CN108339154A - 一种诱导颅脑损伤组织再生的功能生物材料及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导颅脑损伤组织再生的功能生物材料及其应用。本发明保护一种用于诱导颅脑损伤组织再生的功能材料的制备方法，包括如下步骤：将带有胶原结合区的血管内皮生长因子与胶原凝胶混合，得到所述功能材料。所述带有胶原结合区的血管内皮生长因子与胶原凝胶的配比关系为：0.5nmol∶190μL。本发明通过对VEGF进行基因改造，使其能够特异结合胶原，然后加载在胶原支架材料上，形成一个可实现VEGF长期有效释放的功能修复系统，从而有效促进脑损伤的修复。

Description

一种诱导颅脑损伤组织再生的功能生物材料及其应用

技术领域

本发明涉及一种诱导颅脑损伤组织再生的功能生物材料及其应用。

背景技术

创伤性脑损伤(Traumatic brain iniury，TBI)，会造成大脑结构性损伤，是致死和致残的重要原因，尤其在儿童和青壮年人群中。世界上每年因TBI致死的人数约在7.5-10万人，而TBI幸存者中大约又有7万-9万人遭受长期或终身残疾。目前临床上几乎没有有效的治疗方法能阻止TBI后的神经损伤或者有效促进神经组织再生的方法。

脑损伤后，生物材料可为损伤组织的修复提供一种支架，引导细胞的迁移。但单独使用生物材料往往没有活性诱导功能，治疗效果欠佳。

另一方面，血管的生成是TBI后促进结构和功能恢复的关键因素之一，血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种分泌型有丝分裂原，是调控血管生成，血管渗透性和内皮细胞增殖的关键因子。虽然TBI会导致损伤部位周围VEGF表达的上调，但是这种内源性VEGF的表达量和持续时间都无法有效促进再生。因此外源VEGF的补充是非常必要的。而外源性VEGF的应用中的主要问题是可溶性VEGF短暂的半衰期及向脑脊液的快速扩散。这些问题导致脑中VEGF难以在损伤局部保持有效浓度。

发明内容

本发明的目的是提供一种诱导颅脑损伤组织再生的功能生物材料及其应用。

本发明提供一种用于诱导颅脑损伤组织再生的功能材料的制备方法，包括如下步骤：将带有胶原结合区的血管内皮生长因子与胶原凝胶混合，得到所述功能材料。

所述带有胶原结合区的血管内皮生长因子与胶原凝胶的配比关系为：0.5nmol：190uL。

所述带有胶原结合区的血管内皮生长因子包括CBD区段和VEGF区段。

所述CBD区段如序列表的序列2自N端第178-184位氨基酸残基所示。

所述VEGF区段序列如序列表的序列2自N端第1-166位氨基酸残基所示。

所述带有胶原结合区的血管内皮生长因子的氨基酸序列为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列2第1-184位；

(a2)序列表的序列2。

所述带有胶原结合区的血管内皮生长因子的制备方法包括如下步骤(b1)和(b2)：

(b1)将带有胶原结合区的血管内皮生长因子的编码基因导入出发菌，得到重组菌；

(b2)培养步骤(b1)得到的重组菌，得到所述带有胶原结合区的血管内皮生长因子。

所述带有胶原结合区的血管内皮生长因子的编码基因为如下(c1)或(c2)：

(c1)序列表中序列1第1-552位核苷酸所示的DNA分子；

(c2)序列表的序列1所示的DNA分子。

所述带有胶原结合区的血管内皮生长因子的编码基因可通过含有所述编码基因的重组表达载体导入宿主菌得到重组菌。

可用现有的表达载体构建含有所述编码基因的重组表达载体。使用所述编码基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子；此外，使用所述编码基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

所述重组表达载体具体可为在pET-28a(+)载体的多克隆位点插入序列表的序列1第1-552位所示的DNA分子得到的重组表达载体。

所述重组表达载体具体可为将pET-28a(+)载体的XbaI和XhoI酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列1第1-552位所示的DNA分子得到的重组表达载体。

所述出发菌具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。

所述步骤(b2)中，所述培养的条件具体可为37℃、250rpm振荡培养。

所述步骤(b2)中，所述培养采用的培养基具体可为LB液体培养基或含有抗生素的LB液体培养基，更具体可为含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基。

