CN102558345A - 一种从鲟鱼皮中提取胶原蛋白的方法 - Google Patents

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冯伟伟
张敏
吴向阳
赵江丽
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Abstract

本发明一种从鲟鱼皮中提取胶原蛋白的方法，属于食品中废物再利用技术领域。采用稀浓度多元弱碱除去脂质，用3.5℅氯化钠溶液浸泡24小时去除非胶原蛋白，此种方法对胶原蛋白活性无影响；采用胰酶进行提取，可以使提取更加充分，获得最好的提取效果，提高了对胶原蛋白的纯度，并且温和的提取条件，不会引起胶原蛋白变性失活；不添加有毒化学药品，无有害物残留，对胶原蛋白和环境不造成污染，为环境友好、绿色处理技术；工艺简单，设备投入少，经济，适用于工业化生产。

Description

一种从鲟鱼皮中提取胶原蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种从鲟鱼皮中提取胶原蛋白的方法，属于食品中废物再利用技术领域。
背景技术
鲟鱼的拉丁文学名是Acipenser sturio Linnaeus，英文名为Common sturgeon，为脊索动物门，硬骨鱼纲,辐鳍亚纲，硬磷总目，鲟形目，鲟科，鲟属。鲟鱼系现存的古老生物种群，起源于亿万年前的白垩纪时期，素有水中“熊猫”之称（汤宗.鲟鱼的营养及加工[J].北京水产.2002:26-27）。鲟鱼是世界上现有鱼类中体形大、寿命长、最古老的一种鱼类。目前地球上尚有鲟（鳇）鱼26种，集中分布于北半球，我国江河及沿海有8种，其中3种分布于新疆，2种在黑龙江，2种在长江，1种在长江至珠江各河流及沿海，而且鲟鱼对水质要求比较严格，喜生活于流水、溶氧含量较高，水温偏低，底质为砾石的水环境中，少数种类为极其濒危物种。
人工养殖的鲟鱼是一种具有很高食用价值和经济价值的淡水鱼类，随着鲟鱼养殖业的发展，鲟鱼养殖技术不断提高，养殖面积逐年增加。自20世纪90年代鲟鱼养殖业起步以来，鲟鱼养殖遍及全国20多个省、市、自治区，年养殖产量8000吨，产值达3亿元，已形成产业化养殖（程波,户业丽,吕中等. 人工养殖鲟鱼鱼皮制备蛋白粉的工艺研究[J].饲料工业.2007.28(22)），但是目前鲟鱼的利用形式单一，仅为食用（户业丽,程波.人工养殖鲟鱼皮中羟脯氨酸含量的测定[J].食品研究与开发.2008.29(1)）。而且鲟科鱼类属软骨硬鳞鱼类，这类鱼皮难以简单食用，我国每年有700吨以上的鲟鱼皮要作为废物废弃，这一方面浪费资源，另一方面造成了环境污染（胡智力,陈金芳.人工养殖鲟鱼皮的有效利用与制革实验研究[J].武汉工程大学学报.2008.30(3)），因此研究和开发鲟鱼胶原蛋白不仅可以充分利用鲟鱼资源，提高鲟鱼产品的附加值；还能保护环境，扩大胶原蛋白的原料资源。本文所采用的鲟鱼即为生长在长江流域的人工饲养的鲟鱼。
胶原蛋白是一种细胞外蛋白质，它是由3条肽链拧成螺旋形的纤维状蛋白质，胶原蛋白是人体内含量最丰富的蛋白质，占全身总蛋白质的30%以上。胶原蛋白含有丰富的氨基酸，其中必需氨基酸占氨基酸总量的15.78%，蛋白质营养价值高；矿物质含量较丰富，特别是钙元素和硒元素的含量，分别达到了2.7×104和0.37 mg/kg（程波,张小雨,黄武等, 人工养殖鲟鱼鱼皮酶解蛋白粉的营养评价[J], 饲料工业,2009,30(4):26-28）。一个成年人的身体内约有3公斤胶原蛋白，主要存在于人体皮肤、骨骼、眼睛、牙齿、肌腱、内脏（包括心、胃、肠、血管）等部位，其功能是维持皮肤和组织器官的形态和结构，修复各损伤组织。胶原蛋白是维持人体正常活动及抗衰老的重要物质，因此当胶原蛋白不足时，皮肤、骨骼及内脏器官会出现问题。胶原蛋白分子实际是一个多价离子，不同的动物和不同的提取方法提取出的胶原蛋白有不同的等电点，从牛皮中提取的胶原蛋白的等电点是pH 7.5-7.8，呈现出偏碱性，这是因为胶原的肽链中碱性氨基酸比酸性氨基酸多一些（蒋挺大.胶原与胶原蛋白[M].化学化工出版社2006.1）；李贺等用酶法从猪皮中提取的胶原蛋白的等电点为4.98（李贺,刘白玲,陈华林等.中国皮革[M].2002.31(23)）。
