EA015620B1

EA015620B1 - УЛУЧШЕННЫЕ ДИМЕРЫ sgp130FC

Info

Publication number: EA015620B1
Application number: EA200802396A
Authority: EA
Inventors: Георг Х. Ветциг; Дирк Зеегерт
Original assignee: Конарис Рисерч Инститьют Аг
Priority date: 2006-06-30
Filing date: 2007-06-29
Publication date: 2011-10-31
Also published as: AU2007263939A1; SI1873166T1; US8895012B2; US9034817B2; CA2656440C; PL1873166T3; US20140178378A1; BRPI0713063A2; US9573989B2; CA2656440A1; UA95636C2; JP5417171B2; KR20090037898A; AU2007263939B2; WO2008000516A3; EP1873166A1; DK1873166T3; JP2009540843A; BRPI0713063B1; US20100028367A1

Abstract

Описаны полипептидные димеры, содержащие две растворимые молекулы gp130, где каждая из указанных молекул слита с Fc доменом белка IgG1 и где шарнирная область домена Fc модифицирована таким образом, чтобы придавать димеру благоприятные свойства. В особенно предпочтительном воплощении шарнирная область содержит мотив аминокислотной последовательности Ala-Glu-Gly-Ala. Кроме того, описаны фармацевтическая композиция, содержащая указанный димер, и различные медицинские применения.

Description

Настоящее изобретение относится к полипептидному димеру, содержащему две растворимые молекулы др 130, каждая из которых слита с доменом Ес белка 1дС1„ где шарнирная область домена Ес модифицирована таким образом, чтобы придавать димеру полезные свойства. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей указанный димер, и к различным медицинским применениям.

Плейотропный цитокин интерлейкин 6 (1Ь-6) демонстрирует широкий спектр биологических функций, среди которых наиболее значительными являются стимуляция В-клеток и индукция синтеза белков острой фазы в печени. 1Ь-6 осуществляет свою активность в отношении клеток-мишеней посредством связывания со специфичным поверхностным рецептором 1Ь-6 (1Ь-6К). Этот комплекс рецептор/лиганд содействует гомодимеризации др 130, второй субъединицы 1Ь-6 рецепторного комплекса. Димеризация др130 имеет результатом трансдукцию сигнала 1Ь-6. Растворимые формы 1Б-6К (к1Ь-6К), которые генерируются посредством двух механизмов (альтернативный сплайсинг и шеддинг), также способны запускать димеризацию др130 и передачу сигнала при образовании комплекса с 1Ь-6.

Поскольку цитоплазматическая часть 1Ь-6К. не вносит вклада в трансдукцию сигнала, передача сигнала гомодимером др130 может быть индуцирована 1Ь-6 в комплексе с мембраносвязанным или растворимым 1Ь-6К.. Однако присутствие 81Б-6К ведет к сенсибилизации 1Ь-6-отвечающих клеток в отношении лиганда. Кроме того, строго 1Ь-6-зависимые клетки гибридомы не пролиферируют в ответ на очень низкие количества 1Ь-6, когда присутствующий в культуральных средах 81Б-6К постоянно удаляется.

Первоначально описанный как трансдуктор сигнала интерлейкина-6, др 130 является участником трансдукторной системы, в которой участвуют многие цитокины, такие как 1Ь-6, 1Б-11, ингибирующий лейкемию фактор (Ь1Е), онкостатин М (О8М) и цилиарный нейротрофический фактор (ΟΝΤΕ). Все эти цитокины действуют через состоящий из двух или трех компонентов рецепторный комплекс, в котором передача сигнала запускается гомодимеризацией (для 1Ь-6) или гетеродимеризацией др130 с ЫЕ-К. (для Ь1Е, СТ-1, О8М, СЬС и ΟΝΤΕ) или О8М-К (для О8М). Эти цитокины могут, таким образом, опосредовать сходные биологические активности в различных тканях.

В то время как др130 может быть обнаружен почти во всех типах клеток, 1Ь-6К демонстрирует намного более ограниченную экспрессию. Высвобождение 81Б-6К одним типом клеток делает другие клетки, которые экспрессируют только др130, отвечающими на 1Ь-6. Этот сценарий называют транссигналинг. Действительно, было описано несколько клеточных активностей, для которых необходим комплекс 81Б-6К и 1Ь-6, и которые не обнаруживаются в присутствии только одного 1Ь-6. Растворимый белок др130 найден в высоких концентрациях в человеческой плазме. Недавно был описан сконструированный цитокин гипер-Ь-6 (Н-1Ь-6), в котором С-конец 81Ь-6К ковалентно соединен с Ν-концом зрелого 1Ь-6 гибким пептидным линкером. Как и в случае комплекса 1Б-6/К1Б-6К. Н-1Ь-6 также действует на клетки, которые экспрессируют только др130. В отличие от отдельных компонентов 1Ь-6 и к1Б-6К. в 100-1000 раз более низкие концентрации этой слитой молекулы являются достаточными для того, чтобы индуцировать сравнимые биологические сигналы.

Для лечения различных заболеваний или расстройств может быть желательным специфичное блокирование 1Ь-6 ответов, зависящих от растворимого 1Ь-6К. Такие заболевания включают резорбцию кости, гиперкальцемию, кахексию, опухоли или другие типы рака (например рак ободочной кишки, множественную миелому, лимфому, лейкемию, болезнь Ходжкина), аутоиммунные заболевания (например рассеянный склероз (РС) или диабет типа 1), воспалительные или атопические заболевания (например болезнь Крона, язвенный колит, ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, астму, псориаз, саркоидоз, красную системную волчанку или увеит), инфекции (например бактериями, вирусами, грибами или другими патогенами), а также эндокринные расстройства и метаболические или катаболические заболевания (например диабет типа 2, ожирение, гипергликемию или гиперхолистеринемию). Было обнаружено, что, например, димеры кдр130 или димеры кдр130Ес пригодны для терапевтических применений.

