氮(NO)具有杀菌活性。
材料与方法 
质粒构建体：从若干EST克隆中构建了鼠Mpeg-1cDNA的完整编码区，并将所述编码区插入pEGFP-N3质粒(Clontech)。在一些实验中，将单体的RFP克隆代替GFP使用。
细胞系和原代细胞：在补充有10％FBS的IMDM中培养HEK-293(ATCC),RAW264.7(ATCC)和细胞系。从腹膜或骨髓中获得原代巨噬细胞。经巯基乙酸促发的腹膜巨噬细胞：将1.5ml的3％巯基乙酸溶液经腹腔注射(i.p.)入C57/B6小鼠。4天后，收获腹膜细胞并通过贴壁方式，纯化巨噬细胞。来源于骨髓的巨噬细胞：从C57BL/6小鼠的长骨冲洗出骨髓。用ACK缓冲液裂解红血细胞，并将细胞沉淀物在含有20ng/ml粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(Peprotech,Rocky Hill,NJ,USA)的完全培养基中重悬(106个细胞/ml)。在第4天，收获未贴壁细胞，并重新铺板于新鲜的完全培养基。每3天加入新鲜培养基，直至细胞可用于实验为止(通常在7-10天之间)。
电镜负染：通过N 2空化和差速离心法，从P2GFP转染的293细胞中分离得到膜。将膜重悬于小体积的中性Tris缓冲盐液中，用100μg/ml胰蛋白酶37℃处理1h，洗涤，并用5％的中性钠磷钨酸负染30秒。在Phillips CM10透射电子显微镜上，于52000倍初始放大率采集图像。
庆大霉素保护试验：在感染前，将来自甘油原种的鼠伤寒沙门氏菌菌株LT2Z、鸟分枝杆菌、耻垢分枝杆菌(ATCC)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和K12大肠杆菌，在Luria肉汤(LB)(鼠伤寒沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，以及大肠杆菌)或在 Middlebrook 7H9肉汤(分枝杆菌)中，在37℃震荡下生长16-18hr。对于沙门氏菌，则将培养物以1:33稀释于LB中，并另外再生长3小时，以诱导侵袭性表型。将巨噬细胞或小胶质细胞铺板(12孔板，5×105个细胞/孔)并用LPS(为1ng/ml)和IFN-γ(100U/ml)进行过夜刺激。次日，在37℃，5％CO2的培养箱中，在所示MOI时，感染细胞30分钟(鼠伤寒沙门氏菌)或1小时(所有其它细菌)。用PBS洗涤细胞两次，并加入新鲜的含有50μg/ml庆大霉素的培养液。2小时后，将庆大霉素的浓度降低至5μg/ml。在加入庆大霉素后的所示时间点，用PBS洗涤细胞，用0.1％的Triton-X水溶液裂解细胞，稀释细胞并以一式三份的形式将细胞铺板于琼脂平板，并确定CFU。
RT-PCR：按照RNeasy(Qiagen)的说明，从细胞中提取RNA。使用QuantiTect反转录试剂盒(Qiagen)，将1μg的RNA转化为cDNA。使用基因表达检测法(Applied Biosystems)，对鼠Mpeg-1和GAPDH(作为管家对照基因)进行了RT-PCR检测。在Applied Biosystems 7300PCR平台上进行了所有的检测。
抗体：兔抗Mpeg1和兔抗GFP多克隆抗体获自Abcam，并用于western blot分析。兔抗P2(胞质结构域)的抗血清产自并获自21st Century公司。
RNA干扰：从Sigma获得了三种化学合成的、包含19个核苷酸的P2特异性siRNA双链。两种siRNA与P2的3'UTR互补，并且第三种siRNA与编码区互补。序列如下：CCACCUCACUUUCUAUCAA(SEQ ID NO:1)，GAGUAUUCUAGGAAACUUU(SEQ ID NO:2)，以及CAAUCAAGCUCUUGUGCAC(SEQ ID NO:3)。使用Amaxa Nucleofector System(Lonza)，根据厂商的说明，将siRNA转染进巨噬细胞和小胶质细胞中。所有转染使用了4×106个细胞以及1μM终浓度的siRNA(将P2特异性的siRNA合并)。随后立即将转染细胞铺板于包含10％FBS的无抗生素IMDM中。
共聚焦显微镜检：为成像活细胞，在铺有1.5号盖玻片的玻璃底的皿中，用P2GFP对RAW细胞进行核转染，并用LPS(1ng/ml)和IFN-γ(100U/ml)过夜刺激该细胞。用PBS洗涤细胞一次，并标记细胞器。为标记内质网(ER)，使用1μM工作浓度的ER-TRACKERTM Blue-White DPX(Invitrogen)，在37℃作用30分钟。对于所有其它的染色，用3％的多聚甲醛(PFA)室温下固定被转染的细胞15分钟，用0.5％皂甙渗透化细胞，用10％的正常山羊血清封闭细胞，并用一抗和二抗进行孵育。使用抗CD107a(LAMP-1)(BD Pharmingen公司)、抗CD11b(BD Pharmingen)、抗golgin97(Invitrogen)、抗EEA1(Calbiochem)、抗GM130(BD Biosciences)抗体，以及Hoechst 33258(Invitrogen)鉴定细胞器。所有二抗均在山羊体内生成。在装有自动 滑台的Leica SP5倒置共聚焦显微镜上采集了图像，并使用Leica应用套件的先进的荧光软件进行分析。
结果和讨论 
巨噬细胞组成性地转录能预测蛋白的Mpeg1mRNA，所述蛋白具有MACPF结构域，并通常存在于溶细胞性的成孔蛋白。所述MACPF结构域的组成成员是膜攻击复合物的成孔的补体成分C9，所述膜攻击复合物能杀死胞外细菌；以及T淋巴细胞和NK淋巴细胞的成孔分子—Perforin-1，所述T淋巴细胞和NK淋巴细胞能杀死被病毒感染的细胞和肿瘤细胞。通过MACPF结构域的多聚化实现孔的形成，所述多聚化介导构象发生变化，导致四个两亲性的β链插入膜中，引起穿孔和靶细胞死亡。在这个实施例中，显示了Mpeg1编码一种新型的成孔蛋白，命名为Perforin-2(P-2)，所述蛋白通过聚合组装跨膜孔。巨噬细胞内的P-2针对细胞内病原性细菌具有强效的杀伤活性，所述细菌包括鸟分枝杆菌(M.avium)，耻垢分枝杆菌，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)，大肠杆菌(E.coli)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的临床分离物。重要的是，P-2也对ROS和NO的抗微生物活性起作用。
目前理解，巨噬细胞内的杀菌应答是由氧化机制(如吞噬体内的ROS和NO)以及吞噬体-溶酶体的融合来介导的。为了评估与ROS及NO相比，P-2在细胞内杀伤细菌中的作用，对各个杀菌效应物单独、或与P-2一起进行了抑制，并通过庆大霉素保护试验，于感染后1-5小时间，测定腹膜巨噬细胞(PEM)内细胞内细菌的存活情况(图1A-1C)。庆大霉素是膜不通透的，并且仅存在于细胞外基质中。对ROS，NO或P-2的单独的抑制作用对不同的细菌具有不同的效应。当使用鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)时，在没有抑制剂的情况下，在1h时以胞内形式存在于PEM中的细菌有～90％在5h时死亡(～10％的存活率，图1A)。用抗氧化剂和ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)对ROS进行的阻断作用，允许沙门氏菌(Salmonellae)在5h时的存活率与1h时的水平相比，为～80％，表明在没有ROS帮助的情况下，仅杀死了20％的所述细菌。使用一氧化氮合成酶的抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲基酯盐酸盐(L-NAME)阻断NO，具有与NAC类似的效应。另一方面，通过转染P-2特异性的siRNA来抑制P-2(抑制效率的数据见图5A，5B)，即使不阻断ROS和NO，也能消除所有杀伤作用，并允许沙门氏菌(Salmonellae)在细胞内复制(图1A)。重要的是，将NAC或L-NAME与P-2的抑制进行联合，并未将细胞内复制进一步提升至高于单独阻断P-2所提供的水平，表明 P-2普遍介导了ROS和NO两者的抗微生物通路。换句话说，没有P-2，ROS和NO则几乎不具有杀死沙门氏菌(Salmonellae)的效应。
在不存在抑制剂的情况下，约30％的耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)在感染后5h时存活，表明耻垢分枝杆菌对PEM的杀伤作用具有相对耐受性(图1B)。阻断ROS或NO，将它们的存活率提升至～60％，为30％的杀伤率提供了证据。另一方面，对P-2的抑制作用抑制了针对耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)的几乎所有的杀菌活性，再次表明P-2还介导ROS和NO的毒性(图1B)。在不存在抑制剂的情况下，非病原性大肠杆菌K12对PEM的杀伤作用最敏感(100％的杀伤率，图1C)。对ROS和NO的抑制作用，或对P-2的抑制，分别允许～30、～40以及～60％的存活率，表明在不存在P-2的情况下，非病原性大肠杆菌对ROS和NO比病原性细菌更敏感，所述病原性细菌除了受针对ROS和NO的耐受机制(例如产生过氧化氢酶和抗氧化剂)保护外，还可能受更坚固的细胞壁保护。在不存在PEM的情况下，所述抑制剂对细菌生长没有效应(图6)。数据证明，P-2对细菌细胞外壁的损伤作用促进了ROS和NO进入细胞，对细菌的根本性结构产生不可逆损伤，导致了在感染的最初5小时内细菌死亡。这种情况类似于粒酶介导的细胞死亡所需的Perforin-1，以及类似于补体MAC，其为溶菌酶进入细菌的蛋白聚糖层提供入口、进而导致结构坍塌。
从海绵至人类，P-2是高度保守的(图7)，这证明其基本功能的重要性。MACPF结构域的C-末端是一种新型的保守结构域，在所有的Perforin-2直系同源物中保守，但不对任何其他蛋白结构域表现出同源性，本申请将其命名为P-2-结构域(图2A)。P-2不同于免疫系统的其它可溶性孔形成物，它是1型膜蛋白，包含一个典型的跨膜序列以及一个胞质结构域。所述的效应物-MACPF结构域朝向ER腔或出芽中的转运囊泡。短的胞质结构域延伸至细胞胞质并显示出经典的调节性元件，目前正在研究该调节性元件，以明确P-2聚合化的机制。
为了确定P-2是否生成了膜相关的孔，组装了完整的开放阅读框，将绿色荧光蛋白(GFP)与处在胞质结构域的C末端融合，并将它转染入HEK-293细胞。使用市售的抗P-2的多克隆抗肽抗血清、实验室制备的针对P-2的胞质结构域而产生的多克隆抗血清、或抗-GFP的抗体，通过免疫印迹法，检测P-2-GFP(图8)。通过细胞裂解和差速离心获得P-2-GFP的荧光膜，并用胰蛋白酶进行处理，去除膜蛋白，但不去除Perforin-1和MAC孔。胰蛋白酶剪切掉P-2的胞质结构域而非P-2孔；如图2B中，在200,000倍放大倍数 下，负染电子显微镜检显示，P-2孔仍保持着与膜的结合。这个照片代表了首次物理学证据及图像，表明P-2确实是具有细胞裂解活性的成孔蛋白。来自未被转染的293细胞的对照膜以同样方式进行胰酶消化，没有孔复合体(未显示)。与聚Perforin-1的16nm直径(图2G)以及聚C9的10nm直径相比，中空的圆柱体状聚P-2复合体的平均内径为9.2nm。该精细结构表明聚合组合物是12-14个原体。不完全组装的孔证实了该聚合过程(图2C，箭头所示)。在侧视图中，该复合体向外突出12或25nm(图2E和2F；平行箭头所示)。
如庆大霉素保护试验所示(图3A-3I)，除了PEM以外，骨髓来源的巨噬细胞/树突细胞(BMDM/BMDC)以及巨噬细胞(RAW264.7)和小胶质细胞(BV2)的细胞系对被吞噬的MRSA、分枝杆菌(Mycobacteria)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)以及大肠杆菌(E.coli)具有强效的细胞内杀伤机制。巨噬细胞、BMDM/DC和小胶质细胞组成性地表达P-2，并在脂多糖(LPS)和干扰素-γ(IFN-γ)的处理下，上调P-2mRNA和蛋白表达(图9A-9D)。通过转染P-2特异性的siRNA，在RAW、BV2、BMDM/DC或PEM中抑制了P-2，并将细胞内杀菌活性与转染了杂乱siRNA的细胞比较。P-2mRNA的抑制效率为80％至95％(图5A，5B)，其蛋白质的抑制效率>90％(图3E)。P-2的抑制强烈抑制了RAW，BV2，BMDM/BMDC与PEM细胞内的针对细菌的细胞内杀伤作用(图3A-3D和图10A-10E)。P-2的抑制作用抑制了针对高病原性的鸟分枝杆菌(M.avium)、MRSA和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)以及非病原性的大肠杆菌(E.coli)和耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)的细胞内杀伤作用(图3A-3D)。在转染后或转染期，抑制的细胞和对照细胞的细胞生存力所受的影响没有差异(未显示)。通过转染RAW细胞而过量表达P-2-RFP，提升了针对鸟分枝杆菌(M.avium)的细胞内杀伤作用，这与P-2的细胞内杀菌功能是一致的(图3F，3G和图11A-11F)。在转染后和转染期，表达P-2-RFP的细胞和对照细胞的细胞生存力是相当的(未显示)。为了排除P-2的抑制对其他细胞成分产生潜在的意外效应而可能导致细胞内杀伤活性的减弱，用与P-23’UTR互补的P-2-siRNA抑制了内源性的P-2，并通过转染缺少所述P-23’UTR的P-2-RFP cDNA来重建P-2的活性(图3H和图12A，12B)。Western blots(图3I)证实，内源性P-2的抑制以及P-2-RFP的补充完全恢复了细胞内杀菌活性，表明P-2负责摧毁胞内细菌。