所述步骤(b2)中，在培养过程中加入IPTG进行诱导的步骤。IPTG在培养体系中的浓度可为1mM。IPTG的加入时间可为培养体系的OD_600nm＝0.8-1.0时。从加入IPTG开始计时，培养时间可为5小时。

所述带有胶原结合区的血管内皮生长因子的制备方法还包括如下步骤：

(b3)完成步骤(b2)后，收集菌体，进行菌体破碎，然后收集沉淀；

(b4)取步骤(b3)得到的沉淀，进行蛋白复性，然后收集液相；

(b5)取步骤(b4)得到的液相，从中分离带有胶原结合区的血管内皮生长因子。

所述步骤(b3)中，所述菌体破碎的方法可为超声破碎。所述超声破碎的参数具体可为：100W，总时间15min，单次超声时间5s，单次间隔时间5s。所述步骤(b3)中，所述收集沉淀的方法具体可为：13000g离心30min，收集沉淀。

所述步骤(b4)中，进行蛋白复性的方法可为：以氧化还原体系进行蛋白复性。所述步骤(b4)中，进行蛋白复性的方法具体可为：将沉淀溶解于含有8M尿素的Tris缓冲液中72小时。所述步骤(b4)中，收集液相的方法具体可为：过滤收集滤液所述过滤采用的滤膜孔径具体可为0.22μm。

