ES2339960T3 - Metodos de cribado para compuestos que modulan la actividad de receptores acoplados a proteina g. - Google Patents

Metodos de cribado para compuestos que modulan la actividad de receptores acoplados a proteina g. Download PDF

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Abstract

Un método para la identificación de moduladores de GPCRs, que comprende los pasos de: a.transformar una célula hospedadora eucariota con secuencias genéticas que codifican más de un GPCR(s), en donde esta transformación se realiza con un vector de expresión multicistrónico que comprende una unidad de expresión multicistrónica que comprende aguas abajo de un promotor para la expresión en un hospedador eucariota y enlazados funcionalmente al mismo, los cistrones siguientes: i.GPCR1 ii.GPCR2 y un iii.marcador de selección b.cultivar las células hospedadoras transformadas en condiciones suficientes para la expresión funcional de dichos GPCRs, c.poner en contacto la célula hospedadora cultivada que expresa los GPCRs de una manera funcional con un modulador potencial de los GPCRs seleccionados, d.medir una respuesta celular seleccionada de la célula hospedadora transformada por exposición al modulador potencial, y e.seleccionar un identificador, que induce una respuesta específica.

Description

Métodos de cribado para compuestos que modulan la actividad de receptores acoplados a proteína G.
La presente invención se refiere a un método de cribado para la identificación de moduladores (tanto agonistas como antagonistas) de GPCRs y los moduladores así identificados. En una realización preferida de la presente invención, estos moduladores pueden ser moduladores del gusto. La presente invención se refiere adicionalmente a sistemas vectores recombinantes para la expresión estable y heteróloga de receptores acoplados a proteína g (GPCRs) heterodímera seleccionados en células hospedadoras eucariotas. Se describe la expresión funcional de GPCRs manipulados genéticamente para la percepción del sabor dulce y de L-aminoácidos y el uso de dichos receptores para identificación de ligandos funcionales.
Los GPCRs representan la mayor familia de receptores de la superficie celular con un número estimado de hasta 1000 genes en el genoma humano caracterizados por una configuración siete-transmembranal como su característica principal. (Bockaert y Pin, 1999; Pierce et al., 2002). Los GPCRs son activados por una multitud de ligandos diferentes, que incluyen péptidos, proteínas, lípidos, moléculas pequeñas, iones e incluso fotones. Los GPCRs activados alteran su conformación permitiendo que la misma catalice el intercambio de guanosina-difosfato (GDP) por guanosina-trifosfato (GTP) en la subunidad \alpha de una proteína G heterotrímera acoplada al GPCR. Las proteínas G heterotrímeras compuestas de una de 18 subunidades \alpha diferentes, una de 5 subunidades \beta diferentes y una de 11 subunidades \gamma diferentes se clasifican usualmente por la naturaleza de su subunidad \alpha y se agrupan generalmente en cuatro clases principales: G_{s}, que activa adenilil-ciclasa; G_{j} que inhibe adenilil-ciclasa; G_{q} que activa fosfolipasa C; y G_{12/13} con funciones heterólogas. Además de la señalización dependiente de la subunidad \alpha, las subunidades \beta/\gamma pueden funcionar como moléculas señalizadoras por sí mismas. La señalización dependiente de GPCR se hace aún más compleja si se considera que estos receptores pueden existir como complejos homo-oligómeros o hetero-oligómeros. (George et al., 2002; Milligan et al., 2003; Salahpour et al., 2000). Por tanto, no es sorprendente que los GPCRs sean responsables de la regulación de una gran diversidad de procesos fisiológicos diferentes.
Recientemente, el papel de los GPCRs en los sentidos humanos como la vista, el olfato y el gusto ha sido objeto de investigaciones intensificadas. Mientras que la participación del GPCR rodopsina en el sentido de la vista es uno de los ejemplos de señalización de receptores acoplados a proteína G examinados más exhaustivamente en los últimos 30 años (Maeda et al., 2003), el papel de los GPCRs en el olfato y el sabor amargo así como en el sabor dulce se descubrió en los años 1990. (Buck y Axel, 1999; Firestein, 2001; Lindemann 1996b; Lindemann, 2001).
El descubrimiento de la señalización por GPCR en la percepción del sabor está estrechamente unido al descubrimiento de la señalización específica de saborizantes en las células del gusto de los vertebrados. En estudios electrofísicos y bioquímicos se hizo evidente que la señalización derivada de los saborizantes daba como resultado una inducción típica de segundo mensajero dependiente de GPCR, v.g. nucleósidos cíclicos (cAMP, cGMP), inositol-trifosfato (IP3) o calcio. (Kinnamon y Cummings, 1992; Kinnamon y Margolskee, 1996; Lindemann, 1966a). La participación de GCPRs en la percepción del sabor se vio respaldada ulteriormente por el descubrimiento de la proteína g gustducina expresada específicamente en las células del gusto de los vertebrados. (McLaughlin et al., 1992; Wong et al., 1996). Por otra parte, era conocido por estudios genéticos en ratones que la capacidad para sentir el sabor dulce de, v.g., la sacarina estaba ligada al denominado locus sac en el cromosoma 4 del ratón. (Bachmanov et al., 2001; Lush, 1989; Lush et al., 1995). Basándose en estos datos, era obvio investigar marcadores de secuencia GPCR en bibliotecas de cDNA sustraídas derivadas de células del gusto o por realización de escaneos de secuencia genómica para estrechar ulteriormente el locus sac del ratón con vistas a la identificación de análogos de GPCR como receptores supuestos del gusto. Estos dos enfoques condujeron a las secuencias de DNA de receptores de rata, ratón y humanos para los GPCRs del gusto T1R1 y T1R2 (Hoon et al., 1999; Hoon y Ryba, 1997) Así como T1R3. (Kitagawa et al., 2001; Li et al., 2001; Max et al., 2001; Montmayeur et al., 2001; Sainz et al., 2001). Las alineaciones de homología revelaron que estos receptores del gusto como el receptor de glutamato metabotrófico homodímero (mGluR), el receptor de ácido \gamma-aminobutírico heterodímero tipo B (GABA_{B}R) y los receptores homodímeros de calcio extracelular son miembros de la pequeña familia de GPCRs de clase C. Como característica común, la mayoría de los receptores de la clase C exhiben un gran dominio aminoterminal extracelular compuesto de un denominado módulo atrapamoscas de Venus (VFTM) y un dominio rico en cisteína (CRD) que conecta el VFTM al dominio heptahelicoidal. (Pin et al., 2003). Además de ello, se describió homo- y hetero-oligomerización para varios de estos receptores de clase C. (Bai et al., 1998; Kaupmann et al., 1998; Kunishima et al., 2000; White et al., 1998). Consiguientemente, el rasgo característico de la oligomerización GPCR de los receptores de clase C fue testado para los receptores supuestos del sabor dulce T1R1, T1R2 y T1R3.
Por expresión heteróloga recombinante en sistemas de células eucariotas, se demostró una expresión funcional y activación específica de saborizantes de una cascada de señalización dependiente de proteína G enlazada artificialmente, por obtención de imágenes de calcio. Los receptores T1R se ensamblan para construir receptores de sabor funcionales. Como resultado de varias investigaciones se demostró que el T1R1/T1R3 heterodímero funciona como un receptor de glutamato (umami) y de L-aminoácidos, mientras que el heterodímero T1R2/T1R3 funciona como un receptor de alta afinidad de azúcar y edulcorantes artificiales. Particularmente, la co-expresión heterodímera de T1R1 y T1R3 da como resultado receptores del sabor que responden a los estímulos del sabor de umami y de glutamato monosódico, en tanto que la co-expresión heterodímera de T1R2 y T1R3 da como resultado receptores de sabor que responden a estímulos dulces tales como diversos azúcares (v.g. glucosa y sacarosa), edulcorante artificial (v.g. acesulfamo K, ciclamato, sacarina) y proteínas dulces como monelina, taumatina, brazzeína (Li et al., 2002; Nelson et al., 2002; Nelson et al., 2001; Zhao et al., 2002). Podría generarse una crónica similar para la identificación de GPCRs para la percepción del sabor amargo con la excepción de que, hasta ahora, no se ha informado de homo- u oligomerización alguna para estos denominados T2R-GPCRs. (Meyerhof et al., 2005).
La identificación arriba expuesta de genes codificantes de receptores responsables v.g. de la percepción del sabor, junto con la clonación de dichos genes en vectores apropiados para la expresión de dichas proteínas en células eucariotas y la transformación de dichas células con dichos vectores generó la expectativa de que sistemas de cribado y/o métodos de cribado para modulares GPCR, es decir agonistas y antagonistas de los receptores detallados anteriormente, podría ser fácil de desarrollar en un tiempo razonable.
Esto se refleja por un número enorme y todavía creciente de publicaciones y solicitudes de patente en este campo.
Loison et al. (2002) describen el uso de un vector bicistrónico para la expresión de un GPCR.
La clonación de T1R1 se describe en diferentes solicitudes de patente, v.g. en WO 03/025137; en WO 00/06952 (en donde aquél se designa GPCR-B3), US020040191862A1 y WO 2005/033125.
La clonación de T1R2 se describe en las solicitudes de patente WO 03/025137, US020040191862A1 y
US020030040045A1.
La clonación de T1R3 se describe en las solicitudes de patente WO 03/025137, WO 03/025137 (sic),
US020040191862A1 y US020030040045A1.
Un sistema para la expresión de dichas proteínas en células eucariotas se describe en las solicitudes de patente WO 03/025137, WO 00/06952, US20040191862A1, W02004069191 y US20030040045A1.
Un sistema de cribado para moduladores supuestos del gusto se describe en las solicitudes de patente WO 00/06952, W02004069191 y US20030040045A1.
WO 05/072129A describe vectores policistrónicos retrovirales que son aplicables para la expresión de GPCR.
Sin embargo, no se dice nada acerca de la identificación con éxito de nuevos moduladores, v.g. nuevos moduladores artificiales del gusto tales como nuevos edulcorantes que utilicen dichos métodos/sistemas de cribado.
El creciente debate acerca de la obesidad en los países desarrollados y la consciencia creciente por la salud de los consumidores conducen a una demanda creciente de alimentos y bebidas con reducción importante de calorías comparada con productos totalmente edulcorados con carbohidratos tales como sacarosa, glucosa, fructosa o jarabes tales como HFCS55 ó 42. Dado que el consumidor no está dispuesto usualmente a transigir respecto al sabor, los productos deberían tener intensidad de dulzor y calidad de sabor similares a las de los productos edulcorados regularmente con estos carbohidratos.
