CN101245104B

CN101245104B - 一种海洋头足类动物皮胶原蛋白及其制备方法

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Publication number: CN101245104B
Application number: CN2007100463060A
Authority: CN
Inventors: 刘承初; 秦玉青; 王慥
Original assignee: Shanghai Ocean University
Current assignee: Shanghai Ocean University
Priority date: 2007-09-24
Filing date: 2007-09-24
Publication date: 2012-06-13
Anticipated expiration: 2027-09-24
Also published as: CN101245104A

Abstract

本发明属于生物资源与环境技术领域，具体涉及一种海洋头足类动物I胶原蛋白产品及其制备方法。本发明公开了一种海洋头足类动物胶原蛋白，所述胶原蛋白系从海洋头足类动物皮中提取得到，该胶原蛋呈白色白或带淡褐色，为I型胶原蛋白，分子类型为：[α1]₂α2型，其主要肽链分子量为300～330KD，特性粘度为12～18dL/g，变性温度为15～30℃和，每1000个氨基酸残基中分别含甘氨酸280～330、脯氨酸80～90、和羟脯氨酸60-70。本发明以海产食品加工废弃物之一的鱿鱼皮为原料制备I型胶原蛋白；采用可食用的生化试剂、温和的制备条件以及简易的物理方法对鱿鱼皮中的胶原蛋白进行提取；所获得的胶原蛋白产品不存在有毒有害试剂的残留问题，具有很高的安全性，因此除具有一般胶原蛋白的用途外，还可直接应用一般食品、特殊食品、功能性食品和生物医药行业；采用本发明的方法制备胶原蛋白对环境是友好的，不会向环境排放有毒有害物质，避免了某些制备方法可能对环境产生新污染的问题。

Description

一种海洋头足类动物皮胶原蛋白及其制备方法

技术领域

本发明属于生物资源与环境技术领域，具体涉及一种海洋头足类动物I型胶原蛋白产品及其制备方法。

背景技术

胶原蛋白是一类重要的结构蛋白，广泛存在于多细胞动物的骨骼、表皮和肌键等支持组织中。胶原蛋白中含有丰富的甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸，其水解产物中还存在有生理活性肽。由于其弱抗原性和良好的组织相容性，胶原蛋白及其水解产物在医疗、保健及美容方面具有良好的应用前景，从可食用的和摄影等用的明胶，到香肠包装和功能食品添加剂，都有广泛的用途。经特殊处理的可溶性胶原蛋白还被用于烧伤、创伤、美容、矫形、组织修复、创面止血等医药卫生领域。

目前的商用胶原蛋白通常来源于含有结缔组织的屠宰动物(牛和猪的皮及骨骼)。由于近年来疯牛病和口蹄疫等传染病的发生，已使人们对牲畜胶原制品安全性产生疑虑，有不少国家和地区已明文禁止使用以牛皮和猪皮等为原料获得的胶原蛋白及其制品。为了解决这一问题，寻找新的提取胶原蛋白的原料愈来愈迫切。海洋动物含有丰富的胶原蛋白，具有很大开发利用潜力。研究表明，海产动物的胶原与猪、牛等陆生动物的胶原蛋白相比，无论在溶解性、热稳定性及多肽链组成上等方面都存在显著不同。分布于鱼类真皮、肌肉等软组织中的胶原蛋白即使在低温下也易溶于中性盐溶液或稀酸，比较容易调制成可溶性胶原溶液。因此，开发海洋动物胶原蛋白资源、拓宽胶原蛋白的应用，具有非常重要的意义。

