CN107043785A - 一种整合型慢病毒载体表达系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种适合肿瘤细胞研究的整合型慢病毒载体表达系统。本发明提供一种整合型慢病毒载体表达系统，包括KL15490载体、pHelper 1.0载体和pCMV-VSV-G载体和宿主细胞，将系统中的KL15490载体、pHelper 1.0载体和pCMV-VSV-G载体共同转染宿主细胞后，即在宿主细胞中包装获得慢病毒载体。本发明所提供整合型慢病毒载体表达系统中所使用的慢病毒载体骨架小，独立表达EGFP和Puromycin，可以插入的外源基因长达4000bps，而且包装的病毒滴度高，能够提供高效的基因转移、长期的基因表达，特别适合肿瘤细胞。

Description

一种整合型慢病毒载体表达系统

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种适合肿瘤细胞研究的整合型慢病毒载体表达系统。

背景技术

慢病毒作为一种特殊的逆转录病毒,与通常使用的逆转录病毒载体和腺病毒载体比较,具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为当前基因治疗和转基因动物中载体研究的热点，并已经应用于多种疾病的基因治疗研究中。

典型的慢病毒载体系统为HIV-1载体系统，它由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。

为了确保慢病毒载体的安全性、提高其滴度和转导能力，现有的研究从多个方面如包膜蛋白、包装成分、载体质粒等对其进行了改进。

最初的HIV-1载体颗粒，均由其本身的包膜蛋白Env所包裹，仅对CD4+的细胞具有亲嗜性。1996年，Trono课题组的Naldini等设计的HIV-1载体系统采用表达水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的质粒和双嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的质粒，分别取代表达HIV本身包膜蛋白Env的质粒，使HIV-1载体颗粒包上了VSV或双嗜性MLV的包膜。这样做的结果至少具有三个方面的积极意义：①包膜的更换进一步降低了HIV-1载体恢复成野生型病毒的可能；②使HIV载体感染宿主的范围不再仅限于CD4+细胞，而扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞；③VSV的包膜赋予HIV载体颗粒高度的稳定性，使其能够通过超速离心而浓缩，达到高滴度。Naldini等已使HIV-1载体滴度由10⁵转录单位(TU)/ml达到10⁸TU/ml。这样的改进无疑是HIV载体系统走向应用而迈出的一大步。Naldini等在构建包装质粒pCMVΔR9和pCMVΔR8.2时，分别在env基因阅读框架前插入了多个终止密码子或删除了env基因中1.4kp的序列，代之以终止密码子，以阻止env基因的表达。在此基础上，Zufferey等将包装质粒上表达调节蛋白Nef、Vif、Vpr和Vpu的4个基因分别删除或联合删除，结果发现它们对于 产生HIV-1载体颗粒是非必需的，即使完全删除，得到的载体颗粒仍具备转导非分裂细胞的能力。这4个调节蛋白或已被证实、或被高度怀疑是构成HIV毒性的因素，将其删除、加上包膜蛋白的替换，可使制备HIV载体过程中产生野生型病毒的可能必微乎其微。载体质粒上HIV-1的顺式序列通常包括两端的LTR、剪切位点及包装信号Ψ等。此外，研究表明，gag基因5′端的序列可提高载体RNA的包装效率；Rev蛋白需要与Rev反应元件(RRE)相作用，将未剪切的载体转录产物从细胞核转运到胞浆。因此，Naldini等在载体上保留了gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，提高了产生载体颗粒的能力。

但是，现有的载体质粒能够插入的外源基因比较小，没有同时携带荧光蛋白和真核抗性，而且就算有类似的载体，荧光蛋白也会比较弱，也无法保证病毒的滴度，给研究工作带来极大的麻烦，正是基于这个原因，我们改造了适合肿瘤细胞研究的整合型慢病毒载体系统。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种适合肿瘤细胞研究的整合型慢病毒载体表达系统，用于解决现有技术中的问题。

本发明发明人从功能研究方面获得适合肿瘤细胞研究的慢病毒表达框架，进而通过重叠延伸PCR技术获得载体。本发明所提供的整合型慢病毒载体表达系统中，慢病毒表达框架起着重要的作用，该框架具有包装容量大、EGFP独立表达、有Puromycin、滴度高、适合肿瘤细胞研究的特点，然后通过重叠延伸PCR技术获得载体。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种整合型慢病毒载体表达系统，包括KL15490载体、pHelper 1.0载体和pCMV-VSV-G载体和宿主细胞，将系统中的KL15490载体、pHelper 1.0载体和pCMV-VSV-G载体共同转染宿主细胞后，即在宿主细胞中包装获得慢病毒载体。

优选的，所述KL15490载体包括序列如SEQ ID NO:1所示的慢病毒载体表达框。

更优选的，所述KL15490载体由Addgene pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE(Plasmid#12252)改造获得，具体为将Addgene pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE(Plasmid#12252)中的hPGK promoter-EGFP替换为EF1α promoter-MCS-3FLAG-CMV promoter-EGFP-T2A-Puromycin(即慢病毒表达框架)，所述EF1α promoter-MCS-3FLAG-CMV promoter-EGFP-T2A-Puromycin(即慢病毒表达框架)的序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明所提供的整合型慢病毒载体表达系统中，KL15490载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WPRE(woodchuck hepatitis virusposttranscriptional regulatory element)，通常根据不同的实验目的针对KL15490载体进行改造，例如:通过分子克隆的方法在该载体中插入特殊启动子序列以进行启动子活性研究,插入特殊的基因序列进行基因表达的研究，插入特殊的RNA干扰序列进行RNA干扰实验研究等。

更具体的，所述KL15490载体中，EF1α promoter-MCS-3FLAG-CMV promoter-EGFP-T2A-Puromycin(即慢病毒表达框架)序列如下：

AAGCTTTGCAAAGATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACCTTCTAGGTCTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGAAGCTTGGGCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTAGCGCTATGGACTACAAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAATGAGCTAGCTGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCTTAATTAACGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCAT CAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGACTAGTGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTAGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGA(SEQ ID NO:1)

本发明所提供的整合型慢病毒载体表达系统中，pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码合成160kD的gag-pol前体蛋白，从N端至C端分别产生蛋白酶、逆转录酶、核糖核酸酶H及整合酶；rev基因：编码一种96kD的磷蛋白，主要定位于核内，rev结合于RRE，促使病毒转录出各种mRNA，由细胞核进入胞浆，并使其保持稳定；RRE元件，为Rev反应元件，能够明显地增加报告基因的表达。pHelper 1.0载体即pCMV-dR8.2dvpr载体，可以通过addgene网站购得。

