BRPI0713063A2 - dìmeros sgp130fc aperfeiçoados - Google Patents
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Abstract
DìMEROS SGP13OFC APERFEIçOADOS. A presente invenção refere-se a dímeros polipeptídeos compreendendo duas moléculas gp13O solúveis, em que cada uma das ditas moléculas é fundida a um domínio Fc de uma proteína lgG1 e em que a região articulada do domínio Fc é modificada resultando em vantajosas propriedades do dímero. Em uma modalidade particularmente preferida, a região articulada compreende a motivo sequência de aminoácidos Ala~ 234~-Glu~ 235~-Gly~ 236~- Ala~ 237~. Além disso, uma composição farmacêutica contendo o dito dímero e vários usos médicos são descritos.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DIMEROS SGP130FC APERFEIÇOADOS".
A presente invenção refere-se a um dímero de polipeptídeo com- preendendo duas moléculas gp130 solúveis cada uma estando fundida a um domínio Fc de uma proteína IgGI, em que a região articulada do domínio Fc é modificada resultando em vantajosas propriedades do dímero. A presente invenção também refere-se a uma composição farmacêutica contendo o dito dímero e vários usos médicos.
A interleucina-6 citocina pleiotrópica (IL-6) mostra um amplo es- pectro de funções biológicas entre as quais estimulação de células B e indu- ção de síntese de proteína de fase aguda em fígado são principalmente no- táveis. IL-6 exerce sua atividade sobre células-alvo através de ligação a um receptor de superfície específico de IL-6 (IL-6R). Este complexo de receptor/ ligante facilita homodimerização de gp130, a segunda subunidade do com- plexo de receptor de IL-6. Dimerização de gp130 resulta em transdução de um sinal IL-6. Formas solúveis da IL-6R (slL-6R) que são geradas por dois mecanismos (alternativa união e separação) também são capazes de dispa- rar dimerização de gp130 e sinalização quando complexadas com IL-6.
Uma vez que a porção citoplásmica da IL-6R não contribui para transdução de sinal, sinalização por um homodímero gp130 pode ser induzi- da por IL-6 em complexo com IL-6R solúvel ou ligada à membrana. A pre- sença de slL-6R, entretanto, conduz à sensibilização de células responsivas a IL-6 na direção de ligante. Além disso, células hibridoma dependentes es- tritamente de IL-6 não proliferam em resposta a quantidades muito baixas de IL-6 quando slL-6R presente nos meios de cultura é continuamente removida.
Inicialmente descrita como o transdutor de sinal interleucina-6, gp130 é uma cadeia transdutora compartilhada por muitas citocinas, tais como IL-6, IL-11, fator de inibição de leucemia (LIF), oncostatina M (OSM) e fator neurotrófico ciliar (CNTF). Todas estas citocinas atuam através de um complexo receptor bi- ou tri-partite no qual sinalização é disparada por ho- modimerização (para IL-6) ou heterodimerização de gp130 com LIF-R (para LlF, CT-1, OSM1 CLC e CNTF) ou OSM-R (para OSM). Estas citocinas as- sim podem mediar similares atividades biológicas em vários tecidos.
Embora gp130 possa ser encontrada sobre aproximadamente todos os tipos de células, a IL-6R mostra uma expressão muito mais restrita.
A liberação de slL-6R por um tipo de célula rende outras células, que so- mente expressam gp130, responsivas a IL-6. Este cenário é chamado trans- sinalização. Realmente, várias atividades celulares foram descritas as quais requerem o complexo de slL-6R e IL-6 e não são vistas com IL-6 sozinha. Proteína gp130 solúvel é encontrada em altas concentrações em plasma humano. Recentemente a hiper-IL-6 citocina programadora ("designer- cytokine") (H-IL-6), em que o terminal-C de slL-6R está covalentemente fun- dido ao terminal-N de IL-6 madura através de um Iigante peptídeo flexível, foi descrita. Como visto com o complexo de IL-6/slL-6R, H-IL-6 também atua sobre células que somente expressam gp130. Em contraste aos componen- tes separados, IL-6 e slL-6R, uma concentração 100 a 1000 vezes menor desta molécula de fusão é suficiente para induzir comparáveis sinais biológi- cos.
Para o tratamento de várias doenças ou distúrbios, específico bloqueio de respostas IL-6 dependentes de IL-6R solúvel pode ser desejá- vel. Tais doenças incluem ressorção de osso, hipercalcemia, caquexia, tu- mores ou outros tipos de câncer (por exemplo, câncer de cólon, mieloma múltiplo, linfoma, leucemia, doença de Hodgkin), doenças autoimunes (por exemplo, esclerose múltipla (MS) ou diabetes tipo 1), doenças inflamatórias ou atópicas (por exemplo, doença de Crohn, colite ulcerativa, artrite reuma- tóide, artrite reumatóide juvenil, asma, psoríase, sarcoidose, Iupus eritema- toso ou uveíte), infecções (por exemplo, por bactérias, vírus, fungos, ou ou- tros patógenos), assim como distúrbios endocrinológicos e doenças metabó- licas ou catabólicas (por exemplo, diabetes tipo 2, obesidade, hiperglicemia, ou hipercolesterinemia). Foi verificado que, por exemplo, dímeros sgp130 ou dímeros sgp130Fc são úteis para aplicações terapêuticas.
