HU218007B - Eljárás random bio-oligomer könyvtár előállítására valamint, alkalmazására - Google Patents
Eljárás random bio-oligomer könyvtár előállítására valamint, alkalmazására Download PDFInfo
- Publication number
- HU218007B HU218007B HU9204179A HU417992A HU218007B HU 218007 B HU218007 B HU 218007B HU 9204179 A HU9204179 A HU 9204179A HU 417992 A HU417992 A HU 417992A HU 218007 B HU218007 B HU 218007B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- biooligomer
- solid phase
- peptide
- activity
- library
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 206
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims description 32
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title description 31
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 153
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 75
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 63
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 36
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 22
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 342
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 140
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 113
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 87
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 59
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 59
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 57
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 43
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 37
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 37
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 33
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 28
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 25
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 24
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 24
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 20
- -1 polyethylene Polymers 0.000 claims description 19
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 18
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 14
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 12
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 11
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 claims description 11
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 8
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 7
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 7
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 6
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 6
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000002141 anti-parasite Effects 0.000 claims description 5
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 claims description 5
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical group O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 4
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 claims description 4
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 claims description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- AIFRHYZBTHREPW-UHFFFAOYSA-N β-carboline Chemical compound N1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 AIFRHYZBTHREPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 3
- 239000012039 electrophile Substances 0.000 claims description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 229920006122 polyamide resin Polymers 0.000 claims description 3
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 3
- BWKMGYQJPOAASG-UHFFFAOYSA-M 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylate Chemical compound C1=CC=C2CNC(C(=O)[O-])CC2=C1 BWKMGYQJPOAASG-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- MPBMJFQAGBVIDC-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=C2C(O)NC(C(O)=O)CC2=C1 MPBMJFQAGBVIDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- JPHGTWWUDOEBRJ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,4,4a,5-tetrahydro-1h-naphthalene-2-carboxylic acid Chemical compound C1C=CC=C2CC(N)(C(O)=O)CCC21 JPHGTWWUDOEBRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- XDOLZJYETYVRKV-UHFFFAOYSA-N 7-Aminoheptanoic acid Chemical compound NCCCCCCC(O)=O XDOLZJYETYVRKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims description 2
- LSTJLLHJASXKIV-UHFFFAOYSA-N amino hexanoate Chemical compound CCCCCC(=O)ON LSTJLLHJASXKIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940124277 aminobutyric acid Drugs 0.000 claims description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 claims 2
- ZMGMDXCADSRNCX-UHFFFAOYSA-N 5,6-dihydroxy-1,3-diazepan-2-one Chemical compound OC1CNC(=O)NCC1O ZMGMDXCADSRNCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims 1
- 229940122853 Growth hormone antagonist Drugs 0.000 claims 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000003667 hormone antagonist Substances 0.000 claims 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 claims 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 192
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 144
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 140
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 91
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 50
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 50
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 48
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 46
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 42
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 36
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 34
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 34
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 29
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 29
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 23
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 22
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 20
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 18
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 17
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 16
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 14
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 14
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 13
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 12
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 12
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 11
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 10
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 9
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 description 9
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 9
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 9
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 9
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 9
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 9
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000012508 resin bead Substances 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 8
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 8
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 7
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 7
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 7
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 7
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 7
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 6
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 6
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 6
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 6
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N Leu-enkephalin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N 0.000 description 5
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 5
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 5
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical class NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000011049 pearl Substances 0.000 description 5
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 4
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 4
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 4
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003096 antiparasitic agent Substances 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 4
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 4
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 4
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 229940043131 pyroglutamate Drugs 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N Adenosine Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102100036509 Erythropoietin receptor Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 3
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 3
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 3
- AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M lithium bromide Chemical class [Li+].[Br-] AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 3
- 108700024543 mos Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 235000013599 spices Nutrition 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 3
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 3
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RMVRSNDYEFQCLF-UHFFFAOYSA-N thiophenol Chemical compound SC1=CC=CC=C1 RMVRSNDYEFQCLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 1-(2-azaniumylacetyl)pyrrolidine-2-carboxylate Chemical compound NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethylpyridine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=N1 OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MJHJVRHROVNEFO-UHFFFAOYSA-N 2-aminohexanoic acid;ethane-1,2-diamine Chemical compound NCCN.CCCCC(N)C(O)=O MJHJVRHROVNEFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CDIBHUYMESSNFP-UHFFFAOYSA-N 4-(4,4-diaminocyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)cyclohexa-2,5-diene-1,1-diamine Chemical compound C1=CC(N)(N)C=CC1=C1C=CC(N)(N)C=C1 CDIBHUYMESSNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 101710102442 Erythropoietin receptor Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 208000035186 Hemolytic Autoimmune Anemia Diseases 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024781 Immune Complex disease Diseases 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 102400000243 Leu-enkephalin Human genes 0.000 description 2
- 108010022337 Leucine Enkephalin Proteins 0.000 description 2
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 2
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CO SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002022 anti-cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 239000000935 antidepressant agent Substances 0.000 description 2
- 229940005513 antidepressants Drugs 0.000 description 2
- 239000000729 antidote Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 2
- GICLSALZHXCILJ-UHFFFAOYSA-N ctk5a5089 Chemical compound NCC(O)=O.NCC(O)=O GICLSALZHXCILJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 108700020302 erbB-2 Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000004992 fast atom bombardment mass spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008073 immune recognition Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 2
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- JXDYKVIHCLTXOP-UHFFFAOYSA-N isatin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(=O)NC2=C1 JXDYKVIHCLTXOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003951 lactams Chemical class 0.000 description 2
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 2
- URLZCHNOLZSCCA-UHFFFAOYSA-N leu-enkephalin Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1CC(N)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 URLZCHNOLZSCCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- BXRNXXXXHLBUKK-UHFFFAOYSA-N piperazine-2,5-dione Chemical compound O=C1CNC(=O)CN1 BXRNXXXXHLBUKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 239000002287 radioligand Substances 0.000 description 2
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 229930184616 taxin Natural products 0.000 description 2
- KOTXAHKUCAQPQA-AAUVPWARSA-N taxine Chemical compound C1([C@@H]([C@@H](O)C(=O)O[C@@H]2C=3/C[C@@](C([C@H](O)C4=C(C)[C@@H](OC(C)=O)CC(C4(C)C)[C@@H](OC(C)=O)\C=3)=O)(C)[C@@H](O)C2)N(C)C)=CC=CC=C1 KOTXAHKUCAQPQA-AAUVPWARSA-N 0.000 description 2
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N theophylline Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- QWXZOFZKSQXPDC-NSHDSACASA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 QWXZOFZKSQXPDC-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- STGXGJRRAJKJRG-JDJSBBGDSA-N (3r,4r,5r)-5-(hydroxymethyl)-3-methoxyoxolane-2,4-diol Chemical compound CO[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O STGXGJRRAJKJRG-JDJSBBGDSA-N 0.000 description 1
- UJPMYEOUBPIPHQ-UHFFFAOYSA-N 1,1,1-trifluoroethane Chemical compound CC(F)(F)F UJPMYEOUBPIPHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UBTJZUKVKGZHAD-JCYYIGJDSA-N 1-[(2r,4r,5r)-5-[[bis(4-methoxyphenyl)-phenylmethoxy]methyl]-4-hydroxyoxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OC)=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)OC[C@@H]1[C@H](O)C[C@H](N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)O1 UBTJZUKVKGZHAD-JCYYIGJDSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 1
- SVUOLADPCWQTTE-UHFFFAOYSA-N 1h-1,2-benzodiazepine Chemical compound N1N=CC=CC2=CC=CC=C12 SVUOLADPCWQTTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NDKDFTQNXLHCGO-UHFFFAOYSA-N 2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)NCC(=O)O)C3=CC=CC=C3C2=C1 NDKDFTQNXLHCGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYSMHWILUNYBFW-GRIPGOBMSA-N 3'-amino-3'-deoxy-N(6),N(6)-dimethyladenosine Chemical compound C1=NC=2C(N(C)C)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](N)[C@H]1O RYSMHWILUNYBFW-GRIPGOBMSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FTZIQBGFCYJWKA-UHFFFAOYSA-N 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Chemical class S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 FTZIQBGFCYJWKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-2-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2N(CC)C(S(O)(=O)=O)SC2=C1 PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WWYFPDXEIFBNKE-UHFFFAOYSA-N 4-(hydroxymethyl)benzoic acid Chemical compound OCC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WWYFPDXEIFBNKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- OMSMPWHEGLNQOD-UWVGGRQHSA-N Asn-Phe Chemical group NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OMSMPWHEGLNQOD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102400000748 Beta-endorphin Human genes 0.000 description 1
- 101800005049 Beta-endorphin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 101100123850 Caenorhabditis elegans her-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100386910 Caenorhabditis elegans laf-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 244000124209 Crocus sativus Species 0.000 description 1
- 235000015655 Crocus sativus Nutrition 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010049140 Endorphins Proteins 0.000 description 1
- 102000009025 Endorphins Human genes 0.000 description 1
- 108010092674 Enkephalins Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241001337814 Erysiphe glycines Species 0.000 description 1
- 108010075944 Erythropoietin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 1
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 description 1
- 240000005702 Galium aparine Species 0.000 description 1
- 235000014820 Galium aparine Nutrition 0.000 description 1
- KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N Gly-Ile Chemical group CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N Gly-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- AJHCSUXXECOXOY-NSHDSACASA-N Gly-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-VIFPVBQESA-N Gly-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108010026389 Gramicidin Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 208000003807 Graves Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- GVGLGOZIDCSQPN-PVHGPHFFSA-N Heroin Chemical compound O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)OC(C)=O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4OC(C)=O GVGLGOZIDCSQPN-PVHGPHFFSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001059454 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase MARK2 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010021245 Idiopathic thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006552 Lewis Lung Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 1
- 241000713862 Moloney murine sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 208000006098 Neonatal Hyperbilirubinemia Diseases 0.000 description 1
- 201000006346 Neonatal Jaundice Diseases 0.000 description 1
- 102000004108 Neurotransmitter Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000590 Neurotransmitter Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000566242 Ochrotomys Species 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 101800005149 Peptide B Proteins 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102400000745 Potential peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800001357 Potential peptide Proteins 0.000 description 1
- OCYROESYHWUPBP-CIUDSAMLSA-N Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 OCYROESYHWUPBP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- UEKYKRQIAQHOOZ-KBPBESRZSA-N Pro-Trp Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)[O-])C(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 UEKYKRQIAQHOOZ-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- DYAHQFWOVKZOOW-UHFFFAOYSA-N Sarin Chemical compound CC(C)OP(C)(F)=O DYAHQFWOVKZOOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 102100028904 Serine/threonine-protein kinase MARK2 Human genes 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 102000019259 Succinate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010012901 Succinate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- GUGOEEXESWIERI-UHFFFAOYSA-N Terfenadine Chemical compound C1=CC(C(C)(C)C)=CC=C1C(O)CCCN1CCC(C(O)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)CC1 GUGOEEXESWIERI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical class O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 239000003875 Wang resin Substances 0.000 description 1
- NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N [4-[(4-methylphenyl)methoxy]phenyl]methanol Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1COC1=CC=C(CO)C=C1 NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N acetaldehyde Diethyl Acetal Natural products CCOC(C)OCC DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001241 acetals Chemical class 0.000 description 1
- WJGAPUXHSQQWQF-UHFFFAOYSA-N acetic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.CC(O)=O WJGAPUXHSQQWQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- YZVWKHVRBDQPMQ-UHFFFAOYSA-N aminoantipyrene Natural products C1=C2C(N)=CC=C(C=C3)C2=C2C3=CC=CC2=C1 YZVWKHVRBDQPMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 229940035674 anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 244000000054 animal parasite Species 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001773 anti-convulsant effect Effects 0.000 description 1
- 230000001430 anti-depressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003178 anti-diabetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001142 anti-diarrhea Effects 0.000 description 1
- 230000001384 anti-glaucoma Effects 0.000 description 1
- 230000001387 anti-histamine Effects 0.000 description 1
- 230000003276 anti-hypertensive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001062 anti-nausea Effects 0.000 description 1
- 230000001754 anti-pyretic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 description 1
- 239000003472 antidiabetic agent Substances 0.000 description 1
- 229960003965 antiepileptics Drugs 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000000164 antipsychotic agent Substances 0.000 description 1
- 229940005529 antipsychotics Drugs 0.000 description 1
- 239000002221 antipyretic Substances 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 150000001484 arginines Chemical class 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 201000000448 autoimmune hemolytic anemia Diseases 0.000 description 1
- 201000003710 autoimmune thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229940049706 benzodiazepine Drugs 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229940124630 bronchodilator Drugs 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 125000006297 carbonyl amino group Chemical group [H]N([*:2])C([*:1])=O 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008568 cell cell communication Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- JMHFFDIMOUKDCZ-XKMGUCBZSA-N chembl2369948 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 JMHFFDIMOUKDCZ-XKMGUCBZSA-N 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 231100000481 chemical toxicant Toxicity 0.000 description 1
- 108091006116 chimeric peptides Proteins 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- QBABZTXXVPEQBG-UHFFFAOYSA-N chloroethane;dichloromethane Chemical compound CCCl.ClCCl QBABZTXXVPEQBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003920 cocaine Drugs 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 description 1
- 230000002254 contraceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229960002069 diamorphine Drugs 0.000 description 1
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 description 1
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N dimethylpyridine Natural products CC1=CC=CN=C1C HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000027721 electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 230000005294 ferromagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N fluorescamine Chemical compound C12=CC=CC=C2C(=O)OC1(C1=O)OC=C1C1=CC=CC=C1 ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical group O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003193 general anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N glycerine monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC(CO)CO YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N glycerol monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N glycinamide Chemical group NCC(N)=O BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004275 glycolic acid Drugs 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010077435 glycyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 239000003933 gonadotropin antagonist Substances 0.000 description 1
- 229960004905 gramicidin Drugs 0.000 description 1
- ZWCXYZRRTRDGQE-SORVKSEFSA-N gramicidina Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC=O)C(C)C)CC(C)C)C(=O)NCCO)=CNC2=C1 ZWCXYZRRTRDGQE-SORVKSEFSA-N 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150066512 her-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 229940125697 hormonal agent Drugs 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000000887 hydrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007327 hydrogenolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091008915 immune receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000027596 immune receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000010820 immunofluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000035992 intercellular communication Effects 0.000 description 1
- 108040006856 interleukin-3 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000010849 ion bombardment Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000009940 knitting Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150072601 lin-14 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000005567 liquid scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 125000004492 methyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000001538 myasthenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003158 myorelaxant agent Substances 0.000 description 1
- CMWYAOXYQATXSI-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylformamide;piperidine Chemical compound CN(C)C=O.C1CCNCC1 CMWYAOXYQATXSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004081 narcotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000018791 negative regulation of catalytic activity Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 1
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- HKOOXMFOFWEVGF-UHFFFAOYSA-N phenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=CC=C1 HKOOXMFOFWEVGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940067157 phenylhydrazine Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006303 photolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015843 photosynthesis, light reaction Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N picric acid Chemical compound OC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108010015796 prolylisoleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 229940124811 psychiatric drug Drugs 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 239000002212 purine nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 238000003346 radioligand binding method Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000006798 ring closing metathesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013974 saffron Nutrition 0.000 description 1
- 239000004248 saffron Substances 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000001624 sedative effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M sodium octadecanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 229940124549 vasodilator Drugs 0.000 description 1
- 239000003071 vasodilator agent Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1075—Isolating an individual clone by screening libraries by coupling phenotype to genotype, not provided for in other groups of this subclass
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
- C07K1/047—Simultaneous synthesis of different peptide species; Peptide libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
- C07K14/70—Enkephalins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/82—Translation products from oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1062—Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00585—Parallel processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/0059—Sequential processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00592—Split-and-pool, mix-and-divide processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
- B01J2219/00702—Processes involving means for analysing and characterising the products
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
- B01J2219/0072—Organic compounds
- B01J2219/00722—Nucleotides
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
- B01J2219/0072—Organic compounds
- B01J2219/00725—Peptides
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
- B01J2219/0072—Organic compounds
- B01J2219/00729—Peptide nucleic acids [PNA]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
- Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
- Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
- Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
- Y10S530/817—Entrapped within the carrier, e.g. gel, hollow fibre
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Heterocyclic Compounds That Contain Two Or More Ring Oxygen Atoms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Polyethers (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
A találmány tárgya eljárás biológiailag aktív biooligomer-könyvtárlétrehozására, amelynek során az alábbi lépéseket hajtják végre: i) abiooligomerek előállítása céljából egy szilárd fázisú hordozónaklegalább a különböző, hozzáadandó biooligomer-alegységek számávalmegegyező, de legalább két alikvot részét állítják elő, ii) azalegységek egy készletét külön-külön érintkezésbe hozzák a szilárdfázisú hordozó alikvot részeivel, oly módon, hogy egy alegységetjuttatnak be mindegyik alikvot részbe, iii) az alegységeketkvantitatíve hozzákapcsolják a szilárd fázisú hordozó lényegébenösszes kötőhelyéhez, és így egy szilárd fázisú hordozó/új alegységkombináció alikvot részeit összekeverik, iv) meggyőződnek a kapcsolásireakció teljes lejátszódásáról, és ha szükséges, akkor a reakciótteljes lejátszódásig erőltetik, v) a szilárd fázisú hordozó/újalegység kombináció alikvot részeit alaposan összekeverik; majd azi)–v) lépések szükséges számú ismétlése után, egy végső lépésben vi)eltávolítják a védőcsoportokat oly módon, hogy mindegyik, a védelemalól feloldott biooligomer a szilárd fázisú hordozóhoz kapcsolvamarad. ŕ
Description
HU 218 007 Β
A találmány tárgyát szilárd fázisú hordozóhoz kapcsolt biooligomerek könyvtára képezi, amelyben az egyes szilárd fázisú hordozókat egyetlen biooligomerfajtához kapcsoljuk hozzá, és ebben a könyvtárban megtalálható a biooligomereket felépítő monomeralegységek összes lehetséges kombinációja. A találmány szerinti biooligomer lehet egy peptid, egy oligonukleotid, vagy peptidoligonukleotid kiméra konstrukció. A találmány tárgyát képezi továbbá ilyen könyvtár szintézisét szolgáló eljárás is. A találmány tárgyát képezi továbbá a könyvtárban levő biooligomerek alkalmazása olyan ligandumok azonosítására és jellemzésére, amelyek képesek egy akceptormolekulához kötődni, vagy befolyásolni egy számunkra érdekes biológiai aktivitást. A könyvtár biooligomerjei kémiai reakciót is katalizálhatnak.
Ligandumok felismerése és kötődése szabályozza majdnem az összes biológiai folyamatot, például az immunfelismerést, a sejtek által leadott jeleket és a sejtek közötti kommunikációt, transzkripciót és transzlációt, a sejten belüli jelek leadását és a katalízist, például az enzimreakciókat. A szakterületen régóta folyik kutatás olyan molekulák azonosítása céljából, amelyek agonistaként hatnak, vagy amelyek képesek agonizálni vagy antagonizálni ligandumok aktivitását, azaz például hormonok, növekedési faktorok és neurotranszmitterek aktivitását, amelyek B-sejtes (antitestek által közvetített) vagy T-sejtes (sejtek által közvetített) immunitást indukálnak; amelyek kémiai reakciókat képesek katalizálni, vagy amelyek a génexpressziót szabályozzák a transzkripció vagy transzláció szintjén.
Különösen érdekesek a fehérje- vagy peptidligandumok. Ezek tartalmazzák a hormonok, növekedési faktorok, neuroaktív molekulák és immunepitópok legnagyobb részét. Továbbá, amint azt az előzőkben tárgyaltuk, a legtöbb, a receptorok által közvetített biológiai aktivitás, vagy az antitestek vagy T-sejt-epitópok módosítását célzó antagonista vagy agonista készítését célzó erőfeszítés a peptidekre koncentrálódott. A receptorkötő helyekre szabott gyógyászati hatóanyagok kifejlesztését nagymértékben gátolta a peptidligandumok szekvenciája meghatározásának nehézsége. Ezeknek a peptidszekvenciáknak a ritkasága és kevéssé eltérő mivolta ezt egy elérhetetlen céllá tette, hacsak nem izoláltak rendkívül nagy munka árán egy specifikus komplexet, azonosították rajta az epitópot, majd megszekvenálták az epitópot. A problémát tovább bonyolítja az a tény, hogy az epitópok gyakran olyan aminosavcsoportokat tartalmaznak, amelyek a primer szekvenciában egymástól távol vannak.
A szakterületen dolgozó néhány kutató megpróbálta megkerülni ezt az időigényes folyamatot oly módon, hogy egy fehérjének az aminosavszekvenciáját az azt kódoló nukleotidszekvencia alapján határozták meg. A fehérjék nagyméretű peptidek, amelyek aminosavakból állnak; mindegyik aminosavat egy vagy több, három aminosavból álló kodon kódolja. Például az A pepiidet, amely a glutaminsavat tartalmazza, három nukleinsavból: citozinból, adeninből és guaninból álló kodon kódolja. Ennek a kodonnak a komplementere a guanin (amely a citozinhoz kötődik), a timin (amely az adeninhez kötődik) és a citozin, egy B pepiidben egy másik aminosavat kódol. A komplementaritási elmélet szerint a B peptid kötődne az A peptidhez. Pontosabban, Bőst and Blalock [Methods in Enzymology, 168., 16-28. (1989)] azt gondolták, hogy bármely adott peptid kötődik egy olyan peptidhez, amelyet egy komplementer nukleinsav kódol, és ezen információ alapján megjósolták egy komplementer peptid aminosavszekvenciáját. A szekvencia alapján peptidet szintetizáltak, és vizsgálták a kötődési képességét.
Ez a megközelítés nem oldotta meg a problémát, mivel a komplementer peptidek közötti kapcsolódás nagyon gyenge volt, és 15 csoportnál hosszabb komplementer peptidek szintézisét tette szükségessé. Továbbá ehhez a megközelítéshez tudni kell a számunkra érdekes fehérje kötőpartnerének vagy az aminosavsorrendjét vagy a nukleinsavszekvenciáját. Továbbá ez a megközelítés nem működik, ha olyan epitópokra használjuk, amelyek a primer szekvenciában nem egymás mellett található aminosavakat tartalmaznak.
Újabban számos közlemény foglalkozik peptidkönyvtárak előállításával és ezeknek az alkalmazásával peptidligandumok azonosításában, amelyek képesek akceptorokhoz kötődni. Az egyik megközelítésben rekombináns bakteriofágokat használnak nagy könyvtárak előáll ítására, az úgynevezett „fágmódszer” alkalmazásával [Scott and Smith, Science, 249., 386-390. (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87., 6378-6382. (1990); Devlin et al., Science, 249., 404-406. (1990)] nagyon nagy könyvtárak állíthatók elő (106-108 kémiai egység), de a genetikai kód és a biológiai rendszerek számos belső korlátot jelentenek a rendszer sokoldalúsága és diverzitása szempontjából.
Egy második megközelítés elsődlegesen kémiai módszereket alkalmaz, amelyek közül a Geysen-módszer [Geysen et al., Molecular Immunology, 23., 709-715. (1986); Geysen et al., J. Immunologic Method, 102., 259-274. (1987)], valamint a Fodor és munkatársai által közölt új módszer [Science, 251., 767-773. (1991)] lehet a példa. Geysen és munkatársai módszerével korlátozott számú peptidet (103 — 104) lehet előállítani néhány nap alatt polietiléntűkön. Fodor és munkatársai módszere egy úgynevezett „fénnyel irányított, térbelileg címezhető parallel kémiai szintézis” technikát alkalmaz. Ez a technika is korlátozott lehetőségekkel rendelkezik, mivel a fotokémiai peptidszintézis módszerei viszonylag fejletlenek.
Nagy méretekben kifejlesztették a parallel konkurens peptidszintézis technikáját. Houghton leírta több száz analóg peptid szimultán szintézisét polipropilénhálók csomagjaiban (teászacskómódszer) [Houghton, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82., 5131-5135. (1985)]. Berg és munkatársai [J. Am. Chem Soc., 777., 8024-8026. (1989)] leírtak egy polisztirollal kezelt polietilénfilm-hordozót, amely alkalmas peptidszintézis kivitelezésére párhuzamos módon. Mindkét technika standard Boc aminosav gyantát alkalmaz standard védőcsoport-el távolítást, semlegesítési, csatolási és mosási módszerek alkalmazásával, amit eredetileg Merrifield írt le a szilárd fázisú eljáráshoz [J. Am. Chem. Soc., 85., 2149-2154. (1963)].
HU 218 007 Β
Furka és munkatársai (14th International Congress of Biochemistry, 5., Abstract FR-.013 (1988)] leírtak egy olyan módszert, amellyel peptidek keverékét lehet előállítani oly módon, hogy külön kapcsolják mind a három aminosavat, majd a gyantát összekeverik. A Furka és munkatársai által leírt módszer nem ad kielégítő lehetőséget arra, hogy egy kiválasztott pepiidet izoláljunk a számos keletkező pepiid közül.
Jóllehet hasznosak, Geysen, Fodor, Houghton, Berg és Furka kémiai technikái gyakorlatilag csak néhány száz, néhány ezer peptid szintézisét és tesztelését teszik lehetővé egyszerre. Ezek a technikák meglehetősen korlátozottak a több millió lehetséges peptidszekvencia fényében, amelyek közül egy vagy több megfelelhet a kiválasztott egységek közötti kapcsolódási helyeknek. 20 általános aminosav esetében bármely öt aminosavból álló szekvencia 205, azaz körülbelül 3,2 χ 106 lehetséges aminosavkombinációt ad. Az említett eljárások közül egyik sem tette lehetővé azt, hogy egy időben ennyi pepiidet szintetizáljunk. További sokszorozódást jelent a változó peptidlánchossz. Hasonlóképpen, a szokványos peptidszintézis, amit például Stewart és Young írt le [Solid Phase Synthesis, Second Edition, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)], nem ad módszert arra, hogyan lehet egyszerre több millió pepiidet szintetizálni.
Emellett egyik ismert, szokványos peptidszintézismódszer sem teszi lehetővé olyan peptidkönyvtár szintézisét, amely szilárd fázisú hordozóhoz van kapcsolva, és valóban véletlenszerű. Egy valóban véletlenszerű peptidkönyvtár olyan, hogy az összes molekulafajta jó statisztikai gyakorisággal fordul elő benne oly módon, hogy a könyvtár hozzávetőleg ekvimoláris arányban tartalmazza az összes peptidfajtát.
Egy valóban véletlenszerű peptid szintézise általában nem hajtható végre oly módon, hogy különböző aminosavakat adunk egyszerre egy reakcióedénybe, mivel a különböző aminosavak kapcsolási sebessége jelentősen eltér egymástól a szilárd fázisú peptidszintézis (SPPS) során [Ragnarsson et al., Acta Chem. Scand., 25., 1487-1489. (1971); Ragnarsson et al., J. Org. Chem., 39., 3837-3842. (1974)]. Például a Fmoc-glicinnek a kapcsolódási sebessége egy növekedő peptidhez sokkal nagyobb, mint a Fmoc-valin növekedési sebessége, valószínűleg a valin nagy térkitöltésű oldallánca által okozott gátlás miatt. Ha valaki mind a 20 aktivált eukarióta Laminosavat összekeverné a gyantával az összekapcsolás során, akkor a leggyorsabban reagáló aminosavak előnyösen beépülnének a peptidbe, és az egyes peptidfajták ekvimoláris aránya nem lenne elérhető. Továbbá mindegyik lehetséges nukleofdnek eltérő reaktivitása lesz.
Emellett egyik, előzőkben említett peptidszintézismódszer sem teszi lehetővé 105 peptidnél többet tartalmazó könyvtár szintézisét, amelyekben egyetlen peptidfajta egyetlen szilárd fázisú hordozóhoz kapcsolódik. Ha egy hordozón csak egy molekulafajta található, akkor ez nagymértékben javítja a jelenlegi peptidizolálási technikákat.
Tehát a szakterületen szükség van igazán random peptideket és oligonukleotidokat, azaz biooligomerszekvenciákat tartalmazó könyvtár előállítására, amelyből egyetlen biooligomerfajta könnyen és gyorsan izolálható a többi tag közül. Emellett szükség van még a szakterületen egy olyan módszerre is, amellyel gyorsan és olcsón meg lehet szintetizálni több milliót ezekből a valóban random biooligomerszekvenciák közül.
A jelen találmány tárgyát biooligomerek könyvtára képezi, amelyben az alegységek összes lehetséges kombinációja előfordul, valamint a találmány tárgyát képezik a könyvtár előállítására használható módszerek, és a könyvtár használatának módszere.
Pontosabban a jelen találmány tárgya eljárás a könyvtár előállítására, azzal jellemezve, hogy ismételjük azt a lépést, melynek során egy szilárd fázisú hordozóból legalább két alikvot részt kapunk; a szilárd fázisú hordozó alikvot részeire egymástól elkülönítve viszünk be egy alegységkészletet; az alegységet a szilárd fázisú hordozónak lényegében az összes kapcsolási helyéhez hozzákötjük, így létrehozunk egy szilárd fázisú hordozó/új alegység kombinációt, megbizonyosodunk a kapcsolás teljességéről, és ha szükséges, akkor a reakciót a teljesség irányába eltoljuk; a szilárd fázisú hordozó/új alegység kombináció alikvot részeit alaposan összekeverjük; majd az előző lépéseket a szükséges számban megismételjük, eltávolítjuk a védőcsoportokat oly módon, hogy a biooligomer a szilárd fázisú hordozón rajta marad. Egy megvalósítási mód szerint az alegység lehet aminosav, a biooligomer pedig peptid. Egy másik megvalósítási mód szerint az alegység lehet egy nukleozid, a biooligomer pedig egy oligonukleotid. Egy további megvalósítási mód szerint a nukleozid dezoxiribonukleinsav; egy másik megvalósítási mód szerint a nukleozid ribonukleinsav. Egy újabb megvalósítási mód szerint az alegység lehet aminosav vagy nukleozid, a biooligomer pedig lehet egy peptid-oligonukleotid kiméra.
A jelen találmány tárgya eljárás egy akceptormolekula biooligomerliganduma szekvenciájának meghatározására, azzal jellemezve, hogy biooligomerek véletlenszerű könyvtárát állítjuk elő, amelyben a biooligomerek egy szilárd fázisú hordozóhoz vannak kapcsolva. és a szilárdfázisúhordozó-részecskék egyetlen biooligomerfajtát tartalmaznak, és a biooligomert alkotó monomeralegységeknek az összes lehetséges kombinációja megtalálható a kollekcióban; a véletlenszerű könyvtárba bejuttatunk egy kiválasztott akceptormolekulát vagy szubsztrátmolekulát, oly módon, hogy az említett akceptormolekula felismer egy vagy több szilárd fázisú hordozó/biooligomer fajtát a könyvtárban, és hozzákötődik, illetve az említett szubsztrátmolekula kémiai reakción esik át, amelyet a könyvtárban levő egy vagy több szilárd fázisú hordozó/biooligomer kombináció katalizál; izoláljuk azt a szilárd fázisú hordozó/biooligomer kombinációt, amely a keresett tulajdonsággal rendelkezik, majd az izolált szilárd fázisú hordozó/biooligomer komplex oligomerrészének meghatározzuk a szekvenciáját. Egy másik megvalósítási mód szerint a biooligomemek egy részét in situ leválasztjuk a szilárd fázisú hordozó/biooligomer kombinációról, majd a keresett biológiai aktivitást in situ kimutatjuk.
HU 218 007 Β
Az egyik megvalósítási mód szerint a biooligomer egy pepiid. Egy másik megvalósítási mód szerint a biooligomer egy oligonukleotid, pontosabban DNS vagy RNS. Egy még további megvalósítási mód szerint a biooligomer egy peptid/oligonukleotid kiméra.
A jelen találmány tárgyát képezik továbbá azok a terápiás és diagnosztikai hatóanyagok, amelyek az előzőekben meghatározott biooligomerszekvenciákat tartalmazzák.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.
1. ábra: Random peptidszintézis sémája az osztottszintézis-módszerrel egy véletlenszerű tripeptid előállítására, amely egy terminális triptofánt tartalmaz: X-X-X-W (amelyben X=S, A vagy V; 33, azaz 27 lehetséges variáció létezik).
2. ábra: Ciklikus peptidek sematikus ábrázolása.
n=0, 1, 2 stb., és m= 1, 2, 3 stb., n és m értéke lehet egyforma, de nem szükszégszerűen. A folytonos vonalak a lineáris peptidkötéseket jelzik; a szaggatott vonalak a keresztkötéseket jelzik. A specifikusan keresztbe kötött alegységeket A-val és B-vel jelöljük. A csak A-val lép keresztkötésbe, B csak B-vel lép keresztkötésbe, a) „kosár’-motivum; b) „létra”-motívum; c) „pányva”-motívum.
3. ábra: Random tetrapeptidek (X-X-X-W, amelyben X-S, A vagy V) kromatogramjai (C18 fordított fázisú HPLC, Vydac), amelyeket a következőképpen állítunk elő: A) az új megközelítéssel (lásd a szöveget), és B) standard szilárd fázisú peptidszintézissel. A kromatogramot úgy kapjuk, hogy az oszlopot lineáris acetonitril gradienssel eluáljuk. Az A oldószer: 0,1% trifluor-ecetsav és 5% acetonitril; B oldat: 0,1% trifluor-ecetsav és 100 acetonitril.
4. ábra: Anti-v-mos antitesttel és szekunder antitesttel jelzett „hosszú v-mos” peptíd/gyöngy fényképe.
5. ábra: Anti-v-mos antitesttel és szekunder antitesttel jelzett „hosszú v-mos” gyöngyök és „rövid v-mos” gyöngyök keverékének fényképe.
6. ábra: Anti-v-mos antitesttel és szekunder antitesttel jelzett „hosszú v-mos” gyöngyök és „rövid v-mos” gyöngyök keverékének fényképe.
7. ábra: Egy jellegzetes peptidligandkönyvtár screening fotomikrográfiája, amelyben egy pozitív (sötétkék) gyöngy könnyen azonosítható számos negatív (színtelen) gyöngy hátterében.
8. ábra: A biotin koncentrációfuggő gátló hatásának fotomikrográfiája, amelyet az LHPQFgyanta minotóp gyöngyök sztreptavidinalkalikus foszfatázzal való festésére fejt ki.
A: 100 nm; B: 10 nm; C: 1 nm; D: 0,1 nm biotin. Üres gyöngyöket (β-Ala-aminokapronsav-gyanta) kevertünk össze 1:1 arányban az LHPQFD gyantával a sztreptavidin-alkalikus foszfatázzal való inkubálás előtt, hogy belső negatív kontrollként szolgáljon.
A találmány előnyös megvalósítási módjaira részletesen hivatkozunk a továbbiakban.
A továbbiakban a „könyvtár” szakkifejezés egy lényegében véletlenszerű biooligomerkollekciót jelent. A továbbiakban a „biooligomer” egy olyan polimert jelent, amely körülbelül 100 alegységnél kevesebb alegységet tartalmaz. A jelen találmány szerinti biooligomer lehet egy peptid, azaz aminosav alegységeket tartalmazhat, vagy lehet egy oligonukleotid, azaz nukleozid alegységeket tartalmazhat, illetve lehet peptid-oligonukleotid kiméra.
Amint az előzőkben kijelentettük, a jelen találmány tárgya módszer egy biooligomer-könyvtár előállítására oly módon, hogy a biooligomereket random alegységszekvenciával állítjuk elő. A továbbiakban a „random monomeralegység-szekvencia” olyan szekvenciákra vonatkozik, amelyekben bármely monomeralegység megelőzhet vagy követhet egy másik monomeralegységet.
Egy másik megvalósítási mód szerint a monomer alegység lehet egy aminosav, egy aminosavanalóg vagy egy peptidomimetikus anyag. A továbbiakban a „peptidomimetikus anyag” olyan molekulát jelent, amely szerkezetileg és kémiailag hasonlít egy két vagy több aminosavból álló peptidre. Egy másik megvalósítási mód szerint a monomeralegység lehet nukleozid; a nukleozid lehet ribonukleinsav vagy dezoxiribonukleinsav. Egy még további megvalósítási mód szerint a monomeralegységek lehetnek aminosavak és nukleozidok. A biooligomer lehet egy peptid (aminosavakat tartalmaz), egy RNS-oligonukleotid (ribonukleozidokat tartalmaz), egy DNS-oligonukleotid (dezoxiribonukleozidokat tartalmaz), vagy egy peptid-oligonukleotid kiméra. Egy peptideket, oligonukleotidokat vagy peptid-oligonukleotid kimérákat tartalmazó biooligomer az alábbi lépésekből álló eljárással állítható elő:
i) legalább két alikvot részt készítünk egy szilárd fázisú hordozóból a random alegység-szekvenciákhoz;
ii) a szilárd fázisú hordozók alikvot részeihez egymástól elkülönítve kapcsolunk egy alegységcsoportot;
iii) az alegységeket teljesen hozzákapcsoljuk a szilárd fázisú hordozó lényegében összes kötési helyéhez, így létrehozva egy szilárd fázisú hordozó/új alegység kombinációt;
iv) meggyőződünk a kapcsolás teljes lejátszódásáról, és ha szükséges, akkor a reakciókat eltoljuk a teljes lejátszódás felé;
v) a szilárd fázisú hordozó/új alegység kombináció alikvot részeit alaposan összekeverjük;
majd az i)-v) lépéseket a szükséges számban ismételve egy végső vi) lépésben eltávolítjuk a védőcsoportokat úgy, hogy a biooligomer a szilárd fázisú hordozóhoz maradjon kötődve. Egy másik megvalósítási mód szerint a random biooligomer-könyvtárat úgy is előállíthatjuk, hogy legalább az egyik lépésben ugyanazt az alegységet kapcsoljuk az összes szilárd fázisú hordozóhoz, és legalább egy másik lépésben legalább
HU 218 007 Β két alegységet kapcsolunk a szilárd fázisú hordozóhoz. Egy random biooligomer-könyvtár állítható elő az i)-v) lépések ismétlésével; egy másik megvalósítási mód szerint a random biooligomer-könyvtárat az i)-v) lépéseknek több mint egyszeri ismétlésével állíthatjuk elő. Egy szilárd fázisú hordozó úgy is előállítható, hogy egy vagy több alegység már hozzá van kapcsolva.
Egy biooligomer-könyvtár előre meghatározott, korlátozott számú alegységből állhat. Egy másik megvalósítási mód szerint a random biooligomer-könyvtár az összes elérhető alegységet tartalmazhatja.
Egy további megvalósítási mód szerint egy számunkra érdekes biooligomert egy szekvenciális eljárással definiálhatunk, először előállítva egy könyvtárat, majd azonosítva egy biooligomerszekvenciát, amely a számunkra fontos tulajdonságokkal rendelkezik. Ezzel egy olyan szilárd fázisú hordozót állítottunk elő, amely az így azonosított biooligomerszekvenciát tartalmazza. A monomeralegység-szekvenciáknak egy új szegmentumát adjuk az előzőkben azonosított szekvenciához, és ezzel egy új szekvenciát azonosítunk, amely tartalmazza az ismert szekvenciát és egy random szekvenciát, amely a számunkra érdekes tulajdonságokkal rendelkezik. Ez a szekvenciális optimalizálás-randomizálás stratégia lehetővé teszi egy számunkra érdekes biooligomer gyors azonosítását.
A találmány szerinti könyvtár biooligomerjei a könyvtárban lényegében ekvimoláris mennyiségben lehetnek jelen, de nem szükségszerűen. A szakterületen általános jártassággal rendelkező szakember számára nyilvánvaló, hogy a moláris mennyiség egy olyan koncentráció, amelyben egy molekulasúlynyi mennyiséget (grammban kifejezve) oldunk fel az anyagból elegendő oldószerben ahhoz, hogy az oldat térfogata egy liter legyen. A továbbiakban a „lényegében ekvimoláris menynyiségek” szakkifejezés a biooligomerek esetében olyan monomeralegység-fajtákra vonatkozik, amelyek hozzávetőleg azonos koncentrációban vannak jelen. Tehát, ha egy 150 000 biooligomerből álló kollekcióban az A biooligomer 200 pmol/liter koncentrációban van jelen, akkor a 150 000 biooligomer további része is hozzávetőleg 200 pmol/liter koncentrációban van jelen. A továbbiakban azonban a „lényegében ekvimoláris mennyiség” szakkifejezést úgy értelmezzük, hogy a szilárd fázisú hordozó méretének heterogenitásáért felelős. A szilárd fázisú hordozó heterogenitásának eredménye a biooligomer mennyiségének változása, amely az adott hordozóhoz lehet kapcsolva.
A találmány szerinti módszerrel a szilárd fázisú hordozóból legalább két alikvot részt veszünk, amelyekben a szilárd fázisú hordozók száma előnyösen megfelel a szintetizálandó biooligomerek legkisebb számának. Ez lehetővé teszi egy olyan könyvtár készítését, amelyben az egyes szilárd fázisú hordozók egyetlen bioolígomerfajtát tartalmaznak, azaz egy gyöngy-egy biooligomer az arány. A továbbiakban az „alikvot rész” szakkifejezés jelentése egy olyan rész, amely meghatározott frakcióját képezi a szilárd fázisú hordozók összmennyiségének.
Random peptidkönyvtárak
Egy bizonyos megvalósítási mód szerint a random biooligomer-könyvtár peptideket tartalmaz. A „peptid” szakkifejezést a legszélesebb értelemben használjuk, hogy egy, két vagy több aminosav, aminosavanalóg vagy peptidomimetikus anyag alegységből álló vegyületre hivatkozunk. Az alegységeket peptidkötések kötik össze. Egy másik megvalósítási mód szerint az alegység egy másik alegységhez más kötésekkel, például észter-, éter- stb. kötésekkel kapcsolódhat. A továbbiakban az „aminosav” szakkifejezés vagy természetes, vagy mesterséges, szintetikus aminosavakra vonatkozik, beleértve a glicint, valamint mind az L, mind a D optikai izomereket, az aminosavanalógokat és peptidomimetikus anyagokat. Egy három vagy több aminosavból álló pepiidet általában oligopeptidnek hívunk, ha az oligonukleotid rövid. Ha a peptidlánc hosszú, akkor a peptidet polipeptidnek vagy fehérjének hívjuk.