要确定P-2在细胞内的定位，需要将P-2-GFP转染巨噬细胞。市售的针对P-2的多克隆抗肽抗体并不识别天然的P-2(未显示数据)；目前为止还未能成功地生成针对天然的 P-2的单克隆抗体，这可能归因于高保守性(图5A，5B)。为了避免造成P-2-GFP过量表达的伪结果，在瞬时转染后的早期，P2-GFP的表达仍然很低的时候，分析了RAW细胞。不同于单独的GFP，P-2-GFP主要定位于ER、高尔基体和反面高尔基网络膜，并被排除于质膜、溶酶体以及早期内涵体之外(图4A-4D和图13A-13C)。所报道的ER膜与吞噬体膜的融合允许P-2进入吞噬体膜，通过质谱法在包含J774鼠细胞系的胶乳颗粒的纯化吞噬体中检测到P-2。因此P-2存在于那些需要细胞内细菌的吞噬体内杀伤的位置。
本申请所述的研究，证明巨噬细胞包含一种新型的成孔蛋白，即Perforin-2，它是膜相关的蛋白并对广泛的病原性细菌菌种具有强效的细胞内杀菌功能。P-2的存在大大增强了ROS和NO的杀菌活性，P-2对细胞壁的破坏活性可能为小分子包括溶菌酶攻击细菌的肽聚糖层或内膜以及DNA提供了入口。P-2-聚合过程的活化的分子机制还是未知的，但目前正对此进行活跃的研究，焦点放在P-2胞质结构域的功能上。鉴于P-2和细胞内细菌之间漫长的进化对抗，研究细胞内病原体用以避免P-2攻击的逃避策略会是非常有趣的。
P-2似乎是先天性免疫防御系统的原始成孔蛋白，已在原始海绵和其他无脊椎海洋生物中存在。P-2可在几乎所有的体细胞中诱导，并保护它们不受细胞内细菌生长的侵害。古老的P-2会继续成为先天性免疫防御系统一个重要的抗菌成分。
实施例2：对P2的调节
据推测，Src激酶负责活化P2，并且自噬作用参与了对细菌的杀伤。此外，使用酵母双杂交系统鉴定了7个蛋白，所述蛋白与P2的胞质结构域相互作用并由此证明它们参与了P2的活化过程。表1列出了这些蛋白。
P2具有一个跨膜结构域，所述结构域参与了P2的活化，用于发挥杀伤作用。P2具有高度保守的Y和S，以及一个保守的RKYKKK(SEQ ID NO：4)结构域(GTRKYKKKEYQEIEE；SEQ ID NO：6)。
对src、泛素结合酶E2M(Ubc12)、GAPDH、P21RAS/gap 1m(RASA2)、半乳凝集素3和UCHL1的抑制，干扰了小胶质细胞和成纤维细胞对细菌的杀伤作用。因此，这些分子负责活化依赖于P2的细菌杀伤作用。对ATG14的抑制也会干扰P2介导的杀伤作用，这提供了ATG14与P21RAS和自噬的连接关系。通过用小的药物或生物制剂调节(阻断或增强)这些P2活化蛋白，会导致P2活性的升高或降低。由于很多(如果不是所有的话)组织都表达P2，显然，P2对于控制抗微生物的活性是极其重要的。与此同时，失调可能 会导致自体侵略性疾病以及自体免疫疾病(上调了活性)或导致免疫缺陷(下调)。病原性细菌很可能通过阻断活化级联，干扰P2的活化。抵消这种干扰可以用来治疗和治愈患有耐药性细菌感染的患者。
总之，P2活化的分子机制能提供很多用药靶点，这对于治疗广谱的疾病是有用的。
表1
实施例3：体细胞通过成孔蛋白Perforin-2介导杀菌功能 
巨噬细胞、树突细胞、以及小胶质细胞组成性地表达成孔蛋白，以杀死病原性细胞内细菌，所述成孔蛋白命名为Perforin-2(P-2)。P-2通过膜损伤杀死细菌，这也增强了活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)的杀菌效应，证明物理性损伤为进入细菌的敏感层提供了入口。用细菌入侵了上皮细胞、成纤维细胞、以及其它非造血来源的细胞；在自噬相关机制和抗微生物的化合物的协助下，所述细胞清除了细胞内细菌的感染。在这些实验之前，还不知道非造血来源的细胞能否表达并使用P-2，用于清除细菌。本报告首次显示了原代人角质形成细胞组成性地表达P-2-mRNA，并且可以使用1型和2型干扰素对目前为止已分析的所有体细胞进行诱导使其表达P-2mRNA。此外，使用P-2特异性的siRNA抑制内源性的P-2，能抑制杀菌活性；补充P-2-RFP能恢复此活性，而补充RFP不能恢复此活性。
材料与方法 
人类细胞：使用了以下细胞。脐带静脉内皮细胞，MIA PaCa-2胰腺癌细胞(ATCC CRL-1420)，UM-UC-3膀胱癌细胞(ATCC CRL-1749)，UM-UC-9膀胱cancer23细胞， HeLa细胞(ATCC CCL-2)，HEK293T细胞(ATCC CRL-1573)，以及原代角质形成细胞。将HUVECs在Lonza EGM-2bullet kit(内皮细胞培养基套装)中培养；如之前所述，培养了原代人角质形成细胞(Wiens,M.et al.J Biol Chem 280,27949-27959,doi:10.1074/jbc.M504049200(2005))。按照ATCC的建议，培养了所有其他细胞。所有细胞在含有5％CO 2的加湿空气中，于37℃进行培养。
小鼠细胞：CT26结肠癌细胞(ATCC CRL-2638)，CMT-93直肠癌细胞(ATCC CCL-223)，B16-F10黑素瘤细胞(ATCC CRL-6475)，Neuro-2a神经母细胞瘤细胞，CATH.神经母细胞瘤细胞。MOVCAR 5009和MOVCAR 5047卵巢癌细胞购自Fox Chase癌症中心。如之前所述(Sabichi,A.et al.The Journal of Urology 175,1133-1137,doi:10.1016/S0022-5347(05)00323-X(2006)；Tomic-Canic,M.et al.Wound repair and regeneration:official publication of the Wound Healing Society[and]the European Tissue Repair Society 15,71-79,doi:10.1111/j.1524-475X.2006.00187.x(2007))，分离了NIH/3T3成纤维细胞(ATCC CRL-1658)，C2C12成肌细胞(ATCC CRL-1772)，原发性脑膜成纤维细胞以及原代星形胶质细胞。根据ATCC指南，在含有5％CO 2的加湿空气中，于37℃培养所有细胞系。
化学试剂：MG-132、鸡卵清溶菌酶、以及脂多糖(LPS)购自Sigma。重组鼠IL-1α、IL-1β、TNFα、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、以及重组人IFN-γ、IFN-β购自preprotech。重组人IFN-α购自R&D system。在所示地方以10U/mL的浓度添加了鼠IL-1β。以1ng/ml的浓度添加了鼠IL-1β。以20ng/ml的浓度添加了鼠TNFα。以100U/ml的浓度添加了鼠IFN-α、IFN-β以及IFN-γ。在所示地方以150U/ml的浓度添加了人IFN-α。以100U/ml的浓度添加了人IFN-β和IFN-γ。以1ng/ml的浓度加入LPS。
质粒构建体：从多个EST克隆中构建了鼠Mpeg-1cDNA的完整编码区，并将其插入pEGFP-N3质粒(Clontech)。将单体的RFP代替GFP进行克隆，用于感染实验。
透射电子显微镜负染镜检：mEF用IFN-γ(100U/mL)刺激14小时，并用所示的菌株感染5小时，感染复数为30。通过用1％的Igepal双蒸水溶液裂解mEF，收获原核生物膜。裂解物在200g离心10分钟，以沉淀完整的细菌。将得到的沉淀物在较少的双蒸水中重悬，用双蒸水洗涤，并用3％的甲酸双氧铀(UF)负染30秒。在Phillips CM10透射电子显微镜上，于52,000倍初始放大率，采集图像。
抗体：兔抗Mpeg1多克隆抗体购自Abcam，并用于western blot分析。
qRT-PCR:按照RNeasy(Qiagen)的说明，从细胞中提取了RNA。使用QuantiTect反转录试剂盒(Qiagen)，按照供应商提供的方案，将1μg RNA转换为cDNA。使用 基因表达检测试剂盒(Applied Biosystems)，对鼠Mpeg1和GAPDH进行了qRT-PCR检测，后者充当管家对照基因。对于人体组织，使用了Mpeg1和GapDH探针。在Applied Biosystems 7300PCR平台上进行了所有的检测。
RNA干扰：对于鼠细胞，从Sigma获得了三种化学合成的包含19个核苷酸的mpeg1特异性双链siRNA。两种siRNA与P-2的3'UTR互补，并且第三种siRNA与编码区互补。序列如下：CCACCUCACUUUCUAUCAA(SEQ ID NO:1)，GAGUAUUCUAGGAAACUUU(SEQ ID NO:2)，以及CAAUCAAGCUCUUGUGCAC(SEQ ID NO:3)。还生成了杂乱siRNA以充当针对该反应的对照。对于人类细胞，从Ambion(Invitrogen)购得三种人mpeg1特异性的silencer select siRNA：Silencer Select#s61053,s47810,s61054。还使用了来自Ambion(Invitrogen)的#2Silencer select阴性对照。
转染：利用Amaxa Nucleofector System(Lonza)，按照厂商提供的优化方案，对各个细胞系进行了瞬时转染。
庆大霉素保护试验：将来自甘油储存液的鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)菌株LT2Z，耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)以及大肠杆菌(E.coli)菌株K12，在Luria肉汤(LB)(鼠伤寒沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，以及大肠杆菌)或在Middlebrook 7H9肉汤(耻垢分枝杆菌)中，在37℃震荡下生长24小时。对于鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)，金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.coli)，将其培养物以1:33稀释于LB中，并另外再生长3小时，以在感染前达到对数生长期。按照Lonza针对各个细胞的优化方案，转染了真核细胞，并于感染后，将细胞铺板于12孔板中。随后用IFN-γ(100U/ml)刺激该细胞14小时。在37℃,5％CO2的培养箱中，在感染复数(MOI)介于10和60的条件下，感染细胞30分钟(鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium))或1小时(金黄色葡萄球菌(S.aureus)，大肠杆菌(E.coli)和耻垢分枝杆菌(M.smegmatis))。感染后，用冰冷的PBS洗涤细胞两次，并加入新鲜的含有50μg/ml庆大霉素的培养液。2小时后，将该培养液更换，以使庆大霉素的浓度降低至5μg/ml。在所示时间点，用PBS洗涤细胞，用1％Igepal的双蒸水溶液裂解细胞，稀释，并以一式三份的形式将细 胞铺板于LB琼脂平板(鼠伤寒沙门氏菌，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)或Middlebrook7H11平板(耻垢分枝杆菌)，并在菌落大量生长后，确定CFU。
溶菌酶杀伤活性：紧随上述庆大霉素保护试验之后，在裂解之后，将该裂解物分为6等份，其中一半用终浓度为40-μg/ml的溶菌酶处理，剩下的用等体积的缓冲液处理。在进行一式两份铺板以分析CFU之前，将所有的等份在冰上孵育30分钟。
统计分析：首先根据Kolmogorov–Smirnov检验(K-S test)分析数据，以确定是否存在高斯分布。使用得到的统计值，根据各个实验中的独立变量数，分析数据。如果在两组间比较，并且根据K-S检验，数据符合高斯分布，则使用独立的测量法t检验；然而，如果不存在高斯分布，则进行Mann-Whitney检验，以评估统计显著性。对于多于两组间的分析，如果存在高斯分布，则使用独立的测量法，即单向方差分析(ANOVA)，并应用Bonferroni事后比较检验法。如果不存在高斯分布，则使用Kruskal-Wallis检验，并利用Bonferroni事后比较检验法。
结果和讨论 
目前为止，已分析的所有人类和小鼠的原代细胞和细胞系，在干扰素的诱导下，都快速表达P-2mRNA(图14A-14J，表2以及图18A-18I)。用TAQMANTM进行39个循环的PCR后，在未受刺激的原代小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)内，未表达可检测水平的P-2mRNA(图14A)。单独加入干扰素IFNα，β或γ，每个都上调了P-2mRNA；一起加入，它们则诱导了高水平的P-2mRNA。相反，LPS，IL-1α和TNFα未在mEF中诱导P-2mRNA。尽管存在个体差异，在测试的来自小鼠和人类的所有的原代细胞以及建立的细胞株中都存在这种模式的P-2诱导(图14A-14F，完整的列表见图18A-18I和表2)。尽管IFN能强效上调P-2mRNA，对于经干扰素活化的MEF，除非加入蛋白酶抑制剂MG132，否则用Western blot分析检测不到P-2蛋白(图14G)，证明通过蛋白酶降解，P-2蛋白一直发生着快速的蛋白周转。这些发现的例外发生于原代人角质形成细胞，该细胞组成性地表达P-2mRNA和蛋白(图14H)。