Техническая задача, лежащая в основе настоящего изобретения, заключается в создании улучшенных димеров кдр130Ес.

Указанная техническая задача решена посредством предложения воплощений изобретения, охарактеризованных в формуле изобретения. Во время осуществления экспериментов, приведших к созданию настоящего изобретения, было обнаружено, что биологическая активность, способность к очистке и стабильность слитых белков кдр130Ес в значительной степени зависят от аминокислотного состава шарнирной области между кдр130 и Ес участком. Аминокислоты 234, 235 и 237 человеческого !дС1-Ес (согласно нумерации ЕЙ) были подвергнуты мутации для того, чтобы снизить связывание рецептора Ес с этим мотивом (Эппсам е! а1., №1Шге (1988), 332: 563-564; Сапйе1б апб Моткой, 1. Ехр. Меб. (1991), 173: 14831491; \Ушек е! а1., 1. 1ттипо1. (2000), 164: 5313-5318; 8опбегшапп е! а1., №11иге (2000), 406: 267). Неожиданно было установлено, что посредством замены Ьеи₂₃₅ в последовательности дикого типа Ееи₂₃₄-Ееи₂₃₅О1у₂₃₆-О1у₂з7 глутаматом (С1и, Е) или аспартатом (Акр, Э) и тем самым нарушения гидрофобного мотива высокогидрофильной (заряженной) аминокислотой, биологическая активность и стабильность слитых белков кдр130Ес могут быть улучшены. Мутации в положениях 234 и 237 усиливают этот эффект. Самый мощный мутант имеет последовательность А1а₂₃₄-О1и₂₃5-61у₂₃₆-А1а₂₃₇.

- 1 015620

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1. Шарнирная область мутеинов кдр130Ес

Нижняя шарнирная область человеческого 1дС1-Ес была модифицирована посредством сайтнаправленного мутагенеза. Идеальная последовательность, определенная в экспериментах, представляет собой ЛЕСА (как она включена в соединение СК5/18).

Сокращения и символы: аа - аминокислота(ы); С - цистеины, формирующие два дисульфидных мостика, необходимых для димеризации слитого белка Ес; X - аланин (А1а, А) или фенилаланин (Рйе, Е); Ζ - глутамат (С1и, Е) или аспартат (Акр, Ό).

Фиг. 2. Кривые элюции гель-хроматографии кдр130Ес дикого типа и СК.5/18

СК.5/18 показывает значительно меньшее количество агрегатов (побочных продуктов) по сравнению с кдр130Ес дикого типа и, таким образом, более высокий выход незагрязненного продукта.

Фиг. 3. Ингибирование 1Е-6/к1Ь-бК-индуцированной пролиферации клеток ВАЕ3/др130 посредством СК5/18 или кдр130Ес дикого типа, как определено МТ8 анализами жизнеспособности клеток

СК5/18 является значительно более биологически активным, чем кдр130Ес дикого типа (\\1) в плане блокирования пролиферации, запускаемой 100 нг/мл 1Ь-6 и 50 нг/мл 81Ь-6К. Это отображается величиной 1С₅₀ для СК5/18 (1), которая составляет приблизительно половину от 1С₅₀ для кдр130Ес (2). Сокращения и символы: 1С₅₀ концентрация с 50%-ой эффективностью ингибирования; 1Ь-б - интерлейкин-6; 1/К - 1Ь-6 плюс к1Ь-6К; МТ8 субстрат, который преобразуется метаболически активными клетками в растворимый продукт формазан, поглощающий при 490 нм; ΘΌ - оптическая плотность при 490 нм; 81Ь-6К - растворимый рецептор интерлейкина 6.

Таким образом, настоящее изобретение относится к полипептидным димерам, способным ингибировать активность агонистического комплекса 1Е-6/к1Е-6К и содержащим два мономера, где каждый мономер содержит растворимую молекулу др130 либо ее вариант или фрагмент, слитые с доменом Ес белка 1дС, и где по меньшей мере аминокислотный остаток Ьеи₂з5 шарнирной области домена Ес заменен по меньшей мере одним гидрофильным аминокислотным остатком. Предпочтительные гидрофильные аминокислотные остатки представляют собой С1и и Акр.

Термин растворимая, как он используется здесь, относится к молекуле др130 без внутриклеточно го домена и предпочтительно без трансмембранного домена.

Димеры по настоящему изобретению могут быть сконструированы с использованием известных способов. Используемые домены могут состоять из целого внеклеточного домена др130 либо они могут состоять из его мутантов или фрагментов, которые обладают способностью ингибировать активность агонистического комплекса 1Е-6/к1Е-6К. Предпочтительные фрагменты представляют собой фрагменты, состоящие, по меньшей мере, из внеклеточных доменов Ό1-Ό3.

Выражение слитый с доменом Ес белка 1дС означает, что предпочтительно партнер слияния димера состоит только из домена Ес белка 1дС1. Однако этот участок Ес может содержать последовательности из более чем одного изотипа 1дС, и выбор конкретных мотивов последовательности для оптимизации желательных эффекторных функций находится в пределах навыков специалиста в данной области техники.

В предпочтительном воплощении полипептидного димера по настоящему изобретению аминокислотный остаток шарнирной области Ьеи₂₃₄ заменен на Рйе или А1а.

В более предпочтительном воплощении полипептидного димера по настоящему изобретению аминокислотные остатки Ьеи₂₃₄ и/или С1у₂₃₇ шарнирной области заменены аминокислотным остатком А1а.

В еще более предпочтительном воплощении полипептидного димера по настоящему изобретению шарнирная область содержит мотив аминокислотной последовательности А1а₂₃₄-С1и₂₃₅-С1у₂₃₆-А1а₂₃₇ вместо Ееи234-Ьеи235-С1у236-С1у237.

