CZ20033182A3

CZ20033182A3 - Inzulínový prostředek a způsob podávání inzulínu

Info

Publication number: CZ20033182A3
Application number: CZ20033182A
Authority: CZ
Inventors: John S. Patton; Mei-Chang Kuo Kuo; J. Milton Harris; Chester Leach; Kimberly Perkins; Blaine Bueche
Original assignee: Nektar Therapeutics; Nektar Therapeutics Al, Corporation
Priority date: 2001-05-21
Filing date: 2002-05-21
Publication date: 2004-09-15
Also published as: AU2002303869B2; GEP20063917B; BG108494A; ECSP034855A; MA26185A1; AR033903A1; SK15532003A3; BR0209896A; EA007408B1; CN1582171A; LT5153B; US6890518B2; CA2447236A1; NO20035157D0; OA13136A; YU98503A; NZ529572A; EP1395294A2; PL366911A1; AP1763A

Description

Inzulínový prostředek a způsob podávání inzulínu

Oblast techniky

Předložený vynález je zaměřen na biologicky aktivní deriváty inzulínu, které jsou modifikované hydrofilním polymerem, které jsou dopraveny do plic vdechováním. Ve vynálezu jsou také poskytnuty způsoby přípravy a podávání takových derivátů.

Dosavadní stav techniky

Inzulín je polypeptidový hormon produkovaný β-buňkami slinivky normálního (nediabetického) jedince. Lidský inzulín je polypeptidový hormon obsahující 51 aminokyselin, který má molekulární hmotnost 5 800 daltonů. Molekula inzulínu se skládá ze dvou polypeptidových řetězců (řetězec A a řetězec B), který obsahuje jednu disulfidovou vazbu uvnitř podjednotky a dvě disulfidové vazby mezi těmito podjednotkami. Řetězec A je složen z 21 aminokyselin a řetězec B je složen z 30 aminokyselin. Dva inzulínové řetězce tvoří vysoce uspořádanou strukturu s několika ašroubovicovými oblastmi v obou řetězcích A i B. Je zajímavé, že izolované řetězce inzulínu jsou inaktivní. V roztoku může inzulín existovat jako monomer, jako dimer nebo jako hexamer. Inzulín je hexamerní ve vysoce koncentrovaných preparátech, používaných při podkožní terapii, ale stává se monomerní, když je zředěný v tělních tekutinách. Inzulín je nezbytný pro regulování metabolizmu cukrů tím, že snižuje hladinu glukózy v krvi; systémový nedostatek inzulínu způsobuje diabetes. Přežívání diabetických pacientů závisí na častém a dlouhodobém podávání inzulínu pro udržování přijatelné hladiny glukózy v krvi.

Běžně používané inzulínové přípravky mají nedostatky, které mohou vést k vážným medicínským komplikacím při léčení diabetů. Například diabetickými pacienty nejběžněji používaný standardní zinc inzulín existuje jako suspenze mikrokrystalů inaktivního hexamerního inzulínu. Rozpad mikrokrystalů, který je následován disociací hexameru na aktivní monomerní formu, může vést k oddálené a individuálně variabilní absorbcí inzulínu do krevního řečiště (F. Liu, a kol., Bioconjugate Chem., 8, 666-672 (1997); T. Uchio, a kol., Adv. Drug Del. Rev., 35, 289-306 (1999); K. Hinds, a kol., Bioconjugate Chem., 11, 195-201 (2000). Inzulínové přípravky také trpí fyzikální nestabilitou, která je způsobena tendencí inzulínu vytvářet vlákna a nerozpustné precipitáty. Precipitace je zvláště problematická pro přípravky, u kterých je zamýšleno použití v inzulínových pumpách. Inzulínové preparáty také mají sklon k chemické degradaci, např. neenzymatická deaminace a tvorba transformačních produktů o vysoké molekulární hmotnosti, jako jsou kovalentní inzulínové dimery (Brange, J., a kol., Pharm. Res., 9, 715-726 (1992); Brange, J., a kol., Pharm. Res., 9, 727-734 (1992)). Jsou významné doklady o tom, že výskyt imunologických reakcí na inzulín může být důsledkem přítomnosti těchto kovalentních inzulínových agregátů (Robbins,

D. C., a kol., Diabetes, 36, 838-841 (1987). Kromě toho i vysoce vyčištěný lidský inzulín je slabě imunogenní (Kim, tamtéž).

Vedle problémů s nestabilitou preparátů, která byla zmíněna výše, existuje také pokud se týká podávání inzulínu, řada nedostatků, spojených se současnými způsoby inzulínové terapie. Inzulín je běžně podáván ve formě subkutánních injekcí, v typickém případě do břicha nebo horní části stehna. Inzulín také může být podáván intravenózně nebo intramuskulárně. Aby byla udržována přijatelná hladina glukózy v krvi, je často nezbytné injekčně podávat inzulín alespoň jednou nebo dvakrát denně, s doplňkovými injekcemi inzulínu, podávanými v případě nezbytnosti. Agresivní léčba diabetů může vyžadovat ještě daleko častější injekce, přičemž pacient přesně sleduje hladinu glukózy v krvi za pomoci domácí diagnostické soupravy. Podávání inzulínu pomocí injekcí je v řadě ohledů nežádoucí. Zaprvé mnoho pacientů shledává obtížné a únavné injektovat sami sebe tak často, jak je nezbytné pro udržení přijatelná hladiny glukózy v krvi. Ve skutečnost mnoho pacientů typu 2 se po léta vyhýbá užívání inzulínu, protože mají chorobnou bázeň před injekční jehlou. Takový odpor může vést k nedodržování léčeného postupu, což může v nejvážnějších případech být životně ohrožující. Kromě toho systémová absorbce inzulínu zsubkutánní injekce je relativně pomalá, často vyžaduje dobu od 45 do 90 minut, dokonce i když jsou použity nejrychleji působící inzulínové přípravky. Tedy dlouhodobým cílem bylo poskytnout alternativní inzulínové přípravky a způsoby podávání, které by se vyhnuly potřebě injektovat sám sebe a které mohou poskytnout inzulín, který je pro systém rychle dostupný.