O problema técnico suportando a presente invenção foi o provi- mento de aperfeiçoados dímeros sgp130Fc. A solução do dito problema técnico é obtida através de provi- mento de modalidades caracterizadas nas reivindicações. Durante os expe- rimentos conduzindo à presente invenção foi verificado que a atividade bio- lógica, capacidade de purificação e estabilidade de proteínas de fusão sgp130Fc dependem significantemente da composição de aminoácido da região articulada entre a sgp130 e a parte Fe. Os aminoácidos 234, 235, e 237 da IgGI-Fc humana (de acordo com numeração EU) sofreram mutação de modo a reduzir ligação de receptor de Fc para este motivo (Duncan et al., Nature (1988), 332: 563-564; Canfield e Morrison, J. Exp. Méd. (1991), 173:1483-1491; Wines et al., J. Immunol. (2000), 164:5313-5318; Sonder- mann et al., Nature (2000), 406:267). Inesperadamente, através de substitui- ção de Leu235 da seqüência tipo selvagem Leu23^Leu235-GIy236-GIy237 com glutamato (Glu, E) ou aspartato (Asp, D) e, assim, rompendo o motivo hidro- fóbico com um aminoácido fortemente hidrofílico (carregado), a atividade biológica e a estabilidade de proteínas de fusão sgp130Fc podem ser aper- feiçoadas. Mutações em posição 234 e 237 adicionam a este efeito. O mu- tante mais potente apresenta a seqüência Ala234-Glu235-Gly236-Ala237.
Breve Descrição dos Desenhos
Figura 1: Muteínas de região articulada de sgp130Fc
A região articulada inferior de IgGI-Fc humana foi modificada por mutagênese direcionada a sítio. A seqüência ideal, como determinada nos experimentos, é "AEGA" (como incorporada no composto CR5/18).
Abreviaturas e símbolos: aa, aminoácido(s); C, cisteínas for- mando as duas pontes dissulfeto necessárias para dimerização da proteína de fusão Fc; X, alanina (Ala, A) ou fenil alanina (Phe, F); glutamato (Glu, E) ou aspartato (Asp, D).
Figura 2: Curvas de eluição de cromatoqrafia de exclusão de tamanho de sqp130Fc tipo selvagem e CR5/18
CR5/18 mostra uma quantidade significantemente reduzida de agregados (subprodutos) comparado a sgp130Fc tipo selvagem e, assim, um maior rendimento de produto não-contaminado.
Figura 3: Inibição de proliferação induzida por IL-6/slL-6R de células BAF3/qp130 por CR5/18 ou sqp130Fc tipo selvagem como determinada por ensaios de viabilidade de célula MTS
CR5/18 é significantemente mais biologicamente ativo que sgp130Fc tipo selvagem (wt) em bloqueio de proliferação disparada por 100 ng/mL de IL-6 e 50 ng/mL de slL-6R. Isto é refletido pela IC50 de CR5/18 (1), que é cerca de metade de IC50 de sgp130Fc (2).
Abreviaturas e símbolos: IC50, concentração com 50% de eficá- cia inibidora; IL-6, interleucina-6; l/R, IL-6 mais slL-6R; MTS1 substrato que é convertido por células metabolicamente ativas a um produto formazan solú- vel absorvendo em 490nm; OD1 densidade ótica em 490nm; slL-6R, receptor de interleucina-6 solúvel.
Assim, a presente invenção refere-se a um dímero de polipeptí- deo capaz de inibir a atividade do complexo agonístico IL-6/slL-6R e com- preendendo dois monômeros, em que cada monômero compreende uma molécula de gp130 solúvel ou uma sua variante ou fragmento fundido a um domínio de uma proteína IgG e em que pelo menos um resíduo de aminoá- cido Leu235 da região articulada do domínio Fc é substituído por pelo menos um resíduo aminoácido hidrofílico. Resíduos de aminoácidos hidrofílicos pre- feridos são Glu e Asp.
O termo "solúvel" como aqui usado refere-se a uma molécula de gp130 carecendo de domínio intracelular e, preferivelmente, o domínio transmembrana.
Os dímeros da presente invenção podem ser engenheirados u- sando processos conhecidos. Os domínios utilizados podem consistir no in- teiro domínio extracelular de gp130 ou eles podem consistir em mutantes ou em seus fragmentos que mantêm a habilidade para inibir a atividade do com- plexo agonístico IL6/slL-6R. Fragmentos preferidos são fragmentos consis- tindo pelo menos nos domínios extracelulares D1 a D3.
A expressão "fundida a um domínio Fc de uma proteína IgG" significa que, preferivelmente, o parceiro de fusão do dímero meramente consiste no domínio Fc da proteína IgG1. Entretanto, a parte Fc pode com- preender seqüências de mais de um isotipo IgG, e seleção de particulares motivos de seqüências para otimizar desejadas funções efetoras está dentro do conhecimento comum na técnica.
Em uma modalidade preferida do dímero de polipeptídeo da presente invenção, o resíduo de aminoácido de região articulada Leu234 é substituído por Phe ou Ala.
Em uma modalidade mais preferida do dímero de polipeptídeo da presente invenção, os resíduos de aminoácidos Leu234 e/ou Gly237 da re- gião articulada são substituídos pelo resíduo de aminoácido Ala.
Em uma modalidade mesmo mais preferida do dímero de poli- peptídeo da presente invenção, a região articulada compreende o motivo de seqüência de aminoácido Ala234-Glu235-Gly236-Ala237 ao invés de Leu234- Leu235-Gly236-Gly237
Particularmente preferido é um dímero de polipeptídeo, em que a região articulada compreende a seqüência de aminoácidos Asp22-I- Lys222- Th r223- H is224-Th r225-Cy S226- P ro227- P ro228-Cys229- P ro230-Ala23i - P ro232-G IU233- Ala234-GIU235-Gly236-Ala237-PfO238-Ser239-Val240·
As fusões do domínio extracelular de gp130 (sgp130), preferi- velmente no terminal-C, ou sua variante ou fragmento para a região articula- da da parte Fc podem ser diretas ou elas podem empregar um domínio li- gante de polipeptídeo flexível de vários comprimentos e combinações de aminoácidos. Estes Iigantes podem ser inteiramente artificiais (por exemplo, compreendendo 2-50 resíduos de aminoácidos independentemente selecio- nados do grupo consistindo em glicina, serina, asparagina, treonina e alani- na) ou adotados de proteínas ocorrendo naturalmente. Tais Iigantes podem aperfeiçoar propriedades de flexibilidade e ligação do dímero.