本发明所提供的整合型慢病毒载体表达系统中，pCMV-VSV-G载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。pCMV-VSV-G载体可以通过addgene网站购得。

优选的，所述宿主细胞为293T细胞。

本发明第二方面提供所述的整合型慢病毒载体表达系统在慢病毒载体制备领域的用途。

本发明第三方面提供一种整合型慢病毒载体的制备方法，使用所述的整合型慢病毒载体表达系统，包括如下步骤：

a)将KL15490载体、pHelper 1.0载体和pCMV-VSV-G载体共同转染宿主细胞；

b)培养宿主细胞；

c)分离获得整合型慢病毒载体。

优选的，所述步骤a)中，将KL15490载体、pHelper 1.0载体和pCMV-VSV-G载体共同转染宿主细胞前，还将目的基因克隆入KL15490载体。

优选的，所述KL15490载体包括序列如SEQ ID NO:1所示的慢病毒载体表达框。

更优选的，所述KL15490载体由Addgene pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE(Plasmid#12252)改造获得，具体为将Addgene pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE(Plasmid#12252)中的hPGK promoter-EGFP替换为EF1α promoter-MCS-3FLAG-CMV promoter-EGFP-T2A-Puromycin(即慢病毒表达框架)，所述EF1α promoter-MCS-3FLAG-CMV promoter-EGFP-T2A-Puromycin(即慢病毒表达框架)的序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述宿主细胞为293T细胞。

本发明所提供整合型慢病毒载体表达系统中所使用的慢病毒载体骨架小，独立表达EGFP和Puromycin，可以插入的外源基因长达4000bps，而且包装的病毒滴度高，能够提供高效的基因转移、长期的基因表达，特别适合肿瘤细胞，为基因治疗提供了一种更有效的方法。

附图说明

图1显示为本发明目的基因慢病毒表达载体构建流程图；

图2显示为本发明pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE(Plasmid#12252)载体结构图；

图3显示为本发明慢病毒表达载体酶切图；

条带1:10kb Marker(条带自上而下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)；

条带2:pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE(Plasmid#12252)载体EcoR V和Sal I酶切产物；

条带3:pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE(Plasmid#12252)未酶切载体；

图4显示为本发明PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱；

Marker(条带自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp)；

图5显示为本发明阳性克隆的PCR鉴定流程图；

图6显示为本发明PCR阳性克隆鉴定图片；

图7显示为本发明KL15490载体结构图；

图8显示为本发明慢病毒表达载体酶切图；

条带1:10kb Marker(条带自上而下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)；

条带2:KL15490载体Xba I和BamH I酶切产物；

条带3:KL15490未酶切载体；

图9显示为本发明PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱；

Marker(条带自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp)；

图10显示为本发明western blot结果图；

图11 A-E显示为本发明慢病毒载体系统的分离示意图；

图12 A-D显示为本发明滴度测定结果图；

图13显示为本发明pHelper 1.0结构图；

图14显示为本发明pCMV-VSV-G结构图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1载体的改造

1.1实验流程描述

本发明所提供的慢病毒表达框架(SEQ ID NO:1)中，EF1α promoter来源于Addgene pLVTH(Plasmid#12262)，3FLAG通过化学合成方式获得，CMV promoter-EGFP来源于上海吉凯基因化学技术有限公司提供的GV115载体，T2A由于比较短，通过引物添加，Puromycin来源于上海吉凯基因化学技术有限公司提供的GV112载体。从以上载体中分别利用PCR方法扩增目的基因，然后通过重叠延伸PCR技术扩增全长基因，再将目的载体进行酶切、纯化后进行同源重组，其产物转化细菌感受态细胞，对长出的克隆先进行PCR鉴定，其上下游引物分别设计在载体和目的基因上，PCR鉴定为阳性的克隆，证明目的基因已经定向克隆入目的载体。再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对，比对正确的即为构建成功的载体。将构建好的载体进行超纯去内毒素抽提。

1.2实验流程图(如图1所示)

1.3慢病毒表达载体的线性化

1.3.1慢病毒表达载体信息：

pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE载体(Plasmid#12252)结构见图2：

1.3.2慢病毒表达载体酶切：

使用EcoR V和Sal I进行酶切消化：

酶切反应体系如表1所示：

表1

纯化的DNA质粒(1ug/μl)	2μl
		10×buffer	5μl
EcoR V(20U/μl)	1μl
		Sal I(20U/μl)	1μl
H2O	41μl
		Total	50μl

将上述混合的反应物置于37℃，1h。

载体酶切后琼脂糖凝胶电泳图谱见图3：

1.4引物合成(送上海捷瑞生物工程有限公司合成)

KL15490-P1：CTCGAGAAGCTT AAGCTTTGCAAAGATGGATAAAG(SEQ ID NO:2)；

引物说明：含交换臂(单下划线标示的碱基)和EcoR V酶切位点(双下划线标示的碱基)，并含有目的基因5’端部分序列(无下划线标示的碱基)，用于PCR扩增EF1-alphapromoter；

KL15490-P2：TCCAGAGGTTGATT ACGCGTTCAGGCACCGGGCTTGCGGGT(SEQ ID NO:3)；

引物说明：含交换臂(单下划线标示的碱基)和Sal I酶切位点(双下划线标示的碱基)，并含有目的基因3’端部分序列(无下划线标示的碱基)，用于PCR扩增Puromycin；

KL15490-P3：TCAGGTGTCGTGAGAAGCTTGGGCTGCAGGTC(SEQ ID NO:4)；

引物说明：用于扩增3FLAG，同时作为多产物拼接的重叠延伸臂；

KL15490-P4：CAGCCCAAGCTTCTCACGACACCTGAAATGGA(SEQ ID NO:5)；

引物说明：用于扩增EF1-alpha promoter，同时作为多产物拼接的重叠延伸臂；

KL15490-P5：ACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGG(SEQ ID NO:6)；

引物说明：用于扩增CMV promoter-EGFP，同时作为多产物拼接的重叠延伸臂；

KL15490-P6：CTATTAATAACTAATGCATGGCGGTAATACGGT(SEQ ID NO:7)；

引物说明：用于扩增3FLAG，同时作为多产物拼接的重叠延伸臂；

KL15490-P7：

GAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGACCGAGTACAAGCCCA(SEQID NO:8)；

