CN103845272B

CN103845272B - 具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103845272B
Application number: CN201410092689.5A
Authority: CN
Inventors: 刘廷强; 周华锋; 侯冬梅; 严泽民; 段明星; 徐之伟
Original assignee: JIANGSU LONGLIQI BIOTECHNOLOGY CO Ltd; Tsinghua University
Current assignee: Carlyle Cosmetics Co., Ltd; Tsinghua University
Priority date: 2014-03-14
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2017-06-30
Anticipated expiration: 2034-03-14
Also published as: CN103845272A

Abstract

本发明公开了一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物及其制备方法和应用，蚯蚓提取物中含有分子量小于等于3万道尔顿的多肽、氨基酸、蛋白质、蚯蚓素、维生素和微量元素，方法为将干净蚯蚓捣碎或将蚯蚓干品捣碎并浸泡于水中得到蚯蚓样品液，蚯蚓样品液利用自身酶或外加蛋白酶水解，得到蚯蚓水解液，将蚯蚓水解液经截留分子量小于等于3万道尔顿的超滤膜超滤并冷冻干燥，得到蚯蚓提取物。通过上述方式，本发明得到的蚯蚓提取物去除了蚯蚓原有的腥味，具有明显的抗氧化活性，可以有效促进人皮肤成纤维细胞的生长和增殖，促进胶原蛋白等基质的合成，最终达到抗老化作用，可应用于具有抗皮肤老化作用的化妆品和保健品的开发中。

Description

具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物及其制备方法和应用。

背景技术

蚯蚓，是我国传统的一味中药，也称为地龙，具有清热定惊、通络、平喘等作用。目前蚯蚓临床上的用药主要是传统煎煮的提取物或蚯蚓粉，以及通过低温抽提的蚯蚓蛋白粗提物，用于溶栓和抗栓，以及预防和治疗心血管、高血压和高血脂等疾病。

蚯蚓体内含有丰富的蛋白质类、脂肪类，以及蚯蚓素、人体必需的微量元素和维生素等活性成分。蚯蚓通过在一定温度下自溶或外加蛋白酶水解制备的小分子蚯蚓提取物，具有防治高血压、抗菌和抗病毒等作用。但是，还未见制备小分子蚯蚓提取物，用于抗皮肤老化产品的开发。在小分子蚯蚓提取物制备过程中，除了主要生成多肽类，还会产生氨基酸、水溶性小分子脂肪酸等活性成分。现有制备技术中，一方面往往忽视了这些活性成分，以及蚯蚓体内自身含有的维生素和微量元素等其他小分子物质；另一方面制备提取物腥味较重，影响产品的后续开发。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物及其制备方法和应用，该制备方法绿色简单，得到的蚯蚓提取物具有很强的抗氧化活性。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物，所述蚯蚓提取物中包括分子量小于等于3万道尔顿的多肽、氨基酸、蛋白质、蚯蚓素、维生素和微量元素。

提供一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法，包括步骤为：

(1)将干净鲜蚯蚓搅碎得到蚯蚓样品液，或将蚯蚓干品捣碎并浸泡于水中得到蚯蚓样品液；

(2)所述蚯蚓样品液利用所述蚯蚓样品液中自身含有的酶或加入的蛋白酶水解，得到蚯蚓水解液；

(3)将所述蚯蚓水解液经截留分子量小于等于3万道尔顿的超滤膜超滤，得到的超滤液冷冻干燥，得到蚯蚓提取物。

在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)中所述蚯蚓为钜蚓科动物参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蝈、湖北环毛蚓、直隶环毛蚓、异毛环毛蚓、白颈环毛蚓、背暗异唇蚓或赤子爱胜蚓中的一种或多种。

在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)中所述干净蚯蚓是将新鲜的蚯蚓洗净，置于水中1-48小时得到，所述捣碎的蚯蚓干品与水的比例为1g∶0-20ml，所述浸泡时间为0-48h。

在本发明一个较佳实施例中，步骤(2)中所述蚯蚓样品液与所述水的体积比为1∶1-10，所述水解的条件为pH值为2-10、温度为20-70℃、水解时间为0.5-10h。

在本发明一个较佳实施例中，步骤(3)中所述蚯蚓水解液是通过小于等于3万道尔顿超滤膜超滤，截留去除了蚯蚓自身含有的腥味成分，得到蚯蚓提取物。

提供一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物在抗皮肤老化化妆品或保健品中的用途。

本发明的有益效果是：本发明的蚯蚓提取物及其制备方法和应用，得到的蚯蚓提取物去除了蚯蚓原有的腥味，具有明显的抗氧化活性，可以有效促进人皮肤成纤维细胞的生长和增殖，促进胶原蛋白等基质的合成，最终达到抗老化作用，可应用于具有抗皮肤老化作用的化妆品和保健品的开发中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1是本发明的蚯蚓提取物的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