Bylo zkoumáno množství přípravků neinjekčního typu, jako jsou orální nebo nazální, nicméně v průběhu těchto snah se nepodařilo vyvinout žádný komerčně realizovatelný orální nebo nazální systém podávání inzulínu (Patton a kol., Adv. Drug Delivery Reviews, 1, 35 (2-3), 235-247 (1999)), zvláště kvůli velmi nízké a proměnlivé biologické dostupnosti (Hilsted, J., a kol., Diabetologia 38, 680-684 (1995)). Třebaže biologická dostupnost může být zvýšena zesilovači absorbce, tato činidla mohou poškodit sliznici.

Nicméně byly vyvinuty inhalovatelné inzulínové přípravky, které se zdají být poměrně slibné při překonávání mnoha výše zmiňovaných problémů. Například patent US č. 5 997 848 (Patton a kol., Inhale Therapeutic Systems, lne.) popisuje suché práškové inzulínové přípravky, které (i) jsou chemicky a fyzikálně stabilní při teplotě místnosti a (ii) pokud jsou inhalovány, jsou rychle absorbovány epiteliálními buňkami alveolární oblasti do krevního oběhu. Rychle působící inzulínové přípravky a postupy, které jsou zde popsané, se vyhýbají obtížnému injektování sebe samého a v průběhu tříměsíčních studií efektivity bylo ukázáno, že poskytují při srovnávání se subkutánní injekcí ekvivalentní kontrolu glukózy u diabetiků typu I a typu II závisejících na inzulínu (Patton a kol., Adv. Drug Delivery Reviews, I, 35 (2-3), 235-247 (1999)). Přípravky inzulínu ve formě suchého prášku popsané Pattonem a kol., sice překonávají problémy nestability přípravků a neochoty pacientů dodržovat léčebné postupy, stále však pro efektivní kontrolu úrovně glukózy vyžadují časté (např. v průběhu jídla) inhalace inzulínu. Kromě toho, typický inzulínový dávkový režim tohoto typu, založený na rychle působícím inhalovatelném inzulínu, stále ještě vyžaduje jednotlivou injekci inzulínu s prodlouženou dobou účinku v době spánku u diabetiků typu I a u některých diabetiků typu II. Tedy stále existuje potřeba aktivních, rozpustných, stabilních forem inzulínu, které vyžadují méně časté dávkování, tj. přípravků inzulínu s prodlouženou dobou účinku, s výhodou podávaných pomocí inhalace.

Přípravky inzulínu s prodlouženou dobou účinku jsou v ideálním případě charakterizovány tím, že jejich působení má velmi pomalý nástup a že mají prodloužený, relativně plochý pík účinnosti. Současné přípravky injekčně podávaného inzulínu s prodlouženou dobou účinku, např. ultralente (suspenze zinc inzulínu) a suspenze protamin zinc inzulínu, jsou velmi neuspokojivé. Tyto přípravky mají tendenci poskytovat inzulín spíše ve formě píku, než poskytovat nízkou základní koncentraci inzulínu, jejich působení není předpověditelné a v typickém případě vykazují dobu působení ne delší než den. Dlouhý poločas ultralente inzulínu činí obtížné určit optimální dávkový rozsah a protamin zinc inzulín je užíván zřídka pro jeho nepředpověditelný a prodloužený způsob působení (Goodman & Gilman, „The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9. vydání, vydavatelství Hardman a Limbird, 1996, str. 1500). Další injekčně podávané přípravky s prodlouženou dobou účinku, které byly neúspěšně zkoumány, zahrnují přípravky, kdy je inzulín vázaný k albuminu a přípravky obsahující komplex kobaltu a hexameru inzulínu (Hoffman, A. Ziv E., Clin. Pharmacokinet, 33 (4):285-301 (1997)).

Byla také zkoumána řada přípravků plicního inzulínu s prodlouženou dobou účinku. Jedná se o liposomy obsahující vzhledem k inzulínu velký nadbytek lipidů (Liu, F-Y., a kol., Pharm. Res. 10, 228-232, (1993)), inzulínové částice tvořené na porézním kopolymeru kyseliny mléčné a kyseliny glykolové (PLGA) (Edwards, D. A., a kol., Science 276 (5320), 1868-1871 (1997)), PLGA nanočástice ve formě aerosolu (Kawashima, Y., a kol., J. Controlled Release, 62 (1-2): 279-287 (1999)) a přípravky fosfolipid/protamin inzulín (Vanbever, R., a kol., Proč. Control Rel. Bioact. Mater. 25, 261-262 (1998)). Bohužel bylo zjištěno, že všechny tyto přípravky nejsou uspokojivé, buď pro nízkou biologickou dostupnost, když byly podávány krysám, nebo pro selhání přípravku. Tedy je dlouho pociťována potřeba optimalizace inzulínových přípravků s prodlouženou dobou účinku, které by byly biologicky aktivní, fyzikálně a chemicky stabilní, rozpustné ve vodě a s výhodou monomerní. V ideálním případě se bude jednat o přípravek vhodný pro plicní podávání.

