CN106191120A - 一种高效介导t1r3基因过表达的慢病毒载体和慢病毒及其构建方法 - Google Patents

一种高效介导t1r3基因过表达的慢病毒载体和慢病毒及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高效介导T1R3基因过表达的慢病毒载体和慢病毒及其构建方法，属于分子生物学技术领域。本发明通过基因重组技术，以pCDH‑CMV‑EF1‑PURO慢病毒表达载体为基础进行构建，并整合有T1R3基因，得到T1R3基因过表达慢病毒载体pCDH‑CMV‑EF1‑PURO‑T1R3。使用慢病毒包装质粒pLP/VSVG、pLP1和pLP2对T1R3基因过表达慢病毒载体pCDH‑CMV‑EF1‑PURO‑T1R3进行包装，通过转染HEK293细胞，得到T1R3慢病毒。本发明所构建的T1R3基因过表达慢病毒载体对宿主细胞的转染效率高，能特异、持续、高效地促进T1R3基因在宿主细胞中的稳定表达。

Description

一种高效介导T1R3基因过表达的慢病毒载体和慢病毒及其构 建方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种高效介导T1R3基因过表达慢病毒载体和慢病毒及其构建方法。
背景技术
味觉功能学研究表明，甜味主要由味觉细胞的G蛋白偶联受体(G proteincoupled receptors，GPCRs)家族所介导，即味觉受体第1家族(taste receptor family 1members，T1Rs)。其中T1R2和T1R3是甜味受体，它们以T1R2+T1R3异二聚体的形式发挥作用，共同对甜味进行识别。甜味受体在结合配体后，下游G蛋白被激活，其α亚基与β、γ亚基分离，T1R3亚基进入胞浆进而激活下游效应器，最终导致细胞内钙离子浓度升高。因此，通过构建共表达T1R2、T1R3和Gα基因的细胞系，可用钙流检测方法对甜味物质进行识别。
构建共表达T1R2、T1R3和Gα基因的细胞系，需要使用到带有T1R3基因的过表达载体。现有的方法采用的是将整合有T1R3基因的质粒载体通过脂质体对宿主细胞进行转染，但是脂质体转染质粒载体的转染效率较低，要构建能稳定共表达T1R2、T1R3和Gα三种基因的细胞系成功率也较低。因此，如何提高T1R3基因过表达载体的转染效率是目前亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种T1R3基因过表达慢病毒载体、慢病毒、宿主细胞及其构建方法。该方法所构建的慢病毒载体，转染效率高，并能将T1R3基因整合到宿主细胞的基因组中，因此能特异、持续、高效地促进T1R3基因在宿主细胞中的稳定表达。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种高效介导T1R3基因过表达慢病毒载体，以pCDH-CMV-EF1-PURO慢病毒表达载体为基础进行构建，并整合有T1R3基因，得到T1R3基因过表达慢病毒载体pCDH-CMV-EF1-PURO-T1R3。
本发明还提供上述pCDH-CMV-EF1-PURO-T1R3慢病毒表达载体的构建方法，包括如下步骤：
步骤(1)，人工合成T1R3基因；
步骤(2)，以下列PCR扩增引物进行T1R3基因的PCR扩增：
所述的PCR扩增引物为：
T1R3-F：agattctagagctagcaccaccatggatgctgggccctgctg；
T1R3-R：agatccttgcggccgctcactcatgtttcccctg；
步骤(3)，用限制性内切酶EcoRI和BamHI分别对T1R3基因的PCR产物和慢病毒表达载体pCDH-CMV-EF1-PURO进行双酶切；
步骤(4)，用T4DNA连接酶将酶切的得到的线性化的T1R3基因和酶切慢病毒表达载体得到的产物进行连接，将得到的连接液转化Ecoli XL1-BLUE MRF’感受态细胞，并进行PCR鉴定，对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的T1R3基因过表达慢病毒载体pCDH-CMV-EF1-PURO-T1R3；
其中，步骤(4)PCR鉴定采用的PCR扩增引物与步骤(2)所采用的PCR扩增引物相同。
步骤(4)测序所用引物为：
CMV-F：cgcaaatgggcggtaggcgtg；
EF13：ccaacttctcggggactgtg；
T1R3seq1：accttcccctccttcttc；