Los edulcorantes de alta intensidad son sustancias que carecen, o carecen prácticamente, de calorías, y tienen una potencia edulcorante varias veces mayor que el azúcar común. Los edulcorantes de alta intensidad o mezclas de edulcorantes de alta intensidad se utilizan en alimentos y bebidas para conseguir un sabor dulce sin añadir calorías a los productos.
Los edulcorantes de alta intensidad más usados corrientemente no son de origen natural. Los mismos se descubrieron accidentalmente y se sintetizan químicamente. La mayoría de ellos tienen una aprobación generalizada en un gran número de países. Ejemplos son sustancias tales como acesulfamo K, alitama, aspartato, ciclamato, neohesperidina-dihidrocalcona, neotama, sacarina y sucralosa.
Sin embargo, ningún edulcorante de alta intensidad iguala el perfil de sabor del azúcar por completo. Los mismos difieren en características tales como perfil de dulzor, sabor secundario y características de sabor residual. Se sabe que la mezcladura apropiada de diferentes edulcorantes de alta intensidad resuelve parte de las limitaciones de sabor de los edulcorantes de alta intensidad individuales. Pero incluso si se consigue un perfil de dulzor más semejante al del azúcar en productos con edulcorantes de alta intensidad exclusivamente, los mismos pueden ser distinguidos todavía sensorialmente de sus equivalentes con el azúcar solo u otros carbohidratos por la carencia de sensación gustativa y características de aroma reducidas. Por esta razón, existe necesidad de nuevos edulcorantes de alta intensidad que ofrezcan sea solos o en mezclas con los edulcorantes existentes, perfiles de dulzor y características de aroma mucho más próximas a las del azúcar que las que pueden ofrecer los productos existentes.
Además de la reducción de calorías, muchos de los consumidores actuales están buscando productos alimenticios y bebidas sin aditivos artificiales o incluso que sean totalmente orgánicos. Teóricamente, los edulcorantes de alta intensidad naturales podrían satisfacer esta demanda. Varios edulcorantes naturales de alta intensidad han sido descubiertos a lo largo de los últimos años, tales como esteviósido, rebaudiósido, brazzeína, taumatina, mogrósido, gricirricina, monatina, abrusósido, monelina, filodulcina y otros. Éstas son sustancias que existen naturalmente en diferentes plantas y pueden obtenerse por medidas de extracción selectiva. Además de aprobaciones muy limitadas y en algunos casos dificultades de extraer los productos en escala industrial, ninguno de estos productos puede reivindicar el ofrecimiento de un sabor similar al del azúcar. De hecho, todas estas sustancias exhiben un dulzor con comienzo mucho más lento que la sacarosa y un dulzor muy prolongado. La mayoría de estos productos tienen sabor secundario fuerte y características de sabor residual tales como notas amargas, mentoladas o de regaliz o producen incluso sensaciones fuertes de enfriamiento o entumecimiento. Por tanto, alguno de estos productos, v.g. la taumatina, pueden considerarse más bien como intensificadores del sabor que como edulcorantes. La mezcla de dos o más de estas sustancias no puede resolver estas limitaciones de sabor. Por tanto, en el área de los edulcorantes naturales la necesidad de nuevos edulcorantes de alta intensidad con un perfil de sabor próximo al del azúcar común es aún más fuerte que en el caso de los edulcorantes artificiales (O'Brien Nabors, 2001; Leatherhead Food RA, 2000; Grenby, 1996; von Rymon Lipinski y Schiweck, 1991).
Por consiguiente, existe todavía una necesidad en la técnica de identificar y aislar nuevas sustancias que puedan utilizarse como moduladores de la percepción del sabor, v.g. como edulcorantes.
A pesar de lo anterior, debido a la gran importancia de estos GPCRs in vivo, y a las muchas funciones diferentes asociadas con dichos receptores, se ha supuesto que muchos de los moduladores de GPCRs que podrían ser identificados por el método de la presente invención pueden tener valor práctico.
Por esta razón, la disponibilidad de un sistema de cribado simple y fiable para moduladores de dichos receptores podría ser de gran importancia.
En los vectores de expresión multicistrónicos, las secuencias codificantes de diferentes proteínas se encuentran bajo el control de un solo promotor y los diferentes cistrones están conectados por la vía de sitios de entrada de ribosoma internos (IRES) derivados de virus o intensificadores de la traducción independientes de la cápsula (CITE). Los elementos IRES o CITE confieren una iniciación de la traducción independiente del extremo 5', necesario por otra parte, de un RNA mensajero, que es reconocido por los ribosomas eucariotas para comenzar su proceso de escaneo para el primer codón de inicio de la traducción accesible (Fux et al., 2004; Hellen y Sarnow, 2001). Hasta hora, los vectores de expresión multicistrónicos se han descrito básicamente como unidades de expresión dicistrónicas para la expresión acoplada de un gen de interés enlazado por un sitio de iniciación de la traducción independiente de la cápsula a un marcador de resistencia (que confiere resistencia a, v.g. higromicina, zeocina, neomicina) permitiendo la selección de líneas estables de células para estudios de expresión heteróloga en mamíferos. Para este enfoque, están disponibles comercialmente vectores de expresión dependientes IRES o CITE.
Informes acerca de estudios de expresión multicistrónica genuina en sistemas de mamíferos con descripciones de estudios de expresión heteróloga tri-cistrónicos o incluso cuadri-cistrónicos son escasos, y en su mayor parte tenían por objeto mejorar la expresión inducible de proteínas v.g. para aplicaciones de terapia génica. En cambio, en este trabajo pionero las expresiones multicistrónicas se han realizado en su mayor parte con proteínas pequeñas y solubles como genes informadores (proteína fluorescente verde, proteína fluorescente amarilla, proteínas fluorescentes rojas, fosfatasa alcalina secretada, amilasa secretada) o transactivadores manipulados genéticamente, v.g. para marcadores de expresión o selección dependientes de macrólidos o estreptogramina. Aunque estos estudios tienen por objeto la expresión de proteínas terapéuticas potenciales en aplicaciones de terapia génica, solamente un pequeño número de genes con potencial terapéutico se mencionan en estos estudios (v.g. factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); la oncoproteína bcl-2). (Fussenegger et al., 1998; Hartenbach y Fussenegger, 2005; Kramer et al., 2003; Moser et al., 2000; Weber et al., 2005).
En relación con la expresión de receptores del gusto, existe un informe sobre la expresión dicistrónica de receptores del gusto en el ratón (mT2R8/5;mT1R3) fusionado cada uno con proteína fluorescente verde y enlazado por un elemento IRES a proteína fluorescente roja. Este enfoque se aplicó para rastrear y localizar el patrón de expresión de receptores del gusto en las neuronas (Sugita y Shiba, 2005).
Por consiguiente, el problema técnico que subyace en la presente invención consistía en proporcionar un sistema de cribado basado en células para moduladores de GPCRs, es decir establecer un método que haga posible identificar con éxito moduladores importantes de algunos GPCRs seleccionados, preferiblemente GPCRs del gusto de tipo T1R. Un problema ulterior subyacente en la presente invención consistió en proporcionar medios y métodos para el aislamiento de moduladores identificados sin un gravamen excesivo.
La solución a los problemas técnicos arriba mencionados se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.
Por tanto, realizaciones especialmente preferidas de la presente invención son medios y métodos para la expresión de GPCRs del gusto heterodímeros de tipo TR1, en los cuales la expresión de estos GPCRs del gusto heterodímeros de tipo TR1 se efectúa por modulación de las secuencias codificantes de los GPCR y su expresión en operones multicistrónicos.
El problema anterior puede resolverse sin embargo con facilidad sorprendente proporcionando un método para la identificación de moduladores de GPCRs, que comprende los pasos de:
a.
transformar células hospedadoras eucariotas con secuencias genéticas que codifican más de un GPCR(s), en donde esta transformación se realiza con un vector de expresión multicistrónico que comprende una unidad de expresión multicistrónica que comprende aguas abajo de un promotor para la expresión en un hospedador eucariota y enlazados funcionalmente al mismo, los cistrones siguientes:
i.
GPCR_{1}
ii.
GPCR_{2} y un
iii.
marcador de selección
b.
cultivar las células hospedadoras transformadas en condiciones suficientes para asegurar la expresión funcional de dichos GPCRs,
c.
poner en contacto la célula hospedadora cultivada que expresa GPCRs de una manera funcional con un modulador potencial de los GPCRs seleccionados,
d.
medir una respuesta celular específica por exposición de la célula hospedadora transformada al modulador potencial, y
e.
seleccionar un identificador, que induce una respuesta específica.
Dentro del contexto de la presente invención, el término "modulador de GPCRs" tiene por objeto significar una sustancia, que si se aplica in vivo, podría (a) desencadenar una respuesta intracelular por fijación del GPCR seleccionado o (b) podría inhibir dicha respuesta en presencia de un compuesto dulce. V.g., en el caso de receptores del sabor dulce tales como el GPCR seleccionado, este modulador podría ser una sustancia que tiene sabor dulce o que potencia el dulzor de un compuesto con sabor dulce sin ser dulce por sí misma, o que inhibe el dulzor de las sustancias dulces.
La expresión "condiciones suficientes para asegurar la expresión funcional" debe entenderse como un sumario de todas las condiciones necesarias para asegurar la expresión funcional de los GPCRs, más bien que condiciones de cultivo de células. En una realización preferida de la presente invención, este término se refiere al vector utilizado para transformación que es un vector tricistrónico. Adicionalmente, esta expresión abarca el cultivo de células que comprenden una proteína g funcional. En algunas circunstancias, la presión funcional del o de los GPCR(s) debe asegurarse.
Los términos "expresión funcional" o "expresión de manera funcional" significa dentro del contexto de la presente invención que el receptor seleccionado mantiene su capacidad para interaccionar específicamente con las mismas sustancias con las que interaccionaría el receptor cuando se encontrara en situación in vivo.
Por "respuesta celular seleccionada", deben entenderse v.g., cambios en los niveles intracelulares de calcio, los cuales pueden medirse fácilmente, v.g. por utilización de tintes tales como Calcium 3, Fura-2, Fluo-4, Indo-1 o la proteína informadora dependiente de calcio equorina. Está abarcada cualquier respuesta celular relacionada con la actividad de los GPCRs seleccionados. Ejemplos ulteriores de medición de la actividad de GPCRs son (i) la activación del segundo mensajero adenosina-monofosfato cíclico (cAMP), que puede cuantificarse en ensayos basados en células dependientes de GPCR con marcadores luminiscentes o con expresión de genes informadores dependientes de cAMP (v.g. luciferasa, SEAP o similares) o con la tecnología de los melanóforos, utilizando células de piel de rana; (ii) la medida de la fijación de \beta-arrestina al GPCR marcado después de activación inducida por ligandos del GPCR por medidas de transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET), o producción de imágenes de movimiento de \beta-arrestina marcadas con GFP; (iii) medida de la ocupación por agonistas de un GPCR y respectivamente la activación de la proteína G asociada, que puede cuantificarse por utilización del análogo radiactivo no hidrolizable de GTP, [35S]GTP\gammaS; (iv) el uso de ensayos de genes informadores controlados por elementos de respuesta para la lectura de caminos interconectados activados por GPCR, con inclusión de aquéllos que implican quinasas MAP, tirosina-quinasas no receptoras, tirosina-quinasas receptoras, fosfatidilinositol 3-quinasas y JNKs. (Eglen, 2005; Filmore, 2004; Milligan, 2003).
