KR20030097876A - 화학적으로 개질된 인슐린의 폐 투여 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인슐린의 활성, 친수성, 중합체-개질 유도체를 제공한다. 하나의 측면에 있어서, 본 발명의 인슐린 유도체는 폐에 전달하기 적합하고, 천연 인슐린에 비해 유의미하게 개선된 약동학 및/또는 약역학 특성을 나타낸다.

Description

화학적으로 개질된 인슐린의 폐 투여 {PULMONARY ADMINISTRATION OF CHEMICALLY MODIFIED INSULIN}
인슐린은 정상 (비당뇨) 개인의 췌장 β-세포에서 생산되는 폴리펩티드 호르몬이다. 인간 인슐린은 분자량 약 5800 달톤의 51 개 아미노산 폴리펩티드 호르몬이다. 인슐린 분자는 1 개의 서브유닛내 및 2 개의 서브유닛간 디술피드 결합을 포함하는 두 개의 펩티드 사슬 (A 및 B 사슬) 로 이루어진다. A 사슬은 21 개 아미노산으로 이루어지는 반면, B 사슬은 30 개 아미노산으로 이루어진다. 인슐린의 2 개 사슬은 A 및 B 사슬 둘 다에 여러 α-나선형 영역을 갖는 고정렬 구조를 형성한다. 흥미롭게도, 인슐린의 단리된 사슬은 비활성이다. 용액 중에서, 인슐린은 단량체 또는 이량체 또는 6 량체로서 존재할 수 있다. 인슐린은 피하 치료를 위해 사용되는 고농축 제제 중에서는 6 량체이지만, 체액 중에 희석되면 단량체가 된다. 인슐린은 혈중 글루코오스 수준의 감소에 의한 탄수화물 대사의 조절을 위해 필요하며; 인슐린의 전신성 결핍은 당뇨병을 일으킨다.당뇨병 환자의 생존은 허용가능한 혈중 글루코오스 수준을 유지하기 위한 빈번하고 장기적인 인슐린 투여에 의존한다.
현재의 인슐린 제형물은 당뇨병 치료에 있어 심각한 의학적 합병증을 일으킬 수 있는 결함을 보유하고 있다. 예를 들어, 당뇨병 환자들에게 가장 널리 사용되는 표준 아연 인슐린 제제는 비활성 6 량체 인슐린의 마이크로결정 현탁액으로서 존재한다. 마이크로결정의 용해에 이어지는 6 량체의 활성 단량체형으로의 해리는 혈류로의 인슐린의 흡수를 지연시키고 개인별로 편차가 나게 할 수 있다 [F. Liu 등, Bioconjugate Chem., 8, 664-672 (1997); T. Uchio 등, Adv. Drug Del. Rev., 35, 289-306 (1999); K. Hinds 등, Bioconjugate Chem., 11, 195-201 (2000)]. 인슐린의 제형물은 또한 인슐린이 미세섬유 (fibril) 및 불용성 침전물을 형성하는 경향으로 인한 물리적 불안정성을 겪는다. 침전은 특히 인슐린 펌프에서 사용하기 위한 제형물에 있어 문제가 된다. 제형화된 인슐린은 또한 화학적 분해, 예컨대 비효소적 탈아미드화 및 고분자량 변형 산물, 예컨대 공유 인슐린 이량체의 형성을 겪기 쉽다 [Brange, J. 등, Pharm. Res., 9, 715-726 (1992); Brange, J. 등, Pharm. Res., 9, 727-734 (1992)]. 인슐린에 대한 면역학적 반응의 발생이 인슐린의 상기 공유 응집물의 존재로부터 발생할 수 있다는 유의미한 증거가 있다 [Robbins, D. C. 등, Diabetes, 36, 838-841 (1987)]. 또한, 고정제 인간 인슐린이라 할지라도, 약간은 면역원성을 띈다 [Kim, ibid.].
상기 주지된 제형물의 불안정성 문제 이외에도, 투여 관점에서 현재의 인슐린 치료와 관련된 수많은 단점이 또한 존재한다. 인슐린은 가장 일반적으로는피하 주사에 의해, 전형적으로 복부 또는 상부 대퇴 내로 투여된다. 인슐린은 또한 정맥내 또는 근육내 투여될 수 있다. 허용가능한 혈중 글루코오스 수준을 유지하기 위해서는, 종종 1 일 1 회 또는 2 회 이상 인슐린을 주사하는 것이 필요하며, 필요한 경우 인슐린 보충 주사가 투여된다. 당뇨병의 공격적 치료는 보다 빈번한 주사를 필요로할 수 있으며, 가정용 진단 키트를 이용하여 환자의 혈중 글루코오스 수준이 보다 자세히 모니터링된다. 주사에 의한 인슐린 투여는 여러 관점에서 바람직하지 못하다. 첫번째로, 여러 환자들은 허용가능한 혈중 글루코오스 수준을 유지하기 위해 필요한 만큼 빈번하게 스스로에게 주사하는 것이 어렵고 힘들다고 여긴다. 실제로, 여러 제 2 형 환자들은 바늘 공포로 인해 수년간 인슐린을 회피하고 있다. 이러한 마지못함은, 가장 심각한 경우 생명을 위협할 수 있는 불순응성으로 이어질 수 있다. 또한, 피하 주사로부터 인슐린의 전신 흡수는 비교적 느려서, 속효성 인슐린 제형물이 사용되는 경우라도 종종 45 내지 90 분이 소요된다. 따라서, 자가 주사의 필요성을 피할 수 있고, 인슐린의 신속한 전신 이용성을 제공할 수 있는 대안적인 인슐린 제형물 및 투여 경로가 오랫동안 추구되어 왔다.
수많은 비주사 제형물 유형, 예컨대 경구 및 비강 유형이 연구되었으나, 주로 매우 낮고 가변적인 생체이용률 [Hilsted, J. 등, Diabetologia 38, 680-684, (1995)] 로 인해, 이러한 노력의 결과 인슐린에 대해 시판되는 경구 또는 비강 기재 전달 시스템은 개발되지 않고 있다 [Patton 등, Adv. Drug Delivery Reviews, 1, 35 (2-3), 235-247 (1999)]. 흡수 증강제로 생체이용률이 증가될 수는 있지만, 상기 제제는 점막에 손상을 입힐 수 있다.
그러나, 상기 주지된 다수 문제점을 극복하는데 매우 전망이 밝은 것으로 나타나는 흡입가능한 인슐린 제형물이 개발되고 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,997,848 호 (Patton 등, Inhale Therapeutic Systems, Inc.) 에는 (i) 실온에서 화학적으로 및 물리적으로 안정하며, (ii) 흡입되는 경우, 폐포 영역의 상피 세포를 통해 혈액 순환계 내로 신속히 흡수되는 건조 분말 인슐린 제형물이 기재되어 있다. 거기에 기재된 속효성 인슐린 제형물 및 방법은 번거로운 자가 주사의 필요성을 피할 수 있고, 피하 주사와 비교하는 경우, 3 개월 간의 인간 유효성 연구에서 제 I 형 및 제 II 형 인슐린 의존성 당뇨병에서 동등한 글루코오스 조절을 제공함을 나타내었다 [Patton 등, Adv. Drug Delivery Reviews, 1, 35 (2-3), 235-247 (1999)]. Patton 등이 기재한 건조 분말 인슐린 제형물로 제형물 불안정성 및 환자 불순응의 문제점이 극복되지만, 여전히 글루코오스 수준의 효과적인 조절을 위해서는 빈번한 (예컨대 식사 때마다) 인슐린 흡입을 필요로 한다. 또한, 속효성 흡입가능한 인슐린을 기준으로 하는 상기 유형의 전형적 인슐린 투여 요법은 여전히 제 I 형 및 일부 제 II 형 당뇨병 환자들에 대해 취침 시 지속성 인슐린의 단회 주사를 필요로 한다. 따라서, 덜 빈번한 투여를 필요로 하는 인슐린의 활성, 가용성, 안정한 형태, 즉 바람직하게는 흡입에 의해 투여가능한 지속성 인슐린 제형물이 여전히 요구되고 있다.
지속성 인슐린 제형물은 이상적으로는 매우 느린 발현 및 지연되고 비교적 평탄한 작용 피크를 갖는 것을 특징으로 한다. 현재의 지속성 주사가능 인슐린제형물, 예컨대 울트라렌트 (ultralente, 연장된 인슐린 아연 현탁액) 및 프로타민 (protamine) 아연 인슐린 현탁액은 매우 만족스럽지 못하다. 상기 제형물은 낮은 인슐린 기저 농도를 제공하기보다는 피크를 나타내며, 예측이 불가능하고, 전형적으로 약 1 일 이하의 작용 기간을 나타낸다. 울트라렌트 인슐린의 긴 반감기는 최적 투여 범위를 결정하기 어렵게 하고, 프로타민 아연 인슐린은 그 예측불가하고 지연되는 작용 기간으로 인해 거의 사용되지 않는다 [Goodman & Gilman, "The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9 판, Hardman and Limbird 편저, 1996, p. 1500]. 성공적이지 못한 것으로 나타난 다른 지속성 주사가능 제형물에는 알부민 결합 인슐린 및 코발트-인슐린 6 량체 제형물이 포함된다 [Hoffman, A., Ziv E., Clin. Pharmacokinet, 33 (4): 285-301 (1997)].
또한 여러 지속성 폐 인슐린 제형물이 연구되어 왔다. 상기에는 인슐린에 비해 매우 과량의 지질을 함유하는 리포좀 [Liu. F-Y 등, Pharm. Res. 10, 228-232, (1993)], 다공성 폴리(락트산-코-글리콜산) (PLGA) 인슐린 입자 [Edwards, D. A. 등, Science 276 (5320), 1868-1871 (1997)], 분무화 PLGA 나노스피어 [Kawashima, Y. 등, J. Controlled Release, 62 (1-2): 279-287 (1999)] 및 인지질/프로타민 인슐린 제형물 [Vanbever, R. 등, Proc. Control Rel. Bioact. Mater. 25, 261-262 (1998)] 이 포함된다. 불행히도, 모든 상기 제형물은 래트에 투여되는 경우 낮은 생체이용률로 인해 또는 불충분한 제형화로 인해 만족스럽지 못한 것으로 나타났다. 따라서, 생활성이고, 물리적으로 및 화학적으로 안정하며, 수용성이고, 바람직하게는 단량체인, 최적화된 지속성 인슐린 제형물에 대한 오랜 요구가 지속되고 있다. 이상적으로, 상기 제형물은 바람직하게는 폐 투여에 적합할 것이다.
본 발명은 흡입에 의해 폐로 전달하기 위한 생활성 (bioactive), 친수성, 중합체-개질 인슐린 유도체에 관한 것이다. 상기 유도체의 제조 및 투여 방법도 또한 제공된다.
본 발명의 개요
하나의 측면에 있어서, 본 발명은 심폐를 통한 전신 순환계로의 투여를 위한 인슐린 조성물을 기준으로 한다. 구체적으로, 본 발명의 조성물에는 하나 이상의 비천연 생성 친수성 중합체 분자에 공유적으로 커플링된 인슐린 콘쥬게이트가 포함된다. 바람직한 구현예에 있어서, 인슐린에 공유적으로 커플링된 비천연 생성, 친수성 중합체는 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 이지만, 본원에 나타낸 모든 구현예는 다른 비천연 생성 친수성 중합체에 동등하게 적용될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 인슐린-중합체 콘쥬게이트는 특히 폐에 투여되는 경우, 천연 인슐린에 비해 개선된 약동학 및 약역학 특성을 나타낼 것이다. 하나의 구현예에 있어서, 본원에서 제공되는 PEG-인슐린 콘쥬게이트는 폐 및 심폐에 투여되는 경우, 우수한 절대 생체이용률을 나타낸다. 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 PEG-인슐린 콘쥬게이트는 천연 인슐린을 초과하는 절대 폐 생체이용률을 특징으로 한다. 바람직하게는, 본 발명의 PEG-인슐린 콘쥬게이트는 천연 인슐린에서의 1.5 ~ 2.0 배 이상의 절대 폐 생체이용률을 갖는 것을 특징으로 한다. 보다 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 PEG-인슐린 콘쥬게이트는 약 15% 초과, 더욱 바람직하게는 약 20% 초과, 가장 바람직하게는 약 30% 초과의 절대 폐생체이용률을 특징으로 한다.
또다른 구현예에 있어서, 폐로 투여되는 경우, 본 발명의 PEG-인슐린 콘쥬게이트는 천연 인슐린의 1.5 배 이상, 보다 바람직하게는 2 또는 3 배 이상, 더욱 바람직하게는 천연 인슐린의 5 배 이상인 Tmax (최대 농도에 도달하는데 걸리는 시간) 를 나타낸다.
본 발명의 콘쥬게이트에 사용하기 위한 PEG 는 여러 상이한 특징을 보유할 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 PEG-인슐린 콘쥬게이트의 폴리에틸렌 글리콜 부분은 불활성 또는 비반응성 말단기, 예컨대 알콕시기, 보다 구체적으로 메톡시기로 말단이 캡핑된다.
대안적인 구현예에 있어서, 콘쥬게이트의 폴리에틸렌 글리콜 부분은 선형 폴리에틸렌 글리콜 및 다중팔 또는 분지형 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는, 인슐린에 부착하기 위해 특히 매우 적당한 구조를 보유할 것이다. 또다른 구현예에 있어서, PEG-인슐린 콘쥬게이트는 2-활성화된 폴리에틸렌 글리콜로 상호연결된 2 개의 단관능성 유도체화 인슐린 분자 (인슐린-PEG-인슐린) 를 포함할 수 있다. 이와는 달리, 상기 "아령" 구조 내의 인슐린 분자는 추가적 PEG 로 더욱 개질될 수 있다.
또다른 구현예에 있어서, 본 발명의 PEG-인슐린 콘쥬게이트는 중합체 사슬의 하나의 말단에 분지화 잔기를 갖고, 인슐린에 공유 부착하기 위해 분지화 잔기에 연결된 2 개 (또는 2 의 배수개) 의 자유 반응기를 갖는 포크형 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 본 발명의 상기 구현예에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜의 분지형구조는 2 개 이상의 인슐린 분자로의 중합체 사슬의 부착을 허용한다.
본 발명의 인슐린 콘쥬게이트의 폴리에틸렌 글리콜 부분은 임의로 하나 이상의 분해가능한 연결을 포함할 수 있다.
전형적으로, 인슐린은 PEG 의 말단에 위치한 연결 잔기를 통해 PEG 에 공유적으로 커플링된다. 본 발명에 사용하기 위해 바람직한 연결 잔기에는 반응성 인슐린 아미노기와 커플링하기에 적합한 것들, 예컨대 N-히드록시숙신이미드 활성 에스테르, 활성 카르보네이트, 알데히드 및 아세탈이 포함된다.
또다른 구현예에 있어서, 본 발명의 콘쥬게이트에서 인슐린에 공유적으로 커플링된 PEG 는 (OCH2CH2) 의 약 2 내지 약 300 개 서브유닛, 바람직하게는 약 4 내지 200 개 서브유닛, 보다 바람직하게는 약 10 내지 100 개 서브유닛을 포함할 것이다.
대안적인 구현예에 있어서, 인슐린에 공유적으로 커플링된 PEG 는 약 200 내지 약 10,000 달톤의 겉보기 평균 분자량을 보유할 것이다. 바람직한 구현예에 있어서, PEG 는 약 200 내지 약 5000 달톤의 겉보기 평균 분자량을 보유할 것이다. 보다 바람직한 구현예에 있어서, PEG 는 약 200 내지 약 2000 달톤 또는 약 200 내지 약 1000 달톤의 겉보기 평균 분자량을 보유할 것이다.
특정 구현예에 있어서, 콘쥬게이트의 인슐린 부분은 천연 인간 인슐린을 포함한다.
또다른 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물의 콘쥬게이트는 약 90% 초과의 순도를 보유한다 (즉, 90 중량% 이상의 조성물의 콘쥬게이트 부분은 하나 이상의PEG-인슐린을 포함한다). 다시 말하면, 본 발명의 조성물은 고순도의 콘쥬게이션된 인슐린 성분을 특징으로 할 수 있다, 즉 조성물에는 검출가능한 양의 자유 폴리에틸렌 글리콜종 및 기타 PEG-관련 불순물이 없다.
하나의 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 콘쥬게이트를 포함하며, 여기서 인슐린은 하나 이상의 아미노 부위에서 PEG 에 공유적으로 커플링된다. 본 발명의 조성물 내에 포함된 인슐린은 단일치환될 수 있다 (즉, 거기에 공유적으로 커플링된 단지 하나의 PEG 를 갖는다). 본 발명에 따른 특정한 단일치환 PEG-인슐린 콘쥬게이트는 PheB1, GlyA1 및 LysB29 로 이루어진 군으로부터 선택되는 인슐린 분자 상의 위치에 공유적으로 부착된 폴리에틸렌 글리콜 잔기를 보유한다.
바람직한 구현예에 있어서, PEG 잔기는 인슐린의 PheB1 부위에 공유적으로 부착된다. 하나의 구현예에 있어서, 인슐린 상의 약 75% 이상의 B-1Phe 부위가 PEG 에 공유적으로 커플링된다. 또다른 구현예에 있어서, 인슐린 상의 약 90% 이상의 B-1Phe 부위가 PEG 에 공유적으로 커플링된다.
본 발명의 조성물은 또한 상기 기재된 임의의 하나 이상의 특징을 갖는 단일콘쥬게이트된 및 2-콘쥬게이트된 PEG 인슐린의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 3-콘쥬게이트된 PEG 인슐린을 더 포함할 수 있다.
대안적인 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 PEG 인슐린 콘쥬게이트는 비-PEG 화 또는 천연 인슐린에 비해 감소된 단백분해 속도를 특징으로 한다.
본 발명에 따른 조성물은 또한 PEG-인슐린 콘쥬게이트, 및 비화학적으로 개질된 또는 천연 인슐린의 혼합물을 포함할 수 있다.
에어로졸 형태인 상기 기재된 바와 같은 조성물도 또한 포함된다.
본 발명의 조성물은 액체 또는 건조 형태로 용해되거나 현탁될 수 있고, 추가적으로 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다.
또한, 심폐로의 흡입에 의한 투여에 적합한 생활성 폴리에틸렌 글리콜-인슐린 콘쥬게이트가 본원에 제공된다.
또다른 측면에 있어서, 본 발명은 에어로졸 형태인 상기 기재된 바와 같은 PEG-인슐린 조성물의 흡입에 의한 투여로, PEG-인슐린 콘쥬게이트를 필요로 하는 포유류 대상체에게 PEG-인슐린 콘쥬게이트를 전달하기 위한 방법을 제공한다.
또다른 측면에 있어서, 본 발명은 또한 폐로의 투여를 위한, 실질적으로 비면역원성인 인슐린 조성물을 제공하기 위한 방법을 제공한다. 본 방법에는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 비천연 생성 친수성 중합체 콘쥬게이트 분자에 인슐린을 공유적으로 커플링시키고, 조성물을 흡입에 의해 대상체의 폐로 투여하여 그 결과 인슐린이 폐를 통과하여 혈액 순환계 내로 도입되는 단계가 포함된다.
또다른 측면에 있어서, 인간 대상체의 폐로의 투여를 위한 지효성 인슐린 조성물을 제공하기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법에는 하나 이상의 비천연 생성 친수성 중합체 분자에 인슐린을 공유적으로 커플링시켜 인슐린-친수성 중합체 콘쥬게이트를 포함하는 조성물을 제공하고, 조성물을 흡입에 의해 대상체의 폐로 투여하는 것이 포함된다. 투여 단계 시에, 인슐린은 폐를 통과하여 혈액 순환계 내로 도입되며, 상승된 혈중 인슐린 수준은 투여 후 8 시간 이상 지속된다.
에어로졸화되어 흡입에 의해 투여되는 경우, 본 발명의 PEG-인슐린 콘쥬게이트는 당뇨병 (DM) 치료에 유용하다.
본 발명의 상기 및 기타 목적 및 특징은 하기 상세한 설명의 독서로 보다 더 자명해질 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1 은 실시예 6 에 자세히 기재된 바와 같이, 예시적인 PEG-인슐린 콘쥬게이트 ("750-2 PEG 인슐린") 대 비개질된 인슐린 대조군의 효소적 소화 속도의 도면이다.