T1R3seq2：ctctgtctacgcagctgtg。
本发明另外提供一种T1R3慢病毒的构建方法，采用上述T1R3基因过表达慢病毒载体，方法是：使用慢病毒包装质粒pLP/VSVG、pLP1和pLP2对T1R3基因过表达慢病毒载体pCDH-CMV-EF1-PURO-T1R3进行包装，通过转染HEK293细胞，得到T1R3基因过表达慢病毒。
本发明还要求保护上述T1R3慢病毒的构建方法构建得到的T1R3慢病毒。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明所构建的T1R3基因过表达慢病毒载体对宿主细胞的转染效率高达80％～90％，比起现有的质粒转染法转染效率提高了1倍以上。此外由于慢病毒能将T1R3基因整合到宿主细胞的基因组中，因此使用该方法能特异、持续、高效地促进基因T1R3在宿主细胞中的稳定表达。过表达T1R3基因的细胞可用于构建共表达T1R2、T1R3和Gα基因的细胞系，可用钙流检测方法对甜味物质进行识别。
附图说明
图1是pCDH-CMV-EF1-PURO慢病毒表达载体图谱；
图2是pLP/VSVG慢病毒包装质粒图谱；
图3是pLP1慢病毒包装质粒图谱；
图4是pLP2慢病毒包装质粒图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
主要实验试剂及厂家：
1)限制性内切酶(Thermo scientific)
2)DNA连接酶(Thermo scientific)
3)DNA回收试剂盒(美基生物)
4)PrimeSTAR Max Premix(2X)(Takara)
5)T4DNA连接酶(Thermo Scientific)
6)Ecoli XL1-BLUE MRF’感受态细胞(Stratagene)
7)FItran：慢病毒包装专用转染试剂(辉骏生物)
8)DMEM完全培养基(含10％FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)(Gibco)
9)Trizol Reagent(Ambion)
10)BestarTM qPCR RT Kit(德国DBI)
11)SybrGreen qPCR mastermix(德国DBI)
pCDH-CMV-EF1-PURO，以及慢病毒包装质粒pLP/VSVG、pLP1和pLP2均可商购于广州辉骏生物科技有限公司。
实施例1：T1R3基因过表达慢病毒载体构建。
1、人工合成T1R3基因，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2、使用PrimeSTAR高保真酶，以人工合成的T1R3基因为模板，通过如表1所示引物进行的PCR扩增：
表1
引物名称 引物序列(5’-3’) SEQ ID NO.
T1R3-F agattctagagctagcaccaccatggatgctgggccctgctg 2
T1R3-R agatccttgcggccgctcactcatgtttcccctg 3
PCR反应体系与条件如表2：
表2
试剂 体积
模板 1μL
上游引物(10μM) 1μL
下游引物(10μM) 1μL
PrimeSTAR Max(2x) 10μL
ddH2O 7μL
总体积 20μL
PCR程序如表3：
表3
3、琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物大小是否与预期一致，切割在琼脂糖凝胶电泳胶中的目的片段条带，用DNA回收试剂盒回收纯化；
4、用EcoRI和BamHI限制性内切酶分别对T1R3基因的PCR产物和慢病毒载体pCDH-CMV-EF1-PURO进行双酶切(于37℃酶切3h)，反应体系和反应条件如表4：
表4
5、琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，切割在琼脂糖凝胶电泳胶中的T1R3基因片段条带和线性化的慢病毒载体，用胶回收试剂盒回收DNA；
6、用T4DNA连接酶于16℃水浴下，将两种酶切产物进行连接，过夜。反应如表5：
表5
试剂 体积
10X T4DNA连接酶buffer 2μL
T4DNA连接酶(400U/μL) 1μL
T1R3基因片段 10μL
线性化的慢病毒载体 4μL
ddH2O 3μL
总体积 20μL
7、转化感受态细胞：