El término "identificador" está dirigido a un modulador potencial después de ser identificado como modulador real de GPCR o de la cascada de señalización específica de GPCR.
En una realización preferida, el método se caracteriza porque la célula hospedadora se selecciona del grupo constituido por: HEK293 (riñón de embrión humano), HeLa (carcinoma epiteloide de cérvix humano negroide), HT29 (adenocarcinoma de colon humano caucasiano grado II), A431 (carcinoma escamoso humano), IMR32 (neuroblastoma humano caucasiano ), K562 (leucemia mielógena humana caucasina crónica), U937 (linfoma histiocítico humano caucasiano), MDA-MB-231 (adenocarcinoma de mama humano caucasiano), SK-N-BE(2) (neuroblastoma humano caucasiano), SH-SY5Y (neuroblastoma humano), HL60 (leucemia humana promielocítica) o líneas de células eucariotas no humanas como CHO-K1 (ovario de hámster chino), COS-7 (riñón de mono verde africano, transformadas con SV40), S49 (linfoma de ratón), Ltk (tejido conectivo de ratón C34/an), NG108-15 (híbrido Neuroblastoma de ratón x Glioma de rata), B50 (tejido nervioso neuronal de rata, ECACC), C6 (tumor glial de rata), Jurkat (linfoblastos de células T de la leucemia humana), BHK (riñón de hámster sirio), Neuro-2a (neuroblastoma de ratón albino), NIH/3T3 (fibroblastos de embrión de ratón), preferiblemente HEK (riñón de embrión humano), HeLa (carcinoma epiteloide de cérvix humano negroide), CHO-K1 (ovario de hámster chino) o Neuro 2a (neuroblastoma de ratón albino).
Es esencial que la célula hospedadora exprese una proteína g funcional, preferiblemente G-alfa15, sea naturalmente o por medio de alteración genética de la célula hospedadora. Medios para alteración genética de células eucariotas son bien conocidos en la técnica, y no precisan ser expuestos en profundidad en este lugar. Las secuencias de DNA de proteínas G, v.g. G-alfa15 han sido ya descritas en la técnica.
Una realización ulterior preferida del método de la presente invención se caracteriza porque uno o más GPCR(s) se selecciona(n) del grupo constituido por los receptores del sabor T1R o T2R, preferiblemente un GPCR del tipo T1R, especialmente T1R1, T1R2 y/o T1R3.
Una realización adicionalmente preferida del método de la presente invención se caracteriza porque dos o más GPCRs se expresan en una co-expresión heteróloga de al menos dos GPCRs de tipo T1R diferentes, preferiblemente T1R1/T1R3, y más preferiblemente T1R2/T1R3.
Una realización adicionalmente preferida del método de la presente invención se caracteriza porque la transformación se realiza con un vector tricistrónico.
El vector de la presente invención es un vector de expresión. Por el término "vector de expresión" se entiende que el vector se utiliza para transformar una célula hospedadora eucariota seleccionada, que, después de la transformación, expresa el gen o genes codificados por dicho vector. Vectores de expresión pueden ser, v.g. vectores de clonación, vectores binarios o vector de integración. La expresión comprende transcripción de los ácidos nucleicos codificados en un mRNA funcional (susceptible de traducción). Por esta razón, los elementos de control respectivos deberían estar presentes, v.g. una secuencia que promueva la transcripción del mensajero (un promotor) y (opcionalmente) una señal de poliadenilación. Medios para la expresión de genes heterólogos en células eucariotas están muy bien
estudiados.
Para la propagación de tales vectores, usualmente se utilizan células procariotas tales como E. coli. Por esta razón, aunque los vectores de la presente invención están diseñados para trabajar como vectores de expresión en células eucariotas, los mismos llevan también elementos para propagación en células procariotas, v.g. un origen de replicación (ori) y un gen de resistencia a antibióticos, v.g. amp', kan' y similares. Medios para la propagación de vectores en procariotas son bien conocidos en la técnica.
Una lista de posibles vectores de expresión en eucariotas utilizables en la presente invención, y utilizables opcionalmente para la propagación en un hospedador procariota, y ya disponibles comercialmente comprende: pCR1000, pCDM8, pcDNA1, pcDNA1.1, pcDNA1/Amp, pcDNA1.1/Amp and pcDNA1/Neo, pcDNA3, pcDNA3.1, pCDNA3.2, pCDNA6.2, pDEST26, pDEST27, pCR3.1, pCDNA3.1 His, pDisplay (Invitrogen); pTriEx (pTriEx-2-Hygro) (Novagen); pSI, pCI (pCI-neo), pTargeT (Promega); pERV3, pFB-ERV, pCFB-EGSH, pDual, pCMV-Script (Stratagene); pNEBR (New England Biolabs), pEAK (Edge Biosystems).
Una realización preferida adicional del método de la presente invención se caracteriza porque el promotor es un promotor fuerte adecuado para uso en la célula hospedadora seleccionada, seleccionándose preferiblemente del grupo constituido por el promotor de citomegalovirus (P. CMV), el promotor del factor de elongación humano 1 alfa (P-E1\alpha), el promotor ubiquitina humano (P-ubi), el promotor del virus de los simios (P-SV40), el promotor de repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous (P-RSV-LTR) y similares, en donde el GPCR_{1} y el GPCR_{2} se seleccionan, independientemente uno de otro, del grupo constituido por los receptores de sabor T1R o T2R, preferiblemente del grupo de receptores T1R, y más preferiblemente una combinación de T1R1-T1R3 o T1R2-T1R3, en donde el marcador de selección se selecciona del grupo constituido por higromicina^{r}, zeocina^{r}, neomicina^{r}, blasticidina^{r}, o puromicina^{r}, y en donde tanto el GPCR1 como el GPCR2, así como el marcador de selección, están conectados funcionalmente por IRES interpuestos seleccionados del grupo constituido por IRES_{EMCV}, derivado del virus de la encefalomiocarditis (sinónimo: CITE_{EMCV}); IRES_{GTX,} derivado del mRNA del homeodominio GTX; IRES_{Rbm3}, derivado de Rbm3 inducible por frío; IRES_{PV}, derivado de origen polioviral, IRES_{RV}, derivado de rinovirus, IRESFMDV, derivado del virus de la fiebre aftosa; IRES_{HV}, derivado del virus de la hepatitis C, IRES_{CSFV}, derivado del virus de la fiebre porcina clásica, IRES_{BVDV}, derivado del virus de la diarrea viral de los bovinos; IRES_{FMLV}, derivado del mRNA gag del virus de la leucemia murina de Friend; IRES_{MMLV}, derivado del mRNA gag del virus de la leucemia murina de Moloney; IRES_{HIV}, derivado del mRNA env del virus de la inmunodeficiencia humana; IRES_{PSIV}, derivado del virus intestinal de Plautia stali; IRES_{RPV}, derivado del virus de Rhopalosiphum padi; IRES_{KSH}, derivado del herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi, preferiblemente el IRES_{EMCV} derivado del virus de la encefalomiocarditis (sinónimo: CITE_{EMCV}) y en donde la unidad de expresión multicistrónica está terminada por una señal de poliadenilación.
La expresión "ligado funcionalmente al mismo" significa, dentro del contexto de la presente invención, que los componentes descritos están ligados entre sí para funcionar de su manera propuesta.
Una realización adicional preferida del método de la presente invención se caracteriza porque el vector multicistrónico comprende adicionalmente una secuencia genética que codifica una proteína g o un equivalente de la misma, preferiblemente G-alfa15 o un equivalente de la misma, que está codificada como una unidad monocistrónica constituida por un promotor, el gen de la proteína g seleccionada y un sitio de poliadenilación.
Una realización preferida adicional del método de la presente invención se caracteriza porque el vector multicistrónico comprende adicionalmente una secuencia genética que codifica una proteína g o un equivalente de la misma, preferiblemente G-alfa15 o un equivalente de la misma, que está codificada como un cuarto cistrón en una disposición cuadricistrónica por la vía de un elemento IRES adicional.
Una realización preferida adicional del método de la presente invención se caracteriza porque el vector multicistrónico comprende adicionalmente una secuencia genética que codifica una proteína g o un equivalente de la misma, preferiblemente G-alfa15 o un equivalente de la misma, estando preferiblemente la proteína g fusionada en marco a GPCR_{1} y/o GPCR_{2} indicados anteriormente.
De acuerdo con la presente invención, pueden utilizarse proteínas G tales como G-alfa15 o G-alfa16 u otras proteínas G o variantes de proteína G promiscuas, o una proteína G endógena como gustducina, u otra proteína g que, cuando se expresa en asociación con el o los GPCR(s) codificados multicistrónicamente, produce una lectura funcional. Adicionalmente, pueden utilizarse también proteínas G-beta y G-gamma.
Sub-variantes de G-alfa15 y/o G-alfa16 con términos N modificados son también bien conocidas en la técnica, y pueden utilizarse análogamente.
Esencialmente cualquier compuesto químico puede emplearse como modulador o ligando potencial en los ensayos de acuerdo con la presente invención. Compuestos testados como moduladores de receptores acoplados a proteína G pueden ser cualquier compuesto químico o entidad biológica pequeño(a) (v.g., proteína, azúcar, ácido nucleico, lípido). Los compuestos de test serán típicamente moléculas químicas y péptidos pequeños. Generalmente, los compuestos utilizados como moduladores potenciales pueden disolverse en soluciones acuosas u orgánicas (v.g., basadas en DMSO). Los ensayos están diseñados para cribar grandes bibliotecas químicas por automatización de los pasos de ensayo y proporcionando compuestos de cualquier fuente conveniente. Los ensayos se realizan típicamente en paralelo, por ejemplo, en formatos de microtitulación en placas de microtitulación en ensayos robotizados. Existen muchos suministradores de compuestos químicos, que incluyen Sigma (St. Louis, Mo.), Aldrich (St. Louis, Mo.), Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo.), Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs, Suiza), por ejemplo. Asimismo, los compuestos pueden sintetizarse por métodos conocidos en la técnica.
