JP4642775B2 - Bcl−2のモデュレーションのためのオリゴマー化合物 - Google Patents
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Description
5'-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3'
(式中、「LNA」はLNAヌクレオチドを示し、「LNA*」はLNAアナログヌクレオチドを示す)を有し、該標的結合ドメイン中にホスホロチオエート基によって連結された少なくとも2つのLNAヌクレオチドまたはLNAアナログヌクレオチドを含むオリゴマー化合物が、興味深い生物学的特性を有することを見出した。
上記のように、本発明者らは、長さが10〜30ヌクレオチドのオリゴマー化合物であって、ヒトBcl−2mRNAの塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域に特異的にハイブリダイズすることのできる標的結合ドメインを含み、該標的結合ドメインが、式:
5'-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3'
(式中、「LNA」はLNAヌクレオチドを示し、「LNA*」はLNAアナログヌクレオチドを示す)を有し、該標的結合ドメイン中にホスホロチオエート基によって連結された少なくとも2つのLNAヌクレオチドまたはLNAアナログヌクレオチドを含むオリゴマー化合物が、興味深い生物学的特性を有することを見出した。
オリゴマー化合物は、それが標的結合ドメイン中にホスホロチオエート基によって連結された少なくとも2つのLNAヌクレオチドまたはLNAアナログヌクレオチドを含むことを特徴とする。
5'-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3'
(式中、「LNA」はLNAヌクレオチドを示し、「LNA*」はLNAアナログヌクレオチドを示す)を有し、該標的結合ドメインが、ホスホロチオエート基(-O-P(O,S)-O-)によって連結された少なくとも2つのLNAヌクレオチドまたはLNAアナログヌクレオチドを含むオリゴマー化合物に関する。
5'-[(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA* 2-7]-3';
5'-[(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA* 2-7-(DNA/RNA)]-3';
5'-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA* 2-7]-3';および
5'-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA* 2-7-(DNA/RNA)]-3'。
本発明のオリゴマー化合物は、実施例1および2、およびWO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 00/66604, WO 00/125248, WO02/28875, WO 2002/094250, PCT/DK02/00488およびHerdewijn, P., Oligonucleotide Synthesis, Methods and Applications, pp 127-145, Humana Press, トトワ、ニュージャージー、2005の記載に従って調製することができる。それゆえ、本発明のオリゴマー化合物は、有機化学の当業者によく知られた核酸化学ほ重合方法を用いて製造することができる。一般に、ホスホルアミダイト法(S. L. BeaucageおよびR. P. Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; S. L. BeaucageおよびR. P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223)の標準重合サイクルを用いるが、たとえば、H−ホスホネート化学、ホスホトリエステル化学を用いることもできる。
本発明のオリゴマー化合物は、様々な薬理学的に許容しうる塩にて用いることができる。本明細書において、この語は、本明細書に記載の化合物の所望の生物学的活性を保持し、かつ最小の所望でない毒性作用を示す塩をいう。そのような塩の非制限的例は、有機アミノ酸、および金属カチオン、たとえば、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリウムなどとの、またはアンモニア、N,N-ジベンジルエチレン-ジアミン, D-グルコサミン, テトラエチルアンモニウム, またはエチレンジアミンから生成するカチオンとの塩基付加塩;または(c)(a)と(b)との組み合わせと生成することができる(たとえば、亜鉛タンニン酸塩など)。
本発明のさらなる側面は、本明細書で定義した化合物を含むコンジュゲートに関し、該化合物には少なくとも1の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド残基が共有結合している。