引物说明：用于扩增Puromycin，同时作为多产物拼接的重叠延伸臂；

KL15490-P8：

CCACGTCACCGCATGTTAGAAGACTTCCTCTGCCCTCACTAGTCTTGTACAGCTCGTCCATG(SEQ IDNO:9)；

引物说明：用于扩增CMV promoter-EGFP，同时作为多产物拼接的重叠延伸臂；

KL15490-P9：CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG(SEQ ID NO:10)；

引物说明：该引物在目的基因中，用于PCR鉴定阳性克隆；

KL15490-P10：AGCGTAAAAGGAGCAACATAG(SEQ ID NO:11)；

引物说明：该引物在载体中，用于PCR鉴定阳性克隆。

1.5 PCR获得目的基因片段

PCR反应体系为50μl PCR反应体系，具体如表2所示：

表2

注：如果模板是质粒，则取0.2μl做模板；如果模板是菌液，则取1μl做模板

A片断的获取：

Primer(+)：KL15490-P1

Primer(—)：KL15490-P4

模板：Addgene pLVTH(Plasmid#12262)

PCR仪进行反应，按以下循环条件：

98℃2min；(98℃15sec；60℃15sec；72℃1min20sec)30cycles；72℃5min；4℃∞；PCR产物大小：1296bp。

B片断的获取：

Primer(+)：KL15490-P3

Primer(—)：KL15490-P6

模板：pMD19-3FLAG(吉凯自有)，质粒全序列如下：

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTTCAGGTGTCGTGAGAAGCTTGGGCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTAGCGCTATGGACTACAAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAATGAGCTAGCTGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACA ATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC(SEQ ID NO:12)

PCR仪进行反应，按以下循环条件：

98℃2min；(98℃15sec；60℃15sec；72℃30sec)30cycles；72℃5min；4℃∞；PCR产物大小：212bp。

C片断的获取：

Primer(+)：KL15490-P5

Primer(—)：KL15490-P8

模板：GV115(吉凯自有)，该质粒作为模板部分序列如下：

TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCTTAATTAACGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG(SEQ ID NO:13)

PCR仪进行反应，按以下循环条件：

98℃2min；(98℃15sec；60℃15sec；72℃30sec)30cycles；72℃5min；4℃∞；PCR产物大小：1567bp。

D片断的获取：

Primer(+)：KL15490-P7

Primer(—)：KL15490-P2

模板：GV112(吉凯自有)，该质粒作为模板部分序列如下：

ATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTAGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGA(SEQ ID NO:14)

PCR仪进行反应，按以下循环条件：

98℃2min；(98℃15sec；60℃15sec；72℃40sec)30cycles；72℃5min；4℃∞；PCR产物大小：670bp。

E片断(全长片断)的获取：

Primer(+)：KL15490-P1

Primer(—)：KL15490-P2

模板：上述扩增的产物a、b、c、d的混合物

PCR仪进行反应，按以下循环条件：

98℃2min；(98℃15sec；60℃15sec；72℃3min30sec)30cycles；72℃8min；4℃∞；PCR产物大小：3480bp。

PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱见图4。

1.6重组克隆制备

PCR产物同源重组入酶切的慢病毒表达载体，反应体系如表3所示：

表3

阳性对照*：产物为同源重组试剂盒自带#C112-02，Vazyme Biotech Co.,Ltd)。

于37℃保温30min，准备转化。

感受态制备：

配置下述溶液：

1)0.1M CaCl₂溶液，以0.22μm过滤除菌。

2)250mM KCl₂溶液。

3)2M MgCl₂溶液，高压灭菌。

4)SOB:1ml250mM KCl₂溶液加入100ml LB，以5M NaOH调PH值至7.0，高压灭菌，临用前加入0.5ml 2M MgCl₂溶液。

用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞

5)从于37℃培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100ml LB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3小时(旋转摇床，300转/分)。

6)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。

7)于4℃,以4000转/分离心10分钟，回收细胞。

8)倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。

9)以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬每份沉淀，放置于冰浴上。

10)于4℃，以4000转/分离心10分钟，回收细胞。

11)倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。

12)每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬每份细胞沉淀。

13)将细胞分装成小份，放于-70℃冻存。

(感受态细胞制备参考：分子克隆实验指南第二版55页)

转化：

1)用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加10μl同源重组液(即重组的慢病毒载体)，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。

2)将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管架上，恰恰放置90秒，不要摇动试管。

3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却l—2分钟。

4)每管加800μl LB培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏。

5)将150μl已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO₄和kan抗性(100ug/ml)的LB 琼脂培养基上。

6)将平板置于室温直至液体被吸收。

7)倒置平皿，于37℃培养，16小时。

8)长出的克隆进行后续PCR鉴定。

(转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页)

1.7阳性克隆的PCR鉴定(流程图参见图5)

PCR反应体系如表4所示：

表4

PCR引物说明：

Primer(+)：KL15490-P9

Primer(—)：KL15490-P10

PCR仪进行反应，按以下循环条件：

94℃30sec；(94℃30sec；60℃30sec；72℃50sec)22cycles；72℃5min；4℃∞。

1.菌落PCR模板:在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl LB，混匀取1μl作为模板；

2.阴性对照：排除系统中外源核酸污染导致假阳性结果；

3.阳性对照：以确定的含有引物要钓取的其他目的基因的载体作为模板，如GAPDH基因， 以排除PCR反应体系的异常造成的假阴性结果。

PCR产物大小:807bp

如图6所示，电泳鉴定PCR产物，其中样品信息如表5所示：

表5

阳性克隆送测序。

1.8阳性克隆测序结果及结果分析：

测序所得结果与期望序列进行比对，比对说明：Query是我们得到的测序结果；Sbjct是目标基因序列；Identities＝3436/3436(100％)。该载体改造成功。

期望序列如下：

AAGCTTTGCAAAGATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACCTTCTAGGTCTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGAAGC TTGGGCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTAGCGCTATGGACTACAAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAATGAGCTAGCTGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCTTAATTAACGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGACTAGTGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTAGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGA(SEQ ID NO:15)

1.9质粒提取：

KL15490、pHelper 1.0、pCMV-VSV-G质粒DNA的制备：以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中三种质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的水中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA的A260/A280在1.8～2.0之间。具体操作内容如下：