Los denominados métodos de cribado de alta capacidad implican típicamente proporcionar una biblioteca química o peptídica combinatoria que contiene un gran número de compuestos terapéuticos potenciales (v.g., compuestos ligandos o compuestos moduladores). Tales bibliotecas químicas combinatorias o bibliotecas de ligandos se criban luego en uno o más ensayos para identificar aquellos miembros de la biblioteca (v.g., especies o subclases químicas particulares) que exhiben una actividad característica deseada. Los compuestos así identificados pueden servir como compuestos líder convencionales, o pueden ser utilizados en sí mismos como agentes terapéuticos potenciales o
reales.
Una biblioteca química combinatoria es una colección de diversos compuestos químicos generados por síntesis química o síntesis biológica, por combinación de cierto número de bloques de construcción químicos (es decir, reactivos tales como aminoácidos). Como ejemplo, una biblioteca combinatoria lineal, v.g. una biblioteca de polipéptidos o péptidos, se forma por combinación de una serie de bloques de construcción químicos de cualquier manera posible para una longitud de compuesto dada (es decir, el número de aminoácidos en un polipéptido o compuesto peptídico). Millones de compuestos químicos pueden sintetizarse por dicha mezcladura combinatoria de bloques de construcción químicos.
La preparación y el cribado de bibliotecas químicas combinatorias es bien conocida por quienes poseen experiencia en la técnica de que se trata. Las bibliotecas combinatorias incluyen, sin limitación, bibliotecas peptídicas (v.g. Pat. U.S. No. 5.010.175; Furka, 1991, Int. J. Pept. Prot. Res., 37:487-493; y Houghton et al., 1991, Nature, 354:84-88). Pueden utilizarse también otros tipos de química para generación de bibliotecas de diversidad química. Ejemplos no limitantes de químicas de biblioteca de densidad química incluyen, péptidos (publicación PCT No. WO 91/019735), péptidos codificados (publicación PCT No. WO 93/20242), bio-oligómeros aleatorios (publicación PCT No. WO 92/00091), benzodiazepinas (Pat. U.S. No. 5.288.514), diversómeros tales como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6909-6913), polipéptidos vinílogos (Hagihara et al., 1992, J. Amer. Chem. Soc., 114:6568), peptidomiméticos no peptídicos con entramado de glucosa (Hirschmann et al., 1992, J. Amer. Chem. Soc., 114:9217-9218), síntesis orgánica análoga de bibliotecas de compuestos pequeñas (Chen et al., 1994, J. Amer. Chem. Soc., 116:2661), oligocarbamatos (Cho et al., 1993, Science, 261:1303),y/o peptidil-fosfonatos (Campbell et al., 1994, J. Org. Chem., 59:658), bibliotecas de ácidos nucleicos (véase Ausubel, Berger y Sambrook, citados todos ellos anteriormente), bibliotecas de ácidos nucleicos peptídicos (Pat. U.S. No. 5.6539.083), bibliotecas de anticuerpos (v.g., Vaughn et al., 1996, Nature Biotechnology, 14(3):309-314) y Publicación PCT No. WO97/00271 A), bibliotecas de carbohidratos (v.g., Liang et al., 1996, Science, 274, 1520-1522) y Pat. U.S. No. 5.593.853), bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas (benzodiazepinas, Baum C&EN, Ene. 18, 1993, página 33; y Pat. U.S. No. 5.288.514; isoprenoides, Pat. U.S. No. 5.569.588; tiazolidinonas y metatiazanonas, Pat. U.S. No. 5.549.974; pirrolidinas, Pat. U.S. Núms. 5.525.735 y 5.519.134; compuestos de tipo morfolino, Pat. U.S. No. 5.506.337; y análogos).
Dispositivos para la preparación de bibliotecas combinatorias están disponibles comercialmente (v.g., 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville Ky.; Symphony, Rainin, Woburn, Mass.; 433A Applied Biosystems, Foster City, Calif.; 9050 Plus, Millipore, Bedford, Mass.). Adicionalmente, un gran número de bibliotecas combinatorias están disponibles comercialmente (v.g., ComGenex, Princeton, N.J.; Asinex, Moscú, Rusia; Tripos, Inc., St. Louis, Mo.; ChemStar, Ltd., Moscú, Rusia; 3D Pharmaceuticals, Exton, Pa.; Martek Biosciences, Columbia, Md., y análogos).
En una realización, la invención proporciona ensayos in vitro basados en fase sólida en un formato de alta capacidad, en donde la célula o tejido que expresa un canal iónico está unida a un sustrato en fase sólida. En tales ensayos de alta capacidad, es posible cribar hasta varios miles de moduladores o ligandos diferentes en un solo día. En particular, cada pocillo de una placa de microtitulación puede utilizarse para realizar un ensayo separado contra un modulador potencial seleccionado, o bien, si deben observarse efectos de concentración o de tiempo de incubación, cada 5-10 pocillos pueden testar un solo modulador. Así, una placa de microtitulación estándar simple puede ensayar aproximadamente 96 moduladores. Si se utilizan placas de 1536 pocillos, entonces una sola placa puede ensayar con facilidad desde aproximadamente 100 a aproximadamente 1500 compuestos diferentes. Es posible ensayar varias placas diferentes en un solo día; así, por ejemplo, son posibles cribados de ensayo de hasta aproximadamente 6.000-20.000 compuestos diferentes utilizando los sistemas integrados descritos.
En otro aspecto, la presente invención abarca ensayos de cribado y detección de moléculas pequeñas (v.g. fármacos) que implican la detección o identificación de moléculas pequeñas que pueden fijarse a una proteína dada, es decir, un polipéptido o péptido receptor del gusto. Se prefieren particularmente ensayos adecuados para metodologías de cribado de alta capacidad.
En dichos ensayos de detección, identificación o cribado basados en aglutinación, no se requiere típicamente un ensayo funcional. Todo lo que se necesita es una proteína diana, con preferencia purificada sustancialmente, y una biblioteca o panel de compuestos (v.g., ligandos, fármacos, moléculas pequeñas) o entidades biológicas a cribar o ensayar respecto a la aglutinación con la proteína diana. Preferiblemente, la mayoría de las moléculas pequeñas que se fijan a la proteína diana modularán la actividad de algún modo, debido a afinidad de fijación preferencial y mayor a áreas o sitios funcionales en la proteína.
Un ejemplo de un ensayo de este tipo es el ensayo de desplazamiento térmico basado en fluorescencia ((3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc., 3DP, Exton, Pa.) como se describe en Pat. U.S. Núms. 6.020.141 y 6.036.920 otorgadas a Pantoliano et al.; véase también J. Zimmerman, 2000, Gen. Eng. News, 20(8)). El ensayo permite la detección de moléculas pequeñas (v.g., fármacos, ligandos) que se fijan a polipéptidos de canales iónicos expresados, y preferiblemente purificados, basados en determinaciones de afinidad de fijación por análisis de curvas de despliegue térmico de complejos proteína-fármaco o ligando. Los fármacos o moléculas de fijación determinados por esta técnica pueden ensayarse ulteriormente, en caso deseado, por métodos, tales como los descritos en esta memoria, a fin de determinar si las moléculas afectan o modulan la función o actividad de la proteína diana.
Compuestos que son identificados de acuerdo con los métodos proporcionados en esta memoria, y que modulan o regulan la actividad biológica o la fisiología de los polipéptidos T1R de acuerdo con la presente invención son una realización preferida de esta invención. Se contempla que tales compuestos moduladores pueden emplearse como se ha indicado anteriormente.
Ensayos que pueden utilizarse con uno o más T1Rs de acuerdo con la invención incluyen a modo de ejemplo ensayos que utilizan una selección genética para células vivas; ensayos que utilizan células enteras o fragmentos de membrana o proteínas receptoras de sabor purificadas; ensayos que utilizan segundos mensajeros tale como cAMP e IP3, ensayos que detectan la translocación de arrestina a la superficie celular, ensayos que detectan la pérdida de expresión de receptores en la superficie celular (internalización) por ligandos testados, ensayos directos de fijación de ligandos, ensayos de fijación competitiva con inhibidores, ensayos que utilizan proteínas traducidas in Vitro, ensayos que detectan cambios de conformación respecto a la fijación de un ligando (v.g., como se evidencia por proteólisis, fluorescencia o NMR), ensayos de comportamiento que utilizan animales transgénicos no humanos que expresan un GPCR de sabor o una combinación de los mismos, tales como moscas, gusanos, o ratones, ensayos que utilizan células infectadas con virus recombinantes que contienen genes GPCR de sabor, que miden preferiblemente el cambio en los niveles de calcio intracelulares con relación a los niveles de calcio intracelulares sin poner en contacto la célula con el modulador.
Una realización preferida adicional del método de la presente invención se caracteriza porque el cambio es un aumento.
Una realización preferida adicional del método de la presente invención se caracteriza porque el cambio es un aumento con relación a los niveles de calcio intracelulares cuando la célula está en contacto con un modulador en la presencia de un compuesto dulce intensificando con ello el nivel de calcio por encima del nivel generado por el compuesto dulce solo. En este caso, el modulador puede ser dulce por sí mismo o ser un compuesto insípido que no tiene un potencial bioactivo para activar T1Rs o combinaciones de los mismos por sí mismo. El compuesto dulce se selecciona preferiblemente del grupo constituido por glucosa, fructosa, sacarosa, acesulfamo K, sacarina, ciclamato, aspartamo, xilitol, esteviósido, sucralosa, taumatina, monelina, brazzeína, perillartina, glicirricina, ácido sucrónico, P-4000, SC45647, NC174, neohesperidina y aminoácidos de sabor dulce, seleccionados más preferiblemente del grupo constituido por glucosa, fructosa, sacarosa o xilitol.
Una realización preferida adicional del método de la presente invención se caracteriza porque el cambio es una disminución con relación a los niveles intracelulares de calcio cuando la célula se pone en contacto con un compuesto dulce en lugar del modulador, seleccionándose preferiblemente el compuesto dulce del grupo no exhaustivo constituido por glucosa, fructosa, sacarosa, acesulfamo K, sacarina, ciclamato, aspartamo, xilitol, esteviósido, sucralosa, taumatina, monelina, brazzeína, perillartina, glicirricina, ácido sucrónico, P-4000, SC45647, NC174, neohesperidina y aminoácidos de sabor dulce.
Otra realización preferida adicional de la presente invención son moléculas de ácido nucleico que codifican un T1R1, T1R2 o T1R3, representándose la secuencia en SEQ ID NOs. 3 y 4.