Adicionalmente, as proteínas de fusão sgp130Fc da invenção ainda podem ser fundidas a marcadores, tais como poli(His), Myc, Strep, poliarginina, Flag, proteína fluorescente verde (GFP), TAP, glutationa S- transferase (GST), HA1 peptídeo de ligação de calmodulina (CBP), proteína de ligação de maltose (MBP), V5, HSV, S, vírus de estomatite vesicular (VSV), Proteína C, Luciferase, Glu-GIu, E, beta-GAL, T7 ou outros epítopos aos quais anticorpos ou outras moléculas Iigantes são disponíveis para per- mitir rápida purificação, detecção em Western blot ou ELISA, imunoprecipi- tação, ou esgotamento / bloqueio de atividade em bioensaios.
Ainda em uma modalidade preferida do dímero de polipeptídeo da presente invenção, um ou mais sítios de N-glicosilação são inseridos en- tre a molécula de gp130 solúvel ou sua variante ou fragmento e o domínio Fc. Motivos de aminoácidos de sítios de N-glicosilação com a seqüência nú- cleo Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr dependem do contexto do motivo na proteína e podem ser previstos e desenhados por aqueles versados na técnica, por exemplo, através do uso de software livre tal como NetNGIyc (Center for Bio- logical Sequence Analysis, Technical University of Denmark). Um preferido elemento Iigante de N-glicosilação para dímeros sgp130Fc da invenção é His-Asn-Leu-Ser-Val-lle.
Um outro objeto da presente invenção são formas PEGuiIadas ou outras quimicamente modificadas dos dímeros. PEGuilação das molécu- las de gp130 pode ser realizada, por exemplo, de acordo com os processos descritos para IFN-γ, IFN-alfa, IFN-beta, IL-15 ou IL-2 (Youngster et al., Curr Pharm Dês (2002), 8:2139; Grace et al., J Interferon Cytokine Res (2001), 21:1103; Pepinsky et al., J Pharmacol Exp Ther (2001), 297:1059; Pettit et al., J Biol Chem (1997), 272:2312; Goodson et al. Biotechnology NY (1990), 8:343; Katre; J Immunol (1990), 144:209).
Qualquer tipo de polietileno glicol é apropriado para a presente invenção contanto que o dímero de polipeptídeo PEG ainda seja capaz de bloquear respostas de IL-6 dependendo de slL-6R que pode ser ensaiado de acordo com os processos conhecidos na técnica.
Preferivelmente, o polietileno glicol do dímero de polipeptídeo da presente invenção é PEG 1000, 2000, 3000, 5000, 10000, 15000, 20000, ou 40000 com PEG 20000 ou 40000 sendo particularmente preferido.
De modo a formar o dímero, as duas moléculas de gp130 solú- veis são ligadas uma à outra através de uma ligação covalente simples, um ligante peptídeo flexível ou, preferivelmente, via uma ou mais pontes dissul- feto. Ligantes peptídeo podem ser inteiramente artificiais (por exemplo, com- preendendo 2 a 20 resíduos de aminoácidos selecionados independente- mente do grupo consistindo em glicina, serina, asparagina, treonina e alani- na) ou adotado de proteínas ocorrendo naturalmente. Formação de ponte dissulfeto pode ser obtida, por exemplo, através de expressão recombinante, onde a seqüência de ácidos nucléicos codificando o monômero sgp130Fc contém um ou mais códons cisteína, preferivelmente na região articulada do domínio Fc.
Os dímeros da presente invenção são preferivelmente produzi- dos recombinantemente através de uso de um polinucleotídeo codificando um monômero do dímero e vetores, preferivelmente vetores de expressão contendo os ditos polinucleotídeos. Para a produção dos dímeros da inven- ção, os polinucleotídeos são obtidos de clones existentes, isto é, preferivel- mente codificam o polipeptídeo ocorrendo naturalmente ou uma sua parte (para gp130/IL6ST humana: seqüência GenBank NM_002184 e clones su- portando; para a região constante de lgG1/IGHG1 humana: por exemplo, seqüência GenBank AK057754). Polipeptídeos codificados por qualquer po- linucleotídeo que hibridize para o complemento do DNA ou RNA nativo sob condições altamente rigorosas ou moderadamente rigorosas (para defini- ções, ver Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.) tanto quanto este polipeptídeo mantenha a atividade biológica da seqüência nativa, são úteis para produção de dímeros da presente invenção.
Os vetores recombinantes podem ser construídos de acordo com processos bem-conhecidos por aqueles versados na técnica; ver, por exemplo, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. Uma variedade de sistemas de vetor de ex- pressão / hospedeiro pode ser utilizada para conter e expressar seqüências codificando os dímeros da presente invenção. Estes incluem, mas não são limitados a, microorganismos tais como bactérias transformadas com bacte- riófago recombinante, plasmídeo, ou vetores de expressão de DNA cosmí- deo; levedura transformada com vetores de expressão de levedura; sistemas de células de insetos infectados com vetores de expressão de vírus (por e- xemplo, baculovírus); sistemas de células de planta transformadas com veto- res de expressão de vírus (por exemplo, vírus de mosaico de couve-flor, CaMV; vírus mosaico de tabaco, TMV) ou com vetores de expressão bacte- riana (por exemplo, plasmídeos Ti ou pBR322); ou sistemas de células de animal.