Podstata vynálezu

Z jednoho hlediska je předložený vynález založen na inzulínových prostředcích, vhodných pro podávání do systémového oběhu plicní cestou. Přesněji řečeno prostředky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, obsahují konjugát inzulínu, kovalentně vázaného k jedné nebo více molekulám hydrofilního polymeru, který není přírodního původu. Ve výhodném provedení, hydrofilní polymer, který není přírodního původu, kovalentně vázaný k inzulínu, je polyalkylenglykol, jako je polyethylenglykol (PEG), třebaže všechna zde předložená provedení mohou být aplikována rovněž na jiné hydrofilní polymery, který nejsou přírodního původu.

Obecně konjugát inzulín-polymer, který je předmětem tohoto vynálezu, bude vykazovat zdokonalené farmakokinetické a farmakodynamické vlastnosti oproti přírodnímu inzulínu, zvláště když je podáván do plic. V jednom vykazuje zde poskytnutý konjugát PEG-inzulín dobrou absolutní biologickou dostupnost, když je podán do plic a hluboko do plic. V určitém provedení konjugát PEG-inzulín, který je předmětem tohoto vynálezu, je charakterizován absolutní plicní biologickou dostupností, která je větší než u přírodního inzulínu. S výhodou je konjugát PEG-inzulín, který je předmětem tohoto vynálezu, charakterizován tím, že má v plících absolutní biologickou dostupnost, která ·· ·· ·· · ·· · • · · · φφφ · φ φ φ φφ · φ φ φ · · · ·· φ · · φ φ φφ φφφφφ • ••ΦΦΦ · φ φ φφφφφ φφ ··· · · · je alespoň 1,5 až 2,Okřát vyšší, než biologická dostupnost přírodního inzulínu. V nejvýhodnějším provedení konjugát PEG-inzulín podle tohoto vynálezu je charakterizován absolutní biologickou dostupností v plících, která je vyšší o 15 %, ještě výhodněji vyšší o 20 % nebo nejvýhodněji vyšší o 30 %.

V ještě jiném provedení konjugát PEG-inzulín, který je předmětem tohoto vynálezu, když je podán pulmonárně, vykazuje Tmax (doba vyžadovaná pro dosažení maximální koncentrace), která je alespoň 1,5násobkem Tmax přírodního inzulínu, nebo výhodněji je alespoň 2 až 3násobkem Tmax přírodního inzulínu, nebo ještě výhodněji je alespoň 5násobkem Tmax přírodního inzulínu.

Polyethylenglykoly používané pro přípravu konjugátů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou vykazovat několik rozdílných rysů. V jednom provedení vynálezu je polyethylenglykolová část zde popsaného konjugátu PEG-inzulín chráněna čepičkou, představovanou inertní nebo nereaktivní skupinou, jako je alkoxylová skupina, přesněji řečeno methoxylová skupina.

V jiném provedení bude polyethylenglykolová část konjugátu mít strukturu dobře přizpůsobenou pro připojení k inzulínu, včetně lineárních polyethylenglykolů a mnohoramenných nebo rozvětvených polyethylenglykolů. V ještě jiném provedení může být konjugát PEG-inzulín složen ze dvou inzulínových molekul, derivovaných jednou funkční skupinou, spojených vzájemně polyethylenglykolem, který je zaktivován dvěmi funkčními skupinami (inzulín-PEG-inzulín). Jinou možností je, že molekula inzulínu v této „činkovité“ struktuře může být dále modifikována dalšími PEG molekulami.

V jiném provedení se konjugát PEG-inzulín, který je předmětem tohoto vynálezu, obsahuje větvený polyethylenglykol, která má rozvětvenou složku na jedné straně polymerového řetězce a dvě volné reaktivní skupiny (nebo násobek dvou) vázané k rozvětvené složce, které slouží ke kovalentnímu připojení inzulínu. V takovémto provedení vynálezu umožňuje rozvětvená struktura polyethylenglykolu připojení polymerového řetězce ke dvěma nebo více molekulám inzulínu.

Polyethylenglykolová část inzulínového konjugátu, který je předmětem tohoto vynálezu, může volitelně obsahovat jednu nebo více degradovatelných vazeb.

V typickém případě je inzulín kovalentně vázán k polyethylenglykolu pomocí vazebné složky, která je umístěna na konci molekuly polyethylenglykolu. Mezi vazebné složky, výhodné pro použití v tomto vynálezu patří ty, které jsou vhodné pro spojení s reaktivními aminoskupinami inzulínu, jako jsou aktivní N-hydroxysukcinimidové estery, aktivní uhličitany, aldehydy a acetaly.

V ještě jiném provedení se bude polyethylenglykol, kovalentně vázaný k inzulínu vkonjugátu, který je předmětem tohoto vynálezu, skládat z 2 až 300 podjednotek (OCH2CH2), výhodně z 4 až 200 podjednotek a ještě výhodněji z 10 až 100 podjednotek.

