ES2339960T3 - Metodos de cribado para compuestos que modulan la actividad de receptores acoplados a proteina g. - Google Patents
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Abstract
Un método para la identificación de moduladores de GPCRs, que comprende los pasos de: a.transformar una célula hospedadora eucariota con secuencias genéticas que codifican más de un GPCR(s), en donde esta transformación se realiza con un vector de expresión multicistrónico que comprende una unidad de expresión multicistrónica que comprende aguas abajo de un promotor para la expresión en un hospedador eucariota y enlazados funcionalmente al mismo, los cistrones siguientes: i.GPCR1 ii.GPCR2 y un iii.marcador de selección b.cultivar las células hospedadoras transformadas en condiciones suficientes para la expresión funcional de dichos GPCRs, c.poner en contacto la célula hospedadora cultivada que expresa los GPCRs de una manera funcional con un modulador potencial de los GPCRs seleccionados, d.medir una respuesta celular seleccionada de la célula hospedadora transformada por exposición al modulador potencial, y e.seleccionar un identificador, que induce una respuesta específica.
Description
Métodos de cribado para compuestos que modulan
la actividad de receptores acoplados a proteína G.
La presente invención se refiere a un método de
cribado para la identificación de moduladores (tanto agonistas como
antagonistas) de GPCRs y los moduladores así identificados. En una
realización preferida de la presente invención, estos moduladores
pueden ser moduladores del gusto. La presente invención se refiere
adicionalmente a sistemas vectores recombinantes para la expresión
estable y heteróloga de receptores acoplados a proteína g (GPCRs)
heterodímera seleccionados en células hospedadoras eucariotas. Se
describe la expresión funcional de GPCRs manipulados genéticamente
para la percepción del sabor dulce y de
L-aminoácidos y el uso de dichos receptores para
identificación de ligandos funcionales.
Los GPCRs representan la mayor familia de
receptores de la superficie celular con un número estimado de hasta
1000 genes en el genoma humano caracterizados por una configuración
siete-transmembranal como su característica
principal. (Bockaert y Pin, 1999; Pierce et al., 2002). Los
GPCRs son activados por una multitud de ligandos diferentes, que
incluyen péptidos, proteínas, lípidos, moléculas pequeñas, iones e
incluso fotones. Los GPCRs activados alteran su conformación
permitiendo que la misma catalice el intercambio de
guanosina-difosfato (GDP) por
guanosina-trifosfato (GTP) en la subunidad \alpha
de una proteína G heterotrímera acoplada al GPCR. Las proteínas G
heterotrímeras compuestas de una de 18 subunidades \alpha
diferentes, una de 5 subunidades \beta diferentes y una de 11
subunidades \gamma diferentes se clasifican usualmente por la
naturaleza de su subunidad \alpha y se agrupan generalmente en
cuatro clases principales: G_{s}, que activa
adenilil-ciclasa; G_{j} que inhibe
adenilil-ciclasa; G_{q} que activa fosfolipasa C;
y G_{12/13} con funciones heterólogas. Además de la señalización
dependiente de la subunidad \alpha, las subunidades
\beta/\gamma pueden funcionar como moléculas señalizadoras por
sí mismas. La señalización dependiente de GPCR se hace aún más
compleja si se considera que estos receptores pueden existir como
complejos homo-oligómeros o
hetero-oligómeros. (George et al., 2002;
Milligan et al., 2003; Salahpour et al., 2000). Por
tanto, no es sorprendente que los GPCRs sean responsables de la
regulación de una gran diversidad de procesos fisiológicos
diferentes.
Recientemente, el papel de los GPCRs en los
sentidos humanos como la vista, el olfato y el gusto ha sido objeto
de investigaciones intensificadas. Mientras que la participación del
GPCR rodopsina en el sentido de la vista es uno de los ejemplos de
señalización de receptores acoplados a proteína G examinados más
exhaustivamente en los últimos 30 años (Maeda et al., 2003),
el papel de los GPCRs en el olfato y el sabor amargo así como en el
sabor dulce se descubrió en los años 1990. (Buck y Axel, 1999;
Firestein, 2001; Lindemann 1996b; Lindemann, 2001).
El descubrimiento de la señalización por GPCR en
la percepción del sabor está estrechamente unido al descubrimiento
de la señalización específica de saborizantes en las células del
gusto de los vertebrados. En estudios electrofísicos y bioquímicos
se hizo evidente que la señalización derivada de los saborizantes
daba como resultado una inducción típica de segundo mensajero
dependiente de GPCR, v.g. nucleósidos cíclicos (cAMP, cGMP),
inositol-trifosfato (IP3) o calcio. (Kinnamon y
Cummings, 1992; Kinnamon y Margolskee, 1996; Lindemann, 1966a). La
participación de GCPRs en la percepción del sabor se vio respaldada
ulteriormente por el descubrimiento de la proteína g gustducina
expresada específicamente en las células del gusto de los
vertebrados. (McLaughlin et al., 1992; Wong et al.,
1996). Por otra parte, era conocido por estudios genéticos en
ratones que la capacidad para sentir el sabor dulce de, v.g., la
sacarina estaba ligada al denominado locus sac en el
cromosoma 4 del ratón. (Bachmanov et al., 2001; Lush, 1989;
Lush et al., 1995). Basándose en estos datos, era obvio
investigar marcadores de secuencia GPCR en bibliotecas de cDNA
sustraídas derivadas de células del gusto o por realización de
escaneos de secuencia genómica para estrechar ulteriormente el
locus sac del ratón con vistas a la identificación de
análogos de GPCR como receptores supuestos del gusto. Estos dos
enfoques condujeron a las secuencias de DNA de receptores de rata,
ratón y humanos para los GPCRs del gusto T1R1 y T1R2 (Hoon et
al., 1999; Hoon y Ryba, 1997) Así como T1R3. (Kitagawa et
al., 2001; Li et al., 2001; Max et al., 2001;
Montmayeur et al., 2001; Sainz et al., 2001). Las
alineaciones de homología revelaron que estos receptores del gusto
como el receptor de glutamato metabotrófico homodímero (mGluR), el
receptor de ácido \gamma-aminobutírico
heterodímero tipo B (GABA_{B}R) y los receptores homodímeros de
calcio extracelular son miembros de la pequeña familia de GPCRs de
clase C. Como característica común, la mayoría de los receptores de
la clase C exhiben un gran dominio aminoterminal extracelular
compuesto de un denominado módulo atrapamoscas de Venus (VFTM) y un
dominio rico en cisteína (CRD) que conecta el VFTM al dominio
heptahelicoidal. (Pin et al., 2003). Además de ello, se
describió homo- y hetero-oligomerización para
varios de estos receptores de clase C. (Bai et al., 1998;
Kaupmann et al., 1998; Kunishima et al., 2000; White
et al., 1998). Consiguientemente, el rasgo característico de
la oligomerización GPCR de los receptores de clase C fue testado
para los receptores supuestos del sabor dulce T1R1, T1R2 y T1R3.
Por expresión heteróloga recombinante en
sistemas de células eucariotas, se demostró una expresión funcional
y activación específica de saborizantes de una cascada de
señalización dependiente de proteína G enlazada artificialmente,
por obtención de imágenes de calcio. Los receptores T1R se ensamblan
para construir receptores de sabor funcionales. Como resultado de
varias investigaciones se demostró que el T1R1/T1R3 heterodímero
funciona como un receptor de glutamato (umami) y de
L-aminoácidos, mientras que el heterodímero
T1R2/T1R3 funciona como un receptor de alta afinidad de azúcar y
edulcorantes artificiales. Particularmente, la
co-expresión heterodímera de T1R1 y T1R3 da como
resultado receptores del sabor que responden a los estímulos del
sabor de umami y de glutamato monosódico, en tanto que la
co-expresión heterodímera de T1R2 y T1R3 da como
resultado receptores de sabor que responden a estímulos dulces
tales como diversos azúcares (v.g. glucosa y sacarosa), edulcorante
artificial (v.g. acesulfamo K, ciclamato, sacarina) y proteínas
dulces como monelina, taumatina, brazzeína (Li et al., 2002;
Nelson et al., 2002; Nelson et al., 2001; Zhao et
al., 2002). Podría generarse una crónica similar para la
identificación de GPCRs para la percepción del sabor amargo con la
excepción de que, hasta ahora, no se ha informado de homo- u
oligomerización alguna para estos denominados
T2R-GPCRs. (Meyerhof et al., 2005).
La identificación arriba expuesta de genes
codificantes de receptores responsables v.g. de la percepción del
sabor, junto con la clonación de dichos genes en vectores apropiados
para la expresión de dichas proteínas en células eucariotas y la
transformación de dichas células con dichos vectores generó la
expectativa de que sistemas de cribado y/o métodos de cribado para
modulares GPCR, es decir agonistas y antagonistas de los receptores
detallados anteriormente, podría ser fácil de desarrollar en un
tiempo razonable.
Esto se refleja por un número enorme y todavía
creciente de publicaciones y solicitudes de patente en este
campo.
Loison et al. (2002) describen el uso de
un vector bicistrónico para la expresión de un GPCR.
La clonación de T1R1 se describe en diferentes
solicitudes de patente, v.g. en WO 03/025137; en WO 00/06952 (en
donde aquél se designa GPCR-B3), US020040191862A1 y
WO 2005/033125.
La clonación de T1R2 se describe en las
solicitudes de patente WO 03/025137, US020040191862A1 y
US020030040045A1.
US020030040045A1.
La clonación de T1R3 se describe en las
solicitudes de patente WO 03/025137, WO 03/025137 (sic),
US020040191862A1 y US020030040045A1.
US020040191862A1 y US020030040045A1.
Un sistema para la expresión de dichas proteínas
en células eucariotas se describe en las solicitudes de patente WO
03/025137, WO 00/06952, US20040191862A1, W02004069191 y
US20030040045A1.
Un sistema de cribado para moduladores supuestos
del gusto se describe en las solicitudes de patente WO 00/06952,
W02004069191 y US20030040045A1.
WO 05/072129A describe vectores policistrónicos
retrovirales que son aplicables para la expresión de GPCR.
Sin embargo, no se dice nada acerca de la
identificación con éxito de nuevos moduladores, v.g. nuevos
moduladores artificiales del gusto tales como nuevos edulcorantes
que utilicen dichos métodos/sistemas de cribado.
El creciente debate acerca de la obesidad en los
países desarrollados y la consciencia creciente por la salud de los
consumidores conducen a una demanda creciente de alimentos y bebidas
con reducción importante de calorías comparada con productos
totalmente edulcorados con carbohidratos tales como sacarosa,
glucosa, fructosa o jarabes tales como HFCS55 ó 42. Dado que el
consumidor no está dispuesto usualmente a transigir respecto al
sabor, los productos deberían tener intensidad de dulzor y calidad
de sabor similares a las de los productos edulcorados regularmente
con estos carbohidratos.
Los edulcorantes de alta intensidad son
sustancias que carecen, o carecen prácticamente, de calorías, y
tienen una potencia edulcorante varias veces mayor que el azúcar
común. Los edulcorantes de alta intensidad o mezclas de
edulcorantes de alta intensidad se utilizan en alimentos y bebidas
para conseguir un sabor dulce sin añadir calorías a los
productos.