从-80℃冰箱取出1管100μL Ecoli XL1-BLUE MRF’感受态细胞，放冰上解冻(解冻至无冰状态)后，取10μL上述步骤6中的连接产物加到感受态细胞中混匀，静置30min，42℃水浴热激1min，冰上静置2min。加LB液体培养基500μL，37℃振荡培养1小时。3000rpm离心5min，留100μl左右上清液混匀细菌后涂到LB平板上，37℃倒置培养过夜。
8、挑取数个菌落，做菌落PCR检测转化子，反应体系和条件见步骤2；
9、将菌落PCR鉴定得到的阳性克隆进行测序验证，测序引物如表6：
表6
实施例2：T1R3慢病毒包装
1、给汇合度达80％以上的HEK293细胞换上无抗生素培养基DMEM+10％(v/v)FBS，37℃、5％(v/v)CO2培养箱培养2个小时。
2、将包装质粒混合物(pLP/VSVG+pLP1+pLP2，各3μg)和4μg T1R3基因过表达慢病毒载体在400μL 0.9％(w/v)生理盐水中混合，并加入50μL转染试剂Fitran，室温静置孵化20min后缓慢均匀滴入步骤1的含有HEK293细胞的培养皿中，适当摇匀；此时记为转染开始时间。
3、转染4-6h后准备换液，倒掉旧的培养基后，吸取适量PBS轻轻漂洗细胞1-2次，换上含有2％(v/v)FBS的DMEM培养基。
4、转染后72小时收集上清，将收集到的上清于3000rpm 4℃离心10min，取上清用0.45um微孔滤器过滤。
5、将滤液于40mL超速离心管中，4℃，25000r/min离心20min，弃上清液。
6、而后以500ul冰PBS重旋病毒沉淀于4℃溶解过夜，得到慢病毒液，即T1R3慢病毒。
实施例3：细胞转染
1、在6孔细胞培养板中培养HEK293细胞，待细胞完全贴壁汇合度为40％-50％后，即可进行细胞转染；转染前，每孔细胞换成500μL新鲜的DMEM完全培养基，并且每孔加入1μL的聚凝胺(polybrene)，放置于培养箱孵育1h。
2、在上述6孔细胞培养板的2个孔中，分别加入5μL实施例2得到的T1R3慢病毒液，其中一孔细胞加10μL的空载慢病毒液(空载慢病毒液与T1R3慢病毒液的唯一区别是不含有T1R3基因，其余制备方法都相同)，另一孔做空白细胞对照，充分的摇匀后放入37℃、5％(v/v)CO2、95％相对湿度的培养箱中培养。
3、转染6小时后，吸走孔内的培养基，并用PBS洗两次；换成新鲜的DMEM完全培养基，放入37℃、5％(v/v)CO2、95％相对湿度的培养箱中培养。
4、待细胞生长至80％融合度时，加入3μL的嘌呤霉素Puromycin(2mg/mL)进行药筛(Puromycin的终浓度为3ug/ml)；
5、第二天观察到细胞多数漂浮，去除前一天药筛的漂浮细胞，待细胞贴壁加入3μL的Puromycin(2mg/mL)维持；
6、加药后细胞多漂浮，每天更换完全培养基和3μL的Puromycin(2mg/mL)直至空白细胞HEK293全部凋亡后，给纯化后的HEK293-T1R3换上新鲜的完全培养基继续培养；
7、筛选得到纯化的HEK293-T1R3细胞更换上新鲜的完全培养基继续进行传代扩大培养，每次更换细胞培养基均需要加入原药物浓的一半来维持细胞生长，即Puromycin的终浓度为1.5ug/ml。
实施例4：使用实时荧光定量PCR进行T1R3基因的表达检测。
1、HEK293-T1R3细胞总RNA提取：
1)将10cm细胞培养皿中汇合度达80％的实施例3得到的HEK293-T1R3细胞用预冷PBS缓冲液洗2遍，加1ml Trizol裂解液重悬。
2)接着加入0.2ml三氯甲烷，剧烈摇动10s，室温放置3分钟。
3)4℃，12000rpm离心20min。
4)将上清水相转移至另一新的无RNA酶离心管中，并加入等体积的异丙醇，混匀，-80℃放置1h。
5)4℃，12000rpm离心10min，去上清。
6)加入1ml体积浓度为75％乙醇洗涤沉淀。
7)4℃，5000rpm离心3min，去上清，室温晾干。
8)加入40μL RNase-free水溶解RNA。
2、去基因组DNA和cDNA的合成
将RNA加入到gDNA吸附柱，室温10,000g离心1min，收集滤液即为去除基因组DNA的RNA。
把RNA在65℃条件下热变性5分钟后，立即置于冰上冷却。
使用BestarTM qPCR RT Kit逆转录试剂盒进行逆转录反应，得到cDNA，反应体系如表7：
表7
反应条件：
37℃,15min
98℃,5min
4℃,保持
反应结束后，-20℃保存。
3、cDNA的实时荧光定量PCR
将T1R3基因和内参基因18SrRNA的cDNA样本分别取样在荧光定量PCR仪上进行反应，每个样本设置3个平行实验。PCR反应体系为20μL，反应体系如表8：
表8