胶原蛋白不仅有维持人体健康的作用，在制革生产中也占据着重要地位，2005年李宏强以鲟鱼皮为原料，以野生鱼皮制革工艺加工鞣制野生鱼皮，成功制备了一种防水鱼皮革（李宏强.防水鱼皮革[P].中国专利.CN200510087384.6. 2005212221）。
当前鲟鱼皮的脱脂方法主要是有机溶剂脱脂法（程波,吴洁,张玉蓉,等. 酶法提取人工养殖鲟鱼皮中胶原蛋白的工艺研究[M].食品研究与开发.2009.30(3)），但是有机溶剂使胶原蛋白变性，导致其失活；去除非胶原蛋白的方法主要有0.1M NaOH浸泡（Lingzhao Wang, Bao Yang , Xiuqiao Du, et al., Optimization of conditions for extraction of acid-soluble collagen from grass carp(Ctenopharyngodon idella) by response surface methodology[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies.2008.9），但NaOH为强碱，易使胶原蛋白变性，导致其失活；胶原蛋白的提取工艺主要为酸提取(肖高,施亦东,陈衍下.胶原蛋白的提取及其对纺织材料的改性研究[M].研究与技术.2010.2)和胃蛋白酶提取(Phanat Kittiphattanabawon , Soottawat Benjakul , Wonnop Visessanguan, et al.Isolation and characterization of collagen from the cartilages of brownbanded bamboo shark (Chiloscyllium punctatum) and blacktip shark (Carcharhinus limbatus[J]). LWT - Food Science and Technology.2010.43;刘承初;彭得翔;严如娟等. 胶原蛋白活性肽及其制备方法和用途[P], 中国专利,200810037217)，这类提取方法的pH值较低，一般为2-3,，也易使蛋白质变性失活（如胃蛋白酶的最适pH为2.0，此时胶原蛋白已经变性失活）。因此本发明在于解决此技术存在的不足，找到一种从鲟鱼皮中提取胶原蛋白的方法，使鲟鱼皮中胶原蛋白充分提取，同时可保持胶原蛋白活性不变。
发明内容
本发明的目的在于解决上述背景技术存在的不足，提供一种从鲟鱼皮中提取胶原蛋白的方法，其特征在于本发明采用稀浓度多元弱碱除去脂质，用3.5℅（m/V）氯化钠溶液浸泡24小时去除非胶原蛋白，此种方法对胶原蛋白活性无影响；采用胰酶进行提取，可以使提取更加充分，获得最好的提取效果，提高了对胶原蛋白的纯度，并且温和的提取条件，不会引起胶原蛋白变性失活；不添加有毒化学药品，无有害物残留，对胶原蛋白和环境不造成污染，为环境友好、绿色处理技术；工艺简单，设备投入少，经济，适用于工业化生产。
一种从鲟鱼皮中提取胶原蛋白的方法，按照下述步骤进行：（1）鲟鱼皮的预处理：取出冷冻的鲟鱼皮，解冻，剔除皮下肉、脂肪及结缔组织，分切成约0.5cm×0.5cm大小的鱼皮块，以0.5℅（m/V）碳酸钠浸泡去除脂肪至脂肪除尽，洗涤；再以3.5℅（m/V）氯化钠溶液浸泡24小时，除去可溶性的非胶原蛋白，洗涤，干燥备用；（2）将上述的鲟鱼皮5g与蒸馏水按1:5-1:15（m/m）的比例混合，搅拌均匀，加入1℅-3℅胰酶（酶/底物，m/m）混合，在胰酶的最适温度37℃和pH为中性进行浸提，浸提6-12小时后，过滤，收集滤液加入硫酸铵盐析，室温4000 r/min离心20 min，弃上清，沉淀以0.5 mol/L醋酸溶解后，于透析袋中蒸馏水透析24小时，每2小时换一次蒸馏水，冷冻干燥，得白色胶原蛋白。
鲟鱼皮用该技术处理后，其中胶原蛋白的得率最高为22.27%，胶原蛋白的含量为42.18%。
该发明的优点是：（1）本发明采用稀浓度多元弱碱除去脂质，用3.5℅（m/V）氯化钠溶液浸泡24小时去除非胶原蛋白，此种方法对胶原蛋白活性无影响；（2）采用胰酶进行提取，可以使提取更加充分，获得最好的提取效果，提高了胶原蛋白的纯度，并且温和的提取条件，不会引起胶原蛋白变性失活；（3）不添加有毒化学药品，无有害物残留，对胶原蛋白和环境不造成污染，为环境友好、绿色处理技术；（4）工艺简单，设备投入少，经济，适用于工业化生产。