本発明の幾つかの態様において、オリゴマー化合物はプロドラッグの形態であってよい。オリゴヌクレオチドは実質的に負に荷電している。細胞膜の親油性の性質のため、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みは、中性または親油性の等価物に比べて低減している。この極性「妨害」は、プロドラッグアプローチ(たとえば、Crooke, R. M. (1998) in Crooke, S. T., Antisense Research and Application. Springer-Verlag, ベルリン、ドイツ、vol. 131, pp. 103-140を参照)を使用することで回避することができる。このアプローチでは、オリゴマー化合物は、投与されたときに中性となるように保護された形態で調製される。これら保護基は、オリゴマー化合物が細胞によって取り込まれたときに除去されるような仕方にデザインされる。そのような保護基の例は、S−アセチルチオエチル(SATE)またはS−ピバロイルチオエチル(t−ブチル−SATE)である。これら保護基はヌクレアーゼ耐性であり、細胞内で選択的に除去される。
当業者であれば、本発明のLNAオリゴマー化合物が、Bcl−2関連疾患に対して多くの異なる原理により処置するのに用いることができ、これら原理が本発明の精神の範囲内に包含されるという事実を評価するであろう。
本発明の一つの態様において、LNAオリゴマー化合物は、適当なアンチセンス薬として提供される。強力かつ安全なアンチセンス薬のデザインには、効能/有効性、親和性/特異性、生物学的流体中での安定性、細胞の取り込み、作用様式、薬動力学的特性および毒性などの様々なパラメーターの微調整が必要である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの臨床的有効性は、その薬動力学的特性、たとえば、吸収、分布、細胞による取り込み、代謝および排泄に依存する。これらパラメーターは、今度は、オリゴヌクレオチドの基礎をなす化学およびサイズおよび三次元構造によって有意に左右される。
薬力学的特性は、本発明により、オリゴマーの取り込みを改善し、生体安定性を促進し、たとえば、分解に対するオリゴマー耐性を促進し、および/または標的、たとえばmRNA配列とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性の特異性および親和性を増大させる基を用いて高めることができる。
基本的にアンチセンスオリゴマーと関連して2つのタイプの毒性がある:配列依存的な毒性(標的結合ドメインが関与)および配列非依存的なクラス関連毒性。天然のCpG配列モチーフによる免疫促進と関連する論点を例外として、アンチセンスオリゴヌクレオチドの開発において最も顕著な毒性は、たとえば、オリゴヌクレオチドの化学および投与量、投与方法、投与頻度および投与期間と関連して、配列に依存的なものである。ホスホロチオエートクラスのオリゴヌクレオチドは、特によく特徴付けられており、多くの副作用、たとえば、補体の活性化、長くなったPTT(部分トロンボプラスチン時間)、血小板減少症、肝毒性(肝酵素の上昇)、脾腫および細網内皮細胞の過形成を示すことがわかっている。
上記に従い、本発明はまた、本明細書に記載のオリゴマー化合物またはコンジュゲートおよび薬理学的に許容しうる担体を含む医薬組成物にも関することが理解されなければならない。
一つの態様において、本発明の医薬組成物は、水性担体中に長さが10〜30ヌクレオ塩基のオリゴマー化合物を含有する液体医薬組成物であり、該オリゴマー化合物は、ヒトBcl−2mRNAの塩基位置No. 1459 (5')からNo. 1476 (3')の範囲の領域に特異的にハイブリダイズすることのできる標的結合ドメインを含み、該標的結合ドメインは、式:
5'-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3'
(式中、「LNA」はLNAヌクレオチドを示し、「LNA*」はLNAアナログヌクレオチドを示す)を有し、該標的結合ドメインは、ホスホロチオエート基(-O-P(O,S)-O-)によって連結された少なくとも2つのLNAヌクレオチドまたはLNAアナログヌクレオチドを含み、該水性担体は、pHを4.0-8.5の範囲に保持し、20-2000mMのイオン強度を有するようにする緩衝液を含む。
5'-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3'
(式中、「LNA」はLNAヌクレオチドを示し、「LNA*」はLNAアナログヌクレオチドを示す)を有し、該標的結合ドメインは、ホスホロチオエート基(-O-P(O,S)-O-)によって連結された少なくとも2つのLNAヌクレオチドまたはLNAアナログヌクレオチドを含み、該水性担体は、pHを4.0-8.5の範囲に保持し、20-2000mMのイオン強度を有するようにする緩衝液を含む。
5'-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3'
(式中、「LNA」はLNAヌクレオチドを示し、「LNA*」はLNAアナログヌクレオチドを示す)を有し、該標的結合ドメインは、ホスホロチオエート基(-O-P(O,S)-O-)によって連結された少なくとも2つのLNAヌクレオチドまたはLNAアナログヌクレオチドを含み、該組成物中での化学療法化合物と該LNAオリゴヌクレオチドとの重量比は50:1から1:25の範囲である。