LPS不能在mEF中诱导P-2mRNA；然而，将mEF与大肠杆菌K12或耻垢分枝杆菌共培养，会导致P-2mRNA的表达在24h内强烈升高，在10h时已能检测到P-2mRNA水平的显著上调(图14I)。2型IFN对P-2的预诱导作用，使得mEF在庆大霉素保护试验中，能在1-5小时内，快速杀死细胞内的耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)(图14J)；在这期间，庆大霉素在完整的细胞内，是膜不通透的。相反，当将未经诱导的mEF与耻垢分 枝杆菌(M.smegmatis)培养时，对分枝杆菌的细胞内杀伤作用延迟了约16小时，并且效率较低(图14J)。P-2mRNA水平与细胞内杀菌活性的相关性提示具有因果关系。
P-2介导的对细菌的杀伤作用预测了(1)在电子显微镜下，被mEF杀死的细菌的细胞壁上具有损伤，以及(2)当用P2-siRNA抑制P-2mRNA时，抑制了细胞内杀伤作用。在感染后5小时，通过用去污剂裂解宿主细胞，从经2型IFN诱导的mEF中分离出细胞内的耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。此时大部分的细胞内分枝杆菌是死亡的，因为没有菌落形成(图14J)。通过离心，将细菌与细胞裂解物分离。由于膜结合的P-2聚合物是耐胰蛋白酶降解的，因此，类似于Perforin-1和聚C9，用胰蛋白酶和溶菌酶处理了细菌沉淀物，随后通过负染的电子显微镜，在250,000x放大率下，进行检查。分枝杆菌膜和葡萄球菌膜的图像显示，膜的伤口与聚P-2预期的形态是一致的(图15A，15B，15D，15E)，这类似于在HEK293膜上稳定过量表达的P-2阳性对照(图15C)以及在大肠杆菌上造成补体损伤的膜攻击复合物(MAC)(图15F)。将图15B进行更高倍的放大，显示在本该光滑的MRSA细胞壁背景上，可见多簇环状或不规则融合的、充有负染液的伤口，平均内径为9-10nm(图15A箭头所示)。类似的膜伤口可见于耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)膜(图15D和15E中箭头所示)，以两种放大倍数显示。在细菌膜上，可见斑点形式的P-2伤口簇，表明细菌与携带P-2的膜局部接触，导致P-2发生聚合以及聚P2插入细菌的细胞外壁，产生了电子显微镜中所见的伤口。在庆大霉素保护试验中，直肠上皮癌细胞CMT93杀死了耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)(MRSA的临床分离株)，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)，和大肠杆菌(E.coli)K12(图16A-16D)。用RFP标记的P-2-RFP转染CMT-93细胞后，增强了杀伤作用，但单独转染RFP无此效应。相反，用P-2siRNA,而非杂乱siRNA转染，消除了杀菌活性，导致除大肠杆菌(E.coli)外的所有被测细菌发生细胞内复制。由于这种复制，MRSA和耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)几个小时后杀死了宿主细胞，并被释放入含有庆大霉素的基质，在那里它们被抗生素杀死。在绝大多数情况下，试验限于绝大多数的P-2依赖的细菌杀伤作用发生的最初的5小时。在内源性P-2缺失的细胞内，通过转染P-2-RFP可恢复对细菌的杀伤作用；P-2-RFP由于缺失内源性P-2的3’UTR，因而是抑制耐受的(图163E)。
所有组成性地或诱导性地表达P-2mRNA的小鼠和人类细胞，都能够杀死所有这四种细菌菌株。图16F-16L以及补充性的图20A-20B中的实施例，显示了P-2siRNA抑制细胞 内杀伤活性，证明P-2介导的对细菌的细胞内杀伤作用是先天性免疫的重要组成部分，防止细胞内细菌的入侵。
在菌落形成试验中使用相差光学显微镜检查已铺板的细菌，允许对菌落进行早期确定和计数，这节约了时间，对于分枝杆菌(Mycobacteria)尤其明显；分枝杆菌需要2-3天来形成肉眼可见的菌落，但使用显微镜，在铺板后的12h就已经能检测到菌落。以这种方式检查耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)，注意到，5h后从宿主细胞分离得到的细菌，大部分具有未形成菌落的、肿胀、饱满的菌体，表明它们是死亡的(图17A，17B)。从培养物新鲜铺板的活的分枝杆菌(Mycobacteria)具有螺丝锥的形态(图17A)，并能形成菌落(未显示)。对于在5h时分离得到的分枝杆菌，在体外、于冰上向其加入溶菌酶，作用30分钟(图17C)，导致了大部分饱满的菌体消失，表明它们发生了裂解，但不影响少数活细菌的螺丝锥形态，这些活细菌正开始形成菌落(图17C中箭头所示)。因此，细菌细胞壁上的聚P-2伤口介导了对溶菌酶裂解作用的易感性，该易感性可通过计数所有的细菌并报告在有和没有溶菌酶加入的情况下，饱满的菌体的百分比，来进行定量(图17E)。
通过在mEF和CMT93细胞中抑制和过量表达P-2，并使用耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、MRSA、和大肠杆菌(E.coli)，进一步研究了P-2对细胞壁的损伤作用对溶菌酶效应的影响，所有这些细菌在未被损伤的情况下是耐溶菌酶的(图17E-17J，图23A-23C)。对宿主细胞进行去污剂裂解后，在不同时间获得细菌，在含有正常的P-2水平的杂乱siRNA对照组中，向细菌中加入溶菌酶显著减少了菌落的数量(图17E和17H)，证明某些细菌的细胞壁已遭破坏；但是这些细胞壁是可以修复的，除非是通过聚-P-2、经由细胞壁损伤进入的溶菌酶裂解了该细菌。当用P-2siRNA抑制P-2时，检测不到溶菌酶的杀菌效应(图17F和17I)，表明不存在聚-P-2介导的细胞壁损伤；但当伴随着内源性P-2而过量表达P-2-RFP时，溶菌酶的杀菌效应更显著，引起更多的P-2介导的细胞壁损伤(图17G和17J)。
上述数据表明，在成孔蛋白Perforin-2的协助下，显然我们所有的细胞都有能力成为杀伤细胞并消除细胞内细菌的入侵。P-2在很早期发挥作用，通过插入脂双层并聚合，破坏细菌的细胞壁；这与补体攻击膜过程中的C9聚合，以及CTL攻击被病毒感染的细胞和肿瘤细胞过程中的Perforin-1聚合是类似的。所有这三个孔形成物都具有MACPF结构域，该结构域已显示能在Perforin-1中诱发聚合，并很有可能介导Perforin-2中同样的功能。MAC的聚-C9孔为血清溶菌酶提供入口，导致细菌裂解和 结构坍塌；同样地，聚-Perforin-1孔为颗粒酶提供入口，该颗粒酶通过多种凋亡和非凋亡通路，介导细胞死亡。类似的，聚-Perforin-2孔为溶菌酶、ROS、NO、以及可能其他抗微生物的化合物提供入口，以增强细菌杀伤作用。因此，由成孔蛋白导致的物理性膜损伤是常见的免疫防御模式。通过物理性攻击，Perforin-2杀死细胞内细菌，MAC杀死细胞外细菌，以及Perforin-1杀死被病毒感染的细胞。在所有情况下，由孔形成物导致的细胞壁/膜损伤，可用作额外细胞毒性分子进入的口岸，以完成该任务。在这三个共享MAC/PF结构域的孔形成物中，Perforin-2似乎是最古老的，已存在于海绵和其它无脊椎动物中。它与其它两个孔形成物的不同之处在于，它作为跨膜蛋白，被来自胞质结构域的跨膜信号活化。阐明该信号机制很有可能提供药物靶点，以增强或减弱P-2的活性，以及揭开细菌的躲避机制。
表2.所有被测试细胞系的总结。N.D.代表未检测P-2依赖的杀伤作用。
实施例4：Perforin-2防止致命的细菌感染
活性氧和氮的中间体以及提升通透性的蛋白是重要的抗菌效应物，然而，额外的杀菌效应物被认为是存在的。我们现在显示，成孔蛋白Perforin-2对于防止胞内细菌复制是必需的。Perforin-2在体内是无所不在的，它能杀死革兰氏阳性、阴性细菌以及抗酸细菌。Perforin-2缺陷的小鼠死于口胃沙门氏菌(oro-gastric Salmonella)的感染，该感染在具有Perforin-2的小鼠中被清除。Perforin-2是一种跨膜蛋白，其MACPF杀伤结构域伸进膜囊泡的内腔，该膜囊泡在感染后易位至包含细菌的液泡上。被Perforin-2杀死的细菌，在它们的细胞壁上具有成簇的的孔，这可能使细菌针对活性氧和氮的中间体更具易感性。病原性细菌扰乱了Perforin-2的表达或活化，并且在患者中，不愈合的、慢性感染的皮肤溃疡抑制了Perforin-2的水平。研究Perforin-2作用的通路将为新型的针对威胁生命的细菌感染的治疗途径提供机会。
在小鼠中敲除Perforin-2导致沙门氏菌复制失控和致命性
为了在体内确定Perforin-2的生物学重要性，我们用同源重组的方法，生成了Perforin-2敲除(P-2-/-)小鼠。该小鼠具有C57Bl6和129的混合遗传背景，提供了次要MHC抗原的差异，并进而生成有限的多样性。P-2-/-小鼠在无病原体的条件下，正常地发育和茁壮成长。如前所述，对纯合的P-2-/-、杂合的P-2+/-、以及野生型的P-2+/+同窝小鼠，经口胃强行施以鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。在链霉素预处理后24h，用105的耐链霉素沙门氏菌感染P2+/+小鼠，导致在感染后的前5天内体重轻微下降(<10％)，随后在第9天完全恢复(图25a)。相反，纯合的P-2-/-小鼠发展出与体重渐进性减轻相关的血性腹泻，持续至第5或6天，此时对它们进行安乐死用于分析，并防止更多的痛苦。甚至只用102个沙门氏菌就导致在P-2-/-小鼠中发生渐进性疾病并致死。与P-2+/+同窝小鼠相比，P-2+/-同窝小鼠具有更严重的疾病，但得到了恢复(图25a)。
经鼠伤寒沙门氏菌感染的P-2-/-小鼠表现出严重的体重减轻，这与细菌在血液中的高细菌滴度及其向多个器官的分散有关(图25b)。病理组织学检查显示了小肠和大 肠中的上皮屏障发生了完全溶解，以及大规模的细胞浸润，然而，这种浸润未能清除所述细菌(未显示)。
还在体外分析了来自P-2-/-小鼠(P-2-/-PEM)的、经IFN-γ活化的腹腔渗出巨噬细胞对沙门氏菌的击退作用。将PEM感染一个小时，洗涤并随后进行所示时间的孵育，将其裂解，并确定CFU。在P-2-/-PEM内，沙门氏菌复制至高数量。相反，在P-2+/+PEM中，它们的数量在4h时减少了约50％，并随后保持稳定。杂合的P-2+/-PEM仅延后了沙门氏菌的复制。为了进行比较，在野生型PEM中利用siRNA对P-2的抑制，与P-2-/-PEM类似，验证了该抑制技术(图25c)。
干扰素在所有细胞中诱导Perforin-2并且赋予杀菌活性
沙门氏菌在P-2-/-小鼠中的快速扩散表明，在P-2-/-小鼠中，没有细胞能制止细菌分散。因此，我们研究了哪种细胞类型组成性地表达P-2或能被诱导表达P-2。表2汇总了该数据。PMN、巨噬细胞、树突细胞和小胶质细胞组成性地表达Perforin-2mRNA和蛋白，IFN-γ和LPS进一步上调了所述蛋白(数据未显示)。同样地，人原代角质形成细胞和来自取自慢性伤口边缘的组织样品的角质形成细胞(图27)相似地组成性地表达P-2。所有其他被测的细胞和细胞系仅在IFN-α、-β或-γ处理后，表达P-2mRNA。所有表达P-2的细胞能够控制细胞内细菌的感染，然而，当用siRNA抑制P-2时，该控制作用被消除。人PMN细胞和巨噬细胞组成性地表达P-2蛋白(图26a)。由来自HL60的维甲酸在PMN中诱导抑制Perforin-2，显著抑制了杀菌活性并使得MRSA、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)能在细胞内复制(图26a)。同样地，对P-2的抑制显著抑制了在肠上皮细胞(直肠癌CMT93)(图26b)、人内皮细胞(HUVEC)(图26c)和人宫颈癌上皮细胞(HeLa)(图26d)内，对细胞内细菌的杀伤作用。由转染P-2-GFP导致的P-2表达的上升，提升了杀菌活性，该活性对于消除鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)是很重要的(图26e)。对于被特异性针对P-2的3’端非翻译区的siRNA抑制的内源性P-2，用P-2-GFP或P-2-RFP转染对其进行了补充，并在MEF(图26f)或吞噬细胞(未显示)中完全重建了杀菌活性。综上，我们的数据表明，细胞广泛地表达、或能被诱导表达P-2，并且P-2对于杀死或抑制至少这三种被测细菌的细胞内复制来说，是必需的。
细菌能阻断对Perforin-2的诱导和活化 
