CN110157734B - 一种基因表达控制元件和相关的蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基因表达元件，具体涉及一种包括FF‑1α启动子、IL‑3信号肽、LepR基因和转录后调控元件WPRE的基因表达元件，所述表达元件可增强LepR基因在宿主细胞表面的密度，本发明还提供包含这些基因表达元件的真核表达载体和宿主细胞。

Description

一种基因表达控制元件和相关的蛋白
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基因表达元件、包含所述基因表达元件的载体和细胞。
背景技术
瘦素是一种主要由脂肪组织表达的多肽激素，通过与瘦素受体(LepR)相互作用，参与代谢调节、能量平衡和食物摄入。瘦素受体(也被称为“WSX”、“OB受体”、“OB-R”和“CD295”)是I类细胞因子受体家族的单次跨膜受体，LepR至少有6种剪切体(LepRa、LepRb、LepRc、LepRd、LepRe、LepRf)，这些剪切体均具有结合瘦素的结构域，区别在于其细胞内的结构域。LepRb是唯一一个含有瘦素介导JAK-STAT信号转导通路所需的细胞内结构域，瘦素与LepRb受体结合后激活JAK2磷酸化，继而进一步激活STAT3磷酸化启动信号转导。瘦素缺乏、瘦素抵抗和某些LEPR信号传导缺陷型/信号传导受损型突变，与肥胖、2型糖尿病、血脂异常、脂肪代谢障碍、肝脂肪变性、非酒精性和酒精性脂肪肝疾病、严重胰岛素抵抗、Leprechaunism/Donohue综合征、RabsonMendenhall综合征及相关并发症相关。因此研究瘦素与LepRb信号通路变化与疾病的关系非常重要。BaF3为因子依赖的造血干细胞，已有文章报道(
Figure BDA0002071514650000011
ML，et al.The Journal of Neuroscience；1998，18(1)：559-572；Gainsford T，et al.Proc Natl Acad Sci U S A.1996；93(25)：14564-8)，将LepRb基因转入BaF3细胞，构建稳转细胞系，研究瘦素与LepRb之间的信号传导通路，但是并未定量检测所构建的BaF3-LepR稳转细胞系上每个细胞有多少LepR表达，而LepRb在细胞膜上的高密度表达对于信号通路的精准研究以及后续的动物模型上的有效性研究非常重要。
因此，本领域需要一种适合LepRb在细胞表面高密度表达的表达元件。
发明内容
为解决LepRb在细胞表面高密度表达的问题，本发明提供了一种增强基因在细胞表面高密度表达的表达元件，所述表达元件包括：EF-1α启动子、信号肽、可转录的核酸序列和转录后调控元件WPRE，其中所述EEF-1α启动子、所述信号肽和转录后调控元件WPRE一起促进可转录的基因序列的表达。在一些实施方案中，所述信号肽为IL-3信号肽，所述可转录的核酸序列选自LepRb基因。
本发明的另一方面，还提供了一种含有基因表达元件的真核表达载体。所述真核表达载体为S1680。
本发明人的另一方面，还提供了一种含有所述基因表达元件的细胞。在一些具体的实施方案中，通过将含有LepRb基因的真核表达载体S1680与病毒包装质粒转染HEK293细胞进行病毒包装。在一些具体的实施方案中，将包装的病毒感染小鼠血液干细胞BaF3。在一些实施方案中，所述的稳定感染含有所述基因表达元件的BaF3表面其LepRb基因高密度表达。
本发明通过构建含有LepRb基因高密度表达的BaF3稳转细胞株，为LepR信号通路的精准研究以及后续的动物模型上的有效性研究非常重要，有效解决了本领域存在的科学问题。
附图说明
图1为转染LepRb的细胞流式鉴定结果，其中A为细胞未经抗体染色的流式图，B为先用YC09，再用二抗染色的流式图，C为用二抗染色的流式图，D为先用YC10，再用二抗染色的流式图。
图2为稳定转染LepRb的单克隆细胞流式鉴定结果，其中A为未经染色的流式图，B为先用一抗YC09，再用二抗染色的流式图，C为仅用二抗染色的流式图，D为先用一抗YC10，再用二抗染色的流式图。
图3为在含有IL-3的培养基中培养的BaF3-LepRb细胞，用不同浓度瘦素刺激后，在不同的时间点检测到的细胞增殖情况。
图4为在含瘦素的培养基中培养的BaF3-LepRb细胞，用不同浓度瘦素刺激后，在不同的时间点检测到的细胞增殖情况。
实施例
实施例仅为举例说明，不旨在对本发明造成任何方式上的限制。
实施例1真核表达载体构建