Особенно предпочтительным является полипептидный димер, где шарнирная область содержит аминокислотную последовательность Акр₂₂1-Еук₂₂₂-Тйг₂₂₃-Шк₂₂₄-Тйг₂₂5-Сук₂₂₆-Рго₂₂₇-Рго₂₂₈-Сук₂₂₉-Рго₂₃₀ ^А1а231^-РгО232^-С1а233^-А1а234^-С1а235^-С1у236^-А1а237^-РгО238^-8еГ239^-^^а1240.

Слияние внеклеточного домена др130 (кдр130), предпочтительно по С-концу, или его варианта, или фрагмента с шарнирной областью участка Ес может быть непосредственным, либо для него могут быть использованы гибкие полипептидные линкерные домены разной длины и аминокислотного состава. Эти линкеры могут быть либо полностью искусственными (например содержащими 2-50 аминокислотных остатков, независимо выбранных из группы, состоящей из глицина, серина, аспарагина, треонина и аланина), либо полученными из встречающихся в природе белков. Такие линкеры могут усиливать гибкость и связывающие свойства димера.

Кроме того, слитые белки кдр130Ес по изобретению могут быть дополнительно слиты с метками, таким как поли(Шк), Мус, 81гер, полиаргинин, Е1ад, зеленый флуоресцентный белок (СЕР), ТАР, глутатион-8-трансфераза (С8Т), НА, кальмомодулин-связывающий пептид (СВР), мальтоза-связывающий белок (МВР), У5, Н8У (вирус простого герпеса), 8, вирус везикулярного стоматита (У8У), белок С, люцифераза, С1и-С1и, Е, бета-САЕ, Т7 или другие эпитопы, к которым доступны антитела или другие связывающие молекулы для обеспечения быстрой очистки, обнаружения в вестерн-блоттинге или ЕЬ18А (твердофазный иммуноферментный анализ), иммунопреципитации или снижения/блокирования актив

- 2 015620 ности в биоанализах.

В еще одном предпочтительном воплощении полипептидного димера по настоящему изобретению один или более сайтов Ν-гликозилирования вставлены между растворимой молекулой др130, или ее вариантом, или фрагментом и доменом Рс. Аминокислотные мотивы сайтов Ν-гликозилирования с коровой последовательностью Аки-Х-Зег или Аки-Х-Тйг зависят от контекста мотива в белке и могут быть предсказаны и сконструированы специалистом в данной области техники, например, посредством использования бесплатного программного обеспечения, такого как №ιΝ6Ι\ό (Центр Анализа Биологических Последовательностей, Технический университет Дании (СеШег £от Вю1одюа1 Зециеисе Аиа1ук1к, Тесйи1са1 Ишуегкйу о£ Эеитагк)). Предпочтительным элементом линкера Ν-гликозилирования для димеров кдр130Рс по изобретению является НЦ-Аки-Ьеи-Зег-УаРПе.

Другим объектом настоящего изобретения являются ПЭГилированные или другие химически модифицированные формы димеров. ПЭГилирование молекул кдр130 может быть осуществлено, например, согласно способам, описанным для человеческих ΙΡΝ-γ, ΙΡΝ-α, ΙΡΝ-β, Ш-15 или 1Ь-2 (УонидЧег е! а1., Сигг Рйагт Эек (2002), 8:2139; Стасе е! а1., I. 1и!ет£етои Су!окше Век (2001), 21:1103; Рерткку е! а1., I. Рйаттасо1 Ехр Тйег (2001), 297:1059; Ре!!йе! а1., I. Вю1 Сйет (1997), 272:2312; Сообкои е! а1. Вю!есйио1оду ΝΥ (1990), 8:343; Ка!ге; I. 1ттиио1 (1990), 144:209).

Для настоящего изобретения подходит любой вид полиэтиленгликоля (ПЭГ) при условии, что ПЭГполипептид-димер сохранит способность блокировать 1Ь-б ответы, зависящие от 8ΙΕ-6Κ, что может быть проанализировано способами, известными в данной области техники.

Предпочтительно полиэтиленгликоль в полипептидном димере по настоящему изобретению представляет собой ПЭГ 1000, 2000, 3000, 5000, 10000, 15000, 20000 или 40000, причем особо предпочтителен полиэтиленгликоль 20000 или 40000.

Для образования димера две растворимые др130 молекулы соединяют друг с другом простой ковалентной связью, гибким пептидным линкером или предпочтительно посредством одного или более дисульфидных мостиков.

Пептидные линкеры могут быть полностью искусственными (например содержащими 2-20 аминокислотных остатков, независимо выбранных из группы, состоящей из глицина, серина, аспарагина, треонина и аланина) или полученными из встречающихся в природе белков. Образование дисульфидных мостиков может быть осуществлено, например, посредством рекомбинантной экспрессии, где нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая мономер кдр130Рс, содержит один или более кодонов, кодирующих цистеин, предпочтительно в шарнирной области шарнира домена Рс.

Димеры по настоящему изобретению предпочтительно продуцируют рекомбинантным образом путем использования полинуклеотида, кодирующего мономер димера, и векторов, предпочтительно векторов экспрессии, содержащих указанные полинуклеотиды. Для получения димеров по изобретению полинуклеотиды получают из существующих клонов, то есть они предпочтительно кодируют встречающийся в природе полипептид или его часть (для человеческого др130/Ш68Т: последовательность СеиВаик ΝΜ_002184 и поддерживающие клоны; для константной области человеческого 1дС1/1СНС1: например, последовательность СеиВаик АК057754). Полипептиды, кодируемые любым полинуклеотидом, который гибридизуется с комплеменом нативной ДНК или РНК в условиях высокой строгости или умеренной строгости (определения см. в ЗатЬгоок, Мо1еси1аг С1ошид А ЬаЬога!огу Маииа1, Со1б Зрпид НагЬог ЬаЬога!огу (1989) Ν.Υ.) до тех пор, пока этот полипептид сохраняет биологическую активность нативной последовательности, также полезны для получения димеров по настоящему изобретению.