P-2强效的杀菌活性表明，细胞内细菌必须进化出逃避Perforin-2的策略。原则上，细菌能在非吞噬细胞中阻断Perforin-2的转录，导致在组成性表达Perforin-2的细胞中 下调Perforin-2或干扰Perforin-2的活化和聚合。用实验室菌株大肠杆菌(E.coli)K12感染初始MEF细胞，导致快速诱导了P-2mRNA并随后杀死所述细胞内细菌。不同于大肠杆菌(E.coli)，活的野生型鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)未在MEF中诱导P-2mRNA(图27a)。相反，热杀死的或PhoP突变的沙门氏菌(Salmonella)在MEF中诱导了P-2mRNA，程度与大肠杆菌(E.coli)相似，表明鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)有效抑制了对P-2的诱导。同样地，用专性的细胞内细菌沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)感染HeLa细胞，不会诱导P-2的表达。此外，通过一种需要重新合成衣原体蛋白的机制，充分抑制了外源性IFN对P-2的诱导作用(图27b)。EPEC能阻断内吞作用，但吞噬细胞能克服这种抑制(图27c)。被内吞的EPEC，只有当其携带有编码脱酰胺酶的Cif质粒时(图27d)，才能被保护不受Perforin-2的作用，所述脱酰胺酶使NEDD8(一种泛素样分子)失活。NEDD8是活化cullin环E3泛素连接酶(CRL)所必需的，CRL参与很多基本的细胞途径，包括NFκB的活化。使用NEDD8特异性的E2连接酶Ubc12进行类泛素化修饰(Neddylation)。P-2的胞质结构域在酵母双杂交系统中与Ubc12相互作用，并与P-2免疫共沉淀(补充图27)，表明Perforin-2介导的杀伤作用需要对CRL进行Ubc12介导的类泛素化修饰，并且CIF阻断了这一步。
如表2所示，角质形成细胞组成性地表达Perforin-2mRNA和蛋白，这表明其对皮肤防止感染的防御功能有作用。我们在10例伴有高细菌负荷的、未愈的慢性皮肤溃疡患者中，检测了真皮和表皮中P-2的表达水平。作为标准护理的一部分，对伤口和伤口边缘进行了手术清创切除术。随后，将切下的皮肤分为邻近伤口的和邻近正常皮肤的两部分，分离成真皮和表皮，并用TaqMan-PCR定量P-2mRNA的水平。Perforin-2mRNA在邻近慢性溃疡皮肤上的表皮细胞中的水平，比在邻近正常皮肤的细胞中的水平低大约35倍。相反，在下面的真皮中，P-2mRNA的比值具有相反的方向，伤口附近的P-2mRNA水平高了4倍(图27d)。所述数据显示了在伴有高细菌负荷的慢性皮肤溃疡中，P-2的水平受到了影响，并可能与延后愈合相关。
Perforin-2增强活性氧和氮簇的杀菌活性
当前模式表明，可由活性氧和氮簇以及通过被吞噬细菌与溶酶体的融合，杀死细胞内细菌。本申请中，我们分析了每个效应物途径的杀菌效率以及它们的协同作用。我们各自阻断了各个效应物，并确定了鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)和耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)在细胞内的存活和复制，或者杀伤结果。用肠上皮细胞(CMT93) (未显示)开展了这些实验，并且在经IFN-γ活化的PEM上(图27e)也得到了几乎相同的结果。首先，我们确定，被IFN-γ活化的以及被LPS刺激的PEM产生了ROS和NO，并且这种产生不受P-2siRNA抑制的影响。我们还确定，所述使用的ROS和NO的抑制剂特异性地、有效地阻断了ROS或NO(未显示)。PEM能够在感染后在最初四小时内，杀死约90％的细胞内沙门氏菌(Salmonella)，在这段时间内，所有三个效应物在经杂乱siRNA转染的细胞中都是有效的(图27e中，实线所示)。对P-2的抑制彻底消除了对沙门氏菌(Salmonella)的杀菌活性，并允许它们在细胞内复制(图27e，虚线)。使用NAC和NAME对ROS和NO进行额外的抑制，并没有进一步的效应。在P-2存在的情况下(杂乱的siRNA，蓝色和绿色实线)，对ROS或NO的抑制也显著减弱了杀菌活性；但是P-2的存在仍然阻断了细菌的复制。在4小时内，耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)对杀菌效应物的杀伤作用更耐受。尽管如此，Perforin-2的抑制显著抑制了对耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)的杀伤作用，并且，额外地抑制ROS或NO并没有进一步的效应。在没有抑制P-2的情况下阻断ROS或NO，只能有限地、非显著性地影响针对分枝杆菌的杀菌活性。相反，即使没有P-2，非病原性的实验室菌株大肠杆菌K12对ROS和NO的细胞内杀伤作用还是敏感的，虽然效率显著低于P-2存在时的效率。所述数据表明，Perforin-2与活性氧和氮簇协同作用，以及如之前所述，也与溶菌酶协同作用，并且细菌对单个效应物的易感性是有差异的。
Perforin-2易位至包含细菌的液泡
在没有感染的情况下，Perforin-2嵌入核周囊泡隔室的膜中进行存贮(图28b)。因此，为了行使杀伤作用，必须将Perforin-2转运至细菌感染部位。Perforin-2具有一个短且高度保守的胞质结构域，可与胞质蛋白相互作用，促发P-2的易位和聚合(图28a)。由Y至F的突变(如图28A的红色箭头所示)阻断了P-2的杀菌活性，表明其对于P-2活化起到重要功能(未显示)。
通过共聚焦显微镜检，我们测试了Perforin-2向包含细菌的液泡的易位。在这些实验中，在BV2细胞中抑制了内源性Perforin-2，并通过瞬时转染，利用P-2-GFP重构内源性Perforin-2。用沙门氏菌(Salmonella)感染了BV2细胞，该细菌通过诱导内吞作用，有效地侵入细胞(图28b)。在这个实验中，通过用DAPI染色细菌的DNA，对细菌进行了成像(为了更好的可视性，以白色显示)，并用P-2-GFP进行了共定位的成像。在感染后五分钟，已经内吞了一些沙门氏菌(Salmonella)并且看起来已被裂解，因为从被内吞的沙门氏菌中释放出来的DNA被DAPI染色成“云”。三个1.2μ厚 度的切片，显示了被裂解的沙门氏菌的数量(8个)以及由DAPI和P-2-GFP揭示的、包含弥散DNA的内吞囊泡的大小。在底部切片上(左侧图)，在细胞外仍可见一个完整的、经DAPI染色(箭头所示)的沙门氏菌，其形如棒状结构；而在顶部的两个1.2μ切片上，未有完整的沙门氏菌。我们也通过用GFP标记的大肠杆菌(E.coli)进行感染，分析了经瞬时转染P-2-RFP的BV2细胞上的P-2的易位。在感染的五分钟内，在包含细菌的液泡的膜上以及所述细胞上，发现了P-2(图28b)。荧光强度表明Perforin-2高度富集于此位点，表明特异性靶向机制。所述细菌呈现出碎片的形式，并已释放GFP；检测到GFP以弥散的荧光存在于液泡中。所述数据提示，Perforin-2在感染的数分钟内，完成向包含细菌的液泡的易位；并且这种易位与细菌在液泡内的碎片化以及它们的DNA释放相关，这与细菌细胞壁上的P-2攻击和孔的形成是一致的。
Perforin-2在细菌细胞壁上形成～的孔
Perforin-2于感染数分钟内聚集于包封细菌的膜上，其效应结构域指向内腔，这一发现表明，Perforin-2可能通过在细菌细胞壁上聚合并形成充水的孔，来给细菌以致命打击，所述充水孔增强了其他杀菌因子的穿透力，这与补体C9以及Perforin-1的细胞毒性机制相似。我们确定了Perforin-2形成孔的能力，这是以前未曾报道的。我们推断，类似于C9或Perforin-1的单体分子，Perforin-2的单体分子没有细胞毒性，并且孔的形成需要P-2聚合，该聚合是通过P-2的胞质结构域与尚未知的信号蛋白的相互作用而实现的。Perforin-2的胞质结构域包含保守的RKYKKK(SEQ ID NO:4)序列(图28a，蓝色箭头所示)，该序列紧接于跨膜结构域，可能作为蛋白水解切割位点发挥作用，以在膜的对侧促发P-2聚合。通过以下步骤对此进行了试验：使用差速离心法从经P-2-GFP转染的HEK293中纯化含有Perforin-2-GFP的膜，并用低水平的胰蛋白酶对该膜进行简单的处理，以切割胞质结构域(未显示)。对经胰蛋白酶处理的Perforin-2-GFP膜进行电子显微镜检，显示了典型地跨膜孔，平均内径为(图29a,白色箭头所示)。此外，在聚合过程中，Perforin-2融合形成半环状的、形如“8”的,以及更加不规则的结构(黑色箭头所示)，这与持续进行直至环关闭的聚合过程是一致的。如同C9和Perforin-1，对膜蛋白的空间位阻作用可能阻断环的闭合。未被转染的细胞没有这样的孔(未显示)。这些数据直接显示了Perforin-2的确是一个成孔的跨膜蛋白，其能潜在地在位于液泡内的细菌的细胞壁上形成孔。由于Perforin-2是一种膜蛋白，具有指向囊泡内腔的MACPF结构域，所以，孔的形成将在接触位于囊泡内的MACPF结构域的膜上发生。
为了测试P-2-孔是在被杀死的细菌上进行组装的，我们在感染后3小时，通过低渗非离子去污剂裂解作用，从被IFN活化的、具有足够Perforin-2的MEF细胞中，得到了细胞内细菌。不同于磷脂双层，细菌细胞壁对温和去污剂的裂解是耐受的；通过离心获得细菌细胞壁，并用电子显微镜进行成像。在耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)的细胞壁上，可见许多成簇的孔(约)(图29b白色箭头所示)，经常伴有不规则结构(黑色箭头所示)。由耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)的刚性的细胞壁产生的空间位阻，似乎经常干扰Perforin-2聚合物的环的闭合，导致形成更不规则的聚合物。通过负染，发现耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)细胞壁上孔外的部分，其表面染色程度很低，这与已知的分枝杆菌细胞壁的疏水性是一致的。相反，通过允许负性染液附着，金黄色葡萄球菌(S.aureus)的细胞壁呈现出比分枝杆菌的细胞壁更高的亲水性。由Perforin-2孔的不规则性(黑色箭头)和多变的尺寸(图29c)可以判断，金黄色葡萄球菌(S.aureus)的细胞壁比磷脂膜更加刚性。
材料与方法 
质粒构建体 
从若干EST克隆中构建鼠mpeg1cDNA的完整编码区，并将其插入pEGFP-N3质粒(Clontech)。用单体RFP(R.Flavell,Yale)代替GFP进行克隆，以用于一些实验。
细胞系和原代细胞
RAW264.7、J774、HL-60、和HEK-293细胞系获自ATCC。BV2小胶质细胞系来自迈阿密大学的J.Bethea博士的馈赠。按照ATCC的建议，在含有5％CO2的湿润空气中于37℃培养所有的细胞。如之前所述，利用维甲酸，将HL-60朝PMN表型进行分化。如之前所述，从巯基乙酸盐促发的腹膜或骨髓中获得鼠原代巨噬细胞。人巨噬细胞和PMN分离自新鲜健康的供体PBMC。如之前所述，人巨噬细胞分化自单核细胞；并且如之前所述，分离了人PMN。如之前所述，分离了鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。
1.菌株：
2.在Luria肉汤(LB)中，接种鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)菌株LT2Z(由迈阿密大学的G.Plano博士馈赠)、K12大肠杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(S.aureus)(由迈阿密大学的G.Plano博士馈赠)。
3.在Middlebrook 7H9肉汤中，接种鸟胞内分枝杆菌(M.avium intracellulare)(由迈阿密大学的T.Cleary博士馈赠)和耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)(ATCC)。
化学试剂和细胞因子
脂多糖(LPS)购自Sigma并且使用时的终浓度为1ng/ml。重组人和鼠IFN-γ购自Peprotech并且使用时的终浓度为100U/ml。N-乙酰胱氨酸和L-NAME均购自Sigma。
抗体
从Abcam购买兔抗Mpeg1，人抗Mpeg1，以及抗GFP的多克隆抗体，并用于western blot分析。兔抗Perforin-2(胞质结构域)的抗血清由从21st Century生产并购买。
qRT-PCR
按照RNeasy(Qiagen)的说明，从细胞中提取了RNA。使用QuantiTect反转录试剂盒(Qiagen)，按照供应商提供的方案，将1μg RNA转换成cDNA。使用基因表达检测试剂盒(Applied Biosystems)，对鼠mpeg1，GAPDH，以及β-Actin进行了qRT-PCR。对于人体组织，使用了人mpeg1，GAPDH，以及β-Actin的探针。在Applied Biosystems 7300PCR平台上进行了所有的检测。
庆大霉素保护试验