合成含有EF-1a启动子、1L-3信号肽、LepRb基因(SEQ ID NO.1)、WPRE的基因表达元件(SEQ ID NO.3)，采用HieffTM Taq DNA Polymerase DNA聚合酶(上海翊圣生物)扩增基因表达元件。通过Gibson assembly kit(NEB，MA)将扩增的基因表达元件克隆进pSMPUW载体(Cell BioLabs，Inc)，构建的载体通过测序验证。具体序列见下表：
表1核酸和氨基酸序列表
Figure BDA0002071514650000031
实施例2慢病毒包装和纯化
将实施例1构建好的真核表达载体与病毒包装质粒(pMDL、VSVG和REV)(CellBioLabs)转染HEK293细胞，具体如下：
将HEK293细胞种于10cm培养皿，于含5％CO2的37℃温箱中孵育过夜，待细胞汇合度80％以上时转染慢病毒质粒：1.5μg实施例1构建的含有LepR基因的病毒载体和1.5μg病毒包装质粒(pMDL∶VSVG∶REV质量比为5∶3∶2)预先混匀后，加入6ul lipo2000混匀，室温孵育15-20min。将转染混合液逐滴加入细胞培养皿中混匀后，置于含5％CO2的37℃温箱孵育。10h-16h后吸去培养基，加入适量37℃预热的完全培养基，继续将细胞放置温箱孵育。于转染后24h、48h、72h收集含慢病毒的上清。
将三个时间点收集的含病毒的上清混匀，采用PEG8000进行慢病毒的纯化和浓缩：采用0.45μm孔径滤膜过滤含病毒的混合上清，加入5XPEG-8000母液(将NaCl 8.766g NaCl、50g PEG8000溶于200ml纯水后，121℃高温灭菌30min)，于4℃放置过夜后，4℃、4000g离心20min，吸弃上清，加入适量的慢病毒溶解液(组成为含0.5M蔗糖，0.6mg/mL HSA的10mMHEPES缓冲液)溶解慢病毒沉淀，分装后-80℃保存。
实施例3慢病毒感染BaF3细胞及稳转细胞株的鉴定
于感染前24h接种BaF3细胞于10cm培养皿。在感染实验前将储存在-80℃冰箱的慢病毒原液解冻，取适量病毒原液以不含FBS的RPMI-1640培养基稀释使其MOI＝5。感染实验开始时吸弃BaF3细胞上清，PBS洗涤两次后，加入上述稀释的MOI＝5的慢病毒液后室温孵育1h以便细胞均匀地吸收病毒。孵育结束后吸弃细胞上的病毒残液，加入新鲜的细胞培养液，在37℃、5％CO2培养箱孵育，并通过有限稀释法在抗性下进行稳定细胞株筛选。
细胞表面LepRb基因的表达采用FACS检测，具体步骤如下：胰酶消化慢病毒感染48h的BaF3细胞以及通过有限稀释法获得的稳定BaF3细胞，预冷的PBS清洗3次，2％FBS(溶于PBS)封闭后加入一抗YC09(含有Leptin的抗体，实验室表达)或YC10(含有Leptin(N82K)的抗体，实验室表达)4℃孵育2h，2％FBS(溶于PBS)洗去未结合的一抗，用anti-human FcAPC(Cat.409305，Biolegend)二抗4℃孵育1h，2％FBS(溶于PBS)洗脱后利用LSR II流式细胞仪(Becton Dickinson，NJ)检测，并用FlowJo软件(TreeStar，OR)进行分析。PrizmGraphpad用log(agonist)vs.response模型数据进行非线性回归。
结果如图1和图2所示。细胞本身并无背景荧光(图1A和2A)，二抗与多克隆BaF3细胞的非特异性结合很弱(图1C和2C)，一抗YC09可特异性结合BaF3细胞表面的LepRb，其表面阳性率分别为95.23％(多克隆细胞，1B)和96.12％(单克隆细胞，2B)，而另一个一抗YC10几乎无法与BaF3表面的LepRb结合，与预期一致(图1D和2D)。
实施例4 IL-3或瘦素促进BaF3-LepR增殖检测
培养BaF3-LepRb细胞(90％RPMI-1640，10％胎牛血清，10ng/ml IL-3(BioLegend)或0.4ug/ml瘦素(R&D system))。将细胞铺于黑色壁透明底96孔板中(细胞密度1*105个/ml，60μl/孔)，37℃，5％CO2培养过夜。加入梯度稀释的瘦素(40μl/孔)，37℃5％CO2孵育72h后，根据厂家说明书，每孔加入10μl Alamar blue(Thermo)，通过读板机(MolecularDevices)检测不同时间点的荧光信号，数据用软件GraphPad Prism处理和分析。
结果如图3、4和表2所示。IL-3培养的细胞用瘦素刺激4h后，其活性在逐渐衰退(图3)，而瘦素培养的细胞用瘦素刺激4h后，其活性差异不明显(图4)，提示瘦素所培养的细胞能够更好维持特异性增殖活力。另外，如表2所示，IL-3培养、瘦素刺激EC50在1.5h、2.5h和14h时分别为6.39/3.64和2.31ng/ml，而瘦素培养和刺激的EC50显著低于前者(在1.5h、2.5h和4h时分别为0.152、0.132和0.168ng/ml)
Figure BDA0002071514650000051
/>