(1)将新鲜的蚯蚓洗净，置于去离子水或纯净水中24h，排尽体内的食物残渣，然后用高速捣碎机将洗净的蚯蚓捣碎，蚯蚓捣碎液即为鲜蚯蚓样品液；其中所述新鲜蚯蚓为钜蚓科动物参环毛蚓(P.aspergillum(E.Perrier))、通俗环毛蚓(P.vulgaris Chen)、威廉环毛蚓(P.guillelmi(Michaelsen))、栉盲环毛蝈(P.pectinifera(Michaelsen))、湖北环毛蚓(P.hupeiensis)、直隶环毛蚓(P.tschiliensis)、异毛环毛蚓(P.diffringens)、白颈环毛蚓(P.californica)、背暗异唇蚓(Allolobophora caliginosa trapezoides)或赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)等中的一种或多种。

(2)向蚯蚓样品液中加入2倍体积的去离子水，利用自身酶进行水解，酶解条件为：pH值为6.5、温度为40℃、水解3h，即得蚯蚓水解液。

(3)蚯蚓水解液经截留分子量为3万道尔顿超滤膜过滤，去除水解液中的腥味物质，超滤液冷冻干燥，得到蚯蚓提取物，为淡黄色粉末，无腥味。

在步骤(1)中也可以采用干蚯蚓作为原料时，蚯蚓粉碎后进行水提，水提样液可以和鲜蚯蚓样液混合，通过鲜样液中自身酶进行水解；也可以通过外加蛋白酶进行水解，制备得到的蚯蚓提取物与鲜蚯蚓自溶制备得到的提取物性状相同。

实施例二：

蚯蚓提取物中成分的分析实验：

(1)蚯蚓提取物中多肽和蛋白的分子量分布情况：

实验步骤：按照大豆肽粉的国标GB／T22492-2008方法，对蚯蚓自溶获得的多肽分子量的分布情况进行分析。采用Agilent1200系列高效液相色谱仪、TOSOH TSK-Gel-2000SWXL(300×7.8mm)的色谱柱、检测波长220nm，流动相乙腈∶水∶三氟乙酸的体积比为20∶80∶0.1，流速为0.5ml／min，柱温为25℃，进样量为20μl。采用溶菌酶、胰岛素、杆菌肽和谷胱甘肽为参照，绘制标准曲线。

实验结果：请参阅图1，HPLC检测结果如图所示，经对照标准蛋白出峰时间，蚯蚓提取物主要含有多肽和氨基酸的混合物，只含有少量的相对分子质量在1万以上(保留时间为15.48min之前的峰)的蛋白质。

(2)双缩脲试剂法测定多肽和蛋白的浓度：

双缩脲试剂的配制：a)4g无水Na₂CO₃溶解于200ml的0.1mol／l的NaOH溶液中，即为试剂A；b)0.5g CuSO₄·5H₂O溶解于10ml的1％酸钾钠溶液中，即为试剂B；c)将试剂A与试剂B以5∶1的比例进行混合摇匀，即为双缩脲试剂。

测定步骤：用去离子水配制蚯蚓提取物溶液，2ml样品液添加至4ml双缩脲试剂中混匀，于室温下放置30min，540nm处检测OD值。以杆菌肽为参照品，绘制标准曲线。参照标准曲线的回归方程，计算多肽和蛋白的总含量。

实验结果：地龙蚯蚓提取物中多肽和蛋白的总含量为41.02％。

(3)氨基酸浓度测定：

实验步骤：采用凯氏定氮法，对蚯蚓提取物中氮的总量进行检测；氮的总含量减去多肽和蛋白质的总量即为氨基酸含量。

实验结果：地龙蚯蚓提取物中总氮的含量为83.23％，氨基酸含量为42.21％。

(4)通过以上测定数据可知，蚯蚓提取物中富含多肽和氨基酸，少量的蛋白质，以及蚯蚓体中自身含有的蚯蚓素、维生素和微量元素等。因此，制备获得的蚯蚓提取物中含有的物质种类丰富。

实施例三：

蚯蚓提取物的体外抗氧化活性实验

(1)样品溶液配制：实施例一中的蚯蚓提取物采用500道尔顿纳滤膜过滤，去除氨基酸和微量元素等小分子物质，制备分子量为500至3万道尔顿的提取物作为对照；未进行纳滤的蚯蚓提取物作为实验组，分别配制成不同浓度的样液。