Los edulcorantes de alta intensidad más usados
corrientemente no son de origen natural. Los mismos se descubrieron
accidentalmente y se sintetizan químicamente. La mayoría de ellos
tienen una aprobación generalizada en un gran número de países.
Ejemplos son sustancias tales como acesulfamo K, alitama, aspartato,
ciclamato, neohesperidina-dihidrocalcona, neotama,
sacarina y sucralosa.
Sin embargo, ningún edulcorante de alta
intensidad iguala el perfil de sabor del azúcar por completo. Los
mismos difieren en características tales como perfil de dulzor,
sabor secundario y características de sabor residual. Se sabe que
la mezcladura apropiada de diferentes edulcorantes de alta
intensidad resuelve parte de las limitaciones de sabor de los
edulcorantes de alta intensidad individuales. Pero incluso si se
consigue un perfil de dulzor más semejante al del azúcar en
productos con edulcorantes de alta intensidad exclusivamente, los
mismos pueden ser distinguidos todavía sensorialmente de sus
equivalentes con el azúcar solo u otros carbohidratos por la
carencia de sensación gustativa y características de aroma
reducidas. Por esta razón, existe necesidad de nuevos edulcorantes
de alta intensidad que ofrezcan sea solos o en mezclas con los
edulcorantes existentes, perfiles de dulzor y características de
aroma mucho más próximas a las del azúcar que las que pueden ofrecer
los productos existentes.
Además de la reducción de calorías, muchos de
los consumidores actuales están buscando productos alimenticios y
bebidas sin aditivos artificiales o incluso que sean totalmente
orgánicos. Teóricamente, los edulcorantes de alta intensidad
naturales podrían satisfacer esta demanda. Varios edulcorantes
naturales de alta intensidad han sido descubiertos a lo largo de
los últimos años, tales como esteviósido, rebaudiósido, brazzeína,
taumatina, mogrósido, gricirricina, monatina, abrusósido, monelina,
filodulcina y otros. Éstas son sustancias que existen naturalmente
en diferentes plantas y pueden obtenerse por medidas de extracción
selectiva. Además de aprobaciones muy limitadas y en algunos casos
dificultades de extraer los productos en escala industrial, ninguno
de estos productos puede reivindicar el ofrecimiento de un sabor
similar al del azúcar. De hecho, todas estas sustancias exhiben un
dulzor con comienzo mucho más lento que la sacarosa y un dulzor muy
prolongado. La mayoría de estos productos tienen sabor secundario
fuerte y características de sabor residual tales como notas amargas,
mentoladas o de regaliz o producen incluso sensaciones fuertes de
enfriamiento o entumecimiento. Por tanto, alguno de estos
productos, v.g. la taumatina, pueden considerarse más bien como
intensificadores del sabor que como edulcorantes. La mezcla de dos
o más de estas sustancias no puede resolver estas limitaciones de
sabor. Por tanto, en el área de los edulcorantes naturales la
necesidad de nuevos edulcorantes de alta intensidad con un perfil
de sabor próximo al del azúcar común es aún más fuerte que en el
caso de los edulcorantes artificiales (O'Brien Nabors, 2001;
Leatherhead Food RA, 2000; Grenby, 1996; von Rymon Lipinski y
Schiweck, 1991).
Por consiguiente, existe todavía una necesidad
en la técnica de identificar y aislar nuevas sustancias que puedan
utilizarse como moduladores de la percepción del sabor, v.g. como
edulcorantes.
A pesar de lo anterior, debido a la gran
importancia de estos GPCRs in vivo, y a las muchas funciones
diferentes asociadas con dichos receptores, se ha supuesto que
muchos de los moduladores de GPCRs que podrían ser identificados
por el método de la presente invención pueden tener valor
práctico.
Por esta razón, la disponibilidad de un sistema
de cribado simple y fiable para moduladores de dichos receptores
podría ser de gran importancia.
En los vectores de expresión multicistrónicos,
las secuencias codificantes de diferentes proteínas se encuentran
bajo el control de un solo promotor y los diferentes cistrones están
conectados por la vía de sitios de entrada de ribosoma internos
(IRES) derivados de virus o intensificadores de la traducción
independientes de la cápsula (CITE). Los elementos IRES o CITE
confieren una iniciación de la traducción independiente del extremo
5', necesario por otra parte, de un RNA mensajero, que es
reconocido por los ribosomas eucariotas para comenzar su proceso de
escaneo para el primer codón de inicio de la traducción accesible
(Fux et al., 2004; Hellen y Sarnow, 2001). Hasta hora, los
vectores de expresión multicistrónicos se han descrito básicamente
como unidades de expresión dicistrónicas para la expresión acoplada
de un gen de interés enlazado por un sitio de iniciación de la
traducción independiente de la cápsula a un marcador de resistencia
(que confiere resistencia a, v.g. higromicina, zeocina, neomicina)
permitiendo la selección de líneas estables de células para estudios
de expresión heteróloga en mamíferos. Para este enfoque, están
disponibles comercialmente vectores de expresión dependientes IRES
o CITE.
Informes acerca de estudios de expresión
multicistrónica genuina en sistemas de mamíferos con descripciones
de estudios de expresión heteróloga tri-cistrónicos
o incluso cuadri-cistrónicos son escasos, y en su
mayor parte tenían por objeto mejorar la expresión inducible de
proteínas v.g. para aplicaciones de terapia génica. En cambio, en
este trabajo pionero las expresiones multicistrónicas se han
realizado en su mayor parte con proteínas pequeñas y solubles como
genes informadores (proteína fluorescente verde, proteína
fluorescente amarilla, proteínas fluorescentes rojas, fosfatasa
alcalina secretada, amilasa secretada) o transactivadores
manipulados genéticamente, v.g. para marcadores de expresión o
selección dependientes de macrólidos o estreptogramina. Aunque
estos estudios tienen por objeto la expresión de proteínas
terapéuticas potenciales en aplicaciones de terapia génica,
solamente un pequeño número de genes con potencial terapéutico se
mencionan en estos estudios (v.g. factor de crecimiento endotelial
vascular (VEGF); la oncoproteína bcl-2).
(Fussenegger et al., 1998; Hartenbach y Fussenegger, 2005;
Kramer et al., 2003; Moser et al., 2000; Weber et
al., 2005).
En relación con la expresión de receptores del
gusto, existe un informe sobre la expresión dicistrónica de
receptores del gusto en el ratón (mT2R8/5;mT1R3) fusionado cada uno
con proteína fluorescente verde y enlazado por un elemento IRES a
proteína fluorescente roja. Este enfoque se aplicó para rastrear y
localizar el patrón de expresión de receptores del gusto en las
neuronas (Sugita y Shiba, 2005).
Por consiguiente, el problema técnico que
subyace en la presente invención consistía en proporcionar un
sistema de cribado basado en células para moduladores de GPCRs, es
decir establecer un método que haga posible identificar con éxito
moduladores importantes de algunos GPCRs seleccionados,
preferiblemente GPCRs del gusto de tipo T1R. Un problema ulterior
subyacente en la presente invención consistió en proporcionar medios
y métodos para el aislamiento de moduladores identificados sin un
gravamen excesivo.
La solución a los problemas técnicos arriba
mencionados se consigue proporcionando las realizaciones
caracterizadas en las reivindicaciones.
Por tanto, realizaciones especialmente
preferidas de la presente invención son medios y métodos para la
expresión de GPCRs del gusto heterodímeros de tipo TR1, en los
cuales la expresión de estos GPCRs del gusto heterodímeros de tipo
TR1 se efectúa por modulación de las secuencias codificantes de los
GPCR y su expresión en operones multicistrónicos.
El problema anterior puede resolverse sin
embargo con facilidad sorprendente proporcionando un método para la
identificación de moduladores de GPCRs, que comprende los pasos
de:
- a.
- transformar células hospedadoras eucariotas con secuencias genéticas que codifican más de un GPCR(s), en donde esta transformación se realiza con un vector de expresión multicistrónico que comprende una unidad de expresión multicistrónica que comprende aguas abajo de un promotor para la expresión en un hospedador eucariota y enlazados funcionalmente al mismo, los cistrones siguientes:
- i.
- GPCR_{1}
- ii.
- GPCR_{2} y un
- iii.
- marcador de selección
- b.
- cultivar las células hospedadoras transformadas en condiciones suficientes para asegurar la expresión funcional de dichos GPCRs,
- c.
- poner en contacto la célula hospedadora cultivada que expresa GPCRs de una manera funcional con un modulador potencial de los GPCRs seleccionados,
- d.
- medir una respuesta celular específica por exposición de la célula hospedadora transformada al modulador potencial, y
- e.
- seleccionar un identificador, que induce una respuesta específica.
Dentro del contexto de la presente invención, el
término "modulador de GPCRs" tiene por objeto significar una
sustancia, que si se aplica in vivo, podría (a) desencadenar
una respuesta intracelular por fijación del GPCR seleccionado o (b)
podría inhibir dicha respuesta en presencia de un compuesto dulce.
V.g., en el caso de receptores del sabor dulce tales como el GPCR
seleccionado, este modulador podría ser una sustancia que tiene
sabor dulce o que potencia el dulzor de un compuesto con sabor dulce
sin ser dulce por sí misma, o que inhibe el dulzor de las
sustancias dulces.
La expresión "condiciones suficientes para
asegurar la expresión funcional" debe entenderse como un sumario
de todas las condiciones necesarias para asegurar la expresión
funcional de los GPCRs, más bien que condiciones de cultivo de
células. En una realización preferida de la presente invención, este
término se refiere al vector utilizado para transformación que es
un vector tricistrónico. Adicionalmente, esta expresión abarca el
cultivo de células que comprenden una proteína g funcional. En
algunas circunstancias, la presión funcional del o de los
GPCR(s) debe asegurarse.
Los términos "expresión funcional" o
"expresión de manera funcional" significa dentro del contexto
de la presente invención que el receptor seleccionado mantiene su
capacidad para interaccionar específicamente con las mismas
sustancias con las que interaccionaría el receptor cuando se
encontrara en situación in vivo.
Por "respuesta celular seleccionada", deben
entenderse v.g., cambios en los niveles intracelulares de calcio,
los cuales pueden medirse fácilmente, v.g. por utilización de tintes
tales como Calcium 3, Fura-2,
Fluo-4, Indo-1 o la proteína
informadora dependiente de calcio equorina. Está abarcada cualquier
respuesta celular relacionada con la actividad de los GPCRs
seleccionados. Ejemplos ulteriores de medición de la actividad de
GPCRs son (i) la activación del segundo mensajero
adenosina-monofosfato cíclico (cAMP), que puede
cuantificarse en ensayos basados en células dependientes de GPCR
con marcadores luminiscentes o con expresión de genes informadores
dependientes de cAMP (v.g. luciferasa, SEAP o similares) o con la
tecnología de los melanóforos, utilizando células de piel de rana;
(ii) la medida de la fijación de \beta-arrestina
al GPCR marcado después de activación inducida por ligandos del
GPCR por medidas de transferencia de energía por resonancia de
bioluminiscencia (BRET), o producción de imágenes de movimiento de
\beta-arrestina marcadas con GFP; (iii) medida de
la ocupación por agonistas de un GPCR y respectivamente la
activación de la proteína G asociada, que puede cuantificarse por
utilización del análogo radiactivo no hidrolizable de GTP,
[35S]GTP\gammaS; (iv) el uso de ensayos de genes
informadores controlados por elementos de respuesta para la lectura
de caminos interconectados activados por GPCR, con inclusión de
aquéllos que implican quinasas MAP,
tirosina-quinasas no receptoras,
tirosina-quinasas receptoras, fosfatidilinositol
3-quinasas y JNKs. (Eglen, 2005; Filmore, 2004;
Milligan, 2003).