细胞内的杀菌活性改编自。简单来讲，在感染前，于37℃震荡下，使细菌在Luria肉汤(LB)中生长16-18小时(鼠伤寒沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，以及大肠杆菌)或在Middlebrook 7H9肉汤(分枝杆菌)中生长24小时。对于鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，则随后将其培养物以1:33稀释于LB中，并另外再生长3小时，以允许所述细菌进入对数生长期，以及针对沙门氏菌诱导其侵袭性表型。按照Lonza针对各种细胞的优化方案，转染了真核细胞，并于感染后，将细胞接种于12孔板中。对于经RA诱导分化的HL-60细胞，不进行刺激；用LPS(1ng/ml)和IFN-γ(100U/ml)刺激了RAW264.7细胞，以使其向巨噬细胞系分化；用物种特异性的IFN-γ(100U/ml)刺激了其他所有细胞。在37℃,5％CO2的培养箱中，在感染复数(MOI)介于10和60的条件下，感染细胞30分钟(鼠伤寒沙门氏菌)或1小时(金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和耻垢分枝杆菌)。感染后，用冰冷的PBS洗涤细胞两次，并加入新鲜的含有50μg/ml庆大霉素的培养液。2小时后，更换该培养液，以使庆大霉素的浓度降低至5μg/ml。在所示时间点，用PBS洗涤细胞，用0.1％Igepal的双蒸水溶液裂解细胞，稀释，并以一式三份的形式将细胞铺板于LB琼脂平板(鼠伤寒沙门氏菌，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)或Middlebrook 7H11平板(分枝杆菌)上，并于菌落生长后，确定CFU。
不含庆大霉素的细胞内细菌杀伤试验
改进了庆大霉素保护试验，以形成不含庆大霉素的细胞内细菌杀伤试验。对上述试验所做的改进包括将真核细胞铺板，使其在感染时的融合度达90-100％，以及使感染复数(MOI)降至5和15之间。侵入时间保持不变，对鼠伤寒沙门氏菌为30分钟，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、和耻垢分枝杆菌为1小时；并且在37℃，5％CO2的培养箱中发生感染。为了确保最大程度去除细胞外细菌，将洗涤步骤改变成以下方式，即用冰冷的PBS洗涤细胞两次，用胰蛋白酶消化细胞，以帮助去除细胞外细菌附着物，并用冰冷的PBS再额外洗涤3次。每四个小时，除去培养基，并用PBS洗涤所述细胞两次，并随后加回新鲜培养液。于所示时间点，用PBS洗涤细胞三次，并用1％的Igepal双蒸水溶液裂解细胞，进行稀释，并一式三份将其铺板在LB琼脂平板上(鼠伤寒沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，大肠杆菌)或Middlebrook 7H11平板上(分枝杆菌)，在菌落生长后确定CFU。
RNA干扰
对于鼠细胞，从Sigma获得了三种化学合成的、包含19个核苷酸的Perforin-2特异性siRNA双链。两种siRNA与Perforin-2的3'UTR互补，并且第三种siRNA与编码区互补。序列如下：CCACCUCACUUUCUAUCAA(SEQ ID NO:1),GAGUAUUCUAGGAAACUUU(SEQ ID NO:2),和CAAUCAAGCUCUUGUGCAC(SEQ ID NO:3)。还生成了一种杂乱siRNA，以用作所述反应的对照。对于人细胞，从Ambion(Invitrogen)购得三种人Perforin-2特异性的silencer select siRNA：Silencer Select#s61053,s47810,s61054。还使用了来自Ambion(Invitrogen)的#2Silencer select阴性对照。使用Amaxa Nucleofector System(Lonza)，按照厂商的说明，将siRNA转染进所有细胞中。所有转染使用了1-4×106个细胞，终浓度300nM的siRNA(将Perforin-2特异性的siRNA合并)，以及2μg质粒DNA(另有说明)。转染后立即将细胞铺板于不含抗生素的完全培养基中。
透射电子显微镜负染镜检
真核生物膜：通过N2空化和差速离心法，从被稳定转染的Perforin-2-GFP HEK-293细胞中分离出膜。将膜重悬于小体积的中性Tris缓冲盐液中，用100μg/ml胰蛋白酶37℃处理1h，洗涤，并用5％的中性钠磷钨酸负染30秒。在Phillips CM10透射电子显微镜上，于52,000倍初始放大率，采集图像。
细菌膜：用IFN-γ(100U/mL)刺激MEF14小时，并用所示细菌菌株感染MEF 5小时，感染复数为30。通过用1％的Igepal双蒸水溶液裂解MEF，收获原核生物膜。所述裂解物在200g离心10分钟，以沉淀完整的细菌，随后用polytron剪切完整的细菌，以破坏完整的细菌并分开膜。所得到的沉淀物经100μg/ml的胰蛋白酶于37℃处理1小时，沉淀，并在极少量的双蒸水中重悬，并用3％的铀酸盐负染30秒。在Phillips CM10透射电子显微镜上，于52,000-168,000倍的初始放大率，采集图像。
共聚焦显微镜检
对于定位Perforin-2-GFP，在铺有1.5号盖玻片的玻璃底的皿(MatTek Corp)中，用Perforin-2-GFP瞬时转染了RAW264.7细胞，并用LPS(1ng/ml)和IFN-γ(100U/ml)过夜刺激该细胞。用PBS洗涤细胞一次，并标记细胞器。对于标记内质网(ER)，我们使用了1μM工作浓度的ER-TRACKERTM Blue-White DPX(Invitrogen)，在37℃作用30分钟。对于所有其它的染色，用3％的多聚甲醛(PFA)室温下固定被转染的细胞15分钟，用0.5％皂甙渗透化细胞，用10％的正常山羊血清封闭细胞，并用一抗和二抗进行孵育。使用抗CD107a(LAMP-1)(BD Pharmingen公司)、抗CD11b(BD Pharmingen)、抗golgin97(Invitrogen)、抗EEA1(Calbiochem)、抗GM130(BD Biosciences)抗体，以及Hoechst 33258(Invitrogen)来鉴定细胞器。所有二抗均在山羊体内生成。将样品保存于PBS中，并室温下，在装有自动滑台和Leica DFC495摄像机的Leica SP5倒置共聚焦显微镜上，进行成像。使用Leica应用套件的先进的荧光软件分析图像，并应用了反褶积处理(deconvolution processing)。
对于Perforin-2-RFP和大肠杆菌(E.coli)的定位成像，将Perforin-2-RFP和靶向内源性Perforin-2的3’UTR的siRNA共转染BV2细胞，并于所述细胞贴盖玻片后，用IFN-γ(100U/ml)过夜刺激该细胞。在MOI为100时，用GFP-大肠杆菌感染细胞5分钟，此时用PBS洗涤该细胞两次，并于室温用3％PFA固定15分钟。利用Vectashield封片剂将盖玻片封于载玻片上，并于室温下，在装有自动滑台的Leica SP5倒置共聚焦显微镜以及Zeiss LSM710倒置共聚焦显微镜上成像。使用Leica应用套件的先进的荧光软件分析图像。
Leica SP5共聚焦显微镜使用了plan-apochromat 63x/1.4NA物镜，405,488,561nm的激光(如果包括了Cy5或Alexa Fluor 647，则使用633nm的激光)。像素尺寸设置为60nm，以达到二维Nyquist取样(针对500nm的光，衍射极限为214nm)。
Zeiss LSM710共聚焦显微镜使用了plan-apochromat 63x/1.4NA物镜，405,488,561nm的激光(如果包括了Cy5或Alexa Fluor 647，则使用633nm的激发光)。像素尺寸设置为60nm，以达到二维Nyquist取样(针对500nm的光，衍射极限为214nm)。
实施例5：明确RASA2/GAP1MP-2的相互作用在清除细胞内细菌中的作用
在巨噬细胞、小胶质细胞、mEF、HeLa以及其他新鲜取出的细胞或细胞系中，P-2siRNA对P-2的抑制作用阻断了对细胞内细菌的杀伤和清除作用，所述细菌包括病原性的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)(图30A)和鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)(未显示)，这些是在庆大霉素保护试验中确定的，并且也不存在抗生素(未显示)。图30中，在感染前24h，用两种特异性针对P-2的3’UTR的siRNA组成的siRNA池，或对照的杂乱siRNA，瞬时转染了直肠上皮细胞(A)或小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)(B)，所述siRNA池的转染抑制了P-2RNA和蛋白(图31C)；对于补充P-2(B)，用P-2siRNA和对抑制耐受的P-2-RFP(不表达内源性P-2的3’UTR)一起，或用对照RFP，共转染了细胞。P-2-RFP是融合蛋白，其用单体DsRed(RFP)在P-2的C端进行了标记。转染的P-2-RFP能完全有效地杀死细菌(图30B,C)。在-16h时，加入了IFN-γ，以诱导P-2mRNA(当P-2siRNA存在时，P-2mRNA是被抑制的)。在时间点为0时，用病原性的MRSA、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)感染所述细胞30-60min，感染复数(MoI)为每个细胞30-50个细菌。在细胞内感染后，在PBS中冲走细胞外细菌，并将所述细胞重新铺板在庆大霉素中，以抑制细菌在细胞外复制。感染后立即，以及在感染后的某些时间点，用温和去污剂(NP40)裂解所述宿主细胞，并通过复制菌落形成试验，计数存活的细菌。温和去污剂裂解宿主细胞的膜，但不裂解细菌的细胞壁。
在直肠上皮细胞中(图30)，对照的杂乱siRNA的转染不影响P-2，并且不抑制所述上皮细胞杀死细胞内细菌的能力，而P-2siRNA阻断了杀伤作用并允许细胞内复制，杀死所述宿主细胞。除内源性P-2之外，再表达P-2-RFP，升高了细菌杀伤作用(图30A)。当抑制内源性P-2时，用P-2-RFP进行补充，恢复了杀伤作用(图30B)。正如对先天性防御机制所预期的那样，P-2能够杀死具有非常多样化的细胞外壁的细菌，例如革兰氏阴性的沙门氏菌(Salmonella)，革兰氏阳性的葡萄球菌(Staphylococci)以及抗酸的分枝杆菌(Mycobacteria)。
ROS和NO是已知的能杀死吞噬体内细菌的效应物。因此，我们直接比较了阻断 P-2或ROS(用NAC)或NO(用NAME)对经IFN-γ活化的腹膜巨噬细胞的杀菌活性的影响，针对的细菌包括鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、分枝杆菌(Mycobacteria)和MRSA(图31)。所有细菌的数据都很相似，在图31中用鼠伤寒沙门氏菌的数据进行了显示。当未抑制P-2,ROS和NO时，具有出色的细胞内杀伤作用(图31中标记为P-2,ROS,NO的线条)。在不存在P-2的情况下，尽管有ROS和NO，细菌还是能复制的。用NAC抑制ROS，或用NAME抑制NO，减慢了杀伤活性，表明ROS和NO都增强了P-2介导的杀伤作用。
所述数据显示了P-2对于杀死细胞内的病原性细菌是很关键的，这是因为在不存在P-2的情况下，所述细菌能在细胞内复制(图30和图31，红色的ROS和NO曲线)。这是一个关键的区别。细菌持续的复制能杀死宿主细胞，并且在体内，会将感染传播至其他细胞。我们有数据显示，目前为止已测试的所有吞噬性的和非吞噬性的人和小鼠细胞及细胞系都利用Perforin-2来消除细胞内细菌(表2)。非吞噬性细胞利用自噬来清除细胞内细菌。我们的数据表明，P-2可能与自噬合作，以对细菌进行致命打击。
P-2-GFP是一种跨膜蛋白，在静息态的BV2(图32a，顶部两图)和RAW细胞(图33)内，定位于核周膜囊泡室。部分P-2-GFP(绿色)与橙色的RASA2(以黄色显示)共定位(图32a和33)。LC3-RFP(红色)比RASA2或P-2更均匀。DAPI染色将细胞核显示为蓝色。
通过促发III型分泌系统介导的内吞作用，沙门氏菌能在5分钟内有效地侵入细胞。通过DAPI(DNA)染色，可以看见细菌，在图32a中的所有下图中，以白色(为了更好的可视性)显示了细菌。完整的细胞外沙门氏菌具有棒状的外观(白色箭头)。在将经IFN活化的BV2细胞(巨噬细胞来源的小胶质细胞)与鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)孵育5分钟后，可见一些沙门氏菌被细胞内吞，并已经释放它们的DNA(DAPI和P-2-GFP图中的星号，箭头表示与细胞外沙门氏菌的形态比较)，这很有可能是因为它们已经被P-2-GFP杀死了。被内吞的细菌存在于液泡中，所述液泡的膜有P-2-GFP、RASA-2和LC3-GFP的染色。在这个实验中，已经用siRNA抑制了内源性的P-2，并用转染的P-2-GFP进行了重构。转染的混合物还包含LC3-RFP。大肠杆菌显示了类似的数据(图32b)。这些数据直接支持P-2介导了对液泡内细菌的杀伤作用并且RASA2参与P-2的易位，以及作为自噬的标记物的LC3暗示自噬参与了P-2介导的对细胞内细菌的杀伤作用。
这些数据是用吞噬性细胞收集到的；现在我们想在依赖于自噬以清除细菌的非吞 噬性细胞中确定这些机制。这些研究很有可能将P-2与自噬联系起来，并为自噬产生的致命打击提供分子机制。