A jelen találmány szintetikus peptidkémián alapul, és nem alkalmaz semmilyen élő rendszert az amplifikáláshoz vagy szűrővizsgálathoz. A peptidkönyvtárak tartalmazhatnak mesterséges aminosavakat. Azaz a találmány szerinti peptidek tartalmazhatnak D-aminosavakat, D- és L-aminosavak kombinációját, valamint különböző „speciális” aminosavakat (például β-metil-aminosavak, C-a-metil-aminosavak és N-a-metil-amínosavak stb.), hogy ezzel a könyvtárban levő peptideknek speciális tulajdonságokat biztosítsunk. Emellett azzal, hogy az egyes kapcsolási lépésekben specifikus aminosavakat használunk, a-hélixeket, β-hajtűket, βlemezeket, γ-hajtűket és ciklikus peptideket lehet előállítani.
A találmány szerinti peptidkönyvtárak tartalmazzák azoknak az aminosavaknak az összes lehetséges kombinációját, amelyekből a peptid felépül. Példaként használjunk egy dipeptidet, amely két aminosavból, a glicinből és a prolinból áll. Ennek négy lehetséges kombinációja van: glicin-glicin, glicin-prolin, prolin-prolin és prolin-glicin, és a random könyvtár mind a négy kombinációt tartalmazza.
Az első aminosavakat egymástól elválasztva juttatjuk be az egyes alikvot részekbe. Általában a peptidszintézishez használt aminosavak lúgra érzékeny N“amino védett 9-fluoreniI-metoxi-karbonil (Fmoc) aminosavak, amelyeket először Carpino és Han írt le [J. Org. Chem., 37., 3403-3409. (1972)]. A jelen találmány szerinti módszer használható Boc-aminosavakkal is (Na-amino védett Na-butil-oxi-karbonil). Mind a Fmoc, mind a Boc N“-amino védett aminosav megkapható a Flukától (Bachem, Advanced Chemtech, Sigma, Cambridge Research Biochemical, Bachem), vagy a Peninsula Labstól, illetve más kémiai társaságtól, amelyek mind ismertek a szakterületen jártas szakember számára. A találmány szerinti módszer emellett más N«-védőcsoportokkal is használható, amelyek a szakterületen jártas szakember számára ismertek.
Az előzőkben megkezdett dipeptidpéldát folytatva, az először bevitt aminosavak a glicin és a prolin; mindegyik alikvot rész vagy Na-Fmoc glicint, vagy Na-prolint kap.
HU 218 007 Β
A bevitel után az elsőként bevitt aminosavakat teljesen hozzákapcsoljuk a szilárd fázisú hordozónak lényegében az összes kapcsolási helyéhez. A továbbiakban a teljes kapcsolás azt jelenti, hogy a kapcsolási reakciót teljesen végrehajtjuk, függetlenül az egyes aminosavak kapcsolási sebességében fennálló különbségektől. Emellett az aminosavakat a szilárd fázisú hordozónak lényegében az összes elérhető kapcsolási helyéhez hozzákötjük, így mindegyik szilárd fázisú hordozó lényegében csak egyetlen peptidfajtát tartalmaz. A teljes kapcsolás eredménye az lesz, hogy szilárd fázisú hordozó/első aminosav kombinációkat fogunk kapni. Az előzőekben példaként leírt dipeptidet használva a teljes kapcsolás egy gyöngy-glicin kombinációt és egy gyöngy-prolin kombinációt eredményez.
Az aminosavak kapcsolását a szakterületen jártas szakemberek számára ismert technikák alkalmazásával végezzük, amelyeket például Stuart és Young írtak le [Solid Phase Synthesis, Second Edition, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)]. A szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára ismert, hogy a szilárd hordozón való peptidszintézis a peptid karboxil- vagy C-terminális végén kezdődik, amelyben a C-terminális aminosavnak a védett a-aminocsoportját egy szilárd fázisú polimerhez kötjük. A védőcsoportot ezután lehasítjuk, és a következő, szintén védett aminosavat egy peptidkötéssel kapcsoljuk a szilárd fázisú hordozóhoz kapcsolt aminosav a-aminocsoportjához. A ciklust, amely az előző aminosav védőcsoportjának eltávolításából és a következő aminosav hozzákapcsolásából áll, addig ismételjük, amíg a peptid teljesen el nem készül. Az aminosavaknak bármelyik reaktív oldalcsoportját olyan kémiai csoporttal védjük meg, amely képes fennmaradni a kapcsolási és N“-védőcsoport-eltávolítási folyamat során, de amely azután a szintézis végén eltávolítható.
Abból a célból, hogy egy aminosavat kapcsoljunk a növekvő szintetikus lánchoz, a blokkolt aminosav karboxilcsoportját aktiválni kell. Az aktiválásra számos módszer ismert és használható a találmány kivitelezésében, idetartoznak például a preformált szimmetrikus anhidridek (PSA), preformált kevert anhidridek (PMA), savkloridok, aktív észterek, és a karbonsav in situ aktiválása [Fields and Noble, „Solid Phase Peptide Synthesis Utilizing 9-fluorenil-methoxicarbonil Amino Acids”, Int. J. Pept. Protein Rés., 35., 161-214. (1990)].
Az Fmoc-aminosavak használata csak egy a lehetséges peptidszintézis-stratégiák közül. Egy Boc (t-butiloxi-karbonillal védett aminocsoport) stratégia használható szilárd fázisú hordozóhoz kötött peptidkönyvtár készítésére [például Geysen et al., J. Immunoi., Methods, 102., 259-274. (1987)].
A kapcsolás teljességéről meg kell győződni. A szakterületen jártas szakemberek számára ismerősek lesznek a széles körben használt kvantitatív ellenőrző tesztek, azaz a ninhidrin- (a Kaiser-teszt), pikrinsav-, 2,4,6-trinitro-benzolszulfonsav- (TNBS), fluoreszkaminés kloramiltesztek, amelyek szabad aminosavcsoporttal való reakción alapulnak, és a reakció eredménye egy kromofór vegyület. Ha iminosavakat (például Pro és
Hyp) használunk, akkor az izatin-ellenőrzési módszer az előnyös (Fields and Noble, im.). A reakció lejátszódásának teljességét a reakció során ellenőrizhetjük, például Salisbury és munkatársai leírása szerint (nemzetközi közzétételi irat WO 91/03485).
Az Fmoc-szintézis esetében a Kaiser-teszt az előnyös. A Kaiser-tesztben az egyes csövekből származó mintát ninhidrinreagenssel lehet ellenőrizni (Pierce Chemical), a Sárin és munkatársai által közölt módszer alkalmazásával [Anal. Biochem., 117., 147-157. (1981)].
Ha a kapcsolási reakció nem teljes a teszt alapján meghatározva, akkor a reakciót el kell tolni a teljes lejátszódás irányába, a szakterületen jártas szakember számára ismert számos módszer egyikével, beleértve
a) egy második kapcsolási reakciót, a védett aminosav egy-ötszörös feleslegben való alkalmazásával,
b) egy újabb kapcsolás végrehajtását, különböző vagy további oldószerek alkalmazását (például trifluor-etán),
c) kaotrop sók hozzáadását, például NaCIO4- vagy LiBr-sók alkalmazását [Klis and Stewart, „Peptides: Chemistry, Structure and Biology”, Rivier and Marshall, eds., ESCOM Publ., 904-906. (1990)].
Miután a kapcsolási reakció teljesen lejátszódott, a szilárd fázisú hordozó/első aminosav kombinációk alikvotjait alaposan összekeverjük. Alapos keverést akkor kapunk, ha az alikvot részek egyenletesen elkeverednek, előnyösen egyetlen reakcióedényben. Jóllehet az egyenletes keverés bármely módszere a jelen találmány oltalmi körébe tartozik, és a különböző eszközök ismertek a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakemberek számára, az előnyös eszközök közé tartozik például a vortexelés, illetve rázatás bármely kereskedelmi forgalomban levő motoros rázóberendezésben, vagy inért gázzal, például nitrogénnel vagy argonnal való átbuborékoltatás.
A kapott keveréket legalább két alikvot részre osztjuk. Ezek az alikvot részek egyforma térfogatúak, és ha a kevertetés megfelelően alapos volt, akkor lényegében azonos mennyiséget tartalmaz a szilárd fázisú hordozó/első aminosav kombinációkból. A dipeptidpélda alkalmazásával mindegyik alikvot lényegében azonos mennyiséget tartalmaz a gyöngy-glicin kombinációból és a gyöngy-prolin kombinációból.
Mindegyik alikvotba bejuttatunk, egymástól függetlenül, egy második aminosavkészletet. Ez a második tartalmazhatja
a) ugyanazt az aminosavat, amelyet az első lépésben felvittünk a hordozóra, azaz a glicint vagy prolint;
b) egy eltérő aminosavat, például triptofánt vagy leucint;
c) csak egyfajta aminosavat, például izoleucint.
Csakúgy, mint az első aminosavakat, a másodikként bevitt aminosavakat is teljesen hozzákapcsoljuk (egyenként) az első alikvot részek szilárd fázisú hordozó/első aminosav kombinációjához, így olyan peptideket kapunk, amelyek az első aminosavat és a második aminosavat tartalmazzák. Csakúgy, mint az előző kapcsolásnál, a kapcsolást a szakterületen használt bármely technikával elvégezhetjük. Az előzőekben említeit dipeptidpéldát használva:
HU 218 007 Β
a) ugyanazt az aminosavkészletet hozzáadva, a keletkező peptidek lehetnek glicin-glicin, glicin-prolin, prolin-glicin-, prolin-prolin;
b) egy eltérő aminosavkészlet alkalmazásával a keletkező peptidek lehetnek Gly-Trp, Gly-Leu, Pro-Trp vagy Pro-Leu;
c) csak egy típusú aminosavval a keletkező peptid Gly-Ile vagy Pro-Ile.
Ezt a módszert annyiszor ismételhetjük, ahányszor van hozzáadandó aminosav. Ha a kiválasztott peptid egy tetrapeptid X-X-X-Trp, ahol X jelentése például valin, szerin vagy alanin, az eljárást háromszor ismételhetjük meg, hogy megkapjuk az X-X-X-Trp tetrapeptidet. Az aminosavak első, második és harmadik bevitelénél az N«-Fmoc valint, N“-Fmoc szerint (O-Bu’) vagy Na-Fmoc alanint adjuk a szilárd fázisú hordozó alikvot részeihez, így kapunk 27 különböző pepiidet, hozzávetőlegesen ekvimoláris mennyiségben (1. ábra). Ha hexapeptidre van szükség, akkor az eljárást hatszor megismételjük. Ha a hexapeptidnek öt különböző aminosavból kell állnia, akkor a módszert öt alikvotra alkalmazhatjuk, mindegyik egy különböző aminosavat tartalmaz minden egyes kapcsolási lépésben. Ha azonban a hexapeptidet a húsz alapaminosav bármelyikének a felhasználásával kell előállítani, akkor a módszert minden egyes kapcsolási lépésben húsz alikvot rész felhasználásával kell alkalmazni.
A találmány szerinti peptidszintézis-módszer olyan szilárd fázisú hordozóval alkalmazható, amelyhez egy aminosav van hozzákapcsolva, vagy olyan hordozóval, amelyikhez nincs hozzákapcsolva aminosav. Emellett egy linkermolekula is használható, előre a szilárd fázisú hordozóhoz kapcsolva. Egy általános hordozó, amelyhez egy aminosav már hozzá van kötve, a β-alaninPAN-gyanta (Bachem Biochemical). Ezek a gyanták számos kereskedelmi forrásból beszerezhetők, illetve előállíthatók a laboratóriumban, a peptidszintézisben szerzett ismeretek alapján.
Ha egy szilárd fázisú hordozó/aminosav kombinációt, vagy szilárd fázisú hordozó/linker kombinációt használunk kiindulási reagensként, akkor legalább két alikvot részre osztjuk szét, és mind a kettő kap egy aminosavat az első aminosavkészletből. Amint az előzőkben leírtuk, az első aminosavkészletet teljes mértékben hozzákapcsoljuk a szilárd fázisú hordozó/aminosav kombináción vagy szilárd fázisú hordozó/linker kombináción található összes kötőhelyhez, majd ezeket az újonnan hozzáadott aminosavakat tartalmazó alikvot részeket alaposan összekeverjük. Amint az előzőkben leírtuk, a keveréket legalább két alikvot részre osztjuk, mindegyik alikvot rész kap egy aminosavat az aminosavak második csoportjából, majd a kapcsolási reakciót megismételjük, így kapunk egy növekvő peptidet. Amint az előzőkben leírtuk, az eljárást szükség esetén többször megismételhetjük, a kiválasztott peptidek előállítása céljából.
Ezt a módszert használhatjuk random peptidek szintézisére, valamint egy olyan peptidkönyvtár előállítására, amely előre meghatározott szekvenciákat tartalmaz. Az előre meghatározott szekvenciák szintézise magában foglalja specifikus N“-Boc, N“-Fmoc vagy más, megfelelően megvédett aminosavak használatát a specifikus kapcsolási lépésekben. Például specifikus kapcsolási lépésekben kiválaszthatók olyan aminosavak, amelyek révén a keletkező peptidek nagyobb valószínűséggel fognak felvenni egy adott szekunder szerkezetet, például β-lemez-, α-hélix-, β-hajtű- stb. szerkezetet. Például az α-hélix lehet az előnyös, ha Glu, Alá, Leu, His, Trp aminosavat használunk előnyben részesített aminosavként; másrészről viszont a β-lemez lesz az előnyben részesített konformáció, ha Val, He, Tyr és Met aminosavakat használunk. Egy másik eset, ha Gly, Asn, Ser, Pro, Asp aminosavakat használunk, akkor a β-hajtűszerkezet lesz előnyben részesítve. Más példák is megfontolhatok, például savas aminosavak az N-terminális közelében, bázikus aminosavak a C-terminális közelében, az α-hélix stabilizálása érdekében. A D-aminosavak bizonyos kanyarokat stabilizálhatnak, és számos más szerkezeti motívum is beépíthető még (lásd az 5.2.1 és 5.2.2. pontokat). Még az is lehetséges, hogy ciklikus peptidek könyvtárát állítsuk elő diszulfid-, laktám-, lakton- vagy más gyűrűzáró egységek felhasználásával (lásd 5.2.1).
Hangsúlyoznunk kell, hogy a jelen találmány szerinti módszer lehetővé teszi olyan peptidek szintézisét, amelyekre az jellemző, hogy mindegyik szilárd fázisú hordozó, azaz gyantagyöngy csak egyetlen peptidtípust tartalmazzon. Ez a módszer biztosítja hogy minden egyes gyantagyöngy csak egyetlen Fmoc aminosavval legyen kapcsolatban minden egyes kapcsolási ciklusban, és a kapcsolás teljes mértékben lejátszódjon. Az egv gyöngy-egy peptid szintézis nagyobb érzékenységet és nagyobb peptidizolálási hatékonyságot tesz lehetővé, amely specifikus arra az egységre, amelyhez kapcsolódik.
A módszer könnyen használható arra, hogy 105, 107 különböző peptidfajtát tartalmazó random peptidpoolt szintetizáljunk vele.
A találmány egyik megvalósítási módja szerint a könyvtár peptidjei egy speciális aminosavat tartalmazhatnak a C-terminálison, amelyben lehet egy CO2H- vagy CONH2-oldallánc, hogy ezzel egy szabad glicin vagy glicinamidcsoportot szimuláljanak. Egy másik, erre a speciális csoportra vonatkozó megfontolás az, hogy lehet egy D vagy L aminosav analóg egy olyan oldallánccal, amely a linkért vagy a gyöngyhöz való kötést tartalmazza. Egy másik megvalósítási mód szerint a pszeudoszabad C-terminális csoportnak lehet D vagy L optikai konfigurációja; egy másik megvalósítási mód szerint D- és L-izomerek racém keverékét használhatjuk.
Egy még további megvalósítási mód szerint a könyvtár peptidjeinek N-terminális csoportjaként piroglutamátot használhatunk. Jóllehet a piroglutamát nem alkalmas arra, hogy Edman-degradációval meghatározható legyen a szekvenciában, ha egy adott gyöngyön csak korlátozott mértékben (50%) helyettesítjük a peptidet N-terminális piroglutamáttal, akkor marad elég, nem piroglutamátvégű peptid a gyöngyön, abból a célból hogy a szekvenciát meghatározhassuk. A szakterületen átlagos a jártassággal rendelkező szakember szá7
HU 218 007 Β mára nyilvánvaló, hogy ez a technika bármely olyan peptid szekvenciájának a meghatározására alkalmas, amely az N-terminálisán az Edman-degradációnak ellenálló csoportot tartalmaz. Más, a keresett aktivitással rendelkező egyes peptidek jellemzésére szolgáló módszereket részletesen leírjuk a továbbiakban. Egy az Nterminálison blokkoló csoportot, például piroglutamátot tartalmazó pepiidnek a specifikus aktivitását, ha az adott N-terminális csoport csak a peptid 50%-án van jelen, könnyen ki lehet mutatni, oly módon, hogy egy teljesen (100%-ig) blokkolt peptid aktivitását összehasonlítjuk egy nem blokkolt (0%) peptid aktivitásával.
Egy további megvalósítási mód szerint azokat a peptidalegységeket választjuk, amelyek számunkra hasznos kémiai és szerkezeti tulajdonságokkal rendelkeznek. Például a D-aminosavakat tartalmazó peptidek in vivő rezisztensek az L-aminosavakra specifikus proteázokkal szemben. Emellett a jelen találmány szerinti módszerrel készíthetők olyan peptidkönyvtárak, amelyek sokkal jobban meghatározott szerkezeti tulajdonságokkal rendelkeznek, és peptidomimetikus molekulákat, illetve peptidomimetikus kötéseket, például észterkötéseket használhatunk új tulajdonságokkal rendelkező könyvtárak előállítására. Egy másik megvalósítási mód szerint egy olyan peptidkönyvtár is előállítható, amely redukált peptidkötést tartalmaz, például Rt-CH2-NH-R2 kötést, ahol R| és R2 jelentése aminosavcsoport vagy -szekvencia. Egy redukált peptidkötés dipeptidalegység formájában vihető be a peptidbe. Egy ilyen molekula ellenáll a peptidkötés hidrolízisének, például a proteázaktivitásnak. Az ilyen könyvtárak egyedi tulajdonságokkal rendelkező ligandumokat szolgáltatnak, azaz olyanokat, amelyeknek in vivő megnövekedett a féléletidejük, a metabolikus lebontásnak vagy proteázaktivitásnak való ellenállás következtében. Emellett az jól ismert, hogy bizonyos rendszerekben a feszültséget tartalmazó (torzított) peptidek megnövekedett aktivitást mutatnak [Hruby, Life Sciences, 31., 189-199. (1982); Hruby et al., Biochem. J., 268., 249-262. (1990)]; a jelen találmány tárgyát egy olyan módszer képezi, amellyel a összes pozícióban random szekvenciát tartalmazó torzított peptid állítható elő.
Torzított és ciklikus peptidek
Egy torzított, ciklusos vagy megmerevített pepiidet az előzőkben idézett módszerrel állíthatunk elő, azzal a feltétellel, hogy a könyvtár mindegyik peptidjében a szekvencia legalább két pozíciójába egy olyan aminosavat vagy aminosavanalógot építünk be, amely torzítás, ciklizálás vagy megmerevítés kivitelezésére alkalmas kémiai csoportot tartalmaz, amely az említett kívánalmak megvalósítására alkalmas a keresztkötés létrehozását célzó kezelés után. A ciklizálás az előnyös, ha egy hajtűkialakulást indukáló aminosavat építünk be. Egy pepiidben keresztkötés létrehozására alkalmas aminosavra példa lehet a risztéin, amely diszulfídhidakat képez, az aszparaginsav, amely laktont vagy laktámot képez, és egy kelátor, úgymint a gamma-karboxil-glutaminsav (Gla) (Bachem), amely egy átmenetifémmel kelátot képezve hoz létre keresztkötést. Védett gamma-karboxiglutaminsav úgy állítható elő, hogy a Zee-Chang és
Olson által leírt szintézist [Biophys. Biochem. Rés. Comm., 94., 1128-1132. (1980)] módosítjuk. Egy peptidkönyvtárat, amelyben a peptidszekvencia legalább két olyan aminosavat tartalmaz, amelyek képesek keresztkötés kialakítására, megfelelő kezelésnek vethetünk alá, például oxidálhatjuk egy diszulfidhíd kialakítása céljából, vagy fémiont adhatunk hozzá egy kelát kialakítása céljából, ezzel a pepiidben keresztkötést alakítunk ki, és torzított, ciklusos vagy merevített peptidet hozunk létre.
A jelen találmány tárgya egy sorozat általános merev motívum használata a jelen találmány szerinti könyvtárak előállítása céljából. Az egyik megvalósítási mód szerint (2a. ábra) két pár keresztkötés kialakítására képes csoportot úgy rendezünk el, hogy egy „kosarat” hozzanak létre. Egy ilyen „kosár’-motívum jól használható például egy katalitikus zseb kialakításában, emellett újszerű kötési tulajdonságai alakulhatnak ki a torzított konformáció következtében. Egy másik megvalósítási mód szerint két pár keresztkötés egy „létra”-motívumot hoz létre (2b. ábra). D- és L-aminosavak váltakozó használatával egy „létra”-motívumon belül egy olyan peptid hozható létre, amelyben az összes oldallánc az egyik felszín felé irányul, amely analóg a gramicidinben talált hordószerkezethez. Egy ilyen felszín potenciálisan egy kiváló katalitikus hely. Egy még további megvalósítási mód szerint egy egyszerű „pányva”-motívuin állítható elő, amelyben két csoport egy keresztkötést hoz létre (2c. ábra). Amellett, hogy egy peptidhurkot hozunk létre, egy rövidebb „pányva”-motívum is egy konformáció szempontjából torzított lineáris peptidet eredményez, ezzel stabilizálja a szekunder struktúrát. azaz az alfa-hélixet.
Az is elképzelhető, hogy peptidek között létrejött keresztkötések is eredményezhetnek merev peptidmátrixot.
A jelen találmány tárgyát keresztkötések szisztematikus létrehozását célzó stratégiák képezik. Ha például négy ciszteincsoportot építünk be egy peptidszekvenciába, akkor különböző védőcsoportok használhatók [Hiskey, 1981, in The Peptide: Analysis, Synthesis, Biology, 3., Gross and Meienhofer, eds., Academic Press: New York, 137-167. (1981); Ponsanti et al., Tetrahedron, 46., 8255-8266. (1990)]. Az első ciszteinpárról eltávolíthatók a védőcsoportok és oxidálhatok, maid a második ciszteinpárról is eltávolíthatjuk a védőcsoportot és oxidálhatjuk őket. Ily módon a diszulfidkeresztkötések meghatározott sorozata állítható elő. Egy másik módszer szerint egy ciszteinpárt és egy kelátképző aminosavpárt építhetünk be, így hozhatunk létre különböző kémiai természetű keresztkötéseket.
Nem klasszikus aminosavak, amelyek konformációs torzulást okoznak
Az alábbi, nem klasszikus aminosavakat beépíthetjük a random peptidkönyvtárba, hogy ezzel adott konformációs motívumot vigyünk be: 1,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-3-karboxilát [Kazimierski et al., J. Am. Chem. Soc.,
113., 2275-2283. (1991)]; (2S,3S)-metil-fenilalanin, (2S,3R)-metil-fenilalanin, (2R,3S)-metil-fenilalanin és (2R,3R)-metil-fenilalanin [Kazimierski and Hruby,
HU 218 007 Β
Tetrahedron Letters (1991)]; 2-amino-tetrahidronaftalin2-karbonsav [Landis, PhD Thesis, University of Arizona (1989)]; hidroxil-1,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-3-karboxilát [Miyake et al., J. Takeda Rés. Labs., 43., 53-76. (1989)] β-karbolin (D és L) [Kazimierski, PhD Thesis, University of Arizona (1988)]; HIC (hisztidin-izokinolin-karbonsav) (Zechel et al., Int. J. Pép. Protein Rés.,
43., (1991)]; és HIC (hisztidinciklikus karbamid) (Dharanipragada).
Az alábbi aminosavanalógokat és peptidomimetikus anyagokat építhetjük be egy kiválasztott könyvtárba, hogy specifikus szekunder struktúrákat indukáljunk vagy előnyben részesítsünk: LL-Acp (LL-3-amino-2propenidon-6-karbonsav); egy β-hajtűt indukáló dipeptidanalóg [Kemp et al., J. Org. Chem., 50., 5834-5838. (1985)]; β-lemezeket indukáló analógok [Kemp et al., Tetrahedron Letters, 29., 5057-5060. (1988)]; a-hélixet indukáló analógok [Kemp et al., Tetrahedron Letters,
29., 4935-4938. (1988)]; gamma-hajtűt indukáló analógok [Jemp et al., J. Org. Chem., 54., 109-115. (1989)], valamint az alábbi idézetekben szereplő analógok: Nagai and Sato, Tetrahedron Letters, 26., 647-650. (1985); DiMaio et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1687. (1989); egy Gly-Ala kanyaranalóg [Kahn et al., Tetrahedron Letters, 30., 2317. (1989)], amidkötés izoszter [Jones et al., Tetrahedron Letters, 29., 3853-3856. (1988)]; tetrazol [Zabrocki et al., J. Am. Chem. Soc.,
110., 5857-5880. (1988)]; DTC [Sámánén et al., Int. J. Protein Pép. Rés., 35., 501-509. (1990)]; valamint az Olson et al., J. Am. Chem. Sci., 112., 323-333. (1990) és Garvey et al., J. Org. Chem., 56., 436. (1990) irodalmi hivatkozásokban szereplő analógok.
Jóllehet az említett nem klasszikus peptidek és peptidomimetikus anyagok nem alkalmasak az Edman-degradációs szekvenciaelemzés végrehajtására, egy induló Edman-degradáció, majd a megmaradó lánc aminosavelemzése használható arra, hogy egy kívánt aktivitással rendelkező peptid szerkezetét meghatározzuk. Egy másik módszer szerint tömegspektrum-elemzést is használhatunk.
Derivatizált és módosított peptidek
A jelen találmány tárgyát képezi továbbá egy könyvtárban szereplő peptidek módosítása és derivatizálása. Egy átlagos szakmai ismeretekkel rendelkező szakember számára a peptidek módosítása jól ismert, idetartozik a foszforilezés, karboxi-metilezés és acilezés. A módosításokat kémiai és enzimatikus eszközökkel hajthatjuk végre.
Egy másik szempont, hogy glikozilezett vagy zsírsavval acilezett peptidszármazékok is előállíthatok. A glikozilezett vagy zsírsavval acilezett peptidek előállítása jól ismert a szakterületen, amit az alábbi példákkal lehet illusztrálni:
1. Garg and Jeanloz, in Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, 43., Academic Press (1985);
2. Kunz, Ang. Chem. Int. Ed. English, 26., 294-308. (1987);
3. Horvat et al., Ang. Chem. Int. Pept. Protein Rés.,
31., 499-507.(1988);
4. Bardaji et al., Ang. Chem. Int. Ed. English, 23., 231. (1990);
5. Tóth et al., in Peptides: Chemistry, Structure and Biology. Rivier and Marshall, eds., ESCOM Publ., Leiden, 1078-1079. (1990);
6. Torres et al., Experientia, 45., 574-576. (1989);
7. Torres et al., EMBO J„ 8., 2925-2932. (1989);
8. Hordever and Musiol, in Peptides: Chemistry, Structure and Biology, im., 811-812.;
9. Zee-Cheng and Olson, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 94., 1128-1132.(1989);
10. Marki et al., Helv. Chem. Acta, 60., 807. (1977);
11. Fuju et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 163-164.(1987);
12. Ponsati et al., Peptides 1990, Giralt and Andreu, eds., ESCOM Publ., 238-240. (1990);
13. Fuji et al., Peptides: Chemistry and Biology, Marshall, ed., ESCOM Publ., Leiden, 217-219. (1987, 1988);
A peptid-szénhidrát kötéseknek két típusa van. Az elsőben éterkötés köti össze a szerin vagy a treonin hidroxilcsoportját a cukorral. A másodikban amidkötés köti össze a glutamát vagy aszpartát karboxilcsoportját egy, a cukron levő aminocsoporttal. Pontosabban az 1. és 2. referenciák írják le a peptid-szénhidrát éterek és amidok készítésének módszereit. Az acetál- és ketálkötések is hozzáköthetik a szénhidrátot a peptidhez.
Zsírsavas peptidszármazékok is előállíthatok. Például, de nem kívánjuk magunkat erre korlátozni, egy szabad aminocsoport (N-terminális vagy lizil) acilezhető, például mirisztoilezhető. Egy másik megvalósítási mód szerint alifás oldalláncot (CH2)nCH3 tartalmazó aminosav is beépíthető a peptidkönyvtár peptidjeibe. Ezek, és egyéb peptid-zsírsav konjugátumok, amelyek alkalmasak arra, hogy a jelen találmány megvalósítása során alkalmazzuk, a GB-8809162.4 számú UK szabadalmi bejelentésben vannak leírva (PCT/AU89/00166 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés, 5. számú idézet).
Random oligonukleotid-könyvtárak
Nukleinsavakból álló kiválasztott könyvtár szintézisének módszerét adaptálhatjuk a DNS szilárd fázisú szintéziséből [foszforamidit-módszer, úttörői Caruthers, Science, 230., 281. (1985); Caruthers et al., Methods in Enzymology 154., 287-313. (1987)].
Mind a szilikátbázisú oldhatatlan polimerhordozók, mind a védett dezoxinukleozidok kereskedelmi forgalomban vannak (például Peninsula Laboratories, Inc., Califomia, Applied Biosystems, Inc.). A védett dezoxinukleotidokra példa az 5’-O-dimetoxi-tritil-dezoxitimidiri, 5’-O-dimetoxi-tritil-4N-benzoil-dezoxiadenozin és az 5’-O-dimetoxi-tritil-N-izobutil-dezoxiguanozin. Más specifikus védőcsoportok is használhatók, az alkalmazástól függően. A megfelelő dezoxinukleozid 3’-foszforamiditeket Caruthers és munkatársai módszerével (im) szintetizálhatjuk és kapcsolhatjuk a szilárd hordozóhoz. Az első dezoxinukleozidok rögzíthetők, például dezoxiadenozinként. A detritilezés és a diklór-metános, acetonitriles mosás után a szilárd hordozót négy egyforma alikvot részre osztjuk, majd négy különböző reak9
HU 218 007 Β cióedénybe tesszük. A négy dezoxinukleozid-3 ’-foszforamiditet ezután külön-külön a négy különböző reakcióedénybe tesszük. Miután a kapcsolás, mind a négy reakcióedényben lejátszódott, a szilárd hordozókat összekeverjük, alaposan mossuk, majd jód/víz/lutidin/THF elegyével oxidáljuk. Az oxidáció után a szilárd hordozót alaposan mossuk acetonitrillel, és a fenti ciklust megismételjük. Miután a random polidezoxinukleotid-lánc szintézise befejeződött, (azaz 11 kapcsolási lépés után), a metil-észter-csoportokat tiofenollal lehasítjuk, és a DMT-csoportot triklór-ecetsavval lehasítjuk. A védőcsoportokat nem tartalmazó polinukleotidláncok ezután kovalens kötéssel a szilárd hordozóhoz kapcsolva maradnak (ha a megfelelő linkereket választottuk), készen arra, hogy az előzőkben kiválasztott szűrővizsgálati módszerrel átvizsgáljuk.
A jelen találmány szerint más, foszfodiészterkötéstől eltérő kötéseket tartalmazó oligonukleotidok is használhatók. Egy oligonukleotid tartalmazhat például egy foszforotionátkötést. Más módosított foszfodiészterkötések és -kötés-analógok is jól ismertek a szakterületen. Az ilyen módosított kötésekről ismert, hogy ellenállnak az exonukleáz- és endonukleázaktivitásnak.
Mivel kapcsolási lépésenként csak négy DNS- vagy RNS-nukleozidot használhatunk, ezért egy 12 tagú nukleotidokból álló könyvtárban 412 lehetséges polinukleotidszekvencia van, azaz összesen l,68xl07 lehetőség. Emellett egy oligonukleotidot úgy is megszintetizálhatunk, hogy mind DNS-, mind RNS-nukleozidot tartalmaz. Egy, a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára nyilvánvaló, hogy a főnukleozidok mellett ritka, és módosított nukleozidokat is használhatunk. A ritka és módosított nukleozidok közé tartozik például az inozin, a metilezett purinnukleozidok, uridinszármazékok és a 2’-O-metil-ribóz, amely bármelyik ribonukleozidban előfordulhat.
Szilárd fázisú hordozók és linkerek a random biooligomer-könyvtárban való felhasználás céljából
Egy, a találmány szerinti szilárd fázisú hordozó a biooligomerszintézis reakciókörülményeire nem reagál, azaz sem a peptid-, sem az oligonukleotid-szintézis körülményeire nem változik. Egy, a jelen találmány szerinti eljárásban alkalmazott szilárd fázisú hordozónak olyan reaktív csoportokkal kell rendelkeznie, hogy egy monomeralegységet hozzá lehessen kapcsolni, vagy egy olyan linkért vagy kart lehessen hozzákapcsolni, amely egy monomeralegység kezdő kapcsolódási pontjaként szolgálhat. A találmány egyik megvalósítási módja szerint a szilárd fázisú hordozó alkalmas lehet in vivő felhasználásra, azaz a biooligomer-könyvtár direkt felhasználásánál hordozóként szolgálhat (például TentaGel, Rapp Polymere, Tubingen, Germany). Egy bizonyos megvalósítási mód szerint a szilárd fázisú hordozó lehet kellemes ízű, orálisan fogyasztható. Egy másik megvalósítási mód szerint a szilárd fázisú hordozó egy alkalmas kromatográfiás hordozó lehet.
A továbbiakban a szilárd fázisú hordozót nem korlátozzuk egy specifikus típusú hordozóra. Ehelyett inkább nagyszámú hordozó kapható és ismert a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára. A szilárd fázisú hordozók közé tartoznak a szilikagélek, gyanták, műanyagfilm-származékok, üveggyöngyök, gyapot, műanyag gyöngyök, alumíniumgélek. Egy megfelelő szilárd fázisú hordozót a végfelhasználás szempontjából és a különböző szintetikus folyamatokban való alkalmazhatóság szempontjából választunk ki. A peptidszintézishez például a szilárd fázisú hordozó lehet gyanta, például polisztirol (például PAMgyanta, Bachem Inc., Peninsula Laboratories, etc.), POLYHIPE gyanta (Aminotech, Kanada), poliamidgyanta (Peninsula Laboratories), polietilénglikolt tartalmazó polisztirolgyanta (TentaGel, Rapp Polymere, Tübingen, Németország), vagy polidimetil-akrilamid gyanta (Milligen/Biosearch, Califomia). A peptidszintézis egy előnyös megvalósítási módja szerint a szilárd fázisú hordozó egy polidimetil-akrilamid gyanta.
A találmány szerinti szilárd fázisú hordozók linkért is tartalmazhatnak. A továbbiakban linker alatt bármely olyan molekulát értünk, amely térbeli távolságot biztosít a hordozó és a szintetizálandó peptid között. A linkereket kovalens kötéssel a szilárd fázisú hordozóhoz kapcsolhatjuk egy N“-Boc-cal vagy N“-Fmoc-cal, vagy más, megfelelően védett aminosavval való kapcsolás előtt. Az oligomemek a szilárd fázisú hordozóhoz való kapcsolására különböző linkerek használhatók. A linker lehet amino-vajsav, amino-kapronsav, 7-amino-heptánsav és 8-amino-kapronsav. Az Fmoc-amino-kapronsavat a Bachem Biochem árulja, és az előnyös megvalósítási módok egyikében ezt használjuk. Egy további megvalósítási mód szerint a linkerek emellett még egy vagy több β-alanint is tartalmazhatnak, távtartóként. Emellett, a szilárd fázisú hordozót módosíthatjuk úgy is, hogy az adott biológiai esszé vagy vizsgálat specifikus igényeit kielégítse. A szilárd fázisú hordozó módosítását egy specifikus linker beépítésével végezhetjük. A módosított szilárd fázisú hordozó lehet például savérzékeny, bázisérzékeny, nukleofilérzékeny, elektrofilérzékeny, fényérzékeny, oxidációra érzékeny vagy redukcióra érzékeny.
Az előzőkben ismertetett linkerek mellett szelektíven lehasítható linkerek is használhatók. Egy ultraibolyaérzékeny linker, az ONb használatát a későbbiekben mutatjuk be [Bárány and Albenica, J. Am. Chem. Soc., 107., 4936-4942. (1985)]. Más hasítható linkerek hidrogenolízist vagy fotolízist igényelnek a hasításhoz. A fényérzékeny (fénnyel hasítható) linkerekre például Wang [J. Org. Chem., 41., 32-58. (1987)]; Hammer és munkatársai [Int. J. Pept. Protein Rés., 36., 31 -45. (1990)] és Kreib-Cordonier és munkatársai [in Peptides - Chemistry, Structure and Biology, Rivier and Marshall, eds., 895-897. (1990)] adnak meg példákat. Landen [Methods in Enzymology, 47., 145-149. (1977)] vizes hangyasavat használt az Asp-Pro kötések hasítására; ezt a megközelítést használták T-sejt-determinánsok jellemzésére, a Geysen-tűszintézissel kapcsolatban [Van dér Zee et al., Eur. J. Immunoi., 191., 43 -47. (1989)]. Más lehetséges, lúgos körülmények között hasítható linkercsoport például a p-(hidroxi-metil)-benzoesav [Atherton et al., J. Chem. Soc. Perkin I, 538-546. (1981)] és a hidroxi-ecetsav- [Baleux et al.,
HU 218 007 Β
Int. J. Pept. Protein Rés., 28., 22-28. (1986)] alapú csoport. Geysen és munkatársai [J. Immunoi. Methods,
134., 23-33. (1990)] a peptid hasítását a diketopiperazinmechanizmussal végezték. Egy enzim specifikusan hasíthat egy linkért, ha az olyan szekvenciát tartalmaz, amely érzékeny az enzimes hasításra, vagy annak szubsztrátja, például ilyen egy peptidproteáz hasítása; egy oligonukleotid endonukleázos hasítása. Bizonyos esetekben a gyanta 10-15%-ából származékot készíthetünk oly módon, hogy egy hasítható linkért kapcsolunk rá, majd a megmaradó 50-90%-ot egy nem hasítható linkerrel helyettesítjük, hogy biztosítsuk azt, hogy a linker lehasítása után elegendő peptid marad a gyantán a szekvenáláshoz. A hasítható linkerek kombinálása is használható arra, hogy ezzel egyetlen gyöngyről megvalósítható legyen a szekvenciális lehasítás.
Egy, a jelen találmány szerinti eljárásban használható szilárd fázisú hordozó tartalmazhat egy számunkra érdekes biooligomert, amelyhez egy random alegységszekvenciát adhatunk hozzá. Az előre hozzákapcsolt biooligomert az alábbiakban ismertetett eljárások szerint választhatjuk meg, illetve tartalmazhatnak egy olyan szekvenciát, amelyről tudott, hogy a keresett tulajdonságokkal rendelkezik.
Az oligonukleotidok szintézise során egy szilikátalapú, szilárd fázisú hordozó lehet előnyös. Amint azt az előző pontban tárgyaltuk, a szilikátalapú, szilárd fázisú hordozók kereskedelmi forgalomban vannak (például a Peninsula Laboratories, Inc. és az Applied Biosystems, Inc. hozza forgalomba).
A számunkra érdekes biooligomerek kimutatása és azonosítása
Amellett, hogy valódi random biooligomer-könyvtár előállítására ad meg eljárást, a jelen találmány tárgyát képezik még azok a módszerek is, amelyekkel a biooligomer-könyvtárat át lehet vizsgálni, hogy a könyvtáron belül azonosítsuk azokat a biooligomereket, amelyek számunkra érdekes biológiai aktivitással rendelkeznek, azaz kötődési képességgel, stimuláló hatással, gátló hatással, toxicitással, ízzel stb. Más biooligomer-könyvtárak az alábbiakban ismertetett módszerekkel vizsgálhatók át enzimaktivitás, enzimgátló aktivitás, valamint a számunkra érdekes kémiai és fizikai tulajdonságok szempontjából.
Az egy induló szűrővizsgálatban felfedezett, számunkra fontos oligomerek nem szükségszerűen a végső ligandumok. Valójában előnyös, ha egy második könyvtárat szintetizálunk, amelyben a szekvenciákat az első szűrővizsgálat során kiválasztott ligandumok szekvenciája alapján határozzuk meg. Ily módon magasabb aktivitású ligandumokat is azonosíthatunk, azzal a feltétellel, hogy a második szűrővizsgálatot az elsőnél szigorúbb feltételek között hajtjuk végre.
Kötési vizsgálatok
A jelen találmány lehetővé teszi, hogy azonosítsuk azokat a biooligomerligandumokat, amelyek az akceptormolekulákat megkötik. A továbbiakban az „akceptormolekula” bármely olyan szubsztanciára vonatkozik, amely egy biooligomerligandumhoz kötődik. Az akceptormolekula lehet egy biológiai makromolekula, például, anélkül, hogy erre korlátoznánk magunkat, lehet antitest, receptor, vagy vírus. Emellett az akceptormolekula lehet kémiai vegyület, például, anélkül, hogy korlátoznánk magunkat, lehet fehérje, szénhidrát, nukleinsav, lipid, drog, fém vagy kis molekula.
A találmány szerinti biooligomermolekula potenciálisan számos különböző akceptormolekulával léphet kölcsönhatásba. Annak a biooligomerfajtának az azonosításával, amelyhez egy specifikus akceptormolekula hozzákötődik, lehetséges a számunkra érdekes biooligomerfajta fizikai azonosítása.