El término "identificador" está dirigido a
un modulador potencial después de ser identificado como modulador
real de GPCR o de la cascada de señalización específica de GPCR.
En una realización preferida, el método se
caracteriza porque la célula hospedadora se selecciona del grupo
constituido por: HEK293 (riñón de embrión humano), HeLa (carcinoma
epiteloide de cérvix humano negroide), HT29 (adenocarcinoma de
colon humano caucasiano grado II), A431 (carcinoma escamoso humano),
IMR32 (neuroblastoma humano caucasiano ), K562 (leucemia mielógena
humana caucasina crónica), U937 (linfoma histiocítico humano
caucasiano), MDA-MB-231
(adenocarcinoma de mama humano caucasiano),
SK-N-BE(2) (neuroblastoma
humano caucasiano), SH-SY5Y (neuroblastoma humano),
HL60 (leucemia humana promielocítica) o líneas de células eucariotas
no humanas como CHO-K1 (ovario de hámster chino),
COS-7 (riñón de mono verde africano, transformadas
con SV40), S49 (linfoma de ratón), Ltk (tejido conectivo de ratón
C34/an), NG108-15 (híbrido Neuroblastoma de ratón x
Glioma de rata), B50 (tejido nervioso neuronal de rata, ECACC), C6
(tumor glial de rata), Jurkat (linfoblastos de células T de la
leucemia humana), BHK (riñón de hámster sirio),
Neuro-2a (neuroblastoma de ratón albino), NIH/3T3
(fibroblastos de embrión de ratón), preferiblemente HEK (riñón de
embrión humano), HeLa (carcinoma epiteloide de cérvix humano
negroide), CHO-K1 (ovario de hámster chino) o Neuro
2a (neuroblastoma de ratón albino).
Es esencial que la célula hospedadora exprese
una proteína g funcional, preferiblemente G-alfa15,
sea naturalmente o por medio de alteración genética de la célula
hospedadora. Medios para alteración genética de células eucariotas
son bien conocidos en la técnica, y no precisan ser expuestos en
profundidad en este lugar. Las secuencias de DNA de proteínas G,
v.g. G-alfa15 han sido ya descritas en la
técnica.
Una realización ulterior preferida del método de
la presente invención se caracteriza porque uno o más GPCR(s)
se selecciona(n) del grupo constituido por los receptores
del sabor T1R o T2R, preferiblemente un GPCR del tipo T1R,
especialmente T1R1, T1R2 y/o T1R3.
Una realización adicionalmente preferida del
método de la presente invención se caracteriza porque dos o más
GPCRs se expresan en una co-expresión heteróloga de
al menos dos GPCRs de tipo T1R diferentes, preferiblemente
T1R1/T1R3, y más preferiblemente T1R2/T1R3.
Una realización adicionalmente preferida del
método de la presente invención se caracteriza porque la
transformación se realiza con un vector tricistrónico.
El vector de la presente invención es un vector
de expresión. Por el término "vector de expresión" se entiende
que el vector se utiliza para transformar una célula hospedadora
eucariota seleccionada, que, después de la transformación, expresa
el gen o genes codificados por dicho vector. Vectores de expresión
pueden ser, v.g. vectores de clonación, vectores binarios o vector
de integración. La expresión comprende transcripción de los ácidos
nucleicos codificados en un mRNA funcional (susceptible de
traducción). Por esta razón, los elementos de control respectivos
deberían estar presentes, v.g. una secuencia que promueva la
transcripción del mensajero (un promotor) y (opcionalmente) una
señal de poliadenilación. Medios para la expresión de genes
heterólogos en células eucariotas están muy bien
estudiados.
estudiados.
Para la propagación de tales vectores,
usualmente se utilizan células procariotas tales como E.
coli. Por esta razón, aunque los vectores de la presente
invención están diseñados para trabajar como vectores de expresión
en células eucariotas, los mismos llevan también elementos para
propagación en células procariotas, v.g. un origen de replicación
(ori) y un gen de resistencia a antibióticos, v.g. amp', kan' y
similares. Medios para la propagación de vectores en procariotas
son bien conocidos en la técnica.
Una lista de posibles vectores de expresión en
eucariotas utilizables en la presente invención, y utilizables
opcionalmente para la propagación en un hospedador procariota, y ya
disponibles comercialmente comprende: pCR1000, pCDM8, pcDNA1,
pcDNA1.1, pcDNA1/Amp, pcDNA1.1/Amp and pcDNA1/Neo, pcDNA3, pcDNA3.1,
pCDNA3.2, pCDNA6.2, pDEST26, pDEST27, pCR3.1, pCDNA3.1 His,
pDisplay (Invitrogen); pTriEx
(pTriEx-2-Hygro) (Novagen); pSI, pCI
(pCI-neo), pTargeT (Promega); pERV3,
pFB-ERV, pCFB-EGSH, pDual,
pCMV-Script (Stratagene); pNEBR (New England
Biolabs), pEAK (Edge Biosystems).
Una realización preferida adicional del método
de la presente invención se caracteriza porque el promotor es un
promotor fuerte adecuado para uso en la célula hospedadora
seleccionada, seleccionándose preferiblemente del grupo constituido
por el promotor de citomegalovirus (P. CMV), el promotor del factor
de elongación humano 1 alfa (P-E1\alpha), el
promotor ubiquitina humano (P-ubi), el promotor del
virus de los simios (P-SV40), el promotor de
repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous
(P-RSV-LTR) y similares, en donde el
GPCR_{1} y el GPCR_{2} se seleccionan, independientemente uno
de otro, del grupo constituido por los receptores de sabor T1R o
T2R, preferiblemente del grupo de receptores T1R, y más
preferiblemente una combinación de T1R1-T1R3 o
T1R2-T1R3, en donde el marcador de selección se
selecciona del grupo constituido por higromicina^{r},
zeocina^{r}, neomicina^{r}, blasticidina^{r}, o
puromicina^{r}, y en donde tanto el GPCR1 como el GPCR2, así como
el marcador de selección, están conectados funcionalmente por IRES
interpuestos seleccionados del grupo constituido por IRES_{EMCV},
derivado del virus de la encefalomiocarditis (sinónimo:
CITE_{EMCV}); IRES_{GTX,} derivado del mRNA del homeodominio
GTX; IRES_{Rbm3}, derivado de Rbm3 inducible por frío;
IRES_{PV}, derivado de origen polioviral, IRES_{RV}, derivado de
rinovirus, IRESFMDV, derivado del virus de la fiebre aftosa;
IRES_{HV}, derivado del virus de la hepatitis C, IRES_{CSFV},
derivado del virus de la fiebre porcina clásica, IRES_{BVDV},
derivado del virus de la diarrea viral de los bovinos;
IRES_{FMLV}, derivado del mRNA gag del virus de la
leucemia murina de Friend; IRES_{MMLV}, derivado del mRNA
gag del virus de la leucemia murina de Moloney;
IRES_{HIV}, derivado del mRNA env del virus de la
inmunodeficiencia humana; IRES_{PSIV}, derivado del virus
intestinal de Plautia stali; IRES_{RPV}, derivado del virus
de Rhopalosiphum padi; IRES_{KSH}, derivado del
herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi, preferiblemente el
IRES_{EMCV} derivado del virus de la encefalomiocarditis
(sinónimo: CITE_{EMCV}) y en donde la unidad de expresión
multicistrónica está terminada por una señal de poliadenilación.
La expresión "ligado funcionalmente al
mismo" significa, dentro del contexto de la presente invención,
que los componentes descritos están ligados entre sí para funcionar
de su manera propuesta.
Una realización adicional preferida del método
de la presente invención se caracteriza porque el vector
multicistrónico comprende adicionalmente una secuencia genética que
codifica una proteína g o un equivalente de la misma,
preferiblemente G-alfa15 o un equivalente de la
misma, que está codificada como una unidad monocistrónica
constituida por un promotor, el gen de la proteína g seleccionada y
un sitio de poliadenilación.
Una realización preferida adicional del método
de la presente invención se caracteriza porque el vector
multicistrónico comprende adicionalmente una secuencia genética que
codifica una proteína g o un equivalente de la misma,
preferiblemente G-alfa15 o un equivalente de la
misma, que está codificada como un cuarto cistrón en una disposición
cuadricistrónica por la vía de un elemento IRES adicional.
Una realización preferida adicional del método
de la presente invención se caracteriza porque el vector
multicistrónico comprende adicionalmente una secuencia genética que
codifica una proteína g o un equivalente de la misma,
preferiblemente G-alfa15 o un equivalente de la
misma, estando preferiblemente la proteína g fusionada en marco a
GPCR_{1} y/o GPCR_{2} indicados anteriormente.
De acuerdo con la presente invención, pueden
utilizarse proteínas G tales como G-alfa15 o
G-alfa16 u otras proteínas G o variantes de
proteína G promiscuas, o una proteína G endógena como gustducina, u
otra proteína g que, cuando se expresa en asociación con el o los
GPCR(s) codificados multicistrónicamente, produce una
lectura funcional. Adicionalmente, pueden utilizarse también
proteínas G-beta y G-gamma.
Sub-variantes de
G-alfa15 y/o G-alfa16 con términos N
modificados son también bien conocidas en la técnica, y pueden
utilizarse análogamente.
Esencialmente cualquier compuesto químico puede
emplearse como modulador o ligando potencial en los ensayos de
acuerdo con la presente invención. Compuestos testados como
moduladores de receptores acoplados a proteína G pueden ser
cualquier compuesto químico o entidad biológica pequeño(a)
(v.g., proteína, azúcar, ácido nucleico, lípido). Los compuestos de
test serán típicamente moléculas químicas y péptidos
pequeños. Generalmente, los compuestos utilizados como
moduladores potenciales pueden disolverse en soluciones acuosas u
orgánicas (v.g., basadas en DMSO). Los ensayos están diseñados para
cribar grandes bibliotecas químicas por automatización de los pasos
de ensayo y proporcionando compuestos de cualquier fuente
conveniente. Los ensayos se realizan típicamente en paralelo, por
ejemplo, en formatos de microtitulación en placas de microtitulación
en ensayos robotizados. Existen muchos suministradores de
compuestos químicos, que incluyen Sigma (St. Louis, Mo.), Aldrich
(St. Louis, Mo.), Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo.),
Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs, Suiza),
por ejemplo. Asimismo, los compuestos pueden sintetizarse por
métodos conocidos en la técnica.