对海洋动物胶原蛋白的研究，最早在50年代初，当时日本学者高橋豊雄报道了鱼皮中的胶原蛋白同陆生动物皮的胶原蛋白的差异，开创了对海洋动物皮胶原蛋白研究的先河。随后逐渐有学者开展对鳕鱼、鲍鱼、鲶鱼、海盘车、海绵、对虾等多种胶原蛋白的研究。特别是90年代以来，各国学者对此方面的研究日益增多，先后对水母、鲣鱼、鲈鱼、香鱼、黄鲷、鳟鱼、鲐鱼、鲽鱼、虎鲨等海洋动物的胶原蛋白进行了研究。目前国内虽有许多专利涉及水产动物胶原蛋白的研究，其中鱼鳞胶原蛋白最多(公开号[CN1628540A]、[CN1775950A]、[CN1800216A]、[CN1948411A]、[CN1986828A])，其次为鱼皮胶原蛋白(公开号[CN1597741A]、[CN1749296A])。另外，还有来源于海蜇(公开号[CN1803836A])和海洋空肠生物(公开号[CN1721546A])的胶原蛋白。但现有专利文献报道的胶原蛋白提取方法中大多采用了一些不可食用的或对人和环境可能有毒有害或可能在激烈反应过程产生有害物质的有机试剂(如丙酮、醚类、非离子表面活性剂、甲醇、强酸、强碱等(公开号[CN1597741A]、[CN1749296A]、[CN1888075A]、[CN1628540A]、[CN1775950A])，但未见海洋头足类动物原蛋白的专利报道。

我国是渔业生产大国。随着我国远洋渔业的迅速发展，海洋头足类动物资源异军突起，捕获量已达20万吨，成为我国主要的水产加工原料。然而，由于我国目前的加工技术含量低，海洋头足类动物在加工处理过程中约有35％的头、足、内脏及表皮等废弃物产生。对这些废弃物的处理，大多数工厂则采用了掩埋丢弃的方法，这不仅造成资源的极大浪费，更严重的是直接导致环境的污染。占废弃物总量8～13％的海洋头足类动物皮中存在大量的胶原蛋白质(占总蛋白的50％以上)。如何将这些废弃物中的有益成份加以回收利用，实现“变废为宝”实有必要。遗憾的是，目前未见海洋头足类动物原蛋白的专利报道。因此本发明旨在以海洋头足类动物鱿鱼和乌贼的皮为原料，通过采用安全无毒和环境友好型生化制备技术，使鱿鱼皮中难溶性的胶原转化成可溶性胶原进行提取，避免在制备过程中采用有毒有害的试剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备海洋头足类动物皮胶原蛋白及其制备方法。

为达到上述目的，本发明的技术措施如下：

一方面，本发明公开了一种海洋头足类动物胶原蛋白，所述胶原蛋白系从海洋头足类动物皮中提取得到，该胶原蛋呈白色白或带淡褐色，为I型胶原蛋白。其分子类型为：[α1]₂α2型，其分子量为300～330KD，特性粘度为12～18dL/g，变性温度为15～30℃和，每1000个氨基酸残基中含甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸分别为280～330、80～90、60-70。