被内吞的细菌最初是靠近质膜的，在那里自噬在感染数分钟内得到启动。位于包含细菌的液泡上的Rab5募集了vpS34，vpS34是与自噬相关的PI3激酶。液泡成熟为吞噬体和自噬体的过程，分别需要PI3P和PI(3,4,5)P3的生成。我们认为，RASA2通过从核周膜易位而与液泡上的PIP3结合。RASA2可能在众多信号通路中提供典型地用于RasGTPase功能的分子开关。RASA2能为P-2囊泡向所述液泡转运和易位提供这种开关。能将vps34募集至液泡的Rab5，也可能转运P-2，但其它的机制也是可能的。
在mEF和BV2小胶质细胞内Perforin-2和GAP1M/RASA2的成像分析。为了验证在酵母双杂交系统中，细胞内RASA2和P-2的胞质结构域的相互作用，我们确定了所述两种蛋白在RAW巨噬细胞中的定位。巨噬细胞组成性地表达P-2。为了确定共定位，我们产生了P-2-GFP融合蛋白，其通过接头与P-2胞质结构域的C端融合。在补充试验中，P-2-GFP在杀死细胞内细菌方面是有功能的(图30B，图31)。类似于RASA2(图33，中心)，P-2-GFP定位于RAW细胞的的核周膜囊泡中(图33，上图)。当图像合并时，P-2-GFP和RASA2显示共定位于大量的核周囊泡上(图33，下图)。我们认为，当vps34发生磷酸化时，RASA2即易位至包含细菌的液泡。
我们将确定在细菌感染时，RASA2的定位和易位情况。绝大部分或所有的细胞都组成性地表达RASA2(虽然表达水平不同)，并且可用特异性的抗体确定其定位(见图33)。在确定了感染后的RASA2的易位动力学之后，如图32所示，我们将进行P-2-GFP(或-RFP)转染，并通过两色或三色(使用荧光标记的细菌)成像分析，测定P-2的易位及其与RASA2易位的关系。
Rab5将PI3的激酶vps34从其胞质和核周的定位募集至包含细菌的液泡。通过磷脂酰肌醇磷酸化，Vps34可提供用于RASA2易位的肌醇磷酸代码。我们将确定vps34的抑制剂3-MA是否阻断了RASA2和P-2的易位。我们将确定细菌感染对RASA2在BV2细胞、初始mEF细胞或经干扰素预活化的mEF细胞内定位的影响。细胞内细菌操纵囊泡转运，以增强他们在细胞内的存活力。沙门氏菌提高了PI3P的生成，用于生成包含沙门氏菌的液泡(SCV)以允许存活；而分枝杆菌降低PI3P的生成，以阻止液泡成熟并阻止与溶酶体的融合。因此，不同的细菌种属能够操纵RASA2易位，潜在的结果是延迟或阻断P-2向液泡募集。
我们将比较在BV2小胶质细胞与初始(静息的)mEF和经IFN-预活化的mEF内 的易位情况，以确定细菌的内吞作用是否促发类似的应答，以及用IFN预活化mEF是否改变与RASA2易位相关的应答的动力学或质量。IFN诱导了大量的基因，所述基因可能包括在初始非吞噬性细胞中，为P-2攻击细胞内细菌的功能所必须的因子。如图34a所示(左图)，在感染后2h，经IFN预活化的mEF已经杀死大部分的耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)，而初始mEF在12h才开始杀死细菌。RASA2易位的动力学可能也反映了这种延迟。
我们还将抑制Rab5和vps34，并确定其对RASA2易位以及在CFU试验中针对细菌的细胞内杀伤作用的影响。
我们预期，在P-2易位和杀伤活化的机制方面，经IFN预活化的mEF和吞噬性的BV2细胞是相当的。如果RASA2的募集和易位是必需的，那么它在活化的mEF和BV2中也是类似的情况。在初始mEF中，对RAS2A2和P-2的募集可能不是同步的，因为必须首先诱导P-2。活的沙门氏菌(Salmonella)阻断了mEF内对P-2mRNA的诱导，但死的沙门氏菌无此效应(图34b)，这提供了在非吞噬性细胞内的沙门氏菌保护机制。在单独的研究中，我们正在研究鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)中负责抑制P-2的毒力基因(以PhoP为例，图34b)。我们还有关于衣原体抑制P-2的诱导的数据(数据未显示)。这些发现支持我们的提议，即细菌如果想建立细胞内的驻留机制，必须抑制P-2。
为了更进一步深入了解细菌感染后的早期事件，我们还将对Rab5和vps34进行成像，我们预期它们会易位至细菌液泡。
分析siRNA抑制RASA2对杀死细胞内细菌作用的影响。阻断P-2的诱导、募集、易位、活化或聚合所需的任何一个分子，预计也能阻断对细胞内细菌的杀伤作用。如果RASA2是P-2的易位、活化和/或杀伤所必须的，那么对它的抑制应该会抑制对细胞内细菌的杀伤作用。在最初的BV2小胶质细胞杀死细胞内耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)的实验中，对此进行了测试(图35a)。RASA2的抑制完全阻断了细胞内的杀伤作用，这与P-2的抑制类似；并且允许细胞内复制，表明RASA2对于杀死细胞内细菌是很重要的。
此外，还将抑制Rab1、Rab5、Rab7和Rab11，以及vps34，并在庆大霉素保护试验中确定这些抑制对细菌杀伤作用的影响。
在经IFN预活化的和未活化的(初始)mEF，以及直肠上皮细胞CMT93中，通过使用qPCR测定RASA2的信使水平，将进一步测试对RASA2的需求。我们还将在庆 大霉素保护-CFU试验中，分析在siRNA抑制后，针对MRSA、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)以及鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)的细胞内杀伤作用，或其存活率。
免疫共沉淀测定P-2与RASA2的生化性相互作用。我们将用抗RASA2的单克隆抗体免疫沉淀BV2和mEF的裂解物，用SDS-PAGE进行分离，并用抗P-2的抗体进行免疫印迹分析。还将在P-2-GFP转染后，开展所述研究，用抗GFP的抗体进行免疫沉淀，并用抗GFP和抗RASA2分别进行免疫印迹分析(如图35b所示)。GFP转染(无P-2融合)将用作对照(未显示)。将在有或没有IFN预诱导，以及有或没有细菌感染的情况下，开展所述实验。通过对P-2-GFP的免疫沉淀物进行蛋白染色，我们还将寻找额外的蛋白条带，并通过质谱法分析它们的特征。GFP免疫沉淀物将用作对照。我们还将对P2的胞质结构域和RASA2的突变进行突变分析。
通过经P-2-GFP转染的RAW细胞内的免疫共沉淀(图35b)，现在已经证实，在P-2-GFP和RASA2之间存在直接的生化性相互作用，这允许我们开展所述突变实验(GFP对照未与RASA2免疫共沉淀，未显示)。这将使我们能够在免疫沉淀中探测Rab5或vsp34，以及自噬蛋白的存在(目的2)，这些蛋白可能与P-2/RASA2形成复合物。我们还将通过SDS PAGE分析P-2-GFP的免疫沉淀物(使用GFP沉淀物作为对照)，接着对胶进行蛋白染色，以确定与目前为止所提及的成分不对应的蛋白条带是否存在。如果存在额外的条带，我们将用质谱法对它们进行分析并确定它们的身份。
对RASA2在细菌杀伤作用中的突变分析。RASA2在N-端区段具有两个C2结构域(C2A和C2B)，然后是RasGap结构域以及朝向C端的PH/Btk结构域。C2结构域是蛋白结构性的结构域，参与将蛋白靶向至细胞膜，然而还未探索它们在RASA2中的功能。PH-Btk结构域是结合PIP所需的。RASA-2与可溶性的IP(3,4,5)P3、PI(1,3,4,5,6)P5、IP6结合，但不与IP(1,4,5)P3结合；RASA2还与PtdIns(3,4,5)P3结合，表明它的结合需要肌醇-3的磷酸化。对于RASA2是否与由vps34在内源性膜上组成性合成的PtdInsP(3)P结合，还是未知的。
为了检验RASA2的功能性结构域在杀死细菌以及P-2向包含细菌的液泡易位过程中的作用(图32)，我们将删除以下功能性结构域：ΔC2A、ΔC2B、ΔC2A,B、ΔRasGAP、ΔPH-Btk。为了进行分析，将用靶向其3’UTR的siRNA抑制内源性RASA2，并用RASA2的缺失其3’UTR的缺失构建体重构细胞(如图30中所示的P-2-RFP)。
细菌种属对P-2和RASA2易位的效应。在图35中，通过利用鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)和实验室菌株大肠杆菌K12进行感染，完成了P-2的易位。我们还 将利用沙门氏菌(Salmonella)和分枝杆菌(Mycobacteria)以及其它细菌，分别确定野生和突变的P-2，以及野生和突变的RASA2的易位。分枝杆菌(Mycobacteria)干扰PI3P的生成以及液泡的成熟。沙门氏菌(Salmonella)的3型分泌效应物SopB对PI3P具有多重效应，所述效应干扰液泡成熟，以及增强在包含沙门氏菌的液泡(SCV)中的细胞内存活。与大肠杆菌相比，包含沙门氏菌的液泡中的PI3P的变化，可能影响P-2和RASA2两者的易位。
我们预期，RASA2的PH-Btk结构域和RasGap结构域这两者都是杀死细菌所必不可少的。预期在生成PIP3时，RASA2向包含细菌的液泡易位。RasGap通常作为开关调节器进行作用，并且可能在P-2向包含细菌的液泡易位中发挥作用。P-2/RASA2的相互作用可能需要RasGap或C2结构域，对此将通过免疫共沉淀和通过酵母双杂交分析来进行检测。
在随后的研究中，我们将在酵母双杂交筛选中，使用RASA2及其缺失变异体作为诱饵，以确定额外的协助RASA2发挥作用的候选物，例如Rab和液泡分拣连接蛋白(nexin)。
对P-2-RFP的胞质结构域的突变分析。小鼠P-2的胞质序列中，保守的(高亮的)氨基酸是(RKYKKK-SEQ ID NO:4)，紧随其后的是保守的Y，随后是酸性的EIEEQE(SEQ ID NO:5)，紧随其后的是保守的S以及一个额外的靠近C-端的S(图28a)。通过使用针对潜在的磷酸化位点的算法，鉴定了若干激酶家族。我们认为，在受细菌感染时，P-2的胞质结构域接收信号，所述信号用于P-2向包含细菌的液泡易位，以及用于P-2聚合以对细菌细胞壁进行致命打击。我们将进行以下突变：(a)KYKK(SEQ ID NO:7)突变为QYQQ(SEQ ID NO:8)；(b)保守的Y突变为F；以及(c)所述两个保守的S突变为A(阻断性的)或D(组成性地有效)(见图28a)。我们已经证明，如流式细胞术所确定，P-2-RFP中所述Y至F的突变是被稳定表达的，但是当被用于补充对内源性P-2的siRNA抑制时，却消除了细菌杀伤活性。
我们将确定P-2-RFP的突变对表达和稳定性、对细菌杀伤力以及对P-2向包含细菌的液泡易位的效应。此外，我们将通过免疫共沉淀(图35b)确定P-2-RFP的突变对与RASA2的相互作用以及对潜在的RASA2向所述包含细菌的液泡易位的效应。
通过流式细胞术确定，在P-2-RFP中，KYKK向QYQQ的突变，或所述保守的Y向F的突变(图28a)，导致丧失了P-2-RFP的杀伤活性，但表达水平正常(数据未显示)。在这些实验中，使用特异性针对内源性P-2的3’UTR的siRNA，抑制了内源 性的P-2，并同时用突变的、缺失原始3’UTR的P-2-RFP质粒-cDNA进行了转染。通过免疫共沉淀，将确定突变的P-2与RASA2的相互作用(图35b)。所述保守的S向D的突变(模拟磷酸化)升高了P-2的杀伤活性(数据未显示)。其它的突变将缺失C-端序列中增多的部分，并分析在杀伤和与RASA2的相互作用中的作用。我们预期，导致P-2与RASA2的相互作用失败的突变，将阻断P-2介导的杀伤作用。然而，可能存在某些突变，它们不干扰与RASA2的相互作用但仍阻断P-2的功能。后者的效应可能归因于所述胞质结构域的功能，所述功能会促发P-2的聚合，但不影响与RASA2的相互作用及其易位。
实施例6：分析自噬作为一个纽带，连接P-2介导的对细胞内细菌的杀伤作用。
自噬(异源吞噬)由感染激活。vps34复合物对肌醇的3-位进行磷酸化而生成PI(3,4,5)P3和PI3P，这确定了能发展成为吞噬体的吞噬泡的成核位点，由此确定自噬在细胞内的起始位点。
感染后，RAB5将所述PI3的激酶vps 34募集至包含细菌的液泡，vps 34能将肌醇的3-位进行磷酸化，以生成PI(3,4,5)P2和PI(3)P。自噬膜-囊泡间转运的gef是TRAPPIII复合物，并且我们将研究它的成分与Vps34、RASA2、P-2和Rab1的相互作用。Vps34的磷酸化允许与RASA2结合并潜在地伴有与P-2的相互作用(图35b)，并且还在非吞噬性细胞中，用作初期自噬体的成核位点。在吞噬性细胞中，相同的序列可将RASA和P-2带至包含细菌的液泡，所述液泡能成熟成为吞噬体。病原性细菌如沙门鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar typhimurium)和结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)具有毒力基因，能操纵自噬或吞噬体成熟过程中的这些早期步骤。
LC3是哺乳动物细胞中出色的自噬标记物，与早期和晚期的自噬体相关。E3样的Atg16L-Atg17-Atg5复合物能催化LC3与磷脂酰乙醇胺的连接反应。所述Atg16L的复合物也是形成自噬双层膜所必需的，所述双层膜与Atg9L1一起，是阻止鼠伤寒沙门氏菌在mEF细胞内复制所必需的。最后的步骤是酸化以及与溶酶体融合。我们认为，P-2被募集至自噬体，并且可能与LC3共定位(图32)。