Рекомбинантные векторы могут быть созданы способами, хорошо известными специалисту в данной области техники; см., например, ЗатЬгоок, Мо1еси1аг С1ошид А ЬаЬота!огу Маииа1, Со1б Зрпид НагЬог ЬаЬота!огу (1989) Ν.Υ. Для поддержания и экспрессии последовательностей, кодирующих димеры по настоящему изобретению, могут быть использованы разнообразные системы вектор экспрессии/хозяин. Они включают, без ограничения ими, микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, плазмидой или космидными ДНК-векторами экспрессии; дрожжи, трасформированные дрожжевыми векторами экспрессии; системы на основе клеток насекомых, инфицированных вирусными векторами экспрессии (например бакуловирусом); системы на основе растительных клеток, трансформированных вирусными векторами экспрессии (например вирусом мозаики цветной капусты, СаМУ; вирусом мозаики табака, ТМУ) или бактериальными векторами экспрессии (например плазмидами Т1 или рВВ322); или системы на основе животных клеток.

В бактериальных системах может быть выбран целый ряд векторов экспрессии в зависимости от применения, предназначенного для полипептидного димера по настоящему изобретению. Векторы, пригодные для использования в настоящем изобретении, включают, без ограничения ими, рЗКК экспрессирующий вектор для экспрессии в бактериях.

В разновидностях дрожжей дикого типа или модифицированных (например подвергнутых гликоинжинирингу), таких как Зассйаготусек сетеуЩае, ЗсЫхокассйагошусек ротЬе или РюЫа рак!опк, может быть использован ряд векторов, содержащих конституитивные или индуцибельные промоторы или системы промоторов, такие как альфа-фактор, алкогольоксидаза, РСН (фосфоглицераткиназа), тетрациклинглюкоза и т.д.; обзор см. в Сгаи! е! а1. (1987) Ме!йобк Еи/ушок 153:516-544; 81ат е! а1. (2004) Ме!йобк

- 3 015620

33:189-198; Масаи1еу-Ра!пск е! а1. (2005) Уеай 22:249-270, СеШззеп е! а1. (2005) ЕЕМ8 Уеа81 Ке§. 5:10791096; νίΐάΐ апб Сегпдгозк (2005) №а!.Кеу.М1сгоЫо1. 3:119-128.

В случаях, когда используются растительные системы экспрессии из уровня техники (обзор см. в, например, 8!одег е! а1. (2005) Сшт.Орш.Вю!есЬпо1.16:167-173; Сотогб е! а1. (2005) Тгепбк Вю1ес1то1. 23:559-565), экспрессия последовательностей, кодирующих димер (или его мономеры) по настоящему изобретению, может находиться под контролем любого из множества промоторов. Например, могут использоваться вирусные промоторы, такие как промоторы 358 и 198 СаМУ, по-отдельности или в комбинации с омега-лидерной последовательностью из ТМУ (Такатайи (1987) ЕМВО 1. 6:307-311). Альтернативно могут использоваться растительные промоторы, такие как промоторы малой субъединицы КНВ18СО или белков теплового шока, (Соги//1 е! а1. (1984) ЕМВО 1. 3:1671-1680; Вгодйе е! а1. (1984) 8с1епсе 224:838-843; и \Уш1ег е! а1. (1991) Ке§и1!8 РгоЫ. Се11 ОШег. 17:85-105). Эти конструкты могут быть введены в растительные клетки непосредственной ДНК-трансформацией или патогенопосредованной трансфекцией. Такие методики описаны во многих общедоступных обзорах (см., например, НоЬЬк апб Милу ίη МсСгате Н111 УеагЬоок оГ 8с1епсе апб Тескпо1оду (1992) МсСгате Н111, №е\у Уогк, ΝΥ.; рр. 191-196).

Для экспрессии димеров (или их мономеров) по настоящему изобретению также может быть использована система насекомых. Например, в одной такой системе в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клетках 8робор!ега Ггищрегба или в личинках ТпсНоркыа используется вирус ядерного полигедрозиса Аи!одгарйа сайГотшса (ΑсNРV). Последовательности могут быть клонированы в несущественную область вируса, такую как ген полигедрина, и помещены под контроль промотора полигедрина. Успешная вставка ДНК-последовательности, кодирующей мономеры §др130Ес или их фрагменты или варианты, сделает ген полигедрина неактивным и приведет к продуцированию рекомбинантного вируса без белка оболочки. Затем эти рекомбинантные вирусы могут использоваться для инфицирования, например, клеток 8. Ггищрегба или личинок ТпсНорйыа. в которых может быть экспрессирован §др130Ес по настоящему изобретению (ЕпдеШагб е! а1. (1994) Ргос. №а1. Асаб. 8ск 91:3224-3227).

В клетках-хозяевах млекопитающих может быть использовано большое количество систем экспрессии на основе, например, липидной трансфекции или вирусной трансдукции клеток. В тех случаях, когда в качестве вектора экспресии используется аденовирус, последовательности, кодирующие полипептид(ы) по настоящему изобретению, могут быть лигированы в комплекс транскрипции/трансляции аденовируса, состоящий из позднего промотора и тройчатой лидерной последовательности. Вставка в несущественную область Е1 или ЕЗ вирусного генома может использоваться для получения жизнеспособного вируса, который способен экспрессировать полипептиды по настоящему изобретению в инфицированных клетках-хозяевах (Ьодап, 1 апб 81епк, Т. (1984) Ргос. №а!1. Асаб. 8ск 81:3655-3659). Кроме того, для усиления экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающего могут быть использованы транскрипционные энхансеры, такие как энхансер вируса саркомы Рауса (К8У).