Los denominados métodos de cribado de alta
capacidad implican típicamente proporcionar una biblioteca química
o peptídica combinatoria que contiene un gran número de
compuestos terapéuticos potenciales (v.g., compuestos ligandos o
compuestos moduladores). Tales bibliotecas químicas
combinatorias o bibliotecas de ligandos se criban luego en
uno o más ensayos para identificar aquellos miembros de la
biblioteca (v.g., especies o subclases químicas particulares) que
exhiben una actividad característica deseada. Los compuestos así
identificados pueden servir como compuestos líder convencionales, o
pueden ser utilizados en sí mismos como agentes terapéuticos
potenciales o
reales.
reales.
Una biblioteca química combinatoria es
una colección de diversos compuestos químicos generados por síntesis
química o síntesis biológica, por combinación de cierto número de
bloques de construcción químicos (es decir, reactivos tales como
aminoácidos). Como ejemplo, una biblioteca combinatoria
lineal, v.g. una biblioteca de polipéptidos o péptidos, se forma
por combinación de una serie de bloques de construcción químicos de
cualquier manera posible para una longitud de compuesto dada (es
decir, el número de aminoácidos en un polipéptido o compuesto
peptídico). Millones de compuestos químicos pueden sintetizarse por
dicha mezcladura combinatoria de bloques de construcción
químicos.
La preparación y el cribado de bibliotecas
químicas combinatorias es bien conocida por quienes poseen
experiencia en la técnica de que se trata. Las bibliotecas
combinatorias incluyen, sin limitación, bibliotecas
peptídicas (v.g. Pat. U.S. No. 5.010.175; Furka, 1991, Int. J.
Pept. Prot. Res., 37:487-493; y Houghton et
al., 1991, Nature, 354:84-88). Pueden utilizarse
también otros tipos de química para generación de bibliotecas de
diversidad química. Ejemplos no limitantes de químicas de biblioteca
de densidad química incluyen, péptidos (publicación PCT No.
WO 91/019735), péptidos codificados (publicación PCT No. WO
93/20242), bio-oligómeros aleatorios (publicación
PCT No. WO 92/00091), benzodiazepinas (Pat. U.S. No. 5.288.514),
diversómeros tales como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos
(Hobbs et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90:6909-6913), polipéptidos vinílogos (Hagihara
et al., 1992, J. Amer. Chem. Soc., 114:6568),
peptidomiméticos no peptídicos con entramado de glucosa (Hirschmann
et al., 1992, J. Amer. Chem. Soc.,
114:9217-9218), síntesis orgánica análoga de
bibliotecas de compuestos pequeñas (Chen et al., 1994,
J. Amer. Chem. Soc., 116:2661), oligocarbamatos (Cho et al.,
1993, Science, 261:1303),y/o peptidil-fosfonatos
(Campbell et al., 1994, J. Org. Chem., 59:658),
bibliotecas de ácidos nucleicos (véase Ausubel, Berger y Sambrook,
citados todos ellos anteriormente), bibliotecas de ácidos nucleicos
peptídicos (Pat. U.S. No. 5.6539.083), bibliotecas de anticuerpos
(v.g., Vaughn et al., 1996, Nature Biotechnology,
14(3):309-314) y Publicación PCT No.
WO97/00271 A), bibliotecas de carbohidratos (v.g., Liang et
al., 1996, Science, 274, 1520-1522) y Pat. U.S.
No. 5.593.853), bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas
(benzodiazepinas, Baum C&EN, Ene. 18, 1993, página 33; y Pat.
U.S. No. 5.288.514; isoprenoides, Pat. U.S. No. 5.569.588;
tiazolidinonas y metatiazanonas, Pat. U.S. No. 5.549.974;
pirrolidinas, Pat. U.S. Núms. 5.525.735 y 5.519.134; compuestos de
tipo morfolino, Pat. U.S. No. 5.506.337; y análogos).
Dispositivos para la preparación de bibliotecas
combinatorias están disponibles comercialmente (v.g., 357
MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville Ky.; Symphony, Rainin,
Woburn, Mass.; 433A Applied Biosystems, Foster City, Calif.; 9050
Plus, Millipore, Bedford, Mass.). Adicionalmente, un gran número de
bibliotecas combinatorias están disponibles comercialmente
(v.g., ComGenex, Princeton, N.J.; Asinex, Moscú, Rusia; Tripos,
Inc., St. Louis, Mo.; ChemStar, Ltd., Moscú, Rusia; 3D
Pharmaceuticals, Exton, Pa.; Martek Biosciences, Columbia, Md., y
análogos).
En una realización, la invención proporciona
ensayos in vitro basados en fase sólida en un formato de alta
capacidad, en donde la célula o tejido que expresa un canal iónico
está unida a un sustrato en fase sólida. En tales ensayos de alta
capacidad, es posible cribar hasta varios miles de moduladores o
ligandos diferentes en un solo día. En particular, cada pocillo de
una placa de microtitulación puede utilizarse para realizar un
ensayo separado contra un modulador potencial seleccionado, o bien,
si deben observarse efectos de concentración o de tiempo de
incubación, cada 5-10 pocillos pueden testar un solo
modulador. Así, una placa de microtitulación estándar simple puede
ensayar aproximadamente 96 moduladores. Si se utilizan placas de
1536 pocillos, entonces una sola placa puede ensayar con facilidad
desde aproximadamente 100 a aproximadamente 1500 compuestos
diferentes. Es posible ensayar varias placas diferentes en un solo
día; así, por ejemplo, son posibles cribados de ensayo de hasta
aproximadamente 6.000-20.000 compuestos diferentes
utilizando los sistemas integrados descritos.
En otro aspecto, la presente invención abarca
ensayos de cribado y detección de moléculas pequeñas (v.g.
fármacos) que implican la detección o identificación de
moléculas pequeñas que pueden fijarse a una proteína dada,
es decir, un polipéptido o péptido receptor del gusto. Se prefieren
particularmente ensayos adecuados para metodologías de cribado de
alta capacidad.
En dichos ensayos de detección, identificación o
cribado basados en aglutinación, no se requiere típicamente un
ensayo funcional. Todo lo que se necesita es una proteína diana, con
preferencia purificada sustancialmente, y una biblioteca o panel de
compuestos (v.g., ligandos, fármacos, moléculas pequeñas) o
entidades biológicas a cribar o ensayar respecto a la aglutinación
con la proteína diana. Preferiblemente, la mayoría de las
moléculas pequeñas que se fijan a la proteína diana
modularán la actividad de algún modo, debido a afinidad de fijación
preferencial y mayor a áreas o sitios funcionales en la
proteína.
Un ejemplo de un ensayo de este tipo es el
ensayo de desplazamiento térmico basado en fluorescencia
((3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc., 3DP, Exton,
Pa.) como se describe en Pat. U.S. Núms. 6.020.141 y 6.036.920
otorgadas a Pantoliano et al.; véase también J. Zimmerman,
2000, Gen. Eng. News, 20(8)). El ensayo permite la detección
de moléculas pequeñas (v.g., fármacos, ligandos) que se fijan
a polipéptidos de canales iónicos expresados, y preferiblemente
purificados, basados en determinaciones de afinidad de fijación por
análisis de curvas de despliegue térmico de complejos
proteína-fármaco o ligando. Los fármacos o
moléculas de fijación determinados por esta técnica pueden
ensayarse ulteriormente, en caso deseado, por métodos, tales como
los descritos en esta memoria, a fin de determinar si las
moléculas afectan o modulan la función o actividad de la
proteína diana.
Compuestos que son identificados de acuerdo con
los métodos proporcionados en esta memoria, y que modulan o regulan
la actividad biológica o la fisiología de los polipéptidos T1R de
acuerdo con la presente invención son una realización preferida de
esta invención. Se contempla que tales compuestos moduladores pueden
emplearse como se ha indicado anteriormente.
Ensayos que pueden utilizarse con uno o más T1Rs
de acuerdo con la invención incluyen a modo de ejemplo ensayos que
utilizan una selección genética para células vivas; ensayos que
utilizan células enteras o fragmentos de membrana o proteínas
receptoras de sabor purificadas; ensayos que utilizan segundos
mensajeros tale como cAMP e IP3, ensayos que detectan la
translocación de arrestina a la superficie celular, ensayos que
detectan la pérdida de expresión de receptores en la superficie
celular (internalización) por ligandos testados, ensayos directos
de fijación de ligandos, ensayos de fijación competitiva con
inhibidores, ensayos que utilizan proteínas traducidas in
Vitro, ensayos que detectan cambios de conformación respecto a
la fijación de un ligando (v.g., como se evidencia por proteólisis,
fluorescencia o NMR), ensayos de comportamiento que utilizan
animales transgénicos no humanos que expresan un GPCR de sabor o
una combinación de los mismos, tales como moscas, gusanos, o
ratones, ensayos que utilizan células infectadas con virus
recombinantes que contienen genes GPCR de sabor, que miden
preferiblemente el cambio en los niveles de calcio intracelulares
con relación a los niveles de calcio intracelulares sin poner en
contacto la célula con el modulador.
Una realización preferida adicional del método
de la presente invención se caracteriza porque el cambio es un
aumento.
Una realización preferida adicional del método
de la presente invención se caracteriza porque el cambio es un
aumento con relación a los niveles de calcio intracelulares cuando
la célula está en contacto con un modulador en la presencia de un
compuesto dulce intensificando con ello el nivel de calcio por
encima del nivel generado por el compuesto dulce solo. En este
caso, el modulador puede ser dulce por sí mismo o ser un compuesto
insípido que no tiene un potencial bioactivo para activar T1Rs o
combinaciones de los mismos por sí mismo. El compuesto dulce se
selecciona preferiblemente del grupo constituido por glucosa,
fructosa, sacarosa, acesulfamo K, sacarina, ciclamato, aspartamo,
xilitol, esteviósido, sucralosa, taumatina, monelina, brazzeína,
perillartina, glicirricina, ácido sucrónico,
P-4000, SC45647, NC174, neohesperidina y aminoácidos
de sabor dulce, seleccionados más preferiblemente del grupo
constituido por glucosa, fructosa, sacarosa o xilitol.
Una realización preferida adicional del método
de la presente invención se caracteriza porque el cambio es una
disminución con relación a los niveles intracelulares de calcio
cuando la célula se pone en contacto con un compuesto dulce en
lugar del modulador, seleccionándose preferiblemente el compuesto
dulce del grupo no exhaustivo constituido por glucosa, fructosa,
sacarosa, acesulfamo K, sacarina, ciclamato, aspartamo, xilitol,
esteviósido, sucralosa, taumatina, monelina, brazzeína,
perillartina, glicirricina, ácido sucrónico, P-4000,
SC45647, NC174, neohesperidina y aminoácidos de sabor dulce.
Otra realización preferida adicional de la
presente invención son moléculas de ácido nucleico que codifican un
T1R1, T1R2 o T1R3, representándose la secuencia en SEQ ID NOs. 3 y
4.
