ES2600781T3 - Tratamiento para enfermedades relacionadas con el factor de crecimiento del endotelio vascular (vegf) mediante la inhibición de transcritos antisentido naturales de vegf - Google Patents

Tratamiento para enfermedades relacionadas con el factor de crecimiento del endotelio vascular (vegf) mediante la inhibición de transcritos antisentido naturales de vegf Download PDF

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Abstract

Un oligonucleótido que tiene como diana un transcrito antisentido natural del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) para su uso como compuesto terapéutico, en el que el oligonucleótido modula la expresión del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y en el que el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de ácido nucleico mostrada en una de las SEC ID N.º 2 o 3.

Description

DESCRIPCION
Tratamiento para enfermedades relacionadas con el factor de crecimiento del endotelio vascular (vegf) mediante la inhibicion de transcritos antisentido naturales de vegf 5
REFERENCIA CRUZADA
[0001] Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE. UU. 61/119.957, presentada el 4 de diciembre de 2008.
10
CAMPO DE LA INVENClON
[0002] Los casos de la memoria descriptiva comprenden oligonucleotidos que modulan la expresion y/o la funcion del VEGF y moleculas asociadas.
15
ANTECEDENTES
[0003] La hibridacion de ADN-ARN y ARN-ARN es importante en muchos aspectos de la funcion de los acidos nucleicos como la replicacion, la transcripcion y la traduccion del ADN. La hibridacion tambien es fundamental
20 para diversas tecnologfas que bien detectan un acido nucleico en particular o alteran su expresion. Los nucleotidos antisentido, por ejemplo, interrumpen la expresion genica mediante la hibridacion con un ARN diana, interfiriendo de este modo con el ayuste, la transcripcion, la traduccion y la replicacion del ARN. El ADN antisentido tiene la caracterfstica anadida de que los hfbridos ADN-ARN sirven como sustrato para la digestion de la ribonucleasa H, una actividad que esta presente en la mayorfa de los tipos celulares. Las moleculas antisentido pueden 25 administrarse al interior de las celulas, como en el caso de los oligodeoxinucleotidos (ODN), o pueden expresarse a partir de genes endogenos como moleculas de ARN. La FDA ha aprobado recientemente un farmaco complementario, VITRAVENE™ (para el tratamiento de la retinitis por citomegalovirus), que refleja que las moleculas antisentido son de utilidad terapeutica.
30 RESUMEN
[0004] La invencion se define en las reivindicaciones. Aquellos aspectos/casos de la presente memoria descriptiva que constituyen la invencion se definen en las reivindicaciones.
35 [0005] Este resumen se proporciona para presentar un resumen de la memoria descriptiva en la que se
indica brevemente la naturaleza y sustancia de la memoria descriptiva. Se envfa con el conocimiento de que no se utilizara para interpretar o limitar el alcance o significado de las reivindicaciones.
[0006] En un caso, la memoria descriptiva proporciona procedimientos para inhibir la accion de un transcrito
40 antisentido natural utilizando oligonucleotidos antisentido dirigidos hacia cualquier region del transcrito antisentido natural que tiene como resultado la regulacion por incremento del gen sentido correspondiente. Tambien se contempla en este documento que la inhibicion del transcrito antisentido natural puede conseguirse mediante ARNip, ribozimas y moleculas pequenas, que se consideran dentro del alcance de la presente memoria descriptiva.
45 [0007] En un caso se proporciona un procedimiento de modulacion de la funcion y/o expresion de un
polinucleotido del VEGF en celulas o tejidos de pacientes in vivo o in vitro que comprende poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido antisentido de 5 a 30 nucleotidos de longitud en el que dicho oligonucleotido tiene al menos el 50% de identidad de secuencia con un complemento inverso de un polinucleotido que comprende de 5 a 30 nucleotidos consecutivos entre los nucleotidos 1 a 643 de la SEC ID N.° 2; o nucleotidos 1 a 513 de la 50 SEC ID N.° 3 (figura 3) modulando de este modo la funcion y/o expresion del polinucleotido del VEGF en las celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro.
[0008] En otro caso preferido, un oligonucleotido va dirigido hacia una secuencia antisentido natural de polinucleotidos de VEGF, por ejemplo, los nucleotidos mostrados en la SEC ID N.° 2 y 3, y cualquier variante, alelo,
55 homologo, mutante, derivado, fragmento y secuencia complementaria de los mismos. En las SEC ID N.° 4 a 9 se muestran ejemplos de oligonucleotidos antisentido (figura 4).
[0009] En otro caso se proporciona un procedimiento de modulacion de la funcion y/o expresion de un polinucleotido del VEGF en celulas o tejidos de pacientes in vivo o in vitro que comprende poner en contacto dichas
celulas o tejidos con un oligonucleotido antisentido de 5 a 30 nucleotidos de longitud en el que dicho oligonucleotido tiene al menos el 50% de identidad de secuencia con un complemento inverso de un antisentido del polinucleotido del VEGF; modulando de este modo la funcion y/o expresion del polinucleotido VEGF en las celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro.
5
[0010] En otro caso se proporciona un procedimiento de modulacion de la funcion y/o expresion de un polinucleotido del VEGF en celulas o tejidos de pacientes in vivo o in vitro que comprende poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido antisentido de 5 a 30 nucleotidos de longitud en el que dicho oligonucleotido tiene al menos el 50% de identidad de secuencia con un oligonucleotido antisentido del polinucleotido del VEGF;
10 modulando de este modo la funcion y/o expresion del polinucleotido del VEGF en las celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro.
[0011] En un caso preferido, una composicion comprende uno o mas oligonucleotidos antisentido que se unen a los polinucleotidos sentido y/o antisentido del VEGF.
15
[0012] En otro caso preferido, los oligonucleotidos comprenden uno o mas nucleotidos modificados o sustituidos.
[0013] En otro caso preferido, los oligonucleotidos comprenden uno o mas enlaces modificados.
20
[0014] En otro caso mas, los nucleotidos modificados comprenden bases modificadas que comprenden fosforotioato, metilfosfonato, acidos nucleidos peptfdicos, 2'-O-metilo, fluoro o carbono, metileno u otras moleculas de acido nucleico bloqueado (LNA, por sus siglas en ingles). Preferiblemente, los nucleotidos modificados son moleculas de acido nucleico bloqueado, incluyendo a-L-LNA.
25
[0015] En otro caso preferido, los oligonucleotidos se administran a un paciente por via subcutanea, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal.
[0016] En otro caso preferido, los oligonucleotidos se administran en una composicion farmaceutica. Un 30 regimen de tratamiento comprende administrar los compuestos antisentido al menos una vez al paciente; no
obstante, este tratamiento puede modificarse para incluir dosis multiples durante un periodo de tiempo. El tratamiento puede combinarse con uno o mas tipos diferentes de tratamientos.
[0017] En otro caso preferido, los oligonucleotidos estan encapsulados en un liposoma o unidos a una 35 molecula transportadora (p. ej., colesterol, peptido TAT).
[0018] A continuacion se describen otros aspectos.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
40
[0019]
Figura 1:
45 Figura 1A y 1B: es una grafica de los resultados de la PCR en tiempo real en la que se muestra el numero de veces de variacion + desviacion estandar en el ARNm del VEGF tras el tratamiento de las celulas HepG2 con oligonucleotidos fosfotioato introducidos usando Lipofectamina 2000, en comparacion con el control. Los resultados de la PCR en tiempo real muestran que los niveles del ARNm del VEGFA en celulas HepG2 aumentan significativamente 48 h despues del tratamiento con uno de los ARNip disenados frente a vegfass (vefaas1_2, 50 P=0,05), y posiblemente con el segundo vefaas1_3 (P=0,1, Fig. 1A). En las mismas muestras los niveles de ARN vegfaas disminufan significativamente tras el tratamiento con vefaas1_2 o vefaas1_3, pero permanecfan sin cambios tras el tratamiento con vefaas1_5, que tampoco tenia efecto sobre los niveles del ARNm del VEGFA (Fig. 1B). Las barras indicadas como vegfas1_2, vegfas1_3 y vegfas1_5 se corresponden con las muestras tratadas con las SEC ID N.° 4, 5 y 6, respectivamente.
55 Figura 1C: la figura 1 es una grafica de los resultados de la PCR en tiempo real en la que se muestra el numero de veces de variacion + desviacion estandar en el ARNm del VEGF tras el tratamiento de las celulas HepG2 con oligonucleotidos fosfotioato introducidos usando Lipofectamina 2000, en comparacion con el control. Los resultados de la PCR en tiempo real muestran que los niveles del ARNm del VEGFA en celulas HepG2 aumentan significativamente 48 h despues del tratamiento con uno de los ARNip disenados frente a vegRas (veRas1_2,
P = 0,02 y vegRas1_3, P = 0,06). Estan pendientes los resultados del cambio en los niveles de ARN de vegRas. Las barras indicadas como vegRas1_2, vegRas1_3 y vegRas1_5 se corresponden con las muestras tratadas con las SEC ID N.° 7, 8 y 9, respectivamente.
5 En la figura 2 se muestra la SEC ID N.° 1: Factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) de Homo sapiens, variante de transcrito 1, ARNm. (n.° de acceso del NCBI: NM_001025366.1) y la SEC ID N.° 17 muestran la secuencia genomica del VEGF (los exones se muestran en letras mayusculas, los intrones en minuscula).
En la figura 3 se muestra la
10 SEC ID N.° 2: Secuencia antisentido del VEGF natural (n.° de acceso al NCBI: BI045995)
SEC ID N.° 3: Secuencia antisentido del VEGR natural (n.° de acceso al NCBI: BF829784)
La figura 4 muestra los oligonucleotidos antisentido, SEC ID N.° 4 a 6 disenados frente a la secuencia antisentido del VEGF natural 15
La figura 5 muestra los oligonucleotidos antisentido, SEC ID N.° 7 a 9 disenados frente a la secuencia antisentido del VEGF natural
La figura 6 muestra la secuencia diana del exon 1 del VEGFA (SEC ID N.° 10); secuencias del cebador directo (SEC
20 ID N.° 12); secuencias del cebador inverso (SEC ID N.° 13 y 14) y las secuencias indicadoras (SEC ID N.° 15 y 16)
de los ensayos Custom disenados por Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay (Hs00173626_ml).
DESCRIPCION DETALLADA
25 [0020] Varios aspectos de la memoria descriptiva se describen a continuacion en referencia a los ejemplos de
aplicacion a modo de ilustracion. Se entendera que numerosos detalles especfficos, relaciones y procedimientos se establecen para proporcionar un entendimiento completo de la memoria descriptiva. No obstante, un experto en la materia reconocera facilmente que la memoria descriptiva puede ponerse en practica sin uno o mas de los detalles especfficos o con otros procedimientos. La presente memoria descriptiva no esta limitada por el orden de acciones o 30 acontecimientos, ya que algunas acciones pueden producirse en diferente orden y/o de forma concurrente con otras acciones o acontecimientos. Adicionalmente, no son necesarias todas las acciones o acontecimientos ilustrados para implementar una metodologfa segun la presente memoria descriptiva.
[0021] Se pretende que todos los genes, nombres de genes y productos genicos descritos en este 35 documento se correspondan con registros homogeneos de distintas especies en los que las composiciones y
procedimientos descritos en este documento son aplicables. Por tanto, los terminos incluyen, sin limitaciones genes y productos genicos de humanos y ratones. Se entiende que cuando se describe un gen o producto genico de una especie en particular, esta descripcion pretende ser solo un ejemplo, y no debe interpretarse como una limitacion siempre que no este claramente indicado el contexto en el que aparece. Asf, por ejemplo, en el caso de los genes 40 descritos en este documento, en el que en muchos casos se refiere a secuencias de acido nucleico y aminoacidos de mamfferos, se pretende abarcar genes y productos genicos homologos y/u ortologos de otros animales que incluyen, sin limitaciones, mamfferos, peces, anfibios, reptiles y pajaros. En ejemplos preferidos, los genes o secuencias de acido nucleico son humanos.
45 Definiciones
[0022] La terminologfa utilizada en este documento tiene el objetivo de describir exclusivamente ejemplos particulares y no pretende ser una limitacion de la memoria descriptiva. Segun se usa en este documento, se pretende que las formas singulares "un/una" y "el/la" incluyan tambien las formas en plural, siempre que el contexto
50 no indique claramente otra cosa. Adicionalmente, hasta el grado en que se usan los terminos «incluyendo», «incluido», «teniendo», «tiene», «con» o variantes de los mismos en la descripcion detallada y/o en las reivindicaciones, estos terminos pretender ser inclusivos de forma similar al termino «comprendiendo».
[0023] El termino «alrededor» o «aproximadamente» significa dentro de un intervalo de error aceptable para 55 el valor en particular segun determina un experto en la materia, que dependera en parte de como se mide o
determina el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medida. Por ejemplo «alrededor» puede significar dentro de una desviacion estandar de 1 o mas de 1 para la practica de la materia. Alternativamente, «alrededor» puede significar un intervalo de hasta el 20%, preferiblemente hasta el 10%, mas preferiblemente hasta el 5% y, aun mas preferiblemente, hasta el 1% de un valor determinado. Alternativamente, especialmente con respecto a los sistemas
o procesos biologicos, el termino puede significar dentro de un orden de magnitud, preferiblemente dentro de 5 veces y, mas preferiblemente, dentro de 2 veces, de un valor. Cuando se describen valores en particular en la solicitud y en las reivindicaciones, siempre que no se especifique otra cosa, el termino «alrededor» significa que debe asumirse dentro de un intervalo de error aceptable para el valor en particular.
5
[0024] Segun se usa en este documento, el termino «ARNm» significa los transcritos de ARNm actualmente conocidos de un gen diana y cualquier transcrito adicional que puede elucidarse.
[0025] Por «oligonucleotidos antisentido» o «compuesto antisentido» se entiende una molecula de ADN o 10 ARN que se une a un ARN o ADN (ARN, ADN diana). Por ejemplo, si es un oligonucleotido de ARN se une a otra
diana de ARN mediante interacciones ARN-ARN y altera la actividad del ARN diana (Eguchi y col., (1991) Ann. Rev. Biochem. 60, 631-652). Un oligonucleotido antisentido puede regular por incremento o disminucion la expresion y/o la funcion de un polinucleotido en particular. La definicion pretende incluir cualquier molecula de ARN o ARN extrano que es util desde un punto de vista terapeutico, diagnostico u otro punto de vista. Entre estas moleculas se incluyen, 15 por ejemplo, moleculas de ARN y ADN antisentido, ARN de interferencia (ARNi), micro ARN, moleculas de ARN senuelo, ARNip, ARN enzimatico, ARN de edicion terapeutico y ARN agonista y antagonista, compuestos oligomericos antisentido, oligonucleotidos antisentido, oligonucleotidos de secuencia gufa externa (EGS, por sus siglas en ingles), secuencias de ayuste alternativas, cebadores, sondas y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una parte del acido nucleico diana. De este modo, estos compuestos pueden introducirse en 20 forma de compuestos oligomericos de cadena sencilla, cadena doble, cadena parcialmente sencilla o circulares.
[0026] En el contexto de esta memoria descriptiva, el termino «oligonucleotido» se refiere a un oligomero o polfmero de acido ribonucleico (ARN) o acido desoxirribonucleico (ADN), o mimeticos de los mismos. El termino «oligonucleotido», tambien incluye oligomeros lineales o circulares de monomeros o enlaces naturales y/o
25 modificados, incluidos desoxirribonucleosidos, ribonucleosidos, formas sustituidas y alfa anomericas de los mismos, acidos nucleicos peptfdicos (PNA), acidos nucleicos bloqueados (LNA), fosforotioato, metilfosfonatos y similares. Los oligonucleotidos son capaces de unirse especfficamente a un polinucleotido diana mediante un patron regular de interacciones entre monomeros, como el tipo de apareamiento de bases de Watson y Crick, los tipos de apareamiento de bases de Hoogsteen o de Hoogsteen inverso, o similares.
30
[0027] El oligonucleotido puede ser «quimerico», es decir, estar compuesto por regiones diferentes. En el contexto de esta memoria descriptiva los compuestos «quimericos» son oligonucleotidos que contienen dos o mas regiones qufmicas, por ejemplos regiones de ADN, regiones de ARN, regiones de PNA, etc. Cada region qufmica esta compuesta por al menos una unidad monomerica, por ejemplo, un nucleotido en el caso de un compuesto de
35 oligonucleotidos. Tfpicamente, estos oligonucleotidos comprenden al menos una region en la que se modifica el oligonucleotido para que muestre una o mas propiedades deseadas. Las propiedades deseadas del oligonucleotido incluyen, entre otras, por ejemplo, aumento de la resistencia a la degradacion por nucleasas, aumento de la captacion celular y/o aumento de la afinidad de union por el acido nucleico diana. Diferentes regiones del oligonucleotido pueden, por tanto, tener propiedades diferentes. Los oligonucleotidos quimericos de la presente 40 memoria descriptiva pueden formarse como estructuras mixtas de dos o mas oligonucleotidos, oligonucleotidos modificados, oligonucleosidos y/o analogos de oligonucleotidos como se describe a continuacion.
[0028] El oligonucleotido puede estar compuesto por regiones que pueden estar unidas en «registro», es decir, cuando los monomeros se unen de forma consecutiva, como en el ADN nativo, o unidos a traves de
45 espaciadores. Se pretende que los espaciadores constituyan un «puente» covalente entre las regiones y tengan en casos preferidos una longitud que no exceda de aproximadamente 100 atomos de carbono. Los espaciadores pueden ser portadores de diferentes funcionalidades, por ejemplo, tener carga positiva o negativa, presentar propiedades especiales de union al acido nucleico (intercaladores, enlazadores de surcos, toxinas, fluoroforos, etc.), ser lipofilos, inducir estructuras secundarias especiales como, por ejemplo, peptidos que contienen alanina que 50 inducen la formacion de helices alfa.
[0029] Segun se usa en este documento «VEGF» y «factor de crecimiento del endotelio vascular A» son inclusivos de todos los miembros de la familia, mutantes, alelos, fragmentos, especies, secuencias codificadora y no codificadora, cadenas polinucleotfdicas sentido y antisentido.
55
[0030] Segun se usa en este documento, los terminos factor de crecimiento del endotelio vascular A, VEGF, VEGFA se utilizan de forma intercambiable en la presente solicitud.
[0031] Segun se usa en este documento, el termino «oligonucleotido especffico para» u «oligonucleotido
dirigido a» se refiere a un oligonucleotido que tiene una secuencia (i) capaz de formar un complejo estable con una porcion del gen al que se dirige o (ii) capaz de formar un duplex estable con una porcion de un transcrito de ARNm del gen al que se dirige. La estabilidad de los complejos y duplex puede determinarse mediante calculos teoricos y/o ensayos in vitro. En los ejemplos que aparecen a continuacion se describen ejemplos de ensayos para determinar la 5 estabilidad de complejos y duplex de hibridacion.
[0032] Como se utiliza en este documento, el termino «acido nucleico diana» abarca ADN, ARN (que comprende preARNm y ARNm) transcrito a partir de dicho ADN, y tambien ADNc derivado de dicho aRn, secuencias codificadoras y no codificadoras, polinucleotidos sentido o antisentido. La hibridacion especffica de un
10 compuesto oligomerico que es un acido nucleico diana interfiere con la funcion normal del acido nucleico. Esta modulacion de la funcion de un acido nucleico diana por los compuestos, que especfficamente hibridan con este, generalmente se denominan «antisentido». Entre las funciones de ADN en las que se puede interferir se incluyen, por ejemplo, replicacion y transcripcion. Entre las funciones del ARN sobre las que se puede interferir se incluyen todas las funciones clave como, por ejemplo, traslocacion del ARN al sitio de traduccion de la protefna, traduccion de 15 la protefna a partir del ARN, ayuste del ARN para producir una o mas especies de ARNm y actividad catalftica que puede mantener o facilitar el ARN. El efecto global de dicha interferencia con la funcion del acido nucleico diana es la modulacion de la expresion de un producto codificado u oligonucleotidos.
[0033] El ARN de interferencia «ARNi» esta mediado por moleculas de ARN de cadena doble (ARNcd) que 20 tienen una homologfa de secuencia especffica de secuencia con sus secuencias de acido nucleico «diana» (Caplen,
N. J., y col. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:9742-9747). En determinados casos de la presente memoria descriptiva, los mediadores son duplex de ARN de «interferencia pequeno» de 5-25 nucleotidos (ARNip). Los ARNip derivan del procesamiento de ARNcd por una enzima ARNasas conocida como Dicer (Bernstein, E., y col. (2001) Nature 409:363-366). Los productos duplex de ARNip son reclutados dentro de un completo de ARNip y 25 multiprotefnas denominado RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN). Sin desear estar ligado a ninguna teorfa en particular, se considera entonces que un RISC es dirigido hacia un acido nucleico diana (ARNm adecuado), donde el duplex de ARNip interacciona de forma especffica de secuencia para mediar en la escision de forma catalftica (Bernstein, E., y col. (2001) Nature 409:363-366; Boutla, A., y col. (2001) Curr. Biol. 11:1776-1780). Los ARN de interferencia pequenos que pueden usarse segun la presente memoria descriptiva pueden sintetizarse y 30 utilizarse segun procedimientos que son bien conocidos en la tecnica y que seran familiares para el experto en la materia. Los ARN de interferencia pequenos utilizados en los procedimientos de la presente memoria descriptiva comprenden adecuadamente entre aproximadamente 1 a aproximadamente 50 nucleotidos (nt). En ejemplos de casos no limitantes, los ARNip pueden comprender de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 10 y aproximadamente 30 nt, de 35 aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nt o de aproximadamente 20-25 nucleotidos.
[0034] La seleccion de oligonucleotidos adecuados se facilita utilizando programas de ordenado que alinean automaticamente las secuencias de acidos nucleicos e indican las regiones de identidad u homologfa. Dichos programas se utilizan para comparar secuencias de acidos nucleicos obtenidas, por ejemplo, buscando bases de
40 datos como GenBank o productos de secuenciacion de PCR. La comparacion de secuencias de acido nucleico a partir de una gama de especies permite la seleccion de secuencias de acido nucleico que muestran un grado apropiado de identidad entre especies. En el caso de genes que no se hayan secuenciado, se realizan transferencias de ADN que permitan la determinacion del grado de identidad entre genes en la especie diana y en otras especies. Realizando transferencias de ADN con distintos grados de rigurosidad, como se conocen bien en la 45 tecnica, es posible obtener una medida de la identidad aproximada. Estos procedimientos permiten la seleccion de oligonucleotidos que muestran un alto grado de complementariedad con secuencias de acido nucleico diana en un sujeto que se quiere controlar y un grado mas bajo de complementariedad con las correspondientes secuencias de acido nucleico en otras especies. Un experto en la materia entendera que existe una considerable flexibilidad en la seleccion de las regiones apropiadas de genes para su uso en la presente memoria descriptiva.
50
[0035] Por «ARN enzimatico» se entiende una molecula de ARN con actividad enzimatica (Cech, (1988) J. American. Med. Assoc. 260, 3030-3035). Los acidos nucleicos enzimaticos (ribozimas) actuan uniendose en primer lugar a un ARN diana. Dicha union se produce a traves de la porcion de union a la diana de un acido nucleico enzimatico que se produce en la cercanfa de una porcion enzimatica de la molecula que actua escindiendo el ARN
55 diana. Por tanto, el acido nucleico enzimatico reconoce primero y, a continuacion, se une a un ARN diana mediante apareamiento de bases y, una vez unido al sitio correcto, actua enzimaticamente cortando el ARN diana.
[0036] Por «ARN senuelo» se entiende una molecula de ARN que mimetiza el dominio de union natural de un ligando. Por tanto, el ARN senuelo compite con la diana de union natural para la union de un ligando especffico. Por
ejemplo, se ha mostrado que la sobreexpresion del ARN de respuesta de transactivacion (TAR) del VIH puede actuar como un «senuelo» y se une de forma eficaz a la protefna tat del VIH, impidiendo de este modo la union a las secuencias TAR codificadas en el ARN del VIH (Sullenger y col. (1990) Cell, 63, 601- 608). Esto pretende ser un ejemplo especffico. Los expertos reconoceran que esto es solo un ejemplo y que pueden generarse facilmente otros 5 casos usando tecnicas generalmente conocidos en la materia.
[0037] Segun se usa en este documento, el termino «monomeros» tfpicamente indica monomeros unidos mediante puentes fosfodiester o analogos de los mismos para formar oligonucleotidos que oscilan en tamano de unas pocas unidades monomericas, por ejemplo, de aproximadamente 3-4 a aproximadamente varios cientos de
10 unidades monomericas. Entre los analogos de enlaces fosfodiester se incluyen: fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonatos, fosforoselenoato, fosforamidato y similares, como se describe con mas detalle a continuacion.
[0038] El termino «nucleotido» abarca a nucleotidos naturales asf como a nucleotidos no naturales. Deberfa estar claro para el experto en la materia que diversos nucleotidos que previamente se han considerado «no