Dentro del contexto de la presente invención, proteínas funcionalmente equivalentes tienen la misma función o una función muy similar in vivo. Preferiblemente, las proteínas funcionalmente equivalentes comparten al menos 60%, más preferiblemente al menos 80%, especialmente al menos 90%, ventajosamente al menos 99% de identidad en su secuencia de aminoácidos.
Un ácido nucleico funcionalmente equivalente codifica una proteína funcionalmente equivalente y está optimizado para expresión en una célula eucariota. De acuerdo con una optimización multiparamétrica, el uso de codones se adaptó al sesgo de codones de genes de Homo sapiens. Adicionalmente, se han evitado regiones de contenido muy alto (>80%) o muy bajo (<30%) de GC siempre que ha sido posible. Durante el proceso de optimización se evitaron los motivos de secuencia con acción cis siguientes:
a)
secuencias TATA internas, sitios chi y sitios de entrada de ribosoma
b)
tramos de secuencia ricos en AT o ricos en GC
c)
elementos de secuencia ARE, INS, CRS
d)
secuencias de repetición y estructuras secundarias de RNA, así como
e)
sitios donantes y aceptores de remodelación (crípticos), y puntos de ramificación.
El proceso de optimización, partiendo de las secuencias de tipo salvaje humanas (wt_hT1R) reveló varias secuencias; sorprendentemente, las secuencias que ofrecían la eficiencia óptima (sh_T1R) en la generación de líneas de células funcionales estables sobre la base del enfoque de expresión multicistrónico no eran aquéllas que tenían la secuencia teóricamente óptima (opt_hT1R) ni las secuencias de tipo salvaje. Las diferencias de las secuencias aquí citadas como ejemplos se ilustran como una alineación filogenética (generada por el software bioinformático Clustal X) con una matriz de distancia relativa acompañante en la Figura 1.
Una realización muy preferida de la presente invención son vectores de expresión multicistrónicos que comprenden más de un cistrón que codifica un GPCR.
Dicho vector de expresión multicistrónico comprende preferiblemente aguas abajo de un promotor para la expresión en una célula hospedadora eucariota y enlazado funcionalmente al mismo, los cistrones siguientes:
a.
GPCR_{1}
b.
GPCR_{2} y un
c.
marcador de selección,
en donde el promotor es preferiblemente un promotor fuerte, seleccionándose más preferiblemente del grupo constituido por el promotor de citomegalovirus (P-CMV), el promotor del factor de elongación humano 1-alfa (P-E1\alpha), el promotor ubiquitina humano (P-ubi), el promotor del virus de los simios (P-SV40), el promotor de la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous (P-RSV-LTR) y similares en donde el GPCR_{1} y el GPCR_{2} se seleccionan, independientemente uno de otro, del grupo constituido por los receptores de sabor T1R o T2R, preferiblemente del grupo de receptores T1R, más preferiblemente una combinación de T1R1-T1R3 o T1R2-T1R3, y en donde el marcador de selección se selecciona del grupo constituido por higromicina^{r}, zeocina^{r}, neomicina^{r}, blasticidina^{r} o puromicina^{r}, y en donde tanto el GPCR1 como el GPCR2, así como el marcador de selección están conectados funcionalmente por IRES interpuestos seleccionados del grupo constituido por IRES_{EMCV}, derivado del virus de la encefalomiocarditis (sinónimo: CITE_{EMCV}); IRES_{GTX}, derivado del mRNA del homeodominio GTX; IRES_{Rbm3}, derivado de Rbm3 inducido por frío; IRES_{pv}, derivado de origen polio-viral, IRES_{RV}, derivado de rinovirus, IRES_{FMDV}, derivado del virus de la fiebre aftosa; IRES_{HV}, derivado del virus de la hepatitis C, IRES_{CSFV}, derivado del virus de la fiebre porcina clásica, IRES_{BVDV}, derivado del virus de la diarrea viral de los bovinos; IRES_{FMLV}, derivado del mRNA gag del virus de la leucemia murina de Friend; IRES_{MMLV}, derivado del mRNA gag del virus de la leucemia murina de Moloney; IRES_{HIV}, derivado del mRNA env del virus de la inmunodeficiencia humana; IRES_{PSIV}, derivado del virus intestinal de Plautia stali; IRES_{RPV}, derivado del virus de Rhopalosiphum padi; IRES_{KSH}, derivado del herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi, preferiblemente el IRES_{EMCV}, derivado del virus de la encefalomiocarditis (sinónimo: CITE_{EMCV}) y en donde la unidad de expresión multicistrónica está terminada por una señal de poliadenila-
ción.
Otra realización preferible de la presente invención es un vector multicistrónico como se ha definido arriba, comprendiendo el vector adicionalmente un cistrón que codifica una proteína G, preferiblemente G-alfa15, estando localizada preferiblemente la proteína g entre el último GPCR y el marcador de selección, y estando conectada funcionalmente a ambos por un elemento IRES como se ha definido arriba.
Una realización preferida adicional son líneas de células transformadas con los vectores de la presente invención. Líneas de células eucariotas respectivas son células de anfibio, gusano, insecto o mamífero tales como CHO, HeLa, Hek-293 y análogas, v.g. células cultivadas, explantes, y células in vivo.
Preferiblemente, la célula hospedadora se selecciona del grupo constituido por: HEK293 (riñón de embrión humano), HeLa (carcinoma epiteloide de cérvix humana negroide), HT29 ((adenocarcinoma de colon humano caucasiano grado II), A431 (carcinoma escamoso humano), IMR32 (neuroblastoma humano caucasiano), K562 (leucemia mielógena humana caucasina crónica), U937 (linfoma histiocítico humano caucasiano), MDA-MB-231 (adenocarcinoma de mama humano caucasiano), SK-N-BE(2) (neuroblastoma humano caucasiano), SH-SY5Y (neuroblastoma humano), HL60 (leucemia humana promielocítica) o líneas de células eucariotas no humanas como CHO-K1 (ovario de hámster chino), COS-7 (riñón de mono verde africano, transformadas con SV40), S49 (linfoma de ratón), Ltk (tejido conectivo de ratón C34/An), NG108-15 (híbrido Neuroblastoma de ratón x Glioma de rata), B50 (tejido nervioso neuronal de rata, ECACC), C6 (tumor glial de rata), Jurkat (linfoblastos de células T de la leucemia humana), BHK (riñón de hámster sirio), Neuro-2a (neuroblastoma de ratón albino), NIH/3T3 (fibroblastos de embrión de ratón), preferiblemente HEK (riñón de embrión humano), HeLa (carcinoma epiteloide de cérvix humano negroide), CHO-K1 (ovario de hámster chino) o Neuro 2a (neuroblastoma de ratón albino).
Adicionalmente, realizaciones preferidas de la presente invención son los moduladores de GPCRs identificables por los métodos de la presente invención y caracterizados adicionalmente por estar seleccionados del grupo constituido por azúcares, esteroides, taninos y lignanos, terpenos, quinonas, macrociclos, heterociclos, N-heterociclos y O-heterociclos, alifáticos y poliquétidos, flavonoides, proteínas, péptidos y aminoácidos, alcaloides y arenos, como se ha indicado arriba.
Las intensas investigaciones de los autores de la presente invención que condujeron al establecimiento del método de la presente invención demostraron que la co-expresión recombinante de dichos receptores de sabor como integrantes estables de células hospedadoras eucariotas se ve dificultada por una inestabilidad común. Aunque el fenómeno está lejos de ser comprendido, podría ser posible que la expresión y transducción de señales específica de estos receptores de tipo T1R interfiera de manera negativa con la fisiología celular de dichas células hospedadoras estables.
Dentro del contexto de la presente invención, una integración inestable se caracteriza por una pérdida rápida de funcionalidad dentro de los primeros 10 pasos de un clon de la línea de células recombinante seleccionada. Dentro de estos primeros diez pasos, resulta evidente que cada vez más células de un clon recombinante seleccionado liberan su expresión característica funcional del GPCR de sabor, lo que viene indicado por una disminución progresiva dependiente del paso de las inducciones de calcio inducidas por edulcorantes (medidas Fluo-4). En contraste, los integrantes estables de la presente invención se caracterizan porque exhiben una expresión funcional de dichos receptores de sabor al menos a lo largo de 50 pasos, lo que está indicado por inducciones estables de calcio inducidas por edulcorantes estables (medidas Fluo-4) con un clon seleccionado de una línea de células que expresan receptores de
sabor.
Como queda claro por la presente memoria descriptiva de la invención, el uso y la expresión hetero-oligómera de las combinaciones de receptores del gusto T1R1/T1R3 y más preferiblemente T1R2/T1R3 para identificar compuestos como moduladores del sabor dulce en el campo de los saborizantes son realizaciones especialmente preferidas de la presente invención.
De acuerdo con ello, esta invención se refiere a GPCRs de tipo T1R manipulados genéticamente de modo recombinante que tienen actividad en ensayos de saborizantes basados en células, que pueden obtenerse por (a) mejora de la secuencia codificante de los receptores de sabor dulce humanos (T1Rs) y/o (b) clonación de los mismos en una unidad de expresión multicistrónica para expresión coordinada y selección simultanea para la generación de sistemas de células eucariotas estables; y/o (c) marcación de uno o ambos GPCRs en el complejo de expresión heterodímero con proteínas G o quimeras de proteínas G para hacer posible una lectura mejorada de fluorescencia con objeto de la identificación de moduladores GPCR, preferiblemente compuestos moduladores de sabor
dulce.
Secuencias de receptores aplicadas para la invención aquí presentada se ilustran adicionalmente en el Ejemplo 1. Por adición de un prefijo, los receptores optimizados han sido designados shT1R2 y shT1R3. Las secuencias respectivas de aminoácidos se representan en SEQ ID Nos. 1 y 2, y las secuencias de ácido nucleico respectivas en SEQ ID Nos. 3 y 4.
Un medio adicional de la presente invención para resolver la inestabilidad de los GPCRs co-expresados, preferiblemente los receptores de sabor T1R2 y T1R3 en el desarrollo de líneas de células estables es la construcción de unidades de transcripción multicistrónicas. El método para obtener un vector de expresión multicistrónico para la expresión simultánea de receptores de sabor y un marcador de selección de la invención se ilustra adicionalmente en el Ejemplo 2. Como se ha indicado anteriormente, el desarrollo de líneas de células estables que expresan T1R2/T1R3, v.g. Hek293, CHO o Hela en cuanto a su uso en sistemas de ensayo basados en células se ve dificultado por inestabilidades resultantes dentro del proceso de cultivo de células eucariotas en curso y los números de pasos. Para la generación de líneas de células estables en la técnica, se utilizan en la mayoría de los casos vectores de expresión en los cuales el marcador de selección, que confiere resistencia a v.g., neomicina, higromicina, zeocina, blasticidina o puromicina, está codificado de hecho en el mismo vector plasmídico bajo el control de un promotor
independiente.