После введения рекомбинантного вектора(ов) клетки-хозяева выращивают в селективной среде, которая позволяет осуществлять селекцию на рост клеток, содержащих вектор. Для выделения трансформированных клеточных линий может быть использовано любое количество систем селекции. Они включают, без ограничения ими, тимидинкиназу вируса простого герпеса (^1д1ег, М. е! а1. (1977) Се11 11:22332) и аденинфосфорибозилтрансферазу (Ьо^у, I. е! а1. (1980) Се11 22:817-23), гены, которые могут использоваться в 1к.8ир.- или арг1.5ир.- клетках, соответственно. Кроме того, в качестве основы для селекции может использоваться устойчивость к антиметаболиту, антибиотику или гербициду; например, ген бЫг (кодирует дигидрофолатредуктазу), который придает устойчивость к метотрексату (\Ущ1ег М. е! а1. (1980) Ргос. №а!1. Асаб. 8сг77:3567-70); ген пр! (кодирует неомицинфосфотрансферазу), который придает устойчивость к аминогликозидам неомицину и С-418 (Со1Ьеге Со1Ьеге-Сагарш, Е. е! а1 (1981) 1. Мо1. Вю1. 150:1-14) и ген а1§ (кодирует ацетолактатсинтазу) или ген ра! (кодирует фосфинотрицинацетилтрансферазу), которые придают устойчивость к хлорсульфурону и фосфинотрицинацетилтрансферазе, соответственно. Были описаны дополнительные гены для селекции, например, ген !грВ (кодирует триптофансинтазу В), который позволяет клеткам утилизировать индол вместо триптофана, или ген Ы&Э (кодирует гистидинолдегидрогеназу), который позволяет клеткам утилизировать гистинол вместо гистидина (Наг!тап, 8. С. апб К. С. МиШдап (1988) Ргос. №а!1. Асаб. 8с1. 85:8047-51). Использование видимых маркеров приобрело популярность благодаря таким маркерам, как антоцианины, бета-глюкуронидаза и ее субстрат СИ8, и люцифераза и ее субстрат люциферин, которые широко применяются не только для идентификации трансформантов, но также и для определения величины временной или стабильной экспрессии белка, относящегося к конкретной векторной системе (Кйобек, С. А. е! а1. (1995) Ме!йоб§ Мо1. Вю1. 55:121131).

Очистку рекомбинантных полипептидов осуществляют любыми из способов, известных в уровне техники для этой цели, то есть посредством любой общеизвестной методики, включая экстракцию, осаждение, хроматографию, электрофорез или тому подобное. Дополнительная процедура очистки, которая может быть использована, представляет собой афинную хроматографию с использованием, например, белка А, белка С или моноклональных антител, которые связывают целевой полипептид и которые продуцируются и иммобилизуются на гелевой матрице, содержащейся в колонке. Неочищенные препараты,

- 4 015620 содержащие рекомбинантный полипептид, пропускают через колонку. Полипептид связывается с колонкой посредством специфического взаимодействия с аффинной гелевой матрицей, тогда как примеси проходят, не связываясь. После промывания полипептид элюируют из геля, изменяя рН или ионную силу, а затем, если он получен в виде мономера, димеризуют и, если желательно, ПЭГилируют.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к способу получения полипептидного димера по настоящему изобретению, включающему культивирование клетки-хозяина, трасформированной ДНК-последовательностью, кодирующей мономер указанного полипептида, и выделение полипептидамономера или димера из указанной клетки-хозяина или культуры.

Полипептидные димеры по настоящему изобретению полезны для лечения и/или предупреждения всех патологий, при которых должна быть ингибирована активность агонистического комплекса 1Ь6/81Ь6В.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество полипептидного димера по настоящему изобретению, предпочтительно в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтически приемлемый охватывает любой носитель, который не влияет негативно на уровень биологической активности активного ингредиента и который не токсичен для хозяина, которому он вводится. Примеры пригодных фармацевтических носителей хорошо известны в уровне техники и включают забуференные фосфатом физиологические растворы, воду, эмульсии, такие как эмульсии масло/вода, различные типы увлажнителей, стерильные растворы и т.д. Такие носители могут быть получены общеизвестными способами и могут быть введены субъекту в эффективной дозе.

Эффективное количество относится к количеству активного ингредиента, которое является достаточным для того, чтобы воздействовать на течение и тяжесть заболевания, приводя к снижению или ремиссии такой патологии.

Эффективная доза, полезная для лечения и/или предупреждения этих заболеваний или расстройств, может быть определена с помощью способов, известных специалисту в данной области техники (см., например, Είη§1 с1 а1., Тйс Рйагтосо1од1са1 Вак1к οί Тйегареибск, Сообтаи апб Сбшаи, ебк. МасшШап РиЫщЫпд Со., №\ν Уогк, рр. 1-46 ((1975)).

Введение композиций может быть осуществлено различными путями, например внутривенным, внутрибрюшинным, подкожным, внутримышечным, местным или внутрикожным. Режим дозирования будет определен лечащим врачом и другими клиническими факторами. Как известно в медицине, дозы для каждого конкретного пациента зависят от многих факторов, включая размер пациента, площадь поверхности тела, возраст, пол, конкретное соединение, подлежащее введению, время и путь введения, вид терапии, общее состояние здоровья и другие лекарственные средства, вводимые одновременно.

Настоящее изобретение также относится к применению полипептидного димера, как он определен выше, для изготовления фармацевтической композиции для лечения и/или предупреждения заболевания или расстройства, при которых благоприятным является блокирование агонистического комплекса 1Ь6/к1Ь-6В. Предпочтительным медицинским применением полипептидных димеров по настоящему изобретению является лечение/предупреждение резорбции кости, гиперкальцемии, кахексии, опухолей или других типов рака (например рака ободочной кишки, множественной миеломы, лимфомы, лейкемии или болезни Ходжкина), аутоиммунных заболеваний (например рассеянного склероза или диабета типа 1), воспалительных или атопических заболеваний (например болезни Крона, язвенного колита, ревматоидного артрита, ювенильного ревматоидного артрита, астмы, псориаза, саркоидоза, красной системной волчанки или увеита), инфекций (например бактериями, вирусами, грибами или другими патогенами), а также эндокринных расстройств и метаболических или катаболических заболеваний (например диабета типа 2, ожирения, гипергликемии или гиперхолистеринемии).