15 naturales» se han encontrado posteriormente en la naturaleza. Por tanto, «nucleotidos» incluye no solo las moleculas que contienen purinas y pirimidina heterocfclicas conocidas, sino tambien analogos y tautomeros heterocfclicos de las mismas. Son ejemplos ilustrativos de otros tipos de nucleotidos las moleculas que contienen adenina, guanina, timina, citosina, uracilo, purina, xantina, diaminopurina, 8-oxo-N6-metiladenina, 7-deazaxantina, 7- deazaguanina, N4,N4-etanocitosina, N6,N6-etano-2,6-diaminopurina, 5-metilcitosina, 5-(C3-C6)-alquinilcitosina, 520 fluorouracilo, 5-bromouracilo, pseudoisocitosina, 2-hidroxi-5-metil-4-triazolopiridina, isocitosina, isoguanina, inosina y los nucleotidos «no naturales» descritos en la patente de EE. UU N.° 5 432 272 de Benner y col. El termino «nucleotido» pretende cubrir cada uno y todos estos ejemplos asf como analogos y tautomeros de los mismos. Son nucleotidos especialmente interesantes aquellos que contienen adenina, guanina, timina, citosina y uracilo, que se consideran como los nucleotidos naturales en relacion con su aplicacion terapeutica y diagnostica en humanos. Los 25 nucleotidos incluyen los azucares 2'-deoxi y 2'- hidroxilo e.g., como los que se describen en Kornberg y Baker, DNA Replication, 2a Ed. (Freeman, San Francisco, 1992) asf como sus analogos.
[0039] «Analogos» en referencia a los nucleotidos incluye nucleotidos sinteticos que tienen restos de bases modificadas y/o restos de azucares modificados (vease, p. ej., Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, Nueva York,
30 1980; Freier & Altmann, (1997) Nucl. Acid. Res., 25(22), 4429- 4443, Toulme, J.J., (2001) Nature Biotechnology 19:17-18, Manoharan M., (1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139; Freier S. M., (1997) Nucleic Acid Research, 25:4429-4443, Uhlman, E., (2000) Drug Discovery & Development, 3: 203-213, Herdewin P., (2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev., 10:297-310); [3.2.0] bicicloarabinonucleosidos unidos a 2'-O, 3'-C (vease, p. ej. N.K. Christiensen y col., (1998) J. Am. Chem. Soc., 120: 5458-5463; Prakash TP, Bhat B. (2007) Curr Top Med 35 Chem. 7(7):641-9; Cho EJ, y col. (2009) Annual Review of Analytical Chemistry, 2, 241-264). Dichos analogos incluyen nucleotidos sinteticos disenados para potenciar las propiedades de union, por ejemplo, estabilidad, especificidad de duplex o triplex o similares.
[0040] Segun se usa en este documento, «hibridacion» significa el apareamiento de cadenas 40 sustancialmente complementarias de compuestos oligomericos. Un mecanismo de apareamiento implica puentes de
hidrogeno, que pueden ser puentes de hidrogeno de Watson y Crick, de Hoogsteen o Hoogsteen inversos, entre bases nucleosido o nucleotido (nucleotidos) de las cadenas de compuestos oligomericos. Por ejemplo, adenina y timina son nucleotidos complementarios que se aparean mediante la formacion de puentes de hidrogeno. La hibridacion puede producirse en diversas circunstancias.
45
[0041] Un compuesto antisentido es «especfficamente hibridable» cuando la union del compuesto al acido nucleico diana interfiere con la funcion normal del acido nucleico diana para producir una modulacion de la funcion y/o actividad y existe un grado suficiente de complementariedad para evitar la union no especffica del compuesto antisentido a secuencias de acido nucleico no diana en condiciones en las que se desea la union especffica, es
50 decir, en condiciones fisiologicas en el caso de los ensayos in vivo o tratamiento terapeutico y, en el caso de ensayos in vitro, en condiciones en las que se realizan los ensayos.
[0042] Segun se usa en este documento, la frase «condiciones de hibridacion estrictas» o «condiciones estrictas» se refiere a condiciones en las que un compuesto de la memoria descriptiva hibridara con su secuencia
55 diana, pero con un numero mfnimo de otras secuencias. Las condiciones estrictas son dependientes de secuencia y seran diferentes en circunstancias diferentes y en el contexto de esta memoria descriptiva, las «condiciones estrictas» en las que los compuestos oligomericos hibridan con una secuencia diana vienen determinadas por la naturaleza y composicion de los compuestos oligomericos y los ensayos en los que se estan estudiando. En general, las condiciones de hibridacion estrictas comprenden concentraciones bajas (<0,15M) de sales con cationes
inorganicos como Na++ o K++ (es decir, baja fuerza ionica), temperatura superior a 20°-25°C, por debajo de la Tm del complejo compuesto oligomerico:secuencia diana, y la presencia de agentes desnaturalizantes como formamida, dimetilformamida, dimetilsulfoxido o el detergente dodecil sulfato sodico (SDS). Por ejemplo, la tasa de hibridacion disminuye 1,1% por cada 1% de formol. Un ejemplo de unas condiciones de hibridacion altamente estrictas son 5 tampon cloruro sodico-citrato sodico 0,1X (SSC)/(sDs (p/v) al 0,1% a 60°C durante 30 minutos.
[0043] «Complementariedad» segun se usa en este documento, se refiere a la capacidad de apareamiento de forma precisa entre dos nucleotidos de una o dos cadenas oligomericas. Por ejemplo, si una nucleobase en una determinada posicion de un compuesto antisentido es capaz de formar puentes de hidrogeno con una nucleobase
10 de una determinada posicion de un acido nucleico diana, siendo dicho acido nucleico diana una molecula de ADN, ARN u oligonucleotido, entonces la posicion de los puentes de hidrogeno entre el oligonucleotidos y el acido nucleico diana se considera una posicion complementaria. El compuesto oligomerico y la molecula de ADN, ARN u oligonucleotido adicional son complementarios entre si cuando un numero suficiente de posiciones complementarias en cada molecula estan ocupadas por nucleotidos que pueden formar puentes de hidrogeno entre si. Por tanto, 15 «especialmente hibridable» y «complementario» son terminos que se utilizan para indicar un grado suficiente de apareamiento o complementariedad precisa sobre un numero suficiente de nucleosidos de modo que se produce una union estable y especffica entre el compuesto oligomerico y un acido nucleico diana.
[0044] En la materia se entiende que la secuencia de un compuesto oligomerico no necesita ser 100% 20 complementaria con la de su acido nucleico diana para que sean especfficamente hibridables. Ademas, un
oligonucleotido puede hibridar con uno o mas segmentos como los segmentos intermedios o adyacentes no implicados en el acontecimiento de hibridacion (p. ej., una estructura de lazo, estructura desapareada o en horquilla). Los compuestos oligomericos de la presente memoria descriptiva comprenden al menos aproximadamente el 70%, o al menos aproximadamente el 75%, o al menos aproximadamente el 80%, o al menos aproximadamente el 85%, o 25 al menos aproximadamente el 90%, o al menos aproximadamente el 95%, o al menos aproximadamente el 99% de complementariedad de secuencia con una region diana dentro de la secuencia de acido nucleico diana a la que van dirigidos. Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 nucleotidos del compuesto antisentido son complementarios con una region diana, y podrfan, por ejemplo, hibridar especfficamente, podrfan representar el 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, los nucleotidos no complementarios restantes pueden estar 30 agrupados o intercalados con los nucleotidos complementarios y no es necesario que esten contiguos entre si o con nucleotidos complementarios. Como tal, un compuesto antisentido que tiene una longitud de 18 nucleotidos tiene 4 (cuatro) nucleotidos no complementarios, que estan flanqueados por dos regiones de complementariedad completa con el acido nucleico diana tiene una complementariedad total del 77,8% con el acido nucleico diana y podrfa, por tanto, estar dentro del alcance de la presente memoria descriptiva. El porcentaje de complementariedad de un 35 compuesto antisentido con una region de un acido nucleico diana puede determinarse de forma rutinaria usando programas BLAST (herramientas basicas de busqueda de alineamiento local) y programa PowerBLAST conocidas en la tecnica (Altschul y col., (1990) J. Mol. Biol., 215, 403-410; Zhang y Madden, (1997) Genome Res., 7, 649-656). El porcentaje de homologfa, la identidad de secuencia o la complementariedad pueden determinarse, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 para Unix, Genetics Computer Group, 40 University Research Park, Madison Wis.), usando parametros establecidos por defecto que utilizan el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., (1981) 2, 482-489).
[0045] Segun se usa en este documento, el termino «punto de fusion termica (Tf)» se refiere a la temperatura, con fuerza ionica, pH y concentracion de acido nucleico definidos, a la que el 50% de los
45 oligonucleotidos complementarios con la secuencia diana hibridan con la secuencia diana en equilibrio. Tfpicamente, las condiciones estrictas seran aquellas en las que la concentracion salina es al menos de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de concentracion del ion Na (u otras sales) a un pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30 °C para oligonucleotidos cortos (p. ej., de 10 a 50 nucleotidos). Las condiciones estrictas tambien pueden conseguirse con la adicion de agentes desestabilizantes como formol.
50
[0046] Segun se usa en este documento, «modulacion» significa bien un aumento (estimulacion) o una disminucion (inhibicion) en la expresion de un gen.
[0047] El termino «variante» cuando se usa en el contexto de una secuencia de polinucleotidos, puede 55 abarcar una secuencia de polinucleotidos en relacion con un gen natural. Esta definicion tambien puede incluir, por
ejemplo, variantes «alelicas», «de ayuste», «de especie» o «polimorficas». Una variante de ayuste puede tener una identidad significativa con una molecula de referencia, aunque generalmente tiene un numero mayor o menor de polinucleotidos debido al ayuste alternativo de exones durante el procesamiento del ARNm. El polipeptido correspondiente puede poseer dominios funcionales adicionales o ausencia de dominios. Las variantes de especies
son secuencias polinucleotfdicas que varfan de una especie a otra. Son de utilidad especial en la memoria descriptiva las variantes de productos genicos naturales. Las variantes pueden ser el resultado de al menos una mutacion en la secuencia del acido nucleico y puede dar lugar a ARNm alterados o a polipeptidos cuya estructura o funcion pueda estar alterada o no. Cualquier gen natural o recombinante dado puede tener ninguna, una o muchas 5 formas alelicas. Los cambios de mutacion frecuentes que dan lugar a variantes generalmente se atribuyen a deleciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleotidos. Cada uno de estos tipos de cambios puede producirse solo, o en combinacion con los otros, una o mas veces en una secuencia determinada.
[0048] Los polipeptidos resultantes generalmente tendran una identidad relativa de aminoacidos significativa 10 entre si. Una variante polimorfica es una variacion en la secuencia de polinucleotidos de un gen en particular entre
individuos de una especie determinada. Las variantes polimorficas pueden abarcar «polimorfismos de nucleotido unico» (SNP, por sus siglas en ingles) o mutaciones de una unica base en las que la secuencia de polinucleotidos varfa en una base. La presencia de SNP puede ser indicativa de, por ejemplo, una determinada poblacion con propension a una enfermedad, es decir, susceptibilidad frente a resistencia.
15
[0049] Entre los polinucleotidos derivados se incluyen acidos nucleicos sometidos a modificacion qufmica, por ejemplo, sustitucion de hidrogeno por un grupo alquilo, acilo o amino. Derivados, por ejemplo, oligonucleotidos derivados, puede comprenden porciones no naturales, como restos de azucar alterados o enlaces entre azucares. Son ejemplos entre estos el fosforotioato y otras especies que contienen azufre que son conocidas en la tecnica. Los
20 derivados de acidos nucleicos tambien pueden contener marcadores, incluyendo radionucleotidos, enzimas, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, agentes cromogenicos, sustratos, cofactores, inhibidores, partfculas magneticas y similares.
[0050] Un polipeptido o peptido «derivado» es aquel que se modifica, por ejemplo, mediante glucosilacion, 25 pegilacion, fosforilacion, sulfatacion, reduccion/alquilacion, acilacion, conjugacion qufmica o tratamiento ligero con
formol. Un derivado tambien puede modificarse para contener un marcador detectable, directa o indirectamente, incluyendo, entre otras, un radioisotopo, fluorescente y marcador enzimatico.
[0051] Segun se usa en este documento, el termino «animal» o «paciente» pretende incluir, por ejemplo, a 30 humanos, ovejas, alces, ciervos, venados, visones, mamfferos, monos, caballos, vacas, cerdos, cabras, perros,
gatos, ratas, ratones, pajaros, pollos, reptiles, peces, insectos y aracnidos.
[0052] «Mamffero» abarca mamfferos de sangre caliente que normalmente estan bajo atencion medica y veterinaria (p. ej., humanos y animales domesticos). Entre los ejemplos se incluyen felinos, canidos, equinos,
35 bovinos y humanos, asf como tambien solo humanos.
[0053] «Tratando» o «tratamiento» abarca el tratamiento de una enfermedad en un mamffero, e incluye: (a) evitar que se produzca la enfermedad en un mamffero, en particular, cuando dicho mamffero esta predispuesto a la enfermedad pero aun no ha sido diagnosticado que la tiene; (b) inhibir la enfermedad, por ejemplo, parando su
40 desarrollo y/o (c) aliviar la enfermedad, por ejemplo, provocando la regresion de la enfermedad hasta que se alcanza un punto final deseado. Tratando tambien incluye la mejora de un sfntoma de una enfermedad (p. ej., disminuir el dolor o las molestias), donde dicho mejora puede no afectar directamente a la enfermedad (p. ej., causa, transmision, expresion, etc.).
45 [0054] Segun se usa en este documento, el termino «cancer» se refiere a cualquier tumor maligno,
desarrollado especialmente en el pulmon, el rinon o la glandula tiroidea. El cancer en sf se manifiesta como un «tumor» o tejido que comprende las celulas malignas del cancer. Entre los ejemplos de tumores se incluyen: fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, 50 leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cancer pancreatico, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de prostata, carcinoma escamoso, carcinoma basocelular, adenocarcinoma, carcinoma de glandulas sudorfparas, carcinoma de glandulas sebaceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma de conductos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cancer de cuello de utero, tumor de 55 testfculo, carcinoma pulmonar, carcinoma de pulmon microcftico, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acustico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma. Como se aprecia anteriormente, la memoria descriptiva permite especfficamente el diagnostico diferencial de tumores de pulmon, rinon y tiroides.
Composiciones y moleculas polinucleotidicas y oligonucleotidicas
[0055] Dianas: en un caso, las dianas comprenden secuencias de acido nucleico del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), incluidas sin limitaciones, secuencias sentido y/o antisentido codificadoras y/o no
5 codificadoras asociadas con el VEGF.
[0056] El factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) es un potente factor estimulante de la angiogenesis y la permeabilidad vascular. Existen ocho isoformas con funciones diferentes y, en ocasiones, solapantes. Los mecanismos de accion estan siendo investigados con ideas emergentes sobre rutas solapantes e
10 interferencias entre otros receptores como las neurofitinas, que no se han asociado previamente con la angiogenesis. VEGF ejerce acciones fisiologicas importantes sobre el desarrollo embrionario, la curacion y el ciclo menstrual. Tambien tiene un papel importante en las afecciones patologicas asociadas con las enfermedades autoinmunitarias.
15 [0057] Los ejemplos de enfermedades y trastornos mediados por el factor de crecimiento del endotelio
vascular que pueden ser tratados con celulas/tejidos regenerados a partir de celulas madre obtenidas usando los compuestos antisentido comprenden enfermedades que se caracterizan por proliferacion excesiva de celulas endoteliales vasculares; enfermedades cardiovasculares que son el resultado de una insuficiencia cardiovascular (p. ej., arteriopatia coronaria, insuficiencia cardfaca congestiva e insuficiencia venosa periferica); afecciones que se 20 caracterizan o estan causadas por angiogenesis anomala o excesiva, incluido, entre otro, el cancer (p. ej., activacion de oncogenes, perdidas de supresores tumorales); enfermedades infecciosas (p. ej., patogenos que expresan genes angiogenicos, intensificacion de los programas angiogenicos); enfermedades autoinmunitarias (p. ej., activacion de mastocitos y otros leucocitos), incluyendo artritis reumatoide; malformaciones vasculares (p. ej., mutacion de Tie-2); sfndrome de DiGeorge (p. ej., baja expresion de VEGF y neuropilina-1); HHT (p. ej., mutaciones de endoglina o LK- 25 1), hemangioma cavernoso (p. ej., perdida de Cx37 y Cx40); aterosclerosis; ateriopatfa por trasplante; obesidad (p. ej., angiogenesis inducida por dieta rica en grasas, perdida de peso por inhibidores de la angiogenesis); psoriasis, verrugas; dermatitis alergica; cicatrices queloides; granulomas pirogenicos; enfermedad ampollosa; sarcoma de Kaposi en pacientes de SIDA; sfndrome vftreo hiperplasico persistente (p. ej., perdida de Ang-2 o VEGF164); enfermedad renal poliqufstica autosomica dominante (ADPKD, por sus siglas en ingles); retinopatfa diabetica; 30 retinopatfa del prematuro; degeneracion macular relacionada con la edad; neovascularizacion coroidal (p. ej., mutacion de TIMP-3); hipertension pulmonar primaria (p. ej., mutacion de BMPR-2 de la lfnea germinal, mutacion de EC primaria); asma; polipos nasales; enfermedad intestinal inflamatoria; lesion nerviosa; lesion cerebral o enfermedades neurodegenerativas (p. ej., enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson; esclerosis lateral amiotrofica, etc.); enfermedad periodontal; ascitis; adherencias peritoneales, endometriosis; hemorragia uterina; 35 quistes ovaricos; hiperestimulacion ovarica; artritis; sinovitis; osteomielitis y/o formacion osteofita; ulceracion; verruga vulgar; angiofibroma de esclerosis tuberosa; hemangioma plano; sfndrome de Sturge Weber; sfndrome de Kippel- Trenaunay-Weber; sfndrome de Osler-Weber-Rendu y cualquier otra enfermedad o afeccion que este relacionada con los niveles de VEGF-R en una celula o tejido.
40 [0058] En un caso preferido, los oligonucleotidos son especfficos de polinucleotidos de VEGF, que incluyen,
entre otras, regiones no codificadoras. La dianas del VEGF comprenden variantes de VEGF; mutantes de VEGF, incluyendo SNP; secuencias no codificadoras de VEGF; alelos, fragmentos y similares. Preferiblemente el oligonucleotido es una molecula de ARN antisentido.
45 [0059] De acuerdo con los casos de la memoria descriptiva, la molecula de acido nucleico diana no se limita
solo a los polinucleotidos de VEGF sino que se extiende a cualquiera de las isoformas, receptores, homologos, regiones no codificadoras y similares del VEGF.
[0060] En otro caso preferido, un oligonucleotido tiene como diana una secuencia antisentido natural 50 (antisentido natural a las regiones codificadores y no codificadoras) de las dianas del VEGF, incluidos entre otras,
variantes, alelos, homologos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias de las mismas. Preferiblemente el oligonucleotido es una molecula de ARN o ADN antisentido.
[0061] En otro caso preferido, los compuestos oligomericos de la presente memoria descriptiva tambien 55 incluyen variantes en las que se presenta una base diferente en una o mas de las posiciones de nucleotidos del
compuesto. Por ejemplo, si el primer nucleotido es una adenina, pueden producirse variantes que contienen timidina, guanosina, citidina u otros nucleotidos naturales o no naturales en esta posicion. Esto puede hacerse en cualquier de las posiciones del compuesto antisentido. A continuacion, estos compuestos se prueban usando los procedimientos descritos en este documento para determinar su capacidad para inhibir la expresion de un acido
nucleico diana.
[0062] En algunos casos, la homologfa, la identidad de secuencia o la complementariedad entre el compuesto antisentido y la diana es de aproximadamente el 50% a aproximadamente el 60%. En algunos casos, la
5 homologfa, la identidad de secuencia o la complementariedad es de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 70%. En algunos casos, la homologfa, la identidad de secuencia o la complementariedad es de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 80%. En algunos casos, la homologfa, la identidad de secuencia o la complementariedad es de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 90%. En algunos casos, la homologfa, la identidad de secuencia o la complementariedad es de aproximadamente el 90%, aproximadamente el 92%,
10 aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99% o aproximadamente el 100%.
[0063] Un compuesto antisentido es especialmente hibridable cuando la union del compuesto al acido nucleico diana interfiere con la funcion normal del acido nucleico diana causando una perdida de actividad, y existe
15 un grado suficiente de complementariedad como para evitar la union no especffica del compuesto antisentido a secuencias de acido nucleico no diana en condiciones en las que se desea se realice la union. Entre dichas condiciones se incluye, por ejemplo, condiciones fisiologicas en el caso de ensayos o tratamiento terapeutico in vivo, y condiciones en las que se realizan los ensayos en el caso de ensayos in vitro.
20 [0064] Un compuesto antisentido, ya sea ADN, ARN, quimerico, sustituido, etc, es especfficamente hibridable
cuando la union del compuesto a la molecula de ADN o ARN diana interfiere con la funcion normal del ADN o ARN diana produciendo una perdida de utilidad y existe un grado suficiente de complementariedad para evitar la union no especffica del compuesto antisentido a secuencias no diana en las condiciones en las que se desea la union especffica, es decir, en condiciones fisiologicas en el caso de los ensayos in vivo o tratamiento terapeutico y, en el
25 caso de ensayos in vitro, en condiciones en las que se realizan los ensayos.
[0065] En otro caso preferido, el reconocimiento de VEGF que incluye, sin limitaciones, secuencias antisentido que se identifican y propagan, usando por ejemplo, PCR, hibridacion, etc., una o mas de las secuencias mostradas como SEC ID N.°: 2, y similares, modula la expresion o funcion del VEGF. En un caso, la expresion o
30 funcion esta regulada por incremento en comparacion con un control. En otro caso preferido, la expresion o funcion esta regulada por disminucion en comparacion con un control.
[0066] En otro caso preferido, los oligonucleotidos comprenden secuencias de acido nucleico mostradas como SEC ID N.° 4 a 9 que incluyen secuencias antisentido que se identifican y propagan, usando por ejemplo,
35 PCR, hibridacion, etc. Estos oligonucleotidos pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, fragmentos mas cortos o mas largos, enlaces modificados y similares. Son ejemplos de enlaces o uniones entre nucleotidos modificados fosforotioato, fosforoditioato o similares. En otro caso preferido, los nucleotidos comprenden un derivado fosforo. El derivado fosforo (o grupo fosfato modificado) que puede unirse al resto de azucar o analogo de azucar en los oligonucleotidos modificados de la presente memoria descriptiva puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato,
40 alquilfosfato, alcanofosfato, fosforotioato y similares. La preparacion de los analogos de fosfato indicados anteriormente, y su incorporacion a los nucleotidos, nucleotidos modificados y oligonucleotidos per se, tambien es conocida y no es necesario describirla en este documento.
[0067] La especificidad y sensibilidad de antisentido tambien son aprovechadas por los expertos en la
45 materia para usos terapeuticos. Los oligonucleotidos antisentido se han empleado como restos terapeuticos en el
tratamiento de enfermedades en animales y en el hombre. Los oligonucleotidos antisentido se han administrado de forma segura y eficaz a humanos y actualmente estan en curso numerosos ensayos clfnicos. Por tanto, esta establecido que los oligonucleotidos pueden ser modalidades terapeuticas utiles que pueden configurarse como de utilidad en regfmenes terapeuticos para el tratamiento de celulas, tejidos y animales, especialmente humanos.
50
[0068] En casos de la presente memoria descriptiva compuestos antisentido oligomericos, especialmente oligonucleotidos, se unen a moleculas de acido nucleico diana y modulan la expresion y/o funcion de las moleculas codificadas por un gen diana. Las funciones de ADN con las que se puede interferir comprende, por ejemplo, replicacion y transcripcion. Las funciones del ARN con las que se puede interferir comprenden todas las funciones
55 clave como, por ejemplo, translocacion del ARN al sitio de traduccion de protefnas, traduccion de la protefna a partir del ARN, ayuste del ARN para producir una o mas especies de ARNm y actividad catalftica que puede mantener o facilitar el ARN. Las funciones pueden ser reguladas por incremento o inhibidas dependiendo de las funciones deseadas.
[0069] Entre los compuestos antisentido se incluyen compuestos oligomericos antisentido, oligonucleotidos antisentido, oligonucleotidos de secuencia gufa externa (EGS), secuencias de ayuste alternativas, cebadores, sondas y otros compuestos oligomeicos que hibridan con al menos una porcion del acido nucleico diana. De este modo, estos compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligomericos de cadena sencilla, cadena
5 doble, cadena parcialmente sencilla o circulares.