另一方面，上述对胶原蛋白进行提取回收的方法具体实施如下：

a)清洗海洋头足类动物皮、捣碎；

b)均质：加少许洗出液I，在组织捣碎机中均质，加入5～20倍体积的洗出液I继续均质后，静置10～60分钟；

c)去除杂蛋白：离心2000×g，15min，弃去上清液，沉淀同5～20倍体积的的洗出液II混合，搅拌浸提2～72h；；

d)重复进行步骤c操作1～3次；

e)抽提胶原蛋白：步骤d)所得沉淀加入5～50倍体积的提取液，搅拌提取10～100h，获胶原蛋白粗提液；

f)盐析：胶原蛋白粗提液中加入中性盐，使其终浓度达2.5M，使胶原蛋白盐析沉淀；

g)酸溶：离心弃去上清液，沉淀用1～20倍量的0.5M的醋酸溶解

h)透析：步骤g)所得的溶液装入透析袋，透析外液采用0.5M醋酸，至透析液无Cl-检出为止，重复盐析-透析的操作共三次；

i)冷冻干燥。

上述操作均在2～15℃的低温条件下进行。

上述海洋头足类动物皮，可为鱿鱼皮、乌贼皮、墨鱼皮等，可为新鲜原料或经过低温保藏处理的冷冻原料及其捣碎原料。

上述所用洗出液I可以为蒸馏水、纯净水、去离子水等，最好为去离子水。

上述所用洗出液II为可食性中性盐溶液，可为NaCl和KCl等，其浓度为1％～10％。

上述的提取液为可食性弱酸溶液，可以为醋酸、柠檬酸和乳酸等，以醋酸为最佳，其浓度为0.5M，可添加适量或不添加酸性蛋白酶。

其工艺流程如附图1。

本发明具有如下有益效果：

1.原料的选择为海洋头足类动物皮，属于海洋食品加工副产物，通常被丢弃。通过本发明回收利用该原料中含量丰富的胶原蛋白，可“变废为宝”，既能提高产品的附加值，又能缓解环境受污染的程度。

2.本发明使用常见的可食性试剂(如NaCl、KCl、柠檬酸、乳酸和醋酸等)、温和的作用条件(如酶解)和简易的物理方法(如组织捣碎、搅拌、离心、透析、干燥)对海洋头足类动物皮中的胶原蛋白进行提取，所获得的胶原蛋白产品不存在有毒有害试剂的残留问题，具有很高的安全性，因此除具有一般胶原蛋白的用途外，还可直接应用一般食品、特殊食品、功能性食品和生物医药行业

3.采用本发明的方法制备胶原蛋白具有环境友好的特点，制备过程中不会向环境排放有毒有害物质，也避免了某些制备方法可能对环境产生新污染的问题。

附图说明

图1本发明工艺流程图。

具体实施方式

下面通过具体得实施方案来说明最佳提取条件的确定。本方案只用于对本发明的进一步阐述和说明，不能认为是对本发明的保护范围的限制。

实施例1

1.原料前处理

新鲜的鱿鱼皮，用蒸馏水清洗干净；

2.采用洗出液I去除水溶性杂蛋白

将经过清洗的鱿鱼皮，用组织捣碎机中捣碎，加入10倍量洗出液I进行均质，离心(5000×g，15min)取沉淀，再加入洗出液I重复处理2次；

3.采用洗出液II去除盐溶性杂蛋白

在经上述步骤所得沉淀中加入10倍量的洗出液II，进行均质，搅拌浸提24h，离心取沉淀，用净水洗涤沉淀2次；

3.采用提取液抽提胶原蛋白

在上述沉淀中加入10倍量的提取液，搅拌提取48h，离心取上清液即获胶原蛋白粗提液；

4.胶原蛋白的盐析

在胶原蛋白粗提液中加入固态NaCl，使其终浓度达2.5M，使胶原蛋白盐析沉淀，离心取沉淀；

5.胶原蛋白的透析

上述沉淀用0.5M醋酸溶解，装入透析袋进行，透析外液采用0.5M醋酸，至透析液无Cl^-检出为止，重复盐析-透析的操作(共三次)，得胶原蛋白湿品；

6.干燥

采用冷冻干燥方法，对上述胶原蛋白湿品进行干燥，可以防止胶原蛋白质变性，干燥后的鱿鱼皮胶原蛋白为絮状物，色白(或带淡褐色)。经SDS-PAGE和氨基酸分析，确定为I型胶原蛋白，分子类型为：[α1(I)]₂α2(I)型，其分子量为300KD，特性粘度为12.7dL/g，变性温度为16.5℃和，每1000个氨基酸残基中含甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸分别为291、87、62。