5'-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3'
(式中、「LNA」はLNAヌクレオチドを示し、「LNA*」はLNAアナログヌクレオチドを示す)を有し、該標的結合ドメインは、ホスホロチオエート基(-O-P(O,S)-O-)によって連結された少なくとも2つのLNAヌクレオチドまたはLNAアナログヌクレオチドを含み、該組成物中での化学療法化合物と該コンジュゲートの該LNAオリゴヌクレオチド部分との重量比は50:1から1:25の範囲である。
Bcl−2は、赤血球の増殖、細胞の増殖、イオン代謝、グルコースおよびエネルギー代謝、pH制御およびマトリックス代謝を含む多くの基本的な生物学的メカニズムに関与している。本発明の方法は、癌によって引き起こされる疾患に対する治療、維持治療または予防、とりわけ、Bcl−2の発現と関連する癌、たとえば、乳、結腸、前立腺、膵臓、肺、肝臓、胸腺、腎臓、脳、精巣、胃、腸管、腸、脊髄、洞、膀胱、尿管、卵巣、頭および首、血液、皮膚、胃、または骨の癌の治療に用いるのが好ましい。
本発明のオリゴマー化合物は、治療、維持治療および予防として利用することができる。研究においては、アンチセンスオリゴマー化合物は、細胞および実験動物においてBcl−2タンパク質の合成を特異的に抑制し、それによって標的の機能分析または治療介入のための標的としての有用性の評価を容易にするのに用いることができる。治療のためには、Bcl−2の発現をモデュレートすることによって治療することのできる疾患または障害を罹患していることが疑われる動物またはヒト(とりわけ、ヒト)を、本発明によるアンチセンス化合物を投与することにより治療する。さらに、治療学的または予防学的有効量の1またはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物を投与することにより、Bcl−2の発現と関連する疾患または状態を罹患しているかまたは罹患しそうなことが疑われる動物、とりわけマウスおよびラットを治療し、およびヒトを治療する方法も提供される。
本発明の医薬組成物は、局所あるいは全身処置が望まれるか否かおよび処置する領域に依存して多くの仕方で投与することができる。投与は、(a)経口、(b)肺で行う、たとえば、粉末またはエアゾル剤の吸入(ネブライザーによるもの、気管内、鼻内を含む)、(c)表皮、経皮、眼内および粘膜(膣および直腸送達を含む)を含む局所、または(d)静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または注入、または頭蓋内(たとえば、くも膜下腔内または脳室内)投与を含む非経口であってよい。一つの態様において、オリゴマー化合物は、静脈内、腹腔内、経口、局所またはボーラス注射により投与し、または標的臓器に直接投与する。
本発明の医薬組成物としては、これらに限られるものではないが、液剤、懸濁剤、およびリポソーム含有製剤が挙げられる。これら組成物は、前もって生成した液体、自己懸濁化固体および自己懸濁化半固体を含む(これらに限られるものではない)様々な成分から調製できる。腫瘍組織への薬剤の送達は、カチオン性リポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分枝鎖デンドリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ナノ粒子およびミクロスフェアを含む(これらに限られるものではない)担体媒体送達により促進することができる(Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):3-27)。
投与量は、処置しようとする疾患状態の重篤度および応答性、および数日から数ヶ月、または治癒が有効となるかまたは疾患状態の縮減が達成されるまで持続する処置の経過に依存する。最適の投与スケジュールは、たとえば、併用処置、疾患および疾患状態および初期臨床徴候からの結果に依存するであろう。
本発明のさらなる側面は、
(a)本明細書に記載のオリゴマー化合物の1またはそれ以上の注射可能な溶液投与量を入れた第一のコンポーネント、および
(b)1またはそれ以上の化学療法化合物(たとえば、フルダラビンおよび/またはタキサン化合物)の1またはそれ以上の注射可能な溶液を入れた第二のコンポーネント
を含み、その際、該組成物中での該少なくとも1のタキサン化合物と該少なくとも1のLNAオリゴヌクレオチドとの重量比が50:1から1:25の範囲であるキットに関する。
実施例1:モノマー合成
LNAモノマー構築ブロックおよびその誘導体を、以下の刊行された方法およびその中で引用された文献に従って調製した:
WO 03/095467 A1
D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) LNAホスホルアミダイトの調製, Synthesis 6, 802-808
M. D. Sorensen, L. Kvaerno, T. Bryld, A. E. Hakansson, B. Verbeure, G. Gaubert, P. Herdewijn, J. Wengel (2002) α-L-リボ-配置Locked Nucleic Acid (α-l-LNA):合成および特性, J. Am. Chem. Soc., 124, 2164-2176.