Esta situación puede evitarse si los receptores y el marcador de selección están codificados en una unidad de transcripción multicistrónica.
Sin embargo, hasta ahora se han descrito vectores de expresión multicistrónicos únicamente para uso de expresión inducible de proteínas, v.g. para aplicaciones de terapia génica (Fussenegger et al., 1998; Moser et al., 2000).
Para la presente invención, los dos receptores de sabor shT1R2 y shT1R3 han sido clonados en la posición primera y segunda de una unidad de expresión tricistrónica, en tanto que el gen que confiere resistencia al marcador de selección blasticidina se clonó en la tercera posición de la unidad de expresión. La unidad tricistrónica se encuentra bajo el control del promotor del factor de elongación humano fuerte 1-alfa y los genes en la segunda y tercera posiciones están precedidos por un elemento IRES para facilitar la iniciación de su traducción en el mRNA resultante.
Hasta ahora, no se ha descrito un sistema de expresión multicistrónico de 8 kb para la expresión funcional estable de GPCRs localizados en la membrana. Usualmente estos sistemas multicistrónicos - ya en expresiones de productos génicos mucho más pequeños como proteínas fluorescentes - se caracterizan por una expresión no estequiométrica y decreciente con la distancia incrementada del promotor. Dado que los GPCRs de sabor excedían notablemente del tamaño de la GFP o de los genes utilizados hasta ahora en sistemas de expresión tri- o cuadricistrónicos; y por el hecho de que los GPCRs tienen que co-expresarse para formar un complejo proteínico heterodímero a fin de funcionar como receptores sensibles a los edulcorantes, fue un resultado imprevisible y sorprendente de las intensas investigaciones que condujeron a la presente invención que únicamente el uso de vectores multicistrónicos, es decir vectores tri- o tetracistrónicos conduzca a resultados satisfactorios en el establecimiento del método de cribado de la presente invención.
En una realización adicional, esta invención se refiere a métodos que utilizan el vector de expresión multicistrónico mencionado anteriormente para crear líneas de células estables adecuadas para expresar polipéptidos T1R a fin de construir una herramienta de cribado basada en células para la búsqueda de nuevos compuestos en el campo de los moduladores del sabor dulce. Preferiblemente, las células comprenden una proteína G funcional, v.g., G-alfa-15, G-alfa-16 o una proteína G quimérica como las identificadas previamente con término C alterado:
a)
sustitución de los últimos cinco aminoácidos de G-alfa-15:
\quad
G-alfa_15 (EINLL), reemplazado con EYNLV (G-alfa q y G-alfa 11), EFNLV (G-alfa 14), QYELL (G-alfa s y G-alfa olf), DCGLF (G-alfa i1, G-alfa i2, G-alfa t1, G-alfa t2, y G-alfa gust), ECGLY (G-alfa i3), GCGLY (G-alfa ol y G-alfa o2), YIGLC (G-alfa z), DIMLQ (G-alfa 12), QLMLQ (G-alfa 13) o G-alfa 16 reemplazado con ECGLY (G-alfa 16 i3)
b)
sustitución de los cuarenta y cuatro últimos aminoácidos carboxi-terminales de G-alfa-16:
\quad
G-alfa 16gust44 (44 aminoácidos de la proteína G gustducina) G-alfa 16z44 (44 aminoácidos de G-alfa-z); G-alfa 16C44i2 (44 aminoácidos de la G-alfa-i2); G-alfa 16C44i3 (44 aminoácidos de la G-alfa-i3);
u otra proteína G que es capaz de acoplar el receptor quimérico a un camino de señalización intracelular o a una proteína de señalización tal como fosfolipasa C. (Li et al., 2002; Offermanns, 2003; Offermanns y Simon, 1995; Ueda et al., 2003). Para este propósito, células HEK 293 que comprenden una proteína G funcional se han transfectado con el vector pTrix-Eb_R2R3, cultivado en presencia de blasticidina, y se han seleccionado líneas de células estables. Como se muestra en el Ejemplo 3, se ha encontrado que tales células exhiben respuestas a estímulos de sabor y adicionalmente estas líneas de células tienen - comparadas con las derivadas de vectores de expresión T1R monocistrónicos - una expresión estable intensificada de los polipéptidos T1R. Una línea de células estable basada en el vector de expresión pTrix-Eb_R2R3 (véase el Ejemplo 3) exhibe respuestas de calcio a diversos edulcorantes artificiales y una proteína edulcorante natural. Estas respuestas pueden medirse todavía después de más de 50 pasos del clon objeto de selección con blasticidina y G418. Tales resultados no podían alcanzarse con expresiones monocistrónicas o bicistrónicas. Los resultados de RT-PCR de clones monocistrónicos revelaron la pérdida de ambos receptores con los cinco a diez pasos iniciales en condiciones de selección. La línea de células estable HEK_Ga15#17R2R3b #8 exhibe también respuestas de calcio dependientes de la dosis para los saborizantes dulces arriba indicados, correlacionadas con las respuestas de sabor fisiológicas.
Un efecto inesperado adicional es que estas líneas de células que expresan receptores de sabor multicistrónicos estables son muy adecuadas para cribado de compuestos naturales utilizando preparaciones de extractos microbianos complejas. Para el aislamiento y la preparación de tales muestras de cribado complejas pueden aplicarse métodos microbianos estándar que abarcan el cultivo de microorganismos. Metabolitos bioactivos de interés de tales cultivos pueden incluir moléculas intracelulares así como las secretadas en los medios de cultivo. Dependiendo del número de muestras a procesar, puede hacerse generalmente una elección entre diferentes opciones: (i) calentamiento del caldo total; (ii) filtración del sobrenadante de caldo a través de un filtro de expresión de peso molecular alto con liofilización subsiguiente del filtrado; (iii) extracción del caldo entero (tratamiento por ultrasonidos, prensa francesa, bombas de disgregación de células o dispositivos similares) o el sobrenadante del caldo con disolventes orgánicos de polaridad variable (v.g. cloroformo, acetona, metanol o acetato de etilo) seguido por evaporación de los extractos a sequedad; (iv) mezcla del caldo total o el sobrenadante del caldo con resinas (v.g. Amberlite®, XAD-2, XAD-4, XAD-9 o similar) con extracción subsiguiente en fase sólida con disolventes orgánicos (v.g. acetona, ácido acético, butanol, etanol, acetato de etilo, metanol, poliglicoles o similares), sea fraccionados por aplicación de concentraciones crecientes de disolvente o como lote total por aplicación del disolvente puro sin fraccionamiento. Los extractos en fase sólida pueden utilizarse directamente en sistemas de ensayo adecuados o evaporarse ulteriormente a sequedad y resolverse en condiciones normalizadas para testado subsiguiente, v.g. la activación de receptores del sabor en ensayos basados en células. La activación de los receptores T1R en tales células puede detectarse utilizando métodos estándar cualesquiera, por ejemplo por detección de cambios en el calcio intracelular detectando la fluorescencia dependiente de Fluo-4 en la célula. Un ensayo de este tipo es la base de los descubrimientos experimentales presentados en esta solicitud.
De manera similar, pueden utilizarse también extractos de plantas bien conocidos por los expertos.
En la Figura 3, se representa la actividad de una línea de células estable derivada con el plásmido de expresión multicistrónico Ptrix-Eb-R2R3 en un fondo de proteína G G-alfa15. Los datos de la Figura 3 documentan que estas líneas de células, entre varias otras líneas de células aisladas, muestran actividad dependiente de T1R2/T1R3 en ensayos basados en células frente a varios saborizantes como ciclamato, D-fenilalanina, sacarina, acesulfamo K, aspartamo y taumatina.
En una realización adicional, esta invención se refiere al uso de genes de fusión T1R-proteína G para el desarrollo de ensayos basados en células dependientes de T1R. Se ha demostrado que los GPCRs pueden fusionarse en marco con diferentes polipéptidos sin disminución de su actividad funcional (Milligan et al., 2003). A partir de los presentes datos no puede preverse que una fusión de una proteína G funcional con cualquier GPCR conduzca a una actividad mejorada comparada con la situación no fusionada de tipo salvaje. No obstante, se ha programado el desarrollo de proteínas de fusión con T1R2 y/o T1R3 en las cuales el T1R-GPCR está fusionado a una proteína G funcional que es capaz de conectar la señalización dependiente de T1R con los caminos de inducción de calcio utilizados para medida de la actividad dependiente de T1R en ensayos basados en células como se ilustra en el Ejemplo 3. Preferiblemente, las proteínas de fusión con T1R comprenden una proteína G funcional, v.g. proteína G-alfa-15 o proteína G quimérica como las identificadas previamente, u otra proteína G que es capaz de acoplar el receptor quimérico a un camino de señalización intracelular o a una proteína de señalización tal como fosfolipasa C. (Offermanns, 2003; Offermanns y Simon, 1995; Ueda et al., 2003). Para el desarrollo de tales ensayos basados en células, las proteínas de fusión se subclonarán en la cadena principal del vector de expresión multicistrónico conduciendo al vector de expresión del tipo pTrix-Eb-R2Gq-R3 representado en la Figura 4.
Las figuras muestran:
Figura 1: Alineación bioinformática con software Clustal X: Se presentan diferentes secuencias de nucleótidos GPCR de la clase T1R en un análisis de alineación. Se representan secuencias de cDNA humano de tipo salvaje como wt_hT1Rs; las secuencias de cDNA teóricamente más optimizadas después de la optimización multiparamétrica se representan como opt_hT1Rs; los cDNAs parcialmente optimizados utilizados para desarrollo de líneas de células estables se designan sh_T1Rs. Las alineaciones de nucleótidos se presentan como árboles filogenéticos en los cuales se definió como grupo extraño wt_T1R1. La matriz de distancia subyacente se muestra abajo.
Figura 2: Vector de expresión eucariota mulcistrónico pTrix-Eb-R2R3: La expresión de los genes receptores de sabor shT1R2, shT1R3 y el gen de blasticidin-S-desaminasa (bsd) se encuentran bajo el control del promotor del factor de elongación humano 1-alfa (PEF1a). Para conferir expresión multicistrónica al nivel de traducción se han insertado dos sitios de entrada de ribosoma internos (Cite I y Cite II). La unidad multicistrónica está terminada por un sitio de poliadenilación del virus 40 de los simios. El origen de replicación procariota (ori) y el gen de resistencia a kanamicina sirven para la propagación, amplificación y selección del vector plasmídico en E. coli.