所述带有胶原结合区的血管内皮生长因子的氨基酸序列如序列表的序列2所示时，所述步骤(b5)中，通过镍柱亲和层析从液相中分离带有胶原结合区的血管内皮生长因子。

所述带有胶原结合区的血管内皮生长因子的制备方法还包括如下步骤：

(b6)将步骤(b5)得到的有胶原结合区的血管内皮生长因子进行脱盐处理。

所述胶原凝胶材料的制备方法包括如下步骤(d1)-(d6)：

(d1)取离体的动物肌腱组织，去除脂肪和肌肉；

(d2)将步骤(d1)处理后的组织置于NaCl水溶液中处理；

(d3)将步骤(d2)处理后的组织使用DNaseI处理；

(d4)将步骤(d3)处理后的组织置于KOH水溶液中处理；

(d5)将步骤(d4)处理后的组织置于乙酸水溶液中溶解处理后离心取上清；

(d6)取步骤(d5)得到的上清，在去离子水中透析至中性，得到胶原凝胶。

所述动物具体可为牛。

所述胶原凝胶材料的制备方法包括如下步骤(e1)-(e6)：

(e1)取离体的动物肌腱组织，去除脂肪和肌肉；

(e2)将步骤(e1)处理后的组织置于NaCl水溶液中处理，然后用去离子水清洗；

(e3)将步骤(e2)处理后的组织使用DNaseI处理，然后用去离子水清洗；

(e4)将步骤(e3)处理后的组织置于KOH水溶液中处理，然后用去离子水清洗；

(e5)将步骤(e4)处理后的组织置于乙酸水溶液中溶解处理后离心取上清；

(e6)取步骤(e5)得到的上清，在去离子水中透析至中性，得到胶原凝胶。

所述动物具体可为牛。

步骤(d2)或(e2)中，所述NaCl水溶液具体可为1M的NaCl水溶液。

步骤(d2)或(e2)中，所述处理时间具体可为24h。

步骤(d3)或(e3)中，所述DNaseI具体可为含有50U/ml DNaseI的PBS缓冲液。

步骤(d3)或(e3)中，所述处理时间具体可为3h。

步骤(d4)或(e4)中，所述KOH水溶液具体可为1M的KOH水溶液。

步骤(d4)或(e4)中，所述处理时间具体可为20min。

步骤(d5)或(e5)中，所述乙酸水溶液具体可为0.5M的乙酸水溶液。

步骤(d5)或(e5)中，所述处理时间具体可为48h。

步骤(d5)或(e5)中，所述离心具体可为12000g离心20分钟。

步骤(e2)中，所述用去离子水清洗具体可为去离子水清洗5次，每次3小时。

步骤(e3)中，所述用去离子水清洗具体可为去离子水清洗5次，每次3小时。

步骤(e4)中，所述用去离子水清洗具体可为去离子水清洗10次，每次30min。

本发明还保护以上任一所述的方法制备得到的用于诱导颅脑损伤组织再生的功能材料。

本发明还保护所述用于诱导颅脑损伤组织再生的功能材料的应用，为如下(f1)-(f6)中的至少一种：

(f1)制备诱导颅脑损伤组织再生的材料；

(f2)制备用于脑损伤修复的材料；

(f3)制备用于促进脑损伤区代谢活力的材料；

(f4)制备用于促进脑损伤区血管生成的材料；

(f5)制备用于脑损伤后神经功能修复的材料；

(f6)制备用于提升脑损伤后脑血流的材料。

所述脑损伤具体可为创伤性脑损伤。

本发明提供了一种可以同时起到支持作用和诱导作用的功能生物材料，通过对VEGF进行基因改造，使其能够特异结合胶原，然后加载在胶原支架材料上，形成一个可实现VEGF长期有效释放的功能修复系统，从而有效促进脑损伤的修复。

附图说明

图1为胶原凝胶材料的扫描电子显微镜照片。

图2为VEGF的体内扩散分析结果。

图3为mNSS评分统计结果。

图4为各组大鼠脑代谢和血管生成的PET影像。

图5为各组大鼠代谢活性和血管生成的统计分析结果。

图6为脑部血液动力学成像结果。

图7为脑部血液动力学统计分析结果。

图8为免疫组化切片照片。

图9为免疫组化统计分析结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pET-28a(+)载体：EMD Biosciences(Novagen)公司。

大肠杆菌BL21(DE3)：天根生化科技(北京)有限公司。

Na¹²⁵I：盖德化工，货号：24359-64-6。Na¹²⁵I使用时采用PBS缓冲液溶解配制成Na¹²⁵I溶液使用。

SD大鼠：维通利华公司。

小动物正电子发射型断层成像设备：西门子公司。

⁶⁸Ga-PRGD2注射液：北京协和医院核医学科。

¹⁸F-FDG注射液：北京协和医院核医学科。

^99mTc-ECD注射液：北京协和医院核医学科。

VEGF抗体：Sigma公司。

vWF抗体：Sigma公司。

CD61抗体：BD Pharmingen^TM。

NeuN抗体：Abcam公司。

Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析填料、PD-10柱、HiTrap Desalting脱盐柱：GE Pharmacia公司。

实施例1、胶原凝胶的制备

1、取离体的去除脂肪和肌肉的牛肌腱组织。

2、取步骤1得到的组织，依次按照如下步骤处理：

(1)置于1M NaCl水溶液中浸泡24小时，然后用去离子水清洗5次，每次3小时。

(2)置于含有50U/ml DNaseI的PBS缓冲液中浸泡3小时，然后用去离子水清洗5次，每次3小时。

(3)置于1M KOH水溶液中浸泡20分钟，然后用去离子水清洗10次，每次30分钟。

(4)置于0.5M乙酸水溶液中溶解处理48小时，12000g离心20分钟去除沉淀，取上清。

(5)将上清利用透析袋透析，外液为去离子水，透析至中性，得到胶原凝胶。

胶原凝胶的扫描电子显微镜照片如图1所示。扫描电镜显示的胶原凝胶材料孔径在200-500微米，适合新生血管的长入，并且由于多孔带来的表面积的增加更利于生长因子的吸附。

实施例2、生长因子制备

1、将pET-28a(+)载体的XbaI和XhoI酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列1第1-552位所示的DNA分子，得到重组质粒pET28a-CBD-VEGF。外源插入的DNA分子与载体骨架上的部分核苷酸融合，形成序列表的序列1所示的融合基因，编码序列表的序列2所示的融合蛋白。

序列表的序列2中，自N端第1-166位氨基酸残基为VEGF区段，第178-184位氨基酸残基为CBD区段，第187-192位氨基酸残基为组氨酸标签。

序列表的序列1中，自5’端第1-498位核苷酸为VEGF区段的编码基因，第532-552位核苷酸为CBD区段的编码基因，第559-576位核苷酸为组氨酸标签的编码序列。

2、将pET-28a(+)载体的XbaI和XhoI酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列3第1-498位所示的DNA分子，得到重组质粒pET28a-NAT-VEGF。外源插入的DNA分子与载体骨架上的部分核苷酸融合，形成序列表的序列3所示的融合基因，编码序列表的序列4所示的融合蛋白。