Em sistemas de bactérias, um número de vetores de expressão podem ser selecionados dependendo do uso pretendido para o dímero poli- peptídeo da presente invenção. Vetores apropriados para uso na presente invenção incluem, mas não são limitados ao vetor de expressão pSKK para expressão em bactérias.
Em espécies de levedura tipo selvagem ou modificadas (por e- xemplo, glicoengenheiradas), tais como Saccharomyces cerevisiae, Schizo- saccharomyces pombe ou Pichia pastoris, um número de vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis ou sistemas promotores como fator alfa, álcool oxidase, PGH, tetraciclina glucose etc. podem ser usados; para revisões, ver Grant et al. (1987) Methods Enzymol. 153:516-544; Siam et al. (2004) Methods 33:189-198; Macauley-Patrick et al. (2005) Yeast 22:249- 270, Gellissen et al. (2005) FEMS Yeast Res. 5:1079-1096; Wildt and Gern- gross (2005) Nat. Rev. Microbiol. 3:119-128.
Em casos onde sistemas de expressão de planta da técnica são usados (para revisão, ver, por exemplo, Stoger et al. (2005) Curr. Opin. Bio- technol. 16:167-173; Gomord et al. (2005) Trends Biotechnol. 23:559-565) a expressão de seqüências codificando um dímero (ou seus monômeros) da presente invenção pode ser dirigida através de qualquer um de um número de promotores. Por exemplo, promotores virais tais como os promotores 35S e 19S de CaMV podem ser usados sozinhos ou em combinação com a se- quência-líder ômega de TMV (Takamatsu (1987) EMBO J. 6:307-311). Alter- nativamente, promotores de plantas como a subunidade pequena de RU- BISCO ou promotores de choque térmico podem ser usados (Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie et al. (1984) Science 224:838-843; e Winter et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105). Estes constructos podem ser introduzidos em células de plantas através de transformação de DNA direta ou transfecção mediada por patógeno. Tais técnicas são descri- tas em um número de revisões genericamente disponíveis (ver, por exemplo, Hobbs e Murry em McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.; pp. 191-196).
Um sistema de inseto também pode ser usado para expressar os dímeros (ou os seus monômeros) da presente invenção. Por exemplo, em um tal sistema, vírus Autographa californica nuclear polyhedrosis (AcNPV) é usado como um vetor para expressar genes estranhos em células de Spo- doptera frugiperda ou em larvas Trichoplusia. As seqüências podem ser clo- nadas em uma região não-essencial do vírus, tal co mo o gene poliedrina, e colocado sob controle do promotor poliedrina. Inserção bem-sucedida da seqüência de DNA codificando monômeros sgp130Fc ou suas variantes ou fragmentos tornará o gene poliedrina inativo e produzirá vírus recombinantes carecendo de proteína de revestimento. Os vírus recombinantes então po- dem ser usados para infectarem, por exemplo, células de S. frugiperda ou larvas de Trichoplusia nas quais sgp130Fc da presente invenção pode ser expresso (Engelhard et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sei. 91:3224-3227).
Em células hospedeiras mamíferas, um número de sistemas de expressão baseados, por exemplo, em transfecção baseada em lipídeo ou transdução viral das células, pode ser utilizados. Em casos onde um adeno- vírus é usado como um vetor de expressão, seqüências codificando o(s) po- lipeptídeo(s) da presente invenção podem ser ligadas em um complexo de transcrição / tradução de adenovírus consistindo no promotor tardio e se- quência-líder tripartite. Inserção em uma região E1 ou E3 não-essencial do genoma viral pode ser usada para obter um vírus viável que é capaz de ex- pressar os polipeptídeos da presente invenção em células hospedeiras infec- tadas (Logan, J. e Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. 81:3655-3659). Em adição, aperfeiçoadores de transcrição,como o aperfeiçoador de vírus sarcoma de Rous (RSV), podem ser usados para aumentarem expressão em células hospedeiras mamíferas.
Após a introdução do(s) vetor(es) recombinante(s), as células hospedeiras são crescidas em um meio seletivo, que seleciona o crescimen- to de células contendo vetor. Qualquer número de sistemas de seleção pode ser usado para recuperar linhas de células transformadas. Estes incluem, mas não são limitados a, vírus de herpes simplex timidina cinase (Wigler, M. et al. (1977) Cell 11:223-32) e genes adenina fosforribosil transferase (Lowy, I. et al. (1980) Cell 22:817-23) que podem ser empregados em células tk.sup.- ou aprt. Sup.-, respectivamente. Também, resistência a antimetabóli- to, a herbicida ou a antibiótico, pode ser usada como a base para seleção; por exemplo, dhfr que confere resistência a metotrexato (Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. 77:3567-70); npt, que confere resistência aos aminoglicosídeos neomicina e G-418 (Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14) e ais ou pat, que confere resistência a clorsulfuron e fos- finotricina acetil transferase, respectivamente. Adicionais genes selecioná- veis foram descritos, por exemplo, trpB, que permite que células utilizem in- dol no lugar de triptofano, ou hisD, que permite células utilizarem histinol no lugar de histidina (Hartman, S. C. e R.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85:8047-51). O uso de marcadores visíveis ganhou popularidade com marcadores tais como antocianinas, beta-glucuronidase e seu substrato GUS1 e Iuciferase e seu substrato luciferina, sendo amplamente usados não somente para identificar transformantes, mas também para quantificar a quantidade de expressão de proteína transiente ou estável atribuível a um específico sistema vetor (Rhodes, C.A. et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131).