Mivel csak kisszámú gyöngyöt távolítunk el az egyes szűrési/kimutatási/izolálási lépésekben, a gyöngyök legnagyobb része ott marad a poolban. Ennélfogva a random biooligomer-könyvtár többször is felhasználható. Ha a különböző akceptormolekulákhoz különböző szint vagy azonosítási sémát használunk [például fluoreszcens jelzőcsoportokat, mint például a fluoreszceint (zöld), Texas Redet (vörös) és DAPI-t (kék) kötve az akceptorokra], valamint alkalmas gerjesztőszűrőket használunk a fluoreszcenciamikroszkópban vagy a fluoreszcenciadetektorban, akkor különböző akceptorokat (receptorokat) adhatunk egy peptidkönyvtárhoz, és szimultán értékelhetjük ki, hogy megkönnyítsük a specifikus ligandumok gyors szűrővizsgálatát. Ezek a stratégiák nemcsak a költségeket csökkentik, hanem az átvizsgálható akceptormolekulák számát is megnövelhetik.
A találmány szerinti módszerben egy számunkra érdekes akceptormolekulát bejuttatunk egy biooligomerkönyvtárba, ahol a bevitt molekula felismer, és hozzákötődik egy vagy több biooligomerfajtához. Mindegyik biooligomerfajta, amelyhez az akceptormolekula hozzákötődik, egyetlen szilárd fázisú hordozón lesz található, és így a hordozó és vele a biooligomer könnyen azonosítható és izolálható.
A biooligomert a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára ismert szokványos módszerekkel izolálhatjuk, és a találmányt az izolálás módszerei nem korlátozzák. Például anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, lehetséges egy olyan szilárd fázisú biooligomer hordozót fizikailag izolálni, amely a legerősebb kötődést mutatja a specifikus akceptormolekulához. Egy, a fizikokémiai kölcsönhatáson alapuló megvalósítási mód szerint, egy specifikus akceptormolekula oldatát adjuk egy random peptidkönyvtárhoz, amely megfelel körülbelül 105 —107 szilárd fázisú hordozónak. Az akceptormolekulát a gyantával inkubáljuk, annyi ideig, amennyi elegendő ahhoz, hogy létrejöjjön a kötődés a peptid és az antitest között, például mondjuk egy óra hosszat 22 °C-on. Ezután a beborított biooligomer/szilárd fázisú hordozót izoláljuk. Ennél specifikusabb megvalósítási módokat írunk le az alábbi módszerekben, amelyekben oldható akceptormolekulaként egy monoklonális antitest használatát íijuk le. Az nyilvánvaló, hogy ezek a módszerek könnyen adaptálhatók arra, hogy bármely akceptormolekula kötődését kimutassuk. Továbbá, jóllehet az alábbiak peptidkönyvtárakra vonatkoznak, az nyilvánvaló, hogy az oligonukleotid vagy peptid-oligonukleotid kimérák vizsgálatára is igazak.
HU 218 007 Β
i) A monoklonális antitestet először egy fluoreszcens csoporttal jelöljük vagy „fluoreszceinezzük” a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára ismert módszerekkel. Az 1 pg/ml koncentrációjú antitestet ezután hozzáadjuk a peptidkönyvtárhoz, majd miután egy óra hosszat 22 °C-on óvatosan kevertettük, a szilárd fázisú hordozókat mossuk, és a fluoreszcens antitest szilárd fázisú hordozó/peptid kombinációkat azonosítjuk, majd egy fluoreszcenciára aktivált sejtosztályozóval kinyerjük. Egy másik módszer szerint a fluoreszcens antitest/szilárd fázisú hordozó/peptid kombinációkat azonosítjuk, és fizikailag kiválasztjuk egy boncolómikroszkóp alatt, amelyhez egy fluoreszcenciaberendezést és mikromanipulátort kötöttünk hozzá. A fluoreszcencia relatív intenzitása általában arányos a peptidligandumnak a kérdéses monoklonális antitesthez viszonyított affinitásával.
ii) A monoklonális antitestet először konjugáljuk ferromagnetikus gyöngyökre, a szakterületen rutinnak számító módszerekkel. A konjugált antitestet 1 pg/ml koncentrációban inkubáljuk a könyvtárral 1 óra hosszat, 22 °C-on. A mágneses gyöngyök a számunkra érdekes szilárd fázisú hordozó/peptid körül rozettát képeznek, amelyeket egy erős mágnessel fizikailag izolálhatunk.
iii) A monoklonális antitestet először konjugáljuk egy enzimmel, például alkalikus foszfatázzal, a szakterületen ismert módszerek alkalmazásával. Ezt az antitest-enzim konjugátumot ezután a random peptidkönyvtárral inkubáljuk 30 percig vagy egy óra hosszat 22 °Con. A mosás után a teljes könyvtárat egy Petri-csészébe öntjük, amely az alkalikus foszfatáz szubsztrátját tartalmazza, például 5-bróm-4-klór-3-indolil-foszfatázt (BCP) és nitro-blue-tetrazóliumot (NBT). Miután néhány percig inkubáltuk, az antitest/szilárd fázisú hordozó/peptid kombináció megváltoztatja a színét (kék lesz), mivel a konvertált szubsztrát kicsapódik a szilárd hordozóra, és könnyen azonosítható és fizikailag izolálható egy boncolómikroszkóp alatt egy mikromanipulátorral. A színreakció relatív intenzitása általában arányos azzal, hogy a pepiidnek mekkora az affinitása a kérdéses monoklonális antitesthez.
iv) A monoklonális antitestet először egy enzimmel konjugáljuk, például torma-peroxidázzal, a szakterületen ismert módszerek alkalmazásával. Ezt az antitestenzim konjugátumot azután a random peptidkönyvtárral inkubáljuk 30 percig vagy 1 óra hosszat 22 °C-on. Mosás után a teljes könyvtárat egy Petri-csészébe öntjük, amely a peroxidáz enzimszubsztrátját tartalmazza, például 3,3’,4,4’-diamino-benzidint (DAB); 3,3’,5,5’tetrametil-benzidint (TMB); vagy 4-klór-l-naftolt (4CN). Néhány perces inkubálás után az antitest/szilárd fázisú hordozó/peptid kombinációnak megváltozik a színe és könnyen azonosítható és fizikailag izolálható egy boncolómikroszkóp alatt egy mikromanipulátorral. A színreakció relatív intenzitása általában arányos azzal, hogy a peptidnek mekkora az affinitása a kérdéses monoklonális antitesthez.
v) A monoklonális antitestet először biotinnal jelezzük vagy „biotinilezzük” a szakterületen ismert módszerek alkalmazásával, majd a random peptidkönyvtárral inkubáljuk 30 perc-1 óra hosszat 22 °C-on. A mosás után egy sztreptavidin-alkalikus foszfatáz vagy sztreptavidin-torma-peroxidáz komplexet adunk hozzá, és 30 percig inkubáljuk. A hordozót ezután mossuk, és a színt az iii) pontban leírtak alapján hívjuk elő az enzimes módszerrel. A számunkra érdekes peptid/szilárd fázisú hordozót a fentiek szerint fizikailag izoláljuk.
Az oldott akceptormolekulák mellett, egy másik megvalósítási mód szerint, lehetséges olyan biooligomerek detektálása, amelyek a sejtfelszíni receptorokhoz kötődnek, intakt sejtek alkalmazásával. Az intakt sejtek alkalmazása az előnyös azokhoz a receptorokhoz, amelyek több alegységből állnak vagy labilisak, vagy olyan receptorokhoz, amelyek a sejtmembrán egy lipiddoménjének a jelenlétét igénylik. Az ebben a technikában használt sejtek lehetnek élő vagy rögzített sejtek. A sejteket a random peptidkönyvtárral inkubáljuk, és a könyvtárban levő egyes peptidekhez hozzákötődve „rozettát” képeznek a célsejtek és a releváns szilárd fázisú hordozópeptid között. A rozettát ezután differenciálcentrifugálással izoláljuk, vagy fizikailag eltávolítjuk egy boncolómikroszkóp alatt.
Egy másik módszer szerint a könyvtárat átvizsgálhatjuk egy kimosási módszerrel, egy olyan i) „szülői” sejtvonalat alkalmazva, amelyben a számunkra érdekes receptor nincs meg a sejt felszínén, és egy olyan ii) receptorpozitív sejtvonalat alkalmazva, amely úgy jött létre, hogy a szülői sejtvonalat a számunkra érdekes receptort kódoló génnel transzferáltuk. Ezután lehetséges a könyvtár átvizsgálása az alábbi stratégia alkalmazásával:
i) először eltávolítjuk a könyvtárból a nem specifikus gyöngyöket, amelyek a receptort nem tartalmazó sejtekhez kötődnek, a szülői sejtvonalból egy egysejtes réteget bevive a rendszerbe a standard „kimosási technika” alkalmazásával, így meghagyjuk a receptorspecifikus, nem kötődő gyöngyöket, vagy az irreleváns, nem kötődő gyöngyöket;
ii) a nem kötődő gyöngyöket eltávolítjuk, amelyek között mind receptorspecifikus, mind irreleváns gyöngyök lehetnek, majd receptorpozitív sejtek egysejt-rétegére szélesztjük őket, amelyen a receptorspecifikus gyöngyök a receptorpozitív sejtekhez kötődnek;
iii) a megmaradó irreleváns, nem kötődő gyöngyöket eltávolítjuk, enyhe mosást és dekantálást alkalmazva, végül iv) a receptorspecifikus gyöngyö(ke)t egy mikromanipulátorral eltávolítjuk.
A membránhoz kötött receptorok, vagy olyan receptorok, amelyeknek a működőképességéhez a sejtmembrán lipiddoménjére van szükség, teljessejt-vizsgálatának egy alternatívája szerint a receptormolekulák liposzómákban állíthatók helyre, amelyekhez riportercsoportok vagy -enzimek kapcsolhatók hozzá.
Jóllehet az előzőek peptidligandumokra vonatkoznak a korábbiakban leírt biooligomerek használhatók a jelen találmány megvalósítása során. Azaz az akceptormolekulák kötődhetnek nem klasszikus, cirkularizált, konformáció szempontjából befolyásolt vagy szerkezetileg torzított peptidekhez, oligonukleotidokhoz vagy peptid-oligonukleotid kimérákhoz.
HU 218 007 Β
Az egyik megvalósítási mód szerint az akceptormolekula lehet közvetlenül jelezve. Egy másik megvalósítási mód szerint egy jelzett szekunder reagens használható arra, hogy egy akceptormolekulának egy számunkra érdekes biooligomert tartalmazó szilárd fázisú hordozóhoz való kötődését kimutassuk. A kötődés kimutatható egy kromofómak az enzimjelzés hatására in situ való keletkezésével. Az alkalmas enzimek lehetnek, anélkül hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az alkalikus foszfatáz és a tormaperoxidáz. Egy további megvalósítási mód szerint egy, két színt alkalmazó vizsgálat két kromogén szubsztráttal, két enzimjelzéssel két különböző, számunkra érdekes akceptormolekulán, szintén használható. A keresztreakciót adó és az egyszeres reakciót adó ligandumok azonosítható, a kétszínű vizsgálattal.
Más, a találmány megvalósítása során használható jelölés lehet színes latexgyöngy, mágneses gyöngy, fluoreszcens jelölés [például fluoreszcein izotiocianát (FITC), fikoeritrin (PE), Texas Red (TR), rodamin, szabad vagy kelátban levő, lantanidasorozatba tartozó sók, különösen az Eu3+, csak hogy megnevezzünk néhány fluorofórt], kemilumineszcens molekulák, radioizotópok, vagy magmágnesesrezonancia-jelzések. A kétszínű vizsgálatokat két vagy több színezett latexgyöngygyel végezhetjük, vagy olyan fluorofórokkal, amelyek különböző hullámhosszakon sugároznak. A jelzett gyöngyöket manuálisan vagy mechanikai eszközökkel izolálhatjuk. A mechanikai eszközök közé tartozik a fluoreszcenciával aktivált osztályozás, azaz a FACS analógja, valamint a mikromanipulátoros eltávolítóeszközök.
Az említendő specifikus példákban az enzimkromogén-jelzéseket és a fluoreszcens (FITC) jelzéseket használjuk.
A reaktív gyöngyöket a jelzés intenzitása alapján izoláljuk, azaz például a színintenzitás, fluoreszcenciaintenzitás, mágneses erősség vagy radioaktivitás alapján, csak hogy néhány kritériumot megemlítsünk. A legintenzívebben jelzett gyöngyöket kiválaszthatjuk, megszekvenálhatjuk, vagy másképpen jellemezhetjük a szerkezetüket, például tömegspektrum-elemzéssel. Egy másik megvalósítási mód szerint a gyöngyök random szelekciója, amely azokat a gyöngyöket tartalmazza, amelyeknél a jelzés intenzitása egy önkényesen megválasztott érték fölé emelkedett, szekvenálható. Használhatunk modem képelemző mikroszkópiát a színintenzitás mennyiségi meghatározására, és ezzel precízen meghatározhatjuk a ligandumnak az akceptormolekulához való relatív affinitását, mielőtt a gyöngyöt szekvenciaelemzésnek vetnénk alá. Hasonlóképpen, kvantitatív immunfluoreszcencia-mikroszkópiát is használhatunk, ha az akceptort egy fluoreszcenciajelzéssel láttuk el. Egy újabb megvalósítási mód szerint az összetétel elemzéshez, azaz az aminosav-összetétel meghatározásához azokat a gyöngyöket választjuk ki, amelyek egy bizonyos szintű jelölésintenzitást mutatnak. Előállíthatunk és átvizsgálhatunk egy olyan finomított könyvtárat, amely az összetétel-elemzés alapján egy korlátozott számú, fontosnak minősített monomeralegységeket tartalmaz.
Egy másik megvalósítási mód szerint a legnagyobb kötési kapacitással, azaz kötési állandóval rendelkező biooligomereket oly módon azonosíthatjuk, hogy a számunkra érdekes akceptormolekulát addig hígítjuk, ameddig a könyvtárnak csak néhány szilárd fázisú hordozójához való kötődés mutatható ki. Egy másik módszer szerint megnövelhetjük a kötőoldat szigorúságát, illetve nukleinsavak esetében megnövelhetjük egy célnukleinsavval, azaz akceptormolekulával való hibridizáció szigorúságát. A szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára nyilvánvaló, hogy a kötődés vagy a hibridizáció erőssége megnövelhető, ha i) megnöveljük az oldat ionerősségét; ii) megnöveljük a denaturálóvegyületek, például a karbamid koncentrációjái; iii) a semlegeshez (pH 7) viszonyítva megnöveljük vagy csökkentjük a pH-t; iv) nukleinsavak esetében megközelítjük az olvadáspontot (Tm). Más módszerek az oldat körülményeinek változtatására azzal a céllal, hogy a kötődést csak a nagy affinitású kölcsönhatásokra korlátozzuk, szintén jól ismertek. Egy akceptormolekulának egy szilárd fázisú hordozó/biooligomer komplexhez való kötődését nagy hígításban vagy nagyon szigorú körülmények között arra használhatjuk, hogy egy random könyvtárban, amely az összes, vagy majdnem az összes lehetséges monomeralegységet tartalmazza, vagy egy korlátozottan finomított könyvtárban kimutassunk egy számunkra érdekes ligandumot.
Egy másik megvalósítási mód szerint azok a biooligomerek lehetnek számunkra érdekesek, amelyek kismértékű kötődést mutatnak csak. Ezeket úgy szelektálhatjuk, hogy először eltávolítjuk az összes, nagy affinitással, kötődéssel rendelkező biooligomert, majd ezután kimutatjuk a kötődést alacsonyabb szigorúsági fok vagy kevésbé hígított körülmények között.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint egy kettős jelölési módszer használható. Az első jelzést használhatjuk arra, hogy egy számunkra érdekes akceptormolekulának az aspecifikus kötődését mutassuk ki a gyöngyökhöz, az oldható ligandumok jelenlétében. A jelzett gyöngyöket ezután eltávolítjuk a könyvtárból, majd az oldható ligandumot is eltávolítjuk. Ezután kimutatjuk az akceptormolekulának a megmaradt gyöngyökhöz való specifikus kötődését. Az ilyen gyöngyökön található biooligomerektől az várható, hogy az akceptormolekulát ugyanazon a kötőhelyen kötik meg, mint a számunkra érdekes ligandum, és így utánozzák a számunkra érdekes ligandumot. A kettős jelzési vizsgálat azzal az előnnyel jár, hogy a számunkra fontos akceptormolekulát nem kell tisztítani, mivel a vizsgálat első lépése lehetővé teszi, hogy az aspecifikus, pozitívan reagáló gyöngyöket eltávolítsuk.
Bioaktivitási vizsgálatok
A találmány tárgyát képezik továbbá egy könyvtárból származó biooligomer biológiai aktivitásának vizsgálati módszerei, amely biooligomert oly módon kezeltünk, hogy bármely, a szintézisből visszamaradt toxikus molekulát eltávolítsunk, tehát például semlegesítjük, és alaposan mossuk oldószerrel, steril vízzel és tenyésztő táptalajjal. A vizsgálható biológiai aktivitások közé tartozik a toxicitás és ölőképesség, a serkentés és
HU 218 007 Β a növekedés elősegítése, valamint a fiziológiai változás.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a könyvtár biooligomerjeit szelektíven lehasítjuk a szilárd fázisú hordozóról, amelyet a továbbiakban is „gyöngy” néven említünk. Az egyik megvalósítási mód szerint a gyöngyöket úgy állítjuk elő, hogy a biooligomereknek csak egy frakciója hasítható szelektíven. A szelektíven hasítható biooligomereket, linkereket és gyöngyöket a korábbiakban tárgyaltuk. Egy könyvtárat kezelünk egy hasítóanyaggal, oly módon, hogy a biooligomerek egy frakciójának a hasadása történik meg. A hasítóanyagok közé tartozik például, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az UV-fény, sav, bázis, enzim, vagy katalizátor. Az egyik megvalósítási mód szerint a könyvtárat úgy kezeljük, hogy a biooligomerek 10-90 százaléka felszabaduljon. Egy előnyösebb megvalósítási mód szerint a biooligomerek 25-50 százaléka szabadul fel. Ahol az összes biooligomer lehasítható, ott a nem teljes hasítást úgy érjük el, hogy a hasítóanyag mennyiségét korlátozzuk. Az egyik lehetőség, hogy az expozíciós időt és az UV-fény intenzitását korlátozzuk. Egy másik lehetőség, hogy a reagens koncentrációját korlátozzuk. A hasítás kivitelezésére végzett kezelés után a könyvtárat tovább kezelhetjük, például semlegesítéssel, hogy a kiválasztott vizsgálattal biológiailag kompetenssé tegyük. A gyakorlatban a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember meg tudja határozni a részleges hasításhoz megfelelő hasítási körülményeket, ha a könyvtárban szereplő összes biooligomer hasítható linkerekkel vagy kötésekkel van a szilárd fázishoz kapcsolva. A szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára az is nyilvánvaló lesz, hogy a felszabaduló biooligomerek koncentrációját a hasítási körülmények variálásával befolyásolhatjuk.
Mivel a könyvtár gyöngyei immobilizálva vannak, ezért egy adott biooligomemek egy koncentrációgradiense alakul ki. A biooligomer legnagyobb koncentrációja annak a gyöngynek a közelében alakul ki, amelyről felszabadítottuk. Tehát a gyöngy közelében tapasztalt, számunkra érdekes biológiai aktivitás lehetővé teszi a gyöngy azonosítását és izolálását, valamint a biooligomer szekvenálását vagy más típusú jellemzését. A biooligomer azonosítása lehetséges, mivel elegendő marad belőle a gyöngyön azután, hogy a szekvenáláshoz vagy az egyéb jellemzés végrehajtásához részleges hasítást végeztünk. Egy másik megvalósítási mód szerint a gyöngyöket mikrotiterlemez lyukaiba osztjuk szét (például 10 gyöngyöt teszünk egy lyukba), majd a felszabadult biooligomerek adott százalékának megvizsgáljuk a biológiai aktivitását, ezzel megszüntetve a diffúzió által okozott problémákat. Amint az alábbiakban ismertettük, a biooligomerek különböző frakcióit a szilárd fázisú hordozóhoz vagy gyöngyhöz köthetjük, különböző hasítható linkereken keresztül, a szekvenciaelemzés céljából. Ezekben a példákban a „gyöngy” kifejezés a szilárd fázisú hordozókra vonatkozik.
Az alábbi példákat azért adjuk meg, hogy illusztráljuk azt, hogy a biológiai vizsgálatok miként hajthatók végre, és nincs korlátozó jellegük.
i) Egy sejtpopulációt egysejt-réteges szuszpenzióban rétegezőnk folyékony táptalajra vagy félig folyékony hordozóra, amely egy random biooligomer-könyvtárat tartalmaz. Az egyik megvalósítási mód szerint ezt az eljárást 96 lyukas szövettenyésztő mikrotiterlemezen végezzük, lyukanként egy vagy több gyönggyel, plusz a sejtszuszpenzióval. Egy másik megvalósítási mód szerint egy barriermátrixot vagy „sütemény vágót” használunk a sejtszuszpenzióra és a könyvtár gyöngyeire, hogy különálló kamrákat hozzunk létre. Az egyes gyöngyökön levő peptid egy bizonyos részét egy vízzel hasítható (például diketopíperazin) vagy fénnyel hasítható linkerrel kötjük meg. Elegendő mennyiségű peptidet szabadíthatunk fel ahhoz, hogy biológiai hatással rendelkezzenek, miközben elegendő mennyiségű peptid marad a gyöngyhöz kötődve, a szekvenáláshoz. A sejtszuszpenzió lehet oldatban, illetve önmagában lehet egy félig szilárd hordozó. A megfelelő hosszúságú inkubálási periódus után a sejtpopulációnak vizsgáljuk a növekedését és szaporodását, például a telepek azonosításán keresztül. Egy másik megvalósítási mód szerint az MTT tetrazóliumsót [3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5difenil-tetrazólium-bromid] adhatunk a sejtekhez [Mossman, J. Immunoi. Methods, 130., 140-151. (1990); Niks and Ottó, J. Immunoi. Methods, 130., 140-151. (1990)]. A szukcinát-dehidrogenáz, amely az élő sejtek mitokondriumaiban található, az MTT-t formazánkékké alakítja. Tehát a koncentrált kék szín jelzi a metabolikusan aktív sejteket. Egy még további megvalósítási mód szerint egy radioaktív jelzés, például triciált timidin beépítése, vizsgálható, hogy a sejtek szaporodnak-e. Hasonlóképpen, a fehéijeszintézis a 35S-metionin beépülésével mutatható ki. Azokat a gyöngyöket, amelyek a sejtek növekedését vagy serkentették, vagy gátolták, ezután kinyerhetjük és megszekvenálhatjuk, majd az azonosított peptidszekvenciákat újra megvizsgálhatjuk oldatban, az indikátorsejt-típussal szembeni megerősítő tenyészetekben.
ii) Az i) pont további megvalósítási módja szerint a könyvtár gyöngyeit mikrotiterlemezeken osztjuk szét, oly módon, hogy minden egyes lyuk körülbelül tíz gyöngyöt tartalmaz. A gyöngyöket azután oldatfázisban szuszpendáljuk. Az egyes gyöngyökről elegendő menynyiségű peptidet szabadítunk fel ahhoz, hogy biológiai aktivitást kapjunk, miközben elegendő peptid marad a gyöngyökön szekvenálás céljából. A felszabadított peptidet tartalmazó felülúszót egy replikalemezre vihetjük át, vagy a lyukakban hagyhatjuk a gyöngyökkel együtt. A biológiai aktivitást, azaz a sejtvonal növekedését vagy szaporodását meghatározzuk. A biológiai aktivitással rendelkező lyukakból származó gyöngyöket megszekvenáljuk, és minden egyes szekvenciát előállítjuk majd levizsgáljuk, hogy meghatározzuk, melyik szekvencia rendelkezik biológiai aktivitással.
iii) Az ii) pont további megvalósítási módja szerint a biooligomereket oly módon kapcsoljuk a gyöngyökhöz, hogy az első lépésben a biooligomer /-a szabaduljon fel az 1. lépésben, /}-a a második lépésben, és a megmaradó / maradjon a gyöngyön. A szekvenciális felszabadítás származhat két különböző hasítható lin14
HU 218 007 Β kér használatából, illetve a hasítóanyag korlátozásából, oly módon, hogy az egyes lépésekben a biooligomemek csak egy-egy része szabaduljon fel. Az utóbbi esetben a fénnyel hasítható linker szabályozott besugárzása lehet előnyös, jóllehet az óvatosan időzített expozíció egy kémiai vagy enzimatikus hasítást okozó ágenssel szemben okozhat részleges hasítást. A szekvenciálisán hasítható biooligomerekből egy könyvtárat készítünk, majd mikrotiterlemezek lyukaiban osztjuk szét, oly módon, hogy minden egyes lyuk ötvennél több, előnyösebben 50-250 gyöngyöt tartalmaz. A gyöngyöket úgy kezeljük, hogy a biooligomereknek körülbelül J/-át lehasítsuk. A felülúszónak vizsgáljuk a biológiai aktivitását, egy ismételt vizsgálatban. A biológiai aktivitást mutató gyöngyöket azután szuszpendáljuk és egy mikrotiterlemez lyukaiban osztjuk szét, hogy az egyes lukak 1-10 gyöngyöt tartalmazzanak. A gyöngyöket úgy kezeljük, hogy a biooligomerek újabb egyharmadát lehasítsuk, és a felülúszónak vizsgáljuk a biológiai aktivitását. A biológiai aktivitást mutató lyukakból származó gyöngyöket izoláljuk, majd a hozzájuk kötött biooligomert megszekvenáljuk. Ha egynél több gyöngyöt találunk, akkor az összes azonosított szekvenciát izoláljuk, és egyenként vizsgáljuk a biológiai aktivitásukat. Ez a kétlépéses szekvenciális biológiai vizsgálat hatékony módszer nagyon nagy, specifikus biológiai aktivitással rendelkező biooligomer-könyvtárak átvizsgálására.
iv) A citokinfelszabadulás serkentését úgy vizsgálhatjuk, hogy egy félig szilárd hordozóban, például agarózgélben immobilizált egysejt-szuszpenziót adunk a rendszerhez. Ahol a találmány szerinti biooligomer a citokin, például limfokin, növekedési faktor, hormon stb. felszabadulását indukálja, ott a citokin jelenlétét egy indikátor-sejtvonallal lehet kimutatni. Egy indikátor-sejtvonallal specifikus vizsgálatok végezhetők, az i) pont szerint. Egy másik megvalósítási mód szerint a serkentett sejtek által felszabadított citokint egy membránra blottolhatjuk, például nitro-cellulózra, és a citokint immunesszével vagy receptorkötési vizsgálattal mutathatjuk ki.
v) Egy másik megvalósítási mód szerint egy biooligomer toxicitását figyelhetjük meg. A növekedés nélküli zónákat vagy tarfoltokat például a biooligomerkönyvtár fölé rétegzett transzformált vagy rákos sejtvonalakban a citotoxikus aktivitás jeleként értékeljük. Egy módszer az, hogy egy félig szilárdult mátrixban levő két sejtpopulációt rétegezhetünk, egyiket a másik fölé. Ily módon egy olyan, egy célsejtre specifikus citotoxikus biooligomer azonosítható, amelyik nem citotoxikus egy másik sejtre. Egy ilyen vizsgálattal gyorsan azonosítani lehet olyan biooligomereket, amelyek kemoterápiás szerekként használhatók.
vi) A fiziológiás változások is vizsgálhatók. Az egyik megvalósítási mód szerint egy szívizomsejt-szuszpenziót rétegezünk a könyvtár fölé. Az egy biooligomer által serkentett sejtek „dobogása” figyelhető meg. Egy másik megvalósítási mód szerint egy enzim működésének up-regulációja vizsgálható, oly módon, hogy egy specifikus enzim aktivitásának növekedését vizsgálhatjuk, ha megfelelő szubsztrát van jelen, például egy kromogén [MT, i) pont], fluorofór vagy kemilumineszcens anyag. Egy másik módszer szerint egy enzim működésének up-regulációját immunológiai módszerrel vizsgálhatjuk. Egy még további megvalósítási mód szerint hisztológiai technikák jelezhetik a könyvtárban levő biooligomer által okozott fiziológiai vagy morfológiai változásokat.
vii) A jelen találmány tárgya eljárás egy könyvtárban levő biooligomer aktivitásának vizsgálatára polarizált sejteken, például bazolaterális és luminális oldalakkal rendelkező sejteken. Poláris sejttenyészeteket féligáteresztő membránokon készíthetünk, amely megfelel a lumennek. A luminális oldalhoz vagy a bazolaterális oldalhoz egy könyvtárat adhatunk hozzá egy félig megszilárdult hordozóban. Egy, a találmány szerint biooligomer különböző hatásait vizsgálhatjuk, például a poláris transzportra, szaporodásra, intercelluláris kommunikációra stb. gyakorolt hatásait. Pontosabban a biooligomer jelölésével (például egy radioaktív jelöléssel vagy egy fluorofórral való jelölésével) a transzportálható biooligomerek azonosíthatók. A szakterületen régóta szükség van specifikusan abszorbeálódó molekulákra. Pontosabban az ilyen molekulák hasznosak lennének gyógyszerek orális vagy nazális úton való beadására, ahol az epitélium luminális oldaláról a bazolaterális oldalra való transzport szükséges.
A hasitatlan biooligomerekkel végzett biológiai vizsgálatok szintén elképzelhetők. Az összes biooligomerrel borított gyöngy biológiai aktivitása elvégezhető ily módon. Az egyik megoldási mód szerint egy könyvtárat juttathatunk be egy állatba. A számunkra érdekes gyöngyöket egy specifikus szövetből izolálhatjuk. Azok a gyöngyök izolálhatok, amelyek az orális, nazális vagy bőrön át való beadás után specifikusan felszívódtak. Egy előnyös megvalósítási mód szerint ezek a gyöngyök mágnesesek, vagy egyéb, azonosításra alkalmas tulajdonsággal rendelkeznek, ezért könnyen izolálhatok a szövetből.
A szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára nyilvánvaló, hogy az összes említendő biológiai vizsgálat mindazon biooligomerekre vonatkoznak, amelyek peptideket, oligonukleotidokat vagy peptid-oligonukleotid kimérákat tartalmaznak. A peptidekről és peptidanalógokról jól ismert, hogy serkentik a növekedést, gátolják a növekedést, illetve szabályozómolekula módjára viselkednek. A peptidek működhetnek génszabályozóként is oly módon, hogy egy génen található szabályozószekvenciákhoz kötődnek, azaz agonizálják vagy antagonizálják egy promoter-, enhanszervagy szabályozófehérje hatásait. Hasonlóképpen a nukleinsavak működhetnek inhibitorokként a génexpreszszió inducereire hatva a transzkripció szintjén (például a promoterekhez, enhanszerekhez, transzkripciós stopjelekhez stb. kötődve, azokat blokkolva), a proceszszálás szintjén (például zavarva vagy elősegítve az mRNS-processzálást) és a transzláció szintjén. A szakterületen jól ismert, hogy egy oligonukleotid vagy egy oligonukleotid-analóg használható egy specifikus mRNS transzlációjának blokkolására. A korábbiakban
HU 218 007 Β leírt bármelyik könyvtárnak vizsgálható a biológiai aktivitása.
A szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára nyilvánvaló lesz továbbá, hogy bármely sejt, amely szövettenyészetben fenntartható, használható a biológiai vizsgálatban. A „sejt” szakkifejezés alatt a továbbiakban prokarióta- (például baktérium-) és eukariótasejtek értendők, élesztők, penészek, gombák. Tenyészetben fenntartott promotersejtek vagy -sejtvonalak alkalmazhatók. Továbbá a bejelentők el tudják képzelni, hogy vírusokon is végezhető biológiai vizsgálat, oly módon, hogy a sejteket a vírussal fertőzzük vagy transzformáljuk. Például, anélkül, hogy erre az esetre korlátoznánk magunkat, egy biooligomemek az a tulajdonsága, hogy a lambda-bakteriofág lizogénaktivitását képes gátolni, oly módon vizsgálható, hogy azonosítjuk azokat a transzfektált Escherichia coli telepeket, amelyek a fertőzés hatására nem adnak tiszta tarfoltokat.
A jelen találmány szerint egy biooligomer-könyvtár egyik biooligomerje aktivitásának vizsgálatára szolgáló módszerek nem korlátozódnak az említett példákra; a bejelentőknek az a véleményük, hogy ezek mind a találmányuk oltalmi körébe tartoznak.
Egy eritropoietinagonista biológiai vizsgálata
A jelen találmány egy megvalósítási módja szerint egy eritropoietinbiooligomer-agonista vizsgálható. Az nyilvánvaló, hogy az itt ismertetett módszer hasznos stratégiát ad más agonisták azonosítására, például növekedési faktorok, hormonok, citokinek, limfokinek és más intercelluláris hírvivők agonistáinak az azonosítására, amint azt az előző pontban leírtuk.
Ebben a példában a biooligomer-könyvtár a 19 általános aminosavból (cisztein kivételével) készített pentapeptidekből áll. A különböző peptidek száma elméletileg 2 476 099. A könyvtár 19 lépésben állítható elő, hogy megkönnyítsük a vizsgálatra tett erőfeszítéseket. Ezt úgy hajthatjuk végre, hogy minden lépésnél kiválasztunk egyetlen aminosavat a C-terminálisra úgy, hogy csak a többi négy aminosav pozícióját kell randomizálni. Ezáltal az egyes lépésekben a szekvencia XXXXYlinkergyanta lesz, ahol Y-t választjuk meg az adott lépéshez, és X jelenti a random aminosavbeépülést. Ezzel a megközelítéssel a potenciális peptidek száma az egyes lépésekben 130 321-re csökkenthető. 10 gyöngyökként szétosztva egy 96 lyukas mikrotiterlemez 96 lyukában, a szükséges lemezek száma 136 (egy további lemezre a bioassay-standardok, valamint a kontrollok miatt van szükség, így kapunk összesen 137 lemezt). A módszer lehetővé teszi, hogy ilyen számú lemezen egy nap alatt szétosszuk a könyvtárat.
A gyöngyökön szintetizált peptidek nagyobb része (50-80%) lehasítható a biológiai vizsgálatban való felhasználás céljából oly módon, hogy az egyes gyöngyökről következetesen legalább 50 pmol/1 peptidet szabadítunk fel. Hasítható linkerként egy diketopiperazinkötés az előnyös, jóllehet egy fénnyel hasítható linker is szóba jöhet. A kötés elegendően stabil gyengén savas körülmények között (azaz 0,1-1,0 mmol/1 HC1), ami lehetővé teszi, hogy a gyöngyöket 6-8 óra alatt szétosszuk. A hasítást elősegíthetjük 20 μΐ 1,0-10 mmol/1 HEPES puffemek (pH=8,5) az egyes lyukakhoz való hozzáadásával. A hasítás egy éjszaka alatt lejátszódik (12-18 óra), a végső lyuktérfogat megtartása mellett. A bepárlódást azzal szabályozhatjuk, hogy a lemezeket nedvesített atmoszférájú kamrában tartjuk.
A könyvtár gyöngyeiről lehasadt peptidoldatnak aszeptikusnak, illetve aktuálisan sterilnek kell lennie. Az aszeptikus körülmények szükségesek, mivel az oldat a végső tenyészettérfogat 25%-át tartalmazza, és mivel a tenyésztés ideje legalább 24 óra. Az aszeptikus körülmények elérhetők, ha
1. a gyöngyöket szintézis után steril vízben hidratáljuk;
2. az induló gyöngy szuszpenziót savanyított steril vízzel hígítjuk, és
3. steril technikát használunk arra, hogy a gyöngyöket szétosszuk a steril tenyésztőlemezekre.
A végső gyöngyszuszpenzió 20%-nál kevesebb DMSO-t tartalmazhat a hidrofób peptidek oldatba vitele céljából. A DMSO-t, ha egyáltalán szükség van rá, akkor a hidratálási folyamat korai fázisában kell hozzáadni, hogy megkönnyítsük az oldatba vitelt. A végső gyöngyszuszpenzió 10 gyöngy/50 μΐ kell hogy legyen. Ahhoz, hogy a gyöngyöket a pipettázási fázisban szuszpenzióban tartsuk, ahhoz körülbelül 0,8-3,2% metilcellulózt kell hozzáadni. A metil-cellulóz használata esetén csökkenthetjük az oldhatóság növelése céljából az oldathoz adott DMSO mennyiségét. A metil-cellulóz végkoncentrációját 0,8% alatt tartjuk, hogy ne zavarja a biológiai vizsgálatot.
A felszabadult peptideket 50 μΐ-es minták formájában biológiai vizsgáló tenyészlemezekre visszük, fenntartva a pontos megfelelést a mintalemez és a tenyészetlemez között. Fontos, hogy a transzfer során steril körülményeket tartsunk fent. Humán rekombináns EPO-t adunk adhatunk a lemezeken a kiválasztott lyukakhoz, hogy pozitív kontrollként szolgáljanak (minden egyes lemezen), valamint standard görbék előállításához (első és utolsó lemez). A kontroli-lyukak 0,1 NE EPO-t kaphatnak, és a standard görbéket hat, két párhuzamosban elkészített, 1,0-100 milliegység EPO-t kapott lyukakból határozzuk meg [D’Andrea et al., Mól. Cell. Bioi., 11. 1980-1987.(1991)].
A biológiai vizsgálatot az eritropoietinreceptort expresszáló Ba/F3-T rekombináns sejtvonallal (EPO-R) végezhetjük. Ezek a sejtek vagy az interleukin-3 (IL-3), vagy az EPO jelenlététől függenek. Ezeknek a sejteknek a tenyészetei IL-3 jelenlétében (amelyet 10 térfogat/térfogat%-os WHEI-kondicionált tenyészfolvadékban szállítanak) meggátolják, hogy az EPO a táptalajban esetleg zavarja a biológiai vizsgálatot. A Ba/F3-T sejtek alap-növesztőtáptalaja az RPMI 1640 táptalaj, amely 2,0 g/1 NaHCO3-ot, 10 térfogat/térfogat% borjúmagzatszérumot, 1 χ penicillin-sztreptomicin oldatot, 5 μΐ β-merkapto-etanol/liter és 10 mmol/1 végkoncentrációjú HEPEST tartalmaz, pH =7,40. Ezt a táptalajt kell kiegészíteni 10 térfogat/térfogat% WHEI-vel kondicionált táptalajjal, amely az IL- 3-at szolgáltatja. A WHEI-vel kondicionált táptalajt úgy állítjuk elő, hogy a sejtek összeérjenek ugyanabban
HU 218 007 Β az alaptáptalajban. A kondicionált táptalajt a sejtek eltávolítására centrifugáljuk, egy 0,22 μπι-es szűrőn bocsátjuk át, majd fagyasztva tároljuk. A Ba/F3-T sejteket tenyésztjük, így kapunk 1,31 χ 107 sejtet, amelyet 1 χ 103 sejt/lyuk mennyiségben osztunk szét 150 pl térfogatban [Yoshimura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87., 4139-4143.(1990)].
A Ba/F3-T sejteket ezután forgó palackokból nagy (250 ml-es) steril centrifugapalackokba visszük át. A sejteket centrifugálással nyerjük ki (500 xg, 5 perc). A sejteket ezután 200 ml friss alaptáptalajban szuszpendáljuk sejtszámlálás céljából. A táptalaj nem tartalmaz IL-3-at. A végtérfogatot további táptalaj hozzáadásával úgy állítjuk be, hogy 6,67 χ 103 sejt /ml legyen a sejtkoncentráció (lxlO3 sejt/150 ml). Szükséges lesz, hogy a végső sejtszuszpenziót 4-8 alikvot részre osszuk szét az inkubátorban való tárolás céljából, a hosszú szétosztási folyamat során. A sejtek számát és életképességét a szétosztási folyamat elején és végén vett mintákból kell meghatározni, hogy biztosítsuk azt, hogy mind az első, mind az utolsó tenyésztőlemezen hasonló számban találhatók életképes sejtek. A sejteket a felszabadított peptidfelülúszókat tartalmazó tenyésztőlemezekre osztjuk szét. A lemezeket három napig inkubáljuk (Yoshimura et al., supra).
A biológiai vizsgálat végpontja az egyes tenyészlyukakban jelen levő élő sejtek száma. Ezt az MTT assay-vel határozhatjuk meg [Mosmann, J. Immunoi. Methods, 130., 140-151. (1983); módosítva Niks and Ottó által, J. Immunoi. Methods, 130., 140-151. (1990)]. A módosított vizsgálat lehetővé teszi hogy az eleven sejtek számát megmérjük, anélkül, hogy eltávolítanánk a tenyészfolyadékból őket.
Az MTT-t [3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólium-bromid]-ot 5 mg/ml-es oldat formájában állítjuk elő PBS-ben (körülbelül 270 ml-re van szükség). A biológiai vizsgálat minden egyes lyukába 20 μΐ-t teszünk ebből az oldatból, majd a lemezt 4 óra hosszat inkubáljuk 37 °C-on. Ennek a periódusnak a végén 100 μΐ extrahálóoldatot adunk minden egyes lyukhoz, majd a lemezt egy fürdős szonikátorba helyezzük 120 másodpercre. Az extrahálóoldat 50 térfogat/térfogat% Ν,Ν-dimetil-formamidot tartalmaz 20 tömeg/térfogat% nátrium-dodecilszulfát-oldatban (SDS), amelynek a pH-ját 4,7-re állítottuk be ecetsavas sósavval Hansen és munkatársai leírása szerint [J. Immunoi. Methods, 119., 203. (1989)]. Ez a kezelés oldatba viszi az MTTmetabolizmus formazántermékét, és így 570 nm-en megmérhetjük az optikai sűrűséget, egy mikrotiterleolvasóval.
A biológiai vizsgálatból kapott adatokat átlagoljuk az összes mintalyukra, hogy meghatározzuk a 95%-os konfidenciaintervallumot az átlagértékre. Az ezen az intervallumon kívül eső OD-értékkel rendelkező lyukak OD-értékeit használjuk a Student-féle t-tesztben a szignifikancia meghatározására. A szignifikáns értékeket az EPO standard görbéhez hasonlítjuk, így kapunk egy becslést az aktivitásra NE-ben, az EPO-hoz viszonyítva. A standard görbét nem lineáris regressziós elemzéssel határozzuk meg, a logisztikus egyenlet felhasználásával. A két standard görbéből kapott adatokat együtt és külön is elemezzük, hogy meghatározzuk, van-e szignifikáns különbség a biológiai vizsgálat két végén mért válaszban (F teszt). Az egyes lemezekre mért kontroliértékek összehasonlítása a teljes vizsgálat során használható arra, hogy meghatározzuk, van-e konzisztens változás a biológiai vizsgálatban adott válaszban.