序列表的序列4中，自N端第1-166位氨基酸残基为VEGF区段，第169-174位氨基酸残基为组氨酸标签。

序列表的序列3中，自5’端第1-498位核苷酸为VEGF区段的编码基因，第504-522位核苷酸为组氨酸标签的编码序列。

3、取步骤1得到的重组质粒pET28a-CBD-VEGF，依次按照如下步骤操作：

(1)将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆，接种至200ml LB液体培养基(卡纳抗性：50μg/ml)中，37℃，250rpm，培养16小时，得到菌液。

(2)将4ml菌液转接至200m1LB液体培养基(卡纳抗性：50μg/ml)中，37℃，250rpm培养，至菌液OD_600nm＝0.8-1.0时，向菌液中加入终浓度1mM的IPTG，37℃，250rpm诱导5小时，诱导结束后8000rpm离心收集菌体。

(3)将收集的菌体用20ml PBS(含0.5MNaCl)溶解，超声处理(100W，总时间15min，单次超声时间5s，单次间隔时间5s)，然后13000g离心30min，弃掉上清收集沉淀。

(4)将收集的沉淀溶解于含有8M尿素的Tris缓冲液中，以氧化还原体系进行蛋白复性，至72小时结束复性。

(5)复性后的蛋白溶液0.22μm滤膜过滤后，依次按照如下步骤操作，经过镍柱亲和层析和脱盐柱去盐后，得到CBD-VEGF蛋白溶液。

①将复性后的蛋白溶液不断加入至加载有Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析填料的PD-10柱中，使杂蛋白流穿；

②用10倍柱体积的含有50mM咪唑和0.5M NaCl的PBS缓冲液洗柱，洗涤掉未结合的蛋白；

③用3倍柱体积的含有300mM咪唑和0.5M NaCl的PBS缓冲液洗柱，收集流出液(即为目的蛋白)。

④将流出液(目的蛋白)加至加载有Sephadex G-25S填料的HiTrap Desalting脱盐柱中，使杂质流穿；

⑤用1.5倍柱体积的PBS缓冲液(pH7.4)洗柱，在1/3柱体积出峰收集洗脱液(即脱盐纯化后的CBD-VEGF蛋白溶液)。

4、采用重组质粒pET28a-NAT-VEGF替代重组质粒pET28a-CBD-VEGF，按照步骤3进行操作，得到NAT-VEGF蛋白溶液。

5、将50μL CBD-VEGF蛋白溶液(蛋白含量为7.5nmol)与100μLNa¹²⁵I溶液(放射性活度为3mCi)混合，在室温下孵育10分钟，得到Na¹²⁵I标记的CBD-VEGF蛋白溶液。

6、将50μLNAT-VEGF蛋白溶液(蛋白含量为7.5nmol)与100μLNa¹²⁵I溶液(放射性活度为3mCi)混合，在室温下孵育10分钟，得到Na¹²⁵I标记的NAT-VEGF蛋白溶液。

7、将50μL CBD-VEGF蛋白溶液(蛋白含量为7.5nmol)与100μL PBS缓冲液混合，得到未标记的CBD-VEGF蛋白溶液。

8、将50μL NAT-VEGF蛋白溶液(蛋白含量为7.5nmol)与100μL PBS缓冲液混合，得到未标记的NAT-VEGF蛋白溶液。

实施例3、胶原凝胶修复材料的制备

制备如下胶原凝胶修复材料：

1、¹²⁵I-NAT-VEGF胶原凝胶修复材料：将10μL实施例二制备的Na¹²⁵I标记的NAT-VEGF蛋白溶液(蛋白含量为0.5nmol)与190μL实施例一制备的胶原凝胶混合。

2、¹²⁵I-CBD-VEGF胶原凝胶修复材料：将10μL实施例二制备的Na¹²⁵I标记的CBD-VEGF蛋白溶液(蛋白含量为0.5nmol)与190μL实施例一制备的胶原凝胶混合。

3、NAT-VEGF胶原凝胶修复材料：将10μL实施例二制备的未标记的NAT-VEGF蛋白溶液(蛋白含量为0.5nmol)与190μL实施例一制备的胶原凝胶混合。

4、CBD-VEGF胶原凝胶修复材料：将10μL实施例二制备的未标记的CBD-VEGF蛋白溶液(蛋白含量为0.5nmol)与190μL实施例一制备的胶原凝胶混合。