Dentro del contexto de la presente invención,
proteínas funcionalmente equivalentes tienen la misma función o una
función muy similar in vivo. Preferiblemente, las proteínas
funcionalmente equivalentes comparten al menos 60%, más
preferiblemente al menos 80%, especialmente al menos 90%,
ventajosamente al menos 99% de identidad en su secuencia de
aminoácidos.
Un ácido nucleico funcionalmente equivalente
codifica una proteína funcionalmente equivalente y está optimizado
para expresión en una célula eucariota. De acuerdo con una
optimización multiparamétrica, el uso de codones se adaptó al sesgo
de codones de genes de Homo sapiens. Adicionalmente, se han
evitado regiones de contenido muy alto (>80%) o muy bajo
(<30%) de GC siempre que ha sido posible. Durante el proceso de
optimización se evitaron los motivos de secuencia con acción cis
siguientes:
- a)
- secuencias TATA internas, sitios chi y sitios de entrada de ribosoma
- b)
- tramos de secuencia ricos en AT o ricos en GC
- c)
- elementos de secuencia ARE, INS, CRS
- d)
- secuencias de repetición y estructuras secundarias de RNA, así como
- e)
- sitios donantes y aceptores de remodelación (crípticos), y puntos de ramificación.
El proceso de optimización, partiendo de las
secuencias de tipo salvaje humanas (wt_hT1R) reveló varias
secuencias; sorprendentemente, las secuencias que ofrecían la
eficiencia óptima (sh_T1R) en la generación de líneas de células
funcionales estables sobre la base del enfoque de expresión
multicistrónico no eran aquéllas que tenían la secuencia
teóricamente óptima (opt_hT1R) ni las secuencias de tipo salvaje.
Las diferencias de las secuencias aquí citadas como ejemplos se
ilustran como una alineación filogenética (generada por el software
bioinformático Clustal X) con una matriz de distancia relativa
acompañante en la Figura 1.
Una realización muy preferida de la presente
invención son vectores de expresión multicistrónicos que comprenden
más de un cistrón que codifica un GPCR.
Dicho vector de expresión multicistrónico
comprende preferiblemente aguas abajo de un promotor para la
expresión en una célula hospedadora eucariota y enlazado
funcionalmente al mismo, los cistrones siguientes:
- a.
- GPCR_{1}
- b.
- GPCR_{2} y un
- c.
- marcador de selección,
en donde el promotor es preferiblemente un
promotor fuerte, seleccionándose más preferiblemente del grupo
constituido por el promotor de citomegalovirus
(P-CMV), el promotor del factor de elongación humano
1-alfa (P-E1\alpha), el promotor
ubiquitina humano (P-ubi), el promotor del virus de
los simios (P-SV40), el promotor de la repetición
terminal larga del virus del sarcoma de Rous
(P-RSV-LTR) y similares en donde el
GPCR_{1} y el GPCR_{2} se seleccionan, independientemente uno
de otro, del grupo constituido por los receptores de sabor T1R o
T2R, preferiblemente del grupo de receptores T1R, más
preferiblemente una combinación de T1R1-T1R3 o
T1R2-T1R3, y en donde el marcador de selección se
selecciona del grupo constituido por higromicina^{r},
zeocina^{r}, neomicina^{r}, blasticidina^{r} o
puromicina^{r}, y en donde tanto el GPCR1 como el GPCR2, así como
el marcador de selección están conectados funcionalmente por IRES
interpuestos seleccionados del grupo constituido por IRES_{EMCV},
derivado del virus de la encefalomiocarditis (sinónimo:
CITE_{EMCV}); IRES_{GTX}, derivado del mRNA del homeodominio
GTX; IRES_{Rbm3}, derivado de Rbm3 inducido por frío; IRES_{pv},
derivado de origen polio-viral, IRES_{RV},
derivado de rinovirus, IRES_{FMDV}, derivado del virus de la
fiebre aftosa; IRES_{HV}, derivado del virus de la hepatitis C,
IRES_{CSFV}, derivado del virus de la fiebre porcina clásica,
IRES_{BVDV}, derivado del virus de la diarrea viral de los
bovinos; IRES_{FMLV}, derivado del mRNA gag del virus de
la leucemia murina de Friend; IRES_{MMLV}, derivado del mRNA
gag del virus de la leucemia murina de Moloney;
IRES_{HIV}, derivado del mRNA env del virus de la
inmunodeficiencia humana; IRES_{PSIV}, derivado del virus
intestinal de Plautia stali; IRES_{RPV}, derivado del virus
de Rhopalosiphum padi; IRES_{KSH}, derivado del
herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi, preferiblemente el
IRES_{EMCV}, derivado del virus de la encefalomiocarditis
(sinónimo: CITE_{EMCV}) y en donde la unidad de expresión
multicistrónica está terminada por una señal de poliadenila-
ción.
ción.
Otra realización preferible de la presente
invención es un vector multicistrónico como se ha definido arriba,
comprendiendo el vector adicionalmente un cistrón que codifica una
proteína G, preferiblemente G-alfa15, estando
localizada preferiblemente la proteína g entre el último GPCR y el
marcador de selección, y estando conectada funcionalmente a ambos
por un elemento IRES como se ha definido arriba.
Una realización preferida adicional son líneas
de células transformadas con los vectores de la presente invención.
Líneas de células eucariotas respectivas son células de anfibio,
gusano, insecto o mamífero tales como CHO, HeLa,
Hek-293 y análogas, v.g. células cultivadas,
explantes, y células in vivo.
Preferiblemente, la célula hospedadora se
selecciona del grupo constituido por: HEK293 (riñón de embrión
humano), HeLa (carcinoma epiteloide de cérvix humana negroide),
HT29 ((adenocarcinoma de colon humano caucasiano grado II), A431
(carcinoma escamoso humano), IMR32 (neuroblastoma humano
caucasiano), K562 (leucemia mielógena humana caucasina crónica),
U937 (linfoma histiocítico humano caucasiano),
MDA-MB-231 (adenocarcinoma de mama
humano caucasiano),
SK-N-BE(2) (neuroblastoma
humano caucasiano), SH-SY5Y (neuroblastoma humano),
HL60 (leucemia humana promielocítica) o líneas de células
eucariotas no humanas como CHO-K1 (ovario de hámster
chino), COS-7 (riñón de mono verde africano,
transformadas con SV40), S49 (linfoma de ratón), Ltk (tejido
conectivo de ratón C34/An), NG108-15 (híbrido
Neuroblastoma de ratón x Glioma de rata), B50 (tejido nervioso
neuronal de rata, ECACC), C6 (tumor glial de rata), Jurkat
(linfoblastos de células T de la leucemia humana), BHK (riñón de
hámster sirio), Neuro-2a (neuroblastoma de ratón
albino), NIH/3T3 (fibroblastos de embrión de ratón), preferiblemente
HEK (riñón de embrión humano), HeLa (carcinoma epiteloide de cérvix
humano negroide), CHO-K1 (ovario de hámster chino)
o Neuro 2a (neuroblastoma de ratón albino).
Adicionalmente, realizaciones preferidas de la
presente invención son los moduladores de GPCRs identificables por
los métodos de la presente invención y caracterizados adicionalmente
por estar seleccionados del grupo constituido por azúcares,
esteroides, taninos y lignanos, terpenos, quinonas, macrociclos,
heterociclos, N-heterociclos y
O-heterociclos, alifáticos y poliquétidos,
flavonoides, proteínas, péptidos y aminoácidos, alcaloides y
arenos, como se ha indicado arriba.
Las intensas investigaciones de los autores de
la presente invención que condujeron al establecimiento del método
de la presente invención demostraron que la
co-expresión recombinante de dichos receptores de
sabor como integrantes estables de células hospedadoras eucariotas
se ve dificultada por una inestabilidad común. Aunque el fenómeno
está lejos de ser comprendido, podría ser posible que la expresión y
transducción de señales específica de estos receptores de tipo T1R
interfiera de manera negativa con la fisiología celular de dichas
células hospedadoras estables.
Dentro del contexto de la presente invención,
una integración inestable se caracteriza por una pérdida rápida de
funcionalidad dentro de los primeros 10 pasos de un clon de la línea
de células recombinante seleccionada. Dentro de estos primeros diez
pasos, resulta evidente que cada vez más células de un clon
recombinante seleccionado liberan su expresión característica
funcional del GPCR de sabor, lo que viene indicado por una
disminución progresiva dependiente del paso de las inducciones de
calcio inducidas por edulcorantes (medidas Fluo-4).
En contraste, los integrantes estables de la presente invención se
caracterizan porque exhiben una expresión funcional de dichos
receptores de sabor al menos a lo largo de 50 pasos, lo que está
indicado por inducciones estables de calcio inducidas por
edulcorantes estables (medidas Fluo-4) con un clon
seleccionado de una línea de células que expresan receptores
de
sabor.
sabor.
Como queda claro por la presente memoria
descriptiva de la invención, el uso y la expresión
hetero-oligómera de las combinaciones de receptores
del gusto T1R1/T1R3 y más preferiblemente T1R2/T1R3 para identificar
compuestos como moduladores del sabor dulce en el campo de los
saborizantes son realizaciones especialmente preferidas de la
presente invención.
De acuerdo con ello, esta invención se refiere a
GPCRs de tipo T1R manipulados genéticamente de modo recombinante
que tienen actividad en ensayos de saborizantes basados en células,
que pueden obtenerse por (a) mejora de la secuencia codificante de
los receptores de sabor dulce humanos (T1Rs) y/o (b) clonación de
los mismos en una unidad de expresión multicistrónica para
expresión coordinada y selección simultanea para la generación de
sistemas de células eucariotas estables; y/o (c) marcación de uno o
ambos GPCRs en el complejo de expresión heterodímero con proteínas
G o quimeras de proteínas G para hacer posible una lectura mejorada
de fluorescencia con objeto de la identificación de moduladores
GPCR, preferiblemente compuestos moduladores de sabor
dulce.
dulce.
Secuencias de receptores aplicadas para la
invención aquí presentada se ilustran adicionalmente en el Ejemplo
1. Por adición de un prefijo, los receptores optimizados han sido
designados shT1R2 y shT1R3. Las secuencias respectivas de
aminoácidos se representan en SEQ ID Nos. 1 y 2, y las secuencias
de ácido nucleico respectivas en SEQ ID Nos. 3 y 4.
Un medio adicional de la presente invención para
resolver la inestabilidad de los GPCRs
co-expresados, preferiblemente los receptores de
sabor T1R2 y T1R3 en el desarrollo de líneas de células estables es
la construcción de unidades de transcripción multicistrónicas. El
método para obtener un vector de expresión multicistrónico para la
expresión simultánea de receptores de sabor y un marcador de
selección de la invención se ilustra adicionalmente en el Ejemplo
2. Como se ha indicado anteriormente, el desarrollo de líneas de
células estables que expresan T1R2/T1R3, v.g. Hek293, CHO o Hela en
cuanto a su uso en sistemas de ensayo basados en células se ve
dificultado por inestabilidades resultantes dentro del proceso de
cultivo de células eucariotas en curso y los números de pasos. Para
la generación de líneas de células estables en la técnica, se
utilizan en la mayoría de los casos vectores de expresión en los
cuales el marcador de selección, que confiere resistencia a v.g.,
neomicina, higromicina, zeocina, blasticidina o puromicina, está
codificado de hecho en el mismo vector plasmídico bajo el control
de un promotor
independiente.
independiente.