도 2 는 예시적인 PEG 화 (5K PEG 인슐린) 대 비-PEG 화 인슐린 조성물의 정맥내 투여 후 평균 혈청 인슐린 농도의 도면이다 (자세한 내용은 실시예 7 에 제공된다);
도 3 은 예시적인 PEG 화 (5K PEG 인슐린) 대 비-PEG 화 인슐린 조성물의 정맥내 투여 후 혈중 글루코오스 농도의 도면이다 (자세한 내용은 실시예 7 에 제공된다);
도 4 는 웅성 래트에서 PEG 화 (150 ㎍/동물, 5K PEG 인슐린) 대 비-PEG 화 인간 인슐린 (40 ㎍/동물) 의 기관내 (intratracheal) 점적 후 평균 혈청 인슐린 농도의 도면이다 (실시예 8);
도 5 는 웅성 래트에서 PEG 화 (150 ㎍/동물, 5K PEG 인슐린) 대 비-PEG 화 인간 인슐린 (40 ㎍/동물) 의 기관내 점적 후 평균 혈중 글루코오스 농도의 도면이다 (실시예 8);
도 6 은 웅성 래트에서 PEG 화 (750-1 PEG 인슐린) 대 비-PEG 화 인간 인슐린의 기관내 점적 후 평균 혈청 인슐린 농도의 도면이다 (실시예 9);
도 7 은 웅성 래트에서 PEG 화 (750-1 PEG 인슐린) 대 비-PEG 화 인간 인슐린의 기관내 점적 후 평균 혈중 글루코오스 농도의 도면이다 (실시예 9);
도 8 은 웅성 래트에서 PEG 화 (750-1 PEG 인슐린, 80 및 160 ㎍/동물) 대 비-PEG 화 인간 인슐린 (80 ㎍/동물) 의 기관내 점적 후 평균 혈청 인슐린 농도의 도면이다 (실시예 10);
도 9 는 웅성 래트에서 PEG 화 (750-1 PEG 인슐린, 80 및 160 ㎍/동물) 대 비-PEG 화 인간 인슐린 (80 ㎍/동물) 의 기관내 점적 후 평균 혈중 글루코오스 농도의 도면이다 (실시예 10);
도 10 은 웅성 래트에서 PEG 화 (750-2 PEG 인슐린, 80 ㎍/동물) 대 비-PEG 화 인간 인슐린 (80 ㎍/동물) 의 기관내 점적 후 평균 혈청 인슐린 농도의 도면이다 (실시예 11);
도 11 은 웅성 래트에서 PEG 화 (750-1 PEG 인슐린, 80 ㎍/동물) 대 비-PEG 화 인간 인슐린 (80 ㎍/동물) 의 기관내 점적 후 평균 혈중 글루코오스 농도의 도면이다 (실시예 11);
도 12 는 웅성 래트에서 PEG 화 (2K PEG 인슐린, 300 ㎍/동물, 600 ㎍/동물, 900 ㎍/동물 및 1200 ㎍/동물) 대 비-PEG 화 인간 인슐린 (80 ㎍/동물) 의 기관내 점적 후 평균 혈중 글루코오스 농도의 도면이다 (실시예 12);
도 13 은 예시적인 PEG 화 조성물 (2K PEG 인슐린) 대 비-PEG 화 인슐린의 정맥내 투여 후 평균 혈청 인슐린 농도의 도면이다 (상세한 사항은 실시예 13 에제공된다); 및
도 14 는 예시적인 PEG 화 조성물 (2K PEG 인슐린) 대 비-PEG 화 인슐린의 정맥내 투여 후 혈중 글루코오스 농도의 도면이다 (상세한 사항은 실시예 13 에 제공된다).
본 발명의 상세한 설명
다양한 대표적 PEG-인슐린 콘쥬게이트의 고안, 합성 및 분석은 폐로의 폐 전달을 위해 최적화되었다. PEG-인슐린 분자 제제가 이전에 개시되어 있지만, 흡입가능한 인슐린의 지속성 제형물을 제공하기 위한 PEG 의 공유적 커플링의 이용은 이전에 설명되지 않았다. 이와 관련하여, 출원인들이 직면한 과제는 인슐린 분자에 공유적으로 부착한 PEG 사슬의 수, 위치, 구조 및 분자량의 최적 균형을 갖는 PEG-인슐린 콘쥬게이트를 제공하며, 바람직하게는 심폐를 통해 전신 순환계로 투여하기에 적합한 인슐린 조성물을 제공하는 것이었다. 놀랍게도, 상기 견지에서, 본 발명자들은 그 상세한 내용이 하기 설명을 독서하여 보다 자명해질, 하나 이상의 하기 특징을 갖는 특정 PEG-개질된 인슐린 제형물을 발견하였다: (i) 생활성을 가짐, 즉 천연 인슐린 활성의 약 5% 이상을 나타내거나, 바람직하게는 천연 인슐린 활성이 적어도 실질적으로 유지되거나 단지 최소한만 감소된 생활성을 갖거나, 보다 바람직하게는 천연 인슐린에 비해 개선된 활성을 가짐, (ii) 폐로부터 혈류 내로 흡수됨 (폐에 "점착됨" 과 반대임), (iii) 화학적으로 및 물리적으로 안정함, (iv) 폐에 투여되는 경우, 투여 후 약 8 시간 이상 동안 기준선 초과로 상승된 혈중 인슐린 수준이 얻어짐, (v) 인슐린-분해 효소에 의한 효소 공격에 저항성임, 및(vi) 흡입에 의해 투여되는 경우, 비-PEG 화 인슐린에 비해 연장된 반감기를 나타냄.
I. 정의
본원에서 사용되는 하기 용어는 나타내는 의미를 갖는다.
명세서 및 첨부되는 청구범위에서 사용되는 바와 같은 단수 형태의 "a", "an", "the" 에는 문맥 상 뚜렷이 달리 나타내지 않는 한, 복수 지시물이 포함된다.
본원에서 사용되는 "인슐린" 은 프로인슐린 (proinsulin) 이 포함되는 것을 의미하며, 천연 생성 인슐린의 일차 구조 배좌 (즉, 연속된 일련의 아미노산 잔기) 의 일부 또는 전부, 및 하나 이상의 생물학적 특성을 갖는 임의의 정제된 단리 폴리펩티드가 포함된다. 일반적으로, "인슐린" 이라는 용어는 전장 인슐린과 관련된 치료적 활성의 80% 이상을 실질적으로 보유하는 정도로 (본원에 기재된 바와 같은 친수성, 비천연 생성 중합체로의 화학적 개질 이전에) 하나 이상의 아미노산 개질 (결실, 삽입 또는 치환) 을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 이들의 글리코형 (glycoform) 뿐만 아니라 이들의 유사체를 포함하는 천연 및 합성 유래 인슐린이 포함되는 것을 의미한다. 본 발명의 인슐린은 하기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 임의의 표준 방식으로 제조될 수 있다: 췌장 추출, 재조합 발현 및 시험관 내 폴리펩티드 합성. 천연 또는 야생형 인슐린이란 자연에서 발견되는 것과 같은 인슐린의 아미노산 서열에 해당하는 아미노산 서열을 갖는 인슐린을 나타낸다. 천연 또는 야생형 인슐린은 천연물이거나 (즉, 천연원으로부터 단리됨) 합성적으로 제조될 수 있다.
"생리학적으로 절단가능한" 또는 "분해가능한" 결합은 생리학적 조건 하에서 물과 반응하는 (즉, 가수분해되는) 약한 결합이다. pH 8, 25℃ 에서 약 30 분 미만의 가수분해 반감기를 갖는 결합이 바람직하다. 결합이 수중에서 가수분해되는 경향은 2 개의 중심 원자를 연결하는 연결의 일반적 유형 뿐만 아니라, 상기 중심 원자에 부착된 치환기에도 의존할 것이다. 적절한 가수분해적으로 불안정하거나 약한 연결에는 하기가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다: 카르복실레이트 에스테르, 포스페이트 에스테르, 무수물, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬 에테르, 이민, 오르토에스테르, 펩티드 및 올리고뉴클레오티드.
"가수분해적으로 안정한" 연결 또는 결합은 수중에서 실질적으로 안정한, 즉 연장된 시기 동안 임의의 상당한 정도로 생리학적 조건 하에서 가수분해를 겪지 않는 화학적 결합, 전형적으로 공유 결합을 나타낸다. 가수분해적으로 안정한 연결의 예에는 하기가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다: 탄소-탄소 결합 (예컨대, 지방족 사슬에서의), 에테르, 아미드, 우레탄 등. 일반적으로, 가수분해적으로 안정한 연결은 생리학적 조건 하에서 1 일 당 약 1-2% 미만의 가수분해 속도를 나타내는 것이다. 대표적인 화학적 결합의 가수분해 속도는 대부분의 표준 화학 참고서에서 찾아볼 수 있다.
본원에서 사용되는 "PEG" 또는 폴리에틸렌 글리콜은 임의의 수용성 폴리(알킬렌 옥시드) 를 포함하는 것을 의미한다. 가장 전형적으로, 본 발명에 사용하기 위한 PEG 는 하기 구조 "-CH2CH20(CH2CH2O)nCH2CH2-" 를 포함할 것이며, 여기서 전체 PEG 잔기의 말단기 또는 실제 구조는 다양할 수 있다. 하나의 일반적으로 사용되는 PEG 는 말단이 캡핑된 PEG 로, 여기서 PEG 의 한 말단은 상대적으로 비활성인 기, 전형적으로 알콕시기, 예컨대 메톡시 (-OCH3) 로 캡핑되는 반면, 다른 말단은 화학적으로 개질될 수 있는 히드록실기이다. 본 발명의 인슐린 콘쥬게이트의 제조에 사용하기 위한 특정 PEG 형, 예컨대 분지형, 선형, 포크형 PEG 등이 하기에 더 상세히 설명될 것이다.
"PEG-인슐린 콘쥬게이트" 는 거기에 공유적으로 연결되거나 커플링된 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 잔기를 가지며, 임의의 측정가능한 정도의 인슐린 활성 (예컨대, 천연 인슐린의 생물학적 활성의 약 2% 내지 약 100% 이상) 을 보유하는, 인슐린 분자 (상기 정의된 바와 같음) 를 나타낸다.
본 발명의 친수성, 비천연 생성 중합체, 예컨대 PEG 에 있어서 "겉보기 평균 분자량" 이란 전형적으로 크기 배제 크로마토그래피, 광산란 또는 1,2,4-트리클로로벤젠 중의 내재 속도에 의해 결정되는, 중합체의 질량 평균 분자량을 나타낸다. 본 발명의 중합체는 전형적으로 다분산성으로, 약 1.05 미만의 낮은 다분산값을 보유한다.
"친유성 잔기" 는 분해가능한 또는 분해불가능한 결합에 의해 본 발명에 따른 친수성 중합체에 부착되는 경우, 중합체, 따라서 중합체-인슐린 콘쥬게이트의 친수성 성질을 실질적으로 변형시키는데 효과적인 것이다. 전형적인 친유성기, 예컨대 지방산은 약 12 ~ 22 탄소수일 것이다.
"실질적으로 비면역원성인" 본 발명의 인슐린 콘쥬게이트는 천연 인슐린에비해 감소된 면역원성을 보유한다. 면역원성은 비개질된 인슐린에 비해 PEG 인슐린 콘쥬게이트의 투여 시, 마우스에서 또는 바람직하게는 토끼에서의 항체 역가를 결정하여 평가될 수 있다.
"알킬" 은 전형적으로 약 1 내지 15 개 원자 길이 범위인 탄화수소 사슬을 나타낸다. 탄화수소 사슬은 바람직하게는 (반드시 그런 것은 아님) 포화되며, 임의로 거기에 부착된 추가적 관능기를 포함할 수 있다. 탄화수소 사슬은 분지형 또는 직쇄형 사슬일 수 있다. 예시적인 알킬기에는 에틸, 프로필, 1-메틸부틸, 1-에틸프로필 및 3-메틸펜틸이 포함된다. 본 발명의 하나의 바람직한 구현예에 있어서, 알킬화 PEG, 특히 선형 알킬화 PEG 를 포함하는 콘쥬게이트는 지방산 또는 기타 친유성 잔기가 아닌 알킬 부분을 갖는 것이다.
"저급 알킬" 은 탄소수 1 내지 5 이고, 메틸, 에틸, n-부틸, i-부틸, t-부틸로 예시되는 바와 같은 선형 사슬 또는 분지형일 수 있는 알킬기를 나타낸다.
"절대 폐 생체이용률" 은 천연 인슐린의 정맥내 용량에 비해, 흡수되어 포유류의 혈액 순환계에 도입되는, 폐로 전달되는 약물 용량 (예컨대, 본 발명에 따른 PEG-인슐린 콘쥬게이트) 의 백분율이다. 절대 폐 생체이용률 결정을 위해 대표적인 모델 시스템에는 래트, 개, 토끼 및 원숭이가 포함된다. 하나의 측면에 있어서, 본 발명의 흡입가능한 PEG-인슐린 조성물은 혈장 또는 혈중 약 20% 이상의 절대 폐 생체이용률을 특징으로 하며, 절대 폐 생체이용률은 일반적으로 약 10% 내지 30% 이상 범위이다. 일반적으로, PEG-인슐린 콘쥬게이트의 특정 성질에 따라, 본 발명의 콘쥬게이트는 하기 중 하나 이상의 절대 폐 생체이용률을 보유할 것이다: 10%, 12%, 15%, 18%, 20%, 22%, 25%, 30%, 32%, 35% 또는 그 이상. 절대 폐 생체이용률은 직접적인 기관내 투여, 점적으로부터 흡수를 측정하여, 또는 PEG-인슐린 콘쥬게이트 조성물의 흡입에 의해 추정할 수 있다.
PEG-인슐린 콘쥬게이트의 반감기와 관련된 "분포상" 은 인슐린이 혈장으로부터 사라지는 동안의 초기 급성상을 나타낸다. 말기의 느린상 또는 제거상 반감기는 인슐린이 신체로부터 제거되는 동안의 느린상을 나타낸다.
"지효성" 인슐린은 약 6 시간 이상, 바람직하게는 약 8 시간 이상의 효과 기간 (즉, 기준선 초과의 상승된 혈중 수준) 을 갖는 인슐린을 나타낸다.
"억제되는 글루코오스 수준" 은 기준선 또는 기저 수준 미만으로 억제되는 혈중 글루코오스 수준 (예컨대, 본 발명의 PEG-인슐린 콘쥬게이트 투여 후) 을 나타낸다.
"약학적으로 허용가능한 염" 에는 하기가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다: 아미노산 염, 무기산으로 제조되는 염, 예컨대 클로라이드, 술페이트, 포스페이트, 디포스페이트, 히드로브로마이드 및 니트레이트 염, 또는 유기산으로 제조되는 염, 예컨대 말레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 타르트레이트, 숙시네이트, 에틸숙시네이트, 시트레이트, 아세테이트, 락테이트, 메탄술포네이트, 벤조에이트, 아스코르베이트, 파라-톨루엔술포네이트, 팔모에이트, 살리실레이트 및 스테아레이트 뿐만 아니라 에스톨레이트, 글루셉테이트 및 락토바이오네이트 염. 유사하게, 약학적으로 허용가능한 양이온을 함유하는 염에는 하기가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다: 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 알루미늄, 리튬 및 암모늄 (치환암모늄 포함).
"아미노산" 은 아미노기 및 카르복실산기를 둘 다 포함하는 임의의 화합물을 나타낸다. 아미노기는 가장 일반적으로는 카르복시 관능부에 인접한 위치에서 나타나지만, 아미노기는 분자 내 임의의 위치에 존재할 수 있다. 아미노산은 또한 추가적인 관능기, 예컨대 아미노, 티오, 카르복실, 카르복사미드, 이미다졸 등을 포함할 수 있다. 아미노산은 합성물 또는 천연 생성물일 수 있으며, 다양한 비의 거울상 이성질체를 포함하는 라세믹 또는 광학 활성 (D- 또는 L-) 형으로 사용될 수 있다.
"펩티드" 는 펩티드 결합으로 결합된 2 개 이상의 아미노산으로 이루어진다. 펩티드는 호모- 또는 헤테로-펩티드 (즉, 상기 정의된 바와 같은 동일하거나 상이한 아미노산 잔기로 이루어짐) 일 수 있고, 2 개 아미노산으로부터 수백개 아미노산에 이르기까지 길이가 다양할 수 있다.
"건조 분말" 은 전형적으로 약 10% 미만의 수분을 포함하는 분말 조성물을 나타낸다.
"폐 전달에 적합한" 조성물은 에어로졸화될 수 있고, 대상체에 의해 흡입되어 일부의 에어로졸화된 입자가 폐에 도달하여 하부 호흡기 및 폐포 내로 침투할 수 있는 조성물을 나타낸다. 상기 조성물은 "호흡가능한" 또는 "흡입가능한" 것으로 간주된다.
"에어로졸화된" 입자는 전형적으로 흡입 장치, 예컨대 건조 분말 흡입기, 아토마이저 (atomizer), 계량 용량 흡입기 또는 분무기의 작동 (또는 발사) 결과, 기체 중에 현탁되는 액체 또는 고체 입자이다.
"방출 용량" 또는 "ED" 는 발사 또는 분산 작용 후 적합한 흡입기 장치로부터 약물 제형물의 전달 지표를 제공한다. 보다 구체적으로, 건조 분말 제형물에 있어서, ED 는 단위 용량 패키지에서 인출되어 흡입기 장치의 마우스피스로 방출되는 분말의 백분율 측정이다. ED 는 흡입기 장치에 의해 전달되는 용량 대 겉보기 용량 (즉, 발사 전 적합한 흡입기 장치 내에 놓인 단위 용량 당 분말의 질량) 의 비로서 정의된다. ED 는 실험적으로 결정되는 파라미터이며, 전형적으로 환자 투여를 모방하는 시험관 내 장치 설치를 이용하여 결정된다. ED 값을 결정하기 위해서는, 전형적으로 단위 용량형인 건조 분말의 겉보기 용량을 적합한 건조 분말 흡입기 (예컨대 Inhale Therapeutic Systems 에 허여된 미국 특허 제 5,785,049 호에 기재된 바와 같은 것) 내에 놓고 작동시켜, 분말을 분산시킨다. 이어서 생성된 에어로졸 분무를 장치로부터 진공에 의해 인출하여, 장치 마우스피스에 부착된 테어드 (tared) 필터 상에 포획한다. 필터에 도달하는 분말의 양이 방출 용량을 이룬다. 예를 들어, 흡입 장치 내에 놓인 5 mg 건조 분말을 포함하는 투여형에 있어서, 분말의 분산으로 상기 기재된 바와 같은 테어드 필터 상에 4 mg 의 분말이 회수되면, 건조 분말 조성물의 방출 용량은 하기와 같다: 4 mg (전달 용량)/5 mg (겉보기 용량) ×100 = 80%. 비균질 분말에 있어서, ED 값은 건조 분말에 비해, 발사 후 흡입기 장치로부터 약물의 전달 지표를 제공하며, 전체 분말 중량에 비해 약물의 양에 근거한다. 유사하게, MDI 및 분무기 투여형에 있어서, ED 는 투여형에서 인출되고 흡입기 장치의 마우스피스에서 방출되는 약물의 백분율에 해당한다.
"미립자 용량" 또는 "FPD" 는 전형적으로 안데르센 케스케이드 임팩터 (Andersen cascade impactor) 에 의한 측정으로 결정되는, 3.3 ㎛ 미만의 공기역학 직경을 갖는 분말 입자의 질량 백분율로서 정의된다. 상기 파라미터는 약물 물질의 전신 흡수를 위해 환자의 심폐에 도달할 수 있는 최대 가능성을 갖는 입자의 백분율 지표를 제공한다.
"분산가능한" 또는 "분산성" 분말은 약 30% 이상, 보다 바람직하게는 40 ~ 50%, 더욱 바람직하게는 약 50 ~ 60% 이상의 ED 값을 갖는 것이다.
"질량 중앙값 직경" 또는 "MMD" 는 본 발명의 분말이 일반적으로 다중분산되므로 (즉, 일정 범위의 입자 크기로 이루어짐), 평균 입자 크기의 측정이다. 본원에서 보고되는 바와 같은 MMD 값은 원심 침강에 의해 결정되지만, 평균 입자 크기의 측정을 위해 임의 수의 일반적으로 사용되는 기법 (예컨대, 전자 현미경, 광산란, 레이저 회절) 이 사용될 수 있다.
"질량 중앙값 공기역학 직경" 또는 "MMAD" 는 분산 입자의 공기역학 크기의 측정이다. 공기역학 직경은 그 침전 양식의 관점에서 에어로졸화된 분말을 설명할 때 사용되며, 입자와 같이, 공기 중에서 동일한 침전 속도를 갖는 단위 밀도스피어의 직경이다. 공기역학 직경에는 입자 모양, 밀도 및 입자의 물리적 크기가 포함된다. 본원에서 사용되는 MMAD 는 달리 명시되지 않는 한, 케이케이드 충격에 의해 결정되는 에어로졸화된 분말의 공기역학 입자 크기 분포의 중심점 또는 중앙값을 나타낸다.
"약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체" 는 본 발명의 조성물에 임의로 함유될 수 있는 부형제를 나타낸다. 흡입용 조성물에 있어서, 대상체에, 특히 대상체의 폐에 유의미한 독성학적 역효과를 갖지 않고 폐 내로 취해질 수 있는 부형제가 바람직하다.
"약리학적 유효량" 또는 "생리학적 유효량" 은 표적 혈중 글루코오스 수준을 일으키기 위한 혈류 중 인슐린의 목적 수준을 제공하는데 필요한, 본원에 기재된 바와 같은 치료적 조성물에 존재하는 PEG-인슐린 콘쥬게이트의 양이다. 정확한 양은 여러 인자, 예컨대 특정 PEG-인슐린, 사용되는 전달 장치, 치료적 조성물의 성분 및 물리적 특징, 의도하는 환자군, 환자 연구 등에 근거할 것이며, 본원에 제공되는 정보를 기준으로, 당업자가 용이하게 결정할 수 있다.
II. 친수성, 비천연 생성 중합체-인슐린 콘쥬게이트
본 발명에 따른 여러 예시적 PEG-인슐린 콘쥬게이트가 제조되었다. 본 발명의 콘쥬게이트에 사용하기 위해서는 폴리에틸렌 글리콜이 바람직하지만, 다른 수용성, 친수성, 비천연 생성 중합체도 또한 사용될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 기타 중합체에는 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 폴리아크릴로일모르폴린, 폴리옥사졸린, 및 폴리(옥시에틸화 폴리올), 예컨대 폴리(옥시에틸화 글리세롤), 폴리(옥시에틸화 소르비톨), 및 폴리(옥시에틸화 글루코오스) 가 포함된다. 상기 기재된 수용성 중합체로부터 선택되는 서브유닛 또는 서브유닛 블록을 포함하는 중합체도 또한 사용될 수 있다. 추가적으로, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체도 사용될 수 있다. 본 발명의 중합체에는바람직하게는 실질적으로 지방산기 또는 다른 친유성 잔기가 없다.