Purificação dos polipeptídeos recombinantes é realizada através de qualquer um dos processos conhecidos para este propósito, isto é, qual- quer procedimento convencional envolvendo extração, precipitação, croma- tografia, eletroforese, ou similar. Ainda um procedimento de purificação que pode ser usado é cromatografia de afinidade usando, por exemplo, Proteína A, Proteína G ou anticorpos monoclonais, que se ligam a polipeptídeo-alvo e que são produzidos e imobilizados sobre uma matriz-gel contida em uma coluna. Preparações impuras contendo o polipeptídeo recombinante são passadas através da coluna. O polipeptídeo se ligará à coluna através de específica interação com a matriz de gel de afinidade enquanto as impure- zas passarão direto. Após lavagem, o polipeptídeo é eluído do gel através de uma mudança em pH ou resistência iônica e então, se ele for produzido co- mo o monômero, dimerizado e, se desejado, PEGuilado.
Da mesma maneira, a presente invenção também refere-se a um processo de produção de dímero de polipeptídeo da presente invenção, compreendendo cultura de uma célula hospedeira transformada com uma seqüência de DNA codificando um monômero do dito polipeptídeo e recupe- ração de monômero ou dímero de polipeptídeo da dita célula hospedeira ou da cultura.
Os dímeros polipeptídeos da presente invenção são úteis no tra- tamento e/ou prevenção de todas as patologias, nas quais a atividade do complexo agonístico IL-6/slL6R deve ser inibida.
Assim, a presente invenção também refere-se a uma composi- ção farmacêutica contendo uma quantidade efetiva de um dímero de poli- peptídeo da presente invenção, preferivelmente combinado com um veículo farmaceuticamente aceitável. "Farmaceuticamente aceitável" é pretendido abranger qualquer veículo, que não interfira com a eficácia da atividade bio- lógica do ingrediente ativo e que não seja tóxico para o hospedeiro ao qual é administrado. Exemplos de apropriados veículos farmacêuticos são bem- conhecidos na técnica e incluem soluções salinas tamponadas com fosfato, água, emulsões, como emulsões de óleo / água, vários tipos de agentes umectantes, soluções estéreis, etc. Tais veículos podem ser formulados a- través de processos convencionais e podem ser administrados ao sujeito em uma dose eficaz.
Uma "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade do ingredi- ente ativo que é suficiente para afetar o curso e a severidade da doença, conduzindo à redução ou à remissão de tal patologia.
Uma "dose eficaz" útil para tratamento e/ou prevenção destas doenças ou distúrbios pode ser determinada usando processos conhecidos por aqueles versados na técnica (ver, por exemplo, Fingi et al., The Pharma- cological Basis of Therapeutics, Goodman e Gilman, eds. Macmillan Publi- shing Co., New York, pp. 1-46 ((1975)).
Administração das composições pode ser efetuada através de diferentes maneiras, por exemplo, através de administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, tópica ou intradérmica. O regime de dosagem será determinado pelo médico atendente e outros fatores clíni- cos. Como é bem-conhecido nas técnicas de medicina, dosagens para qual- 5 quer paciente dependem de muitos fatores, incluindo o tamanho do paciente, área de superfície de corpo, idade, sexo, o particular composto a ser admi- nistrado, tempo e rota de administração, o tipo de terapia, saúde geral e ou- tros fármacos sendo administrados simultaneamente.
A presente invenção também refere-se ao uso de um dímero de polipeptídeo como definido acima para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou prevenção de uma doença ou distúrbios onde bloqueio do complexo agonístico IL-6/slL-6R tem um efeito benéfico.
Usos médicos preferidos dos dímeros de polipeptídeos da presente invenção são o tratamento / prevenção de ressorção de osso, hipercalcemia, caquexi- a, tumores ou outros tipos de câncer (por exemplo, câncer de cólon, mielo- ma múltiplo, linfoma, leucemia ou mal de Hodgkin), doenças autoimunes (por exemplo, esclerose múltipla ou diabetes tipo 1), doenças inflamatórias ou atópicas (por exemplo, mal de Crohn, colite ulcerativa, artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, asma, psoríase, sarcoidose, Iupus eritematoso ou uveíte), infecções (por exemplo, por bactérias, vírus, fungos ou outros pató- genos), assim como distúrbios endocrinológicos e doenças metabólicas ou catabólicas (por exemplo, diabetes tipo 2, obesidade, hiperglicemia ou hiper- colesterolemia).
Os exemplos abaixo explicam a invenção em mais detalhes.