Esta situación puede evitarse si los receptores
y el marcador de selección están codificados en una unidad de
transcripción multicistrónica.
Sin embargo, hasta ahora se han descrito
vectores de expresión multicistrónicos únicamente para uso de
expresión inducible de proteínas, v.g. para aplicaciones de terapia
génica (Fussenegger et al., 1998; Moser et al.,
2000).
Para la presente invención, los dos receptores
de sabor shT1R2 y shT1R3 han sido clonados en la posición primera y
segunda de una unidad de expresión tricistrónica, en tanto que el
gen que confiere resistencia al marcador de selección blasticidina
se clonó en la tercera posición de la unidad de expresión. La unidad
tricistrónica se encuentra bajo el control del promotor del factor
de elongación humano fuerte 1-alfa y los genes en la
segunda y tercera posiciones están precedidos por un elemento IRES
para facilitar la iniciación de su traducción en el mRNA
resultante.
Hasta ahora, no se ha descrito un sistema de
expresión multicistrónico de 8 kb para la expresión funcional
estable de GPCRs localizados en la membrana. Usualmente estos
sistemas multicistrónicos - ya en expresiones de productos génicos
mucho más pequeños como proteínas fluorescentes - se caracterizan
por una expresión no estequiométrica y decreciente con la distancia
incrementada del promotor. Dado que los GPCRs de sabor excedían
notablemente del tamaño de la GFP o de los genes utilizados hasta
ahora en sistemas de expresión tri- o cuadricistrónicos; y por el
hecho de que los GPCRs tienen que co-expresarse para
formar un complejo proteínico heterodímero a fin de funcionar como
receptores sensibles a los edulcorantes, fue un resultado
imprevisible y sorprendente de las intensas investigaciones que
condujeron a la presente invención que únicamente el uso de vectores
multicistrónicos, es decir vectores tri- o tetracistrónicos
conduzca a resultados satisfactorios en el establecimiento del
método de cribado de la presente invención.
En una realización adicional, esta invención se
refiere a métodos que utilizan el vector de expresión
multicistrónico mencionado anteriormente para crear líneas de
células estables adecuadas para expresar polipéptidos T1R a fin de
construir una herramienta de cribado basada en células para la
búsqueda de nuevos compuestos en el campo de los moduladores del
sabor dulce. Preferiblemente, las células comprenden una proteína G
funcional, v.g., G-alfa-15,
G-alfa-16 o una proteína G quimérica
como las identificadas previamente con término C alterado:
- a)
- sustitución de los últimos cinco aminoácidos de G-alfa-15:
- \quad
- G-alfa_15 (EINLL), reemplazado con EYNLV (G-alfa q y G-alfa 11), EFNLV (G-alfa 14), QYELL (G-alfa s y G-alfa olf), DCGLF (G-alfa i1, G-alfa i2, G-alfa t1, G-alfa t2, y G-alfa gust), ECGLY (G-alfa i3), GCGLY (G-alfa ol y G-alfa o2), YIGLC (G-alfa z), DIMLQ (G-alfa 12), QLMLQ (G-alfa 13) o G-alfa 16 reemplazado con ECGLY (G-alfa 16 i3)
- b)
- sustitución de los cuarenta y cuatro últimos aminoácidos carboxi-terminales de G-alfa-16:
- \quad
- G-alfa 16gust44 (44 aminoácidos de la proteína G gustducina) G-alfa 16z44 (44 aminoácidos de G-alfa-z); G-alfa 16C44i2 (44 aminoácidos de la G-alfa-i2); G-alfa 16C44i3 (44 aminoácidos de la G-alfa-i3);
u otra proteína G que es capaz de acoplar el
receptor quimérico a un camino de señalización intracelular o a una
proteína de señalización tal como fosfolipasa C. (Li et al.,
2002; Offermanns, 2003; Offermanns y Simon, 1995; Ueda et
al., 2003). Para este propósito, células HEK 293 que comprenden
una proteína G funcional se han transfectado con el vector
pTrix-Eb_R2R3, cultivado en presencia de
blasticidina, y se han seleccionado líneas de células estables.
Como se muestra en el Ejemplo 3, se ha encontrado que tales células
exhiben respuestas a estímulos de sabor y adicionalmente estas
líneas de células tienen - comparadas con las derivadas de vectores
de expresión T1R monocistrónicos - una expresión estable
intensificada de los polipéptidos T1R. Una línea de células estable
basada en el vector de expresión pTrix-Eb_R2R3
(véase el Ejemplo 3) exhibe respuestas de calcio a diversos
edulcorantes artificiales y una proteína edulcorante natural. Estas
respuestas pueden medirse todavía después de más de 50 pasos del
clon objeto de selección con blasticidina y G418. Tales resultados
no podían alcanzarse con expresiones monocistrónicas o
bicistrónicas. Los resultados de RT-PCR de clones
monocistrónicos revelaron la pérdida de ambos receptores con los
cinco a diez pasos iniciales en condiciones de selección. La línea
de células estable HEK_Ga15#17R2R3b #8 exhibe también respuestas de
calcio dependientes de la dosis para los saborizantes dulces arriba
indicados, correlacionadas con las respuestas de sabor
fisiológicas.
Un efecto inesperado adicional es que estas
líneas de células que expresan receptores de sabor multicistrónicos
estables son muy adecuadas para cribado de compuestos naturales
utilizando preparaciones de extractos microbianos complejas. Para
el aislamiento y la preparación de tales muestras de cribado
complejas pueden aplicarse métodos microbianos estándar que abarcan
el cultivo de microorganismos. Metabolitos bioactivos de interés de
tales cultivos pueden incluir moléculas intracelulares así como las
secretadas en los medios de cultivo. Dependiendo del número de
muestras a procesar, puede hacerse generalmente una elección entre
diferentes opciones: (i) calentamiento del caldo total; (ii)
filtración del sobrenadante de caldo a través de un filtro de
expresión de peso molecular alto con liofilización subsiguiente del
filtrado; (iii) extracción del caldo entero (tratamiento por
ultrasonidos, prensa francesa, bombas de disgregación de células o
dispositivos similares) o el sobrenadante del caldo con disolventes
orgánicos de polaridad variable (v.g. cloroformo, acetona, metanol o
acetato de etilo) seguido por evaporación de los extractos a
sequedad; (iv) mezcla del caldo total o el sobrenadante del caldo
con resinas (v.g. Amberlite®, XAD-2,
XAD-4, XAD-9 o similar) con
extracción subsiguiente en fase sólida con disolventes orgánicos
(v.g. acetona, ácido acético, butanol, etanol, acetato de etilo,
metanol, poliglicoles o similares), sea fraccionados por aplicación
de concentraciones crecientes de disolvente o como lote total por
aplicación del disolvente puro sin fraccionamiento. Los extractos en
fase sólida pueden utilizarse directamente en sistemas de ensayo
adecuados o evaporarse ulteriormente a sequedad y resolverse en
condiciones normalizadas para testado subsiguiente, v.g. la
activación de receptores del sabor en ensayos basados en células.
La activación de los receptores T1R en tales células puede
detectarse utilizando métodos estándar cualesquiera, por ejemplo
por detección de cambios en el calcio intracelular detectando la
fluorescencia dependiente de Fluo-4 en la célula.
Un ensayo de este tipo es la base de los descubrimientos
experimentales presentados en esta solicitud.
De manera similar, pueden utilizarse también
extractos de plantas bien conocidos por los expertos.
En la Figura 3, se representa la actividad de
una línea de células estable derivada con el plásmido de expresión
multicistrónico Ptrix-Eb-R2R3 en un
fondo de proteína G G-alfa15. Los datos de la Figura
3 documentan que estas líneas de células, entre varias otras líneas
de células aisladas, muestran actividad dependiente de T1R2/T1R3 en
ensayos basados en células frente a varios saborizantes como
ciclamato, D-fenilalanina, sacarina, acesulfamo K,
aspartamo y taumatina.
En una realización adicional, esta invención se
refiere al uso de genes de fusión T1R-proteína G
para el desarrollo de ensayos basados en células dependientes de
T1R. Se ha demostrado que los GPCRs pueden fusionarse en marco con
diferentes polipéptidos sin disminución de su actividad funcional
(Milligan et al., 2003). A partir de los presentes datos no
puede preverse que una fusión de una proteína G funcional con
cualquier GPCR conduzca a una actividad mejorada comparada con la
situación no fusionada de tipo salvaje. No obstante, se ha
programado el desarrollo de proteínas de fusión con T1R2 y/o T1R3
en las cuales el T1R-GPCR está fusionado a una
proteína G funcional que es capaz de conectar la señalización
dependiente de T1R con los caminos de inducción de calcio
utilizados para medida de la actividad dependiente de T1R en ensayos
basados en células como se ilustra en el Ejemplo 3.
Preferiblemente, las proteínas de fusión con T1R comprenden una
proteína G funcional, v.g. proteína
G-alfa-15 o proteína G quimérica
como las identificadas previamente, u otra proteína G que es capaz
de acoplar el receptor quimérico a un camino de señalización
intracelular o a una proteína de señalización tal como fosfolipasa
C. (Offermanns, 2003; Offermanns y Simon, 1995; Ueda et al.,
2003). Para el desarrollo de tales ensayos basados en células, las
proteínas de fusión se subclonarán en la cadena principal del vector
de expresión multicistrónico conduciendo al vector de expresión del
tipo
pTrix-Eb-R2Gq-R3
representado en la Figura 4.
Las figuras muestran:
Figura 1: Alineación bioinformática con software
Clustal X: Se presentan diferentes secuencias de nucleótidos GPCR
de la clase T1R en un análisis de alineación. Se representan
secuencias de cDNA humano de tipo salvaje como wt_hT1Rs; las
secuencias de cDNA teóricamente más optimizadas después de la
optimización multiparamétrica se representan como opt_hT1Rs; los
cDNAs parcialmente optimizados utilizados para desarrollo de líneas
de células estables se designan sh_T1Rs. Las alineaciones de
nucleótidos se presentan como árboles filogenéticos en los cuales
se definió como grupo extraño wt_T1R1. La matriz de distancia
subyacente se muestra abajo.
Figura 2: Vector de expresión eucariota
mulcistrónico pTrix-Eb-R2R3: La
expresión de los genes receptores de sabor shT1R2, shT1R3 y el gen
de blasticidin-S-desaminasa (bsd) se
encuentran bajo el control del promotor del factor de elongación
humano 1-alfa (PEF1a). Para conferir expresión
multicistrónica al nivel de traducción se han insertado dos sitios
de entrada de ribosoma internos (Cite I y Cite II). La unidad
multicistrónica está terminada por un sitio de poliadenilación del
virus 40 de los simios. El origen de replicación procariota (ori) y
el gen de resistencia a kanamicina sirven para la propagación,
amplificación y selección del vector plasmídico en E.
coli.