V alternativním provedení bude mít polyethylenglykol, kovalentně vázaný k inzulínu, průměrnou nominální molekulovou hmotnost od 200 do 10 000 daltonů. Ve výhodném provedení bude mít PEG průměrnou nominální molekulovou hmotnost od 200 do 5000 daltonů. V ještě výhodnějším provedení bude mít PEG průměrnou nominální molekulovou hmotnost od 200 do 2000 daltonů nebo od 100 do 1000 daltonů.

V určitém provedení obsahuje inzulínová část konjugátu přirozený lidský inzulín.

V ještě jiném provedení vykazuje konjugát prostředku, který je předmětem tohoto vynálezu, čistotu vyšší než 90 % (tj. z konjugátové části prostředku je 90 nebo více procent hmotnosti tvořeno jedním nebo více konjugáty PEG-inzulín). Tedy je možno říci, že prostředky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, je možno charakterizovat vysokým stupněm čistoty konjugované inzulínové složky, tj. není přítomné detekovatelné množství různých druhů volných polyethylenglykolů a jiných polyethylenglykolu příbuzných nečistot.

V jednom provedení obsahuje prostředek, který je předmětem tohoto vynálezu, konjugát, ve kterém je inzulín kovalentně vázán na PEG na svém jednom nebo více svých aminových míst. Inzulín obsažený v prostředku, který je předmětem tohoto vynálezu, může být monosubstituovaný (tj. může být k němu kovalentně vázán jeden PEG). Určité monosubstituované konjugáty PEG-inzulín, mohou mít podle tohoto vynálezu polyethylenglykolovou složku kovalentně vázánou na místo inzulínové molekuly, vybrané ze skupiny zahrnující PheB1, GlyA1 a LysB29.

Ve výhodném provedení je polyethylenglykolová složka kovalentně připojena k inzulínu na místě PheB1. V jednom provedení je alespoň 75 % B-1Phe míst na inzulínu kovalentně připojeno k PEG. V jiném provedení je alespoň 90 % B-1Phe míst na inzulínu kovalentně připojeno k PEG.

Prostředky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, se také mohou skládat ze směsi monokonjugovaného a dikonjugovaného PEG-inzulínu, které mají jednu nebo více výše popsaných vlastností. Takové prostředky mohou dále obsahovat trikonjugovaný PEG-inzulín.

00 00 0 ·· · ·· 9 9 999 0 99

99 0 0 · 9999 •9 999 9 « 0 · 0 0000

000 00 00 000 · · ·

V alternativním provedení je konjugát PEG-inzulín, připravený podle tohoto vynálezu, charakterizován rychlostí proteolýzy, která je snížena vzhledem k nepegylovanému nebo přírodnímu inzulínu.

Prostředek podle tohoto vynálezu může také obsahovat směs konjugátu PEGinzulín a nechemicky modifikovaného nebo přírodního inzulínu.

Do rámce vynálezu je také zahrnuta aerosolová forma výše popsaného prostředku.

Prostředky podle tohoto vynálezu mohou být rozpuštěny nebo suspendovány v tekutině, nebo mohou být v suché formě a mohou dále obsahovat farmaceuticky přijatelný excipient.

Je zde také poskytnut biologicky aktivní konjugát polyethylenglykol-inzulín, vhodný pro podávání pomocí inhalace hluboko do plic.

Z jiného hlediska poskytuje vynález způsob podávání konjugátu PEG-inzulín savčímu jedinci, u kterého je tento vyžadován, pomocí inhalování prostředku PEGinzulín ve formě aerosolu, jak bylo popsáno výše.

V jiném ohledu vynález také poskytuje způsob podávání v podstatě neimunogenního inzulínového prostředku, vhodného pro pulmonární administraci. Způsob zahrnuje kroky kovalentního připojení inzulínu k jedné nebo více molekulám hydrofilního polymerového konjugátu, který se v přírodě nevyskytuje, jak bylo popsáno výše, a podávání prostředku do plic jedince pomocí inhalace, výsledkem čehož je, že inzulín prochází plícemi a vstupuje do krevního oběhu.

Z jiného hlediska je poskytnut způsob pro podávání inzulínového prostředku s prodlouženou dobou působení, vhodného pro podávání do plic lidského jedince. Způsob zahrnuje kovalentní připojení inzulínu k jedné nebo více molekulám hydrofilního polymeru, čímž je poskytnut prostředek, který obsahuje konjugát inzulín-hydrofilní polymer, a podávání prostředku do plic jedince pomocí inhalace. Po kroku podání dojde ktomu, že inzulín prochází plícemi, vstupuje do krevního oběhu a zvýšená hladina inzulínu v krvi je udržována alespoň 8 hodin po podání.

Konjugát PEG-inzulín, který je předmětem tohoto vynálezu, pokud je převeden do formy aerosolu a podáván cestou inhalace, je výhodný pro léčení cukrovky -diabetes mellitus (DM).

Tyto a další objekty a význačné znaky vynálezu se stanou plně zřejmé po přečtení následujícího podrobného popisu.