S. K. Singh, R. Kumar, J. Wengel (1998) 新規なビシクロ[2.2.1]リボヌクレオチド: 2'-アミノ- および2'-チオ-LNAモノマーヌクレオシドの合成, J. Org. Chem. 1998, 63, 6078-6079.
C. Rosenbohm, S. M. Christensen, M. D. Sorensen, D. S. Pedersen, L. E. Larsen, J. Wengel, T. Koch (2003) Synthesis of 2'-アミノ-LNAの合成:新規な戦略, Org. Biomol. Chem. 1, 655-663.
D. S. Pedersen, T. Koch (2003) LNA (Locked Nucleic Acid)のアナログ 2'-チオ-LNAチミンおよび5-メチルシトシンホスホルアミダイトの合成, Synthesis, 受領。
オリゴヌクレオチドを、Expedite 8900/MOSS合成機(Multiple Oligonucleotide Synthesis System)でのホスホルアミダイトアプローチを用い、1μモルまたは15μモルのスケールで合成した。より大きなスケールの合成にはAkta Oligo Pilotを用いた。合成の終了時(DMT-on)、水性アンモニアを室温で1〜2時間用いてオリゴヌクレオチドを固相支持体から開裂し、65℃で4時間さらに脱保護した。オリゴヌクレオチドを逆相HPLC(RP−HPLC)により精製した。DMT基の除去後、AE−HPLC、RP−HPLC、およびCGEによりオリゴヌクレオチドを特徴付け、分子量をESI−MSによりさらに確認した。詳細は以下を参照。
LNAスクシニルヘミエステルの調製
5'-O-Dmt-3'-ヒドロキシ-LNAモノマー(500mg)、無水コハク酸(1.2当量)およびDMAP(1.2当量)をDCM(35mL)に溶解した。反応液を室温で一夜攪拌した。NaH2PO4 0.1M pH 5.5 (2×)および食塩水(1×)で抽出した後、有機層をさらに無水Na2SO4で乾燥させ、濾過および蒸発させた。ヘミエステルを95%の収率で得、さらに精製することなく用いた。
上記で調製したヘミエステル誘導体(90μモル)を最小量のDMFに溶解し、DIEAおよびpyBOP(90μモル)を加え、1分間攪拌した。この前活性化混合物をLCAA-CPG(500オングストローム、80-120メッシュサイズ、300mg)と手動合成機中で混合し、攪拌した。室温で1.5時間後、支持体を濾去し、DMF、DCMおよびMeOHで洗浄した。乾燥後、負荷を57μモル/gと決定した(Tom Brown, Dorcas J.S.Brown. Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis. In: F.Eckstein編、Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach. オックスフォード: IRLプレス, 1991: 13-14を参照)。
ホスホルアミダイト(A(bz), G(ibu), 5-メチル-C(bz))またはT-β-シアノ-エチル-ホスホルアミダイト)のカップリングを、アセトニトリル中の0.1Mの5'-O-DMT-保護アミダイトの溶液およびアクチベーターとしてアセトニトリル(0.25M)中のDCI(4,5ジシアノイミダゾール)を用いて行う。チオール化を、水素化キサンテン(アセトニトリル:ピリジン10%中に0.01M)を用いて行う。残りの試薬は、オリゴヌクレオチドの合成に典型的に使用するものである。供給者により提供されるプロトコールを都合よく最適化した。
カラム:Xterra RP18
流速:3mL/分
緩衝液:0.1M酢酸アンモニウム、pH8およびアセトニトリル
DMT:ジメトキシトリチル
DCI:4,5-ジシアノイミダゾール
DMAP:4-ジメチルアミノピリジン
DCM:ジクロロメタン
DMF:ジメチルホルムアミド
THF:テトラヒドロフラン
DIEA:N,N-ジイソプロピルエチルアミン
PyBOP:ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
Bz:ベンゾイル
Ibu:イソブチリル