实施例4、功能生物材料的应用

一、动物模型的制作

实验动物为：成年SD大鼠(230g-250g，雄性)。

1、将实验动物用10％水合氯醛麻醉后暴露头骨，使用直径5mm的气动活塞以4m/s的速率撞击右额顶皮层，制作损伤后将伤口缝合，得到TBI大鼠模型。

2、完成步骤1后肌肉注射青霉素和止痛药3天，第7天时将大鼠麻醉，重新打开缝合的切口，暴露颅骨缺损部位的硬脊膜，并小心切除，将大鼠随机分为6组(每组6只)，分别移植如下功能生物材料：

实验组1：200μL实施例3制备的¹²⁵I-NAT-VEGF胶原凝胶修复材料；

实验组2：200μL实施例3制备的¹²⁵I-CBD-VEGF胶原凝胶修复材料；

实验组3：200μL实施例3制备的NAT-VEGF胶原凝胶修复材料；

实验组4：200μL实施例3制备的CBD-VEGF胶原凝胶修复材料；

实验组5：10μL实施例2步骤5制备的Na¹²⁵I标记的NAT-VEGF蛋白溶液；

对照组：40μL PBS缓冲液。

完成上述操作后用骨蜡封闭大鼠颅脑空洞，然后将伤口缝合。

二、VEGF的体内扩散情况分析

步骤一实验组1、实验组2和实验组5的大鼠在移植结束后第3小时、24小时、14天、28天进行单光子发射计算机断层成像术(Single-Photon Emission ComputedTomography，SPECT)检测。结果如图2所示。结果显示，移植24小时后，实验组1大鼠放射活性急剧下降，而实验组2大鼠随着时间的推移放射性的下降则比较平缓。14天和28天后，实验组2大鼠损伤部位的放射活性明显比全身高，其差异明显大于实验组1。说明带有CBD的生长因子可以更好的维持在损伤部位。

三、神经功能分析

步骤一实验组3、实验组4和对照组的大鼠在移植结束后第1、7、14、21、28天利用改良大鼠神经功能缺损评分(modified neurological severity score，mNSS)测试脑损伤后神经功能(包括感觉和运动神经)预后。mNSS评分越高，神经功能越差。移植1、7、14、21、28天分别进行双盲测试。方法参照文献：Schallert T，Kozlowski DA，Humm JL，et al.Use-dependent structural events in recovery of function.[J].Advances inNeurology，1997，73：229-38.。结果如图3所示。结果显示移植14、21和28天后，实验组4大鼠比实验组3大鼠和对照组大鼠有明显的神经功能恢复。

四、血管生成和脑代谢PET分析

利用正电子发射型断层成像(positron emission tomography，PET)分析血管生成和脑代谢的情况，具体方法为：将步骤一实验组3、实验组4和对照组的大鼠在移植结束第28天通过尾静脉注射50μL⁶⁸Ga-PRGD2溶液(放射性活度为350μCi)，注射一小时后，使用高分辨率的小动物正电子发射型断层成像设备扫描收集数据。⁶⁸Ga-PRGD2注射一天后通过尾静脉注射80μL¹⁸F-FDG溶液(放射性活度为0.5mCi)，注射一小时后，使用高分辨率的小动物正电子发射型断层成像设备扫描收集数据。

将两个图像进行合并处理分析血管生成与脑代谢情况。

结果如图4所示。结果表明，所有动物在移植结束第28天，损伤区脑代谢活性均有下降(图4A-C)。对照组¹⁸F-FDG摄入下降，⁶⁸Ga-PRGD2几乎没有摄入(图4D)，表明其脑代谢活力低，血管生成差。实验组4脑代谢的不对称性表现最不明显，但⁶⁸Ga-PRGD2在损伤区部位有摄入(图4F)，表明该组动物损伤区脑代谢活性与正常侧脑代谢活性差别小，有血管生成，且脑代谢活性下降区，即脑损伤部位(¹⁸F-FDG的摄入减少)与血管新生成区(⁶⁸Ga-PRGD2的摄入)高度吻合(图4C、4F、4I)。

统计结果如图5所示。图5A中，纵坐标为损伤侧与未损伤侧脑代谢比(损伤侧¹⁸F-FDG摄入/未损伤侧¹⁸F-FDG摄入)，图5B中，纵坐标为损伤侧与未损伤侧新生血管比(损伤侧⁶⁸Ga-PRGD2摄入/未损伤侧⁶⁸Ga-PRGD2摄入)。