Návrh, syntéza a charakteristika různých reprezentativních konjugátů PEGinzulín byly optimalizovány pro podávání do plic. Třebaže příprava molekul PEG-inzulín byla již dříve popsána, použití kovalentního připojení na PEG pro získání prodloužené doby účinku preparátů inhalovaného inzulínu, nebylo dříve demonstrováno. V tomto ohledu bylo výzvou pro přihlašovatele poskytnout konjugáty PEG-inzulín, které mají optimální rovnováhu počtu, umístění, struktury a molekulové hmotnosti řetězců PEG, kovalentně připojených k molekule inzulínu, aby byly získány inzulínové prostředky vhodné pro podávání do systémového oběhu, přičemž výhodou cestou je podání hluboko do plic. Ve světle výše uvedeného je překvapující, že vynálezci objevili určité PEG-modifikované inzulínové preparáty, které mají jeden nebo více následujících rysů:

(i) že jsou biologicky aktivní, tj. že vykazují alespoň 5 % aktivity přírodního inzulínu, nebo s výhodou mají biologickou aktivitu, která je v podstatě srovnatelná nebo pouze minimálně redukována oproti biologické aktivitě přírodního inzulínu, nebo ještě výhodněji, má aktivitu, která je oproti biologické aktivitě přírodního inzulínu vylepšena, (ii) že jsou absorbovány z plic do krevního oběhu (opačně k jevu „uváznutí“ v plících), (iii) že jsou fyzikálně a chemicky stabilní, (iv) že, když jsou podány do plic, dosáhnou takové hladiny inzulínu v krvi, která je zvýšena nad základní úroveň po dobu alespoň 8 hodin po podání, (v) že jsou rezistentní k enzymatickému napadení enzymy, které degradují inzulín, a (vi) že vykazují poločasy, které překračují poločasy nepegylovaného inzulínu, když jsou podány cestou inhalace, podrobnosti se stanou zřejmější po přečtení následujícího popisu.

I. Definice

Zde používané termíny mají následující uvedené významy.

V popisu a v připojených patentových nárocích používané termíny v jednotném čísle zahrnují i množné číslo věcí, na které je odkazováno, pokud z kontextu jasně nevyplývá opak.

Má se za to, že zde používaný termín „inzulín“ zahrnuje proinzulín a dále zahrnuje jakýkoli purifikovaný izolovaný polypeptid, který obsahuje část nebo celou primární strukturní konformaci (to jest sousedící série aminokyselinových zbytků) a alespoň jednu z biologických vlastností přirozeně se vyskytujícího inzulínu. Obecně je míněno, že termín „inzulín“ zahrnuje přirozený a synteticky derivovaný inzulín, včetně jejich glykosylovaných forem a rovněž jejich analogy, včetně polypeptidů, které mají jednu nebo více aminokyselinových modifikací (delece, inzerce nebo substituce) do rozsahu, kdy si v podstatě zachovají alespoň 80 % nebo více terapeutické aktivity,

9 · · · · · · · · ··· ·· · 9 9 9 9

999 9 9 99 99999 ·· · · 9 9 9 9

9 9 99 999 99 · spojené s inzulínem plné délky (před zde popsanou chemickou modifikací pomocí hydrofilního polymeru, nevyskytujícího se v přírodě). Inzulíny předloženého vynálezu mohou být produkovány jakýmkoli standardním způsobem, včetně extrakce ze slinivky, expresí rekombinant a in vitro syntézy polypeptidu, vynález však není omezen jen na tyto uvedené způsoby. Inzulín přírodní nebo inzulín standardního typu označuje inzulín, který má aminokyselinovou sekvenci odpovídající aminokyselinové sekvenci inzulínu, nacházejícího se v přírodě. Inzulín přírodní nebo inzulín standardního typu může být přírodního původu (tj. izolovaný z přírodního zdroje) nebo produkovaný synteticky.

„Fyziologicky štěpitelná“ nebo „degradovatelná“ vazba je slabá vazba, která reaguje s vodou (tj. je hydrolyzována) za fyziologických podmínek. Výhodné jsou vazby, které mají poločas hydrolýzy při pH 8 a 25°C kratší než 30 minut. Tendence vazby hydrolyzovat ve vodě bude záviset nikoli pouze na obecném typu vazby spojující dva centrální atomy, ale také na substituentech, které jsou k těmto centrálním atomům připojeny. Vhodné hydrolyticky nestabilní nebo slabé vazby zahrnují mimo jiné uhličitanové estery, fosfátové estery, anhydridy, acetaly, ketaly, acylalkoxyethery, iminy, orthoestery, peptidy a oligonukleotidy.

„Hydrolyticky stabilní“ spojení nebo vazba označuje chemickou vazbu, v typickém případě kovalentní vazbu, která je ve vodě v podstatě stabilní, tj. nepodléhá za fyziologických podmínek po rozsáhlé časové období hydrolýze v jakémkoli patrném rozsahu. Příklady hydrolyticky stabilních spojení zahrnují mimo jiné následující: vazby uhlík-uhlík (např. v alifatických řetězcích), ethery, amidy, uretany a podobné. Obecně řečeno, hydrolyticky stabilní spojení je takové, které vykazuje rychlost hydrolýzy menší než 1 až 2 % za den za fyziologických podmínek. Rychlosti hydrolýzy typických chemických vazeb je možno nalézt ve většině standardních chemických učebnic.

Do zde používaného termínu „PEG“ nebo polyethylenglykol je zde zahrnut jakýkoli ve vodě rozpustný polyalkylenoxid. V nejtypičtějším případě, polyethylenglykoly vhodné pro použití v předloženém vynálezu, budou obsahovat následující strukturu, „~CH2CH2O(CH2CH₂O)nCH2CH2-„ přičemž koncové skupiny nebo aktuální struktura celkové polyethylenglykolové složky mohou být variabilní. Jedním obecně používaným polyethylenglykolem je polyethylenglykol na konci chráněný čepičkou, kde jeden konec polyethylenglykolu je chráněn čepičkou tvořenou relativně inaktivní, typicky alkoxylovou skupinou jako je methoxyskupina (-OCH3), zatímco druhým koncem je hydroxylová skupina, která může být podrobena chemické modifikaci. Specifické formy polyethylenglykolu, vhodné pro použití k přípravě konjugátů inzulínu, které jsou ©© ©· ·· · ·· · • · · · · · · · · ·· ··· ♦· · · · · · • © ·©· · ·©· · ··©· ··· ··· ©·© ©··· ·· ·· ··· ·· · předmětem tohoto vynálezu, jako jsou větvené, lineární a podobné polyethylenglykoly, budou popsány podrobněji dále.