(2)DPPH溶液的配制：将DPPH溶于无水乙醇，配制浓度为1mmol／L的母液，于4℃中避光存放，使用前稀释为100μmol／L的DPPH无水乙醇溶液。

(3)分别取样品液2mL和浓度为100μmol／L的DPPH溶液1mL，先后加入同一试管中，摇匀，室温下静置30分钟，于517nm波长下测定样品吸光度。

清除率：k％=[1-(Ai-Aj)／Ac]×100％，Ai：1ml DPPH溶和2ml样品液的吸光度，Aj：2ml样品液和1ml溶剂的吸光度，Ac：1ml DPPH溶液和2ml溶剂的吸光度。

(4)实验结果：如下表所示，蚯蚓提取物进一步去除氨基酸和微量元素等小分子物质后，对DPPH自由基的清除率反而降低，因此，保留氨基酸和微量元素等小分子物质的蚯蚓(地龙)提取物，具有更好的抗氧化活性。

实施例四：

蚯蚓提取物促进人皮肤成纤维细胞的生长和增殖实验

(1)正常的人皮肤成纤维细胞分别以适宜的密度接种于细胞培养板，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，然后用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1X10⁵个接种于96孔板或细胞培养皿(30mm)中，加入含10％胎牛血清和高糖DMEM培养基，同步化处理各组细胞，于5％CO₂、37℃温箱中培养。

实验分未经处理的空白对照组，以及分别添加实施例二中0.4mg／ml的500至3万道尔顿蚯蚓提取物作为实验对照组和未进行纳滤的蚯蚓提取物作为实验组。分别孵育3～5天后，每孔加入MTT适量，继续培养4h，弃去上清。每孔加入DMSO，振摇，酶标仪检测各孔吸光度值。同样培养3～5天后的各组细胞，分别用胰蛋白酶消化，离心收集细胞，以体积分数为80％的乙醇固定。PBS清洗细胞3次，分别加入4℃保存的含Triton的碘化丙啶(PI)，振荡成单细胞悬液，避光室温静置，用流式细胞仪检测，重复实验3次。

(2)实验结果：添加蚯蚓提取物之前，OD检测值为0.35±0.009；添加经过纳滤的提取物之后OD检测值为0.63±0.024；添加未经纳滤的提取物之后OD检测值为0.76±0.031。经流式细胞仪检测，添加蚯蚓提取物前的结果为8.1，添加经过纳滤的提取物之后的结果为14.8；添加未经纳滤的提取物之后结果为17.3。细胞流式仪检测结果和MTT检测结果，都显示0.4mg／ml蚯蚓提取物能显著促进人皮肤成纤维细胞的生长增殖，而保留氨基酸和微量元素等小分子物质的蚯蚓提取物的作用更明显。

实施例五：

蚯蚓提取物促进人皮肤成纤维细胞分泌胶原蛋白实验：

(1)按照实施例六中细胞培养的方法进行试验，实验分未经处理的空白对照组，以及分别添加实施例二中0.4mg／ml的500至3万道尔顿蚯蚓提取物作为实验对照组和未进行纳滤的蚯蚓提取物作为实验组，分别孵育3～5天。培养结束后，0.5ml细胞培养液离心，上清液采用人I型前胶原羧基端肽(P ICP)ELISA试剂盒，根据说明书进行操作，检测I型前胶原蛋白(Type I procollagen)的分泌情况，试验平行进行三次。

(2)实验结果：基于定量结果，以空白对照组培养液中I型前胶原蛋白的含量定义为100％。添加经过纳滤的提取物之后进行细胞培养时，I型前胶原蛋白的含量提高至148.53±3.94％。而添加未经纳滤的提取物的实验组，其I型前胶原蛋白的含量提高至184.24±4.05％。与空白对照组相比，添加蚯蚓提取物实验组中的I型前胶原蛋白含量明显增加，且保留氨基酸和微量元素等小分子物质的蚯蚓提取物的作用更加显著。

实施例六：

蚯蚓提取物在抗皮肤老化化妆品中的应用

化妆品配方一：以质量百分比计，(A)碳酸二辛酯7.00％、环聚二甲基硅氧烷5.00％、鲸蜡硬脂醇5.00％、十六十八烷基糖苷4.00％、甘油硬脂酸酯2.50％、山茶籽油3.50％、聚二甲基硅氧烷2.00％、羟苯丙酯0.10％，(B)卡波0.550％、甘油6.00％，(C)硬脂酰谷氨酸钠0.20％、去离子水余量、羟苯甲酯0.20％，(D)双(羟甲基)咪唑烷基脲0.30％、蚯蚓提取物1.00％。

制备方法：分别将A、B相加热到80-85度使其完全溶解，然后A相加入B相中进行均质，同时将混合均匀的C相加入，均质5-10min，均质结束后在水浴锅中边搅拌边保温30min，然后降温至50度以下时将D相加入，其中用少量灭菌去离子水溶解蚯蚓提取物成溶液后添加，搅拌均匀，冷却至室温即得。