大スケールでのオリゴヌクレオチドを、AKTAオリゴパイロットでのホスホルアミダイトアプローチを用いて200μモル〜1ミリモルのスケールで合成した。オリゴのDMT-OFF-合成後、その後のDEA-処理も合成機で行った。固相支持体からのオリゴヌクレオチドの開裂、および保護基の除去を、水性アンモニアでの55℃での12時間の処理により行った。ついで、オリゴヌクレオチドをAKTAパイロット上でのイオン交換(IEX)により精製した。脱塩を、SephadexTM G-25培地で行い、ついで凍結乾燥した。オリゴヌクレオチドをIEX−HPLC、CGEおよびESI−MSにより特徴付けた。
表1:本発明のオリゴマー化合物
本明細書において、オリゴマー化合物は特定の配列番号、たとえば、「SEQ ID NO: 15」により言及される。化合物「SEQ ID NO: 56」はまたオブリマーセンナトリウムとも呼ばれ、本明細書において参照化合物として用いられる。
標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の作用は、該標的核酸が測定可能なレベルで存在することを条件として、様々な細胞型のいずれにおいても試験することができる。標的は、内生的に、または該核酸をコードする核酸の一過性または安定なトランスフェクションにより発現させることができる。
トランスフェクションビヒクルとしてカチオン性リポソーム製剤であるLipofectAMINE 2000 (Gibco)を用い、細胞をオリゴヌクレオチドで処理した。
全RNAの単離
RNeasyミニキット(QiagenカタログNo. 74104)かまたはTrizol試薬(Life technologiesカタログNo. 15596)のいずれかを用い、全RNAを単離した。細胞株からのRNA単離の場合はRNeasyが好ましい方法であり、組織試料からの単離の場合はTrizolが好ましい方法である。
OmniScript Reverse Transcriptaseキット(カタログ#205113, Qiagen)を製造業者の指示に従って用い、第一鎖の合成を行った。
Bcl−2発現のアンチセンスモデュレーションは、当該技術分野で知られた様々な仕方でアッセイすることができる。たとえば、Bcl−2mRNAレベルを、たとえば、ノーザンブロット分析または定量的PCRにより定量することができる。定量的PCRが現在のところ好ましい。RNA分析は全細胞のRNAまたはmRNAで行うことができる。
mRNAレベルの定量を、iQ Multi-Color Real Time PCR Detection System(BioRAD)を製造業者の指示に従って用いたリアルタイムの定量的PCRにより決定した。
フォアウォードプライマー:5'catgtgtgtggagagcgtcaa3'(アッセイでの最終濃度;0.6μM)(SEQ ID NO: 62)
リバースプライマー:5'gccggttcaggtactcagtca3'(アッセイでの最終濃度;0.6μM)(SEQ ID NO: 63)
であり、PCRプローブは:
5'FAM-cctggtggacaacatcgccctgt-TAMRA 3'(アッセイでの最終濃度;0.1μM)(SEQ ID NO: 64)であった。
上記で行った第一鎖合成からのcDNAを2〜20倍に希釈し、リアルタイム定量的PCRにより分析した。プライマーおよびプローブを2×Platinum Quantitative PCR SuperMix UDG(カタログ#11730, Invitrogen)と混合し、3.3μlのcDNAに添加して最終容量25μlとした。各試料を3つずつ分析した。目的のRNAを発現する細胞株から精製した物質で調製したcDNAの2倍希釈のアッセイは、該アッセイの標準曲線を生成した。鋳型不在の対照にはcDNAの代わりに滅菌H2Oを用いた。PCRプログラム:50℃で2分、95℃で10分、続いて95℃で15秒、60℃で1分を40サイクル。
Bcl−2のタンパク質レベルは、免疫沈降、ウエスタンブロット分析(イムノブロッティング)、ELISA、RIA(ラジオイムノアッセイ)または蛍光活性化セルソーティング(FACS)その他などの当該技術分野でよく知られた様々な仕方で定量することができる。Bcl−2に対する抗体は同定でき、Upstate Biotechnologies(レイクプラシッド、米国)、Novus Biologicals(リットルトン、コロラド)、Santa Cruz Biotechnology(サンタクルス、カリフォルニア)、DAKO(グロストルップ、デンマーク)などの様々な入手先から得ることができ、あるいは通常の抗体製造法により調製することができる。ウエスタンブロッティング:
本発明に従い、一連のオリゴヌクレオチドをヒトBcl−2mRNAの特定の領域、すなわち、翻訳開始コドンの周辺の領域にハイブリダイズするようにデザインした。異なるデザインおよび長さのオリゴヌクレオチドを表1に示す。オリゴマー化合物を15PC3および518A2にトランスフェクションすることにより、オリゴマー化合物がこれら細胞株でBcl−2をノックダウンする能力を評価した。Bcl−2転写物定常状態をリアルタイムPCRによりモニターし、GAPDH転写物定常状態レベルに正規化した。表3は、SEQ ID NO: 56(オブリマーセンナトリウム;完全に修飾したホスホロチオエート;参照)と比較して強力な一連の化合物を示す。
トランスフェクションの前日に細胞をDMEM中にて白色96ウエルプレート(Nunc 136101)のウエル当たり12,000細胞の密度で播種した。翌日、細胞を前もって温めたOptiMEMで1回洗浄し、ついで5μg/mlのLipofectamine2000(In vitrogen)を含有する72μlのOptiMEMを添加した。OptiMEM中で希釈した18μgのオリゴヌクレオチドを添加する前に細胞を7分間インキュベートした。オリゴヌクレオチドの最終濃度は、0.2nMから25nMの範囲であった。4時間処理した後、細胞をOptiMEMで洗浄し、血清を含有する50μlのDMEMを添加した。オリゴマー化合物で処理後、細胞をCO2インキュベーターから回収し室温で15分間平衡化する前に指示した時間回復させた。等容量の高感度Caspase 3/7-GloTM Reagent(Promega)を96ウエル中の細胞に直接添加し、プレートを60分間インキュベートし、さらに1分間の遅延時間の後にThermo LabsystemsからのLuminoskan Ascent装置でルミネセンス(ルシフェラーゼ活性)を記録した。ルシフェラーゼ活性は、1秒当たりの相対光単位(Relative Light Units per seconds (RLU/s))として測定する。データをAscentソフトウエア2.6で処理し、グラフをエクセルで作成した(図3Aおよび3B参照)。
トランスフェクションの前日に細胞をDMEM中にて白色96ウエルプレート(Nunc 136101)のウエル当たり12,000細胞の密度で播種した。翌日、細胞を前もって温めたOptiMEMで1回洗浄し、ついで5μg/mlのLipofectamine2000(In vitrogen)を含有する72μlのOptiMEMを添加した。OptiMEM中で希釈した18μgのオリゴヌクレオチドを添加する前に細胞を7分間インキュベートした。オリゴヌクレオチドの最終濃度は、5nMから100nMの範囲であった。4時間処理した後、細胞をOptiMEMで洗浄し、血清を含有する100μlのDMEMを添加した。オリゴマー化合物で処理後、細胞を指示した時間回復させ、100μlのDMEM当たり20μlのテトラゾリウム化合物[3-(4,5-ジメチル-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム, 内部塩;MTS]および電子カップリング試薬(フェナジンエトサルフェート;PES)(CellTiter 96R AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega)を添加して生きた細胞を測定した。生きた細胞をPowerwave(Biotek Instruments)中で490nmにて測定した。増殖速度(ΔOD/h)をオリゴマー化合物の濃度に対してプロットした(図4および5を参照)。