[0070] El reconocimiento de un compuesto antisentido a una molecula de acido nucleico en particular, en el

conteXto de esta memoria descriptiva, puede ser un proceso multietapa. El proceso normalmente se inicia con la
identificacion de un acido nucleico diana cuya funcion se va a modular. Este acido nucleico diana puede ser, por

10 ejemplo, un gen celular (o un ARNm transcrito a partir del gen) cuya expresion se asocia con un trastorno o
enfermedad en particular, o una molecula de acido nucleico de un agente infeccioso. En la presente memoria descriptiva, el acido nucleico diana codifica un factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF).
[0071] El proceso de reconocimiento normalmente incluye tambien la determinacion de al menos una region, 15 segmento o sitio diana dentro del acido nucleico diana para que se de la interaccion antisentido de modo que se
produzca el efecto deseado, por ejemplo, la modulacion de la expresion. Dentro del contexto de la presente memoria descriptiva, el termino «region» se define como una porcion del acido nucleico diana que tiene al menos una estructura, funcion o caracterfstica identificable. Dentro de las regiones de los acidos nucleicos diana encontramos segmentos. Los «segmentos» se definen como regiones mas pequenas o subporciones de las regiones dentro de un 20 acido nucleico diana. Los «sitios» segun se usa en la presente memoria descriptiva se definen como posiciones dentro de un acido nucleico diana.
[0072] En un caso preferido, los oligonucleotidos antisentido se unen a las secuencias antisentido naturales del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y modulan la expresion y/o la funcion de dicho factor de
25 crecimiento del endotelio vascular (VEGF) (SEC ID N.° 1). Entre los ejemplos de secuencias antisentido se incluyen las SEC ID N.° 2 a 9.
[0073] En otro caso preferido, los oligonucleotidos antisentido se unen a uno o mas segmentos del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y modulan la expresion y/o la funcion del factor de dicho crecimiento del
30 endotelio vascular (VEGF). Los segmentos comprenden al menos cinco nucleotidos consecutivos de los polinucleotidos sentido o antisentido del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF).
[0074] En otro caso preferido, los oligonucleotidos antisentido son especfficos para las secuencias antisentido naturales del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) donde la union de los oligonucleotidos a las
35 secuencias antisentido naturales del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) modula la expresion y/o la funcion de dicho factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF).
[0075] En otro caso preferido, los compuestos oligonucleotido comprenden secuencias mostradas como SEC ID N.° 4 a 9, secuencias antisentido que se identifica y propagan, usando por ejemplo, PCR, hibridacion, etc. Estos
40 oligonucleotidos pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, fragmentos mas cortos o mas largos, enlaces modificados y similares. Son ejemplos de enlaces o uniones entre nucleotidos modificados fosforotioato, fosforoditioato o similares. En otro caso preferido, los nucleotidos comprenden un derivado fosforo. El derivado fosforo (o grupo fosfato modificado) que puede unirse al resto de azucar o analogo de azucar en los oligonucleotidos modificados de la presente memoria descriptiva puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfato, 45 alcanofosfato, fosforotioato y similares. La preparacion de los analogos de fosfato indicados anteriormente, y su incorporacion a los nucleotidos, nucleotidos modificados y oligonucleotidos per se, tambien es conocida y no es necesario describirla en este documento.
[0076] Puesto que, como es sabido en la materia, el codon de inicio de la traduccion tfpicamente es 5'-AUG 50 (en moleculas de ARNm transcritas; 5'-ATG en la molecula de ADN correspondiente), el codon de inicio de la
traduccion tambien se denomina como el «codon AUG», el «codon de inicio» o el «codon de inicio AUG». Una minorfa de genes tiene un codon de inicio de traduccion con la secuencia de ARN 5'-GUG, 5'-UUG o 5'-CUG; y se ha demostrado que 5'-AUA, 5'-ACG y 5'-CUG funcionan in vivo. Por tanto, los terminos «codon de inicio de la traduccion» y «codon de inicio» pueden abarcar muchas secuencias codon, aunque el aminoacido de inicio en cada 55 caso es tfpicamente metionina (en eucariotas) o formilmetionina (en procariotas). Los genes eucariotas y procariotas pueden tener dos o mas codones de inicio alternativos, cualquiera de los cuales puede utilizarse de forma preferente para el inicio de la traduccion en un tipo celular o tejido en particular, o bajo un conjunto de condiciones en particular. En el contexto de la memoria descriptiva, el «codon de inicio» y el «codon de inicio de la traduccion» se refieren al codon o codones que se utilizan in vivo para iniciar la traduccion de un ARNm transcrito a partir de un gen que
codifica el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), independientemente de las secuencias de dichos codones. Un codon de finalizacion de la traduccion (o «codon de parada») de un gen puede tener una entre tres secuencias, es decir, 5'-UAA, 5'-UAG y 5'-UGA (las secuencias de ADN correspondientes son 5'-TAA, 5'- TAG y 5'- TGA, respectivamente).
5
[0077] Los terminos «region del codon de inicio» y «region del codon de inicio de la traduccion» se refieren a una porcion de dicho ARNm o del gen que abarca desde aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleotidos contiguos en cada direccion (es decir, 5' o 3') desde un codon de inicio de traduccion. Los terminos «region del codon de parada» y «region del codon de parada de la traduccion» se refieren a una porcion de dicho ARNm o del
10 gen que abarca desde aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleotidos contiguos en cada direccion (es decir, 5' o 3') desde un codon de parada de la traduccion. Por consiguiente, la «region del codon de inicio» (o «region del codon de inicio de la traduccion») y la «region del codon de parada» (o «region del codon de parada de la traduccion) son todas las regiones que pueden ser reconocidas de forma eficaz con los compuestos antisentido de la presente memoria descriptiva.
15
[0078] El marco de lectura abierto (ORF, por sus siglas en ingles) o «region codificadora», que es conocido en la materia por referirse a la region entre el codon de inicio de la traduccion y el codon de terminacion de la traduccion, es tambien una region que puede ser reconocida de forma eficaz. Dentro del contexto de la presente memoria descriptiva, una region reconocida es la region intragenica que abarca el codon de inicio o parada de la
20 traduccion de la region de lectura abierta (ORF) de un gen.
[0079] Otra region diana incluye la region 5' no traducida (5'UTR, por sus siglas en ingles), conocida en la tecnica por referirse a la porcion de un ARNm en direccion 5' desde el codon de inicio de la traduccion y, por tanto, incluye nucleotidos entre la caperuza de 5' y el codon de inicio de la traduccion de un ARN (o los nucleotidos
25 correspondientes en el gen). Aun otra region diana incluye la region 3' no traducida (3'UTR), conocida en la materia por referirse a la porcion de un ARNm en direccion 3' desde el codon de parada de la traduccion y, por tanto, incluye nucleotidos entre el codon de parada de la traduccion y el extremo 3' del ARNm (o los nucleotidos correspondientes en el gen). El sitio caperuza 5' de un ARNm comprende un resto de guanosina metilada en N7 unido al resto mas en el extremo 5' del ARNm mediante un enlace 5'-5' trifosfato. Se considera que la region caperuza 5' de un ARNm esta 30 incluida en la estructura de caperuza 5' per se asf como los primeros 50 nucleotidos adyacentes a la caperuza. Otra region diana para esta memoria descriptiva es la region caperuza 5'.
[0080] Aunque algunos transcritos de ARNm eucariota se traducen directamente, muchos contienen una o mas regiones conocidas como «intrones» que se escinden de un transcrito antes de su traduccion. Las regiones
35 restantes (y por tanto traducidas) se conocen como «exones» y se ayustan juntas para formar una secuencia de ARNm continua. En un caso, los sitios de ayuste de reconocimiento, es decir, las uniones entre intron y exon o las uniones entre exon e intron, son especialmente utiles en situaciones en las que esta implicado un ayuste aberrante en una enfermedad, o cuando esta implicada una sobreproduccion de un producto de ayuste en particular en una enfermedad. Una union de fusion aberrante debido a la reorganizacion o deleccion es otro caso de sitio diana. Los 40 transcritos de ARNm producidos mediante el proceso de ayuste de dos (o mas) ARNm de diferentes fuentes de genes se conocen como «transcritos de fusion». Los intrones pueden reconocerse de forma eficaz usando compuestos antisentido dirigidos frente a, por ejemplo, el ADN o del pre-ARNm.
[0081] En otro caso preferido, los oligonucleotidos antisentido se unen a regiones codificadoras y/o no 45 codificadoras de un polinucleotido diana y modulan la expresion y/o la funcion de la molecula diana.
[0082] En otro caso preferido, los oligonucleotidos antisentido se unen a polinucleotidos antisentido naturales y modulan la expresion y/o la funcion de la molecula diana.
50 [0083] En otro caso preferido, los oligonucleotidos antisentido se unen a polinucleotidos sentido y modulan la
expresion y/o la funcion de la molecula diana.
[0084] Pueden producirse transcritos de ARN alternativos a partir de la misma region genomica de ADN. Estos transcritos alternativos se conocen, generalmente como «variantes». Mas especfficamente, las «variantes de
55 pre-ARNm» son transcritos producidos a partir del mismo ADN genomica que difieren de otros transcritos producidos a partir del mismo ADN genomico en su posicion inicial y de parada y contienen tanto secuencias intronicas como exonicas.
[0085] Tras la escision de una o mas regiones exon o intron, o porciones de las mismas durante el ayuste, las
variantes de pre-ARNm producen «variantes de ARNm» mas pequenas. Por consiguiente, las variantes de ARNm son variantes de pre-ARNm y cada variante de pre-ARNm exclusiva debe producir siempre una variante de ARNm exclusiva como resultado del ayuste. Estas variantes de ARNm tambien se conocen como «variantes de ayuste alternativo». Si no se produce el ayuste de la variante de pre-ARNm, entonces la variante de pre-ARNm es identica a 5 la variante de ARNm.
[0086] Las variantes pueden producirse mediante el uso de senales alternativas al inicio o parada de la
transcripcion. Los pre-ARNm y ARNm pueden poseer mas de un codon de inicio o de un codon de parada. Las variantes que se originan a partir de pre-ARNm o de ARNm que utilizan codones de inicio alternativos se conocen
10 como «variantes de inicio alternativo» de dicho pre-ARNm o ARNm. Aquellos transcritos que utilizan un codon de parada alternativo se conocen como «variantes de parada alternativa» de dicho pre-ARNm o ARNm. Un tipo especffico de variante de parada alternativa es la «variante poliA» en la que los transcritos multiples producidos son el resultado de la seleccion alternativa de una de las «senales de parada poliA» por la maquinaria de transcripcion, produciendose de este modo transcritos que terminan en sitios poliA exclusivos. Dentro del contexto de la memoria 15 descriptiva, los tipos de variantes descritos en este documento son tambien casos de acidos nucleicos diana.
[0087] Las localizaciones en el acido nucleico diana con las que hibridan los compuestos antisentido se
definen como al menos una porcion de 5 nucleotidos de longitud de una region diana a la que va dirigido un compuesto antisentido activo.
20
[0088] Mientras que en este documento se muestran las secuencias especfficas de determinados ejemplos de segmentos diana, un experto en la materia reconocera que estos sirven para ilustrar y describir casos particulares dentro del alcance de la presente memoria descriptiva. Un experto en la materia reconocera facilmente segmentos diana adicionales a la vista de esta memoria descriptiva.
25
[0089] Los segmentos diana de 5 a 100 nucleotidos de longitud que comprenden una longitud de al menos cinco (5) nucleotidos consecutivos seleccionados entre los segmentos diana preferidos mostrados se consideran adecuados tambien para el reconocimiento.
30 [0090] Los segmentos diana pueden incluir secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos los 5
nucleotidos consecutivos desde el extremo 5' de uno de los segmentos diana ilustrativos preferidos (siendo el resto de los nucleotidos una extension consecutiva del mismo ADN o ARN que empieza inmediatamente secuencia arriba del extremo 5' del segmento diana y continuando hasta el ADN o ARN que contiene de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleotidos). De forma similar, los segmentos diana preferidos estan representados por 35 secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos los 5 nucleotidos consecutivos desde el extremo 3' de uno de los segmentos diana ilustrativos preferidos (siendo el resto de los nucleotidos una extension consecutiva del mismo ADN o ARN que empieza inmediatamente secuencia arriba del extremo 3' del segmento diana y continuando hasta el ADN o ARN que contiene de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleotidos). Un experto en la materia provisto con los segmentos diana ilustrados en este documento sera capaz, sin necesidad de experimentacion, de 40 identificar segmentos diana preferidos adicionales.
[0091] Una vez que se hayan identificado una o mas regiones, segmentos o sitios diana, se eligen compuestos antisentido que sean suficientemente complementarios con la diana, es decir, que hibriden suficientemente bien y con suficiente especificidad, para proporcionar el efecto deseado.
45
[0092] En los casos de la memoria descriptiva los oligonucleotidos se unen a una cadena antisentido de una diana en particular. Los oligonucleotidos tienen una longitud de al menos 5 nucleotidos y pueden sintetizarse de modo que cada oligonucleotido, se dirija a secuencias solapantes, de modo que estos oligonucleotidos se sintetizan para cubrir la longitud completa del polinucleotido diana. Las dianas tambien incluyen regiones codificadoras asf
50 como no codificadoras.
[0093] En un caso, se prefiere dirigirse a acidos nucleicos especfficos mediante oligonucleotidos antisentido. El reconocimiento de un compuesto antisentido de un acido nucleico en particular, es un proceso multietapa. El proceso normalmente se inicia con la identificacion de una secuencia de acido nucleico cuya funcion se va a
55 modular. Esta puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito a partir del gen) cuya expresion se asocia con un trastorno o enfermedad en particular, o un polinucleotido no codificador como, por ejemplo, ARN no codificador (ARNnc).
[0094] Los ARN pueden clasificarse en (1) ARN mensajeros (ARNm), que se traducen en protefnas y (2)
ARN no codificadores de protefnas (ARNnc). Los ARNnc comprenden ARNmicro, transcritos antisentido y otras unidades transcipcionales (UT) que contienen una alta densidad de codones de parada y carecen de cualquier «marco de lectura abierto» extensivo. Muchos ARNnc parecen iniciarse en sitios de iniciacion de regiones no traducidas 3' (3'UTR) de loci que codifican protefnas. Los ARNnc a menudo son raros y al menos la mitad de los 5 ARNnc que se han secuenciado mediante el consorcio FANTOM parecen no estar poliadenilados. La mayorfa de los investigadores se han concentrado por motivos obvios en los ARNm poliadenilados que se procesan y exportan al citoplasma. Recientemente, se ha demostrado que el conjunto de ARN nucleares no poliadenilados puede ser muy grande y que muchos de estos transcritos surgen de las denominadas regiones intergenicas (Cheng, J. y col. (2005) Science 308 (5725), 1149-1154; Kapranov, P. y col. (2005). Genome Res 15 (7), 987-997). El mecanismo por el cual 10 los ARNnc pueden regular la expresion genica es mediante apareamiento de bases con los transcritos diana. Los ARN que funcionan mediante apareamiento de bases pueden agruparse en (1) ARN que codifican en cis que se codifican en la misma localizacion genetica, pero en la cadena opuesta a la que actuan los ARN y, por tanto, muestran la complementariedad perfecta con sus dianas y (2) ARN que codifican en trans que se codifican en una localizacion cromosomica diferente de la de los ARN que actuan sobre y generalmente no muestran un potencial de 15 apareamiento de bases perfecto con sus dianas.
[0095] Sin desear estar ligado a ninguna teorfa en particular, la perturbacion de un polinucleotido antisentido por los oligonucleotidos antisentido descritos en este documento puede alterar la expresion de los ARN mensajeros sentido correspondientes. No obstante, esta regulacion puede ser discordante (atenuacion antisentido que tiene
20 como resultado la elevacion del ARN mensajero) o concordante (atenuacion antisentido que tiene como resultado la reduccion del ARN mensajero concomitante). En estos casos, los oligonucleotidos antisentido pueden dirigirse a partes solapantes o no solapantes del transcrito antisentido lo que da lugar a su atenuacion o secuestro. Las secuencias antisentido tanto codificadores como no codificadoras pueden ser reconocidas de una forma identica y que cada categorfa es capaz de regular los correspondientes transcritos sentido (bien de forma concordante o 25 discordante). Las estrategias que se emplean para identificar nuevos oligonucleotidos para su uso frente a una diana pueden estar basadas en la atenacion de transcritos de ARN antisentido mediante oligonucleotidos antisentido y cualquier otra forma de modular la diana deseada.
[0096] Estrategia 1: en el caso de regulacion discordante, la atenuacion del transcrito antisentido eleva la 30 expresion del gen convencional (sentido). En caso de que este ultimo gen codifique una diana de un farmaco
conocido o putativo, entonces la atenuacion de su homologo antisentido podrfa mimetizar posiblemente la accion de un agonista del receptor o un estimulante de la enzima.
[0097] Estrategia 2: en el caso de regulacion concordante, podrfa atenuarse de forma concomitante tanto los 35 transcritos antisentido como los sentidos y conseguirse, por tanto, una reduccion sinergica o la expresion genica
(sentido) convencional. Si, por ejemplo, se utiliza un oligonucleotido antisentido para lograr la atenuacion, entonces esta estrategia puede utilizarse para aplicar un oligonucleotido antisentido dirigido al transcrito sentido y a otro oligonucleotido antisentido para el correspondiente transcrito antisentido, o un oligonucleotido antisentido energeticamente simetrico que se dirige simultaneamente a los transcritos sentido y antisentido solapantes.
40
[0098] Segun la presente memoria descriptiva, los compuestos antisentido incluyen oligonucleotidos antisentido, ribozimas, oligonucleotidos con secuencia de gufa externa (EGS), compuestos ARNip, compuestos ARN de interferencia (ARNi) de cadena sencilla y doble como compuestos ARNip y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una porcion del acido nucleico y modulan su funcion. De este modo, pueden ser ADN, ARN,
45 similar a ADN, similar a ARN o mezclas de ambos, o pueden ser mimeticos de uno o mas de estos. Estos compuestos pueden ser de cadena sencilla, de cadena doble, compuestos oligomericos circulares o en horquilla y pueden contener elementos estructurales como protuberancias, desapareamientos o lazos internos o terminales. De forma rutinaria, los compuestos antisentido se preparar linealmente aunque pueden juntarse o prepararse de cualquier otro modo para que sean circulares y/o ramificados. Los compuestos antisentido pueden incluir 50 construcciones como, por ejemplo, dos cadenas hibridan para formar un compuesto completo o parcialmente de cadena doble o una cadena sencilla con suficiente autocomplementariedad que permita la hibridacion y la formacion de un compuesto completa o parcialmente de doble cadena. Las dos cadenas pueden estar unidas internamente dejando libres los extremos 3' o 5' o pueden estar unidas formando una estructura en horquilla o lazo. La estructura en horquilla puede contener una proyeccion en el extremo 5' o en el 3' que produce una extension de caracter de 55 cadena sencilla. Los compuestos de doble cadena pueden, opcionalmente, incluir proyecciones en los extremos Modificaciones adicionales pueden incluir grupos conjugados unidos a uno de los extremos, posiciones de nucleotidos seleccionadas, posiciones de azucares u uno de los enlaces internucleosido. Alternativamente, las dos cadenas pueden estar unidas mediante un resto de acido no nucleico o un grupo enlazador. Cuando se forman a partir de una sola cadena, los ARNcd pueden tomar la forma de una molecula de tipo horquilla autocomplementaria
que se pliega sobre si misma para formar un duplex. Por tanto, los ARNcd pueden ser completa o parcialmente de cadena doble. La modulacion especffica de la expresion genica puede conseguirse mediante la expresion estable de horquillas de ARNcd en lfneas celulares transgenicas, no obstante, en algunos casos, la expresion o la funcion genica esta regulada por incremento. Cuando se forma a partir de dos cadenas, o de una cadena sencilla que toma 5 la forma de una molecula de tipo horquilla autocomplementaria doblada sobre si mismo para formar un duplex, las dos cadenas (o las regiones que forman el duplex de una cadena sencilla) son cadenas de ARN complementarias que aparean sus bases segun el modo de Watson y Crick.
[0099] Una vez introducidos en un sistema, los compuestos de la memoria descriptiva pueden mostrar la
10 accion de una o mas enzimas o protefnas estructurales para llevar a cabo la escision u otra modificacion del acido nucleico diana o pueden funcionar mediante mecanismos basados en el espacio. En general, los acidos nucleicos (incluidos los oligonucleotidos) pueden describirse como «similares a ADN» (es decir, que generalmente tiene uno o mas azucares 2'-desoxi y, en general, base T en lugar de U) o «similar a ARN» (es decir, que generalmente tienen uno o mas azucares 2'-hidroxilo o 2'-modificado y, generalmente, bases U en lugar de T). Las helices de acido 15 nucleico pueden adoptar mas de un tipo de estructura, mas frecuentemente las formas A y B. Se considera que, en general, los oligonucleotidos que tienen estructura similar a la forma B son «similares a aDn» y aquellos que tienen estructura similar a la forma A son «similares a ARN». En algunos casos (quimericos), un compuesto antisentido puede contiene tanto regiones de forma A como de B.
20 [0100] En otro caso preferido, los oligonucleotidos o compuestos antisentido deseados, comprenden al
menos uno de entre: ARN antisentido, ADN antisentido, oligonucleotidos antisentido quimericos, oligonucleotidos antisentido que comprenden enlaces modificados, ARN de interferencia (ARNi), ARN de interferencia corto (ARNic); un ARN de interferencia micro (ARNim); un ARN temporal pequeno (ARNtp) o un ARN en horquilla corto (ARNic); activacion genica inducida por ARN pequeno (ARNa), ARN de activacion pequeno (ARNap) o combinaciones de los 25 mismos.
[0101] El ARNcd puede tambien activar la expresion genica, un mecanismo que se ha denominado «activacion genica inducida por ARN pequeno» o ARNa. Los ARNcd que reconocen promotores genicos inducen una activacion transcripcional potente de genes asociados. La presencia de ARNa se demostro en celulas humanas
30 usando ARNcd sintetico, denominados «ARN de activacion pequeno» (ARNap). Actualmente no se sabe si el ARNa esta conservado en otros organismos.
[0102] Se ha encontrado que los ARN de cadena doble pequenos (ARNcd), como el ADN de interferencia pequeno (ARNip) y el microARN (ARNm), desencadenan un mecanismo evolutivamente conservado conocido como