Claims (3)

1.一种基因表达元件在促进外源基因在BaF3细胞表达中的应用，所述元件包括：
a）EF-1α启动子；
b）IL-3信号肽；
c）可转录的核酸序列；
d）转录后调控元件WPRE；
其中，所述EF-1α启动子、所述IL-3信号肽和所述转录后调控元件WPRE增强所述可转录的核酸序列在BaF3细胞中的表达。
2.根权利要求1所述的应用，其特征在于，所述可转录的核酸序列编码人瘦素受体（LepR）。
3.一种真核表达载体在促进外源基因在BaF3细胞表达中的应用，所述真核表达载体包括一种基因表达元件，所述元件包括：a）EF-1α启动子；
b）IL-3信号肽；
c）可转录的核酸序列；
d）转录后调控元件WPRE；
其中，所述EF-1α启动子、所述IL-3信号肽和所述转录后调控元件WPRE增强所述可转录的核酸序列在BaF3细胞中的表达。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105602992A (zh) * 2016-03-17 2016-05-25 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种基于复制缺陷性重组慢病毒的car-t转基因载体及其构建方法和应用
CN107043785A (zh) * 2016-02-05 2017-08-15 上海吉凯基因化学技术有限公司 一种整合型慢病毒载体表达系统

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107043785A (zh) * 2016-02-05 2017-08-15 上海吉凯基因化学技术有限公司 一种整合型慢病毒载体表达系统
CN105602992A (zh) * 2016-03-17 2016-05-25 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种基于复制缺陷性重组慢病毒的car-t转基因载体及其构建方法和应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EIAV 基因转移载体转录后调控元件的优化;李亚明等;《西北农林科技大学学报》;20080229;摘要 *
Leptin can induce proliferation, differentiation, and functional activation of hemopoietic cells;TIMOTHY GAINSFORD等;《Proc Natl Acad Sci U S A》;19961210;第14564页右栏第2段 *
pEF-BOS, a powerful mammalian expression vector;Seiichi Mizushima等;《Nucleic Acids Research》;19900911;图1 *
张慧展.慢病毒载体性能的改良.《基因工程 第4版》.华东理工大学出版社,2017, *

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