准备工作：

1)新开瓶Buffer P1使用前加入RNase A solution(100μg/ml)，然后储存在4℃冰箱中备用；

2)检查Buffer P2是否有沉淀，如有沉淀需要37℃加热，使溶液澄清；

3)Buffer P3于4℃预冷；

4)每个需要抽提的单克隆需要：2个250ml离心瓶，4个50ml离心管，10ml移液管若干。操作步骤：

1)选择测序鉴定正确的克隆，将保存的正确的单克隆菌液接种于2-5ml抗性(A mp终浓度100μg/ml)LB培养基中，37℃培养8小时；

2)取上述单克隆培养菌液500μl，扩大培养于300ml抗性LB中，37℃培养12-16小时；

3)250ml离心瓶收集菌液，两次，每次150ml，灭菌水配平后6000g，4℃，离心15分钟；

4)倾倒上清后，倒置于吸水纸上控干，然后加入10ml Buffer P1，吹吸混匀至无大块

聚集的菌体，呈均匀悬浊液，转移入新的50ml离心管；

5)加入10ml Buffer P2，轻柔振荡摇匀，室温下放置5分钟，注意要严格控制裂解时间；

6)加入10ml预冷的Buffer P3,立即轻柔混匀，置于冰上15-20分钟，中间间隔轻柔晃动3-5次；

7)用Buffer P3配平后，20000g，4℃，离心30分钟；

8)取上清于新的50ml离心管中，用Buffer P3配平后，20000g，4℃，离心30分钟；

9)在上述离心过程中，预先准备好QIAGEN-tip 500的柱子，用20ml Buffer QBT洗柱；

10)将8中离心得到的上清液，用1ml移液器小心加入到柱子中，特别注意不要吸到蛋白沉淀；

11)待8中离心得到的上清液完全过柱后，用30ml Buffer QC过柱清洗两次；

12)用15ml Buffer QF洗脱柱子中的质粒DNA，待最初的10-15滴QF洗脱液流尽后，收集其余的QF洗脱液于新的50ml离心管中；

13)加入10.5ml异丙醇于洗脱液中，混匀后，15000g，4℃，离心30分钟；

14)小心倒去上清，注意不要丢失质粒DNA沉淀，然后加入10ml 70％酒精洗涤，15000g，离心10分钟；

15)小心倒去上清，注意不要丢失质粒DNA沉淀，在已经灭好菌的超净台中晾干，500μl专用灭菌TE溶解，转移入1.5ml离心管，测浓度，做好标记和记录，-20℃保存。

实施例2构建外源基因

本实施例选择以下基因，该基因CDS区比较大，以测试该载体的包装容量和病毒的质量：

表6

GeneID	Species	Symbol	Genbank_ID	CDS
					55832	Human	CAND1	NM_018448	3693

2.1实验流程描述

从含有CAND1基因的质粒模板中，利用PCR方法钓取目的基因，将目的载体进行酶切、纯化后进行同源重组，其产物转化细菌感受态细胞，对长出的克隆先进行PCR鉴定，其上下游引物分别设计在目的基因和载体上，PCR鉴定为阳性的克隆，证明目的基因已经定向克隆入目的载体。再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对，比对正确的即为构建成功的慢病毒表达载体。将构建好的载体进行超纯去内毒素抽提。

2.2实验流程图(如图1所示)

2.3慢病毒载体的线性化

2.3.1慢病毒载体信息：

KL15490载体结构见图7：

2.3.2慢病毒载体酶切：

使用Xba I和BamH I进行酶切消化，酶切反应体系如表7所示：

表7

KL15490载体质粒(1ug/μl)	2μl
		10×buffer	5μl
Xba I(20U/μl)	1μl
		BamH I(20U/μl)	1μl
H2O	41μl
		Total	50μl

将上述混合的反应物置于37℃，1h。

载体酶切后琼脂糖凝胶电泳图谱见图8。

2.4引物合成(送上海捷瑞生物工程有限公司合成)

CAND1-P1 TCTAGA ATGGCGAGCGCCTCGTACCACATTTCC(SEQID NO:16)；

引物说明：含交换臂(粗体部分标示的碱基)，Xba I酶切位点(单下划线标示的碱基)，kozak序列(双下划线标示的碱基)，并含有目的基因5’端部分序列(无下划线标示的碱基)，用于PCR钓取目的基因。

CAND1-P2 GGATCCACTAGTGTCCATTGATTCCAAGTTAG(SEQ ID NO:17)；

引物说明：含交换臂(粗体部分标示的碱基)，BamH I酶切位点(单下划线标示的碱基)，并含有目的基因3’端部分序列(无下划线标示的碱基)，用于PCR钓取目的基因。