하기 부분에서는 하나 이상의 PEG 잔기, PEG 화 시약, 인슐린 PEG 화 부위, PEG 화 조건 및 후속 콘쥬게이트 정제의 신중한 선택으로, 목적하는 임상적 특성 (개선된 약동학 및/또는 약역학 특성) 을 갖는 PEG-인슐린 조성물이 수득될 수 있음이 예시된다. 이제 본 발명의 PEG-인슐린 콘쥬게이트의 특징을 제공할 것이다.
A. 중합체 및 생성 콘쥬게이트의 구조적 특징
본 발명의 PEG-인슐린 콘쥬게이트는 전형적으로, 각각 약 200 내지 약 40,000 달톤 범위, 바람직하게는 약 200 내지 약 10,000 달톤 범위의 분자량을 갖는 하나 이상의 PEG 사슬을 포함할 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 PEG 는 하기 범위 중 하나에 속하는 평균 분자량을 보유할 것이다: 약 200 내지 10,000 달톤, 약 200 내지 약 7500 달톤, 약 200 내지 약 6,000 달톤, 약 200 내지 약 5,000 달톤, 약 200 내지 약 3000 달톤, 약 200 내지 약 2000 달톤, 및 약 200 내지 약 1000 달톤. 5,000 달톤, 2000 달톤 및 750 달톤의 분자량을 갖는 PEG 로 제조되는 예시적인 콘쥬게이트가 실시예 1 ~ 4 에 제공된다.
폐에 투여하기 위해 바람직한 PEG-인슐린은 약 5000 달톤 미만, 바람직하게는 약 2000 달톤 미만, 더욱 바람직하게는 약 1000 달톤 미만의 분자량을 갖는 PEG 잔기를 보유할 것이다. 본 발명의 하나의 특정 구현예에 있어서, PEG-인슐린 콘쥬게이트는 하기 평균 분자량 중 하나를 갖는 PEG 잔기를 보유할 것이다: 200, 300, 400, 500, 600, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000 또는 5000. 특정 상황에서는, 인슐린 분자의 활성 손실 가능성, 또는 폐 적용에 있어서, 폐 통과의 감소된 효율 (실시예 8) 로 인해, 분자량이 높은 PEG 일수록 덜 바람직할 수 있다.
저분자량 PEG 가 생체이용률의 증가를 위해 바람직할 수 있지만, 고분자량 PEG 사슬, 예컨대 5,000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000, 30,000 또는 40,000 달톤 또는 그 초과의 평균 분자량을 갖는 것은 일반적으로 천연 인슐린의 생체이용률을 감소시키는 것으로 나타나지만, 특히 주사가능한 제형물의 경우 반감기의 증가를 위해 바람직할 수 있다. 즉, 고분자량 PEG 인슐린 (천연물과 비교하여) 에 있어서, 약동학 파라미터, 예컨대 곡선 하 면적 (AUC) 의 유의미한 개선이 그 감소된 활성을 초과 보상할 수 있다.
서브유닛의 수에 있어서, 본 발명에 사용하기 위한 PEG 는 전형적으로 하나 이상의 하기 범위 내에 속하는 여러 (OCH2CH2) 서브유닛을 포함할 것이다: 2 내지 약 900 개 서브유닛, 약 4 내지 약 200 개 서브유닛, 약 4 내지 약 170 개 서브유닛, 약 4 내지 약 140 개 서브유닛, 약 4 내지 약 100 개 서브유닛, 약 10 내지 약 100 개 서브유닛, 약 4 내지 약 70 개 서브유닛, 약 4 내지 약 45 개 서브유닛, 및 약 4 내지 약 25 개 서브유닛.
본 발명의 PEG-인슐린 콘쥬게이트는 단일치환되거나 (즉, 단일 반응성 인슐린 부위에 부착된 PEG 를 가짐), 2 치환되거나 (2 개의 반응성 부위에 부착된 PEG 잔기를 가짐), 3 치환되거나, 또는 인슐린 분자 상에 3 개 초과 부위에 중합체 부착을 가질 수도 있다. 단일치환, 2 치환, 및 3 치환 인슐린은 또한 본원에서 각각 PEG 단량체, 이량체, 및 삼량체로 불린다. 다중치환 인슐린 (2 개 이상의인슐린 부위에 공유 부착된 PEG 잔기를 갖는 인슐린을 의미함) 은 전형적으로 (반드시 그런 것은 아님) 각각의 반응성 부위에 부착된 동일한 PEG 잔기를 보유할 것이다. 즉, 인슐린에 부착된 1 가지 초과 유형의 PEG 잔기를 갖는 PEG-인슐린 조성물이 포함된다. 본 발명에 따라 바람직한 조성물은 주로 단량체 및/또는 이량체 인슐린 콘쥬게이트를 포함하는 것이다. 놀랍게도, 부위 특이적이지 않은 (하나 초과의 반응성 부위에 공유적으로 커플링된 PEG 를 갖는 PEG-인슐린종의 혼합물을 포함하는) PEG-인슐린 조성물은 특히 폐에 투여되는 경우, 천연 인슐린에 비해 개선된 약동학 및 약역학 특성을 보유하는 것으로 나타났다 (실시예 11).
PEG-치환의 위치에 있어서, 인슐린 분자는 PEG 화에 적합한 여러 부위를 보유하며, 반드시는 아니지만 일반적으로 아미노 부위가 가장 바람직하다. PEG 화에 적합한 특정 인슐린 아미노기에는 LysB29 뿐만 아니라, 2 개의 N 말단 GlyA1 및 PheB1 이 포함된다. 인슐린 분자 상의 상기 부위는 또한 각각 간단히 Al, B1 및 B29 로 불린다. 인슐린 상에서 반응성 아미노기로의 커플링에 사용하기 위한 친전자성 활성화 PEG 에는 mPEG2-ALD, mPEG-숙신이미딜 프로피오네이트, mPEG-숙신이미딜 부타노에이트, mPEG-CM-HBA-NHA, mPEG-벤조트리아졸 카르보네이트, mPEG-아세트알데히드 디에틸 아세탈 (Shearwater Corporation, Huntsville, Alabama) 등이 포함된다.
하나의 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 주로 (90% 초과로) 단일치환 인슐린, 예컨대 모노-A1 인슐린, 모노-B1 인슐린, 또는 모노-B29 인슐린을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 하기를 포함할 수 있다: i) 모노-A1 인슐린, ii)모노-A1 인슐린 및 모노-B1 인슐린의 혼합물, 또는 iii) 모노-A1, 모노-B1 및 모노-B29 인슐린의 혼합물. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 주로 2 치환 인슐린, 예컨대 디-A1,B1-인슐린, 또는 디-A1,B29-인슐린, 또는 디-B1,B29-인슐린, 또는 이들의 임의의 다양한 조합을 포함할 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 따른 조성물은 다양한 PEG-인슐린 콘쥬게이트 (즉, 가능한 부착 부위의 임의의 한 조합에 부착된 PEG) 의 혼합물을 포함할 수 있다. 예로서 인슐린 상의 아미노 부위를 이용하면, 본 발명의 조성물은 임의의 하나 이상의 하기 PEG-인슐린 콘쥬게이트를 포함할 수 있다: 모노A1-PEG 인슐린, 모노-B1-인슐린, 모노-B-29 인슐린, 디-A1,B1-인슐린, 디-A1,B29-인슐린, 디-B1,B29-인슐린, 또는 트리-A1,B-1,B29-인슐린. 하나의 구현예에 있어서, 주로 단량체 및 이량체를 포함하는 조성물이 바람직하다. 대표적 조성물에는 약 75% 이상의 조합 단량체 및 이량체, 약 80% 이상의 조합 단량체 및 이량체, 또는 약 85 내지 90% 이상의 조합 단량체 및 이량체를 포함하는 PEG-인슐린 콘쥬게이트 혼합물이 포함될 수 있다 (예컨대, 실시예 5 및 6).
PheB1 은 PEG 의 부착에 의한 화학적 개질을 위해 특히 바람직한 부위이다. 특히 하나의 구현예에 있어서, 본 발명에 사용하기 위한 PEG-인슐린 콘쥬게이트 조성물은 또한 조성물 내의 PEG-인슐린종의 전체 수와는 무관하게, 인슐린 상의 약 70% 이상의 B-1 부위가 PEG 에 공유적으로 커플링된 조성물로서 특징지워진다 (예컨대 표 3A, 실시예 5). 대안적 구현예에는 인슐린 상의 약 75% 이상의 B-1 부위가 PEG 에 공유적으로 커플링되거나, 인슐린 상의 약 80% 이상의 B-1 부위가 PEG에 공유적으로 커플링되거나, 또는 인슐린 상의 약 90% 이상의 B-1 부위가 PEG 에 공유적으로 커플링된 것들이 포함된다.
놀랍게도 본 발명자들은, PEG-인슐린의 무작위 혼합물 (부위 지정 PEG 화가 아니라 무작위로 제조됨) 이 폐에 투여되는 경우, 투여 후 6 시간 이상, 보다 전형적으로 8 시간 이상 혈중 인슐린 수준을 상승시키는 것을 발견하였다. 상기 혼합물은 이들의 이로운 약동학 및 약역학 특성 뿐만 아니라, 대응하는 부위 특이적 접근법에 비해 이들의 합성이 훨씬 더 쉽다 (다중 합성 단계를 필요로 하지 않고, 보호기의 사용을 필요로 하지 않으며, 다중 정제를 필요로 하지 않음 등) 는 점에서 유리하다.
PEG 의 공유 부착에 의해 화학적으로 개질될 수 있는 천연 인슐린 분자에서의 대안적 부위에는 2C-말단, Arg22B, His1OB, His5A, Glu4A, Glu17A, Glu13B, 및 Glu21B 가 포함된다.
천연 인슐린에 부가하여, 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 갖는 비천연 인슐린은 부가적 부위가 하나 이상의 PEG 잔기의 부착에 의한 화학적 개질에 이용가능하도록 사용될 수 있다. 본 발명의 상기 구현예는 특히 인슐린 분자 내에 부가적, 의도적인 PEG 화-부위를 도입하기 위해, 예를 들어 효소 분해에 개선된 저항성을 갖는 PEG-인슐린을 형성하기 위해 유용하다. 상기 접근법은 목적하는 활성, 안정성, 가용성 및 약리학적 특성의 균형을 갖는 최적화된 인슐린 콘쥬게이트의 고안에 있어 더 큰 유연성을 제공한다. 돌연변이는 인슐린 분자 내의 임의 수의 위치에서, 즉 부위 특이적 돌연변이화에 의해 수행될 수 있지만,B-사슬 내의 최초 4 개 아미노산 중 임의의 하나가 시스테인 잔기로 대체된 인슐린 변이체가 바람직하다. 이어서, 상기 시스테인 잔기는 미국 특허 제 5,739,208 호 및 국제 특허 공보 WO 01/62827 에 기재된 바와 같이, 티올기와의 반응에 특이적인 활성화된 PEG, 예컨대 N-말레이미딜 중합체 또는 다른 유도체와 반응할 수 있다. 본 발명의 상기 특정 구현예에 사용하기 위한 예시적인 술프히드릴-선택적 PEG 에는 mPEG-포크형 말레이미드 (mPEG(MAL)2), mPEG2-포크형 말레이미드 (mPEG2(MAL)2), mPEG-말레이미드 (mPEG-MAL), 및 mPEG2-말레이미드 (mPEG2-MAL) (Shearwater Corporation) 가 포함된다. 상기 활성화된 PEG 의 구조는 하기와 같다: 각각 mPEG CONHCH[CH2CONH(CH2CH20)2CH2CH2-MAL, mPEG2-라이신-NH-CH[CH2CONH(CH2CH20)2CH2CH2-MAL]2, mPEG-MAL, 및 mPEG2-라이신-NHCH2CH2NHC(O)CH2CH2MAL.
필요하다면, 그 생물학적 활성이 PEG 화의 결과 일부 손상되는 PEG-인슐린 콘쥬게이트의 생활성을 증가시키기 위해, 천연 인슐린 서열에 대한 추가적 돌연변이를 이용할 수 있다. 상기 돌연변이의 하나는 Thr8 로부터 His8 이다. 추가적인 돌연변이는, 예를 들어 그 내용이 본원에 참고문헌으로 도입된 [Diabetes Care, 13 (9), (1990)] 에서 찾아볼 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 PEG 는 선형, 포크형, 분지형, 아령형 등 다양한 구조를 보유할 수 있다. 전형적으로, PEG 는 인슐린 분자 상의 목적 부위 또는 부위들과의 커플링을 위해 적합한 활성화기로 활성화된다. 활성화된 PEG 는 인슐린과의 반응을 위해 말단에 반응기를 보유할 것이다. 본원에서 사용되는 "링커" 라는 용어는 인슐린과의 반응을 위해 PEG 말단에 위치한 활성화기를 포함하는 것을 의미하며, 활성화된 PEG 의 제조를 용이하게 하기 위해 중합체의 PEG 부분 및 말단에서의 활성화기 사이에 배치된 부가적 (전형적으로 불활성인) 원자들을 추가로 포함할 수 있다. 링커는 임의 수의 원자를 포함할 수 있지만, PEG 골격 및 말단 활성화기 사이에 개입된 메틸렌을 포함하는 링커, 예컨대 mPEG-숙신이미딜 프로피오네이트 및 mPEG-부타노에이트에서와 같은 링커가 바람직하다. 대표적인 활성화된 PEG 유도체 및 약물, 예컨대 인슐린으로의 상기 제제의 콘쥬게이션 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 추가로 [Zalipsky, S. 등, "Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides" in Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992)] 및 [Advanced Drug Reviews, 16: 157-182 (1995)] 에 설명되어 있다.
본 발명의 하나의 특정 구현예에 있어서, 콘쥬게이트의 PEG 부분에는 중합체 또는 중합체-인슐린 콘쥬게이트의 수용성 성질을 상당히 개질시키는데 효과적인 하나 이상의 친유성기가 존재하지 않는다. 즉, 본 발명의 콘쥬게이트의 중합체 또는 비인슐린 부분은 친수성이라기 보다 친유성인 원자기 (예컨대, 탄소수 약 2 내지 8 ~ 12 인 탄소 사슬) 를 포함할 수 있지만, 상기 기 또는 기들의 존재가 중합체 또는 콘쥬게이트의 친수성 성질을 유의미하게 변형시키는데 효과적이지 않은 경우, 상기 잔기가 본 발명의 콘쥬게이트 내에 포함될 수 있다. 즉, 본 발명의인슐린 콘쥬게이트 자체는 친유성 또는 양쪽성이기보다는 친수성인 것을 특징으로 한다. 전형적으로, 인슐린으로의 커플링 이전의 인슐린 콘쥬게이트의 중합체 부분은, 상기 친유성기를 포함하는지 여부와는 무관하게, 높은 친수성/친유성 균형 (HLB) 값을 보유할 것이다. HLB 수는 분자 내 각 유형의 기 (친수성 또는 친유성) 의 중량 백분율을 기준으로 한다; 값들은 전형적으로 약 1 ~ 40 범위이다. 본 발명의 콘쥬게이트에 사용하기 위한 중합체는 전체적으로, 하나 이상의 친유성 치환기의 존재와는 무관하게, 친수성인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 하나의 구현예에 있어서, 중합체-인슐린 콘쥬게이트의 중합체 부분은 25 초과, 보다 바람직하게는 30 초과, 더욱 바람직하게는 35 초과인 HLB 수를 특징으로 한다. 상기 친유성 잔기가 존재할 수 있는 본 발명의 특정 구현예에 있어서, 잔기는 바람직하게는 PEG 사슬의 말단에 위치하지 않는다.
본 발명의 콘쥬게이트에 사용하기 위한 분지형 PEG 에는 그 전문이 본원에 참고문헌으로 도입되는 국제 특허 공보 WO 96/21469 에 기재된 것들이 포함된다. 일반적으로, 분지형 PEG 는 식 R(PEG-OH)n로 나타낼 수 있으며, 여기서 R 은 중심 "코어" 분자를 나타내고, n 은 팔 (arm) 의 수를 나타낸다. 분지형 PEG 는 2 개 이상의 "PEG" 팔이 뻗어나가는 중심 코어를 갖는다. 분지형 배치에 있어서, 분지형 중합체 코어는 인슐린으로의 부착을 위한 단일 반응성 부위를 보유한다. 본 발명에 사용하기 위한 분지형 PEG 는 전형적으로 4 개 미만의 PEG 팔을 포함할 것이며, 보다 바람직하게는 3 개 미만의 PEG 팔을 포함할 것이다. 분지형 PEG 는 이들의 선형 PEG 대응부에 비해, 보다 크고, 보다 밀도가 큰 중합체 구름(cloud) 에 커플링된 단일 반응성 부위를 갖는다는 이점을 제공한다. 분지형 PEG 의 하나의 특정 유형은 (MeO-PEG-)pR-X 로 나타낼 수 있으며, 여기서 p 는 2 또는 3 이고, R 은 여기에 부착된 2 또는 3 개의 PEG 팔을 갖는 라이신 또는 글리세롤과 같은 중심 코어 구조이고, X 는 인슐린과의 커플링을 위해 활성화될 수 있거나 활성화된 임의의 적합한 관능기를 나타낸다. 하나의 특히 바람직한 분지형 PEG 는 mPEG2-라이신-숙신이미드 구조를 갖는 mPEG2-NHS (Shearwater Corporation, Alabama) 이다.
또다른 분지형 구조에 있어서, "돌출형 PEG" 는 상기 예에서와 같이 PEG 사슬의 말단 보다는 PEG 골격을 따라 배치된 단백질 커플링용 반응기를 갖는다. 인슐린과의 커플링을 위해 PEG 골격으로부터 연장된 반응기는 동일하거나 상이할 수 있다. 돌출형 PEG 구조는 유용할 수 있지만, 일반적으로 특히 흡입용 조성물에 있어서는 덜 바람직하다.
대안적으로, PEG-인슐린 콘쥬게이트의 PEG-부분은 중합체 사슬의 한 말단에 분지형 잔기를, 및 인슐린으로의 부착을 위해 분지형 잔기에 연결된 2 개 (또는 2 의 임의 배수개) 의 자유 반응기를 갖는 포크형 구조를 보유할 수 있다. 예시적인 포크형 PEG 는 그 내용이 본원에 참고문헌으로 도입된 국제 특허 공보 WO 99/45964 에 기재되어 있다. 포크형 폴리에틸렌 글리콜은 임의로 중합체 사슬의 반대쪽 말단에 알킬 또는 "R" 기를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 포크형 PEG-인슐린 콘쥬게이트는 하기 식을 갖는다: R-PEG-L(Y-인슐린)n(여기서, R 은 알킬이며, L 은 가수분해적으로 안정한 분지점이고, Y 는 인슐린으로의 포크형 중합체의 화학적 연결을 제공하는 연결기이고, n 은 2 의 배수이다). L 은 단일 "코어" 기, 예컨대 "-CH-" 를 나타내거나, 더 긴 원자 사슬을 포함할 수 있다. 예시적인 L 기에는 라이신, 글리세롤, 펜타에리트리톨 또는 소르비톨이 포함된다. 전형적으로, 분지 잔기 내의 특정 분지 원자는 탄소이다.
본 발명의 하나의 특정 구현예에 있어서, 포크형 PEG 의 인슐린 분자 (Y) 로의 연결은 가수분해적으로 안정하다. 바람직한 구현예에 있어서, n 은 2 이다. 인슐린 상에서 반응성 부위로의 콘쥬게이션 이전에 적합한 Y 잔기에는 하기가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다: 활성 에스테르, 활성 카르보네이트, 알데히드, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 에폭시드, 알콜, 말레이미드, 비닐술폰, 히드라지드, 디티오피리딘, 및 요오드아세트아미드. 적합한 활성화기의 선택은 인슐린 분자상의 목적 부착 부위에 근거할 것이며, 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 생성 PEG-인슐린 콘쥬게이트에서의 해당 Y 기는 인슐린 상의 적합한 반응성 부위와 활성화된 포크형 중합체의 반응에서 얻어지는 것이다. 상기 최종 연결의 특이적 본질은 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들어, 반응성 포크형 PEG 가 활성화된 에스테르, 예컨대 숙신이미드 또는 말레이미드 에스테르를 포함하는 경우, 인슐린 상의 아민 부위를 통한 콘쥬게이션은 대응 아미드 연결을 형성시킬 것이다. 상기 특정 포크형 중합체는 특히 이들이 2:1 이상의 인슐린 대 PEG 몰비를 갖는 콘쥬게이트를 제공하므로 매력적이다. 상기 콘쥬게이트는 인슐린수용체 부위를 차단할 가능성이 더 적을 수 있지만, 여전히 인슐린 분해 효소와 같은 효소적 분해에 대해 인슐린을 보호하려는 고안에서 유연성을 제공한다.
관련 구현예에 있어서, 본 발명의 포크형 PEG-인슐린 콘쥬게이트는 하기 식으로 나타낸다: R-[PEG-L(Y-인슐린)2]n. 상기 예에서, R 은 코어 구조에 부착된 하나 이상의 PEG-디-인슐린 콘쥬게이트를 갖는 중심 코어 구조를 나타낸다. 구체적으로, 본 발명의 상기 측면에 따라 바람직한 포크형 중합체는 n 이 1, 2, 3, 4, 5, 및 6 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것들이다. 예시적인 코어 R 구조는 또한 라이신, 글리세롤, 펜타에리트리톨, 또는 소르비톨로부터 유도될 수 있다.