经过统计实验组4动物脑损伤区的代谢活力显著高于实验组3(P＜0.01，n＝6)和对照组(P＜0.01，n＝6)(图5A)。同样，实验组4动物脑损伤区也显示最活跃的血管生成(P＜0.01，n＝6)(图5B)。

五、脑部血液动力学分析

单光子发射计算机断层成像术(Single-Photon Emission ComputedTomography，SPECT)是一种既快速又准确的评估大脑血液动力学状况的方法。

将步骤一实验组3、实验组4和对照组的大鼠在移植结束第28天运用^99mTc-ECDSPECT分析大鼠脑部血液动力学情况，通过尾静脉注射200μL^99mTc-ECD溶液(放射性活度为2mCi)，注射5分钟后进行成像分析。

结果如图6和图7所示。图7中，纵坐标为灌注不足百分比(损伤侧^99mTc-ECD平均信号强度/未损伤侧^99mTc-ECD平均信号强度)。结果表明，与对照组相比，实验组4(P＜0.01，n＝6)和实验组3(P＜0.01，n＝6)的血液灌注都表现出明显升高，而实验组4表现出在损伤区最高的灌注情况。

六、组织学分析

将步骤一实验组3、实验组4和对照组的大鼠在移植结束第28天后用冷生理盐水和4％多聚甲醛行心脏灌注，取脑固定于4％多聚甲醛中，然后包埋于石蜡中。制作8μm石蜡切片。使用VEGF抗体(1∶100)、vWF抗体(1∶300)、CD61抗体(1∶20)和NeuN抗体(1∶500)行免疫组化分析。

VEGF抗体用于分析外源和内源VEGF的表达。vWF抗体用于分析损伤带的微血管数量。CD6抗体1用于分析β3整合素的表达。NeuN抗体用于分析保留在损伤边界的成熟神经元的数量。结果如图8和图9所示。结果表明，与实验组3(P＜0.01，n＝6)或对照组(P＜0.01，n＝6)相比，实验组4的VEGF表达有显著上升，在损伤区检测到更强的CD61信号，在损伤外周皮质区，有更多的vWF免疫反应微血管和更多的NeuN阳性的成熟神经元。

这些结果表明实验组4能更长时间提升脑血流，保留更多外源VEGF，并促进新血管生成。而且更多的神经元也被改进的血流情况所保护。

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 一种诱导颅脑损伤组织再生的功能生物材料及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 579

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcaccca tggcagaagg aggagggcag aatcatcacg aagtggtgaa gttcatggat 60

gtctatcagc gcagctactg ccatccaatc gagaccctgg tggacatctt ccaggagtac 120

cctgatgaga tcgagtacat cttcaagcca tcctgtgtgc ccctgatgcg atgcgggggc 180

tgctgcaatg acgagggcct ggagtgtgtg cccactgagg agtccaacat caccatgcag 240

attatgcgga tcaaacctca ccaaggccag cacataggag agatgagctt cctacagcac 300

aacaaatgtg aatgcagacc aaagaaagat agagcaagac aagaaaatcc ctgtgggcct 360

tgctcagagc ggagaaagca tttgtttgta caagatccgc agacgtgtaa atgttcctgc 420

aaaaacacag actcgcgttg caaggcgagg cagcttgagt taaacgaacg tacttgcaga 480

tgtgacaagc cgaggcgggg tagcgcgggc agtgctgcgg gttctggcgg tactaagaaa 540

accctgcgta ctctcgagca ccaccaccac caccactga 579

<210> 2

<211> 192

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val

1 5 10 15

Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr

20 25 30

Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe

35 40 45

Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp

50 55 60

Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln

65 70 75 80

Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser

85 90 95

Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala

100 105 110

Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu

115 120 125

Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp

130 135 140

Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg

145 150 155 160

Cys Asp Lys Pro Arg Arg Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly

165 170 175

Gly Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr Leu Glu His His His His His His