6週齢の雌Balb/c無胸腺ヌードマウスをM&B(デンマーク)から購入し、実験に入る前に少なくとも1週間慣らした。ヒト癌細胞、典型的に300μlのマトリゲル(BD Bioscience)中に浮遊させた3×106の細胞を脇腹に皮下注射した。二重異種移植モデルとして、2つの腫瘍を各脇腹に一つずつ移植した。腫瘍増殖が確立されたとき(典型的に腫瘍細胞の注射の5〜12日後)、異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを0.01〜20mg/kg/日にて30日まで、腹腔内(IP)投与経路で毎日、1日に2回、2日または3日に1回または毎週投与した。対照動物は、食塩水のみを同じ期間、同じ投与経路で投与した。各実験群は少なくとも5匹のマウスを含んでいた。抗腫瘍活性を、腫瘍容積により測定した腫瘍増殖の抑制によって評価した。腫瘍増殖は、2つの直交する直径を測定することにより定期的に追跡した。腫瘍容積は、Teicher BA, Tumour Models in Cancer Research. Humana Press, NJ, USA 2002, p. 596中の式に従って計算した:腫瘍容積(mm3)=L×W2×0.5(式中、Lは最大直径を表し、WはLと直交する腫瘍直径である)。処理が終了したら動物を屠殺し、腫瘍重量を測定した。各群の平均腫瘍容積および重量をMann-Whitney検定を用いて比較した。分析はすべてWindows(登録商標)のSPSSバージョン11.0で行った。図7A、7B、7Cおよび7Dを参照。
6週齢の雌Balb/c無胸腺ヌードマウスをM&B(デンマーク)から購入し、実験に入る前に少なくとも1週間慣らした。ヒト癌細胞、典型的に300μlのマトリゲル(BD Bioscience)中に浮遊させた3×106の細胞を脇腹に皮下注射した。二重異種移植モデルとして、2つの腫瘍を各脇腹に一つずつ移植した。腫瘍増殖が確立されたとき(典型的に腫瘍細胞の注射の5〜12日後)、異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを0.01〜20mg/kg/日にて30日まで、静脈内(IV)または腹腔内(IP)投与経路で毎日、1日に2回、2日または3日に1回または毎週投与した。対照動物は、食塩水のみを同じ期間、同じ投与経路で投与した。各実験群は少なくとも5匹のマウスを含んでいた。処理が終了したら動物を麻酔し、腫瘍を切り出し、直ちに液体窒素中で凍結した。
病原体フリーの雌C.B-17 scid/scid(SCID)マウス(4-6週齢、漏出性について試験)をHarlan & Winkelmann(ボルヘン、ドイツ)から得た。動物を層流ラック(laminar flow racks)中のマイクロアイソレーター(microisolator)ケージに収容し、オートクレーブ処理した食物および水を随意に与えた。SCIDマウスの左下腹脇腹に200μlのPBSに再浮遊させた1.5×107の518A2ヒト黒色腫細胞を皮下(s.c.)注射した。10日後、全てのマウスは触知できる皮下腫瘍を発症し、処理群または対照群に対して無作為化し、処理を開始した。連続皮下投与のため、マウスを麻酔し、食塩水中のオリゴヌクレオチドまたはビヒクル対照としての食塩水を充填したミニ浸透ポンプ(Alzet 2002, Alza, Moutain View, カリフォルニア、米国)を傍脊髄ポケット(paraspinal pocket)に皮下移植した。
ラット血漿(NtacSD雄, Li-Heparine (Taconic, M&B))中、37℃、異なる時間アリコート:0, 4, 24および48時間での20μMのSEQ ID NO: 15の安定性。SEQ ID NO: 56はSEQ ID NO: 56(参照)に対応する。SEQ ID NOS: 20および16は、試験した他のオリゴヌクレオチドである。SEQ ID NO: 15のn-1, n-2 およびn-3(3'-末端から)に対応するオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO: 15の可能な消化断片の同定を可能とする対照とすべく含められた。市販のラダーもまた含まれていた(10および20merはPAGE上で視認できる)。(図12Aを参照)
90匹のNMRI雌マウス(約30g)を5群に分け、25mg/kgのSPC 2996(10mL/kg, 2.5mg/ml)を30秒間、静脈内投与した。対照群は0.9%食塩水を投与した。ついで、各群を注射後30秒、6時間、24時間、48時間、72時間、および96時間に屠殺した。組織を採取し、後にRNAに調製した。