Figura 3: El HEK_Ga15#17R2R3b #8 estable se seleccionó con blasticidina y G418 después de transfección del HEK_Ga15#17 estable (G418) con pTriX_Eb_R2R3. Esta expresión tricistrónica era necesaria para la selección y recuperación de clones estables. El clon #8 exhibe respuestas de calcio a varios edulcorantes artificiales y una proteína edulcorante natural.
Figura 4: Vector de expresión eucariota multicistrónico pTrix-Eb-R2R3: La expresión de los genes receptores de sabor shT1R2-Gq, shT1R3 y el gen de blasticidin-S-desaminasa (bsd) se encuentran bajo el control del promotor del factor de elongación humano 1-alfa (PF1a). Para conferir expresión multicistrónica al nivel de traducción se han insertado dos sitios de entrada ribosómicos internos (Cite I y Cite II). La unidad multicistrónica está terminada por un sitio de poliadenilación del virus 40 de los simios. El origen de replicación procariota (ori) y el gen de resistencia a la kanamicina sirven para la propagación, amplificación y selección del vector plasmídico en E. coli.
Materiales y métodos experimentales Cultivo de células
Transfección/selección transitoria de células HEK293 estables - Pueden realizarse transfecciones transitorias y estables con complejos lipídicos tales como precipitación con fosfato de calcio, reactivo Lipofectamina/PLUS (Invitrogen), Lipofectamina 2000 (Invitrogen) o MIRUS TransIT293 (Mirus Bio Corporation) de acuerdo con los manuales. La electroporación puede ser también un método de elección para transfección estable de células eucariotas.
Las células se siembran en placas de 6 pocillos a una densidad de 4 x 10^{5} células/pocillo. Se transfectan células HEK293 con plásmidos linealizados para expresión estable de los genes de interés. Después de 24 horas, comienza la selección seleccionando reactivos tales como zeocina, higromicina, neomicina o blasticidina. Se siembran aproximadamente 50 \mul a 300 \mul de células tripsinizadas transfectadas desde un 6 pocillos (sic) en una cápsula de 100 mm y se añade el antibiótico necesario en una concentración apropiada. Las células se cultivan hasta que son visibles los clones en la placa de cultivo de células de 100 mm. Estos clones se seleccionan para cultivo ulterior y obtención de imágenes de calcio. Son necesarias aproximadamente 4 a 8 semanas para seleccionar los clones de células que expresan de manera estable los genes de interés.
Obtención de imágenes de calcio
Ensayo Fluo-4 AM con células HEK293 estables - Se mantienen células estables en medio DMEM rico en glucosa (Invitrogen) complementado con 10% de suero bovino fetal (Biochrom) y L-glutamina 4 mM (Invitrogen). Las células para obtención de imágenes de calcio se mantienen en medio DMEM pobre en glucosa complementado con 10% de FBS y 1x Glutamax-1 (Invitrogen) durante 48 horas antes de la siembra. Estas células estables se tripsinizan después de 48 horas (sea con tripsina-EDTA, Accutase o TrypLE) y se siembran sobre placas de ensayo de 96 pocillos recubiertas con poli-D-lisina (Corning) a una densidad de 45.000 células/pocillo en medio DMEM pobre en glucosa complementado con 10% de FBS y 1x Glutamax-1.
Al cabo de 24 horas, se cargaron las células en 100 \mul de medio con 100 \mul adicionales de Fluo-4 4\muM (tinte sensible al calcio, concentración final 2 \muM; Molecular Probes) en tampón Krebs-HEPES (KH) durante una hora. El reactivo de carga se reemplaza luego por 80 \mul de tampón KH por pocillo. El tampón Krebs-HEPES es una solución salina fisiológica que incluye CaCl_{2} 1,2 mM, NaHCO_{3} 4,2 mM y HEPES 10 mM.
Las células estables cargadas con tinte en placas se pusieron en una placa de microtitulación de fluorescencia para monitorizar el cambio de la fluorescencia (excitación 488 nm, emisión 520 nm) después de la adición de 20 \mul de tampón KH complementado con 5x saborizantes. Para cada traza, el saborizante se añadió 11,5 segundos después del comienzo del escaneo y se mezcló dos veces con el tampón, se continuó el escaneo durante 32 segundos más, y se recogieron los datos cada segundo.
Análisis de los datos/Registro de los datos - Se cuantificó la movilización del calcio como el cambio de fluorescencia pico (\DeltaF) por encima del nivel de la línea base (F). Los datos se expresaron como el error estándar (E.E) medio del valor \DeltaF/F de muestras independientes replicadas. El análisis se realizó con el software del lector de placas de microtitulación.
Ejemplos
Los ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar realizaciones preferidas de la invención. En las secuencias de DNA presentadas en esta memoria, los códigos de una sola letra N o n se refieren a cualquiera de las cuatro bases nucleotídicas comunes, A, T, C o G. En las secuencias de proteínas presentadas en esta memoria, el código de una sola letra X o Xaa se refiere a cualquiera de los veinte residuos de aminoácidos comunes.
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Ejemplo 1
Síntesis y diseño de cDNAs sintéticos hT1R2 y hT1R3 sin intrones
Las secuencias de nucleótidos de los receptores humanos hT1R2 y hT1R3 están basadas en sus DNAs codificantes de tipo salvaje y han sido optimizadas de acuerdo con un análisis multiparamétrico considerando uso óptimo de codones, sitios de remodelación crípticos supuestos, secuencias repetidas supuestas así como tramos de secuencia ricos en AT o ricos en GC. La optimización de genes tiene a menudo efectos favorables sobre la estabilidad mejorada del mRNA, eficiencia de traducción y estructura secundaria reducida del RNA a fin de prevenir la pausa en la transcripción o la terminación prematura del alargamiento de transcripción.
Hasta ahora, se conocen solamente los sitios de fijación para un pequeño número de ligandos del receptor de sabor dulce T1R2/T1R3 heterodímero. Por tanto, las secuencias de aminoácidos de tipo salvaje codificadas de los receptores se mantuvieron inalteradas en esta optimización multiparamétrica, a fin de retener las cualidades de fijación de los receptores.
La síntesis y construcción de los cDNAs receptores se realizó por la vía del ensamblaje de oligonucleótidos sintéticos y clonación subsiguiente en un vector de plásmido pUC18 estándar para amplificación ulterior. Alternativamente, estos ácidos nucleicos pueden clonarse in vitro por técnicas de clonación bien conocidas. (Ausubel et al., 1998; Pachuk et al., 2000; Sambrook et al., 1989; Stemmer et al., 1995). Pueden obtenerse luego fragmentos de DNA bicatenario por síntesis de la cadena complementaria y reasociación de las cadenas juntas en condiciones apropiadas, o por adición de la cadena complementaria utilizando DNA-polimerasa con una secuencia iniciadora apropiada.
Debido a la generación sintética de los cDNAs, los receptores de la presente invención se han descrito con el prefijo "s" y han sido designados shT1R2 y shT1R3. Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos para las secuencias clonadas T1R arriba mencionadas, así como otras secuencias T1R de longitud total y parciales se indican en el protocolo de secuencias.
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Ejemplo 2
Vectores multicistrónicos para la expresión de receptores de sabor
Para la construcción de una unidad de expresión multicistrónica se han utilizado las secuencias receptoras de sabor que se exponen en el Ejemplo 1. Como se muestra en la Figura 2, la unidad de expresión tricistrónica se encuentra bajo el control del promotor del factor de elongación humano 1-alfa. Utilizando técnicas estándar de clonación, se han clonado el cDNA para los receptores shT1R2 y shT1R3 y el cDNA para el gen de blasticidin-S-desaminasa. A fin de permitir la iniciación de la traducción de cada gen de esta unidad tricistrónica, se han insertado dos sitios de entrada de ribosoma internos derivados del virus EMC (IRES - denominado también intensificador de la traducción independiente de Cap (CITE)). (Jackson et al., 1990; Jang et al., 1988) La unidad de expresión tricistrónica está terminada por una secuencia señal de poliadenilación del virus 40 de los simios. Esta composición permite la expresión simultánea de los tres genes bajo el control de un solo promotor. En contraste con las unidades de transcripción monocistrónicas, que se integran independientemente una de otra en diferentes localizaciones cromosómicas durante el proceso de desarrollo de líneas de células estables, la unidad de transcripción tricistrónica integra todos los genes que se contienen en uno y el mismo locus cromosómico. Debido a la alineación de los genes, el gen de blasticidin-S-desaminasa se transcribe únicamente en el caso de que tenga lugar una transcripción de longitud total. Además, la polaridad de las unidades de transcripción multicistrónicas (Moser et al., 2000) conduce probablemente a una estequiometría equilibrada de los genes receptores y sus tasas de expresión en el intervalo de 1:0,7 hasta 1:1 para las dos primeras posiciones, en tanto que el gen de blasticidin-S-desaminasa comparado con los genes receptores en la tercera posición se expresa en menor proporción. Suponiendo que para el receptor heterodímero funcional shT1R2/shT1R3 es necesaria una estequiometría 1:1, los efectos de menor polaridad para los genes receptores promueven la estequiometría deseada, mientras que la expresión reducida de la desaminasa promueve un locus de integración con actividad de transcripción intensificada.
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Ejemplo 3
Detección de la actividad dependiente de T1R2/T1R3
En las células del gusto de tipo salvaje - v.g. en las papilas gustativas humanas - la transducción de señales es transducida probablemente por las proteínas G gustducina y/o por las proteínas G del tipo G alfa-i. Al enfrentarse a ligandos dulces, el receptor de sabor heterodímero T1R2/T1R3 reacciona con inducción de moléculas de segundo mensajero; o bien la inducción del nivel de cAMP en respuesta a la mayoría de los azúcares o la inducción del nivel de calcio en respuesta a la mayoría de los edulcorantes artificiales (Margolskee, 2002).
Para analizar la función y la actividad del receptor de sabor heterodímero T1R2/T1R3, se ha utilizado un ensayo basado en células dependientes de calcio. Resumidamente, se han transfectado receptores de sabor sintéticos de tipo T1R (como se muestra en el Ejemplo 1) con el vector plasmídico pTrix-Eb-R2R3 (véase el Ejemplo 2) en una línea de células HEK293 que expresa establemente la proteína G de ratón G-alfa-15. La selección de células que expresan T1R2/T1R3 se ha realizado por cultivo de las células transfectadas en presencia de blasticidina.