Termín „konjugát PEG-inzulín“ označuje molekulu inzulínu (jak byla definována dříve), která má k sobě kovalentně připojenou alespoň jednu polyethylenglykolovou složku a vykazuje jakýkoli měřitelný stupeň inzulínové aktivity (například od 2 % do 10 % nebo více biologické aktivity přírodního inzulínu).

„nominální průměrná molekulová hmotnost“ ve vztahu k hydrofilnímu polymeru, který se nevyskytuje v přírodě, a je předmětem tohoto vynálezu, jako je například polyethylenglykol, označuje průměrnou molekulovou hmotnost polymeru, určovanou v typickém případě vylučovací chromatografií, pomocí rozptylu světa nebo pomocí vnitřní rychlosti v 1,2,4-trichlorbenzenu. Polymery, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou v typickém případě polydisperzní, vykazující nízkou hodnotu polydisperze, nižší než 1,05.

„Lipofilní složka“ je taková složka, která když je podle předloženého vynálezu připojena k hydrofilnímu polymeru buď pomocí degradovatelné nebo nedegradovatelné vazby, je schopna podstatně změnit hydrofílní povahu polymeru a tím i konjugátu polymer-inzulín. Typické lipofilní skupiny, jako jsou mastné kyseliny, budou obsahovat 12 až 22 atomů uhlíku.

Termín „v podstatě neimunogenní“ inzulínový konjugát, který je předmětem tohoto vynálezu, vykazuje vzhledem k přírodnímu inzulínu sníženou imunogenicitu. Imunogenicita může být stanovena pomocí určování titrů protilátek u myší nebo s výhodou u králíků po podání konjugátu PEG-inzulín, vzhledem k nemodifikovanému inzulínu.

Termín „alkyl“ označuje uhlovodíkové řetězce obsahující v typickém případě 1 až 15 atomů. Uhlovodíkové řetězce jsou s výhodou, ale nikoli nutně, nasycené a volitelně mohou obsahovat k sobě připojené další funkční skupiny. Uhlovodíkové řetězce mohou být rozvětvené nebo nerozvětvené. Mezi příklady alkylových skupin patří ethyl, propyl,

1-methylbutyl, 1-ethylpropyl a 3-methylpentyl. V jednom výhodném provedení vynálezu jsou použity takové konjugáty obsahující alkylovaný PEG, a zvláště lineární alkylovaný PEG, jejichž alkylová část neobsahuje mastnou kyselinu nebo jinou lipofilní součást.

Termín „nižší alkyl“ označuje alkylovou skupinu obsahující od 1 do 5 uhlíkových atomů a může mít nerozvětvený nebo rozvětvený řetězec, jak je vidět na příkladech methyl, ethyl, n-butyl, i-butyl, t-butyl.

·· ·· ·· · ·· · • · · · · · ♦· · · · ··· ·· · · 9 * ·

9 9 9 9 · 9 9 9 ····· ··· ··· 9 9 9

9999 99 99 ··· ·· ·

Termín „absolutní pulmonární biologická dostupnost“ je takové procento dávky léku (např. konjugátu PEG-inzulín, připraveného podle tohoto vynálezu) dodané do plic, která je absorbována a vstupuje do krevního oběhu savce, vzhledem k intravenózní dávce přírodního inzulínu. Mezi reprezentativní modelové systémy pro určování absolutní pulmonární biologické dostupnosti jsou zahrnuti krysa, pes, králík a opice. Inhalovatelné prostředky PEG-inzulín, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou z jednoho hlediska charakterizovány absolutní pulmonární biologickou dostupností alespoň 20 % v plazmě nebo krvi, přičemž absolutní pulmonární biologická dostupnost se všeobecně pohybuje od 10 % do 30 % nebo více. Všeobecně bude konjugát PEGinzulín, který je předmětem tohoto vynálezu,v závislosti na své specifické podstatě, vykazovat alespoň jednu z následujících hodnot absolutní pulmonární biologické dostupnosti: 10%, 12%, 15%, 18%, 20%, 22%, 25%, 30%, 32%, 35% nebo vyšší. Absolutní pulmonární biologická dostupnost může být odhadnuta pomocí měření absorbce z přímého intratracheálního podání, vkapání nebo inhalace prostředku, který obsahuje konjugát PEG-inzulín.

Termín „distribuční fáze“ ve vztahu k poločasu konjugátu PEG-inzulín označuje počáteční rychlou fázi, během které inzulín mizí z plazmy. Konečná pomalá nebo eliminační fáze poločasu označuje pomalou fázi, během které je inzulín z těla eliminován.

Termín inzulín s „prodlouženým účinkem“ označuje inzulín, u kterého účinek (tj. zvýšení hladiny v krvi nad základní úroveň) přetrvává alespoň po dobu 6 hodin, s výhodou alespoň 8 hodin.