35 ARN de interferencia (ARNi). Los ARNi invariables inducen el silenciamiento genico remodelando la cromatina para suprimir de este modo la transcripcion, degradando el ARNm complementario o bloqueando la traduccion de protefnas. No obstante, en los casos descritos con detalle en la seccion de ejemplos que sigue, se ha demostrado que los oligonucleotidos aumentan la expresion y/o la funcion de los polinucleotidos del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y codifican los productos de los mismos. Los ARNcd pueden tambien actuar como ARN 40 de activacion pequenos (ARNap). Sin desear estar ligado a ninguna teorfa en particular, reconociendo secuencias en promotores genicos, los ARNap podrfan inducir la expresion genica de la diana en un fenomeno denominado activacion transcripcional inducida por ARNcd (ARNa).
[0103] En un caso adicional, los «segmentos diana preferidos» identificados en este documento pueden 45 emplearse en una seleccion de compuestos adicionales que modulan la expresion de polinucleotidos del factor de
crecimiento del endotelio vascular (VEGF). «Moduladores» son aquellos compuestos que disminuyen o aumentan la expresion de una molecula de acido nucleico que codifica el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y que comprende al menos una porcion de 5 nucleotidos que es complementaria a una segmento diana preferido. El procedimiento de seleccion comprende las etapas de poner en contacto un segmento diana preferido de una 50 molecula de acido nucleico que codifica polinucleotidos sentido o antisentido naturales del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) con uno o mas moduladores candidatos, y seleccionar uno o mas moduladores candidatos que disminuyan o aumenten la expresion de una molecula de acido nucleico que codifica los polinucleotidos del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), por ejemplo, las SEC ID N.° 4 a 9. Una vez que se muestra que el modulador o moduladores candidatos son capaces de modular (es decir, disminuir o 55 aumentar) la expresion de una molecula de acido nucleico que codifica los polinucleotidos del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), el modulador puede emplearse a continuacion en estudios de investigacion adicionales de la funcion de los polinucleotidos del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) o para su uso como agente de investigacion, diagnostico o terapeutico segun la presente memoria descriptiva.
[0104] El reconocimiento de la secuencia antisentido natural preferiblemente modula la funcion del gen diana.
Por ejemplo, el gen del VEGF (NM_001025366.1, fig. 2). En un caso preferido, la diana es un polinucleotido antisentido del gen del factor de crecimiento del endotelio vascular A. En un caso preferido, un oligonucleotido antisentido se dirige a secuencias sentido y/o antisentido de los polinucleotidos del factor de crecimiento del 5 endotelio vascular (VEGF) (p. ej., numero de acceso (NM_001025366.1, fig. 2), variantes, alelos, isoformas, homologos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias de los mismos. Preferiblemente el oligonucleotido es una molecula antisentido y las dianas, incluyen regiones codificadoras y no codificadoras de polinucleotidos de VEGR antisentido y/o sentido.
10 [0105] Los segmentos diana preferidos de la presente memoria descriptiva pueden tambien combinarse con
sus respectivos compuestos antisentido complementarios de la presente memoria descriptiva para formar oligonucleotidos de cadena doble estabilizados (formando duplex).
[0106] Dichos restos oligonucleotidos de cadena doble han mostrado en la tecnica que modulan la expresion 15 de la diana y la traduccion regulada asf como el procesamiento del ARN a traves de un mecanismo antisentido.
Ademas, los restos de cadena dobles pueden someterse a modificaciones qufmicas (Fire y col., (1998) Nature, 391, 806-811; Timmons y Fire, (1998) Nature, 395, 854; Timmons y col., (2001) Gene, 263, 103-112; Tabara y col., (1998) Science, 282, 430-431; Montgomery y col, (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 15502-15507; Tuschl y col., (1999) Genes Dev., 13, 3191-3197; Elbashir y col., (2001) Nature, 411, 494-498; Elbashir y col., (2001) Genes Dev. 15, 20 188-200). Por ejemplo, se ha demostrado que dichos restos de cadena doble inhiben la diana mediante la hibridacion clasica de la cadena antisentido de los duplex con la diana, desencadenando de este modo la degradacion enzimatica de la diana (Tijsterman y col., (2002) Science, 295, 694-697).
[0107] En un caso preferido, un oligonucleotido antisentido se dirige a polinucleotidos del factor de 25 crecimiento del endotelio vascular (VEGF) (p. ej., numero de acceso NM_001025366.1), variantes, alelos, isoformas,
homologos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias de los mismos. Preferiblemente el oligonucleotido es una molecula antisentido.
[0108] De acuerdo con los casos de la memoria descriptiva, la molecula de acido nucleico diana no se limita 30 solo al factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) sino que se extiende a cualquiera de las moleculas
isoformas, receptores, homologos y similares del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF).
[0109] En otro ejemplo preferido, un oligonucleotido va dirigido hacia una secuencia antisentido natural de polinucleotidos del VEGF, por ejemplo, polinucleotidos establecidos en las SEC ID N.° 2 y 3, y cualquier variante,
35 alelo, homologo, mutante, derivado, fragmento y secuencia complementaria del mismo. En las SEC ID N.° 4 a 9 se muestran ejemplos de oligonucleotidos antisentido.
[0110] En un caso, los oligonucleotidos son complementarios o se unen a secuencias de acido nucleico del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) antisentido, incluyendo sin limitacion secuencias no
40 codificadoras sentido y/o antisentido asociadas con polinucleotidos del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y modulan la expresion y/o funcion de moleculas del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF).
[0111] En otro caso preferido, los oligonucleotidos son complementarios o se unen a secuencias de acido nucleico del antisentido natural del VEGF, mostradas como las SEC ID N.° 2 y 3, y modulan la expresion y/o funcion
45 de las moleculas del VEGF.
[0112] En un caso preferido, los oligonucleotidos comprenden secuencias de al menos 5 nucleotidos consecutivos de las SEC ID N.° 4 a 9 y modulan la expresion y/o funcion de las moleculas del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF).
50
[0113] Las dianas de polinucleotido comprenden VEGF, incluidos miembros de su familia, variantes de VEGF; mutantes de VEGF, incluidos SNP; secuencias no codificadoras de VEGF; alelos de VEGF; variantes de especies, fragmentos y similares. Preferiblemente el oligonucleotido es una molecula antisentido.
55 [0114] En otro caso preferido, el oligonucleotido que reconoce los polinucleotidos del factor de crecimiento
del epitelio vascular (VEGF) comprende: ARN antisentido, ARN de interferencia (ARNi), ARN de interferencia corto (ARNic); ARN de interferencia micro (ARNi), un ARN temporal pequeno (ARNip) o un ARN en horquilla corto (ARNip); activacion genica inducida por ARN pequeno (ARNa) o ARN de activacion pequeno (ARNap).
[0115] En otro caso preferido, el reconocimiento de los polinucleotidos del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), por ejemplo, las SEC ID N.° 2 y 3, modula la expresion o funcion de estas dianas. En un caso, la expresion o funcion esta regulada por incremento en comparacion con un control. En otro caso preferido, la expresion o funcion esta regulada por disminucion en comparacion con un control.
5
[0116] En otro caso preferido, los compuestos antisentido comprenden secuencias mostradas como SEC ID N.° 4 a 9. Estos oligonucleotidos pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, fragmentos mas cortos o mas largos, enlaces modificados y similares.
10 [0117] En otro caso preferido, las SEC ID N.° 4 a 9 comprenden uno o mas nucleotidos LNA.
[0118] La modulacion de un acido nucleico diana deseado puede llevarse a cabo de varias formas conocidas
en la tecnica. Por ejemplo, oligonucleotidos antisentido, ARNip, etc. Las moleculas de acido nucleico enzimaticas (p. ej., ribozimas) son moleculas de acido nucleico capaces de catalizar una o mas de entre diversas reacciones, 15 incluidas la capacidad para escindir repetidamente otras moleculas de acido nucleico independientes de forma especffica de secuencia de bases de nucleotidos. Dichas moleculas de acido nucleico enzimaticas pueden utilizarse, por ejemplo, para dirigir virtualmente cualquier transcrito de ARN (Zaug y col., 324, Nature 429 1986; Cech, 260 JAmA 3030, 1988; y Jefferies et al., 17 Nucleic Acids, Research 1371, 1989).
20 [0119] Debido a su especificidad de secuencia, las moleculas de acido nucleico enzimaticas que escinden en
trans se muestran como agentes terapeuticos prometedores para la enfermedad humana (Usman & McSwiggen, (1995) Ann. Rep. Med. Chem. 30, 285-294; Christoffersen y Marr, (1995) J. Med. Chem. 38, 2023-2037). Las moleculas de acido nucleico enzimaticas pueden disenarse para que escindan dianas de ARN especfficas dentro del patron del ARN celular. Dicho acontecimiento de escision da lugar a un ARNm no funcional y anula la expresion 25 proteica a partir de dicho ARN. De esta forma, la sfntesis de una protefna asociada con una enfermedad puede inhibirse de forma selectiva.
[0120] En general, los acidos nucleicos enzimaticos con actividad de escision del ARN actuan en primer lugar uniendose a un ARN diana. Dicha union se produce a traves de la porcion de union a la diana de un acido nucleico
30 enzimatico que es produce en las cercanfas de una porcion enzimatica de la molecula que actua escindiendo el ARN diana. Por tanto, el acido nucleico enzimatico reconoce en primer lugar y, a continuacion, se une a un ARN diana mediante apareamiento de bases complementarias y, una vez unido al sitio correcto, actua enzimaticamente cortando el ARN diana. La escision enzimatica de dicho ARN diana destruira su capacidad para dirigir la sfntesis de una protefna codificada. Despues de que el acido nucleico enzimatico se una y escinda su diana ARN, se libera de 35 ese ARN para buscar otra diana y puede unirse y escindir repetidamente nuevas dianas.
[0121] Se han utilizado varias estrategias como las estrategias de seleccion in vitro (evolucion) (Orgel, (1979) Proc. R. Soc. London, B 205, 435) para desarrollar nuevos acidos nucleicos catalizadores capaces de catalizar diversas reacciones, como la escision y el ligamiento de enlaces fosfodiester y enlaces amida (Joyce, (1989) Gene,
40 82, 83-87; Beaudry y col., (1992) Science 257, 635-641; Joyce, (1992) Scientific American 267, 90-97; Breaker y col., (1994) TIBTECH 12, 268; Bartel y col., (1993) Science 261:1411- 1418; Szostak, (1993) TIBS 17, 89-93; Kumar y col., (1995) FASEB J., 9, 1183; Breaker, (1996) Curr. Op. Biotech., 7, 442).
[0122] El desarrollo de ribozimas que son optimos para la actividad catalftica contribuirfa significativamente a 45 cualquier estrategia que emplee ribozimas que escindan ARN con el fin de regular la expresion genica. La ribozima
de cabeza de martillo, por ejemplo, funciona con una velocidad catalftica (kcat) de aproximadamente 1 min-1 en presencia de concentraciones saturantes (10 mM) del cofactor Mg2+. Se ha demostrado que la ribozima artificial «ARN ligasa» cataliza la correspondiente reaccion de automodificacion con una velocidad de aproximadamente 100 min-1. Ademas, es sabido que determinadas ribozimas de cabeza de martillo modificadas que tienen brazos que se 50 unen al sustrato actuan escindiendo ARN catalizado por ADN con velocidades de recambio multiples que se aproximan a 100 min-1. Finalmente, la sustitucion de un resto especffico dentro del centro catalftico de la cabeza de martillo con determinados analogos de nucleotidos proporciona ribozimas modificadas que muestran un aumento de hasta 10 veces en la velocidad catalftica. Estos hallazgos demuestran que las ribozimas pueden promover transformaciones qufmicas con velocidades catalfticas que son significativamente mayores que aquellas mostradas 55 in vitro por la mayorfa de las ribozimas de autoescision naturales. A continuacion, es posible que las estructuras de determinadas ribozimas de autoescision puedan optimizarse para proporcionar una actividad catalftica maxima, o que puedan obtener por motivos de ARN completamente nuevos que muestran velocidades significativamente mas rapidas para la escision del enlace fosfodiester del ARN.
[0123] La escision intermolecular de un sustrato de ARN mediante un catalizador de ARN que se ajusta al modelo de «cabeza de martillo» se mostro por primera vez en 1987 (Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600). El catalizador de ARN se recupero y reacciono con multiples moleculas de ARN, lo que demuestra que era realmente catalftico.
5
[0124] Los ARN catalfticos disenados en funcion del motivo de «cabeza de martillo» han sido utilizados para escindir secuencias diana especfficas haciendo cambios de bases apropiados en el ARN catalftico para mantener los apareamientos de bases necesarios con las secuencias diana (Haseloff y Gerlach, (1988) Nature, 334, 585; Walbot y Bruening, (1988) Nature, 334, 196; Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600; Koizumi, M., y col.
10 (1988) FEBS Lett., 228: 228-230). Esto ha permitido el uso del ArN catalftico para escindir secuencias diana especfficas e indica que los ARN catalfticos disenados segun el modelo de «cabeza de martillo» pueden posiblemente escindir ARN sustrato especfficos in vivo. (vease Haseloff y Gerlach, (1988) Nature, 334, 585; Walbot y Bruening, (1988) Nature, 334, 196; Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600).
15 [0125] La interferencia del ARN (ARN) se ha convertido en una potente herramienta para modular la
expresion genica en mamfferos y en celulas de mamfferos. Esta aproximacion requiere la administracion del ARN de interferencia pequeno (ARNip) bien como ARN en sf o como ADN, usando un plasmido o virus de expresion y la secuencia que codifica el ARN en horquilla pequeno que se procesan en ARNip. Este sistema permite el transporte eficaz de los pre-ARNip al citoplasma donde se activan y permite el uso de promotores regulados y especfficos de 20 tejido para la expresion genica.
[0126] En un caso preferido, un compuesto oligonucleotido o antisentido comprende un oligomero o polfmero
de acido ribonucleico (ARN) y/o acido desoxirribonucleico (ADN) o mimeticos, quimeras, analogos u homologos de los mismos. Este termino incluye oligonucleotidos compuestos por nucleotidos naturales, azucares y enlaces 25 internucleosidos covalentes (esqueleto) asf como oligonucleotidos que tienen porciones no naturales que funcionan de forma similar. A menudo, se prefieren dichos oligonucleotidos modificados o sustituidos sobre las formas nativas debido a las propiedades deseables como, por ejemplo, potenciacion de la captacion celular, potenciacion de la afinidad por un acido nucleico diana y aumento de la estabilidad en presencia de nucleasas.
30 [0127] Segun la presente memoria descriptiva, los oligonucleotidos o «compuestos antisentido» incluyen
oligonucleotidos antisentido (p. ej., ARN, ADN, mimetico, quimera, analogo u homologo del mismo), ribozimas, oligonucleotidos con secuencia de gufa externa (EGS), compuestos ARNip, compuestos ARN de interferencia (ARNi) de cadena sencilla y doble como compuestos ARNip, ARNap, ARNa y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una porcion del acido nucleico diana y modulan su funcion. De este modo, pueden ser aDn, 35 ARN, similar a ADN, similar a ARN o mezclas de ambos, o pueden ser mimeticos de uno mas de estos. Estos compuestos pueden ser de cadena sencilla, de cadena doble, compuestos oligomericos circulares o en horquilla y pueden contener elementos estructurales como protuberancias, desapareamientos o lazos internos o terminales. De forma rutinaria, los compuestos antisentido se preparar con forma lineal aunque puede juntarse o prepararse de cualquier otro modo para que sean circulares y/o ramificados. Los compuestos antisentido pueden incluir 40 construcciones como, por ejemplo, dos cadenas que hibridan para formar un compuesto completo o parcialmente de cadena doble o una cadena sencilla con suficiente autocomplementariedad que permita la hibridacion y la formacion de un compuesto completa o parcialmente de doble cadena. Las dos cadenas pueden estar unidas internamente dejando libres los extremos 3' o 5' o pueden estar unidas formando una estructura en horquilla o lazo. La estructura en horquilla puede contener una proyeccion en el extremo 5' o en el 3' que produce una extension de caracter de 45 cadena sencilla. Los compuestos de doble cadena pueden, opcionalmente, incluir proyecciones en los extremos. Modificaciones adicionales pueden incluir grupos conjugados unidos a uno de los extremos, posiciones de nucleotidos seleccionadas, posiciones de azucares o uno de los enlaces internucleosido. Alternativamente, las dos cadenas pueden estar unidas mediante un resto de acido no nucleico o un grupo enlazador. Cuando se forman a partir de una sola cadena, los ARNcd pueden tomar la forma de una molecula de tipo horquilla autocomplementaria 50 que se pliega sobre sf misma para formar un duplex. Por tanto, los ARNcd pueden ser completa o parcialmente de cadena doble. La modulacion especffica de la expresion genica puede conseguirse mediante la expresion estable de horquillas de ADRcd en lfneas celulares transgenicas (Hammond y col., (1991) Nat. Rev. Genet., 2, 110-119; Matzke y col., (2001) Curr. Opin. Genet. Dev., 11, 221-227; Sharp, (2001) Genes Dev., 15, 485-490). Cuando se forma a partir de dos cadenas, o de una cadena sencilla que toma la forma de una molecula de tipo horquilla 55 autocomplementaria doblada sobre sf misma para formar un duplex, las dos cadenas (o las regiones que forman el duplex de una cadena sencilla) son cadenas de ARN complementarias que aparean sus bases segun el modo de Watson y Crick.
[0128] Una vez introducido en un sistema, los compuestos de la memoria descriptiva pueden mostrar la
accion de una o mas enzimas o protefnas estructurales para llevar a cabo la escision u otra modificacion del acido nucleico diana o pueden funcionar mediante mecanismos basados en el espacio. En general, los acidos nucleicos (incluidos los oligonucleotidos) pueden describirse como «similares a ADN» (es decir, que generalmente tiene uno o mas azucares 2'-desoxi y, en general, base T en lugar de U) o «similar a ARN» (es decir, que en general tiene uno o 5 mas azucares 2'-hidroxilo o 2'-modificado y, generalmente, bases U en lugar de T). Las helices de acido nucleico pueden adoptar mas de un tipo de estructura, mas frecuentemente las formas A y B. Se considera que, en general, los oligonucleotidos que tienen estructura similar a la forma B son «similares a ADN» y aquellos que tienen estructura similar a la forma A son «similares a ARN». En algunos casos (quimericos), un compuesto antisentido puede contener tanto regiones de forma A como de B.
10
[0129] Los compuestos antisentido segun esta descripcion pueden comprender una porcion antisentido con una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 nucleotidos (es decir, de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 nucleosidos unidos). Esto se refiere a la longitud de la cadena o porcion antisentido del compuesto antisentido. En otras palabras, un compuesto antisentido de cadena sencilla de la memoria descriptiva
15 comprende de 5 a aproximadamente 80 nucleotidos, y un compuesto antisentido de cadena doble de la memoria descriptiva (como, por ejemplo, un ARNcd) comprende una cadena sentido y antisentido o una porcion de una longitud de 5 a aproximadamente 80 nucleotidos. Un experto en la materia apreciara que estas porciones antisentido comprenden una longitud de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 4, 5, 26, 27, 28, 9, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 20 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 nucleotidos o cualquiera dentro de este rango.
[0130] En un caso, los compuestos antisentido de la memoria descriptiva tienen porciones antisentido de una longitud de 10 a 50 nucleotidos. Un experto en la materia apreciara que estas porciones incorporan oligonucleotidos
25 con porciones antisentido con una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 35, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 nucleotidos o cualquiera dentro de este rango. En algunos casos, los oligonucleotidos tienen una longitud de 15 nucleotidos.
[0131] En un caso, los compuestos antisentido u oligonucleotidos de la memoria descriptiva tienen porciones 30 antisentido de una longitud de 12 o 13 a 30 nucleotidos. Un experto en la materia apreciara que estas porciones
incorporan compuestos antisentido con porciones antisentido con una longitud de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleotidos o cualquiera dentro de este rango.
[0132] En otro caso preferido, los compuestos oligomericos de la presente memoria descriptiva tambien 35 incluyen variantes en las que se presenta una base diferente a uno o mas de las posiciones de nucleotidos del
compuesto. Por ejemplo, si el primer nucleotido es una adenosina, pueden producirse variantes que contienen timidina, guanosina o citidina en esta posicion. Esto puede hacerse en cualquier de las posiciones de los compuestos antisentido o ARNcd. A continuacion, estos compuestos se prueban usando procedimientos descritos en este documento para determinar su capacidad para inhibir la expresion de un acido nucleico diana.
40
[0133] En algunos casos, la homologfa, la identidad de secuencia o la complementariedad entre el compuesto antisentido y la diana es de aproximadamente el 40% a aproximadamente el 60%. En algunos casos, la homologfa, la identidad de secuencia o la complementariedad es de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 70%. En algunos casos, la homologfa, la identidad de secuencia o la complementariedad es de aproximadamente
45 el 70% a aproximadamente el 80%. En algunos casos, la homologfa, la identidad de secuencia o la complementariedad es de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 90%. En algunos casos, la homologfa, la identidad de secuencia o la complementariedad es de aproximadamente el 90%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99% o aproximadamente el 100%.
50
[0134] En otro caso preferido, los oligonucleotidos antisentido, como por ejemplo, las moleculas de acido nucleico mostradas en las SEC ID N.° 4 a 9 comprenden uno o mas sustituciones o modificaciones. En un caso, los nucleotidos estan sustituidos con acidos nucleicos bloqueados (LNA).
55 [0135] En otro caso preferido, los oligonucleotidos se dirigen a una o mas regiones de las moleculas de acido
nucleico sentido y/o antisentido de secuencias codificadoras y/o no codificadoras asociadas con VEGF y las secuencias mostradas como SEC ID N.° 1 a 3. Los oligonucleotidos estan tambien dirigidos a regiones solapantes de las SEC ID N.° 1 a 3.
[0136] Determinados oligonucleotidos preferidos de esta memoria descriptiva son oligonucleotidos quimericos. Los «oligonucleotidos quimericos» o «quimeras» en el contexto de esta memoria descriptiva son oligonucleotidos que contienen dos o mas regiones qufmicamente diferenciadas, compuesta cada una por al menos un nucleotido. Estos oligonucleotidos tfpicamente contienen al menos una region de nucleotidos modificados que
5 confieren una o mas propiedades beneficiarias (como, por ejemplo, aumento de la resistencia a nucleasas, aumento de la captacion en celulas, aumento de la afinidad de union a la diana) y una region que es un sustrato para las enzimas capaces de escindir hfbridos de ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplo, la ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un duplex de ARN:ADN. Por tanto, la activacion de la ARNasa H tiene como resultado la escision de la diana de ARN, potenciando de este modo en gran medida la 10 eficacia de la modulacion antisentido de la expresion genica. En consecuencia, pueden obtenerse a menudo resultados comparables con oligonucleotidos mas cortos cuando se utilizan oligonucleotidos quimericos, en comparacion con desoxioligonucleotidos fosforotioato que hibridan con la misma region diana. La escision de la diana de ARN puede detectarse de forma rutinaria mediante electroforesis en gel y, si es necesario, tecnicas asociadas de hibridacion de acidos nucleicos conocidas en la tecnica. En un caso preferido, un oligonucleotido 15 quimerico comprende al menos una region modificada para aumentar la afinidad de union a la diana y, normalmente, una region que actua como sustrato para la ARNasa H. La afinidad de un oligonucleotido para esta diana (en este caso, un acido nucleico que codifica ras) se determina de forma rutinaria midiendo la Tf de un par oligonucleotido/diana, que es la temperatura a la que se disocian el oligonucleotido y la diana; la disociacion se detecta espectrofotometricamente. Cuanto mas alta es la Tf, mayor es la afinidad del oligonucleotido por la diana.