CAND1-P3 CAGCAGCACATAACAAGCCATC(SEQ ID NO:18)；

引物说明：引物位于目的基因中，用于鉴定阳性转化子。

CAND1-P4 CCTTATAGTCCTTATCATCGTC(SEQ ID NO:19)；

引物说明：引物位于载体中，用于鉴定阳性转化子。

2.5 PCR获得目的基因片段

反应体系同1.5，PCR引物说明如下：

A片断的获取：

Primer(+)：CAND1-P1

Primer(—)：CAND1-P2

模板：KL8719(吉凯自有)，该质粒部分序列如下：

ATGGCGAGCGCCTCGTACCACATTTCCAATTTGCTGGAAAAAATGACATCCAGCGACAAGGACTTTAGGTTTATGGCTACAAATGATTTGATGACGGAACTGCAGAAAGATTCCATCAAGTTGGATGATGATAGTGAAAGGAAAGTAGTGAAAATGATTTTGAAGTTATTGGAAGATAAAAATGGAGAGGTACAGAATTTAGCTGTCAAATGTCTTGGTCCTTTAGTGAGTAAAGTGAAAGAATACCAAGTAGAGACAATTGTAGATACCCTCTGCACTAACATGCTTTCTGATAAAGAACAACTTCGAGACATTTCAAGTATTGGTCTTAAAACAGTAATTGGAGAACTTCCTCCAGCTTCCAGTGGCTCTGCATTAGCTGCTAATGTATGTAAAAAGATTACTGGACGTCTTACAAGTGCAATAGCAAAACAGGAAGATGTCTCTGTTCAGCTAGAAGCCTTGGATATTATGGCTGATATGTTGAGCAGGCAAGGAGGACTTCTTGTTAATTTCCATCCTTCAATTCTGACCTGTCTACTTCCCCAGTTGACCAGCCCTAGACTTGCAGTGAGGAAAAGAACCATTATCGCTCTTGGCCATCTGGTTATGAGCTGTGGAAATATAGTTTTTGTAGATCTTATTGAACATCTGTTGTCAGAGTTGTCCAAAAATGATTCTATGTCAACAACAAGAACCTACATACAATGTATTGCTGCTATTAGTAGGCAAGCTGGTCATAGAATAGGTGAATACCTTGAGAAGATAATTCCTTTGGTGGTAAAATTTTGCAATGTAGATGATGATGAATTAAGAGAGTACTGTATTCAAGCCTTTGAATCATTTGTAAGAAGATGTCCTAAGGAAGTATATCCTCATGTTTCTACCATTATAAATATTTGTCTTAAATATCTTACCTATGATCCAAATTATAATTACGATGATGAAGATGAAGATGAAAATGCAATGGATGCTGATGGTGGTGATGATGATGATCAAGGGAGTGATGATGAATACAGTGATGATGATGACATGAGTTGGAAAGTGAGACGTGCAGCTGCGAAGTGCTTGGATGCTGTAGTTAGCACAAGGCATGAAATGCTTCCAGAATTCTACAAGACCGTCTCTCCTGCACTAATATCCAGATTTAAAGAGCGTGAAGAGAATGTAAAGGCAGATGTTTTTCACGCATACCTTTCTCTTTTGAAGCAAACTCGTCCTGTACAAAGTTGGCTATGTGACCCTGATGCAATGGAGCAGGGAGAAACACCTTTAACAATGCTTCAGAGTCAGGTTCCCAACATTGTTAAAGCTCTTCACAAACAGATGAAAGAAAAAAGTGTGAAGACCCGACAGTGTTGTTTTAACATGTTAACTGAGCTGGTAAATGTATTACCTGGGGCCCTAACTCAACACATTCCTGTACTTGTACCAGGAATCATTTTCTCACTGAATGATAAATCAAGCTCATCGAATTTGAAGATCGATGCTTTGTCATGTCTATACGTAATCCTCTGTAACCATTCTCCTCAAGTCTTCCATCCTCACGTTCAGGCTTTGGTTCCTCCAGTGGTGGCTTGTGTTGGAGACCCATTTTACAAAATTACATCTGAAGCACTTCTTGTTACTCAACAGCTTGTCAAAGTAATTCGTCCTTTAGATCAGCCTTCCTCGTTTGATGCAACTCCTTATATCAAAGATCTATTTACCTGTACCATTAAGAGATTAAAAGCAGCTGACATTGATCAGGAAGTCAAGGAAAGGGCTATTTCCTGTATGGGACAAATTATTTGCAACCTTGGAGACAATTTGGGTTCTGACTTGCCTAATACACTTCAGATTTTCTTGGAGAGACTAAAGAATGAAATTACCAGGTTAACTACAGTAAAGGCATTGACACTGATTGCTGGGTCACCTTTGAAGATAGATTTGAGGCCTGTTCTGGGAGAAGGGGTTCCTATCCTTGCTTCATTTCTTAGAAAAAACCAGAGAGCTTTGAAACTGGGTACTCTTTCTGCCCTTGATATTCTAATAAAAAACTATAGTGACAGCTTGACAGCTGCCATGATTGATGCAGTTCTAGATGAGCTCCCACCTCTTATCAGCGAAAGTGATATGCATGTTTCACAAATGGCCATCAGTTTTCTTACCACTTTGGCAAAAGTATATCCCTCCTCCCTTTCAAAGATAAGTGGATCCATTCTCAATGAACTTATTGGACTTGTGAGATCACCCTTATTGCAGGGGGGAGCTCTTAGTGCCATGCTAGACTTTTTCCAAGCTCTGGTTGTCACTGGAACAAATAATTTAGGATACATGGATTTGTTGCGCATGCTGACTGGTCCAGTTTACTCTCAGAGCACAGCTCTTACTCATAAGCAGTCTTATTATTCCATTGCCAAATGTGTAGCTGCCCTTACTCGAGCATGCCCTAAAGAGGGACCAGCTGTAGTAGGTCAGTTTATTCAAGATGTCAAGAACTCAAGGTCTACAGATTCCATTCGTCTCTTAGCTCTACTTTCTCTTGGAGAAGTTGGGCATCATATTGACTTAAGTGGACAGTTGGAACTAAAATCTGTAATACTAGAAGCTTTCTCATCTCCTAGTGAAGAAGTCAAATCAGCTGCATCCTATGCATTAGGCAGCATTAGTGTGGGCAACCTTCCTGAATATCTGCCGTTTGTCCTGCAAGAAATAACTAGTCAACCCAAAAGGCAGTATCTTTTACTTCATTCCTTGAAGGAAATTATTAGCTCTGCATCAGTGGTGGGCCTTAAACCATATGTTGAAAACATCTGGGCCTTATTACTAAAGCACTGTGAGTGTGCAGAGGAAGGAACCAGAAATGTTGTTGCTGAATGTCTAGGAAAACTCACTCTAATTGATCCAGAAACTCTCCTTCCACGGCTTAAGGGGTACTTGATATCAGGCTCATCATATGCCCGAAGCTCAGTGGTTACGGCTGTGAAATTTACAATTTCTGACCATCCACAACCTATTGATCCACTGTTAAAGAACTGCATAGGTGATTTCCTAAAAACTTTGGAAGACCCAGATTTGAATGTGAGAAGAGTAGCCTTGGTCACATTTAATTCAGCAGCACATAACAAGCCATCATTAATAAGGGATCTATTGGATACTGTTCTTCCACATCTTTACAATGAAACAAAAGTTAGAAAGGAGCTTATAAGAGAGGTAGAAATGGGTCCATTTAAACATACGGTTGATGATGGTCTGGATATTAGAAAGGCAGCATTTGAGTGTATGTACACACTTCTAGACAGTTGTCTTGATAGACTTGATATCTTTGAATTTCTAAATCATGTTGAAGATGGTTTGAAGGACCATTATGATATTAAGATGCTGACATTTTTAATGTTGGTGAGACTGTCTACCCTTTGTCCAAGTGCAGTACTGCAGAGGTTGGACCGACTTGTTGAGCCATTACGTGCAACATGTACAACTAAGGTAAAGGCAAACTCAGTAAAGCAGGAGTTTGAAAAACAAGATGAATTAAAGCGATCTGCCATGAGAGCAGTAGCAGC ACTGCTAACCATTCCAGAAGCAGAGAAGAGTCCACTGATGAGTGAATTCCAGTCACAGATCAGTTCTAACCCTGAGCTGGCGGCTATCTTTGAAAGTATCCAGAAAGATTCATCATCTACTAACTTGGAATCAATGGACACTAGT(SEQ ID NO:20)