Fontos hogy lássuk, hogy két növekedési faktor receptor van (IL-3R és EPO-R) jelen a Ba/F3-T sejteken, és akármelyiknek az aktiválása pozitív választ eredményez a biológiai vizsgálatban. Tehát az előzőkben ismertetett biológiai válasz mind az IL-3-, mind az EPO-agonistákat kiválasztja. Egy másik sejtvonalat, esetleg fenil-hidrazinnal kezelt egerekből származó lépsejteket kell használni [Krystal, Exp. Hematol., 11., 649-660. (1983)]. Emellett a szintetikus peptideknek mind az EPO-, mind az IL-3-aktivitását vizsgálni kell egy második biológiai vizsgálatban, vagy radioligand kötődési módszerekkel.
Enzimutánzók/enziminhibitorok
A jelen találmány tárgyát képezik továbbá olyan biooligomerek, amelyek reakciókat katalizálnak, azaz olyan enzimkönyvtárak, amelyek koenzimként szolgálnak vagy enzimreakciókat gátolnak. A találmány tárgyát képezik tehát eljárások enzim- és koenzimaktivitás mérésére, illetve enzimaktivitás gátlásának mérésére.
Az enzimaktivitást egy kimutatható reakciótermék képződésével mutathatjuk ki. Egy előnyös megvalósítási mód szerint egy könyvtárnak egyik biooligometje katalizálja az alkalikusfoszfatáz-szubsztrát, azaz az 5bróm-4-klór-3-indolil-foszfát (BCIP) enzimes reakcióját. azaz egy kék, oldhatatlan reakciótermék keletkezik egy szilárd fázisú hordozón (lásd a 8. példát).
Egy másik megvalósítási mód szerint a megfigyelhető terméknek, azaz színnek vagy fluoreszcenciának egy zónája jön létre egy félszilárd hordozóban. Egy könyvtárat rétegezünk egy félig szilárd hordozóban, például agarózgélben, majd egy kromogén vagy más indikátorszubsztrátot adunk hozzá. Ahol a biooligomer/szilárd fázisú hordozó a kívánt enzimaktivitást mutatja, ott jön létre a termék zónája. Például anélkül, hogy erre korlátoznánk magunkat, a torma-peroxidáznak egy biooligoineranalógját úgy azonosíthatjuk, hogy amino-antipirén-oldatot (0,25 mg/ml; Kodak), fenolt (8 mg/ml) és hidrogén-peroxidot (0,005%) adunk a rendszerhez 0,1 mol/1 foszfátpufferben, pH = 7,0. Az enzimaktivitással rendelkező gyöngyök egy lila színű zónát hoznak létre. Egy másik megvalósítási mód szerint a proteázaktivitással rendelkező biooligomer/gyöngy komplexeket oly módon azonosítjuk, hogy a jól ismert kolorimetriás proteázszubsztrátokat adjuk hozzá.
A koenzimakti vitást úgy figyelhetjük meg, hogy a koenzim által befolyásolt enzimaktivitást vizsgáljuk, mikor is a természetes vagy általános koenzim nincs jelen.
Az enziminhibitor-aktivitást egy részlegesen felszabadított biooligomerrel mutathatjuk ki. A biooligomerek felszabadulását a korábbiakban tárgyaltuk. Csak egy példa, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat. szerint egy biooligomer könyvtárat egy enzimet tartalmazó félszilárd mátrixra rétegezünk. A könyvtárat
HU 218 007 Β úgy kezeljük, hogy részlegesen szabaduljanak fel az oligomerek. Ahol a biooligomer gátolja az enzimaktivitást, ott egy termékmentes zóna figyelhető meg. Az egyik megvalósítási mód szerint az enzimszubsztrát kromogén és színes termék keletkezik. Tehát egy enziminhibitor egy színtelen zónát eredményez. Egy másik megközelítési mód szerint a hemoglobin vagy más indikátorenzim, például alkalikus foszfatáz proteolízisének gátlása a félig szilárd zónában egy zavaros zóna jelenlétével mutatható ki. Ez azért fordul elő, mert a proteolízisindikátor megelőzi a hemoglobin vagy az indikátorenzim lebomlását.
A szakterületen jártas szakember számára az jól ismert, hogy egy enzimaktivitással, koenzimaktivitással vagy enziminhibitor-aktivitással rendelkező biooligomer lehet egy peptid, egy oligonukleotid, vagy egy peptid-oligonukleotid kiméra. Különösen érdekesek a torzított vagy cirkularizált peptidek, amelyek egyedülálló katalitikus kötőzsebet vagy felületet hozhatnak létre. Emellett egy peptid-oligonukleotid kimérától várható, hogy egyedülálló kémiai tulajdonságokkal rendelkezik, azaz enzim- vagy koenzimaktivitást mutat, a megfelelő funkciós csoportok egyedülálló elhelyezkedése következtében. Emellett az is elképzelhető, hogy a biooligomer/szilárd fázisú hordozó enzim- vagy koenzimaktivitást mutat, míg a szabad oligomemek nincs meg ez az aktivitása. Ez azért van, mivel a nagy sűrűségű biooligomer közelsége egyedülálló kémiai tulajdonságokat biztosít a biooligomer/szilárd fázisú hordozónak. Az is várható, hogy egy biooligomer enzim- vagy koenzimaktivitást mutat, ha felszabadul a gyöngyökről. Az is várható, hogy ismert koenzimek (kofaktorok) kémiailag beépülhetnek a torzított biooligomerbe, hogy serkentsenek egy egyszerű vagy komplex enzimet, beleértve például egy elektrontranszportláncot.
Egy biooligomer jellemzésének módszerei
Ha egy számunkra érdekes biooligomert tartalmazó gyöngyöt kiválasztottunk az előző szekcióban ismertetett módszerek bármelyikével, akkor a jelen találmány módszert ad arra, hogy meghatározzuk a biooligomer szerkezetét és szekvenciáját.
Ha a biooligomer egy peptid, akkor az előnyös szekvenálási eljárás az Edman-lebontás. Egy különösen előnyös módszer szerint az Applied Biosystems 477A Protein Sequencer berendezést használjuk. A peptidek aminosavszekvenciája gyorsatom-bombázásos tömegspektrometriával is meghatározható (FAB-MS), vagy egyéb analitikai módszerekkel.
A peptidek szekvenciája meghatározható mind úgy, hogy a szilárd hordozóhoz vannak kapcsolva, mind úgy, hogy le vannak hasítva róla. A peptid lehasításához az izolált peptidgyöngyöket tradicionális hasítóanyagokkal kezeljük, amelyek a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakemberek számára jól ismertek, és ezzel a polimert leválasztjuk a szilárd fázisú hordozóról. A hasítóanyag megválasztása a használt szilárd fázisú hordozótól függ. Például, ha a peptideket a Wang gyantáról akarjuk lehasítani, akkor előnyösen 50%-os trifluor-ecetsav (TFA) diklór-metános oldatát használjuk.
Egy másik, a találmány oltalmi körébe tartozó megvalósítási mód szerint lehetséges egyetlen szilárd fázisú hordozót, azaz például egy gyöngyöt izolálni a hozzá kapcsolódó biooligomerekkel együtt, és a gyöngyöket egy szekvenátorban alkalmazzuk, anélkül, hogy előzőleg lehasítanánk a biooligomereket a gyöngyről. Például, ha a biooligomer egy peptid, akkor a becslések szerint egyetlen 100 pm átmérőjű gyanta (0,5 mEkv/gramm gyanta szubsztitúcióval) körülbelül 200 pmol peptidet tartalmaz. Egyetlen 250 pm átmérőjű PAM gyanta (0.5 mEkv/gramm gyanta szubsztitúcióval) körülbelül 3125 pmol peptidet tartalmaz. A peptidszekvenátorok jelenlegi technikai fejlettsége mellett csak 5-10 pmol szükséges a megfelelő szekvenáláshoz. Ennélfogva egy standard méretű, egyetlen PAM gyanta hordozó (100 pm átmérőjű) több elegendő mennyiséget tartalmaz a szekvenáláshoz a peptidből.
Abban az esetben, ha a peptidek olyan aminosavakat vagy peptidomimetikumokat tartalmaznak, amelyekre nem alkalmazható az Edman-analízis, a gyöngyöket úgy készíthetjük, hogy a peptidek 10-50%-ába nem épül be a szekvenálhatatlan aminosav. A megmaradó szekvencia meghatározható, és a szekvenálhatatlan csoportot tartalmazó szekvencia ebből extrapolálható.
A szekvenálhatatlan csoportok másik megközelítési módja szerint a peptid egy részét ideiglenesen lezárjuk, mielőtt a szekvenálhatatlan csoportot beépítjük a könyvtár szintézise során. Az ezt követő szerkezeti azonosítás során használhatjuk az Edman-degradációt a szekvenálhatatlan csoportig, majd eltávolítjuk az ideiglenes lezárórészt, és folytatjuk a szekvenálást a szekvenálhatatlan csoporttól disztálisan (azaz a C-terminális irányába).
Az oligonukleotidok esetében a szekvenálást automatizált oligonukleotid-szekvenátorokkal végezhetjük (például Applied Biosystems berendezéssel). Egy előnyös alternatíva szerint a Maxam Gilbert-technikát alkalmazzuk [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74., 560-564. (1977)]. A szakterületen ismert más, oligonukleotidok szekvenálására alkalmas módszer is használható.
A gyorsion-bombázásos tömegspektrometria szolgáltatja valószínűleg a leghasznosabb szerkezeti elemzést. A fragmentek és a biooligomerfajták kimutatásával egy szekvencia rekonstruálható. Az elektrospray nagy teljesítményű tömegspektrometria (Finnigan MÁT) egyszerre szolgáltat szerkezeti és szekvenciaadatokat is.
Ha a kiválasztott biooligomerszekvenciáját meghatároztuk, akkor nagy mennyiséget szintetizálhatunk kémiailag, egy automata peptidszintetizátor alkalmazásával, illetve más biológiai- vagy kémiaiszintézis-módszerrel. Emellett, ha a biooligomer szekvenciáját meghatároztuk, akkor alegységanalógok is helyettesíthetők, hogy fokozzuk a specifikus biooligomer aktivitását.
Terápiás és gyógyászati hatású anyagok a random biooligomer-könyvtárakból
Ha egyszer egy számunkra érdekes biooligomerszekvenciáját meghatároztuk, akkor a jelen találmány olyan molekulák előállítási eljárását adja meg betegség kezelésére vagy diagnosztizálására, amelyek tartalmaz18
HU 218 007 Β zák a biooligomerszekvenciát. Csak a biooligomerszekvencia is szolgáltathat egy diagnosztikai vagy terápiás ágenst, illetve be is építhető egy nagyobb molekulába. Egy biooligomerszekvenciát tartalmazó, biológiai vagy kötőaktivitással rendelkező molekulát nevezhetünk „effektormolekulának”. A találmány tárgyát képezik továbbá a különböző alkalmazásokban használható könyvtárak. Az említett effektormolekulának az „effektor”-funkciója bármely, az alábbiakban leírt vagy a szakterületen ismert funkció lehet.
Az alábbiakban ismertetett módszer nemcsak egy új eszköz a potenciális diagnosztikai vagy terápiás értékű specifikus ligandumok keresésére, hanem lényeges információt is szolgáltat egy sorozat ligandumról, amelyeknek jelentősen eltér a primer szekvenciájuk vagy a kémiai összetételük, és ennek ellenére mégis képesek fizikai kölcsönhatásba lépni ugyanazzal az akceptormolekulával. Az ilyen információt a molekuláris modellezéssel és a modem számítógépes technikákkal szerezve, valószínűleg új, alapvető ismereteket szerzünk a ligandumreceptor interakciókról.
A találmány szerinti terápiás ágensek olyan effektormolekulákat tartalmaznak, amelyek a citokinek, növekedési faktorok vagy hormonális ágensek biológiai aktivitással rendelkező helyeihez kötődnek, és ezáltal vagy fokozzák, vagy semlegesítik a hatásukat, és blokkolják vagy fokozzák a transzkripciójukat és/vagy transzlációjúkat.
A találmány szerinti terápiás ágensek közé tartoznak például azok az effektormolekulák, amelyek egy farmakológiai szempontból érdekes receptorhoz kötődnek, például a növekedési faktor receptoraihoz, neurotranszmitter-receptorokhoz vagy hormonreceptorokhoz. Ezek az effektormolekulák a természetes receptor ligandumhatásának agonistájaként vagy antagonistájaként használhatók.
A receptorokhoz kötődő effektormolekulák másik felhasználási lehetősége az, hogy a kötődést azon vírusok és mikroorganizmusok kötődésének a gátlására használjuk, amelyek egy normál sejtreceptorhoz hozzáférve kötődnek, és intemalizálódnak. Erre a jelenségre példa lehet humán immundeficienciát okozó vírus kötődése a CD4 receptorhoz, és a herpesz szimplex vírus kötődése a fibroblasztnövekedésifaktor-receptorhoz. Azok az effektormolekulák, amelyek elfoglalják a receptort, használhatók farmakológiai ágensekként a célsejt vírusfertőzésének gátlására. A sejtek parazitainváziója hasonlóképpen gátolható, ha már a jelen találmány szerinti alkalmas effektormolekulákat azonosítottuk.
Egy másik megvalósítási mód szerint egy olyan effektormolekula, amelyik egy olyan biooligomerszekvenciát tartalmaz, amely egy számunkra érdekes akceptormolekulához kötődik, használható gyógyszerként vagy egy taxinként. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a számunkra érdekes akceptormolekula egy olyan receptor vagy antigén, amely egy tumorsejt, állati parazita vagy mikroorganizmus, például baktérium, vírus, egysejtű parazita, egysejtű patogén, gomba vagy penész felszínén található.
Emellett az is lehetséges, hogy a poolban levő néhány millió biooligomer között olyan szekvenciák is vannak, amelyek biológiai aktivitással rendelkeznek. Izolálhatunk olyan biooligomereket, amelyek tumorellenes, állatiparazita-ellenes, vagy antimikrobiális, azaz antifungális, antibakteriális, antiegysejtű parazita, antiegysejtű patogén vagy antivirális aktivitással rendelkeznek. Emellett ezek közül a biooligomerek közül néhány a növekedési faktorok, azaz az eritropoietin, epidermális növekedési faktor, fibroblaszt növekedési faktor, tumor-növekedésifaktor (csak hogy néhányat említsünk ezek közül), valamint a hormonok, neurotranszmitterek, immunmodulátorok vagy más szabályozómolekulák antagonistájaként vagy agonistájaként képes működni. Az egyik megközelítési mód szerint a biooligomerek peptidek.
A találmány szerinti terápiás hatóanyagok közé tartoznak azok az effektormolekulák is, amelyekben gyógyhatású anyagok, például digoxin, benzodiazepin, heroin, kokain vagy teofillin iránt nagy affinitással rendelkező biooligomerszekvenciák találhatók. Ezek a peptidek az ilyen drogok túladagolásánál antidótumként használhatók. Hasonlóképpen, a terápiás ágensek közé tartoznak az olyan effektormolekulák is, amelyek kis molekulákhoz vagy fémionokhoz kötődnek, beleértve a nehézfémionokat is. A billirubinhoz nagy affinitással rendelkező biooligomerszekvenciák hasznosak lehetnek az újszülöttek hiperbillirubinémiájának kezelésében.
Általában a találmány tárgyát képezik olyan eljárások, amelyekkel betegségek vagy kóros állapotok kezelésére alkalmas biooligomerszekvenciákat lehet azonosítani. A betegségek, kóros állapotok a Product Category Index of The Physicians Desk Reference (PDR, 1991, 45. kiadás, Medical Economics Data: Oradell, NJ, 201-202. oldal) című kiadványban találhatók. Azonosíthatók például antiparazita-, antikoaguláns, antikoagulánsantagonista-, antidiabetikuságens-, antikonvulzáns, antidepresszáns-, antidiarreás-, antidótum-, antigonadotropin-, antihisztamin-, antihipertenzív, gyulladáscsökkentő, hányingerellenes, antimigrén-, antiparkinzon-, antivérlemezke-, viszketés elleni, antipszihotikus, antipiretikus, antitoxin- (például antivenum), hörgő tágító, értágító, kelátképző, fogamzásgátló, izomrelaxáns-, antiglaukóma-, vagy nyugtatóaktivitással rendelkező effektormolekulák.
A találmány szerinti terápiás hatású anyagok tartalmazhatnak megfelelő, gyógyászatilag elfogadható hordozókat, hígítószereket és adjuvánsokat. Az ilyen gyógyászati hordozók lehetnek steril folyadékok, például víz és olaj, beleértve a petróleumot, állati, növényi vagy szintetikus eredetű olajakat, például a mogyoróolaj, ásványolaj, szezámolaj, szójaolaj és hasonlók. A víz az előnyös hordozó, ha a gyógyászati készítményt intravénásán adjuk be. Sóoldatok, vizes glükóz- és glicerinoldatok is használható folyékony hordozóként, különösen injektálható oldatok esetében. Az alkalmas gyógyászati töltőanyagok közé tartozik például a keményítő, glükóz, laktóz, szacharóz, zselatin, maláta, rizs, liszt, kréta, szilikagél, magnézium-karbonát, magnéziumsztearát, nátrium-sztearát, glicerin-monosztearát, tal19
HU 218 007 Β kum, nátrium-klorid, szárított sovány tej, glicerin, propilénglikol, víz, etanol és hasonlók. Ezek a készítmények oldatok, szuszpenziók, tabletták, pirulák, kapszulák, porok, szabályozott felszabadulású készítmények és hasonlók formáját ölthetik. Az alkalmas gyógyászati hordozók leírása a „Remington’s Pharmaceutical Sciences”-ben található meg, szerkesztette E. W. Martin. Ezek a készítmények hatásos mennyiséget tartalmaznak az aktív hatóanyagból, egy megfelelő mennyiségű hordozóval együtt, hogy a betegnek való beadás céljából megfelelő formát kapjuk így meg. Míg az intravénás injekció nagyon hatékony formája a beadásnak, más módok is használhatók, például injekciózás, szájon át, orron át vagy parenterális úton történő beadás.
Egy, a jelen találmány szerint meghatározott szekvenciával rendelkező molekula diagnosztikai ágensként is használható. A diagnosztikai ágens egy vagy több, a jelen találmány szerinti biooligomerszekvenciát tartalmazhat, például egynél több peptidszekvenciát vagy oligonukleotid-szekvenciát. Emellett a diagnosztikai ágens tartalmazhat bármely, az előzőkben a terápiás ágensekre leírt hordozó(ka)t.
A továbbiakban a „diagnosztikai ágens” szakkifejezés egy olyan ágensre vonatkozik, amely használható bizonyos állapotok kimutatására, például, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, rák, úgymint T-sejtes vagy B-sejtes limfóma kimutatására, valamint fertőző betegségek kimutatására, az előzőkben leírtak szerint. A kimutatást a legszélesebb értelemben használjuk, ami magában foglalja egy állapot súlyosságában vagy jelzésében szerepet játszó állapot, hely, testrész létezésének kimutatását. Például, egy peptid-torma immunperoxidáz komplex vagy ezzel rokon immunhisztokémiai ágens használható specifikus receptor- vagy antitestmolekulák kimutatására és mennyiségük meghatározására szövetekben, szérumban vagy testfolyadékban. A diagnosztikus ágensek alkalmasak lehetnek in vitro és in vivő alkalmazásokra is. Pontosabban, a jelen találmány tárgyát immunesszékben, Southern vagy Northern hibridizációkban és in situ vizsgálatokban használható diagnosztikai reagensek képezik.
Emellett a diagnosztikum tartalmazhat még egy vagy több markert, például, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, radioaktív izotópot, fluoreszcens jelölést, paramágneses anyagokat vagy más, képalkotó anyagokat. A szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára ismerős lesz a markerek csoportja, valamint azok a módszerek is, amelyekkel az ágensbe beépítik őket, hogy ezzel diagnosztikumot hozzunk létre.
A jelen találmány szerinti terápiás ágensek és diagnosztikumok használhatók állatok, előnyösebben emlősök, beleértve az embereket is, valamint más állatokat, például kutyákat, macskákat, lovakat, szarvasmarhákat, sertéseket, aranyhörcsögöket, egereket és patkányokat, kezelésére és/vagy diagnosztizálására. A terápiás és/vagy diagnosztikai ágensek használhatók növényi betegségek kezelésére és/vagy diagnosztizálására.
A jelen találmány szerinti biooligomerekkel való kezelésre és diagnosztizálásra alkalmas betegségek és állapotok ugyanolyan változatosak és széles körűek, mint a random biooligomer-könyvtárban levő szerkezetek permutációi. Az alábbi példákat csak illusztrálás céljából adtuk meg, nem tekinthetők a szabadalom korlátozásának.
Citotoxikus készítmények
Egy biooligomerszekvenciát tartalmazó molekula önmagától is specifikus citotoxikus aktivitással rendelkezhet. Emellett egy biooligomer, amely egy számunkra érdekes akceptort köt meg, módosítható olyan technikákkal, amelyek a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára rutinszerű, például citotoxikus vegyületekhez, például drogokhoz vagy radioaktív atomokhoz konjugálva, hogy ezzel egy citotoxikus molekulát hozzunk létre. A biooligomer, például peptid „becélozhatja” a citotoxikus vegyületet, és specifikusan tönkreteheti az egy adott akceptormolekulával rendelkező sejteket. Például az ilyen citotoxikuspeptid-konjugátumok közvetlenül eliminálhatják a nem kívánt Tsejt-populációkat, B-sejt limfómákat, T-sejt-populációkat, vagy T-sejt-limfómákat egy betegben. A potenciális klinikai alkalmazások közé tartozik például az autoimmunbetegségek, limfómák kezelése és a szervátültetésekhez specifikus immunszuppresszív terápia alkalmazása. A rák egyéb formái, amelyekben a ráksejt a ligandumnak receptor által közvetített kötődését mutatja, ilyen például az emlőrák és a petefészekrák, amelyeknél az a vélemény, hogy az epidermális növekedési faktor (EGF) receptorai játszanak szerepet, szintén kezelhetők lehetnek ily módon.
Az egy célsejtre, például ráksejtekre vagy vírusfertőzött sejtekre specifikus citotoxikus ágensek, amelyek viszont nem ölik meg a többi sejtet, szövetet vagy szervet, szintén előállíthatok a találmány szerinti módszerrel Amellett, hogy a romboló hatású sejteket, például a daganatokat célozzuk meg, ezek a specifikus toxinok hasznos antimikrobiális szerek is lehetnek. Pontosabban az ilyen terápiás ágensek mutathatnak bakteriosztatikus, bakteriocid, antivirális, antiparazita vagy fungicid aktivitást. Hasonlóképpen olyan toxinok is azonosíthatók, amelyek inszekticid vagy herbicid aktivitással rendelkeznek.
Az egyik megvalósítási mód szerint a biooligomer lehet peptid. A peptid szerepelhet olyan célzó hatóanyagként, amelyhez egy toxin van hozzákapcsolva. A peptid egyedül is képes arra, hogy megcélozzon egy sejtet, és taxinként működjön. Egy másik megvalósítási mód szerint a biooligomer lehet egy oligonukleotid. Az oligonukleotid úgy fejtheti ki toxikus hatását, hogy a sejt életképességéhez nélkülözhetetlen transzkripcióval vagy transzlációval lép zavaró kölcsönhatásba.
Immunmödositók
A jelen találmány tárgyát immunmódosítókként használható molekulák és készítmények képezik. Az „immunmódosító” szakkifejezés olyan molekulákra vagy vegyületekre vonatkozik, amelyek változásokat képesek létrehozni az immunrendszerben. Pontosabban az immunmódosítók képesek a T-sejtes válaszokat, a Bsejtes válaszokat és az aspecifikus immunválaszokat serkenteni vagy gátolni, amely aspecifikus válaszokat a
HU 218 007 Β makrofágok, neutrofil sejtek, polimorfonukleáris fagociták, granulociták és más, mieloid eredetű sejtek fejtik ki. Az effektormolekulák az alábbi immunológiai állapotok kezelésére használhatók:
1. különböző autoimmunbetegségek, beleértve a miaszténia graviszt, szklerózis multiplexet, a Grave-féle betegséget, a reumatoid artritiszt, szisztémás lupusz eritematózuszt (SLE), idült, hólyagos pemphigust, az autoimmun hemolitikus anémiát és az immun trombocitopéniát;
2. nem-Hodgkin-limfómát és egyéb más rákokat;
3. allergiát;
4. immunkomplex betegségeket;
5. átültetett szerv kilökődését;
6. fertőző betegségeket és a
7. cukorbetegséget.
Az immunmódosítók úgy serkenthetik az immunaktivitást, hogy egy serkentő-limfokin aktivitását utánozzák, azaz például az IL-1, IL-2, IL-4, IL-6 granulocita telepserkentő faktor (CSF), makrofág CSF és a granulocita/makrofág CSF aktivitását, csak hogy néhányat említsünk. A serkentés úgy jöhet létre, hogy a peptidligandumként egy limfokinreceptorhoz kötődik, illetve úgy, hogy egy oligonukleotid aktiválja a sejt transzkripciós gépezetét. Egy immunmódosító úgy hathat, hogy egy leukocitához vagy limfocitához kötődik, mint például az Fc receptor, a LAF-1, LAF-2 stb., és például fagocitózist vagy citotoxinok felszabadulását indukálja. Egy, a találmány szerinti effektormolekula kemotoxinként is működhet.
A találmány egy bizonyos megvalósítási módja szerint egy biooligomert tartalmazó molekula utánozhat antigént. Önmagában a biooligomer lehet egy hasznos vakcina, amely egy bizonyos patogénre specifikus Tsejtek vagy a B-sejtek aktivitását kiváltja. Egy másik módszer szerint egy antigén, azaz egy epitóp utánzása használható egy specifikus immunválasz kiváltására.
Az várható, hogy a találmány szerinti effektormolekulák hatékonyak lesznek felszabadított formában. Egy bizonyos biooligomer azonban nagyobb hatékonyságot mutathat, ha egy szilárd fázisú hordozóhoz kötve marad. Pontosabban az epitóputánzat nagy sűrűsége hatékonyabban serkenthet egy B-sejtes választ, oly módon, hogy a membrán immunoglobulinokhoz kötődik, azokat lezárja, vagy más, receptorok által közvetített módon.
Az is várható, hogy egy, a találmány szerinti korlátozott könyvtár hasznos lehet vakcinaként, olyan patogénnel szemben, amely sokféle epitópot tartalmaz. Az például ismert, hogy a tripanoszóma VSG-jének (változó felületi antigén) primer szerkezete (szekvenciája) a fertőzés során időben változik. A VSG epitópot megváltoztatva a tripanoszóma elkerüli, hogy az immunrendszer felismerje. Hasonlóképpen a maláriaparazitákról is ismert, hogy a fajok között különböző antigénepitopokat expresszálnak, az életciklus különböző fázisaiban és alfajokban. Tehát egy korlátozottan változatos peptidkönyvtár immunizálhat a tripanoszóma vagy a maláriaparaziták által bemutatott antigén-sokféleséggel szemben. Egy korlátozott könyvtár használható vakcinaként, bármely olyan esetben, amelyben egy sorozat antigénnel szembeni immunitásra van szükség.
Az várható, hogy az effektormolekulák gátolhatják az immunválaszt
i) blokkolva a specifikus immunfelismerést az antitest vagy a T-sejt-antigénreceptor szintjén;
ii) blokkolva az Fc vagy egyéb immunreceptorokat;
iii) a limfokinekhez és citokinekhez kapcsolódva és gátolva azok aktivitását;
iv) negatív visszacsatolási jeleket szolgáltatva az immunsejteknek.
Az effektormolekulák használhatók az immunrendszer visszafogására, különösen autoimmunantigének esetében. Például a DNS-sel szembeni immuntolerancia befolyásolható egy oligonukleotiddal vagy oligonukleotid-könyvtárral, és hasznos lehet az SLE kezelésében. Továbbá, az immungátlást befolyásolhatjuk az előző szekcióban leírt mechanizmusokkal.
Emellett a találmány szerinti terápiás ágensek tartalmazhatnak kiválasztott szintetikus antigénpeptideket, amelyekkel lehetséges az immunrendszer befolyásolása, hogy ezzel az adott antigénnel szembeni toleranciát indukáljunk, és ezzel elnyomjuk vagy meggyógyítsuk a megfelelő autoimmunbetegséget. Hasonlóképpen, specifikus szintetikus antigénpeptidekkel lehetséges multimer immunkomplexek képződésének megakadályozása, és ezzel megelőzhető specifikus immunkomplex betegségek kialakulása.
A tumorspecifikus monoklonális antitestekhez kötődő peptidek izolálhatok, szekvenálhatók és megszintetizál hatók, hogy immunogénként használjuk őket, a tumor elleni aktív immunitás indukálása céljából.
Az Fc receptorokhoz nagy affinitással rendelkező specifikus peptidek használható terápiás ágensekként, hogy a retikuloendoteliális rendszer Fc receptorait gátoljuk, amely előnyös lehet olyan betegek esetében, akik autoimmunbetegségekben szenvednek, például idiopátiás trombocitopéniában vagy autoimmun hemolitikus anémiában.
Az ilyen peptidekkel való kezelés lehetőségei még jelentősebbek lehetnek. A behatoló szervezetek epitópjaira hasonlító peptidek használhatók egy szervezet által okozott fertőzés gátlására. Például a szerzett immunhiányos szindrómával (AIDS) végzett újabb vizsgálatok kimutatták, hogy az AIDS-vírussal való fertőződés az AIDS-vírus felszínén levő specifikus glikoprotein (gp 120) és a sejt CD4 felszíni receptora közötti felismeréssel és kötődéssel indul. Egy, a gpl20-ra hasonlító peptid beadásával elegendően gátolhatjuk a CD4 receptort, hogy az AIDS-vírus nem lesz képes kötődni és a sejtet megfertőzni. Hasonlóképpen a parazitainváziót és - fertőzést is gátolhatjuk.
Neuroaktív agonisták és antagonisták
Az várható, hogy a jelen találmány szerinti effektormolekulák agonizálják (utánozzák) vagy antagonizálják (gátolják) hormonok, neurotranszmitterek, analgetikumok, anesztetikumok, antipszihotikumok, antidepreszszánsok vagy narkotikumok hatását. Az ilyen effektormolekulák hasznosak tehernek étvágyszabályozók, pszichiátriai gyógyszerek, figyelem- és tanulásbefolyásolók
HU 218 007 Β és memóriasegítők felfedezésében. A jelen találmány tárgyát képezik továbbá íz- és aroma-analógok, azaz „mesterséges” édesítőszerek, sók és aromaanyagok.
Korlátozott könyvtárak
Az is előre látható, hogy a találmány szerinti korlátozott könyvtár egy komplex ízanyagot is képes szolgáltatni, olyat például, mint a fűszer, de kisebb költséggel, illetve az aromaanyagok által alkalmanként okozott, allergiás hatások nélkül. Ily módon drága fűszerek, például a sáfrány, helyettesíthetők. Egy más szemszögből nézve új fűszerosztályok hozhatók létre.
Egy másik megvalósítási mód szerint egy korlátozott könyvtár egyedülálló tulajdonságú kromatográfiás töltet lehet. Az várható, hogy egy biooligomer-könyvtár, amely általános kémiai tulajdonságokkal rendelkező, de különböző szekvenciájú peptidekből áll, sokkal hasznosabb kromatográfiás töltet lehet, mint amelyek jelenleg hozzáférhetők. Egy ilyen kromatográfiás töltet sokkal szelektívebb lehet mint egy ioncserélő vagy fordított fázisú töltet. Mégis, egy tisztítandó akceptormolekula sokkal finomabban, könnyebben leoldható a töltetről, mint ha például egy immunaffmitás-hordozót használnánk, ezzel elkerülhető a denaturálás. Egy megvalósítási mód szerint egy töltetet oly módon állíthatunk elő, hogy a közepes affinitással rendelkezőnek, azaz közepes jelölési intenzitásúnak talált, illetve olyannak talált, hogy a specifikus akceptormolekulának csak nagy koncentrációja mellett kötődik, biooligomerek összetételére vagy szerkezetére alapozva szintetizáljuk meg. Emellett egy nagyon szelektív, alacsony szigorúsági fokkal rendelkező hordozó gyorsan azonosítható anélkül, hogy tisztított anyagra lenne szükségünk.
Egy másik megvalósítási mód szerint az alacsony affinitással rendelkező gyöngyök kiválaszthatók, és a kiválasztott gyöngyök szekvenciája alapján egy korlátozott könyvtár készíthető. Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány alapján szolgáltatott több millió szekvenciából egy vagy több biooligomerszekvencia azonosítható, amely a felhasználó igényei szerinti alacsony affinitással vagy nagy affinitással rendelkező töltetként használható.
A találmány szerinti eljárást még világosabbá tesszük az alábbi példákkal, amelyek csak példaértékűek, és nem korlátozzák a szabadalom érvényességi körét.
1. példa
Egy tetrapeptidkönyvtár szintézise
A találmány szerinti módszert használtuk egy X-X-X-Trp tetrapeptidcsalád megszintetizálására, amelyben X jelentése lehet valin, szerin vagy alanin, és az első aminosav mindig triptofán. A triptofánt azért építjük be a C-terminálisra, hogy megkönnyítsük az OD260-on való spektrofotometriás követést.
A Wang által leírt [J. Amer. Chem., 95., 1328-1333. (1973)] Na-Fmoc-triptofán-alkoxi-metil polisztirolgyantát a Bachem Inc.-tői szereztük be (Torrence, CA), majd egy standard, szilárd fázisú peptidszintézis-tartályba helyezzük. A hozzáadandó aminosavak szintén Fmoc-módosított aminosavak a Bachem
Inc.-tői. A többi használt reagens lényegében azonos azzal, amit rutinszerűen használnak a szilárd fázisú szintézisekben [Auste, „Peptide Synthesis” Methods in Molecular Biology, 3., 311-331. (1988)].
Teflon™ lezáróval ellátott reakcióedényeket használunk a kapcsolási reakciókban; egy standard szilárd fázisú fehérjeszintézis reakcióedényt használunk keverőkamraként, amelyekben az alikvot részeket a kapcsolási reakciók után összekeverjük.
Körülbelül 0,5 gramm Fmoc-Trp alkoxi-metil gyantát duzzasztunk 20 ml diklór-metánban (DCM). A gyantát kétszer mossuk DCM-mel, egyszer mossuk dimetil-formamid (DMF) és DCM 1:1 arányú keverékével, majd háromszor mossuk DMF-fel. A gyantáról ezután eltávolítjuk a védőcsoportot 20 térfogat/térfogat% DMF-es piperidinnek kezelve. A védőcsoportjaitól megfosztott gyantát háromszor alaposan mossuk DMSsel, majd háromszor DCM-mel és kétszer DCM és DMF 1:1 arányú elegyével, majd a gyantát körülbelül 7,5 ml DMF-ben szuszpendáljuk, és három alikvot részre osztjuk (2,5-2,5 ml), és három megszámozott kapcsolócsőbe helyezzük.
A hozzáadandó védett aminosav mennyiségét azon az alapon számoljuk ki, hogy hány mól triptofán van már a gyantához kapcsolva. Minden egyes hozzáadandó aminosav esetében az aminosavat ötszörös mólfeleslegben használjuk mindegyik reakcióelegyben, amelyekbe a mosott gyantát már szétosztottuk. Mindegyik reakcióelegy a különböző aminosavakból ötszörös mennyiséget kap. Mindegyik edényt két percig rázatjuk, és diizopropil-karbodiimidet (DIC) adunk hozzá ötszörös mólfeleslegben 3 ml DCM-ben oldva, majd 1 óra hosszat rázatjuk.
A kapcsolás teljességének ellenőrzéséhez az egyes csövekből mintát veszünk, és ninhidrinnel (Pierce Chemical) ellenőrizzük Sárin módszerével [Sárin et al., Anal. Biochem., 117., 147-157. (1981)]. Ha a kapcsolási reakció ezzel a módszerrel megállapíthatóan nem teljes, akkor a reakciót erőltetjük, hogy teljesen lejátszódjon, a szakterületen jártas szakemberek számára ismert számos módszer egyikével, azaz
a) egy második kapcsolási reakciót végzünk, a védett aminosav 1 -5-szörös feleslegét alkalmazva;
b) egy újabb kapcsolást végzünk egy más, vagy pluszban hozzáadott oldószer (például trifluor-etanol) hozzáadásával, vagy
c) kaotrop só hozzáadásával (például NaClO4 vagy LiBr) [Klis and Stewart, „Peptides: Chemistry, Structure and Biology”, Rivier and Marshall, eds., ESCOM Publ., 904-906. (1990)].
A kapcsolás után a három kapcsolási lépésben keletkező gyantákat óvatosan átvisszük az egyetlen keverőkamrába. A gyantát kétszer mossuk DCM/DMF 1:1 arányit elegyével, majd háromszor mossuk DCM-mel, háromszor DMF-fel, és 20 térfogat/térfogat%-os Piperidin/DMF oldattal eltávolítjuk a védőcsoportokat. Miután a fentiek szerint alaposan mostuk DCM-mel és DMF-fel, a keveréket három alikvot részre osztjuk, és szétosztjuk három különböző reakcióedénybe. A második aminosavkészletet hozzáadjuk. Miután a kapcsoló22
HU 218 007 Β dás teljesen lejátszódott, a gyantáról először eltávolítjuk a védőcsoportot (20%-os piperi dinnel), majd alaposan mossuk DCM-mel és DMF-fel, az előzőkben leírtak szerint. Egy harmadik készlet aminosavat az előzőkben leírt módon adunk hozzá.
A peptideknek a szilárd fázisú hordozókról való lehasítása céljából 30 ml 50 térfogat/térfogat%-os trifluorecetsavat (TFA) plusz 5 térfogat/térfogat% anizolt és 0,9 térfogat/térfogat% etán-ditiolt adunk hozzá DCMben. A keveréket négy óra hosszat rázatjuk, és peptidfelülúszókat kinyerjük. A peptidfelülúszókat ezután egy rotációs bepárlóval betöményítjük, és a peptideket éterrel kicsapjuk. Egy alapos mosás után a peptidcsapadékot megszárítjuk, és ezzel készen áll a további elemzéshez. A liofilizált peptidet (por formájában) lefagyasztva tároljuk.
2. példa
Az igényelt módszer összehasonlítása a peptidszintézis szokványos módszerével Egy random tetrapeptidekből álló könyvtárat állítunk elő a fenti, 6. példa szerint. Emellett egy tetrapeptidekből álló könyvtárat állítunk elő a standard, szilárd fázisú szintézis módszerét alkalmazva (a továbbiakban „SPPS” néven hivatkozunk rá), amelyet Austen írt le (i. m.). A BAchem, Inc.-tői vásárolt Na-Fmoc-triptofán-alkoxi-metil gyantát használjuk szilárd fázisú hordozó/aminosav kombinációként. Ötszörös feleslegben levő, ekvimoláris mennyiségű Na-Fmoc-valint, N“-Fmoc-szerint (O-Bu), és N“-Fmoc-alanint adunk az egyes reakcióelegyekhez az egyes kapcsolási lépések után. A három egymást követő kapcsolási lépés után a tetrapeptideket lehasítjuk, 50 térfogat/térfogat%-os TFA, 5 térfogat/térfogat% anizol és 0,9 térfogat/térfogat% etándiol DCM-es oldatával, Austen leírása szerint (i. m.).
Eredmények
Mindkét peptidkönyvtárat C-18 fordított fázisú HPLC-kromatográfiás oszlopon (Vydac) elemezzük, hogy kimutassuk a könyvtárban levő peptidfajták számát (csúcsok száma), a peptidek relatív koncentrációját (a csúcsok területe) és a peptidek relatív hidrofil természetét (az oszlopról való korai vagy késői eluálódása). Az eredmények az 1. ábrán láthatók. A felső panelen levő kromatogram (la. ábra) a találmány szerinti módszerrel kapott peptidkönyvtár mintázatát mutatja, az alsó panelen látható kromatogram (lb. ábra) az SPPSsel kapott mintázatot mutatja.
Mindkét mintázaton 21 különböző csúcs látható, jelezve, hogy legalább 21 különböző peptidfajta van jelen mindegyik könyvtárban. Az SPPS-mintázat azonban lényegesen nagyobb területet mutat az 1., 2., 3., 4., 5., 6. és 7. csúcsoknál, jelezve, hogy az SPPS-könyvtár sokkal nagyobb koncentrációban tartalmazza az 1-7es peptideket, mint a 8-21-es peptideket. Az 1-7-es peptidek megnövekedett száma azt mutatja, hogy ezek a peptidek jobban szintetizálódtak, mint a többi peptid. Emellett ezek a prominens csíkok korán eluálódtak, azaz ezek a peptidek rövidebb retenciós időt mutattak az oszlopon, jelezve, hogy a peptideknek sokkal hidrofilebb természetük van.
Ezek az eredmények nem váratlanok az SPPS-rendszerben. Az ismert a szakterületen, hogy a valin hidrofób és nagy a térkitöltése, és sokkal kisebb a kapcsolódási sebessége (valószínűleg a szterikus gátlás miatt), mint akár az alaniné, akár a szeriné. Tehát, ha egy konvencionális random peptidszintézist hajtunk végre, amelyben a valin lényegében „verseng” az alaninnal vagy a szerinnel a kapcsolási helyekért, akkor a szintetizált peptidek valinban szegények és a keletkező peptidkönyvtár nem mutatja a random peptidek ekvimoláris eloszlását.