20
[0137] Los compuestos antisentidos quimericos de la presente memoria descriptiva pueden formarse como estructuras compuestas de dos o mas oligonucleotidos, oligonucleotidos modificados y oligonucleosidos y/o mimeticos oligonucleotidos como se describe a continuacion. Por tanto, los compuestos tambien se han denominado en la materia hfbridos o gapmeros. Entre las patentes de Estados Unidos representativas en las que se muestra la
25 preparacion de dichas estructuras se encuentran, entre otras las patentes de EE. UU. N.° 5 013 830, 5 149 797, 5 220 007, 5 256 775, 5 366 878, 5 403 711, 5 491 133, 5 565 350, 5 623 065, 5 652 355, 5 652 356 y 5 700 922.
[0138] En otro caso preferido, la region del oligonucleotido que se modifica comprende al menos un nucleotido modificado en la posicion 2' del azucar, mas preferiblemente un nucleotido modificado en 2'-O-alquilo, 2'30 O-alquilo-O-alquilo o 2'-fluoro. En otros casos preferidos, las modificaciones de ARN incluyen modificaciones 2'-
fluoro, 2'-amino y 2'-O-metilo en la ribosa de pirimidinas, un resto basico o una base invertida en el extremo 3' del ARN. Dichas modificaciones se incorporan de forma rutinaria a los oligonucleotidos y se ha demostrado que estos oligonucleotidos tienen una Tf mas alta (es decir, mas alta afinidad de union por la diana) que los 2'- desoxioligonucleotidos frente a una diana determinada. El efecto de este aumento de la afinidad es un enorme 35 aumento de la inhibicion de la expresion genica por el oligonucleotido ARNi. La ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de los duplex de ARN:ADN; por tanto, la activacion de esta enzima tiene como resultado la escision de la diana de ARN y, de este modo, puede potenciar en gran medida la eficacia de la inhibicion del ARNi. La escision de la diana de aRn puede demostrarse de forma rutinaria mediante electroforesis en gel. En otro caso preferido, el oligonucleotido quimerico tambien esta modificado para potenciar la resistencia a la 40 nucleasa. Las celulas contienen diversas exo y endonucleasas que pueden degradar los acidos nucleicos. Se ha demostrado que varias modificaciones de nucleotido y nucleosido hacen que el oligonucleotido al que se incorporar sea mas resistente a la digestion por nucleasas que el oligonucleotido nativo. La resistencia a nucleasas se mide de forma rutinaria incubando los oligonucleotidos con extractos celulares o soluciones de nucleasas aisladas y midiendo el grado de oligonucleotido intacto que permanece con el tiempo, normalmente mediante electroforesis en gel. Los 45 oligonucleotidos que han sido modificados para potenciar su resistencia a nucleasas sobreviven intactos durante mas tiempo que los oligonucleotidos no modificados. Se ha demostrado que diversas modificaciones de oligonucleotidos potencian o confieren resistencia a nucleasas. Los oligonucleotidos que contienen al menos una modificacion fosforotioato son los mas preferidos en la actualidad. En algunos casos, las modificaciones del oligonucleotido que potencian la afinidad de union a la diana son, independientemente, capaces de potenciar la 50 resistencia a nucleasas. Algunas modificaciones deseables pueden encontrarse en De Mesmaeker y col. (1995) Acc. Chem. Res., 28:366-374.
[0139] Entre los ejemplos especfficos de algunos oligonucleotidos preferidos contemplados por esta memoria descriptiva se incluyen aquellos que comprenden esqueletos modificados, por ejemplo, fosforitioatos,
55 fosforotriesteres, metilfosfonatos, enlaces entre azucares alquilo o cicloalquilo de cadena corta o enlaces entre azucares heteroatomicos o heterocfclicos de cadena corta. Los mas preferidos son oligonucleotidos con esqueletos fosforotioato y aquellos con esqueletos de heteroatomos, especialmente esqueletos CH2 --NH--O-CH2, CH,-- N(CH3)--O--CH2 [conocido como esqueleto metilen(metilimino) o MMI], CH2-O--N (CH3)--CH2, CH2 -N(CH3))--N (CH3)--CH2 y O--N (CH3)--CH2 --CH2, donde el esqueleto fosfodiester nativo esta representado por O--P--O--CH).
Tambien se prefieren los esqueletos de amida descritos por De Mesmaeker y col. (1995) Acc. Chem. Res. 28:366374. Tambien se prefieren los oligonucleotidos con estructuras de esqueleto morfolino (Summerton y Weller, patente de EE. UU. N.° 5 034 506). En otros casos preferidos, como con el esqueleto de acido nucleico peptfdico (PNA), el esqueleto fosfodiester del oligonucleotido se sustituye por un esqueleto poliamida, estando los nucleotidos unidos 5 directa o indirectamente a los atomos de nitrogeno aza del esqueleto poliamida (Nielsen y col. (1991) Science 254, 1497). Los oligonucleotidos tambien pueden comprenden uno o mas restos de azucar sustituidos. Los oligonucleotidos preferidos comprenden uno de los siguientes grupos en la posicion 2': OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3 OCH3, OCH3 O(CH2)n CH3, O(CH2)n NH2 o O(CH2)n CH3 donde n es de 1 a aproximadamente 10; alquilo inferior C1 a C10, alcoxialcoxi, alquilo, alcarilo o aralquilo inferior sustituido; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O--, S-- o N- 10 alquilo; O--, S-- o N-alquenilo; sOcH3; SO2 CH3; OnO2; NO2; N3; NH2; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino; sililo sustituido; un grupo que escinde el ARN; un grupo indicador; un intercalador; un grupo para mejorar las propiedades farmacocineticas de un oligonucleotido; o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinamicas de un oligonucleotido y otros sustituyentes con propiedades similares. Una modificacion preferida incluye 2'-metoxietoxi [2'-O-CH2 CH2 OCH3, tambien conocido como 2'-O-(2-metoxietil)] 15 (Martin y col., (1995) Helv. Chim. Acta, 78, 486). Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-metoxi (2'-O--CH3), 2'- propoxi (2'-OCH2 CH2CH3) y 2'-fluoro (2'-F). Tambien pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones del oligonucleotido, especialmente en la posicion 3' del azucar o en el nucleotido 3' terminal y en la posicion 5' del nucleotido del extremo 5'. Los oligonucleotidos tambien pueden tener mimeticos de azucares como ciclobutilos en lugar del grupo pentofuanosilo.
20
[0140] Los oligonucleotidos tambien pueden incluir, adicional o alternativamente, modificaciones o sustituciones de nucleobases (a menudo denominadas en la materia simplemente «base»). Segun se usa en este documento, nucleotidos «no modificados» o «naturales» incluyen adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Entre los nucleotidos modificados se incluyen nucleotidos que se encuentran solo de forma poco
25 frecuente o transitoria en acidos nucleicos naturales, por ejemplo, hipoxantina, 6-metiladenina, 5-Me pirimidinas, especialmente 5-metilcitosina (tambien denominada 5-metil-2' deoxicitosina y a menudo denominada en la tecnica 5- Me-C), 5- hidroximetilcitosina (HMC), glicosil HMC y gentobiosil HMC, asf como nucleotidos sinteticos, por ejemplo, 2-aminoadenina, 2-(metilamino)adenina, 2-(imidazolilalquil)adenina, 2-(aminoalquilamino)adenina u otras alquiladeninas heterosustituidas, 2-tiouracilo, 2-tiotimina, 5-bromouracilo, 5-hidroximetiluracilo, 8-azaguanina, 730 deazaguanina, N6 (6-aminohexil)adenina y 2,6-diaminopurina. (Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1980, pag. 75-77; Gebeyehu, G., (1987) y col. Nucl. Acids Res. 15:4513). Puede incluirse una base «universal» conocida en la tecnica, por ejemplo, inosina. Se ha demostrado que las sustituciones 5-Me-C aumentan la estabilidad del duplex de acido nucleico en 0,6-1,2 °C. (Sanghvi, Y. S., en Crooke, S. T. y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pag. 276-278) y en la actualidad son las 35 sustituciones de base preferidas.
[0141] Otra modificacion de los oligonucleotidos de la memoria descriptiva implica enlazar qufmicamente el oligonucleotido a uno o mas restos o conjugados que potencian la actividad o la captacion celular del oligonucleotido. Entre estos restos se incluyen, sin limitaciones, restos de lfpidos como un resto de colesterol, un
40 resto colesterilo. (Letsinger y col., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6553), acido colico (Manoharan y col. (1994) Bioorg. Med. Chem. Let. 4, 1053), un tioeter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan y col. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 306; Manoharan y col. (1993) Bioorg. Med. Chem. Let. 3, 2765), un tiocolesterol (Oberhauser y col., (1992) Nucl. Acids Res. 20, 533), una cadena alifatica, por ejemplo, restos dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras y col. EMBO J. 1991, 10, 111; Kabanov y col. (1990) FEBS Lett. 259, 327; Svinarchuk y col. (1993) Biochimie 75, 49), 45 un fosfolfpido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan y col. (1995) Tetrahedron Lett. 36, 3651; Shea y col. (1990) Nucl. Acids Res. 18, 3777), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan y col. (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14, 969) o acido acetico adamantano (Manoharan y col. (1995) Tetrahedron Lett. 36, 3651). Los oligonucleotidos que comprenden restos lipofilos y los procedimientos para la preparacion de dichos oligonucleotidos son conocidos en la tecnica, por 50 ejemplo, a partir de las patentes de EE. UU. N.° 5 138 045, 5 218 105 y 5 459 255.
[0142] No es necesario que todas las posiciones de un oligonucleotido determinado esten uniformemente modificadas y, de hecho, mas de una de las modificaciones mencionadas anteriormente pueden incorporarse a un unico oligonucleotido o incluso dentro de un unico nucleosido dentro de un oligonucleotido. La presente memoria
55 descriptiva tambien incluye oligonucleotidos que son oligonucleotidos quimericos como se definio anteriormente en este documento
[0143] En otro caso, la molecula de acido nucleico de la presente memoria descriptiva esta conjugada con otro resto incluidos, sin limitaciones, nucleotidos no basicos, polieter, poliamina, poliamidas, peptidos, hidratos de
carbono, lipidos o compuestos polihidrocarburos. Los expertos en la materia reconoceran que estas moleculas pueden unirse a uno o mas de cualquier de los nucleotidos que comprende la molecula de acido nucleico en varias posiciones del azucar, la base o el grupo fosfato.
5 [0144] Los oligonucleotidos utilizados segun esta memoria descriptiva pueden obtenerse de forma
conveniente y rutinaria mediante la tecnica bien conocida de sfntesis en fase solida. Varios proveedores venden el equipo para dicha sfntesis, entre ellos Applied Biosystems. Tambien puede emplearse cualquier otro sistema para esta sfntesis; la sfntesis real de los oligonucleotidos esta bien incluida dentro de las habilidades de los expertos en la materia. Tambien es bien conocido el uso de tecnicas similares para preparar otros oligonucleotidos como los
10 fosforotioatos y derivados alquilados. Tambien es bien conocido el uso de tecnicas similares y de amiditas modificadas disponibles en el marcado asf como productos de vidrio de poro controlado (VPC) como amiditas modificadas con biotina, flurescefna, acridina o psoraleno y/o VPC (disponibles a partir de Gelen Research, Sterling VA) para sintetizar oligonucleotidos marcados con fluorescencia, biotinilados o modificados de otra forma como oligonucleotidos modificados con colesterol.
15
[0145] Segun la memoria descriptiva, el uso de modificaciones como el uso de monomeros LNA aumenta la potencia, especificidad y duracion de la accion y amplfa las vfas de administracion de oligonucleotidos que comprenden productos qufmicos actuales como MOE, ANA, FANA, PS, etc. (Uhlman, y col. (2000) Current Opinions in Drug Discovery & Development Vol. 3 N.° 2). Esto puede conseguirse sustituyendo algunos de los monomeros en
20 los oligonucleotidos actuales por monomeros LNA. El oligonucleotido modificado con LNA puede tener un tamano similar al compuesto parental o puede ser mas largo o, preferiblemente, mas corto. Se prefiere que dichos oligonucleotidos modificados con LNA contengan al menos mas de aproximadamente el 70%, mas preferiblemente menos de aproximadamente el 60%, mas preferiblemente menos de aproximadamente el 50% de monomeros LNA y que sus tamanos esten entre aproximadamente 5 y 25 nucleotidos, mas preferiblemente entre aproximadamente l2
25 y 20 nucleotidos.
[0146] Los esqueletos del oligonucleotido modificados preferidos comprenden, sin limitaciones, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforiditioatos, fosfotriesteres, aminoalquilfosforotriesteres, metil y otros alquilfosfonatos que comprenden 3'-alquilen fosfonatos y fosfonatos quirales, fosfonatos, fosforamidatos que comprenden 3'-amino
30 fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriesteres y boranofosfatos con enlaces 3'-5' normales, analogos con enlaces 2'5' de estos y aquellos con polaridad invertida donde los pares adyacentes a las unidades de nucleosidos estan unidos de 3'-5' a 5'-3' o de 2'-5' a 5'-2'. Tambien se incluyen diversas sales, mezclas de sales y formas de acido libre.
35 [0147] Entre las patentes de Estados Unidos representativas en las que se muestra la preparacion de los
enlaces que contienen fosforo anteriores se encuentran, sin limitaciones, las patentes de EE. UU. N.° 3 687 808,
4 469 863, 4 476 301, 5 023 243, 5 177 196, 5 188 897, 5 264 423, 5 276 019, 5 278 302, 5 286 717, 5 321 131,
5 399 676, 5 405 939, 5 453 496, 5 455 233, 5 466 677, 5 476 925, 5 519 126, 5 536 821, 5 541 306, 5 550 111, 5 563 253, 5 571 799, 5 587 361 y 5 625 050.
40
[0148] Los esqueletos de oligonucleotidos modificados referidos que no incluyen un atomo de fosforo en ellos
tienen esqueletos que se forman mediante enlaces entre nucleosidos alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces entre nucleotidos alquilo o cicloalquilo y mezcla de heteroatomos o uno o mas enlaces entre nucleosidos heteroatomicos o heterocfclicos de cadena corta. Estos comprenden aquellos que tienen enlaces morfolino
45 (formados en parte a partir de la porcion azucar de un nucleosido); esqueletos de siloxano; esqueletos de sulfuro, sulfoxido y sulfona; esqueletos de formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de formacetilo y tioformacetilo de metileno; esqueletos que contienen alqueno; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenimino y metilenhidrazino; esqueletos de sulfonato y sulfonamida; esqueletos de amida y otros que tengan mezclas de partes de los compuestos N, O, S y CH2.
50
[0149] Entre las patentes de Estados Unidos representativas en las que se muestra la preparacion de los oligonucleosidos anteriores se encuentran, entre otras las patentes de EE. UU. N.° 5 034 506, 5 166 315, 5 185 444, 5 214 134, 5 216 141, 5 235 033, 5 264 562, 5 264 564, 5 405 938, 5 434 257, 5 466 677, 5 470 967, 5 489 677, 5 541 307, 5 561 225, 5 596 086, 5 602 240, 5 610 289, 5 602 240, 5 608 046, 5 610 289, 5 618 704, 5 623 070,
55 5 663 312, 5 633 360, 5 677 437 y 5 677 439.
[0150] En otros mimeticos de oligonucleotido preferidos, tanto el azucar como el enlace entre nucleosidos, es decir, el esqueleto, de las unidades de nucleotidos se sustituyen por grupos nuevos. Estas unidades base se mantienen para la hibridacion con un compuesto diana de acido nucleico apropiado. Uno de estos compuestos
oligomericos, un mimetico de oligonucleotido que ha mostrado tener excelentes propiedades de hibridacion, se denomina acido nucleico peptfdico (PNA). En los compuestos PNA, el esqueleto de azucar de un oligonucleotido se sustituye con un esqueleto que contiene amida, en particular, un esqueleto de aminoetilglicina. Se mantienen las nucleobases y se unen directa o indirectamente a atomos de nitrogeno de aza de la porcion amida del esqueleto. 5 Entre las patentes de Estados Unidos representativas en las que se muestra la preparacion de los oligonucleosidos PNA se encuentran, entre otras las patentes de EE. UU. N.° 5 539 082, 5 714 331 y 5 719 262.
[0151] Pueden encontrarse explicaciones adicionales de los compuestos PNA en Nielsen, y col. (1991) Science 254, 1497-1500.
10
[0152] En otro caso preferido de la memoria descriptiva los oligonucleotidos con esqueletos fosforotioato y oligonucleosidos con esqueletos de heteroatomos y, en particular -CH2-NH-O-CH2-,-CH2-N (CH3)-O-CH2 [conocido como esqueleto de metilen(metilimino) o MMI],- CH2-O-N (CH3)-CH2-,-CH2N(CH3)-N(CH3) CH2- y -O-N(CH3)- CH2-CH2- donde el esqueleto de fosfodiester nativo esta representado como -O-P-O-CH2- de la patente de EE. UU.
15 mencionada anteriormente N.° 5 489 677, y los esqueletos amida de la patente de EE. UU. mencionada anteriormente N.° 5 602 240. Tambien se prefieren oligonucleotidos con estructuras de esqueleto de morfolino de la patente de EE. UU. mencionada anteriormente N.° 5 034 506.
[0153] Los oligonucleotidos modificados tambien pueden contener uno o mas restos de azucar sustituidos. 20 Los oligonucleotidos preferidos comprenden uno de los siguientes grupos en la posicion 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo;
O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo u O alquil-O-alquilo, donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser C sustituido o no sustituido por alquilo CO o C2 a alquenilo y alquinilo CO. Especialmente preferidos son O (CH2)n OmCH3, O(CH2)n,OCH3 O(CH2)nNH2 O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 y O(CH2nON(CH2)nCH3)2 donde n y m pueden ser de 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleotidos preferidos comprenden uno de los siguientes grupos 25 en la posicion 2': C a CO, (alquilo inferior, sustituido por alquilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo inferior, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2 N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escision de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejora las propiedades farmacocineticas de un oligonucleotido o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinamicas de un oligonucleotido, y otros sustituyentes que tengan propiedades 30 similares. Una modificacion preferida comprende 2'-metoxietoxi (2'-O-CH2 CH2 OCH3, tambien conocido como 2'-O- (2-metoxietil) o 2'-MOE) (Martin y col., (1995) Helv. Chim. Acta, 78, 486-504) es decir, un grupo alcoxialcoxi. Una modificacion preferida comprende 2'-dimetIlaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, tambien conocido como 2-DMAOE, como se describe a continuacion en los ejemplos en este documento, y 2'- dimetilaminoetoxietoxi (tambien conocido en la materia como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'- DMAEOE), es decir, 2'-O-CH2-O-CH2-N 35 (CH2)2.
[0154] Otras modificaciones preferidas comprenden 2'-metoxi (2'-OCH3), 2'- aminopropoxi (2'-O
CH2CH2CH2NH2) y 2'-fluoro (2'-F). Tambien pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones del oligonucleotido, especialmente en la posicion 3' del azucar en el nucleotido 3' terminal o en los oligonucleotidos
40 unidos 2'-5' y en la posicion 5' de nucleotidos del extremo 5'. Los oligonucleotidos tambien pueden tener mimeticos de azucares como restos ciclobutilos en lugar del azucar pentofuanosilo. Entre las patentes de Estados Unidos representativas en las que se muestra la preparacion de dichas estructuras de azucar modificado se encuentran, entre otras las patentes de EE. UU. N.° 4 981 957, 5 118 800, 5 319 080, 5 359 044, 5 393 878, 5 446 137, 5 466 786, 5 514 785, 5 519 134, 5 567 811, 5 576 427, 5 591 722, 5 597 909, 5 610 300, 5 627 053, 5 639 873, 45 5 646 265, 5 658 873, 5 670 633 y 5 700 920.
[0155] Los oligonucleotidos tambien pueden comprender modificaciones o sustituciones de nucleobases (a menudo denominadas en la materia simplemente «base»). Segun se usa en este documento, nucleotidos «no modificados» o «naturales» comprende las bases purfnicas adenina (A) y guanina (G), y las bases pirimidfnicas
50 timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Los nucleotidos modificados comprenden otros nucleotidos sinteticos y naturales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2- tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 855 sustituidas, 5-halo especialmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidas, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3- desazaadenina.
[0156] Adicionalmente, entre los nucleotidos se incluyen aquellos descritos en la patente de Estados Unidos
N.° 3 687 808, aquellos descritos en «The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineerings paginas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquellos descritos en Englisch y col., «Angewandle Chemie, International Edition», 1991, 30, pagina 613, y aquellos descritos en Sanghvi, Y.S., Capitulo 15, «Antisense Research and Applications», paginas 289-302, Crooke, S.T. y Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993. Algunos de estos 5 nucleotidos son especialmente utiles para aumentar la afinidad de union de los compuestos oligomericos de la memoria descriptiva. Estos comprenden pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, que comprenden 2-aminopropiladenina, 5- propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del duplex de acido nucleico en 0,6-1,2 °C. (Sanghvi, Y. S., en Crooke, S. T. y Lebleu, B., eds., «Antisense Research and Applications», CRC Press, Boca Raton, 1993, pag. 27610 278) y en la actualidad son las sustituciones de base preferidas, incluso mas en particular, cuando se combinan con modificaciones del azucar 2'-ometoxietilo.
[0157] Entre las patentes de Estados Unidos representativas en las que se muestra la preparacion de los nucleotidos modificados indicados anteriormente asf como otros nucleotidos modificados se encuentran, sin
15 limitaciones, en la patente de EE. UU. N.° 3 687 808, asf como en las 4 845 205, 5 130 302, 5 134 066, 5 175 273, 5 367 066, 5 432 272, 5 457 187, 5 459 255, 5 484 908, 5 502 177, 5 525 711, 5 552 540, 5 587 469, 5 596 091, 5 614 617, 5 750 692 y 5 681 941.
[0158] Otra modificacion de los oligonucleotidos de la memoria descriptiva implica unir qufmicamente al 20 oligonucleotido uno o mas restos o conjugados que potencian la actividad, la distribucion celular o la captacion
celular del oligonucleotido.
[0159] Entre estos restos se incluyen, sin limitaciones, restos de lfpidos como un resto de colesterol (Letsinger y col., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6553-6556), acido colico (Manoharan y col., (1994) Bioorg.
25 Med. Chem. Let. 4, 1053.1060), un tioeter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan y col. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci., 660, 306-309; Manoharan y col., (1993) Bioorg. Med. Chem. Let. 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser y col., (1992) Nucl. Acids Res., 20, 533-538), una cadena alifatica, por ejemplo, restos dodecandiol o undecilo (Kabanov y col., (1990) FEBS Lett., 259, 327-330; Svinarchuk y col., (1993) Biochimie 75, 49-54), un fosfolfpido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan y col., 30 (1995) Tetrahedron Lett., 36, 3651-3654; Shea y col., (1990) Nucl. Acids Res., 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Mancharan y col., (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14, 969-973) o acido acetico adamantano (Manoharan y col., (1995) Tetrahedron Lett., 36, 3651-3654), un resto palmitilo (Mishra y col., (1995) Biochim. Biophys. Acta, 1264, 229-237) o un resto octadecilamino o hexilamino-carbonil-t-oxicolesterol (Crooke y col., (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther., 277, 923-937).
35
[0160] Entre las patentes de Estados Unidos representativas en la que se muestra la preparacion de dichos
conjugados de oligonucleotidos se encuentran, sin limitaciones, las patentes de EE. UU. N.° 4 828 979, 4 948 882, 5 218 105, 5 525 465, 5 541 313, 5 545 730, 5 552 538, 5 578 717, 5 580 731, 5 580 731, 5 591 584, 5 109 124,