Termín „snížené hladiny glukózy“ označuje hladiny glukózy v krvi (např. po podání konjugátu PEG-inzulín, který je předmětem tohoto vynálezu), které jsou sníženy pod základní úroveň nebo základní hladinu.

Termín „farmaceuticky přijatelná sůl“ zahrnuje mimo jiné aminokyselinové soli, soli připravené s anorganickými kyselinami jako jsou chloridy, sírany, fosforečnany, difosforečnany, bromidy a dusičnany, nebo soli připravené s organickými kyselinami, jako jsou malát, maleát, fumarát, sukcinát, ethylsukcinát, citrát, octan, mléčnan, methansulfonát, benzoát, askorbát, p-toluensulfonát, sůl kyseliny palmitové, salicylát a stearát, rovněž tak soli kyseliny estolové, gluceptové a laktobionové. Podobně soli obsahující farmaceuticky přijatelné kationty zahrnují mimo jiné sodík, draslík, vápník, hořčík, hliník lithium a amonný iont (včetně substituovaného amonného iontu).

9

9 9

9999

9 ·· 99 9

9 9 9 9 9 99

99 999

9 9 9 9 9 9

9 9 · 9 9

9999 9 9 99 999

Termín „aminokyselina“ označuje jakoukoli sloučeninu obsahující jak aminoskupinu, tak karboxylovou skupinu. Třebaže se aminoskupina nejběžněji vyskytuje v pozici sousedící s karboxylovou funkční skupinou, aminoskupina může být umístěna na jakékoli pozici v molekule. Aminokyselina může také obsahovat další funkční skupiny, jako je aminoskupina, thioskupina, karboxylová skupina, karboxamidová skupina, imidazolová skupina atd. Aminokyselina může být syntetického nebo přírodního původu a může být použita buď ve formě racemické směsi nebo ve svých opticky aktivních formách (D- nebo L-), včetně různých poměrů jednotlivých enantiomerů.

„Peptidy“ jsou složeny ze dvou nebo více aminokyselin spojených peptidovou vazbou. Peptidy mohou být homo- nebo hetero-peptidy (tj. složené ze shodných nebo různých aminokyselinových zbytků, jak jsou definovány výše), a mohou varírovat v délce od dvou aminokyselin do několika stovek aminokyselin.

Termín „suchý prášek“ označuje prostředek, který v typickém případě obsahuje méně než 10 % vlhkosti.

Prostředek, který je „vhodný pro podávání do plic“ označuje prostředek, který je možno převést do stavu aerosolu a jedinec jej může inhalovat, takže část aerosolových částic dosáhne plic a umožní penetraci do nižšího respiračního traktu a plicních sklípků. Takový prostředek je považován za „dýchatelný“ nebo „inhalovatelný“.

„Aerosolové“ částice jsou částice tekutiny nebo pevné látky, které jsou suspendovány v plynu, typicky jako výsledek působení inhalačního zařízení, jako jsou inhalátor suchého prášku, atomizér, inhalátor odměřující dávky nebo rozprašovač.

Termín „emitovaná dávka“ nebo „ED“ poskytuje údaj o dodání lékového přípravku ze vhodného inhalačního zařízení poté, co toto zařízení provede disperzní krok. Přesněji řečeno, pro přípravky ve formě suchého prášku je ED údajem o procentu prášku, který je odebrán z jednotkového balení a které opouští náústek inhalačního zařízení. ED je definována jako poměr dávky dodané inhalačním zařízením k nominální dávce (tj. hmota prášku na jednotku dávky umístěné do vhodného inhalačního zařízení před jeho zapnutím). ED je experimentálně určovaný parametr a v typickém případě je určován pomocí in vitro soupravy, která napodobuje dávkování pro pacienta. Pro určení hodnoty ED je nominální dávka suchého prášku, v typickém případě ve formě dávkové jednotky, umístěna do vhodného inhalátoru suchého prášku (jako takový, který je popsán v patentu US č. 5 785 049, přidělený Inhale Therapeutic Systems), který je potom uveden do chodu a disperguje prášek. Výsledný aerosolový oblak je potom ze • w ·· » · · « • ··

9 9 « » · · « ·· ·· • 99 » ·· 9 9 9 • · 9 · · • · · · ···· • · · · ··· 99 · zařízení odtažen pomocí vakua a je zadržen na odváženém filtru, který je připevněn na náústku zařízení. Množství prášku, které dosáhne filtru, tvoří emitovanou dávku. Například pro dávkovou formu, která obsahuje 5 mg suchého prášku a je umístěna do inhalačního zařízení, pokud výsledkem disperze prášku je zachycení 4 mg prášku na odváženém filtru, jak bylo popsáno výše, potom emitovaná dávka pro tento prostředek ve formě suchého prášku je: 4 mg (dodaná dávka)/5 mg (nominální dávka) x 100 = 80%. Pro nehomogenní prášky poskytují hodnoty ED spíše údaj o dodání léku z inhalačního zařízení, než o suchém prášku, a jsou založeny na množství léku a nikoli na celkové hmotnosti prášku. Podobně u MDI a dávkových forem rozprašovačů, ED odpovídá procentu léku, které bylo odebráno z dávkové formy a které projde skrz náústek inhalačního zařízení.

„Dávka jemných částic“ nebo „FPD“ je definována jako procento hmotnosti práškových částic, které mají aerodynamický průměr menší než 3,3 pm, což je v typickém případě určováno měřením v Andersenově stupňovitém kladivovém mlýně. Tento parametr poskytuje údaj o procentu částic, které mají největší schopnost dostat se hluboko do plic a zprostředkovat tak příjem lékové substance do pacientova systému.