Exemplo 1
Construção e produção da muteína de sqp130Fc CR5/18 (A) Material
Os componentes de sistema de clonagem Gateway (AccuPrime Pfx DNA Polymerase, o vetor doador pDON221, o vetor de expressão con- trolado por promotor CMV pCDNA-DEST40, BP e LR recombinase para transferência de inserção e células E. coli competentes) foram adquiridos de Invitrogen (Karlsruhe, Germany). O kit de mutagênese de direcionado a sítio QuikChange II foi obtido de Stratagene (Amsterdam, The Netherlands). Inici- adores de mutagênese purificados por PAGE foram de Microsynth (Balgach, Switzerland). Células CH0-K1 foram obtidas de German CoIIeetion of Micro- organisms and Cell Cultures (Braunschweig, Germany). Componentes de meio de cultura foram adquiridos como se segue: meio F12 Ham, baixa IgG FBS e PBS (PAA Laboratories; Cólbe, Germany), FBS (Biochrom; Berlin, Germany), solução de tripsina/EDTA (Invitrogen) e solução G418 (Sigma- Aldrich; Taufkirehen1 Germany). O reagente de transfecção Lipofectamina 2000 foi de Invitrogen. Santa Cruz (Heidelberg, Germany) forneceu Proteína A/G Mais Agarose para imunoprecipitação. Para ambas, imunoprecipitação e detecção primária em Western blots, um anticorpo monoclonal (Fc) camun- dongo anti-humano IgG foi usado (CBL102; Chemicon; Hofheim, Germany). Detecção secundária Western blot foi realizada com um anticorpo Iigado- HRP anticamundongo IgG, ECL-PIus substrato de Western blotting e Hyper- film ECL (todos de GER Healthcare; Munich, Germany). Garrafas rolantes (2,1 L, 2,5X superfície) foram adquiridas de Greiner Bio-One (Frickenhausen, Germany). Filtros de acetato de celulose (0,45 pm) para uma unidade de filtro a vácuo foram adquiridos de Sartorius (Góttingen, Germany). Materiais para cromatografia de exclusão de tamanho e de afinidade (SEC) foram to- dos obtidos de GE Healthcare (Munich, Germany): material MabSeIect (có- digo de produto 17-5199-01) em uma coluna XK16/20, colunas de dessalini- zação PD-10 e uma coluna HiLoad 26/60 Superdex 200 pg para SEC. Uni- dades de concentração de membrana Amicon Ultra-15 50kDa UItraceI-PL foram adquiridas de Millipore (Eschborn, Germany). Solução de bis- acrilamida fácil de fazer (19:1, 30%) para PAGE foi fornecida por Bio-Rad (Munich, Germany).
(B) Construção de CR5/18
Um DAc para sgp130Fc de inteiro comprimento compreendendo o domínio extracelular completo de gp130 e Fc IgGI humano tipo selvagem (fontes: para gp130/IL6ST humana: seqüência GenBank NM_002184 e clo- nes suportando; para a região constante de IgGI/IGHG1 humana: por e- xemplo, seqüência GenBank AK057754) foi otimizada - códon para expres- são em células CHO-K1 e subclonada em pDONR221 usando iniciadores Gateway, AccuPrime Pfx DNA Polimerase e BP recombinase em um proce- dimento de clonagem Gateway. A inserção subclonada foi completamente verificada - seqüência usando iniciadores de sequenciamento reverso e pa- ra frente empilhados cada 250-300pb. Em uma mutagênese direcionada a sítio com o kit QuikChange II, a região articulada inferior de IgGI-Fc (amino- ácidos 234, 235, e 237 de acordo com numeração EU) sofreu mutação da seqüência tipo selvagem "LLGG" para "AEGA". Clones mutados foram verifi- cados através de completo sequenciamento como descrito acima. Subse- quentemente, a inserção foi transferida para o vetor de expressão pcDNA- DEST40 por recombinação LR Gateway. Na medida em que a inserção codi- fica dois códons de interrupção após a parte Fc, os marcadores codificados em pcDNA-DEST40 (epítopos V5 e 6xHis) não estão presentes em CR5/18. Clones positivos foram identificados por digestão de restrição A1wNI e se- quência novamente verificada.
(C) Cultura e transfecção de célula
Células CHO-K1 foram crescidas em meio F12 Ham suplemen- tado com FBS 10% a 37°C e 5% CO2 em uma atmosfera saturada com á- gua. Culturas de manutenção foram separadas a cada 3-4 dias e usadas somente até 20 passagens. Células foram transfectadas com o construto de expressão pcDNA-DEST40_CR5/18 usando Lipofectamina 2000 e condi- ções-padrão para CHO-K1 fornecida por Invitrogen. Para um primeiro teste de expressão transiente, células CHO-K1 foram transfectadas em placas de 6 cavidades, e ambos, células e sobrenadantes, foram colhidos 24 horas após transfecção. CR5/18 foi imunoprecipitado dos sobrenadantes usando Proteína A/G Mais Agarose e o anticorpo (Fe) IgG anti-humano de acordo com as intruções do fabricante. Proteína de célula integral foi extraída e Western blots com anticorpo (Fe) IgG anti-humano foram realizados com os lisados de célula e imunoprecipitados como descrito em Waetzig et al., J. Immunol. 168: 5342 (2002).
(D) Produção de CR5/18 em células CHO-K1
Após expressão transiente bem-sucedida, células CHO-K1 fo- ram transfectadas e clones positivos foram selecionados usando 400 pg/mL G418 em placas de 10cm. Para determinar qualidade e propriedades de produto, uma reunião de CHO-K1 policlonais pré-selecionadas foi transferida para garrafas rolantes e cultivadas com FBS IgG baixo. Sobrenadantes das células confluentes foram colhidos 2-3 vezes por semana, centrifugados du- as vezes em 3500xg e 4°C por 15 minutos para remover os fragmentos de células e tanto processados imediatamente como congelados a -80°C. Em paralelo, clones de células estáveis foram selecionados da reunião pré- selecionada usando um processo de diluição limitada e caracterizados por análise de expressão Western blot como descrito acima. O clone com a ex- pressão mais alta e mais estável foi transferido para garrafas rolantes e usa- do para produção permanente.
(E) Purificação através de cromatoqrafia de exclusão de tamanho e afinidade Sobrenadantes contendo CR5/18 de culturas de garrafas rolan- tes foram purificados a 4°C usando uma bomba peristáltica P-1 e um AKTA Purifier 100 System (ambos de GE Healthcare; Munich1 Germany). O proto- colo foi baseado nas recomendações do fabricante para a purificação de anticorpos monoclonais. Após centrifugação, o pH do sobrenadante recente ou descongelado (sobre gelo) foi ajustado para 6,7-7,0. Após dois ciclos de filtração a vácuo (0,45 μm) o sobrenadante foi desgaseificado e - se neces- sário - o pH foi novamente ajustado para um valor de 6,7-7,0. Subseqüen- temente, a coluna de cromatografia de afinidade equilibrada com PBS (6- 25mL MabSelect em uma coluna XK16/20) foi carregada com 2-4 L de so- brenadante em uma taxa de fluxo de 3-10 mL/minuto usando a bomba P-1.