5 118 802, 5 138 045, 5 414 077, 5 486 603, 5 512 439, 5 578 718, 5 608 046, 4 587 044, 4 605 735, 4 667 025,

40 4 762 779, 4 789 737, 4 824 941, 4 835 263, 4 876 335, 4 904 582, 4 958 013, 5 082 830, 5 112 963, 5 214 136,

5 082 830, 5 112 963, 5 214 136, 5 245 022, 5 254 469, 5 258 506, 5 262 536, 5 272 250, 5 292 873, 5 317 098,

5 371 241, 5 391 723, 5 416 203, 5 451 463, 5 510 475, 5 512 667, 5 514 785, 5 565 552, 5 567 810, 5 574 142,
5 585 481, 5 587 371, 5 595 726, 5 597 696, 5 599 923, 5 599 928 y 5 688 941.
45 [0161] Descubrimiento de farmacos: los compuestos de la presente memoria descriptiva tambien pueden
aplicarse en los campos del descubrimiento de farmacos y de validacion de dianas. La presente memoria descriptiva abarca el uso de los compuestos y los segmentos diana preferidos identificados en este documento en el descubrimiento de farmaco se empenan en elucidar las relaciones que existen entre el polinucleotido del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y una enfermedad, fenotipo o afeccion. Estos procedimientos incluyen 50 detectar o modular los polinucleotidos del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) que comprende poner en contacto una muestra, tejido, celulas u organismos con los compuestos de la presente memoria descriptiva, midiendo el nivel de acido nucleico o protefnas de los polinucleotidos del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y/o fenotipos o criterios de valoracion qufmicos relacionados en algun momento tras el tratamiento y, opcionalmente, comparar el valor medido con una muestra no tratada o muestra tratada con un compuesto adicional 55 de la memoria descriptiva. Estos procedimientos tambien pueden realizarse en paralelo o en combinacion con otros experimentos para determinar la funcion de genes desconocidos para el proceso de validacion de dianas o determinar la validez de un producto genico en particular como una diana para el tratamiento o prevencion de una enfermedad, afeccion o fenotipo en particular.
Evaluation de la regulation por incremento o inhibition de la expresion genica:
[0162] La transferencia de un acido nucleico exogeno a una celula u organismo huesped puede evaluarse detectando directamente la presencia del acido nucleico en la celula u organismo. Dicha deteccion puede
5 conseguirse mediante varios procedimientos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la presencia del acido nucleico exogeno puede detectarse mediante transferencia de ADN o mediante una tecnica de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores que amplifica especfficamente secuencias de nucleotidos asociados con el acido nucleico. La expresion de los acidos nucleicos exogenos tambien puede medirse usando procedimientos convencionales incluyendo analisis de expresion genica. Por ejemplo, el ARNm producido a partir de un acido
10 nucleico exogeno puede detectarse y cuantificarse usando una transferencia de ARN y PCR de transcripcion inversa (RT-PCR).
[0163] La expresion del ARN a partir del acido nucleico exogeno puede tambien detectarse midiendo una actividad enzimatica o una actividad de protefna indicadora. Por ejemplo, la actividad moduladora antisentido puede
15 medirse indirectamente como una disminucion o aumento en la expresion del acido nucleico diana como una indicacion de que el acido nucleico exogeno produce el ARN efector. En funcion de la conversacion de secuencia, los cebadores pueden disenarse y utilizarse para amplificar las regiones codificadoras de los genes diana. Inicialmente, la region codificadora mas altamente expresada de cada gen puede utilizarse para construir un modelo de gen control, aunque puede utilizarse cualquier region codificadora o no codificadora. Cada gen control se
20 ensambla insertando cada region codificadora entre una region codificadora indicadora y su senal poli(A). Estos plasmidos podrfan producir un ARNm con un gen indicador en la porcion mas alla del extremo 5' del gen y una posible diana de ARNi en la region no codificadora 3'. La eficacia de los oligonucleotidos antisentido individuales deberfa comprobarse mediante la modulacion del gen indicador. Los genes indicadores utilizados en los procedimientos de la presente memoria descriptiva incluyen acetohidroxiacido sintetasa (AHAS), fosfatasa alcalina
25 (AP), beta galactosidasa (LacZ), beta glucoronidasa (GUS), cloranfenicol acetil transferasa (CAT), protefna fluorescente verde (GFP), protefna fluorescente roja (RFP), protefna fluorescente amarilla (YFP), protefna fluorescente cian (CFP), peroxidasa de rabano picante (HRP), luciferasa (Luc), nopalina sintetasa (NOS), octopina sintetasa (OCS) y derivados de las mismas. Hay disponibles marcadores seleccionables multiples que confieren resistencia a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato,
30 fosfinitricina, puromicina y tetraciclina. Los procedimientos para determinar la modulacion de un gen indicador son bien conocidos en la materia e incluyen, sin limitaciones, procedimientos fluorimetricos (p. ej., espectroscopia de fluorescencia, clasificacion de celulas activada por fluorescencia [FACS], microscopia de fluorescencia), determinacion de resistencia a antibioticos.
35 Kits, reactivos de investigation, diagnostico y tratamiento
[0164] Los compuestos de la presente memoria descriptiva pueden utilizarse para el diagnostico, tratamiento y profilaxis, y como reactivos de investigacion y compuestos de los kits. Adicionalmente, los expertos en la materia utilizan a menudo los oligonucleotidos antisentido, que son capaces de inhibir la expresion genica con excelente
40 especificidad, para elucidar la funcion de genes en particular o para distinguir entre las funciones de diversos miembros de una ruta biologica.
[0165] Para su uso en kits y diagnostico, y en diversos sistemas biologicos, los compuestos de la presente memoria descriptiva, bien solos o en combinacion con otros compuestos o tratamiento, son utiles como herramientas
45 en analisis diferenciales y/o combinatorios para elucidar los patrones de expresion de una porcion o el cumplimiento completo de los genes expresados en las celulas y tejidos.
[0166] Segun se usa en este documento el termino «sistema biologico» o «sistema» se define como cualquier organismo, celula, cultivo celular o tejido que expresa, o se hace competente para expresar productos de
50 los genes del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). Estos incluyen, sin limitaciones, humanos, animales transgenicos, celulas, cultivos celulares, tejidos, xenoinjetos, trasplantes y combinaciones de los mismos.
[0167] Como un ejemplo no limitante, los patrones de expresion en las celulas o tejidos tratados con uno o mas compuestos antisentido se comparan con celulas o tejidos control no tratados con compuestos antisentido y los
55 patrones producidos se analizan para niveles diferenciales de expresion genica ya que se corresponden, por ejemplo, con la asociacion con la enfermedad, vfas de senalizacion, localizacion celular, nivel de expresion, tamano, estructura o funcion de los genes examinados. Estos analisis pueden realizarse con celulas estimuladas o no estimuladas y en presencia o ausencia de otros compuestos que afecta a los patrones de expresion.
[0168] Entre los ejemplos de analisis de la expresion genica conocidos en la tecnica se incluyen matrices y
micromatrices de ADN (Brazma y Vilo, (2000) FEBS Lett., 480, 17-24; Celis, y col., (2000) FEBS Lett., 480, 2-16), SAGE (analisis seriado de la expresion genica) (Madden, y col., (2000) Drug Discov. Today, 5, 415-425), READS (amplificacion por enzimas de restriccion de ADNc digeridos) (Prashar y Weissman, (1999) Methods Enzymol., 303, 5 258-72), TOgA (analisis de la expresion genica total) (Sutcliffe, y col., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 197681), matrices proteicas y proteomicas (Celis, y col., (2000) FEBs Lett., 480, 2-16; Jungblut, y col., Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10), secuenciacion de etiquetas de secuencia expresadas (EST) (Celis, y col., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Larsson, y col., J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57), identificacion de ARN sustractivo (SuRF) (Fuchs, y col., (2000) Anal. Biochem. 286, 91-98; Larson, y col., (2000) Cytometry 41, 203-208), clonacion sustractiva, expresion 10 diferencial (DD) (Jurecic y Belmont, (2000) Curr. Opin. Microbiol. 3, 316-21), hibridacion genomica comparativa (Carulli, y col., (1998) J. Cell Biochem. Supl., 31, 286-96), tecnicas de FISH (hibridacion fluorescente in situ) (Going y Gusterson, (1999) Eur. J. Cancer, 35, 1895-904) y procedimientos de espectrometrfa de masas (To, Comb. (2000) Chem. High Throughput Screen, 3, 235-41).
15 [0169] Los compuestos de la memoria descriptiva son utiles para investigacion y diagnostico ya que estos
compuestos hibridan con acidos nucleicos que codifican el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGFA). Por ejemplo, los oligonucleotidos que hibridan con esta eficacia y en estas condiciones segun se describe en este documento que deben ser eficaces como moduladores eficaces del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), son cebadores o sondas eficaces en condiciones que favorecen la amplificacion o deteccion de genes, 20 respectivamente. Estos cebadores y sondas son utiles en procedimientos que requieren la deteccion especffica de las moleculas de acido nucleico que codifican el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y en la amplificacion de dichas moleculas de acido nucleico para la deteccion o el uso en estudios adicionales del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). La hibridacion de los oligonucleotidos antisentido, especialmente los cebadores y sondas, de la memoria descriptiva con un acido nucleico que codifica el factor de crecimiento del 25 endotelio vascular (VEGF) puede detectarse por medios conocidos en la tecnica. Dichos medios pueden incluir la conjugacion de una enzima con el oligonucleotido, el marcaje radiactivo del oligonucleotido o cualquier otro medio de deteccion adecuado. Tambien pueden prepararse kits que utilizan estos metodos de deteccion para detectar el nivel del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) en una muestra.
30 [0170] La especificidad y sensibilidad del antisentido tambien son aprovechadas por los expertos en la
materia para usos terapeuticos. Los oligonucleotidos antisentido se han empleado como restos terapeuticos en el tratamiento de enfermedades en animales, incluso en humanos. Los farmacos de oligonucleotidos antisentido se han administrado de forma segura y eficaz a humanos y actualmente estan en curso numerosos ensayos clfnicos. Por tanto, esta establecido que los compuestos antisentido pueden ser modalidades terapeuticas utiles que pueden 35 configurarse como de utilidad en regfmenes terapeuticos para el tratamiento de celulas, tejidos y animales, especialmente humanos.
[0171] En el caso de los medicamentos, un animal, preferiblemente un humano, sospechoso de tener una
enfermedad o trastorno que puede ser tratado modulando la expresion de los polinucleotidos del factor de 40 crecimiento del endotelio vascular (VEGF) se trata mediante la administracion de compuestos antisentido segun esta memoria descriptiva. Por ejemplo, en un caso no limitante, los procedimientos comprenden el paso de administrar al animal que necesita tratamiento, una cantidad terapeuticamente eficaz del modulador del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). Los moduladores del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) de la presente memoria descriptiva modulan de forma eficaz la actividad del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) o 45 modula la expresion de la protefna del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). En un caso, la actividad o expresion del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) en un animal se inhibe aproximadamente el 10% en comparacion con un control. Preferiblemente, la actividad o expresion del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) en un animal se inhibe aproximadamente el 30%. Mas preferiblemente, la actividad o expresion del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) en un animal se inhibe aproximadamente el 50% o mas. Por 50 tanto, los compuestos oligomericos modulan la expresion del ARNm del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) al menos el 10%, al menos el 50%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, al menos el 99% y al menos el 100% en comparacion con un control.
55 [0172] En un caso, la actividad o expresion del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y/o en un
animal se aumenta aproximadamente el 10% en comparacion con un control. Preferiblemente, la actividad o expresion del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) en un animal aumenta aproximadamente el 30%. Mas preferiblemente, la actividad o expresion del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) en un animal aumenta aproximadamente el 50% o mas. Por tanto, los compuestos oligomericos modulan la expresion del ARNm
del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) al menos el 10%, al menos el 50%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 100% en comparacion con un control.
5
[0173] Por ejemplo, la reduccion de la expresion del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) puede medirse en el suero, sangre, tejido adiposo, hfgado o cualquier otro lfquido corporal, tejido u organo del animal. Preferiblemente, las celulas contenidas en dichos lfquidos, tejidos u organos analizados contiene una molecula de acido nucleico que codifica peptidos del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y/o la
10 propia protefna del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF).
[0174] Los compuestos de la memoria descriptiva pueden utilizarse en composiciones farmaceuticas anadiendo una cantidad eficaz de un compuesto a un diluyente o vehfculo farmaceuticamente aceptable adecuado. El uso de los compuestos y procedimientos de la memoria descriptiva puede tambien ser util a nivel profilactico.
15
Conjugados
[0175] Otra modificacion de los oligonucleotidos de la memoria descriptiva implica unir qufmicamente al oligonucleotido uno o mas restos o conjugados que potencian la actividad, la distribucion celular o la captacion
20 celular del oligonucleotido. Estos restos o conjugados pueden incluir grupos conjugados unidos covalentemente a grupos funcionales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Los grupos conjugados de la memoria descriptiva incluyen intercaladores, moleculas indicadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, polieteres, grupos que potencian las propiedades farmacodinamicas del oligomero y grupos que potencian las propiedades farmacocineticas de los oligomeros. Entre los grupos conjugados tfpicos se incluyen colesteroles, lfpidos, 25 fosfolfpidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluorescefnas, rodaminas, coumarinas y colorantes. Los grupos que potencian las propiedades farmacodinamicas, en el contexto de esta memoria descriptiva, incluyen grupos que mejoran la captacion, potencian la resistencia a la degradacion y/o potencian la hibridacion especffica de secuencia con el acido nucleico diana. Los grupos que potencian las propiedades farmacocineticas, en el contexto de esta memoria descriptica, incluyen grupos que mejoran la captacion, distribucion, 30 metabolismo o excrecion de los compuestos de la actual memoria descriptiva. En la solicitud de patente internacional N.° PCT/US92/09196, presentada el 23 de octubre de 1992 y en la patente de EE. UU. N.° 6 287 860 se describen grupos conjugados representativos.
Entre los restos conjugados se incluyen, sin limitaciones, restos lipfdicos como un resto de colesterol, acido colico, un tioeter, por ejemplo, hexil-5-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifatica, por ejemplo, restos de dodecandiol o 35 undicilo, un fosfolfpido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o acido acetico adamantano, un resto palmitilo o una octadecilamina o un resto de hexilamino-carbonil-oxicolesterol. Los oligonucleotidos de la memoria descriptiva tambien pueden conjugarse con sustancias farmacologicas activas, por ejemplo, acido acetilsalicflico, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, ketoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, 40 acido 2,3,5-triyodobenzoico, acido flufenamico, acido folfnico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometicina, un barbiturato, una cefalosporina, un farmaco sulfa, un antidiabetico, un antibacteriano o un antibiotico.
[0176] Entre las patentes de Estados Unidos representativas en las que se muestra la preparacion de dichos
oligonucleotidos conjugados se incluyen, sin limitaciones, las patentes de EE. UU. N.° 4 828 979, 4 948 882, 45 5 218 105, 5 525 465, 5 541 313, 5 545 730, 5 552 538, 5 578 717, 5 580 731, 5 580 731, 5 591 584, 5 109 124,