明确P-2进入自噬体的进入点。自噬膜的逐步组装以及随后与溶酶体的融合，介导了自噬。我们认为，在感染性自噬过程中，P-2被募集至包含细菌的液泡和/或初期自噬体，在那里，它向细菌进行致命打击，并同时通过跨膜结构域，保持栓于P-2膜的状态(见图28a)。被P-2杀死的细菌具有细胞壁孔，强烈表明Perforin-2的聚合导 致了穿孔(图37)。感染后4h，通过去垢剂裂解，从mEF获得了MRSA并用电子显微镜检进行了分析，显示了典型的的细胞壁孔(图36，左图)，其尺寸与真核细胞膜上的P-2孔类似(图36，右图)。推断性的P-2孔还存在于被mEF杀死的分枝杆菌的细胞壁上(数据未显示)。P-2孔可以促进ROS、NO和溶菌酶跨过细菌细胞壁进行渗透，以完成杀伤作用。根据我们提出的P-2/自噬的连接关系，在先于募集P-2的步骤阻断自噬，将会阻断对细菌的杀伤作用。在P-2已被募集并聚合之后的步骤阻断自噬，不会损害杀伤作用。在自噬中，Atg14L是vps34PI3-激酶复合物的靶向成分。尽管存在有充分活化的P-2，对Atg14L的siRNA抑制阻断了在BV2中对分枝杆菌的杀伤作用(图37)，这与P-2的抑制是类似的。
BV2细胞是吞噬性的细胞。图37中的数据表明，vps34/Atg14L是吞噬性细胞杀死细菌所必需的，这与依赖于自噬的mEF中对它的需求是类似的(图38b)。细菌的吞噬作用和自噬的早期步骤可能是类似的，并反映出在非吞噬性和吞噬性细胞中，关于募集P-2的共同机制。所述数据与以下假设是一致的，即P-2是自噬和吞噬作用两者介导的细菌杀伤作用的效应物。伴随着自噬的启动或液泡向吞噬体成熟化的启动，分别募集了P-2。
为了进一步明确P-2进入自噬体的进入点，我们将抑制Atg5和Atg16L1，这两者是自噬的成分，为LC3与自噬膜上的磷脂酰乙醇胺接合所必需。
图38中的数据表明，Atg14L(图38b)、Atg16L(图38c)和Atg5(图38d)对于杀死沙门氏菌并保持抑菌状态是必需的，与一致。对它们的抑制允许沙门氏菌在mEF内进行细胞内复制。Atg14L也是为阻止沙门氏菌在mEF内复制所必需的(图38)。Atg14L是PI3-激酶-vps34复合物的成分，后者能启动自噬。为了证实vps34-PI3-激酶的酶活性有参与进来，我们将利用PI3-激酶的阻断剂，渥曼青霉素(Wortmannin)，或者选择性更高的vps34抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)，两者都已知能阻断自噬。与P-2的抑制类似，3-MA允许沙门氏菌复制，表明vps34的酶活性是细胞内杀死细菌所必需的。相反，巴弗洛霉素不干扰杀菌/抑菌活性。巴弗洛霉素阻止酸化以及溶酶体融合，而这对于mEF杀死沙门氏菌不是必需的(图39)。
P-2的抑制和自噬的阻断都能阻止细胞内杀死细菌，允许它们在mEF中的复制。对这个发现最简单的解释是，两个过程都是为控制细菌所必需的，并且它们之间可能有所联系。P-2可向细菌递送致命打击，这与自噬是相呼应的。图37-39中的数据将P-2的作用置于Atg14L-vps34之后，但于噬菌体-溶酶体融合之前。抑制Atg5或Atg16L 会允许沙门氏菌在mEF中复制，这与已发表的报道是一致的。Atg5作为Atg16L复合体的一部分是必需的，所述复合体将LC3与磷脂酰乙醇胺连接。因此，P-2介导的对沙门氏菌的杀伤作用可能需要LC3的脂化。Atg16L复合物，连同Atg9L1，是为形成双层膜所必需的。在敲除Atg9L1的mEF中，Atg9L1的缺失提高了沙门氏菌的细胞内复制。Atg9L1可能是脂质囊泡主要的供体之一，所述供体连同Atg16L复合物，是形成饰有LC3的自噬双层膜所必需的。Atg9是一个多次跨膜蛋白，在存在于胞质的 直径的膜囊泡中驻留；在酵母中，所述膜囊泡来源于高尔基复合体，Atg23和Atg27协助了此过程。酵母Atg23和27在哺乳动物中的同源物尚未见描述。Atg9L1是酵母Atg9在哺乳动物中的同源物。有可能RASA-2连同Atg9L1-囊泡一起，将跨膜蛋白P-2(图28a)募集至包含细菌的液泡，这个过程需要Atg16和LC3，此过程启动了双层膜的形成。P-2-囊泡可与Atg9L1-囊泡融合，或经同样的转运途径被分别募集，所述途径可能包括RASA2、Rab5或Rab7和/或其它组分。
通过成像明确自噬过程中的P-2易位和LC3。图32显示了在感染5min内，P-2向包含细菌的液泡易位的示例。在那个实验中，用siRNA抑制了内源性的P-2，并同时用P-2-RFP转染所述细胞。16h后，用表达GFP的大肠杆菌K12感染所述细胞，并于感染后5min用多聚甲醛固定，并用共聚焦显微镜成像。图32a显示了在感染5min内，P-2和LC3在包含细菌的液泡上共定位。
为了检测LC3与吞噬体或自噬体的连接，我们将LC3-GFP永久转染入mEF、BV2和RAW。我们研究的焦点主要放在初始的以及经IFN诱导的mEF；BV2和Raw细胞将用作对照。将抑制Atg 5,7,9L1,14L或16L，并用沙门氏菌、MRSA或分枝杆菌感染所述细胞，并通过固定结束所述反应。
通过抑制和成像，研究在经IFN诱导的mEF中，P-2和ATG9L1在杀菌过程中的相互关系。在未被IFN诱导表达P-2的mEF中，减慢沙门氏菌的细胞内复制，需要ATG9L1。我们已经显示了当不存在P-2时，细菌会在mEF内复制，并在图34b中显示了沙门氏菌可抑制对P-2的诱导。因此，我们将通过在野生型和ATGL1抑制的细胞中成像，研究ATG9L1的作用，所述细胞已被，或未被，诱导以表达P-2。我们还将寻找与P-2-GFP和/或RASA2免疫共沉淀的分子。既然ATG9L1是嵌于～60-90nm脂质囊泡中的六次跨膜蛋白，那么它是能与P-2发生相互作用并利用类似的易位途径的潜在候选者。

Claims (17)

1.一种调节Perforin-2(P2)的功能、活性或表达的方法，所述方法包括：向病人施用有效剂量的至少一种试剂，所述试剂调节与P2表达、功能或活性相关的一个或多个分子的功能、活性或表达；以及，调节P2的所述功能或表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述与P2功能、活性或表达相关的一个或多个分子包括：src、泛素结合酶E2M(Ubc12)、GAPDH、P21RAS/gap1m(RASA2)、半乳凝集素3、泛素C(UCHL1)、蛋白酶、vps34、ATG5、ATG7、ATG9L1、ATG14L、ATG16L、LC3、Rab5、或上述分子的片段。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子抑制P2的转录或翻译。
4.根据权利要求1所述的方法，其中试剂包括：小分子、蛋白、肽、多肽、修饰的肽、修饰的寡核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、合成的分子、天然分子、有机或无机分子、或上述试剂的组合。
5.一种鉴定候选治疗剂的方法，所述方法包括：接触表达一个或多个靶分子的细胞，所述靶分子包括：src、泛素结合酶E2M(Ubc12)、GAPDH、P21RAS/gap1m(RASA2)、半乳凝集素3、泛素C(UCHL1)、蛋白酶、vps34、ATG5、ATG7、ATG9L1、ATG14L、ATG16L、LC3、Rab5、或上述分子的片段；测定所述分子的表达、功能或活性；将所述分子的表达、功能或活性与对照进行比较；以及，鉴定调节Perforin-2表达、功能或活性的候选治疗剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述对一个或多个靶分子的表达、功能、或活性的调节作用调节Perforin-2(P2)分子的表达、功能或活性。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述靶分子是多核苷酸或其表达产物。
8.一种鉴定候选治疗剂的方法，所述方法包括：使检测表面与一个或多个靶分子接触，所述靶分子包括src、泛素结合酶E2M(Ubc12)、GAPDH、P21RAS/gap1m(RASA2)、半乳凝集素3、泛素C(UCHL1)、蛋白酶、vps34、ATG5、ATG7、ATG9L1、ATG14L、ATG16L、LC3、Rab5、上述分子的片段、或相关分子；将所述靶分子与一个或多个候选治疗剂接触并鉴定与一个或多个靶分子或其相关分子结合或杂交的试剂。
9.根据权利要求18所述的方法，其中检测所述经鉴定的候选治疗剂对Perforin-2分子的表达、功能或活性的调节作用。
10.根据权利要求9所述的方法，其中检测所述经鉴定的候选试剂对感染性生物的复制抑制、生长抑制、或致死性的作用。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述感染性生物是胞内或胞外细菌。
12.一种治疗患有感染性疾病生物的患者的方法，所述方法包括，向所述患者施用有效剂量的由权利要求1或权利要求8中所述方法鉴定的试剂。
13.一种转基因小鼠，所述转基因小鼠包括对编码Perforin-2蛋白的基因的破坏。
14.根据权利要求13所述的转基因小鼠，其中所述破坏包括对所述编码Perforin-2蛋白的基因的杂合性或纯合性破坏。
15.根据权利要求14所述的转基因小鼠，其中所述破坏包括纯合性破坏，其中所述纯合性破坏在所述转基因小鼠体内使所述基因失活并抑制功能性Perforin-2蛋白的表达。
16.根据权利要求13-15任意一项所述的转基因小鼠，其中与野生型小鼠相比，所述转基因小鼠对细胞内病原体感染表现出更高的易感性。
17.一种来源于权利要求13-15任意一项所述的转基因小鼠的器官、组织、细胞、或细胞系。
CN201380033237.3A 2012-04-24 2013-03-15 Perforin 2 对侵袭性且多药耐受的病原体的防御 Pending CN104520315A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261637455P 2012-04-24 2012-04-24
US61/637,455 2012-04-24
PCT/US2013/032503 WO2013162772A2 (en) 2012-04-24 2013-03-15 Perforin 2 defense against invasive and multidrug resistant pathogens

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104520315A true CN104520315A (zh) 2015-04-15

Family

ID=48087708

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380033237.3A Pending CN104520315A (zh) 2012-04-24 2013-03-15 Perforin 2 对侵袭性且多药耐受的病原体的防御

Country Status (9)

Country Link
US (2) US20160054299A9 (zh)
EP (1) EP2841450A2 (zh)
JP (1) JP2015516400A (zh)
KR (1) KR20150023287A (zh)
CN (1) CN104520315A (zh)
AU (2) AU2013252909B2 (zh)
CA (1) CA2871462A1 (zh)
HK (2) HK1203209A1 (zh)
WO (1) WO2013162772A2 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109576275A (zh) * 2018-12-16 2019-04-05 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种半滑舌鳎抗细菌病相关基因及其应用方法
CN110305878A (zh) * 2019-04-16 2019-10-08 华中农业大学 一种牛分枝杆菌卡介苗低黏附力及低侵袭力突变株b2909
CN111004819A (zh) * 2019-12-31 2020-04-14 上海博威生物医药有限公司 一种转染红色荧光蛋白的raw264.7单细胞稳定细胞系及其筛选方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115551525A (zh) * 2020-03-06 2022-12-30 安度利体技术公司 用于治疗细胞内细菌感染的组合物和方法
BR112022017797A2 (pt) * 2020-03-06 2022-11-29 Endolytix Tech Inc Métodos de distribuição de um bacteriófago, de tratamento de uma infecção bacteriana, de isolamento de um fago direcionado a uma bactéria e composição
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4769331A (en) 1981-09-16 1988-09-06 University Patents, Inc. Recombinant methods and materials