Ezzel szemben a találmány szerinti módszerrel előállított random peptidkönyvtár mintázata a peptidek ekvimoláris eloszlását mutatja. Jóllehet a 3-as, 6-os, 12-es, 13-as és 18-as csúcsok körülbelül kétszer akkora területűek, mint a többi csúcs, a megmaradó 16 csúcs majdnem azonos mintázatot mutat. Emellett mind a 21 csúcs belefér a retenciósidő-tartományba, ezzel is jelezve a peptidek ekvimoláris eloszlását.
A kiválasztott csúcsok szekvenálása további bizonyítékokkal szolgált. A kisebb, 8-as, 9-es és 21-es csúcsok, valamint a nagyobb, 6-os csúcs szekvenciáját egy Applied Biosystems 477A Protein Sequencerrel határoztuk meg:
#8=Val-Ala-Ser-Trp #9=Val-Ser-Ala-Trp #21 =Val-Val-Val-Trp #6=(Ser-Val)-(Ser-Ala)-(Ser-Ala)-Trp
Ezek a valint tartalmazó szekvenciák megerősítik, hogy a szabadalom szerinti eljárással lehetséges peptidek random szintézise, még akkor is, ha tudottan lassan kapcsolódó aminosavak vannak jelen.
A #6-os csík szekvenciája nem volt meggyőző, valószínűleg azért, mert a csúcs alatt egynél több peptid található. Az a legvalószínűbb, hogy a két főcsúcs SerAla-Ala-Trp és Val-Ser-Ser-Trp.
Összefoglalás
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti randompeptidszintézis-módszer lehetővé teszi, hogy random peptidek könyvtárát állítsuk elő, melyben a peptidek lényegében ekvimoláris mennyiségben fordulnak elő, szemben a standard SPPS-technikával, amelyben egy olyan peptidcsoport dominál, amelyek nagyobb kapcsolási sebességgel rendelkező aminosavakat tartalmaznak.
3. példa
Egy peptidligandum izolálása, amely egy receptor-molekulához kötődik
Annak igazolására, hogy a jelen találmány szerinti módszerrel egy bizonyos peptid izolálható, egy 12 tagú peptidet szintetizáltunk, amelynek szekvenciája megfelelt a V-mos gén termékének. A V-mos egy egérszarkómából izolált onkogén, és a Moloney-rágcsálószarkóma-vírussal áll kapcsolatban. A v-mos géntermékről köztudott, hogy szerin/treonin kináz aktivitással rendelkezik.
Anyagok és módszerek
A Leu-Gly-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Val-Tyr-Lys-Ala szekvenciát egy poliakrilamid gyöngyön szintetizáltuk
HU 218 007 Β meg (körülbelül 300 pm átmérőjű) Na-Fmoc-kémia alkalmazásával, standard, szilárd fázisú peptidszintézisreagensekkel és -technikákkal. Az oldalláncvédő csoportokat 50%-os TFA-val távolítottuk el, majd a peptid kovalensen kötve maradt a poliakrilamid gyantához egy linkeren, az amino-kapronsav-etilén-diaminon keresztül, így kaptuk a végső szerkezetet: Leu-Gly-Ser-GlyGly-Phe- Ser-Val-Tyr-Lys-Alá amino-kapronsav - etilén-diamin gyanta (a továbbiakban „hosszú v-mos gyöngy”). Ez a peptidszekvencia a v-mos géntermék 100 — 111-es aminosavainak felel meg.
Ugyanennek a módszernek az alkalmazásával a vmos géntermék egy rövidebb, 106- 111-es csoportjait tartalmazó peptidjét állítjuk elő (Gly-Ser-Val-Tyr-Lys-Ala) poliakrilamid gyöngyön, ugyanennek a linkemek az alkalmazásával (a továbbiakban „rövid v-mos gyöngy”). Ez a peptid a negatív kontroll.
Egy hibridóma-sejtvonalat, amely a hosszú v-mos peptidre specifikus egér-monoklonálisantitestet, amely anti-v-mos néven ismert, termel (Hybridoma No. 165-28E7, SCRF, Lót No. 165-119.) vásároltunk a Microbiological Associatestől (Maryland). Az ELISAvizsgálatokban ez az antitest a v-mos, MOS, neu/ HER-1, HER-2 géntermékek homológ szekvenciáit mutatja ki. Erről az antitestről ismert, hogy elhanyagolható affinitással rendelkezik a rövid v-mos peptidhez. A szekunder, alkalikus foszfatázzal jelzett kecske-anti-egér IgG-t (nehéz- és könnyűlánc-specifikus) vásároltunk a Sigma-tól.
A monoklonális antitestek előállítására használt szokványos technikák alkalmazásával [Methods in Enzymology, 121. (1986)] monoklonális antitesteket állítottunk elő aszcitesz formában, majd ezt követően egy Pharmaciától vásárolt protein-G oszlopon tisztítottuk.
Eredmények
A hosszú v-mos gyöngyöket ezerszeres feleslegben összekeverjük a rövid v-mos gyöngyökkel. A tisztított anti-v-mos monoklonális antitestből két millilitert (1 pg/ml) 0,1 % Tween 20-at tartalmazó PBS-ben hozzáadunk a hosszú és a rövid v-mos gyöngyökhöz, és szobahőmérsékleten inkubáljuk egy óra hosszat enyhe rázatás közben. A gyöngyöket azután egy óra hosszat mossuk óvatos kevertetés közben. A gyöngyöket azután egy kis eldobható polipropilénoszlopon mossuk (Isolab), ahol a gyöngyöket zsugorított rész tartja vissza. A gyöngyöket azután 2 ml szekunder antitesttel keverjük össze, 1:2000-es hígításban, egy óra hosszat. A mosás után a gyöngyöket polisztirol Petri-csészékre öntjük, és hagyjuk, hogy leülepedjenek. A felülúszót eltávolítjuk, és szubsztrátként óvatosan 5-bróm-4-klór-3-indolil foszfátot és nitro-blue-tetrazóliumot adunk hozzá.
percig inkubáljuk szobahőmérsékleten, ezalatt a hosszú v-mos gyöngyök bíborszínűek lesznek, szemben a rövid v-mos gyöngyökkel, amelyek színtelenek maradnak. Ez tette lehetővé, hogy azonnal kimutassunk egy sötét gyöngyöt, színtelen gyöngyök ezrei között. A gyöngyök közötti különbséget a 2-4. ábrákon láthatjuk, amely ábrák a Petri-csészékben eloszlatott gyöngyök 40 χ -es nagyításai. A 2. ábrán a monoklonális antitestekkel jelzett hosszú v-mos gyöngyök pázsitját láthatjuk, a 3. ábrán anti-v-mos monoklonális antitesttel jelzett hosszú és rövid v-mos gyöngyök keverékét láthatjuk, a 4. ábrán azt láthatjuk, hogy milyen könnyen kimutatható egyetlen kék gyöngy a színtelen gyöngyök pázsitján. Ennek megfelelően azok a gyöngyök, amelyek a számunkra érdekes peptidszekvenciát tartalmazzák, könnyen megkülönböztethetők, és izolálhatok a könyvtárban található többi gyöngy közül.
Izolálás után az Applied Biosystems 477A Protein Sequencert használjuk az egyetlen „hosszú v-mos” gyanta gyöngy N-terminális aminosavszekvenciájának meghatározására.
Következtetés
Ebben a példában azt igazoltuk, hogy a jelen találmány képes egyetlen, egy számunkra érdekes pepiidet tartalmazó biooligomerligandumot tartalmazó gyöngyöt szelektálni, több ezer, számunkra irreleváns, nem kötő gyöngy közül. Továbbá ez a példa azt is igazolja, hogy egy reaktív gyöngy igazolható és a peptidszekvenciája meghatározható.
4. példa
Egy rövidebb peptidligandum izolálása, amely egy receptormolekulához kötődik
Annak igazolására, hogy a jelen találmány szerinti peptid alkalmas egy bizonyos peptid izolálására, egy előre meghatározott szekvenciájú hexapeptidet (GlyPhe-Gly-Ser-Val-Tyr) szintetizálunk a standard 100 pm-es PAM gyöngyön, N“-Fmoc-kémiát és más reagenseket használva a standard, szilárd fázisú peptidszintézisből.
Anyagok és módszerek
A kapcsolási reakciókat a 3. példában leírtak alapján hajtjuk végre. Az alfa-amino-blokkolócsoportokat 20%-os piperidinnel távolítjuk el, az oldalláncvédő csoportokat 50% TFA-val távolítjuk el, így kapjuk a polisztirolgyöngyhöz egy amino-kapronsav-3-alanin-linkeren keresztül hozzákapcsolódó peptidet, amelynek szerkezete Gly-Phe-Gly-Ser-Val-Tyr-amino-kapronsavβ-Ala-gyanta. Ez a peptidszekvencia a 8. példában leírt v-mos géntermék 104-109-es csoportjainak felel meg.
Csakúgy, mint a 3. példában, anti-v-mos antitesteket gyűjtünk a v-mos peptidre specifikus egér-monoklonálisantitesteket termelő hibridóma-sejtvonalból. A jelzett szekunder kecske-anti-egér IgG-alkalikus foszfatázt a Sigmától vásároljuk.
Eredmények
Az előzőkben leírt PAM gyanta/v-mos peptid 0,1 mg-ját körülbelül százszoros feleslegben keverjük össze a Bachem, Inc.-tői vásárolt Na-Fmoc-alanin PAM gyanta-gyöngyökkel. A tisztított monoklonális antitestből (1 pg/ml) két ml-t (PBS plusz 0,1% Tween 20) adunk a peptidhordozó keverékhez, majd szobahőmérsékleten inkubáljuk 45 percig, óvatos kevertetés közben.
A gyöngyöket kis, eldobható polipropilénoszlopon mossuk (Isolab), amely a gyöngyöket egy zsugorított részen tartja vissza. A gyöngyök azután 2 ml alkalikus foszfatázzal jelzett szekunder antitesttel (1:100-as hígítás 1 keverjük össze, és egy óra hosszat hagyjuk állni.
HU 218 007 Β
Mosás után a gyöngyöket egy üvegszűrődarabra szélesztjük el, majd 2,2’-azino-bisz(3-etil-benztiazolinszulfonsav)-(ABTS) szubsztrátba és H2O2-be merítjük. 15 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten, ezalatt a PAM gyanta/v-mos peptidgyöngyök sötétzöld színűek lesznek. Az üvegszűrőn egy kis, halványabb zöld udvar jön létre. A szilárd fázisú hordozó nagyobb része, amelyről hiányzott a v-mos peptid, nem lépett kölcsönhatásba a monoklonális antitesttel, ennélfogva nem mutatott semmilyen színváltozást. A v-mos gyöngyök így könnyen megkülönböztethetők.
Következtetés
Ez a példa azt demonstrálja, hogy egy számunkra érdekes akceptormolekula nem reagál aspecifikusan egy szilárd fázisú hordozóval, hanem inkább specifikusan reagál egy szilárd fázisú hordozó/peptid kombinációval. Csakúgy, mint a 8. példában, egy pozitív reakciót adó gyöngyöt izolálhatunk, és a kapcsolódó peptidet szekvenálhatjuk.
5. példa
A sztreptavidin és az anti-$-endorfin MAB ligandumainak meghatározása
Ebben a példában tovább illusztráljuk a ligandumazonosításnak a jelen találmány szerinti sokszerűségét. Ahelyett, hogy egy biológiai rendszerre támaszkodnánk (például a fúziós fonalas fágok) egy random könyvtár létrehozásában, a jelen találmány hatékonyan alkalmazza nagy peptidkönyvtárak kémiai szintézisét, oly módon, hogy az egyes gyöngyökön különböző peptid van megkötve. Az egyes specifikus peptideket kötő gyöngyöket fizikailag izoláljuk, majd a hozzá kapcsolódó peptid szekvenciáját meghatározzuk.
Ez a megközelítés nagymértékben függ a nagy random peptidkönyvtár kémiai szintézisének képességétől, valamint attól, hogy ez mennyiben kapcsolható egy megfelelő kimutatási, izolálási és szerkezetmeghatározási rendszerhez.
Ennek a problémának a jelen találmány szerinti megoldása az, hogy a gyantagyöngyöket egy sorozat egyforma alikvot részre osztjuk az egyes kapcsolási lépésekben, és hagyjuk, hogy a gyanta alikvot részei teljesen reagáljanak egy aktivált aminosavval. A teljes kapcsolás lejátszódása után a gyanta alikvot részeit alaposan összekeverjük, mossuk, a védőcsoportokat eltávolítjuk, majd ismét szétosztjuk alikvot részekre, egy új kapcsolási ciklushoz. Ennek megfelelően egyik gyantagyöngy sem reagál egynél több aminosavval egyik kapcsolási ciklusban sem, és a számos lépés után mindegyik gyöngy egy egyedülálló peptidszekvenciát tartalmaz. Az ezzel a módszerrel létrehozott peptidkönyvtár elméletileg teljesen random. Emellett az egyes peptidfajtákból ekvimoláris mennyiséget kapunk. A permutációk száma, és ezzel a peptidek száma az egyes kapcsolási lépésekben választott alikvotok számától és az aminosavaktól, valamint a kapcsolási lépések számától függ (a peptid hosszától).
Az új megközelítés, hogy szimultán szintetizáljunk nagyszámú peptidet, nemcsak egy valóban randomizált és ekvimoláris könyvtárat szolgáltat, hanem ennél még fontosabb, hogy szilárd fázisú peptidgyantákat eredményez, amelyek között mindegyik gyanta csak egyetlen peptidet tartalmaz. Ez az utolsó tulajdonság biztos, mivel a peptidszintézis minden egyes ciklusában minden egyes gyöngy csak egyetlen aminosavval kerül érintkezésbe egy adott pillanatban, és minden egyes kapcsolási reakciót teljesen lejátszatunk. Az egy gyöngy-egy peptid koncepció valóban elsődleges fontosságú a leírt módszer sikere szempontjából.
Ezzel a szintetikus megközelítési móddal a kézben virtuálisan bármely peptidkönyvtár megszintetizálható, jól meghatározott összetétellel. Például akár mind a 20 természetes L-aminosav használható az egyes alikvot részekben az egyes kapcsolási lépések során, vagy csak egyetlen vagy néhány aminosav használható egy bizonyos kapcsolási lépésben.
Anyagok és módszerek
Egy peptidkönyvtár szintézise
Egy nagy könyvtárat szintetizálunk, amelynek szerkezete X-X-X-X-X-Ala-amino-kapronsav-etiléndiamin-gyanta (X=a 19 vagy 20 általános aminosav, a cisztein kivételével, az egyes kapcsolási lépésben). A peptidszintézishez választott szilárd fázisú gyantagyöngyök poli-dimetil-akrilamidból vannak (PDA) (Milligen, Inc., USA).
Az ezzel a gyantával végzett peptidszintézis kémiáját és módszerét Atherton és Sheppard írta le [Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach, IRL Press (1988)]. A gyantából három grammot (körülbelül 2 millió gyanta) éjszakán át óvatosan kevertetünk etilén -diaminnal. Egy alapos mosás után amino-kapronsavat, majd β-alanint kapcsolunk a gyantához Fmoc-kémia alkalmazásával, de hasítható linker nélkül. A randoinizálást a következő öt kapcsolási lépésben végezzük, és mind a 19 Fmoc-aminosav-Opfp-t külön használjuk az egyes kapcsolási lépésekben, a cisztein kivételével Miután mind az öt kapcsolási lépés lejátszódott, az Fmoc-csoportot eltávolítjuk (20 térfogat/térfogat% piperidein DMF-ben). Az oldalláncvédő csoportokat 90 térfogat/térfogat% TFA, 1 térfogat/térfogat% anizol és 0,9 térfogat/térfogat% etánditiol segítségével távolítjuk el. A gyantát 10%-os diizopropil-etil-aminnal (DMF-ben) semlegesítjük, majd DMF-ben tároljuk 4 °C-on.
A β-alanin-amino-kapronsav-etilén-diamin 11 szénatomból áll és 4 N atomból, maximális hossz 17,6 A. Mivel 19 különböző aminosavat használunk mind az öt random kapcsolási lépésben, a peptidek elméleti száma 195, azaz 2 476 099 egyedi pentapeptid ebben a könyvtárban.
Amint azt korábban említettük, a módszer általános sémája az, hogy random peptideknek egy nagy könyvtárát szintetizáljuk meg különálló szilárd fázisú gyantagyöngyökön, oly módon, hogy minden egyes gyöngy egyetlen peptidfajtát tartalmaz. Egy különálló gyantagyöngy, amely kölcsönhatásba lép egy akceptormolekulával, ezután azonosítható, fizikailag izolálható, majd a peptidligand aminosavszekvenciáját Edman-degradációval meghatározzuk. A módszer sikeréhez arra van szükség, hogy egy peptidszekvenciát pontosan azonosítani lehessen egyetlen gyöngyön. Egy automata fehérjeszekve25
HU 218 007 Β nátor használatával (Model 477A-01 Pulsed Liquid Automatic Protein/Peptide Sequencer, Applied Biosystems, Foster City, Califomia) 50-500 pmol peptidet lehet rutinszerűen kinyerni az egyes gyanta-gyöngyökről. Továbbá a szekvenciaadatok előzetes elemzése [MiMarch et al., „Peptides: Chemistry, Structure and Biology”, Proceedings of the Eleventh American Peptide Symposium, 1988. július 9-14., La Jolla, Ca, ESCOM, Leiden, 229-230. (1988)] azt mutatta, hogy a szilárd fázisú szintézis kapcsolási hatásfoka 98%-nál magasabb.
Peptidligandumok specifikus azonosítása és szelekciója a könyvtárból
Egy specifikus peptid azonosítását és szelekcióját a random könyvtárból könnyen végrehajthatjuk immunológiai módszerek alkalmazásával, például enzimhez kötött immunszorbens vizsgálattal (ELISA), immunfluoreszcenciával vagy immunmágneses gyöngyökkel. Az alábbiakban ismertetett kísérletekben immunhisztokémiai módszereket alkalmaztunk a kimutatásra. Az ebben a vizsgálatban tanulmányozott, specifikusan kötődő akceptormolekulák a következők:
i) a biotinkötő sztreptavidinfehérje;
ii) egy anti-P-endorfin monoklonális antitest (Mab).
A fúziós fonalas fágepitópkönyvtár-rendszer alkalmazásával [Cvirla et al., Devlin et al., 2. szekció, i. m.), a peptidligandumokat sikeresen azonosítottuk mindkét akceptormolekulára.
Az immunhisztokémiai technikákat a sztreptavidint kötő gyöngyök kimutatására használtuk. A peptidgyöngyök random könyvtárát óvatosan összekevertük növekvő mennyiségű, kétszer desztillált vízzel, hogy a DMFet kihígítsuk. Ezt követően a gyöngyöket alaposan mossuk PBS-sel, majd zselatint használunk (0,1 tömeg/térfogat%) bármely aspecifikus kötődés blokkolására. A sztreptavidin-alkalikus foszfatáz 1:200 000-es hígítását (Pierce, Rockford) adjuk ezután a gyöngyökhöz, majd egy óra hosszat óvatosan kevertetjük. A gyöngyöket alaposan mossuk, majd a standard szubsztrátot, az 5-bróm-4-klór-3-indolil-foszfát/nitroblue-tetrazóliumot (BCIP/NBT) adjuk hozzá. A gyöngyöket a szubsztrát oldattal együtt 15 polisztirol Petri-csészébe visszük át (100x20 mm), és a reakciót további két óra hosszat folytatjuk. A megkötött sztreptavidin-alkalikus foszfatázt tartalmazó gyöngyök sötétkékek lettek, míg a könyvtárban levő gyöngyök többsége színtelen maradt.
A peptidligandum affinitásmeghatározása
Az anti-P-endorfin monoklonális antitest peptidligandkötő affinitását oldatfázisban határoztuk meg. Az anti-P-endorfín-kötési assay 5,0 nmol/1 [3H][Leu]enkefalin (specifikus aktivitása=39,0 Ci/mmol, New England Nuclear Boston, MA) peptidligand gátlást mért 125-200 ng/ml anti-P-endorfin Mab-hoz kötődve, 1 ml 40 mmol/1 Tris-HCl, 150 mmol/1 NaCl pH=7,4 pufferben, amely 1,0 mg/ml szarvasmarhaszérum-albumint, 0,1 térfogat/térfogat% Tween 20-at és 0,05 tömeg/térfogat% nátrium-azidot tartalmazott. A specifikus kötődést úgy határozzuk meg, mint azt a különbséget, amely 1,0 pmol/l jelzetlen [Leujenkefalin jelenlétében, illetve távollétében mérhető. A kötött radioligandumot 10szeres fölöslegben hozzáadott Protein-G Sepharose-zal (Pharmacia) csapjuk ki, majd éjszakán át inkubáljuk (23-24 °C). A Protein-G Sepharose-t centrifugálással nyerjük ki (13 000 xg, 5 perc), majd az üledéket 250 pl 5 térfogat/térfogat% ecetsavban szuszpendáljuk, mielőtt a folyadékszcintillációs számláláshoz alkalmas edényekbe visszük át. A K(1-értékeket (n=3) telítési elemzéssel határozzuk meg, 5 radioligandkoncentrációt használva (1,87-30 nmol/1) a [3H][Leu]enkefalinból, minden egyes esetben dupla teljes és aspecifikus kötési mintákat alkalmazva. A mért átlagos K^-érték 9,79±4,63 nM. A peptidligandum-gátlási görbéket a peptid nyolc koncentrációjára állítjuk elő, egy 400-as koncentrációtartományban. A telítési és gátlási vizsgálatok kötési adatait súlyozott nemlineáris regressziós módszerekkel elemeztük, a megfelelő egyhelyes modellek alkalmazásával [Knapp et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 255., 1278-1282. (1990)]. A gátlási konstansok Kj-értékeit Cheng és Prusoff módszerével számítottuk ki [Biochem. Pharmacol., 22., 3099-3102. (1973)]. Mindegyik Kj-értéket három vagy négy független meghatározásból állapítottuk meg.
Eredmények
Egy nagy szintetikus random peptidkönyvtárat (X-X-X-X-X-gyanta, amelyben X jelentése a 19 általános aminosav - a cisztein kivételével - összesen 195=2 476 099 permutáció) vizsgáltunk át. Körülbelül kétmillió gyöngy volt jelen az átvizsgált könyvtárrészben. Egy első lépcsős vizsgálatban, amelyet csak sztreptavidin-alkalikus foszfatázzal végeztünk körülbelül 75 gyöngyöt találtunk különböző színintenzitással megfestve, ezeket fizikailag kiválogattuk és eltávolítottuk egy boncolómikroszkóp alatt, egy mikromanipulátor segítségével. Ezután mindegyik gyöngyöt 8 mol/1 guanidin-hidrokloriddal mostuk, hogy a megkötött sztreptavidin-enzim konjugátumot eltávolitsuk. Ezt követően az egyes gyöngyöket egyenként egy Applied Biosystems Protein Sequencer (ABI) tartó üvegszűrőjére tesszük. A 28-as és a 75-ös gyöngy szekvenciáját az 1. táblázatban láthatjuk. Mindegyik gyöngy konszenzusszekvenciát tartalmaz, vagy a HPQ-t, vagy a HPM-et. Az 5. ábrán látható mikrofotográfia azt mutatja, hogy milyen könnyen megkülönböztethető egy pozitív (sötétkék) gyöngy több ezer negatív (színtelen) gyöngy között, a peptidligandkönyvtár átvizsgálása közben.
1. táblázat
Az egyes, sztreptavidinnel reagáló peptidszekvenciák3
HPQFV (b0,8, '1120) | GHPQG (0,44, 250) | PLHPQ (2,5,48) |
HPQGP (0,35, 60) | MYHPQ | AIHPQ |
HPQAG (1,5, 53) | REHPQ (0,56, 112) | AAHPQ (0,9, 476) |
LHPQF (0,47, 286) | IQHPQ (1,8,192) | dTPHPQ (0,158) |
FHPQG (0,23, 72) | GNHPQ (0, 222) | WNHPM (2,5, 59) |
GHPQN (0,5, 44) | TVHPQ (0, 96) | WTHPM (1,4,202) |
HU 218 007 Β
1. táblázat (folytatás)
THPQN (0,5, 44) | IGHPQ | VHPMA(0,6,21) |
QHPQG (2,3, 60) | WMHPQ (2,7, 257) | dMHPMA (0,31, 140) |
IHPQG (2,1,57) | GAHPQ |
1 Ezeket a szekvenciákat úgy azonosítottuk, hogy 2 476 099 (195) pepiidből álló könyvtárat vizsgáltunk át.
b A zárójelben levő első szám az Edman-degradáció 5. ciklusában a „prcvicw” százalékát mutatja (azaz azt, hogy mennyi a 4. ciklusban az 5. csoport mcnnyiscgc/az 5. csoport mennyisége az 5. ciklusban). c A zárójelben levő második szám azt mutatja, hogy a szekvenálás során hány pmol peptidet nyertünk ki.
d Két TPHPQ és két MHPMA szekvenciát azonosítottunk; más ismétlődést nem találtunk.
Annak igazolására, hogy a HPQ konszenzusszekvencia aktuálisan kötődik a biotinkötő helyhez a sztreptavidinmolekulában, LHPQF-P-Ala-amino-kapronsavetilén-diamin-gyantát (LHPQF gyantát) szintetizáltunk. Az LHPQF gyantát ezután sztreptavidin-alkalikus foszfatázzal keverjük össze különböző koncentrációjú biotin jelenlétében. Az eredmények a 6. ábrán láthatók. A biotin 100 nmol/1 koncentrációban teljesen blokkolta az LHPQF gyanta festődését. 10 és 1,0 nmol/1 koncentrációban a biotin részlegesen gátolta a festődést, míg 0,1 nmol/1 koncentrációban nem volt hatással az LHPQF gyanta sztreptavidin-alkalikus foszfatázzal való festődésére. A gátlási vizsgálat megállapítása szerint a HPQ konszenzusszekvencia a sztreptavidin biotinkötő helyéhez kötődik.
Mielőtt ugyanezt a random peptidkönyvtárat hasz5 nálnánk az anti-b-endorfin Mab átvizsgálására, az öszszes, csak sztreptavidin-alkalikus foszfatázzal kékre festődött gyöngyöt eltávolítjuk. A megmaradó gyöngyöket azután 8 mol/1 guanidin-hidrokloriddal kezeljük, hogy minden megkötött fehérjét eltávolítsunk.
Ezt a regenerált könyvtárat keverjük el biotinilezett anti-P-endorfin Mab-bal (anti-P-endorfin, 3-E7 klón, kereskedelmi forgalomban beszerezhető a Boehringer Mannheimtől, Indianapolis, Indiana), és 16 óra hosszat hagyjuk együtt állni. Alapos mosás után egy második lé15 pést használunk sztreptavidin-alkalikus foszfatázzal, hogy az ELISA-reakcióhoz beindítsuk a festési reakciót. Ebben a vizsgálatban hat, konszenzusszekvenciával rendelkező peptidet izoláltunk, amelyek erősen hasonlítanak a natív ligandumra, a Leu-enkefalinra (YGFL): YGGMV,
YGALQ, YGGLS, YGGFA, YGGFT és YGGFQ. Ezeknek a ligandumoknak a különböző C-terminálisú peptidanalógjait megszintetizáltuk, és affinitásukat (K,) meghatároztuk [3H]Leu-enkefalin használatával (New England Nuclear, Boston, Massachusetts), amely vizsgálatban a jelzett ligandum és a jelzetlen ligandumok versengtek egymással (anti-P-endorfin-vizsgálat. Ezeknek a vizsgálatoknak az eredményeit a 2. táblázatban foglaljuk össze.
2. táblázat
A peptidligandumok affinitása az anti-p-endorfin monoklonális antitesthez
Peptid | ΐς,ηΜ Karboxitcrminális | |||
OH | -NH2 | -βΑ-ΟΗ | -βΑ-ΝΗ2 | |
aYGGFL | 17,5+3,2 | 27,9+2,3 | 17,1 + 1,8 | 13,7+1,7 |
YGGFA | 32,9+2,0 | 72,0+16,4 | 82,3+8,8 | 93,6+34,7 |
YGGFT | 36,9+7,7 | 65,2+16,8 | 50,6+8,9 | 43,3+2,3 |
YGGFQ | 15,0+1,7 | 40,1+6,0 | 39,4+2,3 | 45,4+11,6 |
YGGLS | 726+134 | 991+52 | 916+182 | 1150+247 |
YGGLQ | 1980+303 | 2910+695 | 1470+120 | 1910+504 |
YGGMV | 8780+1500 | 14000+1110 | 5140+885 | 7160+1010 |
a YGGL a [Leu5]enkefalin, az anti-p-endorfin Mab natív liganduma.
Megbeszélés
Az a képesség, hogy egyes peptideket külön gyöngyök felszínére kötve tudunk szintetizálni, kombinálva egy érzékeny és specifikus módszerrel és szelekciós 50 rendszerrel, a kulcsa a jelen találmány szerinti módszernek. Ezt az új eljárást hívják „szelektid eljárásnak”.
A könyvtárból kiválasztott és 8 mol/1 guanidin-hidrokloriddal kezelt egyes peptidgyöngyöt alaposan megtisztítjuk (a megkötött fehérje eltávolítására), eközben 55 a peptid kovalens kötéssel a gyantához kötve marad, és készen áll a szekvenálásra. A jelenlegi technikai színvonalú automata peptidszekvenátorok egy peptidet 5 10 pmol mennyiségben is képesek megszekvenálni. Emellett a gyöngyökhöz irreverzíbilisen kötődő kék fes- 60 ték nem zavarja a szekvenálást. A randomizáció egyes kapcsolási ciklusaiban minden erőfeszítést meg kell tenni, hogy a szintetikus módszert optimalizáljuk, beleértve az N“-Fmoc-aminosavak nagy fölöslegben való alkalmazását. A szekvenciaadatok előzetes vizsgálata tisztán igazolja, hogy a szintetikus kémiai reakciók kapcsolási hatásfoka meghaladja a 98%-ot.
Mivel a megfestett gyöngyök feltűnően látszanak a színtelen gyöngyök hátterében (lásd például a 7. ábrát), ezert az szinte erőfeszítés nélkül megtehető, hogy vizuálisan átvizsgáljunk kétmillió gyöngyöt egy boncolómikroszkóp alatt 10-15 Petri-csészébe szétosztva, és kiválaszthatjuk a reagáló gyöngyöket a szekvenáláshoz. Emellett megbecsülhetjük a különböző ligandumok relatív affini27
HU 218 007 Β tását oly módon is, hogy az egyes pozitív gyöngyök relatív festődési intenzitását vizsgáljuk. Ez a jelenség lehetővé teszi számunkra, hogy a szekvenáláshoz specifikus színintenzitással rendelkező gyöngyöket válasszunk.
Devlin és munkatársai [Science, 259., 404-406. (1990); 2-es szekció] leírták a HPQ, HPM és HPN szekvenciák fontosságát az általyuk fúziósfonalasfág-technikával izolált 20 sztreptavidinkötő ligandumokban. A 20 izolátumuk közül 15-nek HPQ, 4-nek HPM és 1nek HPN szekvenciája volt. Érdekes, hogy a peptidkönyvtárból 28 különböző peptidet lehetett izolálni, ezek közül 23-nak volt HPQ konszenzusszekvenciája és 5-nek volt HPM konszenzusszekvenciája (1. táblázat). Úgy tűnik, hogy a HPQ/HPM szekvencia pozíciója a pentapeptidben nem lényeges a sztreptavidinkötés szempontjából. Az összes azonosított HPQ vagy HPM pentapeptidszekvencia közül csak kettő volt ismétlődő (TPHPQ és MHPMA). Ez éles ellentétben van azokkal az adatokkal, amelyet Devlin és munkatársai (i. m.) írtak le, ahol is többszörös ismétlődés is található a 20 izolátumukban, jelezve ezzel, hogy szelekciós probléma volt a bioszintetikus módszereikben.
Az anti-P-endorfin-rendszerben 6, a natív YGGFL ligandumhoz nagyon hasonló peptidet azonosítottunk (2. táblázat). Ezek az eredmények hasonlítanak arra, amiket a fúziós fonalas fágos módszerrel kaptunk, amelyben ugyanazt a monoklonális antitestet használták (3-E7 klón) [Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87., 6378-6382. (1990)]. Jóllehet a peptidkönyvtárból kevesebb ligandumszekvenciát kaptunk, mint Cwirla és munkatársai, a kapott ligandumok 50%-ának sokkal nagyobb volt az affinitása az antitesthez, mint a fágtechnikával kiválasztott ligandumoknak.
6. példa
Egy korlátozott peptidkönyvtár
Egy másik kísérletsorozatban a jelen találmány szerinti eljárást egy másik antitestrendszerben vizsgáltuk meg, amelyben az epitóp a peptidlánc közepén található, és nem az N-terminálison (mint például a β-endorfin esetében). A használt antitest egy anti-v-mos peptid monoklonális antitest (anti-v-mos Mab) (lásd a 11.1. szekciót). Ezt az antitestet úgy lehet előállítani, hogy egereket egy 12 aminosavból álló pepiiddel immunizálunk (LGSGGFGSVYKA), ami megfelel a v-mos onkogén termék 100-111-es csoportjainak. A peptidet immunizálás előtt egy hordozófehérjéhez kapcsoljuk. Az ELISA-vizsgálatban ez az anti-v-mos Mab homológ szekvenciákat mutat ki a v-mos, MOS, neu/HER-1 és HER-2 géntermékekben.
Anyagok és módszerek
Egy kereskedelmi forgalomban levő, többtűs rendszerű [Geysen et al., Mól. Immunoi. 23., 709-715. (1986)] epitóp-térképező kitet (Cambridge Research Biochemical, Boston) használunk átfedőpeptidek szintetizálására (tetrapeptid-, pentapeptid- és hexapeptidcsoportok), a 12 aminosavból álló v-mos pepiidben az antiv-mos Mab-bal felismert epitóp a pentapeptidszekvenciára térképezhető (FGSVY) (azaz a v-mos dodekapeptid 6- 10-es csoportjaira).
Ebben a kísérletben egy korlátozott random könyvtárat használtunk, amelyből a v-mos epitópban jelen levő valint és szerint szándékosan kihagytuk. Ennek a korlátozott random könyvtárnak a szekvenciája az alábbi: G-X-X-X-X-X-β-Ala-amino-kapronsavetilén-diamin-gyanta, amelyben X jelentése Glu, Pro, Asn Phe, His, Thr, Lys, Leu, Gly Tyr, Alá Met, Arg és Trp. Ezt a 14-et úgy választottuk meg, hogy mind a valint, mind a szerint kihagytuk belőle, mégis az összes oldallánc funkciós csoport megtalálható bennük, azaz
i) az Asn-t választottuk, nem a Gln-t;
ii) a Glu-t választottuk, nem az Asp-t;
iii) a Thr-t választottuk, nem a Ser-t;
iv) a Leu-t választottuk, nem az Ile-t vagy a Val-t;
v) a Met-t választottuk, nem a Cys-t.
Mivel mind az öt kapcsolási lépésben 14 aminosavat használtunk, a peptidek elméleti száma 145, azaz 537 824.
Az anti-v-mos monoklonális antitestet termelő antiv-mos hibridómát a Microbiological Associatestől, Inc. vásároltuk (Maryland) (Hybridoma No. 165-28E7, SCRF 354., Lót No. 165-119.).
Az anti-v-mos mAb peptidligand affinitását oldatfázisú kapcsolódási vizsgálatokban határoztuk meg, [3H]acetil-v-mos-peptidet ([3]Ac-v-mos) használva radioaktív ligandumként. A radioaktív ligandumot a vmos peptid N-terminális acetilezésével állítjuk elő, mielőtt az oldalláncok védőcsoportjait eltávolítjuk, ekvimoláris mennyiségű [3H]nátrium-acetáttal (specifikus aktivitása=2,52 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA). A [3]Ac-v-mos terméknek, amelyet a reagálatlan v-mos pepiidtől fordított fázisú HPLC-vel választunk el, a specifikus aktivitása 2,50 Ci/mmol. A [3H]Ac-vmos-nak az anti-v-mos Mab-hoz (körülbelül 10 pg/ml) való affinitását 1,0 ml PBS-zselatin pufferben mérjük (0,05 zselatin PBS-ben) 23-24 °C-on, háromórás inkubálás után. A specifikus kötődést úgy határozzuk meg, mint azt a különbséget, ami a [3H]Ac-v-mos-nak 100 pmol v-mos jelzetlen peptid jelenlétében (aspecifikus), illetve távollétében való kötődésében tapasztalható, minden egyes [3H]Ac-v-mos-koncentrációban. A megkötött radioaktív ligandumot centrifugálással választjuk el, 10-szeres felesleget alkalmazva (a használt immunglobulin kötési kapacitásához viszonyítva) a Protein-G Sepharose-ból (Pharmacia) az antitest kicsapására. Az öt meghatározásból számított (125-5000 nM koncentrációtartományban) telítési kötési elemzés azt mutatta, hogy a [3H]Ac-v-mos az antiv-mos mAb-hoz 850±160 nM Kd-értékkel kötődik. A peptid-ligandumok kötési affinitását kötést gátló vizsgálatokkal határoztuk meg, hét peptidligandumkoncentrációt használva 10 pg/ml anti-v-mos MAb-ért versengve 20 nM [3]Ac-v-mos-sal, az előzőekben leírt körülmények között. A teljes kötődésnek több mint 50%-a specifikus volt a gátlási vizsgálatokban. A telítési és gátlási kötődési konstansokat egyetlen kötési helyre határoztuk meg, nemlineáris regressziós elemzéssel [Knapp and Yamamura, Life Sci., 46., 1457-1463. (1990)].
HU 218 007 Β
Eredmények
Körülbelül 230 000 gyöngyöt vizsgáltunk át egy anti-v-mos-alkalikus foszfatáz konjugátummal. Ennélfogva a permutációknak kevesebb mint 43 százalékát vizsgáltuk át. A szubsztráttal való inkubálás után a gyöngyöknek körülbelül 50%-a intenzíven kékre festődön. Ezek közül a gyöngyök közül huszonnégyet fizikailag kiválasztottunk, és ezek közül tizenegynek az aminosavszekvenciáját is meghatároztuk. Emellett tizenhét színtelen gyöngyöt is kiválasztottunk véletlenszerűen, és megszekvenáltuk.
Az anti-v-mos ligandum szekvenálási vizsgálatainak eredménye a 3. táblázatban látható. Mivel mind a valint, mind a szerint akarattal kihagytuk ebből a peptidkönyvtárból, nem meglepő, hogy azt látjuk, hogy a 11 peptidligandum szekvenciája közül egyik sem hasonlít a natív epitópra. Jóllehet nincsenek ismétlődések a 11 peptidligandumban, szekvenciájuk mégsem véletlenszerű. Mind az arginin, mind a tirozin gyakran előfordul a szekvenciákban. Emellett legalább egy, de néhányszor két vagy több arginin van jelen ezeknek a peptidligandumoknak a második és/vagy harmadik pozíciójában. Másrészt viszont a véletlenszerűen kiválasztott negatív gyöngyök nem mutatnak semmi közös aminosavmintázatot. Jóllehet a minta mérete korlátozott, a negatív gyöngyök szekvenciáira készített illeszkedési statisztika khi-négyzet-jósága nem jelentős (x2= 18,27, df= 13, P=0,15), jelezve, hogy nincsen bizonyítékunk arra, hogy az aminosavaknak nem véletlenszerű az eloszlása a nem festődő random peptidgyöngyökön.
3. táblázat
Az anti-v-mos monoklonális antitesttel kölcsönhatásba lépő egyes gyöngyök peptidszekvenciája
A) Kölcsönhatásba lépő gyöngyök
GRRGME
GRRPYG
GRRAYE
GRREGP
GRYAKH
GRKTYY
B) Kölcsönhatásba nem lépő gyöngyök
GKELAG
GPYLMW
GTKMNF
GEKMEF
GYEEPK
GKKPNP
GEYAPP
GGFMEF
GPKFMA
GRYMPK
GFRHMA
GFRHYN
GHEYFN
GWREKE
GFEKHP
GWGAYP
GAARPP
GLFGME
GRLNTL
GMTHAY
GPYGMA
GHYNNL
A pozitív ligandumok közül néhányat megszintetizálunk, és az anti-v-mos Mab-hoz való affinitásukat oldatfázisú kötődési vizsgálatokkal határozzuk meg. Ezeknek a vizsgálatoknak az eredményét a 4. táblázatban foglaljuk össze.
A 4A. táblázat a v-mos epitóp kötési affinitásait foglalja össze (epitóp-térképezés alapján meghatározva) az anti-v-mos monoklonális antitesthez. A karboxiterminális megváltoztatásának hatása is látható. A 4B. táblá10 zat egy olyan peptidkönyvtárból származó azonosított mimotópok kötési affinitásait foglalja össze, amelyekből a v-mos epitóp néhány aminosava hiányzik. A βalanint beépítettük néhány vizsgált ligandumba, hogy annak az azonosított ligandumnak a szerkezetét utánozzuk, amelyhez az antitest a gyöngyön hozzákötődik.
4. táblázat
Peptidligandumok kötődése az anti-v-mos Mab-hoz Peptid Kj, μΜ
A) LGSGGFGSVYKA (v-mos peptid) 3,2±0,4
GFGSVY-NH2 (v-mos epitóp) 246-337
GFGSVY-OH
GFGSVY-βΑ-ΝΗ2
GFGSVY-βΑ-ΟΗ
B) GRRAYE-OH GRRAYE-NH2 GRRAYE-βΑ-ΟΗ GRRAYE-βΑ-ΝΗ2 GRRGME-OH ϋΙΗ<ΟΜΕβΑ_ΝΗ2 GRREGP-βΑ-ΝΗ2 GRRPYG-OH GRRPYG-βΑ-ΝΗ, >1000
409-442
529-770
6,79±2,31
24,70±7,00
15,l±O,5O
9,02-20,40 >100
24,00±8,40
26,90±6,20 >1000
20,50±4,50
A 4. táblázatban szereplő legjobb anti-v-mos mimotóp körülbelül 2,5-szer kisebb affinitással rendelkezik, mint a természetes peptid. Jóllehet a vizsgált peptidligandumok közül egyiknek sem volt olyan alacsony a Kj-értéke, mint a természetes v-mos ligandumnak, az eredmények tisztán azt mutatják, hogy ha egy olyan random könyvtárat használunk, amelyből néhány a természetes epitópban található aminosav hiányzik, akkor egy sorozat, szerkezetileg különböző mimotópot azonosíthatunk, amelyeknek affinitásuk van az akceptormolekulához, azaz az anti-v-mos Mab-hoz.