5 118 802, 5 138 045, 5 414 077, 5 486 603, 5 512 439, 5 578 718, 5 608 046, 4 587 044, 4 605,735, 4 667 025,
4 762 779, 4 789 737, 4 824 941, 4 835 263, 4 876,335, 4 904 582, 4 958 013, 5 082 830, 5 112 963, 5 214 136,

5 082,830, 5 112 963, 5 214 136, 5 245 022, 5 254 469, 5 258 506, 5 262,536, 5 272 250, 5 292 873, 5 317 098,

5 371 241, 5 391 723; 5 416 203, 5 451 463; 5 510 475; 5 512 667; 5 514 785; 5 565 552; 5 567 810; 5 574 142;
50 5 585 481; 5 587 371; 5 595 726; 5 597 696; 5 599 923; 5 599 928 y 5 688 941.
Formulaciones
[0177] Los compuestos de la memoria descriptiva pueden tambien ser mezclados, encapsulados, conjugados
55 o asociados de cualquier otra forma con otras moleculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos, como por ejemplo, liposomas, moleculas dirigidas a receptores, formulaciones orales, rectales, topicas o de otro tipo, como ayuda en la captacion, distribucion y/o absorcion. Entre las patentes de Estados Unidos representativas en las que se muestra la preparacion de dichas formulaciones de ayuda a la captacion, distribucion y/o absorcion se incluyen, sin limitaciones, las patentes de EE. UU. N.° 5 108 921, 5 354 844, 5 416 016, 5 459 127, 5 521 291, 5 543 165,
5 547 932, 5 583 020, 5 591 721, 4 426 330, 4 534 899, 5 013 556, 5 108 921, 5 213 804, 5 227 170, 5 264 221, 5 356 633, 5 395 619, 5 416 016, 5 417 978, 5 462 854, 5 469 854, 5 512 295, 5 527 528, 5 534 259, 5 543 152, 5 556 948, 5 580 575 y 5 595 756.
5 [0178] Aunque no es necesario administrar los oligonucleotidos antisentido en el contexto de un vector para
modular la expresion y/o funcion de la diana, por el contrario la memoria descriptiva se refiere a construcciones del vector de expresion para la expresion de oligonucleotidos antisentido, que comprenden promotores, secuencias genicas promotoras hfbridas y poseen una fuerte actividad promotora constitutiva o una actividad promotora que puede inducirse en el caso deseado.
10
[0179] En un caso, la practica de la memoria descriptiva supone administrar al menos uno de los oligonucleotidos antisentido anteriores con un sistema de administracion de acidos nucleicos adecuado. En un caso, dicho sistema incluye un vector no vfrico unido de forma operativa al polinucleotido. Entre los ejemplos de dichos vectores no vfricos se incluyen el oligonucleotido solo (p. ej., una cualquiera o mas de las SEC ID N.° 4 a 9) o en
15 combinacion con una formulacion de protefna, polisacarido o lfpido adecuado.
[0180] Adicionalmente, entre los sistemas de administracion de acidos nucleicos adecuados se incluye el vector vfrico, tfpicamente, secuencia de al menos uno de entre un adenovirus, virus asociado con adenovirus (AAV), adenovirus dependiente de colaborador, retrovirus o virus hemaglutinante del complejo Japon-liposoma (HVJ).
20 Preferiblemente, el vector vfrico comprende un fuerte promotor eucariota unido de forma operativa al polinucleotido, por ejemplo, un promotor de citomegalovirus (CMV).
[0181] Entre los vectores adicionales preferidos se incluyen vectores vfricos, protefnas de fusion y conjugados qufmicos. Entre los vectores retrovirales se incluyen los virus de la leucemia murina de Moloney y los
25 virus derivados del VIH. Un vector vfrico derivado del VIH preferido comprende al menos dos vectores en los que los genes gag y pol proceden de un genoma de VIH y el gen env es de otro virus. Se prefieren vectores vfricos de ADN. Entre estos vectores se incluyen vectores de la viruela como vectores de ortopoxvirus o del virus de la viruela aviar, vectores del virus del herpes como un vector del virus del herpes simple I (VHS) [Geller, A.I. y col., (1995) J. Neurochem, 64: 487; Lim, F., y col., en DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press,
30 Oxford England) (1995); Geller, A.I. y col., (1993) Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A.:90 7603; Geller, A.I., y col., (1990) Proc Natl. Acad. Sci USA: 87:1149], vectores de adenovirus (LeGal LaSalle y col., Science, 259:988 (1993); Davidson, y col., (1993) Nat. Genet. 3: 219; Yang, y col., (1995) J. Virol. 69: 2004) y vectores de virus asociados a adenovirus (Kaplitt, M.G., y col., (1994) Nat. Genet. 8:148).
35 [0182] Los compuestos antisentido de la memoria descriptiva abarcan cualquier sal, ester o sal de dicho ester
farmaceuticamente aceptable, o cualquier otro compuesto que, tras la administracion a un animal, incluido un humano, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolismo biologicamente activo o un resto del mismo.
40 [0183] El termino «sales farmaceuticamente aceptables» se refiere a sales fisiologica y farmaceuticamente
aceptables de los compuestos de la memoria descriptiva, es decir, sales que retienen la actividad biologica deseada del compuesto parental y no imparten efectos toxicologicos no deseados para el mismo. Para los oligonucleotidos, los ejemplos preferidos de sales farmaceuticamente aceptables y sus usos se describen en detalle en la pat. de EE. UU. N.° 6 287 860.
45
[0184] La presente memoria descriptiva tambien incluye composiciones y formulaciones farmaceuticas que
incluyen los compuestos antisentido de la memoria descriptiva. Las composiciones farmaceuticas de la presente memoria descriptiva pueden administrarse de diversas formas dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistemico y sobre la zona a tratar. La administracion puede ser topica (incluyendo oftalmica, y a las membranas
50 mucosas incluyendo administracion vaginal y rectal), pulmonar, por ejemplo, mediante inhalacion o insuflacion de polvos o aerosoles, incluido mediante nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidermica y transdermica), oral o parenteral. La administracion parenteral incluye inyeccion o infusion intravenosa, intraarterial, subcutanea, intraperitoneal o intramuscular; o intracraneal, por ejemplo, administracion intratecal o intraventricular. Se considera que los oligonucleotidos con al menos una modificacion 2'-O-metoxietil son especialmente utiles para la
55 administracion oral. Las composiciones y formulaciones farmaceuticas para administracion topica pueden incluir parches transdermicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizadores, lfquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehfculos farmaceuticos convencionales, acuosos, polvos o bases oleosas, espesantes y similares. Tambien pueden ser utiles los profilacticos recubiertos, guantes y similares.
[0185] Las formulaciones farmaceuticas de la presente memoria descriptiva, que pueden presentarse convenientemente en una forma de unidad de dosificacion, pueden prepararse segun tecnicas convencionales bien conocidas en la industria farmaceutica. Dichas tecnicas incluyen la etapa de asociar los principios activos con los vehfculos o excipientes farmaceuticos. En general, las formulaciones se preparan asociando los principios activos
5 con vehfculos lfquidos o vehfculos solidos finamente divididos o con ambos, y a continuacion, si es necesario, dandole forma al producto.
[0186] Las composiciones de la presente memoria descriptiva pueden formularse en cualquiera de las muchas formas de dosificacion posibles como, entre otras, comprimidos, capsulas, capsulas de gel, jarabes lfquidos,
10 geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente memoria descriptiva tambien pueden formularse como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener adicionalmente sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension entre las que se incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sodica, sorbitol y/o dextrano. La suspension tambien puede contener estabilizantes.
15 [0187] Entre las composiciones farmaceuticas de la presente memoria descriptiva se incluyen, sin
limitaciones, soluciones, emulsiones, espumas y formulaciones que contienen liposomas. Las composiciones y formulaciones farmaceuticas de la presente memoria descriptiva pueden comprender uno o mas potenciadores de la penetracion, vehfculos, excipientes u otros principios activos o inactivos.
20 [0188] Las emulsiones tfpicamente son sistemas heterogeneos de un lfquido disperso en otro en forma de
microgotas normalmente con un diametro que excede de 0,1 pm. Las emulsiones pueden contener compuestos adicionales ademas de las fases dispersas, y el farmaco activo puede estar presente como solucion en la fase acuosa, en la fase oleosa o por sf mismo como una fase independiente. Las microemulsiones estan incluidas como caso de la presente memoria descriptiva. Las emulsiones y sus usos son bien conocidos en la tecnica y se describe 25 en detalle en la pat. de EE. UU. N.° 6 287 860.
[0189] Entre las formulaciones de la presente memoria descriptiva se incluyen formulaciones de liposomas. Segun se usa en la presente memoria descriptiva, el termino «liposoma» significa una vesfcula compuesta de lfpidos anfifflicos dispuestos en una bicapa o bicapas esfericas. Los liposomas son vesfculas unilamelares o multilamelares
30 que tienen una membrana formada a partir de material lipofilo y un interior acuoso que contiene la composicion que se va a administrar. Los liposomas cationicos son liposomas cargados positivamente que se considera interaccionan con moleculas de ADN cargadas negativamente para formar un complejo estable. Se considera que los liposomas que son sensibles al pH o estan cargados negativamente atrapan el aDn en lugar de formar complejos con este. Ambos liposomas cationicos y no cationicos se han utilizado para administrar ADN a las celulas.
35
[0190] Los liposomas tambien incluyen liposomas «estericamente estabilizados», un termino que, segun se usa en este documento, se refiere a liposomas que comprenden uno o mas lfpidos especializados. Cuando se incorporan a los liposomas, estos lfpidos especializados dan lugar a liposomas con una duracion en circulacion mejorada en relacion con los liposomas que carecen de dichos lfpidos especializados. Son ejemplos de liposomas
40 estericamente estabilizados aquellos en los que parte de la porcion de lfpidos que forman la vesfcula de los liposomas comprende uno o mas glucolfpiidos o sus derivados con uno o mas polfmeros hidrofilos, como un resto de polietilenglicol (PEG). Los liposomas y sus usos se describen adicionalmente en la pat. de EE. UU. N.° 6 287 860.
[0191] Las formulaciones y composiciones farmaceuticas de la presente memoria descriptiva tambien pueden 45 incluir tensioactivos. El uso de tensioactivos en productos farmaceuticos, formulaciones y emulsiones es bien
conocido en la tecnica. Los tensioactivos y sus usos se describen adicionalmente en la pat. de EE. UU. N.° 6 287 860.
[0192] En un caso, la presente memoria descriptiva emplea diversos potenciadores de penetracion que 50 actuan sobre la administracion eficaz de acidos nucleicos, especialmente oligonucleotidos. Ademas de ayudar a la
difusion de farmacos no lipofilos a traves de las membranas celulares, los potenciadores de penetracion ademas potencian la permeabilidad de farmacos lipofilos. Los potenciadores de penetracion pueden clasificarse como pertenecientes a uno de cinco categorfas amplias, a saber, tensioactivos, acidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes. Los potenciadores de penetracion y sus usos se describen 55 adicionalmente en la pat. de EE. UU. N.° 6 287 860.
[0193] Un experto en la materia reconocera que las formulaciones se disenan de forma rutinaria segun su uso pretendido, es decir, la via de administracion.
[0194] Entre las formulaciones preferidas para administracion topica se incluyen aquellas en las que los oligonucleotidos de la memoria descriptiva estan mezclados con un agente de administracion topica como lfpidos, liposomas, acidos grasos, esteres de acidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Entre los lfpidos y liposomas preferidos se incluyen neutros (p. ej., dioleolifosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoilfosfatidil colina
5 DMPC, diestearolifosfatidil colina), negativos (p. ej., dimiristoilfosfatidil glicerol DMPG) y cationicos (p. ej., dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP y dioleilfosfatidil etanolamina DOTMA).
[0195] Para la administracion topica o de otro tipo, los oligonucleotidos de la memoria descriptiva pueden estar encapsulados dentro de liposomas o pueden formar complejos con estos, en particular con liposomas
10 cationicos. Alternativamente, los oligonucleotidos pueden formar complejos con lfpidos, en particular con lfpidos cationicos. Los acidos grasos y esteres preferidos, sus sales farmaceuticamente aceptables y sus usos se describen en detalle en la pat. de EE. UU. N.° 6 287 860.
[0196] Las composiciones y formulaciones para administracion oral incluyen polvos o granulos, 15 micropartfculas, nanopartfculas, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, capsulas, capsulas de
gel, sobres, comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser deseables espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, ayudas a la dispersion o aglutinantes. Las formulaciones orales preferidas son aquellas en las que los oligonucleotidos de la memoria descriptiva se administran junto con uno o mas potenciadores de la penetracion, tensioactivos y quelantes. Entre los tensioactivos preferidos se incluyen acidos grasos y/o esteres o su sales, acidos 20 biliares y/o sus sales Los acidos biliares/sales y acidos grasos preferidos y sus usos se describen en detalle en la pat. de EE. UU. N.° 6 287 860.
[0197] Tambien se prefieren combinaciones de potenciadores de penetracion, por ejemplo, acidos grasos/sales en combinacion con acidos biliares/sales. Una combinacion especialmente preferida es la sal de sodio
25 del acido laurico, acido caprico y UDCA. Entre los potenciadores de penetracion adicionales se incluyen polioxietilen- 9-lauril eter, polioxietilen-20-cetil eter. Los oligonucleotidos de la memoria descriptiva pueden administrarse por via oral, en forma granular incluyendo partfculas secas pulverizables o en complejos para formar micro o nanopartfculas. Los agentes acomplejantes de oligonucleotidos y sus usos se describen adicionalmente en la pat. de EE. UU. N.° 6 287 860.
30
[0198] Las composiciones y formulaciones para administracion parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas esteriles que tambien pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados como, sin limitaciones, potenciadores de la penetracion, compuestos vehfculo y otros vehfculos o excipientes farmaceuticamente aceptables.
35
[0199] Determinados casos de la memoria descriptiva proporcionan composiciones farmaceuticas que contienen uno o mas compuestos oligomericos y uno o mas agentes quimioterapeuticos diferentes que funcionan mediante un mecanismo no antisentido. Entre los ejemplos de dichos agentes quimioterapeuticos se incluyen, sin limitaciones, farmacos quimioterapeuticos antineoplasicos como daunorrubicina, daunomicina, dactinomicina,
40 doxorrubicina, epiruhicina, idarrubicina, esorribucina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, citosina, arabinosido, biscloroctilo-nitrosurea, busulfan, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, motixantrona, amsacrina, clorambucilo, metilciclohexilnitrosurea, mostazas nitrogenadas, melfalan, ciclofosfamida, 6- mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiurea, deoxicoformicina, 4-hidroxiperoxiciclo- 45 fosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 5-fluorodeoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, taxol, vincristina, vinblastina, etoposido (VP-16), trimetrexato, irinotecan, topotecan, gemcitabina, teniposido, cisplatino y dietilestilbestrol (DES). Cuando se usan con los compuestos de la memoria descriptiva, dichos agentes quimioterapeuticos pueden utilizarse individualmente (p. ej., 5-FU y oligonucleotido), secuencialmente (p. ej., 5-FU y oligonucleotido durante un periodo de tiempo seguido de MTX y oligonucleotido) o en combinacion con uno o mas 50 agentes quimioterapeuticos distintos (p. ej., 5-FU, MTX y oligonucleotido, o 5-FU, radioterapia y oligonucleotidos). Tambien pueden combinarse en las composiciones de la memoria descriptiva farmacos antiinflamatorios incluidos, sin limitaciones, farmacos antiinflamatorios no esteroideos y corticoesteroides, y farmacos antivirales, incluido entre otros ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir. Las combinaciones de compuestos antisentido y otros farmacos no antisentido tambien estan dentro del alcance de esta memoria descriptiva. Pueden usar dos o mas compuestos 55 combinados juntos o de forma secuencial.
[0200] En otro caso relacionado, las composiciones de la memoria descriptiva pueden contener uno o mas compuestos antisentido, especialmente oligonucleotidos, dirigidos a un primer acido nucleico y uno o mas compuestos antisentido adicionales dirigidos a un segundo acido nucleico diana. Por ejemplo, la primera diana
puede ser una secuencia antisentido en particular del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y la segunda diana puede ser una region de otra secuencia de nucleotidos. Alternativamente, las composiciones de la memoria descriptiva pueden contener dos o mas compuestos antisentido dirigidos a regiones diferentes de la misma diana del acido nucleico del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). En este documento se ilustran 5 numerosos ejemplos de compuestos antisentido y pueden seleccionarse otros entre los compuestos adecuados conocidos en la tecnica. Pueden usarse dos o mas compuestos combinados juntos o de forma secuencial.
Dosificacidn:
10 [0201] La formulacion de composiciones terapeuticas y su posterior administracion (dosificacion) se
considera que esta dentro de las habilidades de los expertos en la materia. La dosificacion depende de la gravedad y sensibilidad de la enfermedad que se va a tratar, con un transcurso del tratamiento que dura de varios dfas a varios meses, o hasta que se produce la curacion o se consigue la disminucion de la enfermedad. Los calendarios de dosificacion optimos pueden calcularse a partir de las determinaciones de acumulo del farmaco en el organismo 15 del paciente. Los expertos en la materia pueden determinar con facilidad las dosis optimas, las metodologfas de dosificacion y la velocidad de repeticion. Las dosis optimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los oligonucleotidos individuales, y generalmente pueden estimarse en funcion de las CE50 que se encuentra son eficaces in vitro y en modelos animales in vivo. En general, las dosis son de 0,01 pg a 100 g por kg de peso corporal, y pueden administrarse una o mas veces al dfa, a la semana, al mes o al ano, o incluso una vez cada de 2 a 20 20 anos. Los expertos en la materia pueden estimar facilmente las velocidades de repeticion para la dosificacion en funcion de los tiempos de residencia medidos y de las concentraciones del farmaco en los lfquidos corporales o en los tejidos. Tras un tratamiento eficaz, puede ser deseable que el paciente se someta a tratamiento de mantenimiento para evitar la recafda de la enfermedad, donde se administra el oligonucleotido en dosis de mantenimiento, que oscilan de 0,01 pg a 100 g per kg de peso corporal, de una o mas veces al dfa, hasta una vez 25 cada 20 anos.
[0202] Aunque se han descrito anteriormente diversos casos de la presente memoria descriptiva, se entendera que se han presentado solo a modo de ejemplo y no como limitacion. Pueden hacerse numerosos cambios en los casos descritos segun esta memoria descriptiva sin apartarse del espfritu o alcance de dicha
30 memoria descriptiva. Por tanto, la amplitud y alcance de la presente memoria descriptiva no deberfan estar limitados por ninguno de los casos descritos anteriormente.
[0203] Mediante su citacion de diversas referencias en este documento, los solicitantes no admiten que ninguna referencia en particular sea «tecnica previa» a su invencion. En los ejemplos siguientes se ilustran
35 realizaciones de los compuestos y procedimientos de la invencion.
EJEMPLOS
[0204] Los siguientes ejemplos no limitantes sirven para ilustrar las realizaciones seleccionadas de la 40 invencion. Se apreciara que las variaciones mostradas en las proporciones y alternativas en los elementos de los
componentes seran aparentes para los expertos en la materia y estan dentro del alcance de los casos de la presente memoria descriptiva.
Ejemplo 1: Diseno de oligonucleotidos antisentido especfficos de una molecula antisentido de acido 45 nucleico y/o cadena sentido del polinucleotido del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF)
[0205] Segun se indico anteriormente el termino «oligonucleotido especffico para» u «oligonucleotido dirigido a» se refiere a un oligonucleotido que tiene una secuencia (i) capaz de formar un complejo estable con una porcion del gen al que se dirige o (ii) capaz de formar un duplex estable con una porcion de un transcrito de ARNm de gen
50 dirigido.
[0206] La seleccion de oligonucleotidos adecuados se facilita utilizando programas de ordenador que alinean automaticamente las secuencias de acidos nucleicos e indican las regiones de identidad u homologfa. Dichos programas se utilizan para comparar las secuencias de acidos nucleicos obtenidas, por ejemplo, buscando en bases
55 de datos como GenBank o mediante secuenciacion de los productos de PCR. La comparacion de secuencias de acido nucleico a partir de una gama de especies permite la seleccion de secuencias de acido nucleico que muestran un grado apropiado de identidad entre especies. En el caso de genes que no se hayan secuenciado, se realizan transferencias de ADN que permitan la determinacion del grado de identidad entre genes en la especie diana y en otras especies. Realizando transferencias de ADN con distintos grados de rigurosidad, como se conocen bien en la
tecnica, es posible obtener una medida de identidad aproximada. Estos procedimientos permiten la seleccion de oligonucleotidos que muestran un alto grado de complementariedad con secuencias de acido nucleico diana en un sujeto que se quiere controlar y un grado mas bajo de complementariedad con las correspondientes secuencias de acido nucleico en otras especies. Un experto en la materia entendera que existe una considerable flexibilidad en la 5 seleccion de las regiones apropiadas de genes para su uso en la presente invencion.
[0207] Un compuesto antisentido es «especfficamente hibridable» cuando la union del compuesto al acido nucleico diana interfiere con la funcion normal del acido nucleico diana para producir una modulacion de la funcion y/o actividad, y existe un grado suficiente de complementariedad para evitar la union no especffica del compuesto
10 antisentido a secuencias de acido nucleico no diana en condiciones en las que se desea la union especffica, es decir, en condiciones fisiologicas en el caso de los ensayos in vivo o tratamiento terapeutico y, en el caso de ensayos in vitro, en condiciones en las que se realizan los ensayos.
[0208] Las propiedades de hibridacion de los oligonucleotidos descritos en este documento pueden 15 determinarse mediante uno o mas ensayos in vitro segun es conocido en la tecnica. Por ejemplo, las propiedades de
los oligonucleotidos descritos en este documento pueden obtenerse mediante la determinacion de la fuerza de union entre las moleculas antisentido naturales diana y un farmaco potencial usando ensayos de curvas de fusion.
[0209] La fuerza de union entre el antisentido natural diana y una posible molecula de farmaco (Molecula) 20 puede estimarse usando cualquiera de los procedimientos establecidos de medicion de la fuerza de las
interacciones intermoleculares, por ejemplo, un ensayo de curva de fusion.
[0210] En el ensayo de curva de fusion se determina la temperatura a la que se produce una transicion rapida de conformacion de cadena doble a cadena sencilla del complejo antisentido natural/Molecula. Esta temperatura
25 esta ampliamente aceptada como medida fiable de la fuerza de interaccion entre las dos moleculas.
[0211] Un ensayo de curva de fusion puede realizarse usando una copia de ADNc de la molecula de ARN antisentido natural real o un nucleotido de ADN o ARN sintetico que se corresponda con el sitio de union de la Molecula. Hay disponibles multiples kit que contiene todos los reactivos necesarios para realizar este ensayo (p.ej.,
30 el kit MeltDoctor de Applied Biosystems Inc.). Estos kits incluyen una solucion tampon adecuada que contiene uno de los colorantes de union al ADN de cadena doble (ADNcd) (como los colorantes ABI HRM, SYBR Green, SYTO, etc.). Las propiedades de los colorantes de ADNcd son aquellos que practicamente no emiten fluorescencia en forma libre, pero son muy fluorescentes cuando se unen al ADNcd.
35 [0212] Para realizar el ensayo, el ADNc o un oligonucleotido correspondiente se mezclan con la Molecula en
concentraciones definidas por los protocolos del fabricante en particular. La mezcla se calienta a 95 °C para disociar todos los complejos de ADNcd previamente formados, a continuacion, se enfrfa lentamente hasta temperatura ambiente u a otra temperatura mas baja definida por el fabricante del kit que permita que hibriden las moleculas de ADN. A continuacion, los complejos recien formados se calientan lentamente a 95 °C con el registro continuo de 40 datos de forma simultanea sobre la cantidad de fluorescencia que produce la reaccion. La intensidad de fluorescencia es inversamente proporcional a las cantidades de ADNcd presentes en la reaccion. Los datos pueden recopilarse usando un aparato de PCR en tiempo real compatible con el kit (p. ej., sistema StepOne Plus Real Time PCR de ABI o el aparato LightTyper de Roche Diagnostics, Lewes, Reino Unido).
45 [0213] Los puntos de fusion se construyen representando la derivada negativa de la fluorescencia con
respecto a la temperatura (-d(fluorescencia)/dT) en el eje y frente a la temperatura (eje x) usando el software apropiado (por ejemplo, LightTyper (Roche) o SDS Dissociation Curve, ABI). Los datos se analizan para identificar la temperatura de la transicion rapida del complejo de ADNcd a moleculas de cadena sencilla. Esta temperatura se denomina Tf y es directamente proporcional a la fuerza de la interaccion entre las dos moleculas. Tfpicamente, la Tf 50 excedera de 40 °C.
Ejemplo 2: Modulacion de los polinucleotidos VEGF
[0214] Se cultivaron celulas HepG2 de la ATCC (n.° de cat.: HB-8065) en medio de cultivo (MEM/EBSS (n.°
55 de cat. de Hyclone: SH30024 o n.° de cat. de Mediatech: MT-10-010-CV) + SFT al 10% (n.° de cat. de Mediatech, : MT35- 011-Cv) + penicilina/estreptomicina (n.° de cat. de Mediatech: MT30-002-CI) a 37 °C y CO2 al 5% Un dfa antes del experimento las celulas se resembraron a una densidad de 1,5 x 105/ml en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37 °C y CO2 al 5%. El dfa del experimento se cambio el medio de las placas de 6 pocillos por medio de cultivo recien preparado. Todos los oligonucleotidos antisentido se diluyeron a la concentracion de 20 pM. Se
incubaron 2 pi de esta solucion con 400 pi de medio Opti-MEM (n.° de cat. de Gibco: 31985-070) y 4 pi de Lipofectamina 2000 (n.° de cat. de Invitrogen: 11668019) a temperature ambiente durante 20 min y se apiicaron a cada pociiio de las piacas de 6 pociiios con celulas HepG2. Se utilizo para ios controies de simulacion de transfeccion una mezcla similar que inclufa 2 pi de agua en iugar de la solucion de oligonucleotido. Despues de 3 a 5 18 h de incubacion a 37°C y CO2 ai 5% el medio se cambio por medio de cuitivo recien preparado. Cuarenta y ocho horas despues de la adicion de oligonucleotidos antisentido se eiiminaron ios medios y se extrajo el ARN de las celulas usando el sistema de aisiamiento de ARN total SV de Promega (n.° de cat.: Z3105) o el kit de aisiamiento de ARN total RNesay de Qiagen (n.° de cat.: 74181) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se anadieron 600 ng de ARN a la reaccion de transcripcion inversa reaiizada usando el kit de ADNc Verso de Thermo Scientific (n.° de cat.: 10 AB1453B) o el kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (n.° de cat.: 4368813) segun se describe en el protocoio del fabricante. El ADNc de esta reaccion de transcripcion inversa se uso para controiar la expresion genica mediante PCR en tiempo real usando Taqman Gene Expression Mix de aBi (n.° de cat.: 4369510) y ios cebadores/sondas disenadas por ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00173626_m1 de Applied Biosystems Inc., Foster City CA). Se utilizo el siguiente cicio de PCR: 2 min a 50 °C, 10 min a 95 °C, 40 15 cicios de (15 segundos a 95 °C, 1 min a 60 °C) utiiizando el equipo StepOne Pius Real Time PCR (Applied Biosystems).
[0215] El numero de veces de cambio en la expresion genica tras el tratamiento con oligonucleotidos se calculo en funcion de la diferencia de ios vaiores de dCT normaiizados para 18S entre las muestras tratadas y con
20 simulacion de transfeccion.
[0216] Los cebadores y la sonda para el ciiente fueron disenados para el ensayo de Taqman para el VEGF natural antisentido VEGFA (SEC ID N.° 10) (Figura 6).
25 Secuencia diana del exon 1 de VEGFA: ATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGCACC (SEC ID N.° 10)
Secuencia del cebador directo
[0217]
30
Vegfas1 ANYf: GTAGCCTGTCCCCTTCAAGAG (SEC ID N.° 11)
Vegfas2 ANYf: GCGGATAGCCTGGGAGCTA (SEC ID N.° 12)
Secuencia del cebador inverso 35
[0218]
Vegfas1 ANYR: CAGACATCCTGAGGTGTGTTCT (SEC ID N.° 13)
Vegfas2 ANYR: TGTTCGGTTGCTGTGACTGT (SEC ID N.° 14)
40
Coiorante indicador: FAM
[0219]
45 Vegfas1 ANYM1: ATGCCTGCCAAGCCCA (SEC ID N.° 15)
Vegfas2 ANYM1: CAGCCAGCCCTCTGC (SEC ID N.° 16)
Resuitados:
50 Regulacion por disminucion del ARN de VEGFAas
[0220] Los resuitados de la PCR en tiempo real muestran que ios niveies del ARNm de VEGFA en celulas HepG2 aumentan significativamente 48 h despues del tratamiento con uno de ios ARNip disenados frente a vegfass (vefaas1_2, P=0,05), y posibiemente con el segundo vefaas1_3 (P=0,1, fig. 1A). En las mismas muestras ios niveies
55 de ARN de vegfaas disminufan significativamente tras el tratamiento con vegfaas1_2 o vegfaas1_3, aunque permanecfa sin cambios tras el tratamiento con vefaas1_5, que tampoco tenia efecto sobre ios niveies de ARNm de VEGFA (fig. 1B).
Regulacion por disminucion del ARN de VEGRas