대안적인 구현예에 있어서, 본원에서 제공되는 임의의 대표적 구조 중에서, 인슐린 및 중합체 분지점 사이의 화학적 연결은 분해가능할 수 있다 (즉, 가수분해적으로 불안정할 수 있다). 대안적으로, 하나 이상의 분해가능한 연결은 초기 투여된 콘쥬게이트에 비해 더 작은 PEG 사슬을 갖는 PEG-인슐린 콘쥬게이트가 생체 내에서 생성될 수 있게 하기 위해, 중합체 골격 내에 포함될 수 있다. 중합체 콘쥬게이트의 상기 선택적 특징은 투여 시 콘쥬게이트의 최종 목적 약리학적 특성에 대한 추가적 조절을 제공할 수 있다. 예를 들어, 크고 비교적 불활성인 콘쥬게이트 (즉, 부착된 하나 이상의 고분자량 PEG 사슬, 예컨대 분자량 약 10,000 초과의 하나 이상의 PEG 사슬을 갖는 것으로, 콘쥬게이트는 본질적으로 생활성을 보유하지 않음) 가 투여될 수 있고, 이어서 이것은 폐 또는 혈류 중에서 가수분해되어 본래 존재하는 PEG 사슬의 일부를 보유하는 생활성 콘쥬게이트를 만들 수 있다. 상기 방식으로, PEG-인슐린 콘쥬게이트의 특성은 보다 효과적으로 조절될 수 있다. 예를 들어, 초기 중합체 콘쥬게이트의 흡수는 초기 투여 시 느릴 수 있으며, 이는 흡입에 의해 바람직하지만 반드시 필요한 것은 아니다. 가수분해적으로 분해가능한 연결의 생체 내 절단 시, 자유 인슐린 (분해가능한 연결의 위치에 따라) 또는 부착된 작은 폴리에틸렌 태그를 갖는 인슐린이 방출되며, 폐를 통해 보다 쉽게 흡수되고/되거나 혈액 중에서 순환된다.
본 발명의 상기 구현예의 하나의 특징에 있어서, 가수분해 전의 손상되지 않은 중합체-콘쥬게이트는 투여 시 최소한으로 분해되어, 전신 순환계로의 방출 이전 인슐린의 효소적 분해에서와는 대조적으로, 절단가능한 결합의 가수분해가 혈류 내로의 활성 인슐린의 느린 방출 속도를 제어하는데 효과적이다.
생리학적으로 절단가능한 적절한 연결에는 하기가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다: 에스테르, 카르보네이트 에스테르, 카르바메이트, 술페이트, 포스페이트, 아실옥시알킬 에테르, 아세탈, 및 케탈. 상기 콘쥬게이트는 저장 및 투여 시 안정한 생리학적으로 절단가능한 결합을 보유해야 한다. 예를 들어, PEG-절단가능한 연결-인슐린 콘쥬게이트는 최종 약학 조성물의 제조 시, 사용된다면 적절한 전달 비히클 중에서의 용해 시, 및 경로와 무관하게 투여 시, 그 온전성을 유지해야 한다.
보다 구체적으로, 일반적으로 상기 기재된 바와 같이, 생분해성 연결을 가지며 본 발명에서 유용한 PEG-인슐린 콘쥬게이트는 하기 구조로 나타낸다: PEG1-W-PEG2-인슐린 (여기서, PEG1 및 PEG2 는 동일하거나 상이할 수 있다) 또는 PEG-W-인슐린 (여기서, W 는 약한 생분해성 연결을 나타낸다). 상기 콘쥬게이트는 생체 내에서 제거가능한 (즉, 절단가능한) PEG 팔 또는 PEG 팔의 부분을 포함한다. 상기 특정 개질된 인슐린은 전형적으로, 손상되지 않는 경우 분자의 손상되지 않은 PEG-부분의 크기 또는 PEG 사슬에 의한 인슐린 분자 상 활성 부위의 구조적 차단으로 인해 실질적으로 생물학적으로 비활성이다. 그러나, 상기 콘쥬게이트는 생리학적 조건 하에서 절단되어, 예컨대 폐로부터 전신 순환계 내로 흡수될 수 있는 인슐린 또는 생물학적 활성 PEG-인슐린을 방출한다. 제 1 의 예시적인 구조에 있어서, PEG1 부분은 본원에서 논의되는 임의 수의 상이한 구조를 보유할 수 있고, 전형적으로 투여 시 콘쥬게이트가 급속히 흡수되지 않도록 약 10,000 이상의 분자량을 보유할 것이다. 분자의 PEG2 부분은 바람직하게는 약 5000 달톤 미만, 보다 바람직하게는 2000 달톤 미만, 더욱 바람직하게는 1000 달톤 미만의 분자량을 보유한다. 제 2 의 예시적인 구조인 PEG-W-인슐린에 있어서, PEG 부분은 일반적으로 약 10,000 달톤 이상의 분자량을 보유할 것이다.
본 발명의 또다른 특이적 구현예에 있어서, PEG-인슐린 콘쥬게이트는 2 개의 인슐린 잔기가 중심 PEG 에 상호연결된 유사 아령형 구조를 갖는다. 보다 구체적으로, 상기 콘쥬게이트는 인슐린-Y-PEG-Z-인슐린 구조로 나타낼 수 있으며, 여기서 Y 및 Z 는 인슐린을 PEG 잔기에 연결하는, 가수분해적으로 안정한 연결기이다. 특정 구현예에 있어서, Z 는 콘쥬게이션 전에 인슐린 상의 티올기 (예컨대 시스테인) 와의 반응에 적합한 활성화된 술폰이다. 대안적으로, Y 및 Z 는 인슐린과의 공유적 커플링을 위해 적합한 임의 기일 수 있다. 추가예는 그 내용이 본원에 참고문헌으로 도입된 미국 특허 제 5,900,461 호에 제공된다.
본 발명의 콘쥬게이트의 제조에 사용하기 위한 선형 또는 분지형 구조를 갖는 추가의 대표적 모노- 및 디-관능성 PEG 는 Shearwater Corporation (Alabama) 에서 구입할 수 있다. 예시적 구조는 그 내용이 본원에 참고문헌으로 도입된 표제 "Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" 인 Shearwater 의 2001 년도 카탈로그에 기재되어 있다.
B. 제조
인슐린으로의 PEG 커플링을 위한 반응 조건은 사용되는 특정 PEG 유도체, 인슐린 상의 부착 부위 및 반응기의 특정 유형 (즉, 라이신 대 시스테인), 목적하는 PEG 화 정도 등에 따라 다양할 것이며, 당업자가 용이하게 결정할 수 있다.
하기에 더욱 상세히 예시되는 바와 같이, 본 발명의 콘쥬게이트의 합성은 부위 지정되거나 (실시예 1, 2 및 4), 무작위적 (실시예 3) 일 수 있다. 인슐린 아민기 (예컨대 GlyA1, PheB1, Lys29B) 와의 반응을 위해 적합한 PEG 활성화기는 트레실레이트, 알데히드, 에폭시드, 카르보닐이미다졸, 활성 카르보네이트 (예컨대 숙신이미딜 카르보네이트), 아세탈, 및 활성 에스테르, 에컨대 N-히드록실숙신이미드 (NHS) 및 NHS-유도체화 PEG 이다. 이들 중, 가장 반응성인 것은 PEG 카르복시메틸-NHS, 노르류신-NHS, 및 숙신이미딜 카르보네이트이다. 인슐린으로의 커플링을 위한 추가적 PEG 시약에는 PEG 숙신이미딜 숙시네이트 및 프로피오네이트가 포함된다. 본 발명에 사용하기 위해 적합한 PEG 활성 에스테르, 예컨대 단일 프로판산 또는 부탄산 잔기를 갖는 것은, 그 전문이 본원에 참고문헌으로 도입된미국 특허 제 5,672,662 호에 기재되어 있다. 본 발명의 콘쥬게이트의 제조에 사용하기 위한 특이적 활성 에스테르에는 mPEG-숙신이미딜 프로피오네이트 및 mPEG-숙신이미딜 부타노에이트 (실시예 1 ~ 4) 가 포함된다.
특이적 콘쥬게이트를 위한 최적화된 실험 조건은 당업자에 의해, 전형적으로 일상적 실험에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
인슐린 상의 티올 (술프히드릴) 기로의 부착을 위한 PEG-중합체의 활성화에 적합한 반응기에는 비닐술폰, 요오도아세트아미드, 말레이미드, 및 디티오-오르토피리딘이 포함된다. 특히 바람직한 시약에는 PEG 비닐술폰 및 PEG-말레이미드가 포함된다. 본 발명에 사용하기 위한 추가적인 대표적 비닐술폰은 그 내용이 본원에 참고문헌으로 도입된 미국 특허 제 5,739,208 호에 기재되어 있다.
일부 경우에 있어서, 본 발명의 조성물에는 선택적으로 PEG 화된 인슐린이 포함된다, 즉 생성 콘쥬게이트는 PEG 화의 위치 및 정도에 있어 본질적으로 균일하다. 즉, 아미노기의 부위 선택적 또는 부위 지정 PEG 화는 주로 목적하는 표적 위치, 예컨대 PheB1 가 부착된 PEG 잔기를 갖는 인슐린 콘쥬게이트 조성물을 만들 것이다. PEG 화의 목적 부위에 따라, 인슐린 분자 내의 비표적 반응성 부위의 PEG 화를 예방하기 위해, 예컨대 t-BOC (tert-부톡시카르보닐) 또는 디-BOC (디-부톡시카르보닐) 과 같은 보호기의 사용에 의한 보호/탈보호 합성 전략이 필요할 수 있다. 기타 적합한 아미노 보호기에는 카르보벤족시 (CBZ), 트리틸 유도체, 예컨대 트리틸 (Tr), 디메톡시트리틸 (DMTr) 등이 포함된다. 기타 보호기, 예컨대 환형 디아실기 또는 니트로페닐술페닐 (Nps) 도 또한 아미노 관능의 보호를 위해 유용하게 나타날 수 있다. 5K-PEG-인슐린 조성물의 예시적인 부위-지정 합성은 실시예 1 및 2 에 제공된다.
본 발명의 인슐린 콘쥬게이트를 제공하기 위해 사용되는 상기 부위 지정 커플링 화학으로 인슐린 분자 상의 특정 반응성 부위 상에 큰 치환도를 갖는 조성물이 얻어진다. 필요하다면, 상기 조성물을 더욱 정제하여, 본질적으로 순수한 단일- 또는 2-관능성 PEG-인슐린 조성물을 제공할 수 있다.
본질적으로 순수한 PEG-인슐린 조성물이란 임의의 하기 분석 방법 중 하나에 의해, 약 90% 이상 순수한, 바람직하게는 약 95% 이상 순수한 PEG-인슐린 콘쥬게이트를 포함하는 것을 나타낸다. 이와 관련하여, 순도는 PEG-인슐린 콘쥬게이트 함량을 나타낸다. 즉, 약 90% 이상 순수한 PEG-인슐린 콘쥬게이트는 약 90 중량% 이상의 PEG-인슐린 콘쥬게이트종을 포함하는 반면, 다르게는 PEG-인슐린 콘쥬게이트가 아닌 거의 10% 의 불순물을 나타낸다. 본 발명의 PEG-인슐린 콘쥬게이트는 전형적으로 하나 이상의 정제 기법, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 역상 크로마토그래피를 이용하여 정제된다. 생성 PEG-인슐린의 전체 균일성 (존재하는 인슐린-PEG 형의 수) 은 하나 이상의 하기 방법을 이용하여 평가될 수 있다: 크로마토그래피, 전기영동, 질량 분광측정, 및 특히 MALDI-MS, 및 NMR 분광측정. 인슐린 개질 부위를 동정하기 위해 특히 유용한 하나의 방법은 엔도프로티나아제 Glu-C 를 이용하는 인간 인슐린에 대한 USP 본질 시험과 연계된, RP-HPLC 펩티드 맵핑이다 (실시예 6).
C. PEG-인슐린 콘쥬게이트의 분석
본 발명의 하나의 측면에 따라, 폐 투여에 적합한 PEG-인슐린 콘쥬게이트 조성물이 제공된다. 실시예 7 ~ 11 의 생체 내 데이타에서 알 수 있듯이, 본 발명의 PEG 인슐린 콘쥬게이트는 폐에 투여되는 경우, 천연 인슐린에 비해 개선된 약동학 및 약역학 특성을 보유한다. 인슐린은 5,000 K 이하 내지 10,000 K 이상의 분자량을 갖는 PEG 로 개질될 수 있으며, 여전히 활성을 보유하는 것으로 나타났다. 대표적 PEG-인슐린 콘쥬게이트인 5K-PEG-인슐린의 활성을 실시예 7 에 나타낸다.
추가적으로, 본원에서 제공되는 실시예에서 알 수 있듯이, 평균 분자량 750 달톤 내지 2,000 달톤, 5,000 달톤 범위 까지의 PEG 사슬을 보유하는 예시적인 PEG-인슐린 콘쥬게이트는 폐로 및 정맥내 투여되는 경우 생활성이며, 검출 가능한 혈청 인슐린 수준에서 확인되듯이 폐에 투여되는 경우 폐 내에 실질적으로 포획되지 않고, 글루코오스를 실질적인 억제하는데 효과적이며 (실시예 7 내지 11), 이는 일부 경우 천연 인슐린에서 관찰되는 것보다 유의미하게 더 긴 시간 동안에 걸친다. 또한, 본원에는 폐에 투여되는 경우, 빠른 작용 개시 (투여 1 시간 이내) 를 나타내는 PEG-인슐린 콘쥬게이트가 제공된다. 본 발명의 예시적인 PEG-인슐린 조성물에 대한 약동학 및 약역학 파라미터의 요약은 표 13 에 제공된다.
일반적으로, 본 발명의 PEG-인슐린 조성물은 하나 이상의 하기 특징을 보유할 것이다. 본 발명의 PEG-인슐린 콘쥬게이트는 적어도 측정가능한 정도의 비활성을 유지할 것이다. 즉, 본 발명에 따른 PEG-인슐린 콘쥬게이트는 천연 인슐린의 비활성의 약 2% 내지 약 100% 이상 중 임의% 를 보유할 것이다. 본 발명의 하나의 바람직한 구현예에 있어서, PEG-인슐린 콘쥬게이트는 비개질된 천연 인슐린의 생물학적 활성의 10% 이상을 보유할 것이며, 실질적으로 비면역원성이다. 바람직하게는, 본 발명의 콘쥬게이트의 생활성은 천연 인슐린의 생활성의 약 5% 내지 약 20% 이상 범위일 것이다. 본 발명의 콘쥬게이트의 생활성은 간접적으로, 예컨대 혈중 글루코오스 및 인슐린 수준을 모니터링하여 대응 약역학 및/또는 약동학 데이타를 생성함으로써, 또는 RIA (방사면역분석) 에 의해 분석될 수 있다.
예컨대 폐로의, PEG-인슐린 콘쥬게이트의 투여 후 혈청 인슐린 농도에 있어서, 본원에 기재된 콘쥬게이트는 전형적으로 투여 후 약 2 내지 8 시간에 피크를 이루고 (즉, 농도 곡선에서 Cmax 또는 최고점에 도달함), 보다 전형적으로 약 3 내지 6 시간에 피크를 이룰 것이다. 또한, 본 발명의 화학적으로 개질된 인슐린, 특히 본원에 제공되는 지효성 인슐린 제형물은 천연 인슐린보다 장기간에 걸쳐 측정가능한 글루코오스 저하 효과 및 인슐린의 농도 유지를 둘 다 제공하는데 효과적이다. 보다 구체적으로, 폐에 투여되는 경우 PEG-인슐린 콘쥬게이트는 투여 후 약 6 시간 이상, 바람직하게는 8 시간 이상 상승된 인슐린 수준을 나타낼 것이다 (기저 또는 기준선 수준에 비해 상승됨). 바람직하게는, PEG-인슐린 콘쥬게이트는 폐에 투여되는 경우, 투여 후 9 시간, 10 시간, 12 시간 이상 또는 14 시간 이상 연장된 기간에 걸쳐 혈중 인슐린 수준을 상승시키며, 여기서 인슐린 콘쥬게이트의 기저 초과 수준은 투여 후 연장된 기간 동안 혈류에서 측정가능하다. 상기 특징을 나타내는 대표적 조성물이 실시예들에 제공된다.
상술된 바와 같이, 본 발명의 인슐린 콘쥬게이트는 혈중 글루코오스 수준을 저하시키는데 효과적이다. 이제, 혈중 글루코오스를 억제하는 본 발명의 조성물의 능력에 있어서, PEG 인슐린 콘쥬게이트는 예컨대 폐에 투여되는 경우, 투여 후 6 시간 이상 동안 기저 수준 미만으로 혈중 글루코오스 수준을 억제하는데 효과적이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 PEG-인슐린 조성물은 투여 후 8 시간 이상, 바람직하게는 10 시간 이상, 또는 보다 바람직하게는 12 시간 이상 기준선 미만으로 혈중 글루코오스 수준을 억제하는데 효과적이다.
또한, 본 발명의 PEG-인슐린 제형물은 천연 인슐린에 비해 개선된 절대 폐 생체이용률을 나타낸다. 구체적으로, 본원에서 제공되는 바와 같은 PEG-인슐린 제형물은 천연 인슐린에 비해 약 1.2 배 이상인, 바람직하게는 천연 인슐린에 비해 약 1.5 배 이상인, 보다 바람직하게는 천연 인슐린에 비해 약 2 배 이상인, 더욱 바람직하게는 천연 인슐린에 비해 약 2.5 또는 3 배 이상인 절대 폐 생체이용률을 보유한다. (예시적 결과가 표 13 에 제공된다).
III. 제형물
본 발명의 중합체-인슐린 콘쥬게이트 조성물은 특정 투여 방식 및 투여형에 따라, 추가적 부형제, 용매, 안정화제 등을 함유하는 치료적/약학 조성물 중에, 또는 순수하게 투여될 수 있다. 본 발명의 콘쥬게이트는 경구적으로 뿐만 아니라 비경구적으로 투여될 수 있다. 특이적 투여 경로에는 경구, 직장, 협측, 국소, 비강, 안과적, 피하, 근육내, 정맥내, 경피 및 폐가 포함된다. 비경구 및 폐 투여가 가장 바람직하다.
포유류, 바람직하게는 인간 투여를 위한 약학 제형물은 구체적으로 폐 조성물에 대해, 하기에 더욱 상세히 기재될 것과 같이, 전형적으로 하나 이상의 본 발명의 PEG-인슐린 콘쥬게이트를 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 함유할 것이다. 예컨대 비경구 투여용인, 본 발명의 제형물은 가장 전형적으로 액체 용액 또는 현탁액인 반면, 폐 투여용 흡입가능한 제형물은 일반적으로 액체 또는 분말이며, 분말 제형물이 일반적으로 바람직하다. 추가적인 (그러나 덜 바람직한) 본 발명의 화학적으로 개질된 인슐린 조성물에는 시럽, 크림, 연고, 정제 등이 포함된다.
제형물 및 해당 인슐린 용량은 사용되는 인슐린의 농도 생활성에 따라 다양할 것이다. 주사가능한 인슐린은 USP 인슐린 단위 및 USP 인슐린 인간 단위 (U) 로 측정되며; 인슐린 1 단위는 절식 토끼에서 혈중 글루코오스 농도를 45 mg/㎗ (2.5 mM) 로 감소시키는데 필요한 양과 같다. 주사용 인슐린 제제의 전형적인 농도는 30 ~ 100 단위/㎖ 범위이며, 이는 ㎖ 당 약 3.6 mg 인슐린이다. 환자에서 목적하는 생리학적 효과를 달성하기 위해 필요한 인슐린 양은 특정 환자 및 그의 질환 (예컨대 제 I 형 대 제 II 형 당뇨병) 뿐만 아니라, 사용되는 인슐린의 강도 및 특정 유형에 따라 다양할 것이다. 예를 들어, 표준 인슐린 (속효성) 용 투여 범위는 1 일 당 체중 1 kg 당, 약 2 내지 0.3 U 인슐린이다. 하나의 측면에 있어서, 본 발명의 조성물은 치료중인 환자에게 절식 혈중 글루코오스 농도 약 90 내지 140 mg/㎗ 및 식후 값 약 250 mg/㎗ 미만을 달성시키는데 효과적이다. 특정 투여 경로에 대해 사용되는 정확한 인슐린-콘쥬게이트의 약역학 및 약동학과연계되는 경우, 당업자는 정확한 용량을 결정할 수 있고, 주기적인 글루코오스 모니터링에 대한 반응에 따라 쉽게 조절할 수 있다.
흡입가능한 인슐린-콘쥬게이트 제형물에 대한 개별 용량 (흡입 기준에 있어서) 은 전형적으로 약 0.5 mg 내지 15 mg 인슐린-콘쥬게이트 범위이며, 목적하는 전체 투여량은 전형적으로 약 1 ~ 10 회 호흡, 바람직하게는 약 1 내지 4 회 호흡에 의해 달성된다. 평균적으로, 투여 기간 당 흡입에 의해 투여되는 PEG-인슐린의 총 용량은, 약 5U 내지 400 U 을 포함하는 각각의 개별 용량 또는 단위 투여형 (단일 흡입에 해당) 으로, 약 10U 내지 약 400U 범위일 것이다.