Figura 3: El HEK_Ga15#17R2R3b #8 estable se
seleccionó con blasticidina y G418 después de transfección del
HEK_Ga15#17 estable (G418) con pTriX_Eb_R2R3. Esta expresión
tricistrónica era necesaria para la selección y recuperación de
clones estables. El clon #8 exhibe respuestas de calcio a varios
edulcorantes artificiales y una proteína edulcorante natural.
Figura 4: Vector de expresión eucariota
multicistrónico pTrix-Eb-R2R3: La
expresión de los genes receptores de sabor
shT1R2-Gq, shT1R3 y el gen de
blasticidin-S-desaminasa (bsd) se
encuentran bajo el control del promotor del factor de elongación
humano 1-alfa (PF1a). Para conferir expresión
multicistrónica al nivel de traducción se han insertado dos sitios
de entrada ribosómicos internos (Cite I y Cite II). La unidad
multicistrónica está terminada por un sitio de poliadenilación del
virus 40 de los simios. El origen de replicación procariota (ori) y
el gen de resistencia a la kanamicina sirven para la propagación,
amplificación y selección del vector plasmídico en E.
coli.
Transfección/selección transitoria de células
HEK293 estables - Pueden realizarse transfecciones transitorias y
estables con complejos lipídicos tales como precipitación con
fosfato de calcio, reactivo Lipofectamina/PLUS (Invitrogen),
Lipofectamina 2000 (Invitrogen) o MIRUS TransIT293 (Mirus Bio
Corporation) de acuerdo con los manuales. La electroporación puede
ser también un método de elección para transfección estable de
células eucariotas.
Las células se siembran en placas de 6 pocillos
a una densidad de 4 x 10^{5} células/pocillo. Se transfectan
células HEK293 con plásmidos linealizados para expresión estable de
los genes de interés. Después de 24 horas, comienza la selección
seleccionando reactivos tales como zeocina, higromicina, neomicina o
blasticidina. Se siembran aproximadamente 50 \mul a 300 \mul de
células tripsinizadas transfectadas desde un 6 pocillos (sic) en
una cápsula de 100 mm y se añade el antibiótico necesario en una
concentración apropiada. Las células se cultivan hasta que son
visibles los clones en la placa de cultivo de células de 100 mm.
Estos clones se seleccionan para cultivo ulterior y obtención de
imágenes de calcio. Son necesarias aproximadamente 4 a 8 semanas
para seleccionar los clones de células que expresan de manera
estable los genes de interés.
Ensayo Fluo-4 AM con células
HEK293 estables - Se mantienen células estables en medio DMEM rico
en glucosa (Invitrogen) complementado con 10% de suero bovino fetal
(Biochrom) y L-glutamina 4 mM (Invitrogen). Las
células para obtención de imágenes de calcio se mantienen en medio
DMEM pobre en glucosa complementado con 10% de FBS y 1x
Glutamax-1 (Invitrogen) durante 48 horas antes de la
siembra. Estas células estables se tripsinizan después de 48 horas
(sea con tripsina-EDTA, Accutase o TrypLE) y se
siembran sobre placas de ensayo de 96 pocillos recubiertas con
poli-D-lisina (Corning) a una
densidad de 45.000 células/pocillo en medio DMEM pobre en glucosa
complementado con 10% de FBS y 1x Glutamax-1.
Al cabo de 24 horas, se cargaron las células en
100 \mul de medio con 100 \mul adicionales de
Fluo-4 4\muM (tinte sensible al calcio,
concentración final 2 \muM; Molecular Probes) en tampón
Krebs-HEPES (KH) durante una hora. El reactivo de
carga se reemplaza luego por 80 \mul de tampón KH por pocillo. El
tampón Krebs-HEPES es una solución salina
fisiológica que incluye CaCl_{2} 1,2 mM, NaHCO_{3} 4,2 mM y
HEPES 10 mM.
Las células estables cargadas con tinte en
placas se pusieron en una placa de microtitulación de fluorescencia
para monitorizar el cambio de la fluorescencia (excitación 488 nm,
emisión 520 nm) después de la adición de 20 \mul de tampón KH
complementado con 5x saborizantes. Para cada traza, el saborizante
se añadió 11,5 segundos después del comienzo del escaneo y se
mezcló dos veces con el tampón, se continuó el escaneo durante 32
segundos más, y se recogieron los datos cada segundo.
Análisis de los datos/Registro de los datos - Se
cuantificó la movilización del calcio como el cambio de
fluorescencia pico (\DeltaF) por encima del nivel de la línea
base (F). Los datos se expresaron como el error estándar (E.E)
medio del valor \DeltaF/F de muestras independientes replicadas.
El análisis se realizó con el software del lector de placas de
microtitulación.
Los ejemplos siguientes se proporcionan para
ilustrar realizaciones preferidas de la invención. En las secuencias
de DNA presentadas en esta memoria, los códigos de una sola letra N
o n se refieren a cualquiera de las cuatro bases nucleotídicas
comunes, A, T, C o G. En las secuencias de proteínas presentadas en
esta memoria, el código de una sola letra X o Xaa se refiere a
cualquiera de los veinte residuos de aminoácidos comunes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Las secuencias de nucleótidos de los receptores
humanos hT1R2 y hT1R3 están basadas en sus DNAs codificantes de
tipo salvaje y han sido optimizadas de acuerdo con un análisis
multiparamétrico considerando uso óptimo de codones, sitios de
remodelación crípticos supuestos, secuencias repetidas supuestas así
como tramos de secuencia ricos en AT o ricos en GC. La optimización
de genes tiene a menudo efectos favorables sobre la estabilidad
mejorada del mRNA, eficiencia de traducción y estructura secundaria
reducida del RNA a fin de prevenir la pausa en la transcripción o
la terminación prematura del alargamiento de transcripción.
Hasta ahora, se conocen solamente los sitios de
fijación para un pequeño número de ligandos del receptor de sabor
dulce T1R2/T1R3 heterodímero. Por tanto, las secuencias de
aminoácidos de tipo salvaje codificadas de los receptores se
mantuvieron inalteradas en esta optimización multiparamétrica, a fin
de retener las cualidades de fijación de los receptores.
La síntesis y construcción de los cDNAs
receptores se realizó por la vía del ensamblaje de oligonucleótidos
sintéticos y clonación subsiguiente en un vector de plásmido pUC18
estándar para amplificación ulterior. Alternativamente, estos
ácidos nucleicos pueden clonarse in vitro por técnicas de
clonación bien conocidas. (Ausubel et al., 1998; Pachuk
et al., 2000; Sambrook et al., 1989; Stemmer et
al., 1995). Pueden obtenerse luego fragmentos de DNA
bicatenario por síntesis de la cadena complementaria y reasociación
de las cadenas juntas en condiciones apropiadas, o por adición de
la cadena complementaria utilizando DNA-polimerasa
con una secuencia iniciadora apropiada.
Debido a la generación sintética de los cDNAs,
los receptores de la presente invención se han descrito con el
prefijo "s" y han sido designados shT1R2 y shT1R3. Las
secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos para las secuencias
clonadas T1R arriba mencionadas, así como otras secuencias T1R de
longitud total y parciales se indican en el protocolo de
secuencias.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Para la construcción de una unidad de expresión
multicistrónica se han utilizado las secuencias receptoras de sabor
que se exponen en el Ejemplo 1. Como se muestra en la Figura 2, la
unidad de expresión tricistrónica se encuentra bajo el control del
promotor del factor de elongación humano 1-alfa.
Utilizando técnicas estándar de clonación, se han clonado el cDNA
para los receptores shT1R2 y shT1R3 y el cDNA para el gen de
blasticidin-S-desaminasa. A fin de
permitir la iniciación de la traducción de cada gen de esta unidad
tricistrónica, se han insertado dos sitios de entrada de ribosoma
internos derivados del virus EMC (IRES - denominado también
intensificador de la traducción independiente de Cap (CITE)).
(Jackson et al., 1990; Jang et al., 1988) La unidad de
expresión tricistrónica está terminada por una secuencia señal de
poliadenilación del virus 40 de los simios. Esta composición
permite la expresión simultánea de los tres genes bajo el control de
un solo promotor. En contraste con las unidades de transcripción
monocistrónicas, que se integran independientemente una de otra en
diferentes localizaciones cromosómicas durante el proceso de
desarrollo de líneas de células estables, la unidad de transcripción
tricistrónica integra todos los genes que se contienen en uno y el
mismo locus cromosómico. Debido a la alineación de los genes, el
gen de blasticidin-S-desaminasa se
transcribe únicamente en el caso de que tenga lugar una
transcripción de longitud total. Además, la polaridad de las
unidades de transcripción multicistrónicas (Moser et al.,
2000) conduce probablemente a una estequiometría equilibrada de los
genes receptores y sus tasas de expresión en el intervalo de 1:0,7
hasta 1:1 para las dos primeras posiciones, en tanto que el gen de
blasticidin-S-desaminasa comparado
con los genes receptores en la tercera posición se expresa en menor
proporción. Suponiendo que para el receptor heterodímero funcional
shT1R2/shT1R3 es necesaria una estequiometría 1:1, los efectos de
menor polaridad para los genes receptores promueven la
estequiometría deseada, mientras que la expresión reducida de la
desaminasa promueve un locus de integración con actividad de
transcripción intensificada.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
En las células del gusto de tipo salvaje - v.g.
en las papilas gustativas humanas - la transducción de señales es
transducida probablemente por las proteínas G gustducina y/o por las
proteínas G del tipo G alfa-i. Al enfrentarse a
ligandos dulces, el receptor de sabor heterodímero T1R2/T1R3
reacciona con inducción de moléculas de segundo mensajero; o bien
la inducción del nivel de cAMP en respuesta a la mayoría de los
azúcares o la inducción del nivel de calcio en respuesta a la
mayoría de los edulcorantes artificiales (Margolskee, 2002).
Para analizar la función y la actividad del
receptor de sabor heterodímero T1R2/T1R3, se ha utilizado un ensayo
basado en células dependientes de calcio. Resumidamente, se han
transfectado receptores de sabor sintéticos de tipo T1R (como se
muestra en el Ejemplo 1) con el vector plasmídico
pTrix-Eb-R2R3 (véase el Ejemplo 2)
en una línea de células HEK293 que expresa establemente la proteína
G de ratón G-alfa-15. La selección
de células que expresan T1R2/T1R3 se ha realizado por cultivo de
las células transfectadas en presencia de blasticidina.
Para la medida de la actividad dependiente de
los receptores de sabor T1R2/T1R3, se sembraron 4 x 10^{4}
células HEK293 que expresaban de manera estable
G-alfa-15, shT1R2 y shT1R3 en placas
de 96 pocillos y se marcaron con el tinte de fluorescencia sensible
al calcio Fluo4-AM (2 \muM) en medio de cultivo
DMEM durante 1 hora a 37ºC. Para la medida en un lector de placas
de fluorescencia, se cambió el medio por tampón KH y se incubó
durante 15 minutos más a 37ºC. La medida de la fluorescencia de las
células marcadas se condujo en un lector de placas de fluorescencia
Novostar (BMG, Offenburg, Alemania). La respuesta a distintos
saborizantes como se representa en la Figura 3 se registró como
aumento de fluorescencia Fluo4-AM iniciado por el
aumento dependiente de T1R2/T1R3 del segundo mensajero calcio.