PCR仪进行反应，按以下循环条件：

98℃2min；(98℃15sec；60℃15sec；72℃4min)30cycles；72℃10min；4℃∞。PCR产物大小：3737bp

PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱见图9。

2.6重组克隆制备

PCR产物同源重组入酶切的慢病毒表达载体，反应体系同、感受态制备、转化流程同1.6。

2.7阳性克隆的PCR鉴定(流程图参见图5)

体系及流程同1.7。

2.8阳性克隆测序结果及结果分析

测序所得结果与期望序列进行比对，比对说明：Query是我们得到的测序结果；Sbjct是目标基因序列；Identities＝3690/3690(100％)。载体构建成功。

期望序列如下：

ATGGCGAGCGCCTCGTACCACATTTCCAATTTGCTGGAAAAAATGACATCCAGCGACAAGGACTTTAGGTTTATGGCTACAAATGATTTGATGACGGAACTGCAGAAAGATTCCATCAAGTTGGATGATGATAGTGAAAGGAAAGTAGTGAAAATGATTTTGAAGTTATTGGAAGATAAAAATGGAGAGGTACAGAATTTAGCTGTCAAATGTCTTGGTCCTTTAGTGAGTAAAGTGAAAGAATACCAAGTAGAGACAATTGTAGATACCCTCTGCACTAACATGCTTTCTGATAAAGAACAACTTCGAGACATTTCAAGTATTGGTCTTAAAACAGTAATTGGAGAACTTCCTCCAGCTTCCAGTGGCTCTGCATTAGCTGCTAATGTATGTAAAAAGATTACTGGACGTCTTACAAGTGCAATAGCAAAACAGGAAGATGTCTCTGTTCAGCTAGAAGCCTTGGATATTATGGCTGATATGTTGAGCAGGCAAGGAGGACTTCTTGTTAATTTCCATCCTTCAATTCTGACCTGTCTACTTCCCCAGTTGACCAGCCCTAGACTTGCAGTGAGGAAAAGAACCATTATCGCTCTTGGCCATCTGGTTATGAGCTGTGGAAATATAGTTTTTGTAGATCTTATTGAACATCTGTTGTCAGAGTTGTCCAAAAATGATTCTATGTCAACAACAAGAACCTACATACAATGTATTGCTGCTATTAGTAGGCAAGCTGGTCATAGAATAGGTGAATACCTTGAGAAGATAATTCCTTTGGTGGTAAAATTTTGCAATGTAGATGATGATGAATTAAGAGAGTACTGTATTCAAGCCTTTGAATCATTTGTAAGAAGATGTCCTAAGGAAGTATATCCTCATGTTTCTACCATTATAAATATTTGTCTTAAATATCTTACCTATGATCCAAATTATAATTACGATGATGAAGATGAAGATGAAAATGCAATGGATGCTGATGGTGGTGATGATGATGATCAAGGGAGTGATGATGAATACAGTGATGATGATGACATGAGTTGGAAAGTGAGACGTGCAGCTGCGAAGTGCTTGGATGCTGTAGTTAGCACAAGGCATGAAATGCTTCCAGAATTCTACAAGACCGTCTCTCCTGCACTAATATCCAGATTTAAAGAGCGTGAAGAGAATGTAAAGGCAGAT GTTTTTCACGCATACCTTTCTCTTTTGAAGCAAACTCGTCCTGTACAAAGTTGGCTATGTGACCCTGATGCAATGGAGCAGGGAGAAACACCTTTAACAATGCTTCAGAGTCAGGTTCCCAACATTGTTAAAGCTCTTCACAAACAGATGAAAGAAAAAAGTGTGAAGACCCGACAGTGTTGTTTTAACATGTTAACTGAGCTGGTAAATGTATTACCTGGGGCCCTAACTCAACACATTCCTGTACTTGTACCAGGAATCATTTTCTCACTGAATGATAAATCAAGCTCATCGAATTTGAAGATCGATGCTTTGTCATGTCTATACGTAATCCTCTGTAACCATTCTCCTCAAGTCTTCCATCCTCACGTTCAGGCTTTGGTTCCTCCAGTGGTGGCTTGTGTTGGAGACCCATTTTACAAAATTACATCTGAAGCACTTCTTGTTACTCAACAGCTTGTCAAAGTAATTCGTCCTTTAGATCAGCCTTCCTCGTTTGATGCAACTCCTTATATCAAAGATCTATTTACCTGTACCATTAAGAGATTAAAAGCAGCTGACATTGATCAGGAAGTCAAGGAAAGGGCTATTTCCTGTATGGGACAAATTATTTGCAACCTTGGAGACAATTTGGGTTCTGACTTGCCTAATACACTTCAGATTTTCTTGGAGAGACTAAAGAATGAAATTACCAGGTTAACTACAGTAAAGGCATTGACACTGATTGCTGGGTCACCTTTGAAGATAGATTTGAGGCCTGTTCTGGGAGAAGGGGTTCCTATCCTTGCTTCATTTCTTAGAAAAAACCAGAGAGCTTTGAAACTGGGTACTCTTTCTGCCCTTGATATTCTAATAAAAAACTATAGTGACAGCTTGACAGCTGCCATGATTGATGCAGTTCTAGATGAGCTCCCACCTCTTATCAGCGAAAGTGATATGCATGTTTCACAAATGGCCATCAGTTTTCTTACCACTTTGGCAAAAGTATATCCCTCCTCCCTTTCAAAGATAAGTGGATCCATTCTCAATGAACTTATTGGACTTGTGAGATCACCCTTATTGCAGGGGGGAGCTCTTAGTGCCATGCTAGACTTTTTCCAAGCTCTGGTTGTCACTGGAACAAATAATTTAGGATACATGGATTTGTTGCGCATGCTGACTGGTCCAGTTTACTCTCAGAGCACAGCTCTTACTCATAAGCAGTCTTATTATTCCATTGCCAAATGTGTAGCTGCCCTTACTCGAGCATGCCCTAAAGAGGGACCAGCTGTAGTAGGTCAGTTTATTCAAGATGTCAAGAACTCAAGGTCTACAGATTCCATTCGTCTCTTAGCTCTACTTTCTCTTGGAGAAGTTGGGCATCATATTGACTTAAGTGGACAGTTGGAACTAAAATCTGTAATACTAGAAGCTTTCTCATCTCCTAGTGAAGAAGTCAAATCAGCTGCATCCTATGCATTAGGCAGCATTAGTGTGGGCAACCTTCCTGAATATCTGCCGTTTGTCCTGCAAGAAATAACTAGTCAACCCAAAAGGCAGTATCTTTTACTTCATTCCTTGAAGGAAATTATTAGCTCTGCATCAGTGGTGGGCCTTAAACCATATGTTGAAAACATCTGGGCCTTATTACTAAAGCACTGTGAGTGTGCAGAGGAAGGAACCAGAAATGTTGTTGCTGAATGTCTAGGAAAACTCACTCTAATTGATCCAGAAACTCTCCTTCCACGGCTTAAGGGGTACTTGATATCAGGCTCATCATATGCCCGAAGCTCAGTGGTTACGGCTGTGAAATTTACAATTTCTGACCATCCACAACCTATTGATCCACTGTTAAAGAACTGCATAGGTGATTTCCTAAAAACTTTGGAAGACCCAGATTTGAATGTGAGAAGAGTAGCCTTGGTCACATTTAATTCAGCAGCACATAACAAGCCATCATTAATAAGGGATCTATTGGATACTGTTCTTCCACATCTTTACAATGAAACAAAAGTTAGAAAGGAGCTTATAAGAGAGGTAGAAATGGGTCCATTTAAACATACGGTTGATGATGGTCTGGATATTAGAAAGGCAGCATTTGAGTGTATGTACACACTTCTAGACAGTTGTCTTGATAGACTTGATATCTTTGAATTTCTAAATCATGTTGAAGATGGTTTGAAGGACCATTATGATATTAAGATGCTGACATTTTTAATGTTGGTGAGACTGTCTACCCTTTGTCCAAGTGCAGTACTGCAGAGGTTGGACCGACTTGTTGAGCCATTACGTGCAACATGTACAACTAAGGTAAAGGCAAACTCAGTAAAGCAGGAGTTTGAAAAACAAGATGAATTAAAGCGATCTGCCATGAGAGCAGTAGCAGCACTGCTAACCATTCCAGAAGCAGAGAAGAGTCCACTGATGAGTGAATTCCAGTCACAGATCAGTTCTAACCCTGAGCTGGCGGCTATCTTTGAAAGTATCCAGAAAGATTCATCATCTACTAACTTGGAATCAATGGACACTAGT(SEQID NO:21)