A. 화학적으로 개질된 인슐린의 흡입가능한 제형물
상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 인슐린 콘쥬게이트에 대한 투여의 하나의 바람직한 경로는 폐로의 흡입에 의한 것이다. 특정 제형물 성분, 특징 및 전달 장치를 이제 더욱 자세히 설명할 것이다.
제형물 중 인슐린 콘쥬게이트의 양은 천연 인슐린의 하나 이상의 치료적 효과, 즉 혈중 글루코오스 수준을 거의 정상혈당증으로 조절하는 능력을 달성하기 위한 단위 용량 당 인슐린의 치료적 유효량을 전달하는데 필요한 양일 것이다. 실제로, 이는 특정 인슐린 콘쥬게이트, 그 활성, 치료될 당뇨병 상태의 중증도, 환자군, 제형물의 안정성 등에 따라 매우 다양할 것이다. 조성물은 일반적으로 약 1 중량% 내지 약 99 중량% 의 PEG-인슐린, 전형적으로 약 2 중량% 내지 약 95 중량% 의 콘쥬게이트, 보다 전형적으로 약 5 중량% 내지 85 중량% 의 콘쥬게이트 중 어느 하나를 포함할 것이며, 또한 조성물에 함유되는 부형제/첨가제의 상대량에근거할 것이다. 보다 구체적으로, 조성물은 전형적으로 하나 이상의 하기 PEG-인슐린 백분율을 포함할 것이다: 10 중량%, 20 중량%, 30 중량%, 40 중량%, 50 중량%, 60 중량%, 70 중량%, 80 중량%, 90 중량% 또는 그 이상. 바람직하게는, 분말 조성물은 약 60 중량% 이상, 예컨대 약 60 ~ 100 중량% 의 PEG-인슐린을 포함할 것이다. 하나 초과의 인슐린이 본원에 기재된 제형물 내에 혼입될 수 있으며, "제제" 또는 "인슐린" 이라는 용어는 둘 이상의 인슐린, 또는 또다른 활성제와 인슐린의 배합의 사용을 배제하는 것이 아님이 이해되어야 한다. (예를 들어, 예시적인 PEG-인슐린 제형물은 또한 천연 인슐린을 함유할 수 있다).
A.1. 부형제
대부분의 경우, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 부형제를 포함할 것이다. 다른 부형제 또는 첨가제와 배합되거나 단독의 탄수화물 부형제가 바람직하다. 본 발명의 조성물에 사용하기 위한 대표적인 탄수화물에는 당, 유도체화 당, 예컨대 알디톨, 알돈산, 에스테르화당, 및 당 중합체가 포함된다. 본 발명에 사용하기 위해 적합한 예시적인 탄수화물 부형제에는, 예를 들어 단당류, 예컨대 프룩토오스, 말토오스, 갈락토오스, 글루코오스, D-만노오스, 소르보오스 등; 이당류, 예컨대 락토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 셀로바이오스 등; 다당류, 예컨대 라피노오스, 멜레지토오스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 및 알디톨, 예컨대 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨 소르비톨 (글루시톨), 피라노실 소르비톨, 미오이노시톨 등이 포함된다. 비환원 당, 인슐린 콘쥬게이트와 배합되는 경우 실질적으로 건조 비정질 또는 유리상을 형성할 수 있는 당, 및 비교적 높은Tg (예컨대, 40℃ 초과, 바람직하게는 50℃ 초과, 보다 바람직하게는 60℃ 초과, 더욱 바람직하게는 70℃ 초과, 가장 바람직하게는 80℃ 이상의 Tg) 를 보유한 당이 바람직하다.
추가적 부형제에는 아미노산, 펩티드, 구체적으로 2 ~ 9 개 아미노산, 보다 바람직하게는 2 ~ 5 머를 포함하는 올리고머, 및 폴리펩티드가 포함되며, 이들 모두 동종 또는 이종일 수 있다. 대표적인 아미노산에는 글리신 (gly), 알라닌 (ala), 발린 (val), 류신 (leu), 이소류신 (ile), 메티오닌 (met), 프롤린 (pro), 페닐알라닌 (phe), 트립토판 (trp), 세린 (ser), 트레오닌 (thr), 시스테인 (cys), 티로신 (tyr), 아스파라긴 (asp), 글루탐산 (glu), 라이신 (lys), 아르기닌 (arg), 히스티딘 (his), 노르류신 (nor) 및 이들의 개질형이 포함된다. 특히 바람직한 하나의 아미노산은 류신이다.
흡입가능한 조성물 중 부형제로서 사용하기 위해, 본원에 그 전문이 참고문헌으로 도입된 Inhale Therapeutic System 의 국제 특허 출원 PCT/US00/09785 에 기재된 바와 같은 2 개 이상의 류실 잔기를 포함하는 디- 및 트리-펩티드가 또한 바람직하다.
약 40℃ 초과, 보다 바람직하게는 50℃ 초과, 더욱 바람직하게는 60℃ 초과, 가장 바람직하게는 70℃ 초과의 유리 전이 온도를 갖는 디- 및 트리-펩티드도 또한 바람직하다.
이들의 제한된 수용성으로 인해 덜 바람직하지만, 본 발명에 사용하기 위한 추가적인 안정성- 및 에어로졸 성능-개선 펩티드는 상기 기재된 바와 같은 임의의아미노산 조합을 포함하는 4-머 및 5-머이다. 보다 바람직하게는, 4-머 또는 5-머는 2 개 이상의 류신 잔기를 포함할 것이다. 류신 잔기는 펩티드 내 임의의 위치를 점유할 수 있지만, 나머지 (즉, 비-류신) 아미노산 위치는 생성 4-머 또는 5-머가 약 1 mg/㎖ 이상의 수용성을 갖는 한, 상기 기재된 바와 같은 임의 아미노산에 의해 점유될 수 있다. 바람직하게는, 4-머 또는 5-머 중 비-류신 아미노산은 수중 펩티드의 용해도를 증가시키기 위해, 친수성 아미노산, 예컨대 라이신이다.
폴리아미노산, 특히 본원에 기재된 임의의 아미노산을 포함하는 것들이 또한 안정화제로서 사용하기 위해 적합하다. 폴리아미노산, 예컨대 폴리-라이신, 폴리-글루탐산 및 폴리(lys, ala) 가 바람직하다.
본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 추가적 부형제 및 첨가제에는 하기가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다: 단독으로 또는 배합되어 존재할 수 있는, 단백질, 비생물학적 중합체, 및 생물학적 중합체. 적합한 부형제는 Inhale Therapeutic Systems 의 국제 공보 WO 96/32096 및 98/16205 에 제공되는 것들이다. 약 35℃ 초과, 바람직하게는 약 40℃ 초과, 보다 바람직하게는 45℃ 초과, 가장 바람직하게는 약 55℃ 초과의 유리 전이 온도 (Tg) 를 갖는 부형제가 바람직하다.
예시적인 단백질 부형제에는 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민 (HSA), 재조합 인간 알부민 (rHA), 젤라틴, 카제인, 헤모글로빈 등이 포함된다. 조성물은 또한 전형적으로 (반드시는 아님) 유기산 또는 염기로부터 제조된 염인 완충제 또는 pH 조절제를 포함할 수 있다. 대표적인 완충제에는 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 카르본산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산 또는 프탈산의 유기산 염이 포함된다. 기타 적합한 완충제에는 Tris, 트로메타민 히드로클로라이드, 보레이트, 글리세롤 포스페이트 및 포스페이트가 포함된다. 아미노산, 예컨대 글리신도 또한 적합하다.
본 발명의 조성물은 또한 추가적 중합체성 부형제/첨가제, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈, 유도체화 셀룰로오스, 예컨대 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 및 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 피콜 (Ficoll, 중합체성 당), 히드록시에틸전분 (HES), 덱스트레이트 (예컨대, 시클로덱스트린, 예컨대 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린 및 술포부틸에테르-β-시클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 및 펙틴을 포함할 수 있다.
조성물은 추가로 항료, 미각 차폐제, 무기 염 (예컨대, 염화나트륨), 항균제 (예컨대, 벤잘코늄 클로라이드), 감미제, 항산화제, 정전기 방지제, 계면활성제 (예컨대, 폴리소르베이트, 예컨대 "TWEEN 20" 및 "TWEEN 80", 및 BASF 에서 시판되는 플루로닉 (pluronic), 예컨대 F68 및 F88), 소르비탄 에스테르, 지질 (예컨대, 인지질, 예컨대 레시틴 및 기타 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 (바람직하게는 리포좀형이 아님)), 지방산 및 지방 에스테르, 스테로이드 (예컨대, 콜레스테롤), 및 킬레이트화제 (예컨대, EDTA, 아연 및 기타 상기 적합한 양이온) 를 포함할 수 있다. 천공 마이크로구조 (즉 속이 빈, 다공성 마이크로스피어) 의 제조를 위한 특정 2 치환 포스파티딜콜린의 이용을 하기에 더욱 상세히 설명한다.본 발명에 따른 조성물에 사용하기에 적합한 기타 약학 부형제 및/또는 첨가제는 ["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19 판, Williams & Williams, (1995)] 및 ["Physician's Desk Reference", 52 판, Medical Economics, Montvale, NJ (1998)] 에 기재되어 있다.
하나의 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 조성물에는 종종 상당한 흡수 증강을 제공하기 위해 필요한, 자극을 일으킬 수 있고 고수준에서 독성을 갖는 침투 증강제가 없을 수 있다. 본 발명의 조성물에 존재하지 않을 수 있는 특이적 증강제는 세제 유사 증강제, 예컨대 데옥시콜레이트, 라우레트-9, DDPC, 글리코콜레이트 및 푸시데이트이다. 그러나, 특정 증강제, 예컨대 효소 분해로부터 인슐린을 보호하는 것들, 예컨대 프로테아제 및 펩티다아제 억제제, 예컨대 알파-1 안티프로테아제, 캅트로프릴, 티오르판, 및 HIV 프로테아제 억제제는 본 발명의 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 PEG-인슐린 제형물 중에 혼입될 수 있다. 또다른 구현예에 있어서, 본 발명의 PEG-인슐린 콘쥬게이트에는 리포좀, 지질 매트리스 및 캡슐화제가 존재하지 않을 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 약학 조성물은 약 1 중량% 내지 약 99 중량% 의 부형제, 바람직하게는 약 5 중량% ~ 98 중량% 의 부형제, 보다 바람직하게는 약 15 ~ 95 중량% 의 부형제를 포함할 것이다. 더욱 바람직하게는, 분무 건조된 조성물은 약 0 ~ 50 중량% 의 부형제, 보다 바람직하게는 0 ~ 40 중량% 의 부형제를 포함할 것이다. 일반적으로, 최종 약학 조성물 중에서 높은 인슐린 농도가 바람직하다. 전형적으로, 부형제/첨가제의 최적량은 실험적으로, 즉 다양한 양의 부형제 (낮은 양 ~ 높은 양 범위) 를 함유하는 조성물을 제조하고, PEG-인슐린의 화학적 및 물리적 안정성, MMAD 및 약학 조성물의 분산성을 조사한 후, 인슐린 안정성에 유의미한 역효과를 갖지 않으면서 최적 에어로졸 성능이 달성되는 범위를 더욱 조사하여 결정된다.
A.2. 건조 분말의 제조
PEG-인슐린 콘쥬게이트를 포함하는 본 발명의 건조 분말 제형물은 임의 수의 건조 기법에 의해, 바람직하게는 분무 건조에 의해 제조될 수 있다. 제형물의 분무 건조는, 예를 들어 일반적으로 그 내용이 본원에 참고문헌으로 도입된 ["Spray Drying Handbook", 5 판, K. Masters, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1991)], 및 Platz, R. 등의 국제 특허 공보 WO 97/41833 (1997) 및 WO 96/32149 (1996) 에 기재된 바와 같이 수행된다.
PEG-인슐린 콘쥬게이트의 용액은 종래 분무 건조기, 예컨대 Niro A/S (Denmark), Buchi (Switzerland) 등과 같은 상업적 공급자로부터 시판되는 것에서 분무 건조되어, 분산가능한 건조 분말이 생성된다. PEG-인슐린 용액의 분무 건조를 위한 최적 조건은 제형물 성분에 따라 상이할 것이며, 일반적으로 실험적으로 결정된다. 물질의 분무 건조에 사용되는 기체는 전형적으로 공기이지만, 불활성 기체, 예컨대 질소 또는 아르곤도 또한 적합하다.
또한, 분무된 물질의 건조에 사용되는 기체의 입구 및 출구 둘 다의 온도는 분무된 물질 중에서 PEG-인슐린의 분해를 일으키지 않는 정도이다. 상기 온도는 전형적으로 실험적으로 결정되지만, 일반적으로 입구 온도는 약 50℃ 내지 약200℃ 범위인 반면, 출구 온도는 약 30℃ 내지 약 150℃ 범위일 것이다. 바람직한 파라미터에는 약 20 ~ 150 psi, 바람직하게는 약 30 ~ 40 내지 100 psi 범위의 분무 작용압이 포함된다. 전형적으로 사용되는 분무 작용압은 하기 (psi) 중 하나일 것이다: 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 또는 그 이상.
본원에 기재된 특징을 갖는 호흡가능한 PEG-인슐린 조성물은 또한 그 전문이 본원에 참고문헌으로 도입된 WO 99/16419 에 기재된 바와 같은 천공화 마이크로구조 분말을 형성시키는 특정 제형물 성분의 건조에 의해 제조될 수 있다. 천공화 마이크로구조 분말은 전형적으로 큰 내부 공극을 정의하는 비교적 얇은 다공성 벽을 갖는, 분무 건조되고 속이 빈 마이크로스피어를 포함한다. 천공화 마이크로구조 분말은 선택된 현탁 매질 (예컨대 비수성 및/또는 플루오르화 취입제) 중에 분산되어, 건조 전에 안정화된 분산액을 제공할 수 있다. 비교적 저밀도의 천공화 (또는 다공성) 마이크로구조 또는 마이크로입자의 사용은 입자 간 인력을 유의미하게 감소시켜, 전단력을 감소시키고, 생성 분말의 유동성 및 분산성을 증가시키며, 이들의 안정화된 분산의 응집, 침강 또는 크림화에 의한 분해를 감소시킨다.
대안적으로, 폐 전달용 PEG-인슐린 조성물은 미국 특허 제 6,136,295 호에 기재된 바와 같은 공기역학적으로 가벼운 입자를 포함할 수 있다.
본 발명의 분말화 제형물은 또한 동결건조, 진공 건조, 분무 냉동 건조, 초임계 플루이드 가공 (예컨대 Hanna 등의 미국 특허 제 6,063,138 호에 기재된 바와 같이), 대기 건조, 또는 기타 증발 건조 형태에 의해 제조될 수 있다.
또다른 접근법에 있어서, 건조 분말은, 예컨대 본원에 참고문헌으로 도입된Ahlneck, C. 등의 국제 PCT 공보 WO 95/09616, 1995 에 기재된 바와 같이, 분말 성분을 응집시키고, 물질을 체질하여 응집물을 수득하고, 구화시켜 보다 구형인 응집물을 제공하고, 크기분류하여 균일한 크기의 산물을 수득함으로써 제조될 수 있다.
건조 분말은 또한 건조 분말형 중 제형물 성분을 배합, 연마, 체질 또는 제트 분쇄하여 제조될 수 있다.
일단 형성되면, 건조 분말 조성물은 바람직하게는 제조, 가공 및 저장 도중 건조 (즉 상대적 저습도) 조건 하에서 유지된다. 사용되는 건조 방법과 무관하게, 상기 방법은 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 화학적으로 개질된 인슐린을 포함하는 흡입가능한, 고분산성 입자를 만들 것이다.
A.3. 건조 분말 제형물의 특징
본 발명의 분말은 여러 특징, 가장 현저하게는 하기 하나 이상을 특징으로 한다: (i) 저장 시에도 유지되는 일관된 고분산성 (ii) 작은 공기역학적 입자 크기 (MMAD), (iii) 모두 전신 순환계로의 전달을 위한 하부 기관도 (즉, 폐포) 조직으로의 개선된 분말 침투능에 기여하는, 개선된 미립자 용량값, 즉 3.3 미크론 MMAD 미만 크기의 높은 입자 백분율을 갖는 분말. 이하에 보다 자세히 기재될, 본 발명의 흡입가능한 분말의 상기 물리적 특징은 상기 분말의 심폐로의 에어로졸화된 전달의 효율 최대화에 중요하다.
본 발명의 건조 분말은 폐로의 침투에 효과적인 에어로졸화 입자로 이루어진다. 본 발명의 입자는 약 20 ~ 30 ㎛ 미만, 20 ㎛ 미만, 또는 약 10 ㎛ 미만, 바람직하게는 약 7.5 ㎛ 미만, 보다 바람직하게는 약 4 ㎛ 미만, 더욱 바람직하게는 약 3.5 ㎛ 미만의 질량 중앙값 직경 (MMD) 을 가지며, 통상 0.1 ㎛ 내지 5 ㎛ 직경 범위이다. 바람직한 분말은 약 0.2 내지 4.0 ㎛ 의 MMD 를 갖는 입자로 이루어진다. 일부 경우에 있어서, 분말은 또한 호흡불가능한 담체 입자, 예컨대 락토오스를 포함할 것이며, 여기서 호흡불가능한 입자는 전형적으로 약 40 미크론 초과 크기이다.
본 발명의 분말은 추가로 약 10 ㎛ 미만의 질량 중앙값 공기역학 직경 (MMAD), 바람직하게는 약 5 ㎛ 미만, 보다 바람직하게는 4.0 ㎛ 미만, 더욱 바람직하게는 3.5 ㎛ 미만, 가장 바람직하게는 3 ㎛ 미만의 MMAD 를 갖는 에어로졸 입자 크기 분포를 특징으로 한다. 분말의 질량 중앙값 공기역학 직경은 특징적으로 약 0.1 ~ 10 ㎛, 바람직하게는 약 0.2 ~ 5.0 ㎛ MMAD, 보다 바람직하게는 약 1.0 ~ 4.0 ㎛ MMAD, 더욱 바람직하게는 약 1.5 내지 3.0 ㎛ 범위일 것이다. 작은 공기역학 직경은 일반적으로 최적화 분무 건조 조건 및 부형제의 선택 및 농도의 조합에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 PEG-인슐린 분말은 추가로 이들의 밀도를 특징으로 할 수 있다. 흡입용 분말화 조성물은 일반적으로 약 0.1 내지 10 g/㎠, 바람직하게는 약 0.1 ~ 2 g/㎠, 보다 바람직하게는 약 0.15 ~ 1.5 g/㎠ 의 벌크 밀도를 보유할 것이다.
분말은 일반적으로 약 20 중량% 미만, 통상적으로 약 10 중량% 미만, 바람직하게는 약 5 중량% 미만의 수분 함량을 가질 것이다. 하나 이상의 하기 중량 백분율 미만인 수분 함량을 갖는 본 발명에 따른 분말이 바람직하다: 15%, 10%, 7%, 5%, 또는 3%. 상기 저수분 함유 고체는 포장 및 저장 시 더 높은 안정성을나타내는 경향이 있다.
추가적으로, 본원에 기재된 분무 건조 방법 및 안정화제는 고분산성 PEG-인슐린 제형물을 제공하는데 효과적이다. 분말 제형물에 있어서, 상기 분말의 방출 용량 (ED) 은 전형적으로 30% 초과, 통상 40% 초과이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 분말의 ED 는 50% 초과이며, 종종 60% 초과이다.
본원에 기재되는 조성물은 또한 화학적 안정성 및 물리적 안정성 둘 다에 대해 우수한 안정성, 즉 시간에 따른 에어로졸 성능을 보유한다. 일반적으로, 화학적 안정성에 대해서, 제형물 중에 포함되는 PEG-인슐린 콘쥬게이트는 분무 건조 시 약 15% 이하로 분해될 것이다. 즉, 분말은 약 85% 이상의 손상되지 않은 PEG-인슐린 콘쥬게이트, 바람직하게는 약 90 또는 95% 이상의 손상되지 않은 콘쥬게이트를 보유할 것이며, 더욱 바람직하게는 약 97% 이상의 손상되지 않은 PEG-인슐린을 포함할 것이다. 바람직하게는, 분무 건조 방법으로 약 10% 미만의 총 단백질 응집물을 갖는 분말, 즉 90 중량% 초과의 화학적으로 개질된 인슐린이 단량체 형태인 분말이 얻어질 것이다.
에어로졸 성능에 있어서, 본 발명의 조성물은 일반적으로 3 달 기간 동안 주위 조건 하에서 저장되는 경우, 약 20% 이하, 바람직하게는 약 15% 이하, 더욱 바람직하게는 약 10% 이하의 방출 용량 감소를 특징으로 한다.
A.4. 조성물의 투여
본원에 기재된 바와 같은 PEG-인슐린 제형물은 임의의 적합한 건조 분말 흡입기 (DPI), 즉 건조 분말 약물을 폐로 수송하기 위한 비히클로서 환자의 흡입 호흡을 이용하는 흡입기 장치를 사용하여 전달될 수 있다. 본원에 참고문헌으로 도입된, Patton, J.S. 등의 미국 특허 제 5,458,135 호, Oct. 17, 1995; Smith, A. E. 등의 미국 특허 제 5,740,794 호, Apr. 21, 1998; 및 Smith, A. E. 등의 미국 특허 제 5,785,049 호, July 28, 1998 에 기재된 바와 같은 Inhale Therapeutic Systems 의 건조 분말 흡입 장치가 바람직하다. 상기 유형의 장치를 사용하여 투여되는 경우, 분말화 약제는 구멍을 낼 수 있는 뚜껑 또는 기타 접근 표면을 갖는 저장소, 바람직하게는 블리스터 (blister) 패키지 또는 카트리지 중에 포함되며, 저장소는 단회 투여 단위 또는 다회 투여 단위를 포함할 수 있다. 건조 분말 약제의 계량 용량으로 다수의 공동 (즉, 단위 용량 패키지) 을 채우기 위해 편리한 방법은, 예컨대 본원에 참고문헌으로 도입된 Parks, D. J. 등의 국제 특허 공보 WO 97/41031, Nov. 6, 1997 에 기재되어 있다.