荧光定量PCR使用的引物如表9：
表9
反应条件为：
循环结束后从60℃升高到98℃获取熔解曲线。
本发明所构建的T1R3基因过表达慢病毒载体对宿主细胞的转染效率高达80％～90％。
实验以18SrRNA为内参基因，采用2-△△Ct法进行分析，经所构建的pCDH-CMV-EF1-PURO-T1R3慢病毒载体转染的HEK293细胞中T1R3基因的相对表达量是未转入T1R3基因的HEK293细胞的5396倍。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
SEQ ID NO.1
SEQ ID NO.2
agattctaga gctagcacca ccatggatgc tgggccctgc tg 42
SEQ ID NO.3
agatccttgc ggccgctcac tcatgtttcc cctg 34
SEQ ID NO.4
cgcaaatggg cggtaggcgt g 21
SEQ ID NO.5
ccaacttctc ggggactgtg 20
SEQ ID NO.6
accttcccct ccttcttc 18
SEQ ID NO.7
ctctgtctac gcagctgtg 19
SEQ ID NO.8
cctggatacc gcagctagga 20
SEQ ID NO.9
gcggcgcaat acgaatgccc c 21
SEQ ID NO.10
caaaacccag acgacatcgc 20
SEQ ID NO.11
ctgtcccgat ggtgaacgaa 20

Claims (5)

1.一种高效介导T1R3基因过表达慢病毒载体，其特征在于以pCDH-CMV-EF1-PURO慢病毒表达载体为基础进行构建，并整合有T1R3基因，得到T1R3基因过表达慢病毒载体pCDH-CMV-EF1-PURO-T1R3。
2.权利要求1所述的pCDH-CMV-EF1-PURO-T1R3慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），人工合成T1R3基因；
步骤（2），以下列PCR扩增引物进行T1R3基因的PCR 扩增：
所述的PCR扩增引物为：
T1R3-F ：agattctagagctagcaccaccatggatgctgggccctgctg；
T1R3-R ：agatccttgcggccgctcactcatgtttcccctg；
步骤（3），用限制性内切酶EcoRI和BamHI分别对T1R3基因的PCR 产物和慢病毒表达载体pCDH-CMV-EF1-PURO进行双酶切；
步骤（4），用T4 DNA连接酶将酶切的得到的线性化的T1R3基因和酶切慢病毒表达载体得到的产物进行连接，将得到的连接液转化Ecoli XL1- BLUE MRF’感受态细胞，并进行PCR鉴定，对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的T1R3基因过表达慢病毒载体pCDH-CMV-EF1-PURO-T1R3；
其中，步骤（4）PCR鉴定采用的PCR扩增引物与步骤（2）所采用的PCR扩增引物相同。
3.根据权利要求2所述的pCDH-CMV-EF1-PURO-T1R3慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，步骤（4）测序所用引物为：
CMV-F：cgcaaatgggcggtaggcgtg；
EF13：ccaacttctcggggactgtg；
T1R3seq1：accttcccctccttcttc；
T1R3seq2：ctctgtctacgcagctgtg。
4.一种T1R3慢病毒的构建方法，采用权利要求1所述的T1R3基因过表达慢病毒载体，其特征在于，使用慢病毒包装质粒pLP/VSVG、pLP1和pLP2对T1R3基因过表达慢病毒载体pCDH-CMV-EF1-PURO-T1R3进行包装、，通过转染HEK293细胞，得到T1R3慢病毒。
5.权利要求4所述的T1R3慢病毒的构建方法构建得到的T1R3慢病毒。
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Title
孟凡荣等: "慢病毒载体及其研究进展", 《中国肺癌杂志》 *
郭谦等: "HDAC1 过表达诱导胶质瘤细胞产生耐药性", 《中国肿瘤生物治疗杂志》 *

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