Após lavagem com PBS, a coluna foi transferida para o purificador AKTA e novamente lavada com PBS até a A280 ter estabilizado após remoção quanti- tativa de proteína não-ligada. Para a eluição, o sistema AKTA foi equipado com dois tampões de citrato de sódio 50 mM em pH 3,25 e 5,5, respectiva- mente, que foram misturados para produção de desejadas condições de pH. Uma etapa de lavagem em pH 5,1 foi seguida por eluição com pH 3,7. Fra- ções de 10mL foram coletadas em tubos de 15mL contendo 2mL de Tris-HCI 1M (pH 11). A frações de pico foram reunidas, e o pH foi medido e ajustado para 7,5, se necessário. Concentração de proteínas reunidas foi medida por A28o e a reunião foi cuidadosamente concentrada para um máximo de 1,5 mg/mL usando unidade de concentração de membrana Amicon Ultra-15 50 kDa Ultracel-PL. Colunas de dessalinização PD-10 equilibradas com PBS foram usadas para substituir o tampão citrato com PBS, seguido por uma outra medição de concentração de proteína em 280 nm.
Para cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), uma con- centração máxima de proteína de 1,2 mg/mL em PBS foi recomendável. SEC foi realizada com o sistema AKTA em uma coluna HiLOad 26/60 Su- perdex 200 pg equilibrada com PBS em uma taxa de fluxo de 0,8 mL/minuto. Em contraste, a sgp130Fc tipo selvagem, CR5/18 eluiu em um pico simples após um baixo pico de agregados de maior peso molecular (Figura 2). Nas primeiras corridas, amostras de todas as frações foram obtidas para análises PAGE. Frações de picos foram reunidas, suas concentrações de proteínas foram medidas e fixadas para 400-500 pg/mL em PBS, e alíquotas de uso único foram congeladas a -80°C para estocagem de longo termo. Frações e amostras reunidas foram analisadas por PAGE nativa (7,5%) e subsequente manchamento com prata ou Coomassie.
Como mostrado na Figura 2, a quantidade de subprodutos (a- gregados) de CR5/18 é significantemente reduzida comparada ao composto parente sgp130Fc que foi purificado em um experimento paralelo. Além dis- so, a eluição do desejado produto (dímero CR5/18) é claramente separável das frações de impureza (agregados), o que não é o caso com sgp130Fc tipo selvagem. Assim, ambos, rendimento (devido a uma maior proporção do desejado produto) e qualidade de preparações de CR5/18 são melhores que aqueles de sgp130Fc convencional, conduzindo a menores custos para a produção industrial. Estes resultados indicam um claro aperfeiçoamento de CR5/18 sobre a molécula sgp130Fc parente.
Exemplo 2
Bioatividade de CR5/18 em um ensaio de proliferação padronizada de célu- las
(A) Material A linha de célula precursora de célula B estavelmente transfec- tada BAF3/gp130 e o Hyper-IL-6 citocina programadora foram usados. Com- ponentes de meio de cultura foram adquiridos como se segue: DMEM e PBS (PAA Laboratories; Cõlbe, Germany), FBS (Biochrom; Berlin, Germany) e solução de tripsina / EDTA (Invitrogen; Karlsruhe, Germany). lnterleucina-6 (IL-6) e receptor de interleucina-6 solúvel (slL-6R) foram adquiridos de Bio- Source (Solingen, Germany) e R&D Systems (Wiesbaden, Germany), res- pectivamente. O ensaio de proliferação de células não-radioativo aquoso 96 de título de célula (MTS) foi obtido de Prômega (Mannheim, Germany). (B) Bloqueio de proliferação de células BAF3/qp130 induzido por IL-6/slL-6R por sqp130Fc ou CR5/18
Células BAF3/gp130 dependem da presença do complexo de IL- 6/slL-6R no meio de cultura para proliferação e viabilidade. Para manuten- ção, células BAF3/gp130 foram cultivadas em uma densidade de menos que 5x10^5 células/mL em DMEM com FBS 10% e 10 ng/mL de Hyper-IL-6 (uma citocina desenhista consistindo em IL-6 e slL-6R ligadas covalentemente; Fischer et al. 1997, Nat. Biotechnol. 15: 142-145). O Hyper-IL-6 10 ng/mL pode ser substituído por 100 ng/mL de IL-6 e 50 ng/mL de slL-6R. Células foram passadas duas vezes por semana. Para ensaios, células foram Iava- das duas vezes em meio sem Hyper-IL-6 (ou IL-6/slL-6R) e então foram se- meadas em 5000 células / cavidade em placas de 96 cavidades. CR5/18 ou o composto parente sgp130Fc foram adicionados em várias concentrações variando de 20 pg/mL a 78 ng/mL (séries de diluições 1:4; Figura 3). Subse- qüentemente, células foram incubadas por 3 dias na presença de 100 ng/mL de IL-6 e 50 ng/mL de slL-6R. Controles incluíram células não-estimuladas sem e com a concentração máxima de CR5/18 ou sgp130Fc assim como células incubadas somente com os estimulantes IL-6 e slL-6R (Figura 3).