Después de obtener las señales de calcio para cada muestra, se
cuantificó la movilización del calcio en respuesta a los
saborizantes como el cambio relativo (fluorescencia pico F1 - nivel
de fluorescencia F0 de la línea base, designado como dF) respecto a
su propio nivel de fluorescencia de línea base (designado como F0).
Por tanto, la RFU relativa es dF/F0. La intensidad de fluorescencia
pico se alcanzó aproximadamente 20-30 s después de
la adición de saborizantes. Los datos presentados se obtuvieron a
partir de dos experimentos independientes y realizados por
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que modulan la actividad de receptores
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\hskip-.1em\dddseqskipacoplados a proteína g
\hfill
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<210> 1
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<212> PRT
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<213> sintético
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<400> 1
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\hskip0,8cm
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\hskip0,8cm
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<210> 2
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<211> 2582
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Claims (15)
1. Un método para la identificación de
moduladores de GPCRs, que comprende los pasos de:
- a.
- transformar una célula hospedadora eucariota con secuencias genéticas que codifican más de un GPCR(s), en donde esta transformación se realiza con un vector de expresión multicistrónico que comprende una unidad de expresión multicistrónica que comprende aguas abajo de un promotor para la expresión en un hospedador eucariota y enlazados funcionalmente al mismo, los cistrones siguientes:
- i.
- GPCR_{1}
- ii.
- GPCR_{2} y un
- iii.
- marcador de selección
- b.
- cultivar las células hospedadoras transformadas en condiciones suficientes para la expresión funcional de dichos GPCRs,
- c.
- poner en contacto la célula hospedadora cultivada que expresa los GPCRs de una manera funcional con un modulador potencial de los GPCRs seleccionados,
- d.
- medir una respuesta celular seleccionada de la célula hospedadora transformada por exposición al modulador potencial, y
- e.
- seleccionar un identificador, que induce una respuesta específica.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque la célula hospedadora se selecciona del
grupo constituido por: HEK293 (riñón de embrión humano), HeLa
(carcinoma epiteloide de cérvix humano negroide), HT29
(adenocarcinoma de colon humano caucasiano grado II), A431
(carcinoma escamoso humano), IMR32 (neuroblastoma humano
caucasiano), K562 (leucemia mielógena humana caucasina crónica),
U937 (linfoma histiocítico humano caucasiano),
MDA-MB-231 (adenocarcinoma de mama
humano caucasiano),
SK-N-BE(2) (neuroblastoma
humano caucasiano), SH-SY5Y (neuroblastoma humano),
HL60 (leucemia humana promielocítica) o líneas de células eucariotas
no humanas como CHO-K1 (ovario de hámster chino),
COS-7 (riñón de mono verde africano, transformadas
con SV40), S49 (linfoma de ratón), Ltk (tejido conectivo de ratón
C34/An), NG108-15 (híbrido Neuroblastoma de ratón x
Glioma de rata), B50 (tejido nervioso neuronal de rata, ECACC), C6
(tumor glial de rata), Jurkat (linfoblastos de células T de la
leucemia humana), BHK (riñón de hámster sirio),
Neuro-2a (neuroblastoma de ratón albino), NIH/3T3
(fibroblastos de embrión de ratón), preferiblemente HEK (riñón de
embrión humano), HeLa (carcinoma epiteloide de cérvix humano
negroide), CHO-K1 (ovario de hámster chino) o Neuro
2a (neuroblastoma de ratón
albino).
albino).
3. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el uno
o más GPCR(s) es un GPCR de tipo T1R, especialmente T1R1,
T1R2 y/o T1R3.
4. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dos o
más GPCRs se expresan en una co-expresión heteróloga
de al menos dos GPCRs diferentes de tipo T1R, preferiblemente
T1R1/T1R3, y más preferiblemente T1R2/T1R3.
5. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la
transformación se realiza con un vector de clonación tricistrónico
o tetracistrónico.
6. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el
promotor es un promotor fuerte adecuado para uso en la célula
hospedadora seleccionada, que se selecciona preferiblemente del
grupo constituido por el promotor de citomegalovirus
(P-CMV), el promotor del factor de elongación humana
1-alfa (P-E1\alpha), el promotor
ubiquitina humano (P-ubi), el promotor del virus de
los simios (P-SV40), el promotor de la repetición
terminal larga del virus del sarcoma de Rous
(P-RSV-LTR),
en donde el GPCR1 y el GPCR2, independientemente
uno de otro, se seleccionan del grupo constituido por receptores de
sabor T1R y T2R, preferiblemente del grupo de receptores T1R, más
preferiblemente una combinación de T1R/T1R3 o T1R2/T1R3,
en donde el marcador de selección se selecciona
del grupo constituido por higromicina, zeocina^{r},
neomicina^{r}, blasticidina^{r} o puromicina^{r};
en donde ambos GPCR_{1} y GPCR_{2}, así como
el marcador de selección están conectados funcionalmente por IRES
interpuestos seleccionados del grupo constituido por IRES_{EMCV},
derivado del virus de la encefalomiocarditis (sinónimo:
CITE_{EMCV}); IRES_{GTX}, derivado del mRNA del homeodominio
GTX; IRES_{Rbm3}, derivado de Rbm3 inducible por frío;
IRES_{PV}, derivado de origen polioviral, IRES_{RV}, derivado de
rinovirus, IRES_{FMDV}, derivado del virus de la fiebre aftosa;
IRES_{HV}, derivado del virus de la hepatitis C, IRES_{CSFV},
derivado del virus de la fiebre porcina clásica, IRES_{BVDV},
derivado del virus de la diarrea viral de los bovinos;
IRES_{FMLV}, derivado del mRNA gag del virus de la leucemia
murina de Friend; IRES_{MMLV}, derivado del mRNA gag del
virus de la leucemia murina de Moloney; IRES_{HIV}, derivado del
mRNA env del virus de la inmunodeficiencia humana;
IRES_{PSIV}, derivado del virus intestinal de Plautia
stali; IRES_{RPV}, derivado del virus de Rhopalosiphum
padi; IRES_{KSH}, derivado del herpesvirus asociado al
sarcoma de Kaposi, preferiblemente el IRES_{EMCV} derivado del
virus de la encefalomiocarditis (sinónimo: CITE_{EMCV}),
y en donde la unidad de expresión
multicistrónica está terminada por una señal de poliadenilación.
7. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el
vector de clonación multicistrónico comprende además un cistrón que
codifica una proteína G, preferiblemente G-alfa15,
estando localizada preferiblemente la proteína g entre el último
GPCR y el marcador de selección, y estando conectada funcionalmente
a ambos por un IRES como se define en la reivindicación 5.
8. Un método de acuerdo con una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el
modulador se selecciona del grupo constituido por pequeñas
moléculas y/o péptidos.
9. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la
respuesta celular se determina por medición del cambio de los
niveles de calcio intracelulares con relación a los niveles de
calcio intracelulares sin poner en contacto la célula con el
modulador.
10. Un método de acuerdo con la reivindicación
9, caracterizado porque el cambio es un aumento.
11. Un método de acuerdo con la reivindicación
9, caracterizado porque el cambio es una disminución con
relación a los niveles de calcio intracelulares cuando la célula
está en contacto con un compuesto dulce en lugar del modulador,
seleccionándose preferiblemente el compuesto dulce del grupo
constituido por glucosa, fructosa, sacarosa, acesulfamo K,
sacarina, ciclamato, aspartamo, xilitol, esteviósido, sucralosa,
taumatina, monelina, brazzeína, perillartina, glicirricina, ácido
sucrónico, P-4000, SC45647, NC174, neohesperidina y
aminoácidos de sabor
dulce.
dulce.
12. Molécula de ácido nucleico que codifica un
T1R1, T1R2 o T1R3 representado en una de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO:
4.
13. Vector de expresión multicistrónico que
comprende aguas abajo de un promotor para la expresión en una
célula eucariota y enlazados funcionalmente al mismo los cistrones
siguientes:
- a.
- GPCR_{1}
- b.
- GPCR_{2} y un
- c.
- marcador de selección,
en donde el promotor es preferiblemente un
promotor fuerte adecuado para uso en la célula hospedadora
seleccionada, seleccionándose más preferiblemente del grupo
constituido por: el promotor de citomegalovirus
(P-CMV), el promotor del factor de elongación
humano 1-alfa (P-E1\alpha), el
promotor ubiquitina humano (P-ubi), el promotor del
virus de los simios (P-SV40), el promotor de la
repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous
(P-RSV-LTR),
(P-RSV-LTR),
en donde el GPCR_{1} y el GPCR_{2} se
seleccionan, independientemente uno de otro, del grupo constituido
por los receptores de sabor T1R o T2R, preferiblemente del grupo de
receptores T1R, más preferiblemente una combinación de
T1R1-T1R3 o T1R2-T1R3,
en donde el marcador de selección se selecciona
del grupo constituido por higromicina^{r}, zeocina^{r},
neomicina^{r}, blasticidina^{r} o puromicina^{r},
en donde tanto el GPCR1 como el GPCR2, así como
el marcador de selección están conectados funcionalmente por IRES
interpuestos seleccionados del grupo constituido por IRES_{EMCV},
derivado del virus de la encefalomiocarditis (sinónimo:
CITE_{EMCV}); IRES_{GTX}, derivado del mRNA del homeodominio
GTX; IRES_{Rbm3}, derivado de Rbm3 inducido por frío;
IRES_{pv}, derivado de origen polio-viral,
IRES_{RV}, derivado de rinovirus, IRES FMDV, derivado del virus
de la fiebre aftosa; IRE_{HV}, derivado del virus de la hepatitis
C, IRES_{CSFV}, derivado del virus de la fiebre porcina clásica,
IRES_{BVDV}, derivado del virus de la diarrea viral de los
bovinos; IRES_{FMLV}, derivado del mRNA gag del virus de la
leucemia murina de Friend; IRES_{MMLV}, derivado del mRNA
gag del virus de la leucemia murina de Moloney; IRES_{HIV},
derivado del mRNA env del virus de la inmunodeficiencia
humana; IRES_{PSIV}, derivado del virus intestinal de Plautia
stali; IRES_{RPV}, derivado del virus de Rhopalosiphum
padi; IRES_{KSH}, derivado del herpesvirus asociado al
sarcoma de Kaposi, preferiblemente el IRES_{EMCV}, derivado del
virus de la encefalomiocarditis (sinónimo: CITE_{EMCV}) y
en donde la unidad de expresión multicistrónica
está terminada por una señal de poliadenilación.
14. Un vector de acuerdo con la reivindicación
13, caracterizado porque el vector de clonación
multicistrónico comprende adicionalmente un cistrón que codifica
una proteína g o un equivalente de la misma, preferiblemente
G-alfa 15 o un equivalente de la misma, la proteína
g o un equivalente de la misma, estando preferiblemente la proteína
g fusionada en marco al GPCR_{1} y/o GPCR_{2} anteriores.
15. Líneas de células transfectadas de manera
estable con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, preferiblemente un vector de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14.
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