Claims (12)

1. Un oligonucleotido que tiene como diana un transcrito antisentido natural del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) para su uso como compuesto terapeutico, en el que el oligonucleotido modula la
5 expresion del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y en el que el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico mostrada en una de las SEC ID N.° 2 o 3.
2. Un oligonucleotido que tiene como diana un transcrito antisentido natural del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) para su uso en la prevencion o tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con
10 el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), en el que dicho oligonucleotido modula la expresion del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y en el que el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico mostrada en una de las SEC ID N.° 2 o 3.
3. Uso de un oligonucleotido que tiene como diana un transcrito antisentido natural del factor de 15 crecimiento del endotelio vascular (VEGF) para la produccion de un medicamento para la prevencion o tratamiento
de una enfermedad o trastorno asociado con el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), en el que dicho oligonucleotido modula la expresion del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y en el que el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico mostrada en una de las SEC ID N.° 2 o 3.
20 4. Uso segun la reivindicacion 3, o el oligonucleotidos para su uso segun la reivindicacion 2, en el que la
enfermedad o trastorno se selecciona a partir del grupo consistente en las enfermedades que se caracterizan por proliferacion excesiva de las celulas del endotelio vascular; enfermedades cardiovasculares que son el resultado de una insuficiencia cardiovascular (p. ej., artropatfa coronaria, insuficiencia cardfaca congestiva e insuficiencia venosa periferica); afecciones que se caracterizan o estan causadas por angiogenesis anomala o excesiva incluido, sin 25 limitaciones, el cancer (p. ej., activacion de oncogenes, perdida de supresores tumorales); enfermedades infecciosas (p. ej., patogenos que expresan genes angiogenicos, intensificacion de los programas angiogenicos); enfermedades autoinmunitarias (p. ej., activacion de mastocitos y otros leucocitos), incluyendo artritis reumatoide; malformaciones vasculares (p. ej., mutacion DE Tie-2); sfndrome de DiGeorge (p. ej., baja expresion de VEGF y neuropilina-1); HHT (p. ej., mutaciones de endoglina o LK-1), hemangioma cavernoso (p. ej., perdida de Cx37 y Cx40); aterosclerosis; 30 arteriopatfa por trasplante; obesidad (p. ej., angiogenesis inducida por dieta rica en grasas, perdida de peso por inhibidores de la angiogenesis); psoriasis, verrugas; dermatitis alergica; cicatrices queloides; granulomas pirogenicos; enfermedad ampollosa; sarcoma de Kaposi en pacientes de SIDA; sfndrome vftreo hiperplasico persistente (p. ej., perdida de Ang-2 o VEGF164); enfermedad renal poliqufstica autosomica dominante (ADPKD); retinopatfa diabetica; retinopatfa del prematuro; degeneracion macular relacionada con la edad; neovascularizacion 35 coroidal (p. ej., mutacion de TIMP-3); hipertension pulmonar primaria (p. ej., mutacion de BMPR-2 de la lfnea germinal, mutacion de EC primaria); asma; polipos nasales; enfermedad intestinal inflamatoria; lesion nerviosa; lesion cerebral o enfermedades neurodegenerativas (p. ej., enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson; esclerosis lateral amiotrofica, etc.); enfermedad periodontal; ascitis; adherencias peritoneales, endometriosis; hemorragia uterina; quistes ovaricos; hiperestimulacion ovarica; artritis; sinovitis; osteomielitis; y/o formacion 40 osteofita; ulceracion; verruga vulgar; angiofibroma de esclerosis tuberosa; hemangioma plano; sfndrome de Sturge Weber; sfndrome de Kippel-Trenaunay-Weber; sfndrome de Osler-Weber-Rendu y cualquier otra enfermedad o afeccion que este relacionada con los niveles de VEGF-R en una celula o tejido.
5. Un procedimiento in vitro para modular la expresion del factor de crecimiento del endotelio vascular
45 (VEGF) en celulas o tejidos de un paciente que comprende: poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido que tiene como diana un transcrito antisentido natural del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF); modulando de este modo la expresion del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), en el que el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico mostrada en una de las SEC ID N.° 2 o 3.
50 6. Un oligonucleotido que tiene como diana un transcrito antisentido natural del factor de crecimiento del
endotelio vascular (VEGF), en el que el oligonucleotido modula la expresion del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y en el que el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico mostrada en una de las SEC ID N.° 2 o 3.
55 7. Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, o el oligonucleotido para su uso segun una
cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4, o un procedimiento in vitro segun la reivindicacion 5, o un oligonucleotido
segun la reivindicacion 6, en el que el oligonucleotido tiene una longitud entre 10 y 30 nucleotidos.
8. Uso segun una cualquiera de la reivindicaciones 3, 4 o 7, o el oligonucleotido para su uso segun una
5
10
15
20
25
30
35
40
45
cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 7, o un procedimiento in vitro segun la reivindicacion 5 o la reivindicacion 7, o un oligonucleotido segun la reivindicacion 6 o la reivindicacion 7, en el que el oligonucleotido tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a un complemento de un transcrito antisentido natural del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF).
9. Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 7 u 8, o el oligonucleotido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 7 u 8, o un procedimiento in vitro segun una cualquiera de las reivindicaciones 5, 7 u 8, o un oligonucleotido segun una cualquiera de la reivindicaciones 6 a 8, en el que el oligonucleotido es de cadena sencilla.
10. Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 7 u 8, o el oligonucleotido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 7 u 8, o un procedimiento in vitro segun una cualquiera de las reivindicaciones 5, 7 u 8, o un oligonucleotido segun una cualquiera de la reivindicaciones 6 a 8, en el que el oligonucleotido es un compuesto ARNip.
11. Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 7 a 10, o el oligonucleotido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 7 a 10, o un procedimiento in vitro segun una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7 a 10, o un oligonucleotido segun una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en el que el oligonucleotido comprende una de las SEC ID N.° 4 a 9.
12. Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 7 a 11, o el oligonucleotido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 7 a 11, o un procedimiento in vitro segun una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7 a 11, o un oligonucleotido segun una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, en el que el oligonucleotido aumenta la expresion del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF)
13. Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 7 a 12, o el oligonucleotido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 7 a 12, o un procedimiento in vitro segun una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7 a 12, o un oligonucleotido segun una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, en el que la expresion del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) aumenta al menos el 10%.
14. Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 7 a 13, o el oligonucleotido para su uso segun
una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 7 a 13 o un procedimiento in vitro segun una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7 a 13, o un oligonucleotido segun una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, en el que el oligonucleotido ademas comprende una o mas modificaciones que comprende:
a. un enlace entre nucleosidos modificado que comprende un fosforotioato, 2'-O-metoxietilo (MOE), 2'-fluoro, alquilfosfonato, fosforoditioato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, triester de fosfato, acetamidato, ester de carboximetilo y/o combinaciones de los mismos;
b. al menos un nucleotido modificado que comprende moleculas de acido nucleico bloqueado (LNA), acido arabino-nucleico, acidos nucleicos peptfdicos (PNA), analogos o derivados de los mismos, o
c. un resto de azucar modificado que comprende un resto de azucar modificado con 2'-O-metoxietilo, un resto de azucar modificado con 2'-metoxi, un resto de azucar modificado con 2'-O-alquilo o un resto de azucar bicfclico.
15. Una composicion farmaceutica que comprende al menos un oligonucleotido segun una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14 y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
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