約100mgの組織を500μlの抽出緩衝液(0.5%Igepal CA-630, 25mM Tris pH 8.0, 25mM EDTA, 100mM NaCl;1mg/mlのRNAse Aを含有)中で機械的にホモジナイズし、37℃で一夜インキュベートした。500mlに参照オリゴヌクレオチドを加え、1mlのフェノール-イソアミル-クロロホルム(25:1:24(v/v/v))を加えて抽出した。水性相を新たなチューブに移し、再び抽出した。必要なら、抽出物を凍結乾燥した。
50μLの試料容量を、保護カラムDNAPac PA-100(2×50mm, Dionex)を備えたDNAPac PA-100(2×250mm, Dionex)カラムで分離した。カラムを40℃に加熱した。流速は0.25mL/分であり、検出波長は260nmであった。移動相の勾配:A:TRIS (20mM), EDTA (1mM) および過塩素酸ナトリウム(10mM)pH:7.6、B:TRIS (20mM), EDTA (1mM) および過塩素酸ナトリウム(1M)pH:7.6, (0-13分、A:20%, B:20%;14-18分、A:40%, B:60%;22-28分、A:0%, B:100%;33-38分、A:80%, B:20%)。
Claims (15)
- 下記配列:
C S T S c S c S c S a S a S c S g S t S g S c S g S C S C S a(配列番号15)
(式中、大文字はLNAヌクレオチドを示し、小文字はDNAヌクレオチドを示し、下付きのSは隣接するヌクレオチドがホスホルアミダイト基により連結されていることを示し、LNA-Cモノマーはすべてメチル-Cである)からなるオリゴマー化合物。 - 請求項1 に記載のオリゴマー化合物および該化合物に共有結合した少なくとも1の非ヌクレオチド/非ポリヌクレオチド残基を含むコンジュゲート。
- 請求項1 に記載のオリゴマー化合物または請求項2に記載のコンジュゲート、および薬理学的に許容しうる担体を含む医薬組成物。
- 化学療法化合物、抗炎症化合物、抗ウイルス化合物、細胞増殖抑制化合物、抗血管形成化合物、抗増殖化合物、アポトーシス促進化合物、シグナル伝達モデュレーター、およびキナーゼインヒビターよりなる群から選ばれたさらなる薬剤を含む、請求項3に記載の医薬組成物。
- 少なくとも1の化学療法化合物をさらに含む、請求項4に記載の医薬組成物。
- 癌疾患の治療用である、請求項3ないし5のいずれかに記載の医薬組成物。
- 癌疾患が、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫およびびまん性大B細胞リンパ腫よりなる群から選ばれる、請求項6に記載の医薬組成物。
- 癌疾患の治療のための医薬を製造するための請求項1 に記載のオリゴマー化合物または請求項2に記載のコンジュゲートの使用。
- 癌疾患が、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫およびびまん性大B細胞リンパ腫よりなる群から選ばれる、請求項8に記載の使用。
- 癌疾患の治療が、化学療法化合物、抗炎症化合物、抗ウイルス化合物、細胞増殖抑制化合物、抗血管形成化合物、抗増殖化合物、アポトーシス促進化合物、シグナル伝達モデュレーター、およびキナーゼインヒビターよりなる群から選ばれたさらなる薬剤を併用するものである、請求項8または9に記載の使用。
- 該医薬が、少なくとも1の化学療法化合物をさらに含む、請求項8ないし10のいずれかに記載の使用。
- 該医薬が、1またはそれ以上の抗体化合物をさらに含む、請求項8ないし11のいずれかに記載の使用。
- 癌疾患の治療が、放射線療法を併用するものである、請求項8ないし12のいずれかに記載の使用。
- インビトロで細胞アポトーシスを誘発する方法であって、細胞を、請求項1に記載のオリゴマー化合物、請求項2に記載のコンジュゲートまたは請求項3に記載の医薬組成物と接触させることによって細胞アポトーシスを誘発することを含む、方法。
- インビトロで細胞の増殖を妨害または抑制する方法であって、細胞を、請求項1に記載のオリゴマー化合物、請求項2に記載のコンジュゲートまたは請求項3に記載の医薬組成物と接触させることによって細胞の増殖を妨害または抑制することを含む、方法。
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