Примеры ниже объясняют изобретение более подробно.

Пример 1. Конструирование и продуцирование кдр130Гс мутеина СВ5/18 (А) Материалы

Компонентны системы клонирования Са1е\сау (АссиРпте Ρίχ ДНК полимераза, донорный вектор рООНВ221, вектор экспрессии рсОНА-ЭЕ8Т40 с СМУ промотором, ВР и ЬВ рекомбиназа для переноса вставки и компетентные клетки Е. сой) были получены от 1иуйгодеи (Карлсруэ, Германия). Набор для сайт-направленного мутагенеза ОшкСТапде II был получен от 81га1адеие (Амстердам, Нидерланды). Очищенные ПААГ праймеры для мутагенеза получали от М1сгокуи1й (Бальгах, Швейцария). Клетки СНО-К1 были получены из немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Брауншвейг, Германия). Компоненты культуральных сред были получены следующим образом: среда Хама Е12, ГВ8 (фетальная телячья сыворотка) с низким содержанием 1дС и РВ8 (РАА БаЬогаЮпек; Кёлбе, Германия), ГВ8 (Вюсйгот; Берлин, Германия), раствор трипсин/ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота, 1иу11годеи) и раствор С418 (8фта-А1бпс11; Тауфкирхен, Германия). Реагент для трансфекции, ^^рοίесΐат^ηе 2000, получали от 1иуйгодеи. 8аи1а Сгих (Гейдельберг, Германия) поставил белок А/С плюс агароза для иммунопреципитации. Как для иммунопреципитации, так и для первичного обнаружения в вестернблоттингах использовали мышиное моноклональное антитело против человека 1дС (Гс) (СВЬ102; Сйеш1сои; Хофхайм, Германия). Вторичное обнаружение в вестерн-блоттинге проводили с помощью антитела

- 5 015620

1дС против мыши, связанного с НКР (пероксидаза хрена), субстрата ЕСЬ-Р1и8 для вестерн-блоттинга и Н1ретй1ш ЕСЬ (все от СЕ Неаббсате; Мюнхен, Германия).

Роллерные флаконы (2,1 л, 2,5Х поверхность) получали от Сге1пег Вю-Опе (Фриккенхаузен, Германия). Фильтры из ацетата целлюлозы (0,45 мкм) для вакуум-фильтра получали от 8аПопи8 (Геттинген, Германия). Материалы для аффинной и гель-хроматографии (8ЕС) были получены от СЕ Неаббсате (Мюнхен, Германия): материал МаЬ8е1ес1 (код продукта 17-5199-01) в колонке ХК16/20, РЭ-10 обессоливающие колонки и Н1Ьоаб 26/60 8иретбех 200 пг колонки для 8ЕС. Мембранные блоки для концентрирования Ат1соп Ибга-15 ИбгасеЕРЬ на 50 кДа были получены от Мбброте (Эшборн, Германия). Готовый раствор бис-акриламида (19:1, 30%) для ПААГ (полиакриламидный гель) был получен от Вю-Каб (Мюнхен, Германия).

(Б) Конструирование СК5/18 кДНК для полноразмерного здр130Ес, содежащую полный внеклеточный домен др130 и человеческий 1дС1 Ес дикого типа (источники: для человеческого др130/1Ь68Т: последовательность СепВапк ΝΜ_002184 и поддерживающие клоны; для константной области человеческого 1дС1/1СНС1: например, последовательность СепВапк АК057754), оптимизировали по кодонам для экспрессии в клетках СНО-К1 и субклонировали в р^ОNК221, используя праймеры Са1е\тау. АссиРпте Р£х ДНК полимеразу и ВР рекомбиназу в стандартной процедуре клонирования Са1е\тау. Последовательность субклонированной вставки полностью проверяли, используя стэкированные прямой и обратный праймеры для секвенирования, каждый 250-300 п.о. Посредством сайт-направленного мутагенеза с помощью набора ОшкСНапде II нижнюю шарнирную область 1дС1-Ес (аминокислоты 234, 235 и 237 согласно нумерации ЕЙ) мутировали из последовательности дикого типа, ЬЕСС, в АЕСА. Мутантные клоны проверяли полным секвенированием, как описано выше. Затем вставку переносили в вектор экспрессии рс^NА-^Е8Т40 путем ЬК Са1е\тау рекомбинации. Поскольку вставка кодирует два стоп-кодона после участка Ес, метки, закодированные в рс^NА-^Е8Т40 (У5 и 6хН18 эпитопы), не присутствуют в СК5/18. Положительные клоны идентифицировали рестрикционным анализом с помощью А1\сМ и снова секвенированием.

(В) Клеточная культура и трансфекция

Клетки СНО-К1 выращивали в среде Хама Е12 с добавлением 10% ЕВ8 при 37°С и 5% СО₂ в насыщенной водными парами атмосфере. Поддерживающие культуры делили каждые 3-4 дня и использовали только вплоть до 20 пассажей. Клетки трансфицировали экспрессионным конструктом рс^NАЭЕ8Т40_СК5/18, используя Ыро£ес1ат1ие 2000 и стандартные условия для СНО-К1, поставляемые Ιπνί1годеп. Для первого теста временной экспрессии клетки СНО-К1 трансфицировали в 6-луночных планшетах, и клетки и супернатанты собрали через 24 ч после трансфекции. СК5/18 подвергали иммунопреципитации из супернатантов, используя белок А/С плюс агароза и антитело 1дС (Ес) против человека согласно инструкциям изготовителя. Весь клеточный белок экстрагировали и проводили вестернблоттинги с антителом 1дС (Ес) против человека с лизатами клеток и иммунопреципитатами, как описано в ХУаеШд е1 а1., I. 1ттипо1. 168: 5342 (2002).