2.9质粒提取：

流程同1.9。

实施例3 western blot验证基因表达

由于CAND13’端融合3FLAG标签，因此可以用FLAG抗体检测目的基因表达是否正常。流程如下：

3.1细胞培养

293T细胞培在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中生长，培养条件为37℃、5％CO₂。

细胞传代方法如下：

1)弃去旧培养液，加入5ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS溶液。

2)加入2ml胰酶消化液，消化1-2min直到细胞完全消化下来。

3)加入含10％胎牛血清和100U/ml青链霉素的DMEM培养基5ml，用刻度吸管吹打数次，将瓶壁上的细胞冲洗下来。

4)混匀细胞后分至两个新的培养瓶中，继续培养。

细胞株的冻存：

1)取培养2～3天生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×10⁶～2×10⁷/ml。

2)在1ml细胞冻存管中加入0.5ml细胞悬液，0.4ml小牛血清和0.1ml二甲基亚砜(或甘油)，混匀后密封。置4℃1小时，-20℃2小时，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上过夜后浸入液氮中。

细胞复苏：

1)从液氮罐中取出细胞冻存管。

2)迅速放入盛有37℃水的水浴中解冻。

3)用70％酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加3ml含10％FBS的DMEM培养基，置温箱培养。

4)次日更换一次培养液后再继续培养。

3.2载体转染293T细胞：

转染原理基于脂质体(Lipofectamine2000，Invitrogen)介导的DNA转染法，具体方法如下：

1)转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10％血清的培养基调整细胞 密度为1.2×10⁷细胞/20ml，重新接种于15cm细胞培养皿，37℃、5％CO₂培养箱内培养。24h待细胞密度达70％～80％时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。

2)转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。

3)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pLVTH载体20μg，pHelper 1.0载体15μg，pCMV-VSV-G载体10μg)，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5分钟。

4)将Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀，取100μl Lipofectamine2000试剂在另一管中与2.4ml Opti-MEM混合，在室温下温育5分钟。

5)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合。

6)混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。

7)将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃,5％CO₂细胞培养箱中培养。

8)培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。

9)每瓶细胞中加入含10％血清的细胞培养基25ml，于37℃、5％CO₂培养箱内继续培养48小时。

3.3总蛋白抽提，收样：

1)3.2中转染后细胞弃去细胞培养液，按细胞量加入适量的1×Lysis Buffer；

2)用1ml枪头刮下细胞，将样品转移入Ep管中，4℃裂解细胞10～15min；

3)4℃，12000g，离心5min，放入100℃水浴20min；

4)4℃，12000g，离心1min，-20℃保存备用。

3.4配制SDS-PAGE：

1)把玻璃板冲洗干净，晾干。

2)把晾干后的玻璃板按要求放入制具，根据蛋白的大小配制SDS-PAGE胶，先配分离胶， 玻璃板中加入7ml分离胶，再加2ml无水乙醇，30min后等分离胶充分凝固后再配浓缩胶，弃去玻璃板中的无水乙醇，用滤纸把残留的无水乙醇吸干，加入2ml浓缩胶，然后插入梳齿。

3.5上样电泳：

1)上样：等胶凝固好后，将其放入电泳槽中，加足够的电泳液后开始准备上样。用双手抓住梳子的两端轻轻用力向上拔去梳子，用1ml的移液器吸入电泳缓冲液轻轻吹洗上样孔，将准备好的3.3步骤获得的总蛋白样品上样，每个样品取相同总蛋白量，用20ul的移液器垂直于上样孔把样品缓慢加入上样孔内。在电泳槽下部加入适量的电泳液。

2)电泳：恒流30mA 2h。

3.6免疫印迹(湿转)

电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃，400mA恒流条件下电转120min，将蛋白转移到PVDF膜上：在医用托盘中倒入500-800ml的电转移缓冲液，把玻璃板从电泳装置中取出来，用胶铲在玻璃板的上端轻轻地把两块玻璃板撬开，把胶的最底端用胶铲轻轻切除，然后用胶铲把胶轻轻托起来放在滤纸上，注意放置顺序从负极到正极依次放置：滤纸—胶—PVDF膜—滤纸，把治具放入转移电泳装置中，加入1L的电转移缓冲液进行转膜。