US5288641A (en) 1984-06-04 1994-02-22 Arch Development Corporation Herpes Simplex virus as a vector
US4859587A (en) 1984-06-04 1989-08-22 Institut Merieux Recombinant herpes simplex viruses, vaccines and methods
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
NL8720442A (nl) 1986-08-18 1989-04-03 Clinical Technologies Ass Afgeefsystemen voor farmacologische agentia.
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
IE66205B1 (en) 1990-06-14 1995-12-13 Paul A Bartlett Polypeptide analogs
US5650489A (en) 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
US5328688A (en) 1990-09-10 1994-07-12 Arch Development Corporation Recombinant herpes simplex viruses vaccines and methods
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
US5491084A (en) 1993-09-10 1996-02-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of green-fluorescent protein
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5593853A (en) 1994-02-09 1997-01-14 Martek Corporation Generation and screening of synthetic drug libraries
US5539083A (en) 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
US5525735A (en) 1994-06-22 1996-06-11 Affymax Technologies Nv Methods for synthesizing diverse collections of pyrrolidine compounds
US5549974A (en) 1994-06-23 1996-08-27 Affymax Technologies Nv Methods for the solid phase synthesis of thiazolidinones, metathiazanones, and derivatives thereof
US5569588A (en) 1995-08-09 1996-10-29 The Regents Of The University Of California Methods for drug screening
US6420338B1 (en) * 1997-06-13 2002-07-16 New York University Medical Center Inhibition of the Src kinase family pathway as a method of treating HBV infection and hepatocellular carcinoma
JP2007526774A (ja) * 2004-03-01 2007-09-20 ピーター・マッカラム・キャンサー・インスティテュート 組換えパーフォリン、その発現、およびその使用
EP2024516A4 (en) * 2006-06-02 2009-11-11 Univ Miami Perforin-2 PROTEINS
EP2364702A3 (en) * 2006-09-05 2012-01-25 Emory University Kinase inhibitors for preventing or treating pathogen infection and method of use thereof
JO3421B1 (ar) 2011-06-20 2019-10-20 H Lundbeck As طريقة لإعطاء 1-((1ار.3س)-6-كلورو-3-فينيل-اندان-1-ايل)-1.2.2-ترايميثيل- بيبيرازين واملاجها لمعالجة انفصام الشخصية

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109576275A (zh) * 2018-12-16 2019-04-05 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种半滑舌鳎抗细菌病相关基因及其应用方法
CN110305878A (zh) * 2019-04-16 2019-10-08 华中农业大学 一种牛分枝杆菌卡介苗低黏附力及低侵袭力突变株b2909
CN111004819A (zh) * 2019-12-31 2020-04-14 上海博威生物医药有限公司 一种转染红色荧光蛋白的raw264.7单细胞稳定细胞系及其筛选方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20150023287A (ko) 2015-03-05
HK1203209A1 (zh) 2015-10-23
AU2017279777A1 (en) 2018-01-25
US20170191058A1 (en) 2017-07-06
CA2871462A1 (en) 2013-10-31
HK1209430A1 (zh) 2016-04-01
EP2841450A2 (en) 2015-03-04
WO2013162772A3 (en) 2014-01-16
US20160054299A9 (en) 2016-02-25
US20150204845A1 (en) 2015-07-23
AU2013252909B2 (en) 2017-09-28
WO2013162772A2 (en) 2013-10-31
JP2015516400A (ja) 2015-06-11
AU2013252909A1 (en) 2014-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kemp et al. Subversion of host cellular functions by the apicomplexan parasites
Biswas et al. Environmental sensing and signal transduction pathways regulating morphopathogenic determinants of Candida albicans
CN104520315A (zh) Perforin 2 对侵袭性且多药耐受的病原体的防御
Chen et al. Calcineurin controls hyphal growth, virulence, and drug tolerance of Candida tropicalis
Liu et al. Characterization of a type-I crustin with broad-spectrum antimicrobial activity from red swamp crayfish Procambarus clarkii
Arasu et al. Bacterial membrane binding and pore formation abilities of carbohydrate recognition domain of fish lectin
Prochazkova et al. Developmental and immune role of a novel multiple cysteine cluster TLR from Eisenia andrei earthworms
Tavignot et al. Inhibition of a NF-κB/Diap1 pathway by PGRP-LF is required for proper apoptosis during Drosophila development
WO2019035089A2 (en) LECTIN-RELATED BACTERIA AND USES THEREOF
Zheng et al. A newly characterized dense granule protein (GRA76) is important for the growth and virulence of Toxoplasma gondii
Wang et al. A novel fucolectin from Apostichopus japonicus with broad PAMP recognition pattern
CN103975064A (zh) 经修饰的天蚕素用于治疗内寄生感染和细菌感染的方法和用途
Wang et al. A genome-wide loss-of-function screen identifies Toxoplasma gondii genes that determine fitness in interferon gamma-activated murine macrophages
US20160250303A1 (en) Perforin-2 activators and inhibitors as drug targets for infectious disease and gut inflammation
Mayoral A Diverse Toolkit: Studies on Secreted Proteins from the Parasite Toxoplasma gondii
Tsapras Molecular mechanisms of selective autophagy in innate immunity
CN107064521B (zh) 一种茶花鸡的选育方法
Lin Hyphal morphogenesis of the human fungal pathogen cryptococcus neoformans
Richterová Selection and characterization of a new, non-melanising line of Anopheles gambiae ss refractory to Plasmodium falciparum
Mercer The role of Toxoplasma gondii dense granule protein GRA24 in signaling and immunity during infection
Arsenault Yee Deciphering the Function of HAM1 in the Biology of Cryptococcus neoformans Item
Torelli et al. In vivo CRISPR screens identify GRA12 as a transcendent secreted virulence factor across Toxoplasma gondii strains and mouse subspecies
Tomita The Toxoplasma gondii Cyst Wall Glycoprotein CST1 is Critical for the Structural Integrity of Brain Cysts and Their Persistence
Zhang In vivo success of Trypanosoma cruzi is regulated by host cell type and parasite sensing of host cell health
Issi Identification and characterization of novel putative virulence factors in Candida albicans

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1209430

Country of ref document: HK

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150415

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1209430

Country of ref document: HK