(Г) Продуцирование СК5/18 в клетках СНО-К.1

После успешной временной экспрессии клетки СНО-К1 трансфицировали и отбирали положительные клоны, используя 400 мкг/мл С418, в чашках диаметром 10 см. Для определения качества и свойств продукта предварительно отобранный поликлональный пул СНО-К1 переносили в роллерные флаконы и культивировали в ЕВ8 с низким содержанием 1дС. Супернатанты конфлюентных клеток собирали 2-3 раза в неделю, центрифугировали дважды при 3500 хд и 4°С в течение 15 мин, чтобы удалить клеточные остатки и либо обрабатывали немедленно, либо замораживали при -80°С. Параллельно стабильные клеточные клоны отбирали из предварительно отобранного пула, используя метод ограниченного разведения, и характеризовали анализом экспрессии в вестерн-блоттинге, как описано выше. Клон с самой высокой и самой стабильной экспрессией переносили в роллерные флаконы и использовали для постоянной продукции.

(Д) Очистка аффинной и гель-хроматографией

СК5/18-содержащие супернатанты из культур в роллерных флаконах очищали при 4°С с использованием перистальтического насоса Р-1 и системы АКТА Рцпйег 100 (оба от СЕ Неаббсате; Мюнхен, Германия). Протокол был основан на рекомендациях изготовителя для очистки моноклональных антител. После центрифугирования рН свежего или оттаявшего (на льду) супернатанта доводили до 6,7-7,0. После двух раундов вакуумного фильтрования (0,45 мкм) супернатант дегазировали и, в случае необходимости, рН снова доводили до значения 6,7-7,0. Затем в колонку для аффинной хроматографии, уравновешенную РВ8 (6-25 мл МаЬ8е1ес1 в колонке ХК16/20), загружали 2-4 л супернатанта при скорости потока 3-10 мл/минут, используя насос Р-1. После промывания РВ8 колонку переносили в АКТА Рштбег и снова промывали РВ8 до тех пор, пока А₂₈₀ не стабилизировался после количественного удаления несвязанного белка. Для элюции в систему АКТА вводили два 50 мМ буфера на основе цитрата натрия с рН 3,25 и 5,5, соответственно, которые смешивали, чтобы получить желательные условия рН. После одной стадии промывания при рН 5,1 следовала элюция при рН 3,7. Фракции по 10 мл собирали в пробирки объемом 15 мл, содержащие 2 мл 1 М трис-НС1 (рН 11). Пиковые фракции объединяли и измеряли рН и доводили до 7,5 в случае необходимости. Концентрацию белка в пуле измеряли при А₂₈₀ и пул осторож

- 6 015620 но концентрировали максимум до 1,5 мг/мл, используя мембранные блоки для концентрирования Атсои ИЕта-15 иИтасе1-РЬ на 50 кДа. Использовали ΡΌ-10 обессоливающие колонки, уравновешенные РВ8, для замены цитратного буфера на РВ8, после чего проводили еще одно измерение концентрации белка при 280 нм.

Для гель-хроматографии (8ЕС) рекомендована максимальная концентрация белка 1,2 мг/мл в РВ8. 8ЕС выполняли с системой АКТА в ШЬоаб 26/60 8иретбех колонке на 200 пк, уравновешенной РВ8, при скорости потока 0,8 мл/мин. В отличие от дикого типа кдр130Ес, СР5/18 элюировался в единственном пике после низкого пика агрегатов более высокой молекулярной массы (фиг. 2). В первых прогонах были получены образцы всех фракций для анализа посредством электрофореза в полиакриламидном геле. Пиковые фракции объединяли, измеряли в них концентрацию белка и доводили до 400-500 мкг/мл в РВ8, а аликвоты для одноразового использования замораживали при -80°С для длительного хранения. Фракции и объединенные образцы анализировали с помощью анализа посредством нативного электрофореза в полиакриламидном геле (7,5%) с последующим окрашиванием серебром или Кумасси.

Как показано на фиг. 2, количество побочных продуктов (агрегатов) СР5/18 значительно уменьшено по сравнению с исходным соединением кдр130Ес, которое очищали в параллельном эксперименте. Кроме того, элюция желаемого продукта (димер СВ5/18) четко отделена от фракций примесей (агрегатов), что не имеет места при кдр130Ес дикого типа. Таким образом, как выход (благодаря более высокой доле желаемого продукта), так и качество препаратов СР5/18 лучше, чем таковые для обычного 5§р130Рс. что приводит к более низким затратам для промышленного производства. Эти результаты указывают на явное усовершенствование СР5/18 по сравнению с исходной молекулой кдр130Ес.

Пример 2. Биоактивность СР5/18 в стандартизированном анализе клеточной пролиферации (A) Материалы

Использовали стабильно трансфицированную клеточную линию ВАЕ3/др130, являющуюся предшественником В клеток, и сконструированный цитокин гипер-1Ь-6. Компоненты культуральной среды были получены следующим образом: ΌΜΕΜ (модифицированная по Дульбекко среда Игла) и РВ8 (РАА БаЬогаЮпек; Кольбе, Германия), ЕВ8 (ВюсЕтот; Берлин, Германия) и раствор трипсин/ЭДТА (1пуЕгодеи; Карлсруэ, Германия). Интерлейкин-6 (1Ь-6) и растворимый рецептор интерлейкина-6 (81Б-6Е) были получены у Вю8оитсе (Золинген, Германия) и Ρ&Ό 8ук1етк (Висбаден, Германия), соответственно. Набор для водного нерадиоактивного анализа пролиферации клеток (ΜΤ8) ТЕе Се11 ТЕет 96 был получен от Рготеда (Мангейм, Германия).