3.7免疫显色：

1)封闭：在培养皿中倒入40-50ml的封闭液(含5％脱脂牛奶的TBST溶液)，把已经转好的PVDF膜正面向上放入培养皿中，以防止蛋白脱落，PVDF膜要完全浸没在封闭液中，室温封闭1h。

2)一抗孵育：用PE手套把已封闭好的PVDF膜包起来，加入封闭液稀释的抗体(Monoclonal ANTI-FLAG，#F1804，SIGMA-ALDRICH Co.,Ltd)，放在H20型混合器上4℃孵育12h。洗膜：把PVDF膜从PE手套中取出来，放入培养皿中，加入40-50ml TBST溶液，放在脱色摇床上轻摇，洗膜3次，每次10min。

3)二抗孵育：用封闭液稀释相应的二抗(goat anti-mouse IgG-HRP，#sc-2005，SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC)，室温下孵育PVDF膜2h。洗膜：TBST洗膜3次，每次10min。

4)采用Amersham公司ECL+plusTM Western blotting system试剂盒进行显色。

5)X光显影：在暗房中进行获得显示条带的胶片，条带要求清晰匀称。

western blot结果见图10，图10中实验结果样品说明如表8所示：

表8

目的基因融合蛋白大小：135KD

结论：

经Western Blot检测，可以观察到135KD附近处有特征条带，其大小和目的基因融合蛋白相吻合。结果说明：该质粒用flag抗体检测到目的条带，过表达ok。

实施例4病毒包装

4.1细胞培养：

同3.1。

4.2载体转染293T细胞：

同3.2。

4.3慢病毒载体系统的分离(如图11A-E所示)：

根据慢病毒载体的特性，使用Millipore超滤装置Plus-20的方法进行浓缩和纯化。具体方法如下：

1)收集转染后48小时(转染即可为0小时计起)的293T细胞上清液。

2)于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片。以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中。

3)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中(最多19ml)，盖上盖子。将过滤杯插到滤过液收集管中。

4)组合好后，做好平衡，放在转头上。

5)在4000×g离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15分钟。离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。

6)将过滤杯倒扣在样品收集杯上。

7)离心力不超过1000g，时间为2分钟。过高转速会导致样品损失。把离心杯从样品收集杯上移开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。

8)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80度长期保存。取其中一支进行病毒生物学滴度测定。

4.4慢病毒载体滴度测定

1)测定前一天，为测定滴度所需的细胞(293T细胞)铺板，96孔板，每个孔加4×10⁴个细胞，体积为100μl。

2)根据病毒的预期滴度，准备7～10个无菌的Ep管。在每个管中加入90μl的无血清培养基。取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。

3)选取所需的细胞孔，吸去90μl培养基，丢弃。加入90μl稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养。

4)24小时后，加入完全培养基100μl。小心操作，不要吹起细胞。

5)4天后，观察荧光表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。

6)滴度计算:根据带有荧光的细胞来推算病毒滴度，例如，在加入1E-6μl病毒原液的孔中观察到2个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有2个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量。滴度测定结果见图12A-D。

第一组图谱(图12A)：0.1μL病毒感染293T细胞，2μg/mL Puromycin，放大200倍的明场视野和绿色荧光视野。

第二组图谱(图12B)：1μL病毒感染293T细胞，2μg/mL Puromycin，放大200倍的明场视野和绿色荧光视野。

第三组图谱(图12C)：10μL病毒感染293T细胞，2μg/mL Puromycin，放大100倍的明场视野和绿色荧光视野。

第四组图谱(图12D)：10μL病毒感染293T细胞，2μg/mL Puromycin，放大200倍的明场视野和绿色荧光视野。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种整合型慢病毒载体表达系统，包括KL15490载体、pHelper 1.0载体和pCMV-VSV-G载体和宿主细胞，将系统中的KL15490载体、pHelper 1.0载体和pCMV-VSV-G载体共同转染宿主细胞后，即在宿主细胞中包装获得慢病毒载体。

2.如权利要求1所述的一种整合型慢病毒载体表达系统，其特征在于，所述KL15490载体包括序列如SEQ ID NO:1所示的慢病毒载体表达框。

3.如权利要求1所述的一种整合型慢病毒载体表达系统，其特征在于，所述KL15490载体由Addgene pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE(Plasmid#12252)改造获得，具体为将AddgenepRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE(Plasmid#12252)中的hPGK promoter-EGFP替换为EF1αpromoter-MCS-3FLAG-CMV promoter-EGFP-T2A-Puromycin，所述EF1α promoter-MCS-3FLAG-CMV promoter-EGFP-T2A-Puromycin的序列如SEQ ID NO:1所示。

4.如权利要求1所述的一种整合型慢病毒载体表达系统，其特征在于，所述宿主细胞为293T细胞。

5.权利要求1-4任一权利要求所述的整合型慢病毒载体表达系统在慢病毒载体制备领域的用途。

6.一种整合型慢病毒载体的制备方法，使用如权利要求1-4任一权利要求所述的整合型慢病毒载体表达系统，包括如下步骤：

a)将KL15490载体、pHelper 1.0载体和pCMV-VSV-G载体共同转染宿主细胞；

b)培养宿主细胞；

c)分离获得整合型慢病毒载体。

7.如权利要求6所述的一种整合型慢病毒载体的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中，将KL15490载体、pHelper 1.0载体和pCMV-VSV-G载体共同转染宿主细胞前，还将目的基因克隆入KL15490载体。

8.如权利要求6所述的一种整合型慢病毒载体的制备方法，其特征在于，所述KL15490载体包括序列如SEQ ID NO:1所示的慢病毒载体表达框。

9.如权利要求8所述的一种整合型慢病毒载体的制备方法，其特征在于，所述KL15490载体由Addgene pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE(Plasmid#12252)改造获得，具体为将Addgene pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE(Plasmid#12252)中的hPGK promoter-EGFP替换为EF1α promoter-MCS-3FLAG-CMV promoter-EGFP-T2A-Puromycin，所述EF1α promoter-MCS-3FLAG-CMV promoter-EGFP-T2A-Puromycin的序列如SEQ ID NO:1所示。

10.如权利要求6所述的一种整合型慢病毒载体的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为293T细胞。