Para la medida de la actividad dependiente de los receptores de sabor T1R2/T1R3, se sembraron 4 x 10^{4} células HEK293 que expresaban de manera estable G-alfa-15, shT1R2 y shT1R3 en placas de 96 pocillos y se marcaron con el tinte de fluorescencia sensible al calcio Fluo4-AM (2 \muM) en medio de cultivo DMEM durante 1 hora a 37ºC. Para la medida en un lector de placas de fluorescencia, se cambió el medio por tampón KH y se incubó durante 15 minutos más a 37ºC. La medida de la fluorescencia de las células marcadas se condujo en un lector de placas de fluorescencia Novostar (BMG, Offenburg, Alemania). La respuesta a distintos saborizantes como se representa en la Figura 3 se registró como aumento de fluorescencia Fluo4-AM iniciado por el aumento dependiente de T1R2/T1R3 del segundo mensajero calcio. Después de obtener las señales de calcio para cada muestra, se cuantificó la movilización del calcio en respuesta a los saborizantes como el cambio relativo (fluorescencia pico F1 - nivel de fluorescencia F0 de la línea base, designado como dF) respecto a su propio nivel de fluorescencia de línea base (designado como F0). Por tanto, la RFU relativa es dF/F0. La intensidad de fluorescencia pico se alcanzó aproximadamente 20-30 s después de la adición de saborizantes. Los datos presentados se obtuvieron a partir de dos experimentos independientes y realizados por triplicado.
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acoplados a proteína g
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<130> 2006/002NUT
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<212> PRT
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Claims (15)

1. Un método para la identificación de moduladores de GPCRs, que comprende los pasos de:
a.
transformar una célula hospedadora eucariota con secuencias genéticas que codifican más de un GPCR(s), en donde esta transformación se realiza con un vector de expresión multicistrónico que comprende una unidad de expresión multicistrónica que comprende aguas abajo de un promotor para la expresión en un hospedador eucariota y enlazados funcionalmente al mismo, los cistrones siguientes:
i.
GPCR_{1}
ii.
GPCR_{2} y un
iii.
marcador de selección
b.
cultivar las células hospedadoras transformadas en condiciones suficientes para la expresión funcional de dichos GPCRs,
c.
poner en contacto la célula hospedadora cultivada que expresa los GPCRs de una manera funcional con un modulador potencial de los GPCRs seleccionados,
d.
medir una respuesta celular seleccionada de la célula hospedadora transformada por exposición al modulador potencial, y
e.
seleccionar un identificador, que induce una respuesta específica.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula hospedadora se selecciona del grupo constituido por: HEK293 (riñón de embrión humano), HeLa (carcinoma epiteloide de cérvix humano negroide), HT29 (adenocarcinoma de colon humano caucasiano grado II), A431 (carcinoma escamoso humano), IMR32 (neuroblastoma humano caucasiano), K562 (leucemia mielógena humana caucasina crónica), U937 (linfoma histiocítico humano caucasiano), MDA-MB-231 (adenocarcinoma de mama humano caucasiano), SK-N-BE(2) (neuroblastoma humano caucasiano), SH-SY5Y (neuroblastoma humano), HL60 (leucemia humana promielocítica) o líneas de células eucariotas no humanas como CHO-K1 (ovario de hámster chino), COS-7 (riñón de mono verde africano, transformadas con SV40), S49 (linfoma de ratón), Ltk (tejido conectivo de ratón C34/An), NG108-15 (híbrido Neuroblastoma de ratón x Glioma de rata), B50 (tejido nervioso neuronal de rata, ECACC), C6 (tumor glial de rata), Jurkat (linfoblastos de células T de la leucemia humana), BHK (riñón de hámster sirio), Neuro-2a (neuroblastoma de ratón albino), NIH/3T3 (fibroblastos de embrión de ratón), preferiblemente HEK (riñón de embrión humano), HeLa (carcinoma epiteloide de cérvix humano negroide), CHO-K1 (ovario de hámster chino) o Neuro 2a (neuroblastoma de ratón
albino).
3. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el uno o más GPCR(s) es un GPCR de tipo T1R, especialmente T1R1, T1R2 y/o T1R3.
4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dos o más GPCRs se expresan en una co-expresión heteróloga de al menos dos GPCRs diferentes de tipo T1R, preferiblemente T1R1/T1R3, y más preferiblemente T1R2/T1R3.
5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la transformación se realiza con un vector de clonación tricistrónico o tetracistrónico.
6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el promotor es un promotor fuerte adecuado para uso en la célula hospedadora seleccionada, que se selecciona preferiblemente del grupo constituido por el promotor de citomegalovirus (P-CMV), el promotor del factor de elongación humana 1-alfa (P-E1\alpha), el promotor ubiquitina humano (P-ubi), el promotor del virus de los simios (P-SV40), el promotor de la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous (P-RSV-LTR),
en donde el GPCR1 y el GPCR2, independientemente uno de otro, se seleccionan del grupo constituido por receptores de sabor T1R y T2R, preferiblemente del grupo de receptores T1R, más preferiblemente una combinación de T1R/T1R3 o T1R2/T1R3,
en donde el marcador de selección se selecciona del grupo constituido por higromicina, zeocina^{r}, neomicina^{r}, blasticidina^{r} o puromicina^{r};
en donde ambos GPCR_{1} y GPCR_{2}, así como el marcador de selección están conectados funcionalmente por IRES interpuestos seleccionados del grupo constituido por IRES_{EMCV}, derivado del virus de la encefalomiocarditis (sinónimo: CITE_{EMCV}); IRES_{GTX}, derivado del mRNA del homeodominio GTX; IRES_{Rbm3}, derivado de Rbm3 inducible por frío; IRES_{PV}, derivado de origen polioviral, IRES_{RV}, derivado de rinovirus, IRES_{FMDV}, derivado del virus de la fiebre aftosa; IRES_{HV}, derivado del virus de la hepatitis C, IRES_{CSFV}, derivado del virus de la fiebre porcina clásica, IRES_{BVDV}, derivado del virus de la diarrea viral de los bovinos; IRES_{FMLV}, derivado del mRNA gag del virus de la leucemia murina de Friend; IRES_{MMLV}, derivado del mRNA gag del virus de la leucemia murina de Moloney; IRES_{HIV}, derivado del mRNA env del virus de la inmunodeficiencia humana; IRES_{PSIV}, derivado del virus intestinal de Plautia stali; IRES_{RPV}, derivado del virus de Rhopalosiphum padi; IRES_{KSH}, derivado del herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi, preferiblemente el IRES_{EMCV} derivado del virus de la encefalomiocarditis (sinónimo: CITE_{EMCV}),
y en donde la unidad de expresión multicistrónica está terminada por una señal de poliadenilación.
7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el vector de clonación multicistrónico comprende además un cistrón que codifica una proteína G, preferiblemente G-alfa15, estando localizada preferiblemente la proteína g entre el último GPCR y el marcador de selección, y estando conectada funcionalmente a ambos por un IRES como se define en la reivindicación 5.
8. Un método de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el modulador se selecciona del grupo constituido por pequeñas moléculas y/o péptidos.
9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la respuesta celular se determina por medición del cambio de los niveles de calcio intracelulares con relación a los niveles de calcio intracelulares sin poner en contacto la célula con el modulador.
10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque el cambio es un aumento.
11. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque el cambio es una disminución con relación a los niveles de calcio intracelulares cuando la célula está en contacto con un compuesto dulce en lugar del modulador, seleccionándose preferiblemente el compuesto dulce del grupo constituido por glucosa, fructosa, sacarosa, acesulfamo K, sacarina, ciclamato, aspartamo, xilitol, esteviósido, sucralosa, taumatina, monelina, brazzeína, perillartina, glicirricina, ácido sucrónico, P-4000, SC45647, NC174, neohesperidina y aminoácidos de sabor
dulce.
12. Molécula de ácido nucleico que codifica un T1R1, T1R2 o T1R3 representado en una de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.
13. Vector de expresión multicistrónico que comprende aguas abajo de un promotor para la expresión en una célula eucariota y enlazados funcionalmente al mismo los cistrones siguientes:
a.
GPCR_{1}
b.
GPCR_{2} y un
c.
marcador de selección,
en donde el promotor es preferiblemente un promotor fuerte adecuado para uso en la célula hospedadora seleccionada, seleccionándose más preferiblemente del grupo constituido por: el promotor de citomegalovirus (P-CMV), el promotor del factor de elongación humano 1-alfa (P-E1\alpha), el promotor ubiquitina humano (P-ubi), el promotor del virus de los simios (P-SV40), el promotor de la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous
(P-RSV-LTR),
en donde el GPCR_{1} y el GPCR_{2} se seleccionan, independientemente uno de otro, del grupo constituido por los receptores de sabor T1R o T2R, preferiblemente del grupo de receptores T1R, más preferiblemente una combinación de T1R1-T1R3 o T1R2-T1R3,
en donde el marcador de selección se selecciona del grupo constituido por higromicina^{r}, zeocina^{r}, neomicina^{r}, blasticidina^{r} o puromicina^{r},
en donde tanto el GPCR1 como el GPCR2, así como el marcador de selección están conectados funcionalmente por IRES interpuestos seleccionados del grupo constituido por IRES_{EMCV}, derivado del virus de la encefalomiocarditis (sinónimo: CITE_{EMCV}); IRES_{GTX}, derivado del mRNA del homeodominio GTX; IRES_{Rbm3}, derivado de Rbm3 inducido por frío; IRES_{pv}, derivado de origen polio-viral, IRES_{RV}, derivado de rinovirus, IRES FMDV, derivado del virus de la fiebre aftosa; IRE_{HV}, derivado del virus de la hepatitis C, IRES_{CSFV}, derivado del virus de la fiebre porcina clásica, IRES_{BVDV}, derivado del virus de la diarrea viral de los bovinos; IRES_{FMLV}, derivado del mRNA gag del virus de la leucemia murina de Friend; IRES_{MMLV}, derivado del mRNA gag del virus de la leucemia murina de Moloney; IRES_{HIV}, derivado del mRNA env del virus de la inmunodeficiencia humana; IRES_{PSIV}, derivado del virus intestinal de Plautia stali; IRES_{RPV}, derivado del virus de Rhopalosiphum padi; IRES_{KSH}, derivado del herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi, preferiblemente el IRES_{EMCV}, derivado del virus de la encefalomiocarditis (sinónimo: CITE_{EMCV}) y
en donde la unidad de expresión multicistrónica está terminada por una señal de poliadenilación.
14. Un vector de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque el vector de clonación multicistrónico comprende adicionalmente un cistrón que codifica una proteína g o un equivalente de la misma, preferiblemente G-alfa 15 o un equivalente de la misma, la proteína g o un equivalente de la misma, estando preferiblemente la proteína g fusionada en marco al GPCR_{1} y/o GPCR_{2} anteriores.
15. Líneas de células transfectadas de manera estable con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, preferiblemente un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14.
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