(Б) Блокирование 1Е-6/к1Е-6В-индуцированной пролиферации клеток ВАЕ3/др130 посредством эдр130Ес или СВ5/18

Пролиферация и жизнеспособность клеток ВАЕ3/др130 зависят от присутствия комплекса 1И-6/51И-6Н в культуральной среде. Для поддержания клетки ВАЕ3/др130 культивировали при плотности меньше чем 5 х10⁵ клеток/мл в ΌΜΕΜ с 10% ЕВ8 и 10 нг/мл гипер-1Ь-6 (сконструированный цитокин, состоящий из соединенных ковалентной связью 1Ь-6 и 81Ь-6В; Е1ксЕег е( а1. 1997, №1. Вю1есЕио1. 15: 142-145). 10 нг/мл гипер1Ь-6 можно заменить на 100 нг/мл 1Ь-6 и 50 нг/мл 81Б-6В. Два раза в неделю проводили клеточные пассажи. Для анализов клетки промывали дважды в среде без гипер-1Ь-6 (или 1Ь-6/к1Е-6В) и затем засевали с плотностью 5000 клеток/лунку в 96-луночных планшетах. СВ5/18 или исходное соединение кдр130Ес добавляли в различных концентрациях, варьирующих от 20 мкг/мл до 78 нг/мл (серии разведений 1:4; фиг. 3). Затем клетки культивировали в течение 3 дней в присутствии 100 нг/мл 1Ь-6 и 50 нг/мл 81Ь-6К Контроли включали нестимулированные клетки без СВ5/18 или кдр130Ес и с их максимальной концентрацией, а также клетки, инкубировавшиеся только со стимуляторами 1Ь-6 и 81Р-6Р (фиг. 3).

(B) Результаты

Биологическую активность СВ5/18 или кдр130Ес дикого типа в клеточной культуре измеряли по снижению числа жизнеспособных клеток ВАЕ3/др130 (как определено превращением субстрата ΜΤ8) после 3 дней. СВ5/18 является более биологически активным, чем кдр130Ес дикого типа, достигая своей 1С₅₀ при концентрации примерно 400 нг/мл, где кдр130Ес (с 1С₅₀ примерно 800 нг/мл) не показывает никакого значительного эффекта (фиг. 3). Это указывает на то, что СР5/18 может использоваться в концентрации, составляющей приблизительно половину терапевтической концентрации соединения дикого типа.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Полипептидный димер, способный ингибировать активность агонистического комплекса 1Ь6/8ΙΕ-6Ρ и содержащий два мономера, где каждый из указанных мономеров содержит внеклеточную часть молекулы др130, или ее вариант, или фрагмент, слитые с доменом Ес белка 1дС1, и где, по меньшей мере, аминокислотный остаток Ьеи₂з5 шарнирной области домена Ес заменен по меньшей мере одним гидрофильным аминокислотным остатком.
2. Полипептидный димер по п.1, где гидрофильный аминокислотный остаток представляет собой 61и или Акр.
3. Полипептидный димер по п.1 или 2, где, кроме того, аминокислотный остаток Ьеи₂₃₄ шарнирной

- 7 015620 области заменен на РЬе или А1а.
4. Полипептидный димер по п.3, где аминокислотные остатки Ьеи₂₃₄ и/или С1у₂з7 шарнирной области заменены аминокислотным остатком А1а.
5. Полипептидный димер по любому из пп.1-4, где шарнирная область содержит мотив аминокислотной последовательности А1а₂₃₄-С1и₂₃₅-С1у₂₃₆-А1а₂₃₇ вместо Ьеи₂₃₄-Ьеи₂₃₅-С1у₂₃₆-С1у₂₃₇.
6. Полипептидный димер по п.5, где шарнирная область содержит аминокислотную последовательность А8р221-Ьу8222-ТЬГ223-Н18224-ТЬГ225-Су8226-РГО227-РГО228-Су8229-РГО230-А1а231-РГО232-С1и233-А1а234-С1и235С1у23б-А1а237-Рго238-8ег239-Уа1240.
7. Полипептидный димер по любому из пп.1-6, где растворимая молекула др130, или ее вариант, или фрагмент слиты с шарнирной областью домена Ес белка 1дС1 непосредственно или посредством гибкого полипептидного линкера.
8. Полипептидный димер по п.7, где линкер представляет собой линкер, содержащий 2-50 аминокислотных остатка, независимо выбранных из группы, состоящей из глицина, серина, аспарагина, треонина и аланина.
9. Полипептидный димер по любому из пп.1-8, где между растворимой молекулой др130, или ее вариантом, или фрагментом и доменом Ес вставлен один или более сайтов Ν-гликозилирования.
10. Полипептидный димер по любому из пп.1-9, где мономеры соединены друг с другом посредством простой ковалентной связи, гибкого пептидного линкера либо одного или более дисульфидных мостиков.
11. Полипептидный димер по любому из пп.1-10, где по меньшей мере один мономер указанного димера является ПЭГилированным.
12. Полинуклеотид, кодирующий мономер полипептидного димера по любому из пп.1-10.
13. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п.12.
14. Клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии по п.13.
15. Способ получения полипептидного димера по любому из пп.1-10, включающий культивирование клетки-хозяина по п.14 и выделение мономера или димера из указанной клетки-хозяина или культуры.
16. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептидный димер по любому из пп.1-11.
17. Применение полипептидного димера по любому из пп.1-11 для изготовления фармацевтической композиции для лечения и/или предупреждения заболевания или расстройства, при которых благоприятно блокирование агонистического комплекса 1Ь-6/81Ь-6В.
18. Применение по п.17, где указанное заболевание представляет собой резорбцию кости, гиперкальцемию, кахексию, опухоль или другой тип рака, аутоиммунное заболевание, воспалительное или атопическое заболевание, инфекцию, эндокринное расстройство либо метаболическое или катаболическое заболевание.