건조 분말의 폐 투여를 위한 기타 건조 분말 분산 장치에는, 예를 들어 본원에 참고문헌으로 도입된 Newell, R. E. 등의 유럽 특허 제 EP 129985 호, Sept. 7, 1988; Hodson, P. D. 등의 유럽 특허 제 EP472598 호, July 3, 1996; Cocozza, S. 등의 유럽 특허 제 EP 467172 호, April 6, 1994, 및 Lloyd, L. J. 등의 미국 특허 제 5,522,385 호, June 4, 1996 에 기재된 것들이 포함된다. PEG-인슐린 건조 분말의 전달을 위해서는 Astra-Draco "TURBUHALER" 와 같은 흡입 장치가 또한 적합하다. 상기 유형의 장치는 모두가 본원에 참고문헌으로 도입된 Virtanen, R. 의 미국 특허 제 4,668,218 호, May 26, 1987; Wetterlin, K. 등의 미국 특허 제 4,667,668 호, May 26, 1987; 및 Wetterlin, K. 등의 미국 특허 제 4,805,811 호,Feb. 21, 1989 에 상세히 기재되어 있다. 기타 적합한 장치에는 건조 분말 흡입기, 예컨대 Rotahaler(Glaxo), Discus(Glaxo), SpirosTM흡입기 (Dura Pharmaceuticals), 및 Spinhaler(Fisons) 가 포함된다. 또한, 본원에 참고문헌으로 도입된 Mulhauser, P. 등의 미국 특허 제 5,388,572 호, Sept. 30, 1997 에 기재된 바와 같은, 분말화 약제를 혼입하거나, 공기를 스크린을 통해 통과시켜 담체 스크린으로부터 약제를 리프팅하거나, 혼합 챔버 내에서 분말 약제와 대기를 혼합한 후 장치의 마우스피스를 통해 환자에게 분말을 도입시키기 위해 피스톨을 이용하는 장치가 적합하다.
흡입가능한 PEG-인슐린 조성물은 또한 둘다 본원에 참고문헌으로 도입된 Laube 등의 미국 특허 제 5,320,094 호, June 14, 1994, 및 Rubsamen, R. M. 등의 미국 특허 제 5,672,581 호 (1994) 에 기재된 바와 같이, 약학적으로 불활성인 액체 추진제, 예컨대 클로로플루오로카본 또는 플루오로탄소 중에 약물의 용액 또는 현탁액을 포함하는 가압화 계량 용량 흡입기 (MDI), 예컨대 Ventolin계량 용량 흡입기를 이용하여 전달될 수 있다.
대안적으로, 본원에 기재되는 PEG-인슐린은 용매, 예컨대 물 또는 식염수 중에 용해되거나 분산되어 분무화에 의해 투여될 수 있다. 에어로졸화된 용액의 전달을 위한 분무기에는 AERxTM(Aradigm), Ultravent(Mallinkrodt), Pari LC PlusTM또는 Pari LC StarTM(Pari GmbH, Germany), DeVilbiss Pulmo-Aide, 및 AcornII(Marquest Medical Products) 가 포함된다.
상술된 바와 같이, 본원에 기재된 PEG-인슐린 콘쥬게이트는 또한 정맥내 주사, 또는 덜 바람직하게는 근육내 또는 피하 주사에 의해, 비경구적으로 투여될 수 있다. 상기 제형물의 정확한 성분은 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 비경구 투여를 위해 적합한 제형물 유형에는 즉시 사용가능한 용액, 사용 전에 용매와 조합되는 건조 분말, 즉시 주사가능한 현탁액, 사용 전 비히클과 조합되는 건조 불용성 조성물, 투여 전 희석되는 에멀젼 및 액체 농축액이 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 PEG-인슐린 조성물의 주사가능한 용액은 수성 비히클, 예컨대 수성 염화나트륨, 링거액, 덱스트로오스-주사 용액, 락테이트화 링거액 등 중에 용해된 조성물을 포함할 수 있으며, 상술된 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 상용성 부형제 또는 첨가제를 포함할 수 있다.
IV. 용도
본 발명의 조성물은 임의의 적합한 투여 경로, 바람직하게는 흡입 또는 주사에 의해 당뇨병, 특히 제 I 형 또는 제 II 형 당뇨병의 치료를 위해, 포유류 대상체에게 치료적 유효량으로 투여되는 경우 유용하다.
본원에서 참고되는 모든 기사, 서적, 특허 및 기타 공보는 본원에 그 전문이 참고문헌으로 도입된다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하지만, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
물질 및 방법
폴리에틸렌 글리콜 시약은 Shearwater Corporation (Huntsville, Alabama) 에서 입수하였다.
인간 인슐린은 Diosynth, Inc. 에서 입수하였다.
실시예 1
디-NαA1,NεB29-t-Boc-인슐린의 합성
주로 모노-PEG 화 인슐린으로 이루어진 조성물을 예시적인 선형 5,000 달톤 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여, 실시예 1 및 2 에 나타낸 바와 같이 부위 특이적 방식으로 제조하였다.
먼저 2 (Di)-보호된 인슐린을 하기와 같이 제조하였다. 602 mg 의 인간 인슐린 (0.103 mmol) 을 166 ㎕ 의 트리에틸아민을 포함하는 3.0 ㎖ 의 무수 디메틸 술폭시드 (DMSO) 중에 용해시켰다. 50 ㎕ 의 디-tert-부틸디카르보네이트 (0.215 mmol) 를 인슐린 용액에 첨가하였다. 실온에서 60 분 후, 반응 용액을 240 ㎖ 의 아세톤에 부은 뒤 3 방울의 6 M HCl 을 첨가하여 응집을 개시하였다. 침전물을 여과에 의해 단리하고 진공 건조하였다. 반응 생성물을 Waters 25 ×lOOmm C18 칼럼 (평균 입자 크기 15㎛; 포어 크기 100A) 을 이용하여 분취 HPLC 로 정제하였다. 탈이온수 중 0.1% TFA 및 아세토니트릴의 혼합물을 용출액으로서 3.0 ㎖/분의 속도로 사용하였다. 생성물을 수집하고 증류하여 아세토니트릴을 제거한 후 동결건조하였다. 수율은 164.8 mg 였다 (26.7%, MALDI 에 의한 MW ~6000).
실시예 2
모노-PEG 화 mPEG-5K-SPA-PheB1-인슐린 콘쥬게이트 NαB1- 메톡시폴리(에틸렌 글리콜)5K-인슐린 (mPEG5K-PheB1-인슐린) 의 합성
실시예 1 로부터의 새로 정제된 150 mg (~0.025 mmol) 의 디-NαA1,NεB29-t-Boc-인슐린을 95 ㎕ 의 트리에틸아민을 함유하는 4 ㎖ DMSO 중에 용해시켰다. 169 mg (0.032 mmol) 의 mPEG-SPA-5000 (mPEG-숙신이미딜 프로피오네이트, mPEG-O-CH2CH2C(O)O-숙신이미드, MW 5,000) 을 인슐린 용액에 첨가하였다. 실온에서 하룻밤 동안 (29 시간) 인큐베이션 후, 생성 mPEG-인슐린 유도체를 100 ㎖ 2 차 증류수로 희석하고, 4 시간 동안 2 차 증류수에 대해 투석한 후 동결건조하였다. 동결건조된 생성물을 4 ㎖ 무수 TFA 중에 재용해시키고, 0℃ N2하에서 1.5 시간 동안 유지하여 Boc 보호기를 제거하였다. 탈보호된 mPEG-인슐린을 50 ㎖ 의 2 차 증류수로 희석하고, 하룻밤 동안 0.1% NH4HC03및 2 차 증류수에 대해 투석하였다. 생성물의 동결건조로 백색 분말을 수득하였다. 수율은 117.6 mg 였다 (41.6%, MALDI 에 의한 MW ~11311.6).
질량 분광 데이타에 근거한 모노-콘쥬게이트된 인슐린의 백분율은 대략 90% 로, 상기 합성 접근법의 부위 특이적 성질이 확인되었다. 추가적 분석 데이타를 실시예 5 에 제공한다. 얻어진 생성물의 인슐린 함량은 51.3% 였다. 참조의 용이성을 위해, NαBl-메톡시폴리(에틸렌 글리콜)5K-프로피온아미도-인슐린 또는 mPEG5K-PheB1-인슐린을 본원에서 "5K PEG 인슐린" 으로 부를 것이다.
실시예 3
mPEG-2K-SPA-인슐린 콘쥬게이트의 합성
하기 접근법을 이용하여, 대략 2,000 달톤의 분자량을 갖는 예시적인 선형 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 부위 비특이적 (즉 무작위적) 방식으로 PEG 화 인슐린을 제조하였다. 0.1012 g 의 인슐린 (MW 5826 Da, 0.01737 mmol) 을 0.5 ㎖ 의 무수 DMSO 에 용해시키고, 50 ㎕ 의 트리에틸아민 (0.3587 mmol, 20 배 몰 과량) 으로 처리하였다. 상기 반응 혼합물에 52 mg 의 m-SPA-2000 (mPEG-숙신이미딜 프로피오네이트, Shearwater Corporation, MW ~2000 Da, 0.02605 mmol, 1.5 배 몰 과량) 을 첨가하였다. 혼합물을 질소 하 실온에서 약 17 시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 총 부피 5.5 ㎖ 이 되도록 0.1% TFA 중에 용해시키고, C-18 칼럼, 및 아세토니트릴/0.1% TFA 를 용출액으로서 이용하여 역상 HPLC 로 정제하였다. 역상 HPLC 에서 모노 (1 개의 PEG 가 부착된) 및 디-PEG 화 (2 개의 PEG 가 부착된) 생성물 둘 다의 혼합물이 확인되었으며; 본원에서 상기 조성물은 "2K PEG 인슐린" 으로 부른다.
수율: 68 mg
RP-HPLC 에 의한 인슐린 함량: 50.5 mg
실시예 4
mPEG-750 Da-SPA-인슐린 콘쥬게이트의 합성
B1 부위에 PEG 화된 인슐린으로 주로 이루어진 조성물을 대표적인 폴리에틸렌 글리콜 개질제, 즉 인슐린으로의 공유 부착에 적합한 숙신이미딜 프로피오네이트 말단을 갖는 선형 750 달톤 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 부위 특이적 방식으로 제조하였다.
4A. 디-NA1,NB29-t-Boc-인슐린의 합성
2-보호 인슐린을 하기와 같이 제조하였다. 602 mg 의 인간 인슐린 (0.103 mmol) 을 166 ㎕ 의 트리에틸아민을 함유하는 3.0 ㎖ 의 무수 디메틸 술폭시드 (DMSO) 중에 용해시켰다. 50 ㎕ 의 디-tert-부틸디카르보네이트 (0.215 mmol) 를 인슐린 용액에 첨가하였다. 실온에서 60 분 후, 반응 용액을 240 ㎖ 의 아세톤에 부은 뒤, 3 방울의 6 M HCl 을 첨가하여 응집을 개시하였다. 침전물을 여과에 의해 단리하고 진공 건조하였다. 반응 생성물을 Waters 25 ×lOOmm C18 칼럼 (평균 입자 크기 15㎛; 포어 크기 100Å) 을 이용하여 분취 HPLC 로 정제하였다. 탈이온수 중 0.1% TFA 및 아세토니트릴의 혼합물을 용출액으로서 3.0 ㎖/분의 속도로 사용하였다. 생성물을 수집하고 증류하여 아세토니트릴을 제거한 후 동결건조하였다. 수율은 164.8 mg 였다 (26.7%, MALDI 에 의한 MW ~6000).
4B. mPEG-750 Da-SPA-PheB1-인슐린 콘쥬게이트의 합성
실시예 4A 로부터의 새로 정제된 63.4 mg (~0.01056 mmol) 의 디-NA1,NB29-t-Boc-인슐린을 200 ㎕ 의 트리에틸아민을 함유하는 0.5 ㎖ DMSO 중에 용해시켰다. 33 mg (0.03173 mmol, mSPA750 의 MW 는 약 1040Da 이다) 의 mPEG-SPA-750 (mPEG-숙신이미딜 프로피오네이트, mPEG-O-CH2CH2C(O)O-숙신이미드, PEG MW 750) 을 인슐린 용액에 첨가하였다. 실온에서 하룻밤 동안 (29 시간) 인큐베이션 후, 300 ㎕ 의 TFA 를 반응 혼합물에 첨가하고, 생성 mPEG-인슐린 유도체를 100 ㎖ 에틸 에테르 중에 침전시켜 진공건조하였다. 수율은 약 28.5 mg 이었고, 역상 HPLC 로 측정된 인슐린 함량은 21.3 mg 이었다 (33.6%, MALDI 에 의한 MW ~6639.3 Da). 간단히, 본원에서 상기 조성물을 "750 PEG 인슐린" 으로 부른다.
상기 물질 상에, 하나의 예외를 제외하고는 상기 합성 방법을 둘 다 이용하는 상이한 합성을 수행하였다: 하나의 합성은 7:1 의 mPEG-SPA-750 대 인슐린 몰비로 수행한 반면, 다른 합성은 3:1 의 mPEG-SPA-750 대 인슐린 몰비로 수행하였다. 상기 두 가지 제조로부터 얻어지는 생성 조성물을 본원에서 "750-1 PEG 인슐린" (PEG 시약 대 인슐린의 몰비 7:1) 및 "750-2 PEG 인슐린" (PEG 시약 대 인슐린의 몰비 3:1) 로 부른다.
실시예 5
예시적인 PEG-인슐린 조성물의 분석
상술된 PEG 화 인슐린 콘쥬게이트 조성물을 다양한 분석 기법으로 추가 분석하였다.
질량 분광측정을 이용하여, 상대 피크 면적을 기준으로, 각각의 조성물 중에 존재하는 모노, 디, 및 트리-콘쥬게이트화 인슐린 (또한 PEG 인슐린 단량체, 이량체, 및 삼량체로 불림) 의 상대량 추정을 제공하였다. 결과를 하기 표 1 에 제공한다.
질량 분광측정을 기준으로 하는 모노, 디, 및 트리-콘쥬게이트화 인슐린의 상대량
PEG-인슐린 조성물 모노콘쥬게이트 % 디콘쥬게이트 % 트리콘쥬게이트 %
5K PEG 인슐린 91 4 결정안됨
750-1 PEG 인슐린 46 39 15
750-2 PEG 인슐린 60 32 8
2K PEG 인슐린 51 45 결정안됨
Waters 2690 HPLC 시스템 상에 조립된 2 개의 Shodex SEC 칼럼 (부품 번호 KW-802.5) 를 사용하여 상기 기재된 750-1,750-2 및 2K PEG-인슐린 조성물 상에서 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 를 수행하였다. 이동상은 수중 33% 아세토니트릴 (V/V) 및 22% 빙초산으로 이루어졌다. 크로마토그래피 데이타를 각각의 상기 조성물 중 모노, 디, 및 트리-콘쥬게이트화 인슐린의 상대량 결정을 위한 대안적 접근법으로 이용하였다. 결과를 하기 표 2 에 나타낸다. 표 1 및 2 에서의 데이타 비교로 알 수 있듯이, 2 개의 상이한 방법은 조성물에 존재하는 각 유형의 콘쥬게이트의 상대량에 대해 근사하게 일치하는 결과를 제공하였다.
HP-SEC 을 기준으로 하는 모노, 디, 및 트리-콘쥬게이트화 인슐린의 상대량
인슐린 유형 모노콘쥬게이트 % 디콘쥬게이트 % 트리콘쥬게이트 % 다른 것들 %
PEG750-1 48 47 5 0
PEG750-2 66 26 7 2
PEG2000 40 51 결정안됨 9
추가적 연구를 수행하여, 각각의 3 개의 예시적 조성물 중 다양한 위치 콘쥬게이트의 분포, 즉 각각의 가능한 3 개 부착 부위, A-1Gly, B-1Phe 또는 B-29Lys 에서의 치환 정도를 결정하였다. 디티오트레이톨 (DTT, Sigma) 을 사용하여, 인슐린 표본 중 디술피드 결합을 환원시키고, 인슐린 A 및 B 사슬 사이의 공유 부착을 절단시켰다.
환원 반응을 수행하기 위해, PEG-인슐린 표본을 각각의 콘쥬게이트화 종에 대해 약 0.2 mg/㎖ 의 동등 인슐린 질량으로, 0.4 M 중탄산암모늄을 함유하는 8 M 요소 중에 용해시켰다. DTT 를 물에 용해시켜 (7 mg/㎖) DTT 수용액을 형성하였다. 이어서, DTT 용액 1 부를 각각의 인슐린 용액 5 부에 첨가하고, 50℃ 에서 15 분 동안 환원 반응을 수행하였다. 환원된 750 PEG 인슐린 조성물을 요오도아세트아미드 (Sigma) 로 알킬화시켰다. PEG-인슐린 용액 6 부를 크로마토그래피 및 효소 소화 이전에 100 mM 요오도아세트아미드 1 부와 반응시켰다. 이어서, 반응 생성물을 HPLC 로 분석하였다. 인슐린 A 또는 B 사슬로의 콘쥬게이션 백분율을 대조군보다 늦게 용출된 (폴리에틸렌 글리콜에 대한 콘쥬게이션 때문이라고 생각함) 인슐린 A 또는 B 사슬의 양을 기준으로 추정하였다. 따라서, 상기 후기 용출 피크는 대조군에 대해 기대되는 보유 시간에 존재하지 않았다. 상대 피크 면적을 사용하여, 인슐린 A 또는 B 사슬로의 폴리에틸렌 글리콜의 콘쥬게이션 백분율의 지표를 제공하였다.
B-29 Lys 대 B1-Phe 에 부착된 PEG 의 상대량을 추가 조사하기 위해, 상기 기재된 DTT-환원으로부터 750-1 및 750-2 PEG 인슐린 조성물의 환원 및 알킬화된 A 및 B 사슬을 서열분석 등급 효소인 엔도프로티나아제 Glu-C (Sigma) 로 추가 소화시켰다. 수성 중탄산암모늄 중 0.125㎍/㎕ 의 효소를 함유하는 용액을 제조하였다. 효소 용액 첨가 전, 각각의 환원 반응 혼합물 중의 인슐린 농도는 0.4 M 중탄산암모늄을 함유하는 8 M 요소 중에서 0.05 ㎍/㎕ 이었다. 이어서, 효소 용액 1 부를 인슐린 용액 40 부에 첨가하였다. 엔도프로티나아제 Glu-C 로의소화로, A1-A4, A5-A17, A18-A21, B1-B13, B14-B21, 및 B22-B30 의 인슐린 펩티드 절편이 생성되었다.
750-1 및 750-2 PEG 인슐린 조성물의 A 및 B 사슬 둘 다의 효소적 소화로 생성된 절편을 HPLC 로 분석하여, 각각의 상기 조성물에 대해 인슐린으로의 PEG 부착 부위의 전체 분포를 추정하였다. 대조군에 비해 없어진 피크의 백분율은 PEG 에 콘쥬게이트된 절편양의 추정을 제공하는데, 이는 상기 절편이 크로마토그래프 상의 다른 곳에서 용출되기 때문이다.
예시적 PEG-인슐린 제형물의 PEG 부착 부위의 분포
인슐린 유형 A1 부위가 콘쥬게이트된 % B-1 부위가 콘쥬게이트된 % B-29 부위가 콘쥬게이트된 %
PEG 750-1 30 95 21
PEG 750-2 11 95 15
PEG 2000 63 85*
*소화 데이타는 없고, 환원 회수만 있음.
표 3A 에서의 수는 100% 콘쥬게이트된 각 부위의 가능성을 기준으로 한다. 예를 들어, 각각의 모노종은 3 개의 가능한 배치 (모노-A1, 모노-B1, 모노-B-29) 를 가지며, 각각의 디콘쥬게이트는 3 개 배치 (디-A1,B1; 디-A-1,B-29; 및 디-B-1,B-29) 를 갖는다. 표 3A 의 데이타, 예컨대 PEG-750-1 에 대해 살펴보면, 조성물에 존재하는 모든 가능한 종에 있어서, 95% 의 PEG-인슐린 콘쥬게이트가 B-1 부위에 공유 부착된 폴리에틸렌 글리콜을 보유하였다.
가능한 다양한 콘쥬게이트종
유형 모노-콘쥬게이트 디-콘쥬게이트 트리-콘쥬게이트 HMWP
종 # 1 2 3 4 5 6 7 8
콘쥬게이션 위치 A-1 B-1 B-29 (A-1+B-1) (A-1+B-29) (B-1+B-29) (A-1+B-1+B-29) 콘쥬게이트된 인슐린 이량체
실시예 6
750-2 PEG 인슐린 대 비개질된 인슐린의 효소 소화 속도의 비교
키모트립신에 의한 750-2 PEG-인슐린의 효소 소화 속도를 인슐린에서와 비교하였다.
인슐린 대조군 및 PEG 750 인슐린-2 조성물을 pH 7.8 의 포스페이트 완충 식염수 용액 중 1 mg/㎖ 로 제조하였다. 키모트립신을 1 mM HCl 용액 중 1 mg/㎖ 로 제조하였다. 효소 용액 1 부를 인슐린 용액 20 부에 첨가하였다. 혼합 용액의 적은 분취량을 대략 1 시간 마다 인출하였다.