Megbeszélés
Az ebben a vizsgálatban használt anti-v-mos Mab viszonylag kis affinitással rendelkezik a v-mos pepiidhez (az immunogénhez). A szerin és a valin kimutatható a v-mos lineáris epitópban (FGSVY), de szándékosan kihagytuk ezeket a használt szűrő könyvtárból; mindezek ellenére a módszer lehetővé tette egy teljesen eltérő szekvenciájú és aminosav-összetételű lineáris mimotóp azonosítását, amely ennek ellenére összemérhető affinitással rendelkezik az antitesthez. Ez világosan illusztrálja a makromolekula-peptid kölcsönhatások komplexitását és változékonyságát.
7. példa
Egy szelektíven hasítható linker: ONb
Egy négy pepiidből álló csoportot készítettünk, amely az UV-val hasítható ONb linkért is tartalmazza majd levizsgáltuk a csoportot.
Anyagok és módszerek
Az alábbi négy pepiidet állítottuk elő két gyantán, standard szilárd fázisú szintetikus módszerek alkalmazásával.
i) Fmoc-Trp-Tyr(OBu’)-Phe-O;Yh-fiAlaACA-EDA-PepSyn K
HU 218 007 Β ii) TRP-Tyr-Phe-CWó-PAla-ACA-EDAPepSyn K iii) Fmoc-Trp-TyríOBuO-Phe-CWb-pAlaACA-4-MBHA iv) Trp-Tyr-Phe-OA7?-[3Ala-ACA-4-MBHA
Mindegyik peptidet 1-3 óra hosszat sugároztuk be ultraibolya (UV) és látható (VIS) fénnyel 0,3 ml vízben, vagy klór-etán-diklór-metán 3:7 arányú elegyében. Összesen 16+16 kísérletet végeztünk és értékeltünk ki.
Az expozíció után a felülúszókat kiszűrjük, liofilezzük, majd újra oldjuk azonos térfogatú MeOH-ban (0,3 ml). A termékeket HPLC-vel elemezzük.
Eredmények
A HPLC-elemzés világosan megmutatta, hogy nincs tripeptidfelszabadulás vízben VIS-besugárzás hatására, és majdnem teljes a tripeptidfelszabadulás egy óra alatt UV-besugárzás hatására.
Pontosabban, az i) peptid vízben egyetlen termékre hasadt. Néhány esetben két termék figyelhető meg a HPLC-oszlopról való eluálás közben. Hosszabb expozíciós idők esetében (UV), a két termék egymásba való át alakulása figyelhető meg, legalább néhány esetben.
Megbeszélés
Az UV-érzékeny linker tisztán működik, felszabadítja a peptidet vizes oldatban. Az egyórás expozíciós idő elegendő ahhoz, hogy inkomplett peptidfelszabadulást kapjunk. Az eredmények azt is mutatják, hogy a poliamidgyanta stabil és kompatibilis a vizes rendszerben.
8. példa
Egy enzimutánzó azonosítása
Anyagok és módszerek
A jelen találmány szerinti eljárással egy pentapeptideket tartalmazó random könyvtárat állítunk elő, amelynek a készítéséhez a 20 közönséges aminosavat (cisztein kivételével) használtuk fel (lásd a 10.1. szekciót).
A peptidkönyvtárat a nitro blue tetrazolium (NBT)klorid kromogén szubsztráttal hoztuk kölcsönhatásba exogén enzim távollétében, olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik a termékképződést, és pozitívan reagáló gyöngyöket azonosítottunk. Ezeket a gyöngyöket kiválasztottuk és szekvenáltuk.
Eredmények
Azoknak a gyöngyöknek a szekvenciáit, amelyek katalizálták az NBT redukcióját a mélykék diformazántermékké, az 5. táblázatban mutatjuk be.
5. táblázat
Azoknak a peptidgyöngyöknek a szekvenciája, amelyek enzimként működnek
PNNNH
WNNNM
PNNNG
MNNNR
QNNNR
Megbeszélés
Az előbbi eredmények azt sugallják, hogy a PNNNH peptid képes az NBT-t mélykék diformazántermékké katalizálni vagy kémiailag, vagy enzimatikusan. Akárhogyan is, a peptid vagy a peptidgyöngy „mesterséges enzim” vagy enzimaktivitást utánzó anyag.
9. példa
Egy rákellenes peptidszekvencia keresése
Egy korlátozott könyvtárat állítunk elő, amelyben olyan pentapeptidek találhatók, amelyek tirozint tartalmaznak, ezt követi egy random szekvencia, amely öt aminosavból áll. Ezt az öt aminosavat az alábbi csoportból választjuk: glutaminsav, szerin, valin, glicin, arginin és aszparagin. Ez a korlátozott könyvtár rákellenes(azaz tumorellenes) sejtvonal-aktivitással rendelkező peptidszekvenciákat tartalmaz.
Anyagok és módszerek
A jelen találmány szerinti random peptidkönyvtárat egy hidrolizálható diketopiperazin-linkerrel szintetizáltuk meg. 96 lyukas lemezeket használtunk a rákellenes (tumorellenes) hatóanyagok keresésében.
Az oldalláncvédő csoportok és az N“-Fmoc-csoport eltávolítása után a peptidkönyvtárat DIEA-val (diizopropil-etil-amin) semlegesítettük, majd alaposan mostuk DMF-fel, hogy minden potenciálisan toxikus kémiai anyagot eltávolítsunk. A könyvtárat ezután lépcsőzetesen 0,01 mol/1 sósavba visszük át (olyan körülmény, amelynél a linker stabil), majd végül 0,001 mol/1 sósavval mossuk. Ezután a könyvtárból körülbelül 10 gyöngyöt viszünk az egyes lyukakba a lemezeken. 50 μΐ RPMI táptalajt (25 mmol/1 HEPES pufferben) adunk ezután mindegyik lyukhoz, hogy a pH-t semlegesre állítsuk. Semleges vagy enyhén lúgos pH-nál a peptidek felszabadulnak (például 16-24 óra alatt).
Ezután vagy a teljes mennyiségű táptalajt visszük át egy másik lemezre, amely egy specifikus sejtvonalat tartalmaz, vagy a rákos sejtvonalat adjuk közvetlenül a gyöngyöket tartalmazó lyukakhoz. Körülbelül 2500 tüdőráksejtet használunk lyukanként. A lemezeket ezután 7 napig inkubáljuk 37 °C-on, és MTT-elemzést végzünk, hogy meghatározzuk az egyes lyukakban felszabaduló peptidek relatív citotoxicitását.
A vizsgálathoz különböző állandó humán karcinóma-, limfóma-, mielóma- valamint leukémia-sejtvonal használható. Példák erre az NCI paneltumorok: L1210 limfoid leukémia; B16 melanóma; Lewis-tüdőkarcinóma; M5076 szarkóma; vastagbél 38 karcinóma és MX-1 emlőrák. Más példa lehet: MCF-7 emlőrák, 8226 mielóma-sejtvonal; P388 (egér) leukémia sejtvonal; és a Hawkins-, nem kis sejtes tüdőráksejtvonal.
Eredmények
Átvizsgálunk egy könyvtárat, amely körülbelül 8000 YXXXXX-[gyöngy] szekvenciájú peptidet tartalmaz, amelyben Y jelentése Tyr, X jelentése pedig Glu, Ser, Val, Gly, Arg vagy Asn. Két kísérletben, 3-4 olyan felülúszóról, amely néhány ezer gyöngyből származik, kiderült hogy a Hawkins-féle, nem kissejtes tüdőrák növekedését gátolta. Mivel minden egyes lyuk körülbelül tíz gyöngyöt tartalmazott, ezért lényegében mind a 8000 lehetséges szekvenciát levizsgáltuk, és 3 aktív gyöngyöt azonosítottunk. Ugyanezt a típusú eredményt kaptuk, amikor a gyöngyöket közvetlenül inkubáltuk a
HU 218 007 Β sejtekkel, és amikor a felszabadult peptidfelülúszót vittük át a sejtekre.
Megbeszélés
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy egy korlátozott peptidkönyvtár tartalmazhat néhány, citotoxikus aktivitással rendelkező peptidet. Az előző példában a lehetséges szekvenciáknak körülbelül 0,05%-a mutatott rákellenes aktivitást. A felszabadult peptideket tartalmazó felülúszókat több vizsgálatban elemezve, más ráksejtekkel és normál sejtekkel szemben mutatott aktivitás határozható meg.
Ily módon olyan sejtek azonosíthatók, amelyek ráksejtekkel szemben széles toxicitással rendelkeznek, vagy egy specifikus tumorsejttel szemben rendelkeznek toxicitással; azokat a szekvenciákat, amelyek normál sejtekkel szemben alacsony toxicitással rendelkeznek, előnyös terápiás ágenseknek tekintjük. Ez a módszer használható antimikrobiális, antiparazita és növekedésifaktor-antagonista ágensek kiszűrésére.
Hasonló közelítés használható egy növekedésifaktor-agonista kiszűrésére, amelynek során egy növekedési faktor dependens sejtvonalat használunk. Egy ilyen vizsgálatban a növekedésifaktoragonista-aktivitással rendelkező peptidszekvenciák a lényeges növekedési faktor távollétében tenyésztett sejtek növekedését serkentik.
A jelen találmány oltalmi köre nem korlátozható a leírt specifikus megvalósítási módokra. Valójában a találmány különböző módosításai a szakterületen jártas szakemberek számára nyilvánvalók a leírásból és a mellékelt ábrákból. Az ilyen módosítások a mellékelt igénypontok oltalmi körébe tartoznak.
Különböző publikációkat idéztünk, ezek leírása teljes egészében referenciaként szolgál.
Claims (44)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás biológiailag aktív biooligomer-könyvtár létrehozására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket hajtjuk végre:i) a biooligomerek előállítása céljából egy szilárd fázisú hordozónak legalább a különböző, hozzáadandó biooligomer-alegységek számával megegyező, de legalább két alikvot részét állítjuk elő, ii) az alegységek egy készletét külön-külön érintkezésbe hozzuk a szilárd fázisú hordozó alikvot részeivel, oly módon, hogy egy alegységet juttatunk be mindegyik alikvot részbe, iii) az alegységeket kvantitatíve hozzákapcsoljuk a szilárd fázisú hordozó lényegében összes kötőhelyéhez, és így egy szilárd fázisú hordozó/új alegység kombináció alikvot részeit összekeverjük, iv) meggyőződünk a kapcsolási reakció teljes lejátszódásáról, és ha szükséges, akkor a reakciót a teljes lejátszódásig erőltetjük,v) a szilárd fázisú hordozó/új alegység kombináció alikvot részeit alaposan összekeverjük; majd az i)-v) lépések szükséges számú ismétlése után, egy végső lépésben vi) eltávolítjuk a védőcsoportokat oly módon, hogy mindegyik, a védelem alól feloldott biooligomer a szilárd fázisú hordozóhoz kapcsolva marad.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szilárd fázisú hordozóként polidimetil-akrilamidot alkalmazunk.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szilárd fázisú hordozóként polisztirolgyantát, poliamidgyantát, polietilénglikollal ojtott polisztirolgyantát vagy polidimetil-akrilamid-gyantát alkalmazunk.
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szilárd fázisú hordozóként szilikagélt alkalmazunk.
- 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szilárd fázisú hordozó egy linkért is tartalmaz.
- 6. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szilárd fázisú hordozó linkerként amino-vajsavat, amino-kapronsavat, 7-amino-heptánsavat, etilénglikolt vagy 8-amino-kapronsavat tartalmaz.
- 7. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szilárd fázisú hordozó linkerként amino-kapronsavat tartalmaz.
- 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a random biooligomer-könyvtárat oly módon állítjuk elő, hogy legalább az egyik lépésben ugyanazt az alegységet kapcsoljuk az összes szilárd fázisú hordozóhoz, és legalább egy másik lépésben legalább két alegységet kapcsolunk egymástól függetlenül a szilárd fázisú hordozó legalább két alikvot részéhez.
- 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az i)-v) lépéseket egyszer hajtjuk végre.
- 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az i)-v) lépéseket egynél többször hajtjuk végre.
- 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biooligomerek védelem alól feloldott peptidek.
- 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biooligomerek védelem alól feloldott oligonukleotidok.
- 13. Eljárás egy akceptor molekulához tartozó biooligomerligandum szekvenciájának meghatározására, azzal jellemezve, hogy a következő lépéseket hajtjuk végre:a) egy biooligomer-könyvtárhoz, amely számos, biológiailag aktív, védelem alól feloldott biooligomerfajtát, ahol minden egyes biooligomerfajta különböző biooligomeralegység-szekvenciával rendelkezik, valamint számos szilárd fázisú hordozót tartalmaz, amelyek alaposan összekeverhetek, és a biooligomerek kémiai szintézisének reakciókörülményei közötti alkalmazásra megfelelőek, amely reakció során egy bizonyos, védelem alól feloldott, egy bizonyos alegységszekvenciával rendelkező biooligomerfajtát minden egyes szilárd fázisú hordozóhoz hozzákapcsolunk, ezzel szilárd fázisú hordozó/biooligomer kombinációkat képezve; egy számunkra érdekes akceptor molekulával hozunk érintkezésbe, oly módon, hogy az említett akceptor molekula felismeri és kötődik a könyvtárban lévőHU 218 007 Β egy vagy több szilárd fázisú hordozó/biooligomer fajtához,b) izoláljuk azt a szilárd fázisú hordozó/biooligomer fajtát, amely kötődést mutat az akceptormolekulához, ésc) meghatározzuk a b) lépésben izolált szilárd fázisú hordozó/biooligomer fajtán található biooligomer szekvenciáját.
- 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy akceptormolekulaként antitesteket, receptorokat, vírusokat, baktériumokat, fehérjéket, szénhidrátokat, nukleinsavakat, lipideket, drogokat vagy fémeket alkalmazunk.
- 15. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy akceptormolekulaként antitestet alkalmazunk.
- 16. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy akceptormolekulaként receptort alkalmazunk.
- 17. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy biooligomerekként védelem alól feloldott peptideket alkalmazunk.
- 18. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alegységekként glicint, L-aminosavakat, Daminosavakat, 1,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-3-karboxilátot, (2S,3S)-metil-fenilalanint, (2R,3S)-metil-fenilalanint, (2S,3R)-metil-fenilalanint, (2R,3R)-metil-fenilalanint, 2-amino-tetrahidronaftalin-2-karbonsavat, hidroxi-1,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-3-karboxilátot, β-karbolint (D és L), hisztidin-izokinolin-karbonsavat, hisztidin ciklusos karbamidot vagy peptidomimetikumokat - azaz olyan molekulákat, amelyek szerkezeti és kémiai tulajdonságaikat tekintve egy, kettő vagy több aminosavból álló pepiidre hasonlítanak - alkalmazunk.
- 19. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a peptidek legalább két, keresztkötések létrehozására képes aminosavat tartalmaznak.
- 20. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy biooligomerekként védelem alól feloldott peptideket alkalmazunk.
- 21. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alegységként ribonukleotidokat, dezoxiribonukleotidokat vagy nukleotidszármazékokat alkalmazunk.
- 22. Eljárás egy biológiailag aktív biooligomerligandum szekvenciájának meghatározására, azzal jellemezve, hogy a következő lépéseket hajtjuk végre:a) egy biooligomer-könyvtár egy részét, amely számos biológiailag aktív, védelem alól feloldott biooligomerfajtát, ahol minden egyes biooligomerfajta különböző biooligomeralegység-szekvenciával rendelkezik, valamint számos szilárd fázisú hordozót tartalmaz, amelyek alaposan összekeverhetek, és a biooligomerek kémiai szintézisének reakciókörülményei közötti alkalmazásra megfelelőek, amely reakció során egy bizonyos, védelem alól feloldott, egy bizonyos alegységszekvenciával rendelkező biooligomerfajtát minden egyes szilárd fázisú hordozóhoz hozzákapcsolunk, ezzel szilárd fázisú hordozó/biooligomer kombinációkat képezve in situ felszabadítjuk,b) a felszabadított biooligomer biológiai aktivitását in situ kimutatjuk,c) izolálunk egy olyan szilárd fázisú hordozó/biooligomer kombinációt, amelyben a biooligomer a számunkra érdekes, a b) lépésben kimutatott biológiai aktivitással rendelkezik, ésd) meghatározzuk a c) lépésben izolált szilárd fázisú hordozón fennmaradó biooligomer szekvenciáját.
- 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szilárd fázisú hordozóként savérzékeny, bázisérzékeny, nukleofilérzékeny, fényérzékeny, elektrofilérzékeny, oxidációra érzékeny vagy redukcióra érzékeny anyagot alkalmazunk.
- 24. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, a szilárd fázisú hordozó savérzékeny, bázisérzékeny, nukleofilérzékeny, fényérzékeny, elektrofilérzékeny, oxidációra érzékeny vagy redukcióra érzékeny linkért tartalmaz.
- 25. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) in situ felszabadítást enzimatikus hasítással, kémiai hasítással vagy fotokémiai hasítással váltjuk ki.
- 26. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben megállapított biológiai aktivitás citotoxicitás, antitumoraktivitás, antibakteriális aktivitás, antivirális aktivitás, antifüngális aktivitás, antiparazitaaktivitás, növekedésifaktor-aktivitás, növekedést gátló aktivitás, hormonaktivitás, neurotranszmitteraktivitás, immunomodulátor-aktivitás vagy szabályozóaktivitás.
- 27. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben megállapított biológiai aktivitás enzimgátló aktivitás.
- 28. A 13. vagy 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy biooligomerligandumként gyógyszert alkalmazunk.
- 29. A 13. vagy 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy biooligomerligandumként diagnosztikumot alkalmazunk.
- 30. A 13. vagy 22. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy a biooligomerligandumot citotoxikus aktivitással rendelkező peptidszekvenciából hozzuk létre.
- 31. A 13. vagy 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biooligomerligandumot antitumoraktivitással rendelkező peptidszekvenciából hozzuk létre.
- 32. A 13. vagy 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biooligomerligandumot antimikrobiális aktivitással rendelkező peptidszekvenciából hozzuk létre.
- 33. A 13. vagy 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biooligomerligandumot növekedésihormonagonista-aktivitással rendelkező peptidszekvenciából hozzuk létre.
- 34. A 13. vagy 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biooligomerligandumot növekedésihormon-antagonista aktivitással rendelkező peptidszekvenciából hozzuk létre.
- 35. A 13. vagy 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biooligomerligandumot hormonagonista-aktivitással rendelkező peptidszekvenciából hozzuk létre.HU 218 007 Β
- 36. A 13. vagy 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biooligomerligandumot hormonantagonista-aktivitással rendelkező peptidszekvenciából hozzuk létre.
- 37. A 13. vagy 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biooligomerligandumot eritropoietinagonista-aktivitással rendelkező peptidszekvenciából hozzuk létre.
- 38. A 13. vagy 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biooligomerligandumot citotoxikus aktivitással rendelkező oligonukleotid-szekvenciából hozzuk létre.
- 39. A 13. vagy 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biooligomerligandumot antitumoraktivitással rendelkező oligonukleotid-szekvenciából hozzuk létre.
- 40. A 13. vagy 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biooligomerligandumot antimikrobiális aktivitással rendelkező oligonukleotid-szekvenciából hozzuk létre.
- 41. A 13. vagy 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biooligomerligandumot immunogénaktivitással rendelkező oligonukleotid-szekvenciából hozzuk létre.
- 42. Eljárás egy enzimreakciót katalizáló biooligomerligandum szekvenciájának meghatározására, azzal jellemezve, hogy a következő lépéseket hajtjuk végre:a) egy biooligomer-könyvtárhoz, amely számos, biológiailag aktív, védelem alól feloldott biooligomerfajtát, ahol minden egyes biooligomerfajta különböző biooligomeralegység-szekvenciával rendelkezik, valamint számos szilárd fázisú hordozót tartalmaz, amelyek alaposan összekeverhetők, és a biooligomerek kémiai szintézisének reakciókörülményei közötti alkalmazásra megfelelőek, amely reakció során egy bizonyos, védelem alól feloldott, egy bizonyos alegység-szekvenciával rendelkező biooligomerfajtát minden egyes szilárd fázisú hordozóhoz hozzákapcsolunk, ezzel szilárd fázisú hordozó/biooligomer kombinációkat képezve egy szubsztrátot adunk, oly módon, hogy a könyvtárban található szilárd fázisú hordozók közül egy vagy több által katalizált enzimatikus reakció egy reakcióterméke kimutatható legyen,b) izoláljuk a bizonyos reakcióterméket eredményező reakciót katalizáló szilárd fázisú hordozó/biooligomer fajtát, ésc) meghatározzuk a b) lépésben izolált szilárd fázisú hordozó/biooligomer fajtán található biooligomer szekvenciáját.
- 43. A 42. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy enzimaktivitással rendelkező biooligomerekként védelem alól feloldott peptideket alkalmazunk.
- 44. A 42. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy enzimaktivitással rendelkező biooligomerekként glicinből, nem természetes aminosavakból, természetes aminosavak D-izomerjeiből, aminosav-analógokból vagy peptidomimetikumokból álló biooligomereket alkalmazunk.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US54684590A | 1990-07-02 | 1990-07-02 | |
US07/717,454 US5650489A (en) | 1990-07-02 | 1991-06-19 | Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU9204179D0 HU9204179D0 (en) | 1993-04-28 |
HUT63576A HUT63576A (en) | 1993-09-28 |
HU218007B true HU218007B (hu) | 2000-05-28 |
Family
ID=27068387
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9204179A HU218007B (hu) | 1990-07-02 | 1991-07-01 | Eljárás random bio-oligomer könyvtár előállítására valamint, alkalmazására |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US5650489A (hu) |
EP (1) | EP0542770B1 (hu) |
JP (1) | JP3552718B2 (hu) |
KR (2) | KR100222146B1 (hu) |
AT (1) | ATE176330T1 (hu) |
AU (3) | AU659091B2 (hu) |
CA (1) | CA2086672C (hu) |
CZ (1) | CZ289365B6 (hu) |
DE (1) | DE69130828T2 (hu) |
DK (1) | DK0542770T3 (hu) |
ES (1) | ES2126572T3 (hu) |
FI (1) | FI107995B (hu) |
GR (1) | GR3029443T3 (hu) |
HU (1) | HU218007B (hu) |
IE (1) | IE912299A1 (hu) |
IL (1) | IL98682A (hu) |
MX (1) | MX9100052A (hu) |
NO (1) | NO315002B1 (hu) |
NZ (1) | NZ238805A (hu) |
PL (2) | PL168354B1 (hu) |
RO (1) | RO112336B1 (hu) |
SK (1) | SK281490B6 (hu) |
WO (1) | WO1992000091A1 (hu) |
Families Citing this family (618)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5747334A (en) * | 1990-02-15 | 1998-05-05 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Random peptide library |
US5498538A (en) * | 1990-02-15 | 1996-03-12 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Totally synthetic affinity reagents |
US5639595A (en) * | 1990-05-01 | 1997-06-17 | Isis Phamaceuticals, Inc. | Identification of novel drugs and reagents |
US5650489A (en) * | 1990-07-02 | 1997-07-22 | The Arizona Board Of Regents | Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof |
US6197529B1 (en) * | 1990-11-21 | 2001-03-06 | Torrey Pines Institute For Molecular Studies | Linear substituted oligoalkyleneimine libraries |
US20050209121A1 (en) * | 1990-12-05 | 2005-09-22 | Novozymes A/S | Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof |
US5646001A (en) * | 1991-03-25 | 1997-07-08 | Immunivest Corporation | Affinity-binding separation and release of one or more selected subset of biological entities from a mixed population thereof |
AU2547592A (en) * | 1991-08-23 | 1993-03-16 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Synthetic unrandomization of oligomer fragments |
WO1993005182A1 (en) * | 1991-09-05 | 1993-03-18 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Determination of oligonucleotides for therapeutics, diagnostics and research reagents |
WO1993006121A1 (en) * | 1991-09-18 | 1993-04-01 | Affymax Technologies N.V. | Method of synthesizing diverse collections of oligomers |
US5639603A (en) * | 1991-09-18 | 1997-06-17 | Affymax Technologies N.V. | Synthesizing and screening molecular diversity |
US6117974A (en) * | 1991-10-02 | 2000-09-12 | Peptor Limited | Libraries of backbone-cyclized peptidomimetics |
US20010021513A1 (en) * | 1991-11-21 | 2001-09-13 | Puijk Wouter Cornelis | Test device comprising a plate containing a multiplicity of wells with an associated metering device, as well as a kit which comprises these devices and use of the devices |
US5573905A (en) * | 1992-03-30 | 1996-11-12 | The Scripps Research Institute | Encoded combinatorial chemical libraries |
ATE199726T1 (de) * | 1992-04-15 | 2001-03-15 | Univ Johns Hopkins | Synthese von verschiedenen und nützlichen oligonukleotidsammlungen |
US5541061A (en) * | 1992-04-29 | 1996-07-30 | Affymax Technologies N.V. | Methods for screening factorial chemical libraries |
WO1994002515A1 (en) * | 1992-07-21 | 1994-02-03 | Bunsen Rush Laboratories Inc. | Oligomer library formats and methods relating thereto |
HUT72495A (en) * | 1992-10-01 | 1996-05-28 | Cold Spring Harbor Lab | Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags |
US5721099A (en) * | 1992-10-01 | 1998-02-24 | Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags |
US6503759B1 (en) | 1992-10-01 | 2003-01-07 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags |
US5565324A (en) * | 1992-10-01 | 1996-10-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags |
US5807683A (en) * | 1992-11-19 | 1998-09-15 | Combichem, Inc. | Combinatorial libraries and methods for their use |
DE4243770A1 (de) * | 1992-12-23 | 1994-06-30 | Behringwerke Ag | Verfahren zur Herstellung von rekombinanten und synthetischen Peptiden und deren Verwendung |
US5605798A (en) | 1993-01-07 | 1997-02-25 | Sequenom, Inc. | DNA diagnostic based on mass spectrometry |
WO1994020521A1 (de) * | 1993-03-12 | 1994-09-15 | Jerini Bio Chemicals Gmbh | Verfahren zur synthese und selektionierung von sequenzen aus kovalent verbundenen bausteinen |
US6864048B2 (en) | 1993-04-28 | 2005-03-08 | Affymetrix, Inc. | Factorial chemical libraries |
US5840485A (en) * | 1993-05-27 | 1998-11-24 | Selectide Corporation | Topologically segregated, encoded solid phase libraries |
AU686186B2 (en) * | 1993-05-27 | 1998-02-05 | Aventisub Ii Inc. | Topologically segregated, encoded solid phase libraries |
AU684510B2 (en) * | 1993-05-28 | 1997-12-18 | Chiron Corporation | Method for selection of biologically active peptide sequences |
US5846731A (en) * | 1993-06-17 | 1998-12-08 | Torry Pines Institute For Molecular Studies | Peralkylated oligopeptide mixtures |
US5480971A (en) * | 1993-06-17 | 1996-01-02 | Houghten Pharmaceuticals, Inc. | Peralkylated oligopeptide mixtures |
ATE369376T1 (de) * | 1993-06-21 | 2007-08-15 | Aventis Pharma Inc | Selektiv spaltbare linker, die auf einer methionin- und einer estergruppe basieren |
JPH09500625A (ja) | 1993-07-09 | 1997-01-21 | スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション | 環状セミランダムペプチドライブラリー |
AU7193494A (en) * | 1993-07-21 | 1995-02-20 | Oxford Glycosystems Ltd | Saccharides, their synthesis and use |
US6001982A (en) | 1993-07-29 | 1999-12-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Synthesis of oligonucleotides |
ES2179847T3 (es) * | 1993-08-13 | 2003-02-01 | Albany Molecular Res Inc | Metodos biocataliticos para la sintesis e identificacion de compuestos biologicamente activos. |
CN1154640C (zh) * | 1993-10-01 | 2004-06-23 | 纽约市哥伦比亚大学理事 | 用标示物编码的多元组合化学库 |
US5922545A (en) * | 1993-10-29 | 1999-07-13 | Affymax Technologies N.V. | In vitro peptide and antibody display libraries |
US5503805A (en) * | 1993-11-02 | 1996-04-02 | Affymax Technologies N.V. | Apparatus and method for parallel coupling reactions |
US6165778A (en) * | 1993-11-02 | 2000-12-26 | Affymax Technologies N.V. | Reaction vessel agitation apparatus |
US6287787B1 (en) | 1993-11-24 | 2001-09-11 | Torrey Pines Institute For Molecular Studies | Dimeric oligopeptide mixture sets |
WO1995016209A1 (en) * | 1993-12-09 | 1995-06-15 | Ciba-Geigy Ag | Process for the production of combinatorial compound libraries |
DE69406806D1 (de) * | 1993-12-15 | 1997-12-18 | Combichem Inc | Kombinatorische Bibliotheken und Verfahren zu ihrer Verwendung |
US5587471A (en) * | 1994-01-11 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Method of making oligonucleotide libraries |
CA2180844A1 (en) * | 1994-01-13 | 1995-07-20 | W. Clark Still | Synthetic receptors, libraries and uses thereof |
US5593853A (en) * | 1994-02-09 | 1997-01-14 | Martek Corporation | Generation and screening of synthetic drug libraries |
US5541085A (en) * | 1994-02-14 | 1996-07-30 | Zymogenetics, Inc. | Method for preparing orphan receptor ligands |
US5539083A (en) * | 1994-02-23 | 1996-07-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis |
US5756810A (en) * | 1994-03-11 | 1998-05-26 | Pharmacopeia, Inc. | Process of preparing 3-nitro benzoate compounds in lower alkanol |
US6015880A (en) * | 1994-03-16 | 2000-01-18 | California Institute Of Technology | Method and substrate for performing multiple sequential reactions on a matrix |
US6936477B2 (en) | 1994-04-13 | 2005-08-30 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags |
US5856083A (en) * | 1994-05-06 | 1999-01-05 | Pharmacopeia, Inc. | Lawn assay for compounds that affect enzyme activity or bind to target molecules |
US5846841A (en) * | 1994-05-20 | 1998-12-08 | Selectide Corporation | Motif Libraries |
IL109943A (en) * | 1994-06-08 | 2006-08-01 | Develogen Israel Ltd | Conformationally constrained backbone cyclized peptide analogs |
US6407059B1 (en) | 1994-06-08 | 2002-06-18 | Peptor Limited | Conformationally constrained backbone cyclized peptide analogs |
WO1995034813A1 (en) * | 1994-06-14 | 1995-12-21 | Smithkline Beecham Corporation | Resins for solid state synthesis |
US5663046A (en) * | 1994-06-22 | 1997-09-02 | Pharmacopeia, Inc. | Synthesis of combinatorial libraries |
AU2871195A (en) * | 1994-06-23 | 1996-01-19 | Affymax Technologies N.V. | Methods for the synthesis of diketopiperazines |
US5817751A (en) * | 1994-06-23 | 1998-10-06 | Affymax Technologies N.V. | Method for synthesis of diketopiperazine and diketomorpholine derivatives |
US5939268A (en) * | 1994-07-26 | 1999-08-17 | The Scripps Research Institute | Combinatorial libraries of molecules and methods for producing same |
MX9700725A (es) * | 1994-07-26 | 1997-05-31 | Scripps Research Inst | Coleccion combinatoria soluble. |
US5948693A (en) * | 1994-09-01 | 1999-09-07 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Solid phase synthesis of immunosuppressive agents |
US5463564A (en) * | 1994-09-16 | 1995-10-31 | 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. | System and method of automatically generating chemical compounds with desired properties |
US6558633B1 (en) * | 1994-09-21 | 2003-05-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Chemical reaction apparatus and methods |
US5695934A (en) * | 1994-10-13 | 1997-12-09 | Lynx Therapeutics, Inc. | Massively parallel sequencing of sorted polynucleotides |
US5846719A (en) | 1994-10-13 | 1998-12-08 | Lynx Therapeutics, Inc. | Oligonucleotide tags for sorting and identification |
USRE43097E1 (en) | 1994-10-13 | 2012-01-10 | Illumina, Inc. | Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors |
US6280935B1 (en) | 1994-10-13 | 2001-08-28 | Lynx Therapeutics, Inc. | Method of detecting the presence or absence of a plurality of target sequences using oligonucleotide tags |
US5604097A (en) * | 1994-10-13 | 1997-02-18 | Spectragen, Inc. | Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags |
WO1996012186A1 (en) * | 1994-10-14 | 1996-04-25 | Chiron Mimotopes Pty. Ltd. | Method and apparatus for efficient mimotope discovery |
US5556752A (en) | 1994-10-24 | 1996-09-17 | Affymetrix, Inc. | Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA |
US6974666B1 (en) | 1994-10-21 | 2005-12-13 | Appymetric, Inc. | Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA |
US5688696A (en) * | 1994-12-12 | 1997-11-18 | Selectide Corporation | Combinatorial libraries having a predetermined frequency of each species of test compound |
DE4444260A1 (de) * | 1994-12-13 | 1996-06-20 | Hoechst Ag | Cyclohexapeptide und deren Mischungen, Verfahren zur Herstellung sowie deren Verwendung |
AU5849796A (en) * | 1994-12-27 | 1996-08-07 | United Biomedical Inc. | Peptide ratchet libraries for ctl-inducing vaccines and therapeutics |
GB9502225D0 (en) * | 1995-02-04 | 1995-03-22 | Zeneca Ltd | Method |
US5759865A (en) * | 1995-05-03 | 1998-06-02 | Eli Lilly And Company | Combinatorial process for synthesizing azetidinone analogs |
AU5487496A (en) * | 1995-05-03 | 1996-11-21 | Eli Lilly And Company | Combinatorial process for synthesizing azetidinone analogs |
US5834318A (en) * | 1995-05-10 | 1998-11-10 | Bayer Corporation | Screening of combinatorial peptide libraries for selection of peptide ligand useful in affinity purification of target proteins |
US5830655A (en) | 1995-05-22 | 1998-11-03 | Sri International | Oligonucleotide sizing using cleavable primers |
US5750674A (en) * | 1995-05-23 | 1998-05-12 | Hybridon, Inc. | Methods and compounds for the stereoselective enrichment of oligonucleotide diastereomers and oligonucleotides thereby produced |
AU5871196A (en) * | 1995-05-23 | 1996-12-24 | Hybridon, Inc. | Methods and compounds for the synthesis of oligonucleotides and the oligonucleotides thereby produced |
US20010053523A1 (en) * | 1995-06-02 | 2001-12-20 | M&E Biotech A/S. | Method for identification of biologically active peptides and nucleic acids |
US5770687A (en) * | 1995-06-07 | 1998-06-23 | Peptor Limited | Comformationally constrained backbone cyclized somatostatin analogs |
US6051554A (en) * | 1995-06-07 | 2000-04-18 | Peptor Limited | Conformationally constrained backbone cyclized somatostatin analogs |
CA2225313A1 (en) * | 1995-06-21 | 1997-01-09 | Martek Biosciences Corporation | Combinatorial libraries of labeled biochemical compounds and methods for producing same |
SE9502286D0 (sv) * | 1995-06-22 | 1995-06-22 | Pharmacia Ab | Process for detection, quantification and/or identification of a peptide |
JP4105763B2 (ja) * | 1995-06-23 | 2008-06-25 | ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ,アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ | アグーチシグナルタンパク質およびそのペプチドの脱色活性 |
GB9515070D0 (en) * | 1995-07-22 | 1995-09-20 | Zeneca Ltd | Label |
US6068829A (en) | 1995-09-11 | 2000-05-30 | The Burnham Institute | Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo |
AU728668B2 (en) * | 1995-09-11 | 2001-01-18 | La Jolla Cancer Research Foundation | Molecules that home to a selected organ or tissue in vivo and methods of identifying same |
ATE382630T1 (de) * | 1995-09-11 | 2008-01-15 | Jolla Cancer Res Found | Moleküle, die sich in ausgewählten organen oder geweben in-vivo einfinden |
US6743892B1 (en) | 1995-09-11 | 2004-06-01 | La Jolla Cancer Research Foundation | Molecules that home to a selected organ in vivo |
US7026114B1 (en) * | 1995-09-13 | 2006-04-11 | Affymetrix, Inc. | Methods and compositions for monitoring polymer array synthesis |
US6841533B1 (en) | 1995-12-07 | 2005-01-11 | Peptor Limited | Conformationally constrained backbone cyclized interleukin-6 antagonists |
US20110028350A1 (en) * | 1995-12-15 | 2011-02-03 | Affymetrix, Inc. | Photocleavable protecting groups |
US6147205A (en) * | 1995-12-15 | 2000-11-14 | Affymetrix, Inc. | Photocleavable protecting groups and methods for their use |
JP2000502897A (ja) * | 1995-12-18 | 2000-03-14 | プレーシス ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド | 標的に結合する化合物を同定する方法 |
AU1582197A (en) * | 1996-01-22 | 1997-08-11 | Eli Lilly And Company | Combinatorial process for preparing substituted indane libraries |
DE69722176T2 (de) | 1996-01-23 | 2004-03-18 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University, Palo Alto | Verfahren zur suche nach transdominanten effektorpeptiden und rna-molekülen |
US6365344B1 (en) * | 1996-01-23 | 2002-04-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for screening for transdominant effector peptides and RNA molecules |
US6277583B1 (en) * | 1996-02-07 | 2001-08-21 | Conjuchem, Inc. | Affinity labeling libraries and applications thereof |
US6080719A (en) * | 1996-02-23 | 2000-06-27 | Hoechst Aktiengesellschaft | Cyclohexapeptides and their mixtures, a process for preparing them, and their use |
US6051378A (en) * | 1996-03-04 | 2000-04-18 | Genetrace Systems Inc. | Methods of screening nucleic acids using mass spectrometry |
DE19610103A1 (de) | 1996-03-15 | 1997-09-18 | Basf Ag | Cycloalkylderivate und ihre Synthese an fester Phase |
EP0954601A4 (en) * | 1996-03-20 | 2004-08-18 | Genzyme Corp | METHOD FOR DETECTING CYTOTOXIC T-CELL EPITOPES |
AU2341397A (en) * | 1996-03-21 | 1997-10-10 | Princeton University | Carbohydrate-based ligand library, assay and method |
US5866341A (en) * | 1996-04-03 | 1999-02-02 | Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. | Compositions and methods for screening drug libraries |
US6387707B1 (en) | 1996-04-25 | 2002-05-14 | Bioarray Solutions | Array Cytometry |
US6251691B1 (en) | 1996-04-25 | 2001-06-26 | Bioarray Solutions, Llc | Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces |
US7144119B2 (en) | 1996-04-25 | 2006-12-05 | Bioarray Solutions Ltd. | System and method for programmable illumination pattern generation |
US5958342A (en) * | 1996-05-17 | 1999-09-28 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Jet droplet device |
DE19621177A1 (de) | 1996-05-24 | 1997-11-27 | Basf Ag | Kohlenhydratderivate und ihre Synthese an fester Phase |
US6699658B1 (en) | 1996-05-31 | 2004-03-02 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Yeast cell surface display of proteins and uses thereof |
US6203978B1 (en) * | 1996-05-31 | 2001-03-20 | Du Vergier Ltd. | Capture of single stranded nucleic acids |
US6300065B1 (en) | 1996-05-31 | 2001-10-09 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Yeast cell surface display of proteins and uses thereof |
US6696251B1 (en) | 1996-05-31 | 2004-02-24 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Yeast cell surface display of proteins and uses thereof |
DE69737659T2 (de) | 1996-06-14 | 2007-12-27 | Meiji Dairies Corp. | Peptide aus t-zellepitopen |
WO1997049430A1 (en) * | 1996-06-26 | 1997-12-31 | Antigen Express, Inc. | Immunotherapy by modulation of antigen presentation |
DE19626762A1 (de) | 1996-07-03 | 1998-01-08 | Basf Ag | Enzymatisch spaltbare Linker für Festphasensynthesen |
US6355613B1 (en) | 1996-07-31 | 2002-03-12 | Peptor Limited | Conformationally constrained backbone cyclized somatostatin analogs |
US5817489A (en) | 1996-08-01 | 1998-10-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Di-nitrogen heterocycle compositions |
US5922872A (en) * | 1996-08-01 | 1999-07-13 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Meta-benzylic and alpha-amido compositions and methods for preparing same |
US6576239B1 (en) | 1996-09-10 | 2003-06-10 | The Burnham Institute | Angiogenic homing molecules and conjugates derived therefrom |
AU4351897A (en) | 1996-09-16 | 1998-04-02 | Conjuchem, Inc. | Affinity labeling libraries with tagged leaving groups |
US5965363A (en) | 1996-09-19 | 1999-10-12 | Genetrace Systems Inc. | Methods of preparing nucleic acids for mass spectrometric analysis |
US5798035A (en) * | 1996-10-03 | 1998-08-25 | Pharmacopeia, Inc. | High throughput solid phase chemical synthesis utilizing thin cylindrical reaction vessels useable for biological assay |
US20020022227A1 (en) * | 1996-10-17 | 2002-02-21 | Short Jay M. | Morphatides: novel shape and structure libraries |
US6838238B1 (en) * | 1996-10-17 | 2005-01-04 | Invitrogen Corporation | Morphatides: novel shape and structure libraries |
US6149869A (en) * | 1996-10-23 | 2000-11-21 | Glaxo Wellcome Inc. | Chemical synthesizers |
US6042789A (en) * | 1996-10-23 | 2000-03-28 | Glaxo Group Limited | System for parallel synthesis of organic compounds |