具体实施方式
本发明采用羟脯氨酸法测定胶原蛋白的含量。具体方法为准确称取胶原蛋白粉末5.0mg，于50ml烧杯中溶解，然后定量转入250.0ml的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，置冰箱中备用。精密吸取蛋白溶液2ml置于试管中，平行两份，另取一个试管作空白对照，向试管中分别加入0ml、0ml、2ml的蒸馏水，再加入氯胺T溶液3.0ml，摇匀后于20℃放置20min，分别加入显色剂3.0ml，摇匀于60℃加热20min取出，迅速冷却，测A560值。根据标准曲线，计算胶原蛋白的含量。
本发明采用胰酶购自国药集团化学试剂有限公司，按干燥品计算，每1g中含胰蛋白酶中酶活力≥12000活力单位。
实施例1
鲟鱼皮的预处理：取出冷冻的鲟鱼皮，解冻，剔除皮下肉、脂肪及结缔组织，分切成约0.5cm×0.5cm大小的鱼皮块，以0.5℅（m/V）碳酸钠浸泡去除脂肪至脂肪除尽，洗涤；再以3.5℅（m/V）氯化钠溶液浸泡24小时，除去可溶性的非胶原蛋白，洗涤，干燥备用。
将预处理好的鲟鱼皮5g与蒸馏水按1:5（m/m）的比例混合，搅拌均匀，加入1℅（酶/底物，m/m）胰酶，在胰酶的最适温度37℃和pH为7时进行搅拌，浸提6小时，过滤，收集滤液加入硫酸铵盐析，室温4000 r/min离心20 min，弃上清，沉淀以0.5 mol/L醋酸溶解后，于透析袋中蒸馏水透析24小时，每2小时换一次蒸馏水，冷冻干燥，得胶原蛋白，其中胶原蛋白的得率为10.58%，胶原蛋白的含量为26.87%。
实施例2
鲟鱼皮的预处理：取出冷冻的鲟鱼皮，解冻，剔除皮下肉、脂肪及结缔组织，分切成约0.5cm×0.5cm大小的鱼皮块，以0.5℅（m/V）碳酸钠浸泡去除脂肪至脂肪除尽，洗涤；再以3.5℅（m/V）氯化钠溶液浸泡24小时，除去可溶性的非胶原蛋白，洗涤，干燥备用。
  将预处理好的鲟鱼皮5g与蒸馏水按1:10（m/m）的比例混合，搅拌均匀，加入2℅（酶/底物，m/m）胰酶，在胰酶的最适温度37℃和pH为7时进行搅拌，浸提9小时，过滤，收集滤液加入硫酸铵盐析，室温4000 r/min离心20 min，弃上清，沉淀以0.5 mol/L醋酸溶解后，于透析袋中蒸馏水透析24小时，每2小时换一次蒸馏水，冷冻干燥，得胶原蛋白，其中胶原蛋白的得率为16.45%，胶原蛋白的含量为38.15%。
实施例3
鲟鱼皮的预处理：取出冷冻的鲟鱼皮，解冻，剔除皮下肉、脂肪及结缔组织，分切成约0.5cm×0.5cm大小的鱼皮块，以0.5℅（m/V）碳酸钠浸泡去除脂肪至脂肪除尽，洗涤；再以3.5℅（m/V）氯化钠溶液浸泡24小时，除去可溶性的非胶原蛋白，洗涤，干燥备用。
将预处理好的鲟鱼皮5g与蒸馏水按1:15（m/m）的比例混合，搅拌均匀，加入3℅（酶/底物，m/m）胰酶，在胰酶的最适温度37℃和pH为7时进行搅拌，浸提12小时，过滤，收集滤液加入硫酸铵盐析，室温4000 r/min离心20 min，弃上清，沉淀以0.5 mol/L醋酸溶解后，于透析袋中蒸馏水透析24小时，每2小时换一次蒸馏水，冷冻干燥，得胶原蛋白，其中胶原蛋白的得率为22.27%，胶原蛋白的含量为42.18%。

Claims (1)

1.一种从鲟鱼皮中提取胶原蛋白的方法，其特征在于按照下述步骤进行：（1）鲟鱼皮的预处理：取出冷冻的鲟鱼皮，解冻，剔除皮下肉、脂肪及结缔组织，分切成约0.5cm×0.5cm大小的鱼皮块，以0.5℅碳酸钠浸泡去除脂肪至脂肪除尽，洗涤；再以3.5℅氯化钠溶液浸泡24小时，除去可溶性的非胶原蛋白，洗涤，干燥备用；（2）将上述的鲟鱼皮5g与蒸馏水按1:5-1:15的比例混合，搅拌均匀，加入1℅-3℅胰酶混合，在胰酶的最适温度37℃和pH为中性进行浸提，浸提6-12小时后，过滤，收集滤液加入硫酸铵盐析，室温4000 r/min离心20 min，弃上清，沉淀以0.5 mol/L醋酸溶解后，于透析袋中蒸馏水透析24小时，每2小时换一次蒸馏水，冷冻干燥，得白色胶原蛋白。
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