RP (역상)-HPLC 방법을 나트륨 퍼클로레이트, 인산 및 아세토니트릴을 포함하는 이동상으로 C-18 칼럼을 이용하여 전개하였다. 아세토니트릴 구배를 사용하여, 214 nm 에서 모니터링되는 약간 분해된 피크군 중 PEG 화 인슐린종 분류를 용출하였다. 피크군을 수작업으로 한 피크로 통합하여 PEG 인슐린으로 라벨링하였다. 소화가 진행됨에 따라, 손상되지 않은 PEG 인슐린 및 인슐린의 손실이 나타났다 (도 1). 키모트립신의 존재 하 이들의 반감기를 추정하였다.
750-2 PEG 인슐린 조성물의 주성분 농도의 절반을 효소 소화시키는데 필요한 시간 길이는 비개질된 인슐린에서 보다 5 배 길었다. 즉, 표준 인슐린에 비해,예시적 PEG 화 인슐린 농도의 절반을 키모트립신으로 소화시키는데 5 배 더 긴 시간이 소요되었다. 상기 결과는 비개질된 인슐린에 비해, PEG 인슐린 콘쥬게이트가 단백분해에 대한 증강된 저항성으로 인해 폐포에서의 잔여 시간이 연장될 가능성을 나타내었다.
실시예 7
래트에서 5K PEG 인슐린의 정맥내 투여 후 혈청 글루코오스 및 인슐린 농도의 평가 (P-2001-015)
5K PEG 인슐린 조성물 중 인슐린의 활성이 예시적인 5K 폴리에틸렌 글리콜 사슬로의 화학적 개질 시 유지되는지 여부를 결정하고, 정맥내 투여되는 경우 상기 조성물에 있어서의 용량 및 글루코오스 반응 곡선을 조사하기 위해, 상기 연구를 수행하였다.
외부 목덜미 피부 아래에 꿰메진 억세스 포트를 갖는, 미리 캐뉼라를 삽입한 (경정맥/대퇴부 정맥 [JVC/FVC]) 웅성 Sprague Dawley 래트 (325 ~ 350 그램) 를 Hilltop Lab Animals Inc. (P.O. Box 183, Scottdale, PA 15683) 에서 얻었다. 경정맥 캐뉼라를 약학 등급 폴리비닐-피롤리돈 (PVP - MW 40,000), 생리 식염수 및 나트륨 헤파린 용액 (관강 충전제) 으로 채워서 개방을 유지하였다. 연구 당일날, 캐뉼라를 밀봉하는 나일론 필라멘트 플러그를 제거하고 모노젝트 블런트 캐뉼라 23G ×1 (VWR #53498-484) 로 교체하였다. 평가 시스템에는 위약군을 위해 무작위로 선택된 1 마리 웅성 래트, 비-PEG 화군을 위해 무작위로 선택된 2 마리 웅성 래트, 및 PEG-인슐린군을 위해 무작위로 선택된 4 마리 웅성 래트가 포함되었다. 상기 연구를 위한 PEG 화 인슐린의 공급원은 실시예 2 의 5K PEG 인슐린이었다. 용량을 정맥내 투여하였다.
동물의 수/성별
1 일: 1M/위약군 1 에 대한 군
2M/군 2 에 대한 군; 4M/군 3 ~ 5 에 대한 군
연구 개시 전 12 ~ 18 시간 동안 동물을 절식시켰다. 인간 인슐린 (Diosynth) 을 사용 전까지 -20℃ 에서 보관하였다. 5K PEG 인슐린 (실시예 2) 을 사용 전까지 -20℃ 에서 보관하였다. 투여를 위한 2 개의 상이한 용액을 제조하였다:
I.V. 투여용 용액
비-PEG 화 인간 인슐린 (1.0 mg/㎖ 스톡): 1.0 ㎖ PBS 를 1.0 mg 인슐린 분말에 첨가하였다.
5K PEG 인슐린: (1.0 mg/㎖ 인간 인슐린 - 농도는 콘쥬게이트 보다는 인슐린을 기준으로 하였다): 6.0 ㎖ PBS 를 11.7 mg 의 5K PEG 인슐린 분말에 첨가하였다.
동물을 흡입 이소플루란으로 마취하였다. i.v. 용량 (300 ㎕/동물) 을 FVC 를 통해 준 뒤, 카테터를 묶어 혈액 당김으로 인한 교차 오염을 배제하였다. 모든 혈액 표본을 JVC 를 통해 인출하였다. 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 를 1 군에 300 ㎕ i.v. 용량으로 투여하였다. 비-PEG 화 인간 인슐린을 2 군에 20 ㎍/동물 i.v. 용량으로 투여하였다. PEG 화 인간 인슐린 제형물을 3 군에 20㎍/동물 i.v. 용량으로, 4 군에 40 ㎍/동물 i.v. 용량으로, 및 5 군에 30 ㎍/동물 i.v. 용량으로 투여하였다. 혈액 표본 (~ 500 ㎕) 을 투여 전 (투여 2 내지 0.25 시간 전), 투여 후 10, 15, 30, 60, 120, 및 180 분에 JVC 로부터 수집하였다. 소량의 혈액을 Glucometer Elite 글루코오스 모니터 (Bayer Corp., Elkart, IN) 에 의한 혈중 글루코오스의 측정을 위한 글루코오스 평가 스트립 상에 놓았다. 나머지 표본은 혈청 분리기 튜브 내에 놓고, 원심분리기 내에 두어 혈액을 분리하였다. 이어서, 혈청을 다른 튜브 내로 경사분리하고, 방사면역분석 (RIA) 으로 분석하였다. 평균 및 표준 편차 (SD) 를 MicrosoftExcel 2000 을 이용하여 계산하였다.
생체 내 실험의 요약하기는 사용된 각 군 당 투여된 실제 용량 및 실제 동물 수이다. 연구는 하루에 종료되었다.
군 번호 조성물 투여 경로 인슐린의 1 일 총 용량(㎍/동물) 동물수/성별
1 위약 i.v. 0 1M
2 비-PEG 인슐린 i.v. 20 2M
3 PEG 인슐린 i.v. 20 4M
4 PEG 인슐린 i.v. 40 4M
5 PEG 인슐린 i.v. 30 4M
결과는, 5K PEG 인슐린 조성물이 혈중 글루코오스를 저하시키는 그 능력에서 알 수 있듯이, 폴리에틸렌 글리콜로의 개질 시 생활성을 보유함을, 즉 인슐린 분자가 활성인 채로 남아있음을 시사하였다. PEG 화 인슐린의 i.v. 투여 후 평균 혈청 인슐린 농도는 용량 의존적이었으며; 글루코오스 수준의 용량 의존적 감소가 또한 관찰되었다. 결과를 도 2 및 3 에 요약한다. 도 2 는 PEG 화 대 비-PEG 화 인슐린의 예시적 조성물의 i.v. 투여 후 평균 혈청 인슐린 농도를 나타내는 도면이며; 도 3 은 상술된 조성물의 i.v. 투여 후 혈중 글루코오스 농도를 나타내는 도면이다.
실시예 8
폐로의 5K PEG 인슐린 투여 (P-2001-017)
예시적인 PEG 화 인슐린인 5K PEG 인슐린을 기관내 투여를 통해 투여하여, (i) 그 활성이 폐로의 투여 시 유지되는지 여부, 및 (ii) 폐로 직접 전달되는 경우, 만약 있다면 혈청 인슐린 및 혈중 글루코오스 농도에 대한 영향을 결정하였다.
스톡 용액
비-PEG 화 인슐린: 1 ㎖ PBS 를 1.0 mg 인슐린 분말에 첨가하여, 1 mg/㎖ 스톡 용액을 제조하였다. 인슐린 (대조군) 의 스톡 용액은 연구 개시일에 제조하였다.
5K PEG 인슐린: 4.0 ㎖ PBS 를 7.8 mg 의 5K PEG 인슐린 분말에 첨가하여, 1 mg/㎖ (인슐린 기준) 스톡 용액을 제조하였다.
투여 용액
인슐린 40㎍/동물: 투여 2 시간 이내에, 667 ㎕ 의 인슐린 스톡 용액을 4.33 ㎖ PBS 에 첨가하였다.
인슐린 B-1 150㎍/동물: 투여 2 시간 이내에, 2.5 ㎖ 의 5K PEG 인슐린 스톡 용액을 2.5 ㎖ PBS 에 첨가하였다.
기관내 점적
플렉시글래스 (plexiglass) 마취 챔버 내에서 대략 5 분 동안 산소와 혼합된 흡입 3.0 ~ 5.0% 이소플루란 (Isoflurane, Abbott Laboratories) 를 이용하여 래트를 가볍게 마취하였다. 주 기관분기부 바로 위로, 래트의 입에서 기관 쪽으로 1 ㎖ 주사기 내에 맞춰진 영양 주사 (Popper & Sons Inc.; 18 ×3" W2-1/4 mm 볼, New Hyde Park, NY 11040) 를 삽입하여 투여하였다. 영양 주사를 기관내로 삽입할 때, 영양 주사의 볼을 이용하여 인후 피부 아래의 연골 고리의 거칠기를 느껴서 적절한 삽입을 확인하였다. 상기 방법을 이용하여 폐 내로 용량을 투여한 후, 영양 주사를 제거하였다.
경정맥 카테터 (JVC) 가 삽입된 14 마리 (N=7/군) 의 절식 웅성 래트 (Hilltop Lab Animals, Scottsdale, PA (300 ~ 350 g)) 를 상기 연구에 사용하였다. 비-PEG 화 인간 인슐린을 1 군에 40 ㎍/300 ㎕ i.t. 용량으로 투여하였다. PEG 화 인간 인슐린 제형물을 2 군에 150 ㎍/300 ㎕ i.t. 용량으로 투여하였다. 혈액 표본 (~ 500 ㎕) 을 투여 전 (투여 전 2 내지 0.25 시간 전), 투여 후 15, 30, 60, 120, 240, 360, 480, 및 720 분에 수집하였다. 소량의 혈액을 Glucometer Elite 글루코오스 모니터 (Bayer Corp., Elkart, IN) 에 의한 혈중 글루코오스의 측정을 위한 글루코오스 평가 스트립 상에 놓았다. 나머지 표본은 혈청 분리기 튜브 내에 놓고, 방사면역분석으로 분석하였다. 평균 및 표준 편차 (SD) 를 MicrosoftExcel 2000 을 이용하여 계산하였다. 동물 2 ~ 3 마리는 응고된 카테터로 인해 연구에서 탈락하였다.
래트에서 생체 내 실험의 요약하기는 사용된 각 군 당 투여된 실제 용량 및 실제 동물 수이다.
군 번호 인슐린 유형 투여 경로 동물수/성별 인슐린의 1 일 총 용량(㎍/동물) 투여 일수
1 인슐린 I.T. 7M 40 1
2 5K PEG 인슐린 I.T. 7M 150 1
생체 내 투여 수준
군 번호 인슐린 유형 인슐린의 1 일 총 용량(㎍/동물) 투여 부피 (㎕) 투여 용액의 농도 (㎍/㎖)
1 인슐린 40 300 133.33
2 5K PEG 인슐린 150 300 500
기관내 투여 후 인슐린 및 5K PEG 인슐린의 평균 혈청 농도 및 평균 혈중 농도를 작성하고, 각각 도 4 및 도 5 에 나타낸다. 결과는, 본 발명의 PEG 화 인슐린 조성물이 폐로의 전달 시 활성을 보유하며 폐 내에 존재함을 시사하였다. 약동학 데이타는 추가로, 비내인성 인슐린에 대응하는 검출가능한 혈청 인슐린 수준에서 알 수 있듯이, PEG 화 인슐린이 폐를 통해 순환계 내로 통과될 뿐만 아니라 활성을 유지함을 시사하였다. 기관내 투여 후 약 1 시간 내에 관찰되는 혈중 인슐린 수준으로 인해, PEG 화 인슐린이 실질적으로 폐 내에 포획되는 것이 아니라, 투여 직후 혈류 내로 폐를 통과하는 것으로 나타내었다. 또한 결과는, PEG 화 인슐린이 폐에 투여되는 경우, 혈중 글루코오스의 저하에 효과적임을 나타냈다. 그러나 본 실시예에 있어서, PEG 화 인슐린은 혈중 글루코오스의 저하에 있어, 투여되는 용량에서 비-PEG 화 인슐린에 비해 덜 효과적인 것으로 나타났다. 기관내 투여되는 PEG 화 인슐린에 대한 약동학 및 약역학 반응 곡선은 둘 다 일부 비-PEG 화 인슐린과 유사하지만, 도 4 의 프로파일에 근거하여, PEG-인슐린이 비-PEG 화 인슐린에 비해 지속성인 것으로 나타났다. 본원에 제시된 지침에 근거하여 및 특정한 화학적으로 개질된 인슐린 생성물의 투여 요건, 목적 환자군, 치료될 상태 등을 기준으로, 당업자는 투여량 및 특정 폴리에틸렌 글리콜 개질제의 추가적 최적화를 쉽게 달성할 수 있다.
실시예 9
폐로의 750-1 PEG 인슐린의 투여 (P-2001-025)
대표적인 PEG 화 인슐린인 750-1-PEG 인슐린을 기관내 투여에 의해 래트에 투여하였다. 상기 연구는 부분적으로, 폐에 투여되는 경우 대략 1,000 달톤 이하의 분자량을 갖는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 사슬에 공유 부착된 인슐린 조성물의 효과를 조사하기 위해 수행하였다.
생체 내 래트 연구는 본질적으로 상기 실시예 8 에 기재된 바와 같이 수행하였다. 뒤따르는 정확한 투여 방식 및 투여 용량을 하기 표에 요약한다.
군 번호 인슐린 유형 투여 경로 동물수/성별 인슐린의 1 일 총 용량(㎍/동물) 투여 일수
1 인슐린 I.T. 2M 80 1
2 750-1 PEG 인슐린 I.T. 4M 100 1
3 750-1 PEG 인슐린 I.T. 4M 300 1
4 750-1 PEG 인슐린 I.T. 4M 500 1
군 번호 인슐린 유형 인슐린의 1 일 총 용량(㎍/동물) 투여 부피 (㎕) 투여 용액의 농도 (㎍/㎖)
1 인슐린 80 300 266.67
2 750-1 PEG 인슐린 100 300 333.33
3 750-1 PEG 인슐린 300 300 1000.00
4 750-1 PEG 인슐린 500 300 1666.67
래트에서 기관내 투여 후 인슐린 및 750-1 PEG 인슐린의 혈청 인슐린 및 혈중 글루코오스 농도를 작성하고, 각각 도 6 및 도 7 에 나타낸다. 도 6 에서 평균 혈청 인슐린 농도의 도면을 살펴보면, 천연 또는 비-PEG 화 인슐린은 대략 15 분에 최대 혈청 농도에 도달하는 반면, PEG 화 인슐린 조성물은 6 시간 (100 ㎍/동물) 및 8 시간 (300 ㎍/동물) 째에 최대 혈청 농도에 도달하여, 흡입에 의해 폐로 투여되는 경우 상기 조성물의 지속성 성질이 나타났다. 도 6 에서 알 수 있듯이, 비개질된 인슐린은 투여 후 대략 6 시간째에 기준선으로 복귀되지만, 6 시간 째의 PEG 화 인슐린에 대한 인슐린 수준은 유의미하게 기준선을 초과한다 (기준선 값의 약 3 내지 7 배 이상). 또한, PEG 화 인슐린의 기관내 투여로, 투여 후 12 시간째에 기준선으로 복귀하지 않고 전신 인슐린 수준이 지속되었다. 실제로, PEG 화 인슐린에 대한 인슐린 수준은 8 및 12 시간째 둘 다에서 기준선 값 (즉, 비개질된 인슐린에 대한 값) 의 3 배를 초과하였다. 상기 결과의 도면을 도 6 에 나타낸다.
결론적으로, 폐에 투여되는 경우 750-1 PEG 인슐린은 비개질된 인슐린에 비해 전신 인슐린 수준을 증가시켰다. 또한, PEG 화 인슐린군에 대한 전신 인슐린 수준은 12 시간 째에도 여전히 유의미하게 기준선을 초과하였다. 즉, 상승된 인슐린 수준은 비개질된 인슐린에서보다 2 배 이상 오래 PEG 화 인슐린군에서 지속되었다. 상기 데이타는 추가로, PEG 화 인슐린이 폐를 통과하며, 생활성이고, 비개질된 인슐린에 비해 지연된 전신 인슐린 수준을 제공함을 나타내었다.
비-PEG 화 대 750-1 PEG 화 인슐린의 기관내 투여 후 평균 혈중 글루코오스 농도의 도면을 도 7 에 제공한다. 혈중 글루코오스 반응 수준은 PEG 화 인슐린군에 있어서 혈청 인슐린 수준과 밀접하게 연관되었다. (즉, 상승된 혈청 인슐린 수준에서, 대응하는 혈중 글루코오스의 억제/저하도 또한 관찰되었다). 도 7 을 살펴보면, 본 발명의 PEG 화 인슐린 조성물이, 폐로 경구 투여되는 경우, 여러 서방형 제형물에 전형적인 지연된 작용 개시보다는, 천연 인슐린과 비교하여 빠른 작용 개시를 나타냄을 알 수 있었다. 즉, 글루코오스 억제는 투여 직후 일어났다. 추가적으로, 천연 또는 비-PEG 화 인슐린이 약 2 시간 내에 최대 글루코오스 저하에 도달하는 반면, PEG 화 인슐린이 최대 글루코오스 저하에 도달하는 시간은 각각 500 ㎍, 100 ㎍, 및 300 ㎍ 용량에 있어서 4 시간, 6 시간, 및 8 시간 이상으로 연장되었다. 따라서, 폐에 투여되는 경우, PEG 화 인슐린이 최대 혈중 글루코오스 저하에 도달하는 시간은 비-PEG 화 인슐린에 비해 2 내지 4 배 지연되었다. 전체적으로, 750-1 PEG 인슐린 글루코오스 억제는 비개질된 인슐린과 비교하는 경우, 12 시간에 걸쳐 유의미하게 증가되었다. 8 시간 째에, 비개질된 인슐린에 있어서 글루코오스 수준은 본질적으로 정상으로 복귀되는 반면, PEG 인슐린군에 대한 글루코오스 수준은 비개질된 인슐린에서에 비해 1.3 내지 3 배였다.PEG 화 인슐린군에 있어서 글루코오스 수준은 12 시간 째에도 기준선으로 복귀하지 않아서, 본 발명의 화학적 유도체화 인슐린 조성물에 있어서의 지연된 글루코오스 억제를 추가로 시사하였다.
실시예 10
폐로의 750-1 PEG 인슐린 투여 (P-2002-001)
상기 실시예 9 에서와 유사한 연구에서, 750-1-PEG 인슐린을 실시예 9 에서 사용된 것보다 낮은 용량으로 기관내 투여에 의해 래트에 투여하였다.
생체 내 기관내 래트 연구를 본질적으로 상기 실시예 8 에 기재된 바와 같이 수행하였다. 정확한 투여 방식 및 투여 용량을 하기 표에 요약한다.
군 번호 인슐린 유형 투여 경로 동물수/성별 인슐린의 1 일 총 용량(㎍/동물) 투여 일수
1 인슐린 I.T. 5M 80 1
2 750-1 PEG 인슐린 I.T. 5M 80 1
3 750-1 PEG 인슐린 I.T. 5M 160 1
군 번호 인슐린 유형 인슐린의 1 일 총 용량(㎍/동물) 투여 부피 (㎕) 투여 용액의 농도 (㎍/㎖)
1 인슐린 80 300 266.7
2 750-1 PEG 인슐린 80 300 266.7
3 750-1 PEG 인슐린 160 300 533.3
래트에서의 기관내 투여 후 비개질된 인슐린 및 750-1 PEG 인슐린의 혈청 인슐린 및 혈중 글루코오스 농도를 작성하고, 결과를 각각 도 8 및 9 에 나타내었다.도 8 에서 평균 혈청 인슐린 농도의 도면을 살펴보면, 천연 또는 비-PEG 화 인슐린은 대략 15 분에 최대 혈청 농도에 도달하는 반면, PEG 화 인슐린 조성물은 2 시간 (80 ㎍/동물) 및 6 시간 (160 ㎍/동물) 째에 최대 혈청 농도에 도달하는 것을 알 수 있었다. 즉, PEG-개질된 인슐린에 있어서 인슐린의 최대 혈청 수준에 도달하는 시간은 폐를 통해 전신 순환계에 투여되는 경우, 천연 또는 비-PEG 화 인슐린에 비해 8 내지 24 배 연장되었다. 도 8 에서 알 수 있듯이, 비개질된 인슐린은 투여 후 대략 12 시간 째에 기준선으로 복귀하는 반면, PEG-인슐린군에 대한 인슐린 수준은 동일한 12 시간째 시점에서 기준선의 2.5 내지 3.5 배 범위였다. 대략 25 시간째까지, PEG 화 인슐린군에 대한 인슐린 수준은 기준선으로 복귀하지 않았으며, 이는 비개질된 인슐린과 비교하여 PEG 화 인슐린군에서 기준선으로의 복귀에 2 배 가량 긴 시간이 소요됨을 시사하였다. 전신 인슐린 수준은 PEG 화 인슐린군에 있어서, 비개질된 인슐린에 비해 약 2 배 (25 시간 대 12 시간) 시기 동안 지속되었다. 약 6 시간째 시점에서, 2 개의 PEG 화 인슐린군에 대한 인슐린 수준은 대략 투여된 용량에 대응하였다 (즉, 160 ㎍/동물군에 대한 인슐린 농도는 80 ㎍/동물군의 대략 2 배였다).