实施例2

将新鲜或解冻后的乌贼皮用清水洗净、剪碎、均质，加入5倍量的洗出液I后处理，离心除去上清液，在沉淀中加入10倍量的洗出液II，搅拌浸提16h。离心取沉淀，用净水洗涤沉淀，然后用15倍量的提取液，搅拌提取56h，获胶原蛋白粗提液。加入固态NaCl，使其终浓度达2.5M，离心弃去上清液，沉淀用0.5M醋酸溶解，进行透析，透析外液采用0.5M醋酸，至透析液无Cl^-检出为止，经冷冻干燥后，即获得乌贼皮胶原蛋白产品，其分子量为330KD，特性粘度为18dL/g，变性温度为30℃和，每1000个氨基酸残基中含甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸分别为330、90、70。

实施例3

将冷冻鱿鱼皮在冰箱的储藏室里解冻，用去离子水清洗干净，然后加入10倍量洗出液I，在组织捣碎机中进行均质。离心(2000×g，15min)，去除上清液，沉淀用15倍量的洗出液II搅拌浸提48h。离心取沉淀，用去离子水洗涤沉淀3次后，加入20倍量的含有1％胃蛋白酶的提取液，搅拌提取72h，离心取上清液即为胶原蛋白粗提液。加入固体KCl，使其终浓度达2.5M，离心去除上清液，沉淀用0.5M的醋酸溶解，进行透析处理，透析外液为0.5M醋酸，至透析液无Cl-检出为止，经冷冻干燥后获得鱿鱼皮胶原蛋白产品。经SDS-PAGE和氨基酸分析，确定为I型胶原蛋白，分子类型为：[α1(I)]₂α2(I)型，其分子量为300KD，特性粘度为16.3dL/g，变性温度为25.5℃，每1000个氨基酸残基中含甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸分别为301、86、65。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种海洋头足类动物胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所制备的海洋头足类动物胶原蛋白呈色白或带淡褐色，为I型胶原蛋白，分子类型为：[α1]₂α2型，其分子量为300～330KD，特性粘度为12～18dL/g，变性温度为15～30℃，每1000个氨基酸残基中分别含甘氨酸280～330个、脯氨酸80～90个、和羟脯氨酸60～70个；

具体包括下列步骤，

a)清洗海洋头足类动物皮；

b)均质：加少许水，在组织捣碎机中均质，加入5～20倍体积的水继续均质后，静置10～60分钟；

c)去除杂蛋白：离心2000×g，15min，弃去上清液，得第一沉淀，第一沉淀同5～20倍体积的1％～10％可食性中性盐溶液混合，搅拌浸提2～72h，离心取第二沉淀，用净水洗涤第二沉淀；

d)重复进行步骤c操作1～3次；

e)抽提胶原蛋白：步骤d)所得第二沉淀加入5～50倍体积的0.5M可食性弱酸溶液，搅拌提取10～100h，获胶原蛋白粗提液；

f)盐析：胶原蛋白粗提液中加入可食性中性盐，使其终浓度达2.5M，使胶原蛋白盐析沉淀；

g)酸溶：离心弃去上清液，沉淀用1～20倍量的0.5M的醋酸溶解；

h)透析：步骤g)所得的溶液装入透析袋，透析外液采用0.5M醋酸，至透析液无Cl^-检出为止，重复盐析-透析的操作共三次；

i)冷冻干燥；

上述操作均在2～15℃的低温条件下进行。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述海洋头足类动物皮为鱿鱼皮、乌贼皮或墨鱼皮或它们任何组合。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述海洋头足类动物皮为新鲜原料或经过低温保藏处理的冷冻原料，以及所述新鲜原料及冷冻原料的捣碎原料。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤b)中所述水选自蒸馏水、纯净水或去离子水。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤b)中所述水为去离子水。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤c)和f)中所述可食性中性盐为NaCl或KCl。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤e)中所述可食性弱酸溶液选自醋酸溶液、柠檬酸溶液或乳酸溶液。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤e)中所述可食性弱酸溶液为醋酸溶液。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤e)中所述可食性弱酸溶液中还添加酸性蛋白酶。