US6413724B1 (en) | 1996-10-28 | 2002-07-02 | Versicor, Inc. | Solid phase and combinatorial library syntheses of fused 2,4-pyrimidinediones |
US6025371A (en) * | 1996-10-28 | 2000-02-15 | Versicor, Inc. | Solid phase and combinatorial library syntheses of fused 2,4-pyrimidinediones |
US6453246B1 (en) | 1996-11-04 | 2002-09-17 | 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. | System, method, and computer program product for representing proximity data in a multi-dimensional space |
JP2001503546A (ja) | 1996-11-04 | 2001-03-13 | 3―ディメンショナル ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 化学データの可視化、並びに対話式に処理および分析するためのシステム、方法、およびコンピュータプログラム製品 |
US6571227B1 (en) | 1996-11-04 | 2003-05-27 | 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. | Method, system and computer program product for non-linear mapping of multi-dimensional data |
US6083761A (en) * | 1996-12-02 | 2000-07-04 | Glaxo Wellcome Inc. | Method and apparatus for transferring and combining reagents |
US6054325A (en) * | 1996-12-02 | 2000-04-25 | Glaxo Wellcom Inc. | Method and apparatus for transferring and combining distinct chemical compositions with reagents |
AU7624298A (en) * | 1996-12-03 | 1998-06-29 | Graybill, Todd L. | Aminobenzenedicarboxylic acid-based combinatorial libraries |
JP2001524808A (ja) | 1996-12-10 | 2001-12-04 | ジーントレイス・システムズ・インコーポレイテッド | 放出可能な不揮発性の質量標識分子 |
AU6682598A (en) * | 1997-03-04 | 1998-09-22 | Bio-Technology General Corporation | Isolation of tissue specific peptide ligands and their use for targeting pharmaceuticals to organs |
US6045755A (en) * | 1997-03-10 | 2000-04-04 | Trega Biosciences,, Inc. | Apparatus and method for combinatorial chemistry synthesis |
US20030027126A1 (en) | 1997-03-14 | 2003-02-06 | Walt David R. | Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions |
US7622294B2 (en) | 1997-03-14 | 2009-11-24 | Trustees Of Tufts College | Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions |
US6177464B1 (en) | 1997-03-14 | 2001-01-23 | Sepracor, Inc. | Ring opening metathesis of alkenes |
JPH10260223A (ja) * | 1997-03-19 | 1998-09-29 | Fujitsu Ltd | 半導体検査装置及びこれを用いた検査方法 |
EP1015479A4 (en) * | 1997-04-11 | 2002-07-24 | Lilly Co Eli | COMBINATIVE SUBSTANCE LIBRARIES OF PEPTIDOMIMETIC MACROCYCLES AND THE RELATED METHODS |
US6004823A (en) * | 1997-05-07 | 1999-12-21 | Smithkline Beecham Corporation | Compounds |
US5908960A (en) * | 1997-05-07 | 1999-06-01 | Smithkline Beecham Corporation | Compounds |
GB9710582D0 (en) | 1997-05-22 | 1997-07-16 | Oxford Glycosciences Uk Ltd | A method for de novo peptide sequence determination |
WO1998053093A1 (en) * | 1997-05-23 | 1998-11-26 | Bioarray Solutions Llc | Color-encoding and in-situ interrogation of matrix-coupled chemical compounds |
AU8147798A (en) * | 1997-06-16 | 1999-01-04 | University Of North Carolina At Chapel Hill, The | Peptido oligonucleotides (pons) and their combinatorial libraries |
EP1387390B1 (en) | 1997-06-20 | 2009-02-18 | Bio - Rad Laboratories, Inc. | Retentate chromatography and protein chip arrays with applications in biology and medicine |
NZ516848A (en) | 1997-06-20 | 2004-03-26 | Ciphergen Biosystems Inc | Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine |
US5874589A (en) * | 1997-07-18 | 1999-02-23 | Glaxo Wellcome, Inc. | Methods for synthesizing diverse collections of tetramic acids and derivatives thereof |
US6410342B1 (en) * | 1997-08-19 | 2002-06-25 | Pharmacopeia, Inc. | Method and apparatus for controlled photoelution |
US7252950B1 (en) | 1997-09-04 | 2007-08-07 | The Regents Of The University Of California | Assays for detecting modulators of cytoskeletal function |
US6960457B1 (en) | 1997-09-04 | 2005-11-01 | Stanford University | Reversible immobilization of arginine-tagged moieties on a silicate surface |
GB9722131D0 (en) | 1997-10-20 | 1997-12-17 | Medical Res Council | Method |
ATE218892T1 (de) | 1997-11-07 | 2002-06-15 | Conjuchem Inc | Affinitätsmarkierer für menschliches serum albumin |
US6228579B1 (en) * | 1997-11-14 | 2001-05-08 | San Diego State University Foundation | Method for identifying microbial proliferation genes |
US6083682A (en) * | 1997-12-19 | 2000-07-04 | Glaxo Group Limited | System and method for solid-phase parallel synthesis of a combinatorial collection of compounds |
US6759243B2 (en) | 1998-01-20 | 2004-07-06 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | High affinity TCR proteins and methods |
US5968361A (en) * | 1998-02-24 | 1999-10-19 | Arqule, Inc. | Rapid method for separation of small molecules using reverse phase high performance liquid chromatography |
US6497820B1 (en) | 1998-02-03 | 2002-12-24 | Arqule, Inc. | Rapid method for separation of small molecules using reverse phase high performance liquid chromatography |
WO1999043409A1 (en) * | 1998-02-27 | 1999-09-02 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Hplc fractionation of complex chemical mixtures |
US6232287B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-05-15 | The Burnham Institute | Molecules that home to various selected organs or tissues |
EP1062508A1 (en) | 1998-03-20 | 2000-12-27 | The Rockefeller University | Assays for screening compounds which interact with cation channel proteins, mutant prokaryotic cation channel proteins, and uses thereof |
AU767185B2 (en) | 1998-03-23 | 2003-11-06 | President And Fellows Of Harvard College | Synthesis of compounds and libraries of compounds |
CA2324060A1 (en) * | 1998-03-30 | 1999-10-07 | The Regents Of The University Of California | Methods and compounds for modulating nuclear receptor activity |
US6316616B1 (en) | 1998-04-02 | 2001-11-13 | President And Fellows Of Harvard College | Parallel combinatorial approach to the discovery and optimization of catalysts and uses thereof |
AU3745799A (en) | 1998-04-14 | 1999-11-01 | Regents Of The University Of California, The | Assays for the detection of microtubule depolymerization inhibitors |
US6699969B1 (en) | 1998-04-14 | 2004-03-02 | The Regents Of The University Of California | Assays for the detection of microtubule depolymerization inhibitors |
US6872537B1 (en) | 1998-04-14 | 2005-03-29 | Regents Of The University Of California | Assays for the detection of microtubule depolymerization inhibitors |
JP2002513591A (ja) | 1998-05-04 | 2002-05-14 | フラウンホファー ゲセルシャフトツール フェールデルンク ダー アンゲヴァンテン フォルシュンク エー.ファオ. | 電気的総合的核酸単離、精製及び検出 |
DE19819889A1 (de) * | 1998-05-04 | 1999-11-11 | Fraunhofer Ges Forschung | Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren |
EP1138692A1 (en) | 2000-03-29 | 2001-10-04 | Erasmus Universiteit Rotterdam | Fragments of human chorionic gonadotropin (hcg) as immunoregulator |
US6541211B1 (en) * | 1998-05-20 | 2003-04-01 | Selectide Corporation | Apparatus and method for synthesizing combinational libraries |
US6872535B2 (en) | 1998-05-20 | 2005-03-29 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | Three-dimensional array of supports for solid-phase parallel synthesis and method of use |
US7387779B2 (en) * | 1998-06-17 | 2008-06-17 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Anti-angiogenic proteins and fragments and methods of use thereof |
US7402400B2 (en) | 2001-07-03 | 2008-07-22 | Regents Of The University Of California | Mammalian sweet taste receptors |
EP1105360B1 (en) | 1998-08-17 | 2009-07-29 | Bristol-Myers Squibb Company | Identification of compound-protein interactions using libraries of protein-nucleic acid fusion molecules |
US6633543B1 (en) * | 1998-08-27 | 2003-10-14 | Intel Corporation | Multicast flow control |
US6423493B1 (en) * | 1998-10-26 | 2002-07-23 | Board Of Regents The University Of Texas System | Combinatorial selection of oligonucleotide aptamers |
US20040242521A1 (en) * | 1999-10-25 | 2004-12-02 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Thio-siRNA aptamers |
WO2000027627A1 (en) * | 1998-11-12 | 2000-05-18 | Eli Lilly And Company | Aryloxime linkers in the solid-phase synthesis of 3-aminobenzisoxazoles |
US20030027214A1 (en) * | 1999-02-17 | 2003-02-06 | Kamb Carl Alexander | Methods for substrate-ligand interaction screening |
AU5291600A (en) | 1999-06-01 | 2000-12-18 | Caliper Technologies Corporation | Microscale assays and microfluidic devices for transporter, gradient induced, and binding activities |
ES2242620T3 (es) | 1999-06-14 | 2005-11-16 | Genentech, Inc. | Estructuras peptidicas para exhibir bibliotecas de giros de un fago. |
SE9902479D0 (sv) * | 1999-06-30 | 1999-06-30 | Amersham Pharm Biotech Ab | Particle classification as marker |
US7742877B1 (en) * | 1999-07-22 | 2010-06-22 | Becton, Dickinson & Company | Methods, apparatus and computer program products for formulating culture media |
CA2382157C (en) | 1999-08-18 | 2012-04-03 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for preparing oligonucleotide solutions |
EP1207905B1 (en) | 1999-09-03 | 2010-09-01 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and compositions for treatment of inflammatory disease using cadherin-11 modulating agents |
JP2003511362A (ja) * | 1999-10-04 | 2003-03-25 | ユニバーシティー オブ メディシン アンド デンティストリー オブ ニュー ジャージー | 新規カルバメートおよび尿素類 |
US6569685B1 (en) * | 1999-10-05 | 2003-05-27 | The Molecular Sciences Institute, Inc. | Protein fingerprint system and related methods |
KR100378252B1 (ko) * | 1999-11-12 | 2003-03-29 | 학교법인 포항공과대학교 | 니트로술포닐에톡시카르보닐-아미노산을 이용한 합성테트라펩티드 라이브러리의 제조방법 |
US6458538B1 (en) * | 1999-12-14 | 2002-10-01 | Ptc Therapeutics, Inc. | Methods of assaying for compounds that inhibit premature translation termination and nonsense-mediated RNA decay |
US8642284B1 (en) | 1999-12-15 | 2014-02-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for identifying agents that alter NAD-dependent deacetylation activity of a SIR2 protein |
US7452664B2 (en) | 1999-12-15 | 2008-11-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for identifying agents which alter histone protein acetylation |
WO2001053539A1 (en) | 2000-01-24 | 2001-07-26 | Phylos, Inc. | Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis |
US7022479B2 (en) | 2000-01-24 | 2006-04-04 | Compound Therapeutics, Inc. | Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis |
EP1251904A1 (en) | 2000-02-03 | 2002-10-30 | The Regents of the University of California | Assays for the detection of agents that affect cognition |
US7416524B1 (en) | 2000-02-18 | 2008-08-26 | Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development, L.L.C. | System, method and computer program product for fast and efficient searching of large chemical libraries |
US6671627B2 (en) | 2000-02-29 | 2003-12-30 | 3-D Pharmaceuticals, Inc. | Method and computer program product for designing combinatorial arrays |
TW201006846A (en) | 2000-03-07 | 2010-02-16 | Senomyx Inc | T1R taste receptor and genes encidung same |
AU2001247627A1 (en) | 2000-03-22 | 2001-10-03 | 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. | System, method, and computer program product for representing object relationships in a multidimensional space |
US20050037430A1 (en) * | 2000-03-29 | 2005-02-17 | Biotempt B.V. | Methods and uses for protein breakdown products |
USRE43279E1 (en) | 2000-03-29 | 2012-03-27 | Biotemp B.V. | Compositions capable of reducing elevated blood urea concentration |
US7139739B2 (en) | 2000-04-03 | 2006-11-21 | Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development, L.L.C. | Method, system, and computer program product for representing object relationships in a multidimensional space |
AU2001268468A1 (en) | 2000-06-13 | 2001-12-24 | The Trustees Of Boston University | Use of nucleotide analogs in the analysis of oligonucleotide mixtures and in highly multiplexed nucleic acid sequencing |
US9709559B2 (en) | 2000-06-21 | 2017-07-18 | Bioarray Solutions, Ltd. | Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays |
WO2001098765A1 (en) | 2000-06-21 | 2001-12-27 | Bioarray Solutions, Ltd. | Multianalyte molecular analysis |
US6759510B1 (en) * | 2000-06-30 | 2004-07-06 | Becton, Dickinson And Company | Peptides for use in culture media |
US20020019011A1 (en) * | 2000-07-07 | 2002-02-14 | Stockwell Brent R. | Methods for identifying combinations of entities as therapeutics |
US20020051991A1 (en) * | 2000-07-11 | 2002-05-02 | Zhi Hong | Rapid generation of diverse nucleoside and nucleotide libraries |
AU8356201A (en) * | 2000-08-11 | 2002-02-25 | Agilix Corp | Ultra-sensitive detection systems |
US6963807B2 (en) | 2000-09-08 | 2005-11-08 | Oxford Glycosciences (Uk) Ltd. | Automated identification of peptides |
US7420030B2 (en) | 2000-09-08 | 2008-09-02 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Aminopeptidase A (APA) targeting peptides for the treatment of cancer |
US7452964B2 (en) | 2001-09-07 | 2008-11-18 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Compositions and methods of use of targeting peptides against placenta and adipose tissues |
US20040170955A1 (en) | 2000-09-08 | 2004-09-02 | Wadih Arap | Human and mouse targeting peptides identified by phage display |
JP2005523232A (ja) * | 2000-09-11 | 2005-08-04 | アフィメトリックス インコーポレイテッド | 光切断可能保護基 |
CA2422080A1 (en) * | 2000-09-18 | 2002-03-21 | Genzyme Corporation | Method to identify therapeutic antibody targets associated with a therapeutic response |
WO2002026107A2 (en) | 2000-09-25 | 2002-04-04 | The Regents Of The University Of California | Model for neurodegenerative diseases involving amyloid accumulation |
US20030045005A1 (en) | 2000-10-17 | 2003-03-06 | Michael Seul | Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces |
US7045283B2 (en) | 2000-10-18 | 2006-05-16 | The Regents Of The University Of California | Methods of high-throughput screening for internalizing antibodies |
US20020165149A1 (en) * | 2000-12-08 | 2002-11-07 | Kranz David M. | Mutated class II major histocompatibility proteins |
US7572575B2 (en) | 2000-12-13 | 2009-08-11 | Massachusetts Institute Of Technology | SIR2 activity |
PT1404867E (pt) * | 2000-12-23 | 2008-06-05 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Método de pesquisa da transfecção de oligonucleótidos |
TW201022287A (en) | 2001-01-03 | 2010-06-16 | Senomyx Inc | T1R taste receptors and genes encoding same |
US7054757B2 (en) | 2001-01-29 | 2006-05-30 | Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development, L.L.C. | Method, system, and computer program product for analyzing combinatorial libraries |
DE10106339A1 (de) * | 2001-02-09 | 2002-08-22 | Hans-Joachim Mueller | Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening von Kandidaten-Verbindungen über die Hochdurchsatz-Direktsynthese von rekombinanten Polypeptiden |
US7883856B2 (en) | 2001-04-05 | 2011-02-08 | Senomyx Inc. | Identification of bitter ligands that specifically activate human T2R receptors and related assays for identifying human bitter taste modulators |
US20030191073A1 (en) | 2001-11-07 | 2003-10-09 | Challita-Eid Pia M. | Nucleic acid and corresponding protein entitled 161P2F10B useful in treatment and detection of cancer |
US20040219545A1 (en) * | 2001-04-13 | 2004-11-04 | Rando Robert F. | Methods for identifying small molecules that bind specific rna structural motifs |
US20060228730A1 (en) * | 2001-04-11 | 2006-10-12 | Rando Robert F | Methods for identifying small molecules that bind specific RNA structural motifs |
US20050142545A1 (en) * | 2001-04-11 | 2005-06-30 | Conn Michael M. | Methods for identifying small molecules that bind specific rna structural motifs |
US6914123B2 (en) | 2001-04-17 | 2005-07-05 | Genentech, Inc. | Hairpin peptides with a novel structural motif and methods relating thereto |
US7803982B2 (en) | 2001-04-20 | 2010-09-28 | The Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | T1R3 transgenic animals, cells and related methods |
CZ20033143A3 (en) | 2001-05-21 | 2004-04-14 | Aclara Biosciences, Inc. | Methods and compositions for analyzing proteins |
US20050164515A9 (en) * | 2001-06-05 | 2005-07-28 | Belcher Angela M. | Biological control of nanoparticle nucleation, shape and crystal phase |
US20030148380A1 (en) * | 2001-06-05 | 2003-08-07 | Belcher Angela M. | Molecular recognition of materials |
US20030113714A1 (en) * | 2001-09-28 | 2003-06-19 | Belcher Angela M. | Biological control of nanoparticles |
US6955888B2 (en) | 2001-06-11 | 2005-10-18 | Xenoport | Methods of screening agents, conjugates or conjugate moieties for transport by a PEPT2 transporter |
US7727713B2 (en) | 2001-06-20 | 2010-06-01 | Nuevolution A/S | Templated molecules and methods for using such molecules |
US7262063B2 (en) | 2001-06-21 | 2007-08-28 | Bio Array Solutions, Ltd. | Directed assembly of functional heterostructures |
EP2003451B1 (en) | 2001-06-26 | 2012-05-30 | Senomyx, Inc. | T1r1-t1r3 hetero-oligomeric umami taste receptors and cell lines that express said receptors and use thereof for identification of umami taste compounds |
CA2453403C (en) | 2001-07-09 | 2013-10-08 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods of inhibiting amyloid toxicity |
US6800449B1 (en) | 2001-07-13 | 2004-10-05 | Syngenta Participations Ag | High throughput functional proteomics |
US7413870B2 (en) | 2001-08-01 | 2008-08-19 | Rigel Pharmaceuticals, Incorporated | SAK: modulation of cellular proliferation for treatment of cancer |
US6767731B2 (en) * | 2001-08-27 | 2004-07-27 | Intel Corporation | Electron induced fluorescent method for nucleic acid sequencing |
TW573125B (en) * | 2001-08-29 | 2004-01-21 | Combinatorx Inc | A screening system for identifying drug-drug interactions and methods of use thereof |
US20030073104A1 (en) * | 2001-10-02 | 2003-04-17 | Belcher Angela M. | Nanoscaling ordering of hybrid materials using genetically engineered mesoscale virus |
WO2003034029A2 (en) | 2001-10-15 | 2003-04-24 | Bioarray Solutions, Ltd. | Multiplexed analysis of polymorphic loci by concurrent interrogation and enzyme-mediated detection |
EP1440083B1 (en) | 2001-10-25 | 2013-01-02 | Medical Research Council | Molecules |
US7262269B2 (en) | 2001-10-26 | 2007-08-28 | The Regents Of University Of California | Method for screening combinational bead library; ligands for cancer cells |
US6670142B2 (en) | 2001-10-26 | 2003-12-30 | The Regents Of The University Of California | Method for screening combinatorial bead library, capturing cells from body fluids, and ligands for cancer cells |
CA2466861A1 (en) * | 2001-11-06 | 2003-07-10 | Agilix Corporation | Sensitive coded detection systems |
EP1527341B1 (en) * | 2001-11-20 | 2009-06-17 | Duke University | Interfacial biomaterials |
US7871619B2 (en) | 2001-11-30 | 2011-01-18 | Chemocentryx, Inc. | Compositions and methods for detecting and treating diseases and conditions related to chemokine receptors |
WO2003052053A2 (en) * | 2001-12-17 | 2003-06-26 | Ribapharm Inc. | Nucleoside libraries and compounds by mcc combinatorial strategies on solid support |
US7291456B2 (en) | 2002-01-24 | 2007-11-06 | The Regents Of The University Of California | Method for determining differences in molecular interactions and for screening a combinatorial library |
EP1470551A2 (en) * | 2002-01-28 | 2004-10-27 | Burstein Technologies, Inc. | Methods and apparatus for logical triggering |
CA2471017A1 (en) | 2002-01-31 | 2003-08-07 | Burstein Technologies, Inc. | Method for triggering through disc grooves and related optical analysis discs and system |
US20030220249A1 (en) * | 2002-02-07 | 2003-11-27 | Hackett Perry B. | Factors for angiogenesis, vasculogenesis, cartilage formation, bone formation, and methods of use thereof |
US7091331B2 (en) | 2002-03-04 | 2006-08-15 | Bristol-Myers Squibb Company | Nucleic acid molecules and polypeptides encoding baboon TAFI |
DE60324778D1 (de) | 2002-03-15 | 2009-01-02 | Nuevolution As | Eine verbesserte methode zur synthese von matritzenabhängigen molekülen |
US7544767B2 (en) | 2002-04-05 | 2009-06-09 | Burnham Institute For Medical Research | HMGN2 peptides and related molecules that selectively home to tumor blood vessels and tumor cells |
US20060275753A1 (en) * | 2002-04-15 | 2006-12-07 | Hammond David J | Recovery of analytes using combinatorial libraries |
EP1494695A4 (en) | 2002-04-15 | 2006-01-25 | American Nat Red Cross | PLASMA PROTEIN BINDING LIGANDS |
EP1578781A4 (en) * | 2002-05-17 | 2007-05-30 | Alfred E Slanetz | METHOD FOR DETERMINING TARGET FUNCTION AND IDENTIFICATION OF DRUG SERIES HEADS |
US7893218B2 (en) | 2003-06-16 | 2011-02-22 | Stowers Institute For Medical Research | Antibodies that specifically bind SOST peptides |
WO2004001010A2 (en) * | 2002-06-21 | 2003-12-31 | Ptc Therapeutics, Inc. | METHODS FOR IDENTIFYING SMALL MOLECULES THAT MODULATE PREMATURE TRANSLATION TERMINATION AND NONSENSE MEDIATED mRNA DECAY |
US20100168037A1 (en) * | 2002-07-03 | 2010-07-01 | Bio Science International, Inc. | Peptides comprising aromatic d-amino acids and methods of use |
DE60332115D1 (de) * | 2002-07-11 | 2010-05-27 | American Nat Red Cross | Verfahren zur identifizierung einzelner aktiver einheiten aus komplexen gemischen |
US7301006B2 (en) * | 2002-07-16 | 2007-11-27 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods and materials for the synthesis of modified peptides |
US7927791B2 (en) * | 2002-07-24 | 2011-04-19 | Ptc Therapeutics, Inc. | Methods for identifying small molecules that modulate premature translation termination and nonsense mediated mRNA decay |
EP1539980B1 (en) | 2002-08-01 | 2016-02-17 | Nuevolution A/S | Library of complexes comprising small non-peptide molecules and double-stranded oligonucleotides identifying the molecules |
AU2003243151A1 (en) | 2002-08-16 | 2004-03-03 | Agensys, Inc. | Nucleic acid and corresponding protein entitled 251p5g2 useful in treatment and detection of cancer |
EP2402036B1 (en) | 2002-09-06 | 2018-02-14 | Cerulean Pharma Inc. | Cyclodextrin-based polymers for delivering the therapeutic agents covalently attached thereto |
US7157228B2 (en) * | 2002-09-09 | 2007-01-02 | Bioarray Solutions Ltd. | Genetic analysis and authentication |
US20050064508A1 (en) | 2003-09-22 | 2005-03-24 | Semzyme | Peptide mediated synthesis of metallic and magnetic materials |
AU2003304278B2 (en) * | 2002-10-16 | 2009-03-12 | Board Of Regents Of The University Of Texas System | Bead bound combinatorial oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer libraries |
WO2004038415A1 (en) * | 2002-10-24 | 2004-05-06 | Biacore Ab | Assay with co-immobilized ligands |
CN106337046B (zh) | 2002-10-30 | 2021-03-23 | 纽韦卢森公司 | 合成双功能复合物的方法 |
US7526114B2 (en) | 2002-11-15 | 2009-04-28 | Bioarray Solutions Ltd. | Analysis, secure access to, and transmission of array images |
EP1953551B1 (en) | 2002-12-03 | 2014-02-19 | Pathogen Removal and Diagnostic Technologies, Inc. | Prion protein ligands and methods of use |
US20040185473A1 (en) * | 2002-12-17 | 2004-09-23 | Affymetrix, Inc. | Releasable polymer arrays |
EP2175019A3 (en) | 2002-12-19 | 2011-04-06 | Nuevolution A/S | Quasirandom structure and function guided synthesis methods |
US7736909B2 (en) * | 2003-01-09 | 2010-06-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions comprising capture agents |
AT413945B (de) * | 2003-01-14 | 2006-07-15 | Mattner Frank Dr | Impfstoff für die alzheimer-krankheit |
EP1597395A2 (en) | 2003-02-21 | 2005-11-23 | Nuevolution A/S | Method for producing second-generation library |
GB0305448D0 (en) * | 2003-03-10 | 2003-04-16 | Tcp Innovations Ltd | Immunoassay |
US20100022414A1 (en) | 2008-07-18 | 2010-01-28 | Raindance Technologies, Inc. | Droplet Libraries |
US20040185499A1 (en) * | 2003-03-20 | 2004-09-23 | Jolley Michael E. | Method of epitope scanning using fluorescence polarization |
US20040235053A1 (en) * | 2003-03-28 | 2004-11-25 | The Regents Of The University Of California | Preparation and application of encoded bead aggregates in combinatorial chemistry |
US20040235054A1 (en) * | 2003-03-28 | 2004-11-25 | The Regents Of The University Of California | Novel encoding method for "one-bead one-compound" combinatorial libraries |
US20060078893A1 (en) * | 2004-10-12 | 2006-04-13 | Medical Research Council | Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control |
GB0307428D0 (en) * | 2003-03-31 | 2003-05-07 | Medical Res Council | Compartmentalised combinatorial chemistry |
GB0307403D0 (en) | 2003-03-31 | 2003-05-07 | Medical Res Council | Selection by compartmentalised screening |
WO2004087865A2 (en) * | 2003-03-31 | 2004-10-14 | The Regents Of The University Of California | The preparation and application of ligand-biopolymer conjugates |
SG187269A1 (en) | 2003-04-04 | 2013-02-28 | Univ North Carolina State | Prion protein binding materials and methods of use |
US7510848B2 (en) | 2003-04-04 | 2009-03-31 | North Carolina State University | Prion protein binding materials and methods of use |
US20040210036A1 (en) * | 2003-04-15 | 2004-10-21 | Nanogen, Inc. | Peptide substrate libraries |
JP4391523B2 (ja) | 2003-04-30 | 2009-12-24 | オーロラ ディスカバリー インコーポレイティッド | 高密度保存およびアッセイプラットフォームを提供するマルチウェルプレート |
US20060121489A1 (en) * | 2003-05-23 | 2006-06-08 | Board Of Regents, The University Of Texas System | High throughput screening of aptamer libraries for specific binding to proteins on viruses and other pathogens |
EP1635765B1 (en) * | 2003-05-23 | 2013-07-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Structure based and combinatorially selected oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer targeting ap-1 transcription factors |
NZ572940A (en) | 2003-05-30 | 2010-04-30 | Agensys Inc | Prostate stem cell antigen (PSCA) variants and subsequences thereof |
WO2004109280A2 (en) * | 2003-06-06 | 2004-12-16 | Combinatorx Incorporated | System and method for multidimensional evaluation of combinations of compositions |
US7672791B2 (en) * | 2003-06-13 | 2010-03-02 | International Business Machines Corporation | Method of performing three-dimensional molecular superposition and similarity searches in databases of flexible molecules |
EP1648909A4 (en) * | 2003-07-24 | 2008-11-12 | Univ Texas | THIOAPTAMERS FOR DISCOVERING PHYSIOLOGICAL PATHWAYS AND NEW THERAPEUTIC STRATEGIES |
BRPI0413347A (pt) | 2003-08-06 | 2006-10-10 | Senomyx Inc | novos sabores, modificadores de sabor, agentes de sabor, realçadores de sabor, agentes de sabor e/ou realçadores umami ou doces, e utilização correspondente |
ATE447626T1 (de) | 2003-09-18 | 2009-11-15 | Nuevolution As | Methode zur gewinnung struktureller informationen kodierter moleküle und zur selektion von verbindungen |
US7927796B2 (en) | 2003-09-18 | 2011-04-19 | Bioarray Solutions, Ltd. | Number coding for identification of subtypes of coded types of solid phase carriers |
ES2375962T3 (es) | 2003-09-22 | 2012-03-07 | Bioarray Solutions Ltd | Polielectrolito inmovilizado en superficie con múltiples grupos funcionales capaces de unirse covalentemente a biomoléculas. |
WO2005035552A2 (en) * | 2003-10-07 | 2005-04-21 | Genzyme Corporation | Transducing combinatorial peptide library |
AU2004286252A1 (en) | 2003-10-28 | 2005-05-12 | Bioarray Solutions Ltd. | Optimization of gene expression analysis using immobilized capture probes |
WO2005045060A2 (en) | 2003-10-29 | 2005-05-19 | Bioarray Solutions, Ltd. | Multiplexed nucleic acid analysis by fragmentation of double-stranded dna |
EP1694816B1 (en) | 2003-11-07 | 2013-08-28 | Ciphergen Biosystems, Inc. | Biomarkers for alzheimer's disease |
US8071839B2 (en) | 2003-12-24 | 2011-12-06 | G2 Inflammation Pty Ltd | Transgenic mouse comprising a polynucleotide encoding human or humanized C5aR and methods of production and use |
US20050164167A1 (en) * | 2004-01-28 | 2005-07-28 | Buscher Benjamin A. | Method of discovery and development of broad-spectrum antiviral drugs |
US20050221339A1 (en) * | 2004-03-31 | 2005-10-06 | Medical Research Council Harvard University | Compartmentalised screening by microfluidic control |
JP5223072B2 (ja) | 2004-04-02 | 2013-06-26 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | avβ5インテグリンに関連のある疾患を治療および予防するための方法および組成物 |
US7794713B2 (en) | 2004-04-07 | 2010-09-14 | Lpath, Inc. | Compositions and methods for the treatment and prevention of hyperproliferative diseases |
WO2005113147A2 (en) | 2004-04-08 | 2005-12-01 | Biomatrica, Inc. | Integration of sample storage and sample management for life science |
US20050239134A1 (en) * | 2004-04-21 | 2005-10-27 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Combinatorial selection of phosphorothioate single-stranded DNA aptamers for TGF-beta-1 protein |
US7939251B2 (en) | 2004-05-06 | 2011-05-10 | Roche Molecular Systems, Inc. | SENP1 as a marker for cancer |
EP1759212B1 (en) | 2004-05-25 | 2008-12-17 | 2Curex | Identification of compounds modifying a cellular response |
WO2005118864A2 (en) | 2004-05-28 | 2005-12-15 | Agensys, Inc. | Antibodies and related molecules that bind to psca proteins |
WO2006002262A2 (en) | 2004-06-21 | 2006-01-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Genes and pathways differentially expressed in bipolar disorder and/or major depressive disorder |
JP4507080B2 (ja) * | 2004-07-30 | 2010-07-21 | 東亞合成株式会社 | 抗菌ペプチド及びその利用 |
US7848889B2 (en) | 2004-08-02 | 2010-12-07 | Bioarray Solutions, Ltd. | Automated analysis of multiplexed probe-target interaction patterns: pattern matching and allele identification |
EP2633858A3 (en) | 2004-08-20 | 2013-12-11 | Buck Institute for Age Research | Small molecules that replace or agonize p53 function |
US7968287B2 (en) | 2004-10-08 | 2011-06-28 | Medical Research Council Harvard University | In vitro evolution in microfluidic systems |
US7850960B2 (en) | 2004-12-30 | 2010-12-14 | University Of Washington | Methods for regulation of stem cells |
US7547775B2 (en) | 2004-12-31 | 2009-06-16 | Affymetrix, Inc. | Parallel preparation of high fidelity probes in an array format |
US8338093B2 (en) * | 2004-12-31 | 2012-12-25 | Affymetrix, Inc. | Primer array synthesis and validation |
EP1851551A2 (en) * | 2005-02-03 | 2007-11-07 | Perkinelmer Las, Inc. | Ultra-sensitive detection systems using multidimension signals |
WO2006094014A2 (en) | 2005-02-28 | 2006-09-08 | The Regents Of The University Of California | Methods for diagnosis and treatment of endometrial cancer |
US20100240770A1 (en) * | 2005-03-11 | 2010-09-23 | Jifa Qi | Synthesis and use of colloidal III-V nanoparticles |
WO2006100449A1 (en) | 2005-03-19 | 2006-09-28 | Medical Research Council | Improvements in or relating to treatment and prevention of viral infections |
PL1866328T3 (pl) | 2005-03-22 | 2011-05-31 | Rohto Pharma | Peptydy zwiększające wytwarzanie kolagenu lub kwasu hialuronowego |
EP1869230B1 (en) | 2005-03-23 | 2017-08-30 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Method for purifying proteins |
RU2413735C2 (ru) | 2005-03-31 | 2011-03-10 | Эдженсис, Инк. | Антитела и родственные молекулы, связывающиеся с белками 161p2f10b |
US8318906B2 (en) | 2005-04-15 | 2012-11-27 | The Regents Of The University Of California | EMP2 antibodies and their therapeutic uses |
US20070099830A1 (en) | 2005-04-21 | 2007-05-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Sirt4 activities |
WO2006124644A2 (en) * | 2005-05-12 | 2006-11-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Protein and antibody profiling using small molecule microarrays |
US8486629B2 (en) | 2005-06-01 | 2013-07-16 | Bioarray Solutions, Ltd. | Creation of functionalized microparticle libraries by oligonucleotide ligation or elongation |
US20070021433A1 (en) | 2005-06-03 | 2007-01-25 | Jian-Qiang Fan | Pharmacological chaperones for treating obesity |
PL1904093T3 (pl) | 2005-07-19 | 2018-12-31 | Stemgen S.P.A. | Hamowanie przez bmp-4 zdolności do tworzenia guzów przez komórki macierzyste guza |
AU2006272462A1 (en) * | 2005-08-16 | 2007-03-08 | Children's Mercy Hospital | Quantification of microsphere suspension hybridization and uses thereof |
US7943134B2 (en) | 2005-08-31 | 2011-05-17 | Academia Sinica | Compositions and methods for identifying response targets and treating flavivirus infection responses |
US7781209B2 (en) | 2005-09-25 | 2010-08-24 | Multispan, Inc. | GPCR-expressing cell lines |
CN101605810B (zh) | 2005-10-20 | 2013-07-17 | 塞诺米克斯公司 | 嵌合的人甜味-鲜味和鲜味-甜味受体 |
US8119572B2 (en) * | 2005-10-24 | 2012-02-21 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods for determining protein binding specificity using peptide libraries |
KR20080072644A (ko) | 2005-11-03 | 2008-08-06 | 레드포인트 바이오 코포레이션 | Trpm5 이온 채널용 고속 처리 스크리닝 검정 |
EA014900B1 (ru) | 2005-11-07 | 2011-02-28 | Зе Скрипс Ресеч Инститьют | Композиции и способы контроля специфичности передачи сигналов, опосредуемой тканевым фактором |
EP1951908B1 (en) | 2005-11-12 | 2013-08-07 | The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University | Fgf2-related methods for diagnosing and treating depression |
US7576037B2 (en) | 2005-11-18 | 2009-08-18 | Mei Technologies, Inc. | Process and apparatus for combinatorial synthesis |
PT3305900T (pt) | 2005-12-01 | 2021-10-27 | Nuevolution As | Métodos de codificação enzimática para síntese eficaz de bibliotecas grandes |
GB2433505A (en) * | 2005-12-20 | 2007-06-27 | Sharp Kk | Capture agents for binding a ligand |
GB2433506A (en) * | 2005-12-20 | 2007-06-27 | Sharp Kk | A method of producing a multimeric capture agent |
GB2433591A (en) * | 2005-12-20 | 2007-06-27 | Sharp Kk | Method for functionalising a hydrophobic substrate |
WO2007087113A2 (en) | 2005-12-28 | 2007-08-02 | The Scripps Research Institute | Natural antisense and non-coding rna transcripts as drug targets |
EP3913375A1 (en) | 2006-01-11 | 2021-11-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Microfluidic devices and methods of use in the formation and control of nanoreactors |
WO2007079755A1 (en) * | 2006-01-12 | 2007-07-19 | Janus Beierholm Holding Aps | Reimmunization and antibody design |
WO2007092777A2 (en) * | 2006-02-02 | 2007-08-16 | Wyeth | Cloning, characterization, and application of tnfrsf19 in neurological disorders |
US20100278821A1 (en) | 2006-03-21 | 2010-11-04 | The Regents Of The University Of California | N-cadherin: target for cancer diagnosis and therapy |
AU2007227195A1 (en) | 2006-03-21 | 2007-09-27 | The Regents Of The University Of California | N-cadherin and Ly6 E: targets for cancer diagnosis and therapy |
CN101472947A (zh) * | 2006-04-21 | 2009-07-01 | 惠氏公司 | 用于高通量筛选细胞系的方法 |
EP3398452A3 (en) | 2006-04-21 | 2018-11-28 | Senomyx, Inc. | Comestible compositions comprising high potency savory flavorants, and processes for producing them |
WO2007124755A1 (en) * | 2006-05-02 | 2007-11-08 | The Antibody Project Aps | Method for immunizing an avian species |
CN101421419B (zh) | 2006-05-02 | 2012-08-29 | 学校法人帝京大学 | 增加谷胱甘肽的物质的筛选方法 |
US9562837B2 (en) | 2006-05-11 | 2017-02-07 | Raindance Technologies, Inc. | Systems for handling microfludic droplets |
US20080003142A1 (en) | 2006-05-11 | 2008-01-03 | Link Darren R | Microfluidic devices |
US7862812B2 (en) | 2006-05-31 | 2011-01-04 | Lpath, Inc. | Methods for decreasing immune response and treating immune conditions |
ES2339960T3 (es) | 2006-06-07 | 2010-05-27 | NUTRINOVA NUTRITION SPECIALTIES & FOOD INGREDIENTS GMBH | Metodos de cribado para compuestos que modulan la actividad de receptores acoplados a proteina g. |
US7572618B2 (en) | 2006-06-30 | 2009-08-11 | Bristol-Myers Squibb Company | Polynucleotides encoding novel PCSK9 variants |
US7674594B2 (en) | 2006-07-27 | 2010-03-09 | Redpoint Bio Corporation | Screening assay for inhibitors of TRPA1 activation by a lower alkyl phenol |
EP2077912B1 (en) | 2006-08-07 | 2019-03-27 | The President and Fellows of Harvard College | Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants |
WO2008023840A2 (en) | 2006-08-25 | 2008-02-28 | Oncotherapy Science, Inc. | Prognostic markers and therapeutic targets for lung cancer |
WO2008030986A2 (en) | 2006-09-06 | 2008-03-13 | The Regents Of The University Of California | Molecular diagnosis and classification of malignant melanoma |
US20090252745A1 (en) * | 2006-09-15 | 2009-10-08 | Duke University | Amino acids in the HCV core polypeptide domain 3 and correlation with steatosis |
US20110294782A1 (en) | 2006-11-10 | 2011-12-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Small molecule pak inhibitors |
WO2008067196A2 (en) | 2006-11-16 | 2008-06-05 | The Regents Of The University Of California | Methods for identifying inhibitors of solute transporters |
AU2007341981A1 (en) | 2006-12-29 | 2008-07-10 | The Salk Institute For Biological Studies | Methods for enhancing exercise performance |
US20080176958A1 (en) | 2007-01-24 | 2008-07-24 | Insert Therapeutics, Inc. | Cyclodextrin-based polymers for therapeutics delivery |
US8772046B2 (en) | 2007-02-06 | 2014-07-08 | Brandeis University | Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems |
WO2008130623A1 (en) | 2007-04-19 | 2008-10-30 | Brandeis University | Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems |
US20080269065A1 (en) * | 2007-04-30 | 2008-10-30 | Syntrix Biosystems, Inc. | Conformationally Constrained Analytical Probes |
KR101440153B1 (ko) * | 2007-05-09 | 2014-09-15 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 펩타이드 라이브러리를 이용한 단백질 인산화 효소의기질특이성 분석 방법 |
CN101820757A (zh) | 2007-06-01 | 2010-09-01 | 普林斯顿大学托管委员会 | 通过调节宿主细胞代谢途径治疗病毒感染 |
NZ599430A (en) * | 2007-06-11 | 2014-03-28 | Loch Macdonald R | A drug delivery system for the prevention of cerebral vasospasm |
US10092524B2 (en) | 2008-06-11 | 2018-10-09 | Edge Therapeutics, Inc. | Compositions and their use to treat complications of aneurysmal subarachnoid hemorrhage |
US8334239B2 (en) * | 2007-07-10 | 2012-12-18 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | High affinity VEGF-receptor antagonists |
US8163874B2 (en) * | 2007-08-06 | 2012-04-24 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy | Beta helical peptide structures stable in aqueous and non-aqueous media and methods for preparing same |
US8703161B2 (en) * | 2007-08-13 | 2014-04-22 | Elc Management, Llc | Skin repair compositions comprising circadian gene activators and a synergistic combination of Sirt1 gene activators |
EP2522752B1 (en) | 2007-08-13 | 2014-04-02 | Baxter International Inc. | IVIG modulation of chemokines for treatment of Multiple Sclerosis, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease |
CZ2010180A3 (cs) | 2007-08-21 | 2010-10-13 | Senomyx, Inc | Identifikace lidských T2R receptoru, které reagují na horké slouceniny, které vyvolavají horkou chut v kompozicích, a jejich použití v testech pro identifikaci sloucenin, které inhibují (blokují) horkou chut v kompozicích a jejich použití |
CA2702025A1 (en) | 2007-10-01 | 2009-04-09 | Redpoint Bio Corporation | A non-desensitizing mutant of the transient receptor potential trpm5 ion channel |
AU2008308509B2 (en) | 2007-10-04 | 2014-10-23 | Zymogenetics, Inc. | B7 family member zB7H6 and related compositions and methods |
WO2011063161A2 (en) | 2009-11-20 | 2011-05-26 | The Regents Of The University Of California | Epithelial membrane protein-2 (emp2) and proliferative vitreoretinopathy (pvr) |
EP2924435A3 (en) | 2007-10-22 | 2015-11-04 | The Regents of The University of California | Biomarkers for prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus |
US8415361B2 (en) | 2007-11-09 | 2013-04-09 | The Salk Institute For Biological Studies | Use of TAM receptor inhibitors as antimicrobials |
WO2009079373A2 (en) | 2007-12-14 | 2009-06-25 | The Regents Of The University Of California | Inhibitors of calcium-activated chloride channels |
US9187535B2 (en) | 2007-12-19 | 2015-11-17 | Affibody Ab | Polypeptide derived from protein A and able to bind PDGF |
EP2077272A1 (en) * | 2007-12-21 | 2009-07-08 | Affibody AB | Polypeptide libraries with a predetermined scaffold |
EP2072525A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-06-24 | Affibody AB | New polypeptides having affinity for HER2 |
NZ587750A (en) | 2008-03-05 | 2012-10-26 | Univ California | Molecular diagnosis and classification of malignant melanoma |
WO2009117439A2 (en) | 2008-03-17 | 2009-09-24 | The Scripps Research Institute | Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells |
EP2278879B1 (en) | 2008-04-21 | 2016-06-15 | PATH Drug Solutions | Compounds, compositions and methods comprising oxadiazole derivatives |
EP2268654B1 (en) | 2008-04-21 | 2017-01-25 | The Regents Of The University Of California | Selective high-affinity polydentate ligands and methods of making such |
EP2116618A1 (en) | 2008-05-09 | 2009-11-11 | Agency for Science, Technology And Research | Diagnosis and treatment of Kawasaki disease |
AU2009266924B2 (en) * | 2008-07-01 | 2015-12-10 | Genocea Biosciences, Inc. | Antigen screening system |
US12038438B2 (en) | 2008-07-18 | 2024-07-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Enzyme quantification |
US20110262485A1 (en) | 2008-08-04 | 2011-10-27 | University Of Miami | Sting (stimulator of interferon genes), a regulator of innate immune responses |
CA2733790A1 (en) | 2008-08-20 | 2010-02-25 | Ensemble Discovery Corporation | Macrocyclic compounds for inhibition of tumor necrosis factor alpha |
CN102224254A (zh) | 2008-09-23 | 2011-10-19 | 哈佛大学校长及研究员协会 | Sirt4及其用途 |
EP2352748B1 (en) | 2008-09-25 | 2014-03-05 | University Of Guelph | Nitrogen responsive early nodulin gene |
US10131693B2 (en) | 2008-10-20 | 2018-11-20 | Gwangju Institute Of Science And Technology | Bipodal-peptide binder |
EP2352503B1 (en) | 2008-11-06 | 2017-07-19 | University of Miami | Role of soluble upar in the pathogenesis of proteinuric kidney disease |
EP2687609B1 (en) | 2008-11-10 | 2017-01-04 | The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services | Method for treating solid tumor |
WO2010060599A1 (en) | 2008-11-27 | 2010-06-03 | Roche Diagnostics Gmbh | Directed synthesis of oligophosphoramidate stereoisomers |
CN105001196B (zh) | 2008-12-03 | 2017-05-10 | 斯克里普斯研究所 | 干细胞培养 |
ES2600781T3 (es) | 2008-12-04 | 2017-02-10 | Curna, Inc. | Tratamiento para enfermedades relacionadas con el factor de crecimiento del endotelio vascular (vegf) mediante la inhibición de transcritos antisentido naturales de vegf |
KR101829469B1 (ko) | 2008-12-04 | 2018-03-30 | 큐알엔에이, 인크. | Epo에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 에리트로포에틴(epo) 관련된 질환의 치료 |
JP5923306B2 (ja) | 2008-12-04 | 2016-05-24 | クルナ・インコーポレーテッド | 腫瘍抑制遺伝子に対する天然アンチセンス転写物の抑制による腫瘍抑制遺伝子関連疾患の治療 |
US20100233172A1 (en) | 2008-12-16 | 2010-09-16 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods of inhibiting quiescent tumor proliferation |
SG172160A1 (en) | 2008-12-17 | 2011-07-28 | Scripps Research Inst | Generation and maintenance of stem cells |
US20120165650A1 (en) | 2010-12-22 | 2012-06-28 | General Electric Company | Her2 binders |
CN101768213B (zh) | 2008-12-30 | 2012-05-30 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种与植物分蘖数目相关的蛋白及其编码基因与应用 |
WO2010093904A2 (en) | 2009-02-12 | 2010-08-19 | Curna, Inc. | Treatment of brain derived neurotrophic factor (bdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to bdnf |
CN101817879A (zh) | 2009-02-26 | 2010-09-01 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 金属硫蛋白及其编码基因与应用 |
EP2408919B1 (en) | 2009-03-16 | 2017-10-18 | CuRNA, Inc. | Treatment of nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (nrf2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nrf2 |
ES2627763T3 (es) | 2009-03-17 | 2017-07-31 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con el homólogo tipo delta 1 (dlk1) por inhibición de transcrito antisentido natural a dlk1 |
EP3415235A1 (en) | 2009-03-23 | 2018-12-19 | Raindance Technologies Inc. | Manipulation of microfluidic droplets |
EP2411410B1 (en) | 2009-03-27 | 2015-07-08 | Gojo Industries, Inc. | Compositions and methods for screening and using compounds antagonizing spore-surface interactions |
US8343976B2 (en) | 2009-04-20 | 2013-01-01 | Institute For Oneworld Health | Compounds, compositions and methods comprising pyrazole derivatives |
CN102459596B (zh) | 2009-05-06 | 2016-09-07 | 库尔纳公司 | 通过针对脂质转运和代谢基因的天然反义转录物的抑制治疗脂质转运和代谢基因相关疾病 |
JP6250930B2 (ja) | 2009-05-06 | 2017-12-20 | クルナ・インコーポレーテッド | トリステトラプロリン(ttp)に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるttp関連疾患の治療 |
EP2427554B1 (en) | 2009-05-08 | 2016-11-16 | CuRNA, Inc. | Treatment of dystrophin family related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dmd family |
CN102575251B (zh) | 2009-05-18 | 2018-12-04 | 库尔纳公司 | 通过抑制针对重编程因子的天然反义转录物来治疗重编程因子相关的疾病 |
JP2012527248A (ja) | 2009-05-22 | 2012-11-08 | クルナ・インコーポレーテッド | 転写因子e3(tfe3)に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるtfe3およびインスリン受容体基質2(irs2)関連疾患の処置 |
KR101704988B1 (ko) | 2009-05-28 | 2017-02-08 | 큐알엔에이, 인크. | 항바이러스 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 항바이러스 유전자 관련된 질환의 치료 |
CA2765509C (en) | 2009-06-16 | 2021-08-17 | Joseph Collard | Treatment of paraoxonase 1 (pon1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to pon1 |
WO2010148050A2 (en) | 2009-06-16 | 2010-12-23 | Curna, Inc. | Treatment of collagen gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a collagen gene |
KR101807323B1 (ko) | 2009-06-24 | 2017-12-08 | 큐알엔에이, 인크. | Tnfr2에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 종양 괴사 인자 수용체 2(tnfr2) 관련된 질환의 치료 |
CA2765815A1 (en) | 2009-06-26 | 2010-12-29 | Opko Curna, Llc | Treatment of down syndrome gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a down syndrome gene |
EP2454269A4 (en) * | 2009-07-15 | 2013-03-06 | Agency Science Tech & Res | IMPROVED SCREENING OF BIOPOLYMERS |
US20120122711A1 (en) * | 2009-07-15 | 2012-05-17 | Heath James R | Screening of biopolymers |
SG178073A1 (en) | 2009-07-22 | 2012-03-29 | Agency Science Tech & Res | Differentiation of isobaric amino acids and other species |
CA2768947C (en) | 2009-07-24 | 2018-06-19 | Opko Curna, Llc | Treatment of sirtuin (sirt) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a sirtuin (sirt) |
AU2010275367B2 (en) | 2009-07-24 | 2015-09-03 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for treating and preventing disease associated with avB5 integrin |
EP2462229B1 (en) | 2009-08-05 | 2016-05-11 | CuRNA, Inc. | Treatment of insulin gene (ins) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an insulin gene (ins) |
CN102625841A (zh) | 2009-08-11 | 2012-08-01 | 欧科库尔纳有限责任公司 | 通过抑制脂连蛋白(adipoq)的天然反义转录物治疗脂连蛋白(adipoq)相关疾病 |
JP5823964B2 (ja) | 2009-08-14 | 2015-11-25 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 自閉症を診断及び治療する方法 |
WO2011022638A1 (en) | 2009-08-20 | 2011-02-24 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Trp inhibitors and uses thereof |
US8791087B2 (en) | 2009-08-21 | 2014-07-29 | Curna, Inc. | Treatment of ‘C terminus of HSP70-interacting protein’ (CHIP)related diseases by inhibition of natural antisense transcript to CHIP |
WO2011028390A1 (en) | 2009-08-24 | 2011-03-10 | St. Jude Children's Research Hospital | Compositions and methods for potentiating interleukin-35 |
CA2771172C (en) | 2009-08-25 | 2021-11-30 | Opko Curna, Llc | Treatment of 'iq motif containing gtpase activating protein' (iqgap) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to iqgap |
JP6175236B2 (ja) | 2009-09-25 | 2017-08-09 | カッパーアールエヌエー,インコーポレイテッド | フィラグリン(flg)の発現および活性の調整によるflg関連疾患の処置 |
EP2486409A1 (en) | 2009-10-09 | 2012-08-15 | Universite De Strasbourg | Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof |
ES2365343B1 (es) | 2009-11-19 | 2012-07-10 | Fundación Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii | Uso de cd98 como marcador de receptividad endometrial. |
US20110237540A1 (en) * | 2009-11-23 | 2011-09-29 | Crawford Thomas C | Cyclodextrin-based polymers for therapeutic delivery |
KR101823702B1 (ko) | 2009-12-16 | 2018-01-30 | 큐알엔에이, 인크. | 막 결합 전사 인자 펩티다제, 부위 1(mbtps1)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 mbtps1 관련 질환의 치료 |
RU2619185C2 (ru) | 2009-12-23 | 2017-05-12 | Курна, Инк. | Лечение заболеваний, связанных с разобщающим белком 2 (ucp2), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к ucp2 |
US10837883B2 (en) | 2009-12-23 | 2020-11-17 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Microfluidic systems and methods for reducing the exchange of molecules between droplets |
CN102869776B (zh) | 2009-12-23 | 2017-06-23 | 库尔纳公司 | 通过抑制肝细胞生长因子(hgf)的天然反义转录物而治疗hgf相关疾病 |
US8962585B2 (en) | 2009-12-29 | 2015-02-24 | Curna, Inc. | Treatment of tumor protein 63 (p63) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to p63 |
WO2011090740A2 (en) | 2009-12-29 | 2011-07-28 | Opko Curna, Llc | Treatment of nuclear respiratory factor 1 (nrf1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nrf1 |
KR101853511B1 (ko) | 2009-12-31 | 2018-06-20 | 큐알엔에이, 인크. | 인슐린 수용체 기질 2 및 전사 인자 e3(tfe3)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 irs2 관련된 질환의 치료 |
KR101878501B1 (ko) | 2010-01-04 | 2018-08-07 | 큐알엔에이, 인크. | 인터페론 조절 인자 8 (irf8)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 인터페론 조절 인자 8 (irf8) 관련된 질환의 치료 |
KR101853509B1 (ko) | 2010-01-06 | 2018-04-30 | 큐알엔에이, 인크. | 췌장 발달 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 췌장 발달 유전자와 관련된 질환의 치료 |
CA2786535C (en) | 2010-01-11 | 2019-03-26 | Curna, Inc. | Treatment of sex hormone binding globulin (shbg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to shbg |
CN202823394U (zh) | 2010-01-19 | 2013-03-27 | 伊鲁米那股份有限公司 | 用于处理化学反应的设备和系统 |
US9216189B2 (en) | 2010-01-25 | 2015-12-22 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Antibodies which bind type I cannabinoid receptor/angiotensis II receptor heteromers |
JP5981850B2 (ja) | 2010-01-25 | 2016-08-31 | カッパーアールエヌエー,インコーポレイテッド | RNaseH1に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるRNaseH1関連疾患の治療 |
WO2011094759A2 (en) | 2010-02-01 | 2011-08-04 | The Regents Of The University Of California | Novel diagnostic and therapeutic targets associated with or regulated by n-cadherin expression and/or epithelial to mesenchymal transition (emt) in prostate cancer and other malignancies |
US10351905B2 (en) | 2010-02-12 | 2019-07-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analyte analysis |
EP3392349A1 (en) | 2010-02-12 | 2018-10-24 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
US9399797B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-07-26 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
US9366632B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-06-14 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
JP5976548B2 (ja) | 2010-02-22 | 2016-08-23 | カッパーアールエヌエー,インコーポレイテッド | Pycr1に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるピロリン−5−カルボン酸レダクターゼ1(pycr1)関連疾患の治療 |
US8980856B2 (en) | 2010-04-02 | 2015-03-17 | Curna, Inc. | Treatment of colony-stimulating factor 3 (CSF3) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to CSF3 |
WO2011127337A2 (en) | 2010-04-09 | 2011-10-13 | Opko Curna Llc | Treatment of fibroblast growth factor 21 (fgf21) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to fgf21 |
EP3540059A1 (en) | 2010-04-16 | 2019-09-18 | Nuevolution A/S | Bi-functional complexes and methods for making and using such complexes |
CA2798218A1 (en) | 2010-05-03 | 2011-11-10 | Curna, Inc. | Treatment of sirtuin (sirt) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a sirtuin (sirt) |
TWI531370B (zh) | 2010-05-14 | 2016-05-01 | 可娜公司 | 藉由抑制par4天然反股轉錄本治療par4相關疾病 |
JP5917497B2 (ja) | 2010-05-26 | 2016-05-18 | カッパーアールエヌエー,インコーポレイテッド | メチオニンスルホキシドレダクターゼa(msra)に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるmsra関連疾患の治療 |
EP2576783B1 (en) | 2010-05-26 | 2017-11-29 | CuRNA, Inc. | Treatment of atonal homolog 1 (atoh1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to atoh1 |
EP2400304A1 (en) | 2010-06-22 | 2011-12-28 | Centro de Investigación Cooperativa En Biomateriales ( CIC biomaGUNE) | Method for the characterization of intermolecular interactions |
CN103025873B (zh) | 2010-06-23 | 2018-05-08 | 库尔纳公司 | 通过抑制电压门控钠通道α亚基(SCNA)的天然反义转录物而治疗SCNA相关疾病 |
JP5998131B2 (ja) | 2010-07-14 | 2016-09-28 | カッパーアールエヌエー,インコーポレイテッド | Discslargehomolog(dlg)dlg1への天然アンチセンス転写物の阻害によるdlg関連疾患の治療 |
WO2012018638A2 (en) | 2010-07-26 | 2012-02-09 | Biomatrica, Inc. | Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures |
US9845489B2 (en) | 2010-07-26 | 2017-12-19 | Biomatrica, Inc. | Compositions for stabilizing DNA, RNA and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures |
SG10201506785SA (en) * | 2010-08-27 | 2015-10-29 | Agency Science Tech & Res | Peptide libraries for screening and other applications |
EP2622103B2 (en) | 2010-09-30 | 2022-11-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Sandwich assays in droplets |
RU2624048C2 (ru) | 2010-10-06 | 2017-06-30 | Курна, Инк. | Лечение заболеваний, связанных с геном сиалидазы 4 (neu4), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена neu4 |
WO2012052391A1 (en) | 2010-10-19 | 2012-04-26 | Glaxo Group Limited | Polypeptide with jmjd3 catalytic activity |
WO2012054723A2 (en) | 2010-10-22 | 2012-04-26 | Opko Curna Llc | Treatment of alpha-l-iduronidase (idua) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to idua |
US10000752B2 (en) | 2010-11-18 | 2018-06-19 | Curna, Inc. | Antagonat compositions and methods of use |
EP2643484A4 (en) | 2010-11-22 | 2014-04-16 | Univ California | METHOD OF IDENTIFYING AN RNA TRANSCRIPTION OF CELLULAR ORIGIN |
KR102010598B1 (ko) | 2010-11-23 | 2019-08-13 | 큐알엔에이, 인크. | Nanog에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 nanog 관련된 질환의 치료 |
CN103380212B (zh) | 2010-12-22 | 2017-04-05 | 菲特治疗公司 | 用于单细胞分选与增强ipsc重新编程的细胞培养平台 |
WO2012109495A1 (en) | 2011-02-09 | 2012-08-16 | Metabolic Solutions Development Company, Llc | Cellular targets of thiazolidinediones |
EP3859011A1 (en) | 2011-02-11 | 2021-08-04 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods for forming mixed droplets |
EP2675893B1 (en) | 2011-02-18 | 2019-01-09 | The Scripps Research Institute | Directed differentiation of oligodendrocyte precursor cells to a myelinating cell fate |
EP2675819B1 (en) | 2011-02-18 | 2020-04-08 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Compositions and methods for molecular labeling |
SG192856A1 (en) | 2011-03-04 | 2013-09-30 | Intrexon Corp | Vectors conditionally expressing protein |
WO2012119989A2 (en) | 2011-03-04 | 2012-09-13 | Oryzon Genomics, S.A. | Methods and antibodies for the diagnosis and treatment of cancer |
WO2012138854A1 (en) | 2011-04-05 | 2012-10-11 | Edge Therapeutics | Intraventricular drug delivery system for improving outcome after a brain injury affecting cerebral blood flow |
US20120301904A1 (en) | 2011-04-26 | 2012-11-29 | Prosetta Antiviral, Inc | Multiprotein assemblies |
EP2710144B1 (en) | 2011-05-19 | 2020-10-07 | Agena Bioscience, Inc. | Processes for multiplex nucleic acid identification |
US8841071B2 (en) | 2011-06-02 | 2014-09-23 | Raindance Technologies, Inc. | Sample multiplexing |
DE202012013668U1 (de) | 2011-06-02 | 2019-04-18 | Raindance Technologies, Inc. | Enzymquantifizierung |
US9561274B2 (en) | 2011-06-07 | 2017-02-07 | University Of Hawaii | Treatment and prevention of cancer with HMGB1 antagonists |
US9244074B2 (en) | 2011-06-07 | 2016-01-26 | University Of Hawaii | Biomarker of asbestos exposure and mesothelioma |
RU2620980C2 (ru) | 2011-06-09 | 2017-05-30 | Курна, Инк. | Лечение заболеваний, связанных с фратаксином (fxn), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта fxn |
US8658430B2 (en) | 2011-07-20 | 2014-02-25 | Raindance Technologies, Inc. | Manipulating droplet size |
WO2013018690A1 (ja) | 2011-07-29 | 2013-02-07 | 国立大学法人徳島大学 | Erap1由来ペプチド及びその使用 |
WO2013077921A2 (en) | 2011-09-02 | 2013-05-30 | The Regents Of The University Of California | Substituted pyrazolo[3,4-d]pyrimidines and uses thereof |
EA029151B1 (ru) | 2011-09-06 | 2018-02-28 | Курна, Инк. | ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С АЛЬФА-СУБЪЕДИНИЦАМИ ПОТЕНЦИАЛЗАВИСИМЫХ НАТРИЕВЫХ КАНАЛОВ (SCNxA), С ПОМОЩЬЮ МАЛЫХ МОЛЕКУЛ |
EP2771043A4 (en) | 2011-10-28 | 2015-04-29 | Presage Biosciences Inc | METHODS OF DRUG DELIVERY |
JP2015500345A (ja) | 2011-12-16 | 2015-01-05 | トランスポサジェン・バイオファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドTransposagen Biopharmaceuticals, Inc. | 疼痛の治療または予防に使用されるtrpc4調節因子 |
EP2812344A4 (en) | 2012-02-07 | 2015-10-28 | Vibrant Holdings Llc | SUBSTRATE, PEPTIDARRAYS AND METHOD |
US9708411B2 (en) | 2012-02-16 | 2017-07-18 | The Penn Research Foundation | Modulators of acyl-CoA lysocardiolipin acyltransferase 1 (ALCAT1) and uses thereof |
EP2825210B1 (en) | 2012-03-14 | 2019-06-26 | University of Central Florida Research Foundation, Inc. | Lim kinasemodulating agents for neurofibromatoses therapy and methods for screening for same |
WO2013138374A2 (en) | 2012-03-15 | 2013-09-19 | Curna, Inc. | Treatment of brain derived neurotrophic factor (bdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to bdnf |
JP6399660B2 (ja) | 2012-04-10 | 2018-10-03 | ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイー・オブ・カリフオルニア | 癌治療用組成物および方法 |
EP2841450A2 (en) | 2012-04-24 | 2015-03-04 | University of Miami | Perforin 2 defense against invasive and multidrug resistant pathogens |
US9399019B2 (en) | 2012-05-09 | 2016-07-26 | Evonik Corporation | Polymorph compositions, methods of making, and uses thereof |
WO2013184645A2 (en) | 2012-06-04 | 2013-12-12 | The Scripps Research Institute | Novel phenyl glyoxal probes |
EP2877211A4 (en) | 2012-07-25 | 2016-02-10 | Salk Inst For Biological Studi | REGULATION OF THE INTERACTION BETWEEN TAM LIGANDS AND LIPID MEMBRANES CONTAINING PHOSPHATIDYLSERIN |
CA2922849A1 (en) | 2012-08-31 | 2014-03-06 | Ixchel Pharma, Llc | Agents useful for treating obesity, diabetes and related disorders |
RU2015115631A (ru) | 2012-09-26 | 2016-11-20 | Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Калифорния | Модулирование ire1 |
US10006909B2 (en) | 2012-09-28 | 2018-06-26 | Vibrant Holdings, Llc | Methods, systems, and arrays for biomolecular analysis |
WO2014055493A1 (en) | 2012-10-02 | 2014-04-10 | Cerulean Pharma Inc. | Methods and systems for polymer precipitation and generation of particles |
AU2013204200B2 (en) | 2012-10-11 | 2016-10-20 | Brandeis University | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis |
US20140120116A1 (en) | 2012-10-26 | 2014-05-01 | The Chinese University Of Hong Kong | Treatment of cancer using smad3 inhibitor |
CA2889765C (en) | 2012-10-26 | 2021-06-22 | Minna D. BALBAS | Androgen receptor variants and methods for making and using |
US10286376B2 (en) | 2012-11-14 | 2019-05-14 | Vibrant Holdings, Llc | Substrates, systems, and methods for array synthesis and biomolecular analysis |
JP2016505826A (ja) * | 2012-12-10 | 2016-02-25 | フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター | スクリーニングの方法 |
WO2014100755A2 (en) | 2012-12-20 | 2014-06-26 | Biomatrica, Inc. | Formulations and methods for stabilizing pcr reagents |
US20140288097A1 (en) | 2013-02-07 | 2014-09-25 | The Regents Of The University Of California | Use of translational profiling to identify target molecules for therapeutic treatment |
CA2923379C (en) | 2013-02-15 | 2023-01-03 | Vibrant Holdings, Llc | Methods and compositions for amplified electrochemiluminescence detection |
US9227978B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-01-05 | Araxes Pharma Llc | Covalent inhibitors of Kras G12C |
WO2014144844A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | tRNA DERIVED SMALL RNAs (tsRNAs) INVOLVED IN CELL VIABILITY |
WO2014172661A1 (en) | 2013-04-19 | 2014-10-23 | The Regent Of The University Of California | Lone star virus |
US10626178B2 (en) | 2013-08-21 | 2020-04-21 | Raz Yirmiya | Treatment of mood and stress related disorders |
US9950036B2 (en) | 2013-08-21 | 2018-04-24 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Treatment of mood and stress related disorders |
US11901041B2 (en) | 2013-10-04 | 2024-02-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analysis of nucleic acid modification |
TWI659021B (zh) | 2013-10-10 | 2019-05-11 | 亞瑞克西斯製藥公司 | Kras g12c之抑制劑 |
WO2015057461A2 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-23 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Antibodies that specifically bind ataxia telangiectasia-mutated and rad3-related kinase phosphorylated at position 1989 and their use |
WO2015089327A1 (en) | 2013-12-11 | 2015-06-18 | Biogen Idec Ma Inc. | Biaryl compounds useful for the treatment of human diseases in oncology, neurology and immunology |
US10919929B2 (en) | 2013-12-11 | 2021-02-16 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Glucocorticoid inhibitors for treatment of prostate cancer |
US9944977B2 (en) | 2013-12-12 | 2018-04-17 | Raindance Technologies, Inc. | Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample |
US11193176B2 (en) | 2013-12-31 | 2021-12-07 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Method for detecting and quantifying latent retroviral RNA species |
KR102460549B1 (ko) | 2014-03-04 | 2022-10-28 | 페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드 | 개선된 재프로그래밍 방법 및 세포 배양 플랫폼 |
WO2015136509A2 (en) | 2014-03-14 | 2015-09-17 | Genesis Theranostix Korlatolt Felelossegu Tarsasag | Diagnostic and therapeutic targets for preeclampsia and closely related complications of pregnancy |
EP3656215B1 (en) | 2014-06-10 | 2021-08-04 | Biomatrica, INC. | Stabilization of thrombocytes at ambient temperatures |
JO3556B1 (ar) | 2014-09-18 | 2020-07-05 | Araxes Pharma Llc | علاجات مدمجة لمعالجة السرطان |
US10011600B2 (en) | 2014-09-25 | 2018-07-03 | Araxes Pharma Llc | Methods and compositions for inhibition of Ras |
EP3197870B1 (en) | 2014-09-25 | 2020-08-19 | Araxes Pharma LLC | Inhibitors of kras g12c mutant proteins |
AU2016245864C1 (en) | 2015-04-10 | 2021-09-09 | Araxes Pharma Llc | Substituted quinazoline compounds and methods of use thereof |
CA2982360A1 (en) | 2015-04-15 | 2016-10-20 | Liansheng Li | Fused-tricyclic inhibitors of kras and methods of use thereof |
EP3286328B1 (en) | 2015-04-24 | 2020-10-21 | Agena Bioscience, Inc. | Multiplex methods for detection and quantification of minor variants |
EP3286327B1 (en) | 2015-04-24 | 2021-11-10 | Agena Bioscience, Inc. | Multiplexed method for the identification and quantitation of minor alleles and polymorphisms |
WO2016195982A2 (en) | 2015-06-01 | 2016-12-08 | The Penn State Research Foundation | Hepatitis b virus capsid assembly |
US20160370380A1 (en) * | 2015-06-16 | 2016-12-22 | Pharmaseq, Inc. | Combinatorial antibody diagnostic |
US10851423B2 (en) | 2015-06-22 | 2020-12-01 | Proteovista Llc | SNP arrays |
EP3314260B1 (en) | 2015-06-24 | 2021-04-21 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for detecting protein-protein interactions |
US10144724B2 (en) | 2015-07-22 | 2018-12-04 | Araxes Pharma Llc | Substituted quinazoline compounds and methods of use thereof |
US10647981B1 (en) | 2015-09-08 | 2020-05-12 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Nucleic acid library generation methods and compositions |
US10975071B2 (en) | 2015-09-28 | 2021-04-13 | Araxes Pharma Llc | Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins |
WO2017058768A1 (en) | 2015-09-28 | 2017-04-06 | Araxes Pharma Llc | Inhibitors of kras g12c mutant proteins |
US10689356B2 (en) | 2015-09-28 | 2020-06-23 | Araxes Pharma Llc | Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins |
US10730867B2 (en) | 2015-09-28 | 2020-08-04 | Araxes Pharma Llc | Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins |
WO2017058792A1 (en) | 2015-09-28 | 2017-04-06 | Araxes Pharma Llc | Inhibitors of kras g12c mutant proteins |
US10875842B2 (en) | 2015-09-28 | 2020-12-29 | Araxes Pharma Llc | Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins |
EP3356353A1 (en) | 2015-09-28 | 2018-08-08 | Araxes Pharma LLC | Inhibitors of kras g12c mutant proteins |
EP3362570A4 (en) | 2015-10-16 | 2019-03-20 | Fate Therapeutics, Inc. | PLATFORM FOR INDUCTION AND MAINTENANCE OF PLURIPOTENCE IN THE FUNDAMENTAL STATE |
JP2018533939A (ja) | 2015-10-19 | 2018-11-22 | アラクセス ファーマ エルエルシー | Rasの阻害剤をスクリーニングするための方法 |
MX2018005967A (es) | 2015-11-16 | 2018-08-29 | Araxes Pharma Llc | Compuestos de quinazolina 2-sustituida que comprenden un grupo heterociclico sustituido y metodos de uso de los mismos. |
KR20230145258A (ko) | 2015-12-08 | 2023-10-17 | 바이오매트리카 인코포레이티드 | 적혈구 침강 속도의 감소 |
WO2017100546A1 (en) | 2015-12-09 | 2017-06-15 | Araxes Pharma Llc | Methods for preparation of quinazoline derivatives |
CA3013829A1 (en) | 2016-02-09 | 2017-08-17 | Alexander Krantz | Site-selective functionalization of proteins using traceless affinity labels |
US10822312B2 (en) | 2016-03-30 | 2020-11-03 | Araxes Pharma Llc | Substituted quinazoline compounds and methods of use |
US10646488B2 (en) | 2016-07-13 | 2020-05-12 | Araxes Pharma Llc | Conjugates of cereblon binding compounds and G12C mutant KRAS, HRAS or NRAS protein modulating compounds and methods of use thereof |
WO2018036503A1 (en) | 2016-08-25 | 2018-03-01 | The Chinese University Of Hong Kong | Fecal bacterial markers for colorectal cancer |
WO2018064510A1 (en) | 2016-09-29 | 2018-04-05 | Araxes Pharma Llc | Inhibitors of kras g12c mutant proteins |
US10726944B2 (en) | 2016-10-04 | 2020-07-28 | International Business Machines Corporation | Recommending novel reactants to synthesize chemical products |
CN110312711A (zh) | 2016-10-07 | 2019-10-08 | 亚瑞克西斯制药公司 | 作为ras抑制剂的杂环化合物及其使用方法 |
CN110291084A (zh) | 2016-12-15 | 2019-09-27 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于治疗癌症的组合物和方法 |
US11358959B2 (en) | 2017-01-26 | 2022-06-14 | Araxes Pharma Llc | Benzothiophene and benzothiazole compounds and methods of use thereof |
EP3573954A1 (en) | 2017-01-26 | 2019-12-04 | Araxes Pharma LLC | Fused bicyclic benzoheteroaromatic compounds and methods of use thereof |
US11059819B2 (en) | 2017-01-26 | 2021-07-13 | Janssen Biotech, Inc. | Fused hetero-hetero bicyclic compounds and methods of use thereof |
WO2018140513A1 (en) | 2017-01-26 | 2018-08-02 | Araxes Pharma Llc | 1-(3-(6-(3-hydroxynaphthalen-1-yl)benzofuran-2-yl)azetidin-1yl)prop-2-en-1-one derivatives and similar compounds as kras g12c modulators for treating cancer |
US11136308B2 (en) | 2017-01-26 | 2021-10-05 | Araxes Pharma Llc | Substituted quinazoline and quinazolinone compounds and methods of use thereof |
US11771703B2 (en) | 2017-03-17 | 2023-10-03 | The Johns Hopkins University | Targeted epigenetic therapy against distal regulatory element of TGFβ2 expression |
US11555031B2 (en) | 2017-03-20 | 2023-01-17 | The Broad Institute, Inc. | Compounds and methods for regulating insulin secretion |
AU2018240199A1 (en) | 2017-03-20 | 2019-10-17 | Genocea Biosciences, Inc. | Treatment methods |
WO2018218069A1 (en) | 2017-05-25 | 2018-11-29 | Araxes Pharma Llc | Quinazoline derivatives as modulators of mutant kras, hras or nras |
CN110869358A (zh) | 2017-05-25 | 2020-03-06 | 亚瑞克西斯制药公司 | Kras的共价抑制剂 |
TW201906832A (zh) | 2017-05-25 | 2019-02-16 | 美商亞瑞克西斯製藥公司 | 用於癌症治療之化合物及其使用方法 |
WO2018218250A2 (en) | 2017-05-26 | 2018-11-29 | Vibrant Holdings, Llc | Photoactive compounds and methods for biomolecule detection and sequencing |
EP3675880B1 (en) | 2017-09-01 | 2023-06-07 | The Johns Hopkins University | Targeted epigenetic therapy for inherited aortic aneurysm condition |
EP3692073A4 (en) | 2017-10-03 | 2021-05-26 | Cedars-Sinai Medical Center | METHOD OF TARGETING THE IMMUNE CHECK POINT PD1 SIGNAL PATH FOR TREATMENT OF LUNG FIBROSIS |
EP3703676A4 (en) | 2017-11-04 | 2021-12-15 | Advanced Proteome Therapeutics, Inc. | COMPOSITION AND PROCESS FOR MODIFYING POLYPEPTIDES |
CA3116594A1 (en) | 2018-10-29 | 2020-05-07 | Genocea Biosciences, Inc. | Treatment methods |
EP3873488A4 (en) | 2018-10-31 | 2022-08-03 | The University of Sydney | COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF VIRUS INFECTION |
WO2020097261A1 (en) | 2018-11-06 | 2020-05-14 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | New compositions and methods for treating beta-globinopathies |
WO2020159445A1 (en) | 2019-01-31 | 2020-08-06 | Agency For Science, Technology And Research | Cnx/erp57 inhibitor for use in the treatment or prevention of cancer |
US20220249559A1 (en) | 2019-05-13 | 2022-08-11 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy |
RU2699563C1 (ru) * | 2019-05-29 | 2019-09-06 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт-ПИЯФ) | Модифицированный синтетический аналог природного опиоидного пептида энкефалина |
DE102020202529A1 (de) * | 2020-02-27 | 2021-09-02 | Robert Bosch Gesellschaft mit beschränkter Haftung | Verfahren zur Identifikation einer Wirkstoffkombination |
US11965162B2 (en) | 2020-04-16 | 2024-04-23 | The Johns Hopkins University | MicroRNA and inhibitors thereof and methods of treatment |
WO2023081167A2 (en) | 2021-11-02 | 2023-05-11 | The Regents Of The University Of California | P-selectin mutants and modulation of integrin-mediated signaling |
WO2023086969A2 (en) | 2021-11-12 | 2023-05-19 | Ichor Medical Systems Inc. | Treatment methods |
WO2023146807A1 (en) | 2022-01-25 | 2023-08-03 | The Regents Of The University Of California | Vegf mutants and modulation of integrin-mediated signaling |
Family Cites Families (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4392997A (en) * | 1981-07-06 | 1983-07-12 | Northwestern University | Antigenic peptide compounds |
US4618598A (en) * | 1982-04-12 | 1986-10-21 | Duke University | Method of regulating hormone function or release |
NZ207394A (en) * | 1983-03-08 | 1987-03-06 | Commw Serum Lab Commission | Detecting or determining sequence of amino acids |
US4703008A (en) * | 1983-12-13 | 1987-10-27 | Kiren-Amgen, Inc. | DNA sequences encoding erythropoietin |
US4555101A (en) * | 1984-03-13 | 1985-11-26 | Stobb, Inc. | Method and apparatus for separating signatures from a stack |
US4590003A (en) * | 1984-03-23 | 1986-05-20 | Oncogen | Platelet related growth regulator |
US4569792A (en) * | 1984-06-14 | 1986-02-11 | Eli Lilly And Company | Anti-diabetic compounds |
US4625014A (en) * | 1984-07-10 | 1986-11-25 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Cell-delivery agent |
CA1255586A (en) * | 1984-07-24 | 1989-06-13 | Hendrik M. Geysen | Method of determining mimotopes |
US4798787A (en) * | 1984-09-19 | 1989-01-17 | Cetus Corporation | Peptide antibodies and their use in detecting oncogene products |
US4705777A (en) * | 1985-02-25 | 1987-11-10 | The Regents Of The University Of California | Cationic oligopeptides having microbicidal activity |
US4863857A (en) * | 1985-03-01 | 1989-09-05 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Polypeptide complementary to peptides or proteins having an amino acid sequence or nucleotide coding sequence at least partially known |
US4631211A (en) * | 1985-03-25 | 1986-12-23 | Scripps Clinic & Research Foundation | Means for sequential solid phase organic synthesis and methods using the same |
NZ215865A (en) * | 1985-04-22 | 1988-10-28 | Commw Serum Lab Commission | Method of determining the active site of a receptor-binding analogue |
WO1986006487A1 (en) * | 1985-04-22 | 1986-11-06 | Commonwealth Serum Laboratories Commission | Method for determining mimotopes |
US4710489A (en) * | 1985-04-22 | 1987-12-01 | Cornell Research Foundation, Inc. | Glutathione delivery system |
CS256960B1 (en) * | 1985-11-16 | 1988-04-15 | Viktor Krchnak | Peptides with properties of antigenic determinants and method of their production |
US4780421A (en) * | 1986-04-03 | 1988-10-25 | Sclavo Inc. | Cleavable labels for use in binding assays |
US4837304A (en) * | 1987-05-22 | 1989-06-06 | Merck & Co., Inc. | Inhibitor of ribonucleotide reductase |
KR890701761A (ko) * | 1987-10-13 | 1989-12-21 | 제롤드 엘.글릭 | 면역 진단시약의 제조방법 |
DE68928704T2 (de) * | 1988-03-24 | 1998-12-10 | Terrapin Technologies, Inc., San Francisco, Calif. | Gruppe von getrennten peptiden |
US5010175A (en) * | 1988-05-02 | 1991-04-23 | The Regents Of The University Of California | General method for producing and selecting peptides with specific properties |
WO1989011211A2 (en) * | 1988-05-24 | 1989-11-30 | Gesellschaft Für Biotechnologische Forschung Mbh ( | Oligonucleotide bank and process for dna sequencing |
US4988625A (en) * | 1988-11-09 | 1991-01-29 | Merck & Co., Inc. | Method for determining the functionalization of a solid support |
CA2009996A1 (en) * | 1989-02-17 | 1990-08-17 | Kathleen S. Cook | Process for making genes encoding random polymers of amino acids |
US5182366A (en) * | 1990-05-15 | 1993-01-26 | Huebner Verena D | Controlled synthesis of peptide mixtures using mixed resins |
US5650489A (en) * | 1990-07-02 | 1997-07-22 | The Arizona Board Of Regents | Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof |
-
1991
- 1991-06-19 US US07/717,454 patent/US5650489A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-01 RO RO93-00398A patent/RO112336B1/ro unknown
- 1991-07-01 DK DK91913268T patent/DK0542770T3/da active
- 1991-07-01 ES ES91913268T patent/ES2126572T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-01 SK SK4073-92A patent/SK281490B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 CA CA002086672A patent/CA2086672C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-01 NZ NZ23880591A patent/NZ238805A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 IL IL9868291A patent/IL98682A/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 IE IE229991A patent/IE912299A1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 PL PL91299372A patent/PL168354B1/pl unknown
- 1991-07-01 JP JP51265091A patent/JP3552718B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-01 AU AU82385/91A patent/AU659091B2/en not_active Expired
- 1991-07-01 AT AT91913268T patent/ATE176330T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 PL PL91308051A patent/PL169616B1/pl unknown
- 1991-07-01 WO PCT/US1991/004666 patent/WO1992000091A1/en active IP Right Grant
- 1991-07-01 HU HU9204179A patent/HU218007B/hu unknown
- 1991-07-01 EP EP91913268A patent/EP0542770B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-01 DE DE69130828T patent/DE69130828T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-02 MX MX9100052A patent/MX9100052A/es unknown
-
1992
- 1992-12-31 CZ CS19924073A patent/CZ289365B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-12-31 FI FI925986A patent/FI107995B/fi not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-01-04 KR KR1019930700015A patent/KR100222146B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-01-04 NO NO19930011A patent/NO315002B1/no not_active IP Right Cessation
- 1993-02-08 US US08/014,979 patent/US5510240A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-08-04 AU AU28369/95A patent/AU2836995A/en not_active Withdrawn
- 1995-08-10 AU AU28454/95A patent/AU683762B2/en not_active Expired
-
1996
- 1996-10-23 US US08/735,623 patent/US5858670A/en not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-02-17 GR GR990400528T patent/GR3029443T3/el unknown
- 1999-03-02 KR KR1019997001697A patent/KR100245767B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0542770B1 (en) | Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof | |
Salmon et al. | Discovery of biologically active peptides in random libraries: solution-phase testing after staged orthogonal release from resin beads. | |
EP1310510B1 (en) | Topologically segregated, encoded solid phase libraries | |
US6090912A (en) | Topologically segregated, encoded solid phase libraries comprising linkers having an enzymatically susceptible bond | |
EP0332225B1 (en) | Antibody to polypeptides complementary to peptides or proteins having an amino acid sequence or nucleotide coding sequence at least partially known and methods of design therefor | |
JP2003327597A (ja) | イミノジ酢酸エステル結合に基づく選択的に開裂可能なリンカー | |
DE69409312T2 (de) | Herstellung und Durchmusterung von hochgradig diversen Peptidbanken hinschtlich Bindungsaktivität | |
JPH09504522A (ja) | 細胞接着インヒビターの同定に有用なグリコ−ペプチドのライブラリー | |
JP2002530059A (ja) | 輸送ベクター | |
JPS62502513A (ja) | 少なくとも部分的に知られたアミノ酸配列又はヌクレオチド解読配列を有するペプチド類又は蛋白質類に相補的なポリペプチド類及びその設計方法 | |
WO1994018345A1 (en) | Receptor-binding antiproliferative peptides | |
US5639852A (en) | Immunostimulatory agents | |
EP0138616A2 (en) | Nona- and dodecapeptides for augmenting natural killer cell activity, processes for making them and pharmaceutical compositions comprising them | |
RU2145233C1 (ru) | Неупорядоченная библиотека пептидов, способ ее получения и способ идентификации пептида, синтезированного твердофазным синтезом | |
CA2234723A1 (en) | Generating d-peptides: methods and compositions | |
Rapaka et al. | Opioid peptides: an update | |
EP0872555A1 (en) | Bacterial peptide library | |
Sepetov et al. | A One-Bead One-Peptide Combinatorial Library Method for B-Cell Epitope Mapping |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
DGB9 | Succession in title of applicant |
Owner name: THE ARIZONA BOARD OF REGENTS, US |