化妆品配方二：以质量百分比计，甘油2.00％、1，3-戊二醇3.50％、聚甲基丙烯酸甘油酯／丙二醇／PVM／MA共聚物4.50％、氢化蓖麻油1.00％、甘油4.00％、苯氧乙醇0.30％、甲基异噻唑啉酮0.10％、蚯蚓提取物0.60％、灭菌去离子水余量。

制备方法：依次将上述原料加入灭菌去离子水中，边加入边搅拌，直至透明即得。

化妆品配方三：以质量百分比计，(A)聚氧乙烯(21)硬脂醇醚1.00％、PEG-100硬脂酸酯2.50％、十六十八醇1.20％、异硬脂酸异丙酯3.50％、棕榈酸异丙酯5.00％、蜂蜡2.00％、硬脂酸1.00％，(B)1，3-丁二醇3.00％、丙烯酸二甲基牛磺酸铵／vp共聚物0.50％，(C)聚二甲基硅氧烷交联聚合物1.00％、聚二甲基硅氧烷3.00％，(D)聚丙烯酰胺／C13～14异链烷烃／月桂醇聚醚-70.90％，(E)甘油3.00％、去离子水余量，(F)柠檬酸0.01％、柠檬酸钠0.05％、氢氧化钠0.04％，(G)苯氧乙醇0.80％、蚯蚓提取物0.90％。

制备方法：将A相和E相分别加热到80-90度，然后把A加入B中进行均质，同时将B、C和D加入，均质5-10min，均质完成后边搅拌边保温30min，降温至50度时，依次分别将F相配制的水溶液和G相配制的水溶液加入，搅拌均匀，降温至室温即得。

化妆品配方四：以质量百分比计，(A)EDTA-2Na0.05％、1，2-戊二醇4.00％、去离子水余量、甘油6.00％，(B)1，3-丁二醇5.00％、丙烯酰二甲基牛磺酸铵／VP共聚物0.85％，(C)苯氧乙醇0.70％、蚯蚓提取物0.50％。

制备方法：将A相加热到85-90度，然后将混合均匀的B相加入并均质5-10min，降温至50度以下时，加入C相水溶液，搅拌均匀，冷却至室温即得。

实施例七：

蚯蚓提取物在抗老化保健品中的应用：

胶囊配方：以质量百分比计，微晶纤维素／淀粉65.98％、蚯蚓提取物34.00％、磷脂0.02％。

制备方法：上述各物质分别进行充分碾磨，过100目筛网，然后按照比例添加，进行充分混匀，灌装胶囊即得。

口服液配方：以质量百分比计，蚯蚓提取物1.20％、果汁粉3.00％、三氯蔗糖0.05％、香精0.02％、去离子水余量。

制备方法：上述各物质按照比例依次加入去离子水中，搅拌均匀后，经300目筛网过滤后即得。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物，其特征在于，所述蚯蚓提取物中包括分子量小于等于 3 万道尔顿的多肽、氨基酸、蛋白质、蚯蚓素、维生素和微量元素；

所述蚯蚓提取物在抗皮肤老化化妆品或保健品中的用途；

所述具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法，包括步骤为：

(1) 将干净鲜蚯蚓搅碎得到蚯蚓样品液，或将蚯蚓干品捣碎并浸泡于水中得到蚯蚓样品液；

(2) 所述蚯蚓样品液利用所述蚯蚓样品液中自身含有的酶或加入的蛋白酶水解，得到蚯蚓水解液；

(3) 将所述蚯蚓水解液经截留分子量小于等于 3 万道尔顿的超滤膜超滤，得到的超滤液冷冻干燥，得到蚯蚓提取物。

2.根据权利要求1所述的蚯蚓提取物，其特征在于，步骤(1)中所述蚯蚓为钜蚓科动物参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蚓、湖北环毛蚓、直隶环毛蚓、异毛环毛蚓、白颈环毛蚓、背暗异唇蚓或赤子爱胜蚓中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的蚯蚓提取物，其特征在于，步骤(1)中所述干净蚯蚓是将新鲜的蚯蚓洗净，置于水中1-48小时得到，所述捣碎的蚯蚓干品与水的比例为1g∶0-20ml，所述浸泡时间为 0-48h。

4.根据权利要求 1所述的蚯蚓提取物，其特征在于，步骤 (2) 中所述蚯蚓样品液与水的体积比为 1 ∶ 1-10，所述水解的条件为 pH 值为 2-10、温度为 20-70℃、水解时间为0.5-10h。

5.根据权利要求1所述的蚯蚓提取物，其特征在于，步骤(3)中所述蚯蚓水解液是通过小于等于 3 万道尔顿超滤膜超滤，截留去除了蚯蚓自身含有的腥味成分，得到蚯蚓提取物。