180 185 190

<210> 3

<211> 525

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggcaccca tggcagaagg aggagggcag aatcatcacg aagtggtgaa gttcatggat 60

gtctatcagc gcagctactg ccatccaatc gagaccctgg tggacatctt ccaggagtac 120

cctgatgaga tcgagtacat cttcaagcca tcctgtgtgc ccctgatgcg atgcgggggc 180

tgctgcaatg acgagggcct ggagtgtgtg cccactgagg agtccaacat caccatgcag 240

attatgcgga tcaaacctca ccaaggccag cacataggag agatgagctt cctacagcac 300

aacaaatgtg aatgcagacc aaagaaagat agagcaagac aagaaaatcc ctgtgggcct 360

tgctcagagc ggagaaagca tttgtttgta caagatccgc agacgtgtaa atgttcctgc 420

aaaaacacag actcgcgttg caaggcgagg cagcttgagt taaacgaacg tacttgcaga 480

tgtgacaagc cgaggcggct cgagcaccac caccaccacc actga 525

<210> 4

<211> 174

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val

1 5 10 15

Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr

20 25 30

Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe

35 40 45

Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp

50 55 60

Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln

65 70 75 80

Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser

85 90 95

Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala

100 105 110

Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu

115 120 125

Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp

130 135 140

Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg

145 150 155 160

Cys Asp Lys Pro Arg Arg Leu Glu His His His His His His

165 170

Claims (10)

1.一种用于诱导颅脑损伤组织再生的功能材料的制备方法，包括如下步骤：将带有胶原结合区的血管内皮生长因子与胶原凝胶混合，得到所述功能材料。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述带有胶原结合区的血管内皮生长因子与胶原凝胶的配比关系为：0.5nmol∶190μL。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述带有胶原结合区的血管内皮生长因子包括CBD区段和VEGF区段；所述CBD区段如序列表的序列2自N端第178-184位氨基酸残基所示；所述VEGF区段序列如序列表的序列2自N端第1-166位氨基酸残基所示。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述带有胶原结合区的血管内皮生长因子的氨基酸序列为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列2第1-184位；

(a2)序列表的序列2。

5.如权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述带有胶原结合区的血管内皮生长因子的制备方法包括如下步骤(b1)和(b2)：

(b1)将带有胶原结合区的血管内皮生长因子的编码基因导入出发菌，得到重组菌；

(b2)培养步骤(b1)得到的重组菌，得到所述带有胶原结合区的血管内皮生长因子。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述带有胶原结合区的血管内皮生长因子的编码基因为如下(c1)或(c2)：

(c1)序列表中序列1第1-552位核苷酸所示的DNA分子；

(c2)序列表的序列1所示的DNA分子。

7.如权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述胶原凝胶材料的制备方法包括如下步骤(d1)-(d6)：

(d1)取离体的动物肌腱组织，去除脂肪和肌肉；

(d2)将步骤(d1)处理后的组织置于NaCl水溶液中处理；

(d3)将步骤(d2)处理后的组织使用DNaseI处理；

(d4)将步骤(d3)处理后的组织置于KOH水溶液中处理；

(d5)将步骤(d4)处理后的组织置于乙酸水溶液中溶解处理后离心取上清；

(d6)取步骤(d5)得到的上清，在去离子水中透析至中性，得到胶原凝胶。

8.如权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述胶原凝胶材料的制备方法包括如下步骤(e1)-(e6)：

(e1)取离体的动物肌腱组织，去除脂肪和肌肉；

(e2)将步骤(e1)处理后的组织置于NaCl水溶液中处理，然后用去离子水清洗；

(e3)将步骤(e2)处理后的组织使用DNaseI处理，然后用去离子水清洗；

(e4)将步骤(e3)处理后的组织置于KOH水溶液中处理，然后用去离子水清洗；

(e5)将步骤(e4)处理后的组织置于乙酸水溶液中溶解处理后离心取上清；

(e6)取步骤(e5)得到的上清，在去离子水中透析至中性，得到胶原凝胶。

9.权利要求1-8中任一所述的方法制备得到的用于诱导颅脑损伤组织再生的功能材料。

10.权利要求9所述的用于诱导颅脑损伤组织再生的功能材料的应用，为如下(f1)-(f6)中的至少一种：

(f1)制备诱导颅脑损伤组织再生的材料；

(f2)制备用于脑损伤修复的材料；

(f3)制备用于促进脑损伤区代谢活力的材料；

(f4)制备用于促进脑损伤区血管生成的材料；

(f5)制备用于脑损伤后神经功能修复的材料；

(f6)制备用于提升脑损伤后脑血流的材料。