비-PEG 화 대 750-1 PEG 화 인슐린의 기관내 투여 후 평균 혈중 글루코오스 농도의 도면을 도 9 에 제공한다. 투여 후 25 시간째에, 두 PEG 화 인슐린군에 대한 글루코오스 억제는 비개질된 인슐린과는 대조적으로 여전히 기준선으로 복귀하지 않았다. 실시예 9 의 결과와 유사하게, PEG 화 인슐린에 대한 전체 프로파일은 25 시간 초과까지 연장되는 지연된 글루코오스 억제를 나타내었다. 8시간 째에, 비개질된 인슐린의 글루코오스 수준은 거의 정상으로 복귀한 반면, PEG 인슐린군의 글루코오스 수준은 비개질된 인슐린보다 약 1.5 배 낮았다. 또한 상기 결과는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 잔기로의 인슐린 개질로, 지연된 글루코오스 억제 뿐만 아니라, 폐를 통한 우수한 생체이용률 및 지연된 전신 인슐린 수준이 얻어짐을 나타내었다.
실시예 11
폐로의 750-2 PEG 인슐린 투여 (P-2002-003)
대표적인 PEG 화 인슐린 조성물인 750-2-PEG 인슐린을 기관내 투여에 의해 래트에 투여하였다. 직접 폐로 투여되는 경우, 다양한 용량의 PEG 화 대 비-PEG 화 인슐린의 효과를 추가 조사하기 위해, 상기 연구를 수행하였다. 인슐린의 PEG 화 및 비-PEG 화형 둘 다를 동물마다 80 ㎍ 인슐린씩 동물에 투여하였다. 생체 내 래트 연구는 본질적으로 상기 실시예 8 에 기재된 바와 같이 수행하였다. 뒤따르는 정확한 투여 방식 및 투여 용량을 하기 표에 요약한다.
군 번호 인슐린 유형 투여 경로 동물수/성별 인슐린의 1 일 총 용량(㎍/동물) 투여 일수
1 인슐린 I.T. 7M 80 1
2 750-2 PEG 인슐린 I.T. 7M 80 1
군 번호 인슐린 유형 인슐린의 1 일 총 용량(㎍/동물) 투여 부피 (㎕) 투여 용액의 농도 (㎍/㎖)
1 인슐린 80 300 266.7
2 750-2 PEG 인슐린 80 300 266.7
80 ㎍/동물 용량에서 비-PEG 화 및 750-1 PEG 인슐린 둘 다의 기관내 점적 후 평균 혈청 인슐린 농도의 도면을 도 10 에 나타낸다. 80 ㎍/동물 용량에서 비-PEG 화 및 750-1 PEG 인슐린 둘 다의 기관내 점적 후 평균 혈중 글루코오스 농도의 도면을 도 11 에 나타낸다. 실시예 9 및 10 에서와 유사한 결과가 수득되었다.
실시예 10 및 11 로부터의 약동학 파라미터의 도표가 하기에 제공된다. 생체이용률은 절대 생체이용률이다 (즉, 정맥내 투여된 인슐린과 비교됨).
평균 혈청 인슐린 약동학
실시예 인슐린 유형 경로 용량㎍/동물 CMaxμU/㎖ TMax분 AUCμU*분/㎖ 절대 BA
9 (P-2001-25) 인슐린 IT 80 56 15 12878
9 750-1 PEG IT 100 64 368 27954
9 750-1 PEG IT 300 160 188 50691
9 750-1 PEG IT 500 3474 184 255881
10 (P-2002-001) 인슐린 IT 80 132 15 28167
10 750-1 PEG IT 80 56 210 36818
10 750-1 PEG IT 160 117 78 60713
IV Ref. P-2002-002 인슐린 IV 20 3057 5 44388
IV Ref. 750-2 PEG IV 20 2638 7 63190
IV Ref. 750-2 PEG IV 30 3510 5 62746
11 (P-2002-003) 인슐린 IT 80 89 24 22203 12.5
11 750-2 PEG IT 80 164 73 57639 32**32***
*영역밖 값은 데이타 세트에서 제거하지 않았음.**IV 20 ㎍/동물 용량에 비해. 제거된 영역밖 값은 22% 였음.***IV 30 ㎍/동물 용량에 비해. 제거된 영역밖 값은 변하지 않았음.
절대 생체이용률은 하기와 같이 계산하였다:
[(AUC)/(AUCIV ins)] ×[(용량IV ins)/(용량)]
실시예 12
폐로의 2K PEG 인슐린 투여 (P-2002-010)
또다른 예시적인 PEG 화 인슐린 조성물인 2K PEG 인슐린을 기관내 투여에 의해 래트에 투여하였다. 상기 연구를 위해 사용된 2K PEG 인슐린은 실시예 3 에 기재된 바와 같이 제조하였다. 비-PEG 화 인슐린에 대해, 동물 당 80 ㎍ 인슐린을 동물에 투여하였다. 2K PEG 인슐린에 대해, 동물 당 300 ㎍ 인슐린, 동물 당 600 ㎍ 인슐린, 동물 당 900 ㎍ 인슐린, 및 동물 당 1200 ㎍ 인슐린을 동물에 투여하였다. 생체 내 래트 연구는 본질적으로 상기 실시예 8 에 기재된 바와 같이 수행하였다. 뒤따르는 정확한 투여 방식 및 투여 용량을 하기 표에 요약한다.
군 번호 인슐린 유형 투여 경로 동물수/성별 인슐린의 1 일 총 용량(㎍/동물) 투여 일수
1 인슐린 I.T. 3 80 1
2 PEG2K-1 인슐린 I.T. 3 600 1
3 PEG2K-1 인슐린 I.T. 3 80 1
4 PEG2K-1 인슐린 I.T. 3 160 1
5 PEG2K-1 인슐린 I.T. 3 300 1
6 PEG2K-1 인슐린 I.T. 3 900 1
7 PEG2K-1 인슐린 I.T. 3 1200 1
군 번호 인슐린 유형 인슐린의 1 일 총 용량(㎍/동물) 투여 부피 (㎕) 투여 용액의 농도 (㎎/㎖)
1 인슐린 80 300 0.267
2 PEG2K-1 인슐린 600 300 2.0
3 PEG2K-1 인슐린 80 300 0.267
4 PEG2K-1 인슐린 160 300 0.533
5 PEG2K-1 인슐린 300 300 1.0
6 PEG2K-1 인슐린 900 300 3.0
7 PEG2K-1 인슐린 1200 300 4.0
기관내 투여 후 평균 혈중 글루코오스 농도의 도면을 도 12 에 나타낸다. 폐에 투여되는 경우, PEG 화 인슐린 조성물에 대한 우수한 용량 반응이 관찰되었다(즉, 더 높은 용량의 2K-PEG 인슐린으로 더 큰 혈중 글루코오스 농도 감소가 얻어졌다). PEG 화 및 비-PEG 화 조성물 둘 다에 대해 최대 글루코오스 억제가 얻어지는 곡선 중 시점은 약 3 시간째인 것으로 나타났지만, PEG 화 대 비-PEG 화 인슐린에 대한 프로파일은 글루코오스 억제 기간에 대해 유의미하게 상이했다. 특히, 3 개의 높은 2K PEG 화 인슐린 용량 (동물 당 600 ㎍, 900 ㎍, 및 1200 ㎍) 에서 약 6 시간을 지나는 시점에 대해, 글루코오스 수준은 비-PEG 화 인슐린에서보다 유의미하게 낮게 억제되었다. 상기 결과는 추가적으로, 폐로의 PEG 화 인슐린의 투여에 의해 지연된 전신 효과가 달성될 수 있음을 나타내었다.
실시예 13
래트에서 2K PEG 인슐린의 정맥내 투여 후 혈청 글루코오스 및 인슐린 농도의 평가 (P-2002-009)
예시적인 2K PEG 인슐린 조성물 중 인슐린의 활성을 추가로 조사하고, PEG 화 인간 인슐린 (PEG2K-1) 의 정맥내 (i.v.) 투여가 혈중 글루코오스를 약 30 ~ 40 mg/㎗ 농도로 저하시키는데 효과적인지를 결정하기 위해, 상기 연구를 수행하였다.
하기 표에 요약된 조성물, 동물군, 및 용량을 이용하여, 실시예 7 에 기재된 바와 유사한 프로토콜을 수행하였다.
군 번호 인슐린 유형 투여 경로 동물수/성별 인슐린의 1 일 총 용량(㎍/동물) 투여 일수
1 인슐린 i.v. 2M 20 1
2 PEG2K-1 인슐린 i.v. 2M 20 1
3 PEG2K-1 인슐린 i.v. 2M 30 1
4 PEG2K-1 인슐린 i.v. 2M 40 1
5 PEG2K-1 인슐린 i.v. 2M 80 1
6 PEG2K-1 인슐린 i.v. 2M 160 1
군 번호 대조군/평가 물품 인슐린의 1 일 총 용량(㎍/동물) 투여 부피 (㎕) 투여 용액의 농도 (㎍/㎖)
1 인슐린 20 300 67
2 PEG2K-1 인슐린 20 300 67
3 PEG2K-1 인슐린 30 300 100
4 PEG2K-1 인슐린 40 300 133
5 PEG2K-1 인슐린 80 300 267
6 PEG2K-1 인슐린 160 300 533
20 ㎍/동물 (비-PEG 화 인슐린) 및 20, 30, 및 40 ㎍/동물 (2K PEG 인슐린) 용량의 비-PEG 화 및 2K PEG 인슐린의 정맥내 투여 후 평균 혈청 인슐린 농도의 도면을 도 13 에 나타낸다. 상술한 용량의 비-PEG 화 및 2K PEG 인슐린의 정맥내 투여 후 평균 혈중 글루코오스 농도의 도면을 도 14 에 나타낸다.

Claims (77)

  1. 하나 이상의 비천연 생성 친수성 중합체 분자에 공유적으로 커플링된 인슐린 콘쥬게이트를 포함하는, 폐 투여용 인슐린 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 콘쥬게이트에 친유성 잔기가 없는 인슐린 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 비천연 생성 친수성 중합체가 폴리알킬렌 글리콜인 인슐린 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 비천연 생성 친수성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 인슐린 조성물.
  5. 제 2 항에 있어서, 상기 비천연 생성 친수성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 인슐린 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서, 천연 인슐린을 초과하는 절대 폐 생체이용률을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 천연 인슐린의 2 배 이상의 절대 폐 생체이용률을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 4 항에 있어서, 15% 초과의 절대 폐 생체이용률을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 30% 초과의 절대 폐 생체이용률을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 4 항에 있어서, 폐로 투여되는 경우, 천연 인슐린의 3 배 이상의 Tmax 를 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 폐로 투여되는 경우, 천연 인슐린의 5 배 이상의 Tmax 를 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 4 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 말단이 캡핑된 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 말단이 알콕시기로 캡핑된 조성물.
  14. 제 4 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 선형 폴리에틸렌 글리콜, 분지형 폴리에틸렌 글리콜, 포크형 폴리에틸렌 글리콜 및 아령형 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 생분해성 연결을 포함하는 조성물.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 약 2 내지 300 개 서브유닛, 약 4 내지 200 개 서브유닛 및 약 10 내지 100 개 서브유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되는 여러 (OCH2CH2) 서브유닛을 포함하는 조성물.
  17. 제 14 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 약 200 내지 약 10,000 달톤의 겉보기 평균 분자량을 갖는 조성물.
  18. 제 14 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 선형인 조성물.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 약 200 내지 약 5,000 달톤의 겉보기 평균 분자량을 갖는 조성물.
  20. 제 17 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 약 200 내지 약 2,000 달톤의 겉보기 평균 분자량을 갖는 조성물.
  21. 제 17 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 약 200 내지 약 1,000 달톤의겉보기 평균 분자량을 갖는 조성물.
  22. 제 4 항에 있어서, 상기 인슐린이 천연 인슐린인 조성물.
  23. 제 4 항에 있어서, 상기 콘쥬게이트가 90% 초과 순도를 갖는 조성물.
  24. 제 4 항에 있어서, 상기 인슐린이 하나 이상의 그 아미노 부위에서 폴리에틸렌 글리콜에 공유적으로 커플링된 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서, 인슐린 상의 약 75% 이상의 B-1Phe 부위가 폴리에틸렌 글리콜에 공유적으로 커플링된 조성물.
  26. 제 25 항에 있어서, 인슐린 상의 약 90% 이상의 B-1Phe 부위가 폴리에틸렌 글리콜에 공유적으로 커플링된 조성물.
  27. 제 24 항에 있어서, 인슐린의 단량체 및 이량체 콘쥬게이트 혼합물을 포함하는 조성물.
  28. 제 27 항에 있어서, 삼량체 인슐린 콘쥬게이트를 추가로 포함하는 조성물.
  29. 제 4 항에 있어서, 상기 인슐린이 상기 폴리에틸렌 글리콜의 말단에 위치한 연결 잔기를 통해 폴리에틸렌 글리콜에 공유적으로 커플링된 조성물.
  30. 제 4 항에 있어서, 인슐린에 커플링되기 전의 상기 폴리에틸렌 글리콜이, 인슐린과의 공유 커플링에 적합한 하나의 말단에 활성화된 연결 잔기를 보유하는 조성물.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 활성화된 연결 잔기가 반응성 인슐린 아미노기와의 커플링에 적합한 조성물.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 활성화된 연결 잔기가 N-히드록시숙신이미드 활성 에스테르, 활성 카르보네이트, 알데히드 및 아세탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응성 관능기를 포함하는 조성물.
  33. 제 29 항에 있어서, 인슐린이 아미드 연결을 통해 폴리에틸렌 글리콜에 공유적으로 커플링된 조성물.
  34. 제 4 항에 있어서, 에어로졸 형태인 조성물.
  35. 제 4 항에 있어서, 액체 또는 건조 형태인 조성물.
  36. 제 4 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 함유하는 조성물.
  37. 제 4 항에 있어서, 분무 건조 형태인 조성물.
  38. 인슐린을 필요로 하는 포유류 대상체로의 인슐린 전달 방법에 있어서,
    제 4 항의 인슐린 조성물을 에어로졸화하고,
    상기 에어로졸화된 인슐린 조성물을 상기 대상체의 폐로의 침적 및 폐로부터의 흡수를 위해 흡입 투여하는 것을 포함하는 방법.
  39. 실질적으로 비면역원성인 인슐린 조성물을 필요로 하는 대상체 폐로의 투여를 위한 상기 인슐린 조성물의 제공 방법에 있어서,
    하나 이상의 비천연 생성 친수성 중합체 분자에 인슐린을 공유적으로 커플링시켜 인슐린-친수성 중합체 콘쥬게이트를 포함하는 조성물을 제공하고,
    이를 필요로 하는 대상체의 폐로 상기 조성물을 흡입 투여하여, 상기 투여의 결과 상기 인슐린이 폐를 통과하여 혈액 순환계 내로 도입되는 것을 포함하는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 비천연 생성 친수성 중합체가 폴리알킬렌 글리콜인방법.
  41. 지효성 인슐린 조성물을 필요로 하는 대상체의 폐로의 투여를 위한 상기 조성물의 제공 방법에 있어서,
    하나 이상의 비천연 생성 친수성 중합체 분자에 인슐린을 공유적으로 커플링시켜 인슐린-친수성 중합체 콘쥬게이트를 포함하는 조성물을 제공하고,
    이를 필요로 하는 대상체의 폐로 상기 조성물을 흡입 투여하여, 상기 투여의 결과 (i) 상기 인슐린이 폐를 통과하여 혈액 순환계로 도입되며, (ii) 상승된 혈중 인슐린 수준이 투여 후 8 시간 이상 지속되는 것을 포함하는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 비천연 생성 친수성 중합체가 폴리알킬렌 글리콜인 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 비천연 생성 친수성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 방법.
  44. 제 43 항에 있어서, 상승된 인슐린 수준이 투여 후 10 시간 이상 지속되는 방법.
  45. 제 43 항에 있어서, 상승된 인슐린 수준이 투여 후 12 시간 이상 지속되는방법.
  46. 제 43 항에 있어서, 상기 투여의 결과 추가적으로, 상기 대상체에서의 글루코오스 수준이 투여 후 10 시간 이상 억제되는 방법.
  47. 제 46 항에 있어서, 상기 투여의 결과 추가적으로, 상기 대상체에서의 글루코오스 수준이 투여 후 12 시간 이상 억제되는 방법.
  48. 제 43 항에 있어서, 상기 투여 단계가 에어로졸 형태인 상기 조성물의 투여를 포함하는 방법.
  49. 제 43 항에 있어서, 투여 전 상기 조성물의 에어로졸화 단계를 추가로 포함하는 방법.
  50. 제 43 항에 있어서, 상기 커플링 단계가 부위 특이적 방식으로 인슐린을 폴리에틸렌 글리콜에 공유적으로 커플링시키는 것을 포함하는 방법.
  51. 제 43 항에 있어서, 상기 커플링 단계가 무작위적 방식으로 인슐린을 폴리에틸렌 글리콜에 공유적으로 커플링시키는 것을 포함하는 방법.
  52. 제 43 항에 있어서, 폐에 투여되는 경우 상기 상기 콘쥬게이트는 천연 인슐린을 초과하는 절대 폐 생체이용률을 추가적 특징으로 하는 방법.
  53. 제 43 항에 있어서, 상기 커플링 단계가 말단이 캡핑된 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 인슐린을 공유적으로 커플링시키는 것을 포함하는 방법.
  54. 제 43 항에 있어서, 상기 커플링 단계가 선형, 분지형, 포크형 및 아령형 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 인슐린을 공유적으로 커플링시키는 것을 포함하는 방법.
  55. 제 43 항에 있어서, 상기 콘쥬게이트에 친유성 잔기가 없는 방법.
  56. 제 43 항에 있어서, 상기 조성물에 친유성 성분이 없는 방법.
  57. 제 43 항에 있어서, 상기 커플링 단계가 생분해성 연결을 포함하는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 인슐린을 공유적으로 커플링시키는 것을 포함하는 방법.
  58. 제 43 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 약 2 내지 300 개 서브유닛, 약 4 내지 200 개 서브유닛 및 약 10 내지 100 개 서브유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되는 여러 (OCH2CH2) 서브유닛을 포함하는 방법.
  59. 제 43 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 약 200 내지 약 10,000 달톤의 겉보기 평균 분자량을 갖는 방법.
  60. 제 43 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 약 200 내지 약 5,000 달톤의 겉보기 평균 분자량을 갖는 방법.
  61. 제 43 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 약 200 내지 약 2,000 달톤의 겉보기 평균 분자량을 갖는 방법.
  62. 제 43 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 약 200 내지 약 1,000 달톤의 겉보기 평균 분자량을 갖는 방법.
  63. 제 43 항에 있어서, 상기 커플링이 하나 이상의 그 반응성 아미노 부위에서 인슐린에 폴리에틸렌 글리콜을 커플링시키는 것을 포함하는 방법.
  64. 제 63 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 아미드, 우레탄 및 메틸렌 아미노로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합을 통해 하나 이상의 그 반응성 아미노 부위에서 인슐린에 커플링되는 방법.
  65. 제 63 항에 있어서, 상기 커플링이 N-히드록시숙신이미드 활성 에스테르, 활성 카르보네이트, 알데히드 및 아세탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 말단 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜과 인슐린 상의 하나 이상의 반응성 아미노 부위를 반응시키는 것을 포함하는 방법.
  66. 제 43 항에 있어서, 상기 커플링으로 인슐린 상의 약 75% 이상의 B-1Phe 부위가 폴리에틸렌 글리콜에 공유적으로 커플링된 조성물이 얻어지는 방법.
  67. 제 43 항에 있어서, 상기 커플링으로 인슐린 상의 약 90% 이상의 B-1Phe 부위가 폴리에틸렌 글리콜에 공유적으로 커플링된 조성물이 얻어지는 방법.
  68. 제 43 항에 있어서, 상기 커플링으로 인슐린의 단량체 및 이량체 콘쥬게이트의 혼합물을 포함하는 조성물이 얻어지는 방법.
  69. 제 68 항에 있어서, 상기 커플링으로 인슐린의 삼량체 콘쥬게이트를 추가로 포함하는 조성물이 얻어지는 방법.
  70. 제 43 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 인슐린과의 공유적 커플링에 적합한 하나 이상의 말단에 활성화된 연결 잔기를 포함하는 방법.
  71. 제 43 항에 있어서, 상기 활성화된 연결 잔기가 N-히드록시숙신이미드 활성 에스테르, 활성 카르보네이트, 알데히드 및 아세탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응성 관능기를 포함하는 방법.
  72. 제 70 항에 있어서, 상기 연결 잔기가 약 2 내지 약 20 개 원자 길이를 갖는 방법.
  73. 제 43 항에 있어서, 상기 투여 단계가 건조 분말 흡입기에 의한 상기 조성물의 투여를 포함하는 방법.
  74. 제 43 항에 있어서, 상기 투여 단계가 계량 용량 흡입기에 의한 상기 조성물의 투여를 포함하는 방법.
  75. 제 43 항에 있어서, 상기 투여 단계가 분무기에 의한 상기 조성물의 투여를 포함하는 방법.
  76. 제 43 항에 있어서, 상기 조성물이 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 함유하는 방법.
  77. 제 43 항에 있어서, 상기 콘쥬게이트 조성물의 투여 결과, 기저 수준의 2 배 이상인 혈청 인슐린 수준이 투여 후 1 시간 이내에 달성되는 방법.
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