(C) Resultados
A atividade biológica de CR5/18 ou sgp130Fc tipo selvagem na cultura de células foi medida através de redução do número de células BAF3/gp130 viáveis (como determinado por conversão de substrato MTS) após 3 dias. CR5/18 é mais biologicamente ativo que sgp130Fc tipo selva- gem, atingindo sua IC50 em uma concentração de aproximadamente 400 ng/mL, em que sgp130Fc (IC50 = 800 ng/mL) ainda não mostra efeito signifi- cante (Figura 3). Isto indica que CR5/18 pode ser usado em cerca de meta- de de concentração terapêutica do composto tipo selvagem.
Listagem de seqüência <110> Conaris research institute AG
<120> DÍMEROS SGP130FC APERFEIÇOADOS
<130> C 1087
<140> PCT/EP2007/005812
<141> 2007-06-29
<150> EP06013668
<151> 2006-06-30
<160> 9
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ala Glu Gly Ala 1
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Leu Leu Gly Gly 1
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly 1 5 10 15
Ala Pro Ser Val 20
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 4
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15
Gly Pro Ser Val 20
<210> 5 <211> 20 <212> PRT <213 > Homo sapxens <220> <221> MUTAGÊNIO <222> (14) <223 > Xaa é Ala ou Phe <220> <221> MUTAGÊNIO <222 > (15) <223 > Xaa é Asp ou Glu <400> 5
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Xaa Xaa Gly 1 5 10 15
Ala Pro Ser Val 20
<210> 6 <211> 20 <212> PRT
<213 > Seqüência artificial <220>
<223> mutante 1; região articulada IgGI
<400> 6
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly 1 5 10 15
Ala Pro Ser Val 20
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213 > Seqüência artificial
<220> <223> mutante 2; região articulada IgGI
<400>7
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Asp Gly 1 5 10 15
Ala Pro Ser Val 20
<210> 8
<211> 20
<212> PRT
<213 > Seqüência artificial
<220>
<223 > mutante 3; região articulada IgGI <400> 8
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly 1 5 10 15
Ala Pro Ser Val 20
<210> 9 <211> 20 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223 > mutante 4; região articulada IgGI <400> 9
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Asp Gly 1 5 10 15
Ala Pro Ser Val 20
Claims (18)
1. Dímero de polipeptídeo capaz de inibir a atividade do comple- xo agonístico IL-6/slL-6R e compreendendo dois monômeros, em que cada um dos ditos monômeros compreende uma parte extracelular de uma molé- cuia gp130 ou sua variante ou fragmento fundido a um domínio Fc de uma proteína IgGI e em que pelo menos o resíduo de aminoácido Leu235 da regi- ão articulada do domínio Fc está substituído por pelo menos um resíduo a- minoácido hidrofílico.
2. Dímero de polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, em que o resíduo de aminoácido hidrofílico é Glu ou Asp.
3. Dímero de polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que além disso, o resíduo de aminoácido Leu234 da região articulada é substituído por Phe ou Ala.
4. Dímero de polipeptídeo de acordo com a reivindicação 3, em que os resíduos de aminoácidos Leu234 e/ou Gly237 da região articulada são substituídos pelo resíduo de aminoácido Ala.
5. Dímero de polipeptídeo de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 4, em que a região articulada compreende o motivo seqüên- cia de aminoácidos Ala234-Glu235-Gly236-Ala237 ao invés de Leu234-Leu235- Gly236-Gly23?.
6. Dímero de polipeptídeo de acordo com a reivindicação 5, em que a região articulada compreende a seqüência de aminoácidos Asp22r Lys222-Th r223-H is224-Th r225-Cys226- P Γ0227- P ro228-CyS229- P ro23o-AIa23I - Pro232- Glu233-Ala234-Glu235-Gly236-Ala237-Pro238-Ser239-Val240·
7. Dímero de polipeptídeo de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 6, em que a molécula gp130 solúvel ou sua variante ou frag- mento é diretamente fundido à região articulada do domínio Fc da proteína IgGI ou através de um Iigante de polipeptídeo flexível.
8. Dímero de polipeptídeo de acordo com a reivindicação 7, em que o Iigante é um Iigante compreendendo 2 a 50 resíduos de aminoácidos selecionados independentemente do grupo consistindo em glicina, serina, asparagina, treonina e alanina.
9. Dímero de polipeptídeo de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 8, em que um ou mais sítios de N-glicosilação são inseridos entre a molécula gp130 solúvel ou sua variante ou fragmento e o domínio Fc.
10. Dímero de polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que os monômeros são ligados uns aos outros a- través de uma ligação covalente simples, um Iigante peptídeo flexível ou uma ou mais pontes dissulfeto.
11. Dímero de polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o pelo menos um monômero do dito dímero é PEGuilado.
12. Polinucleotídeo codificando um monômero do dímero de po- lipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
13. Vetor de expressão contendo um polinucleotídeo como defi- nido na reivindicação 12.
14. Célula hospedeira contendo um vetor de expressão como definido na reivindicação 13.
15. Processo de produção de dímero de polipeptídeo como defi- nido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, compreendendo cultura de uma célula hospedeira como definida na reivindicação 14, e recuperação de monômero ou dímero da dita célula hospedeira ou cultura.
16. Composição farmacêutica contendo um dímero de polipeptí- deo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
17. Uso de um dímero de polipeptídeo como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 11, para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou para a prevenção de uma doença ou de um distúrbio, em que o bloqueio do complexo agonista IL-6/slL-6R tem um efeito benéfico.
18. Uso de acordo com a reivindicação 17, em que a dita doença é ressorção de osso, hipercalcemia, caquexia, um tumor ou outro tipo de câncer, uma doença autoimune, uma doença inflamatória ou atópica, uma infecção, um distúrbio endocrinológico ou uma doença metabólica ou catabólica.
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