„Dispergovatelný“ a „dispersní“ prášek je takový prášek, který má hodnotu ED alespoň 30 %, výhodněji 40 až 50 % a ještě výhodněji alespoň 50 až 60 % nebo vyšší.

„Většinový střední průměr“ nebo „MMD“ je mírou průměrné velikostí částic, protože prášky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou obecně polydisperzní (tj. skládají se z částic o určitém rozsahu velikostí). Zde uváděné hodnoty MMD jsou určovány pomocí centrifugační sedimentace, třebaže pro měření středního průměru částice může být použita jakákoli z řady obecně používaných technik (např. elektronová mikroskopie, rozptyl světla, laserová difrakce).

„Většinový střední aerodynamický průměr“ nebo „MMAD“ je mírou aerodynamické velikosti dispergované částice. Aerodynamický průměr je používán pro popis prášku ve formě aerosolu, pokud se týká jeho chování při usazování, a odpovídá průměru koule o jednotkové hustotě, která má stejnou rychlost usazování ve vzduchu jako uvažovaná částice. Aerodynamický průměr v sobě zahrnuje tvar, hustotu a fyzikální velikost částice. Zde je MMAD používán pro označení středního bodu nebo středu distribuce aerodynamické velikosti částic prášku ve formě aerosolu, který je zjišťován, pokud není stanoveno jinak, pomocí stupňovitého kladivového mlýna.

···· ·· ·· ··· ·· ·

Termín „farmaceuticky přijatelný excipient nebo nosič“ zde označuje excipient, který volitelně může být obsažen v prostředku, který je předmětem tohoto vynálezu. Pro prostředky určené k inhalování jsou výhodnými takové excipienty, které mohou být vneseny do plic bez nějakých významných nepříznivých toxikologických účinků pro daného jedince a zvláště pro jeho plíce.

Termín „farmakologický účinné množství“ nebo „fyziologicky účinné množství“ je množství konjugátu PEG-inzulín přítomné ve zde popsaném terapeutickém prostředku, které je potřebné pro dosažení požadované hladiny inzulínu v krevním oběhu, jejímž výsledkem bude udržování plánované hladiny glukózy v krvi. Přesné množství bude záviset na řadě faktorů, např. určitém typu PEG-inzulínu, použitém dodávacím zařízení, složkách a fyzikálních charakteristikách terapeutického prostředku, zamýšlené cílové populaci pacientů, ohledu k pacientům a podobně, a může být určeno snadno osobou se zkušenostmi v oboru, na základě zde poskytnutých informací.

II. Konjugáty inzulínu s hydrofilním polymerem, který se v přírodě nevyskytuje

Podle předloženého vynálezu bylo připraveno několik ukázkových konjugátů PEG-inzulín. Třebaže je při přípravě konjugátů podle předloženého vynálezu dávána přednost polyethylenglykolu, mohou být také použity jiné, ve vodě rozpustné polymery, které se v přírodě nevyskytují. Mezi jiné polymery, vhodné pro použití v předloženém vynálezu, patří polyvinylpyrrolidon, polyvinylalkohol, polyakryloylmorfolin, polyoxazolin a polyoxyethylované polyoly, jako je polyoxyethylovaný glycerol, polyoxyethylovaný sorbitol a polyoxyethylovaná glukóza. Mohou také být použity polymery, které obsahují podjednotky nebo bloky, vybrané zvýše popsaných ve vodě rozpustných polymerů. Dále mohou být použity kopolymery polyethylenglykolu a polypropylenglykolu. Je výhodné, když polymery používané v předloženém vynálezu v podstatě neobsahují skupiny mastných kyselin nebo jiné lipofilní složky.

V následující části je ukázáno, že pečlivým výběrem jedné nebo více složek PEG, pegylačních reagencií, pegylačních míst na inzulínu, podmínek pegylace a následné purifikace konjugátu, mohou být získány prostředky PEG-inzulín s požadovanými klinickými vlastnostmi (vylepšené farmakokinetické a/nebo farmakodynamické vlastnosti). Nyní budou podány specifické rysy konjugátů PEGinzulín, které jsou předmětem tohoto vynálezu.

A. Strukturní rysy polymeru a výsledného konjugátu

Konjugát PEG-inzulín, který je předmětem tohoto vynálezu, bude v typickém případě obsahovat jeden nebo více řetězců polyethylenglykolu, z nichž každý má • · · • · · · · molekulovou hmotnost v rozsahu 200 až 40 000 daltonů, s výhodou v rozsahu 200 až 10 000 daltonů. Bude výhodné, když polyethylenglykol používaný v předloženém vynálezu bude mít molekulovou hmotnost spadající do jednoho z následujících rozsahů: od 200 do 10 000 daltonů, od 200 do 7 500 daltonů, od 200 do 6000 daltonů, od 200 do 5000 daltonů, od 200 do 3000 daltonů, od 200 do 2000 daltonů a od 200 do 1000 daltonů. V příkladech 1 až 4 jsou uvedeny příklady konjugátů, připravených s polyethylenglykoly o molekulové hmotnosti 5000 daltonů, 2000 daltonů a 750 daltonů.

PEG-inzulíny výhodné pro podávání do plic budou mít složku PEG o molekulové hmotnosti menší než 5000 daltonů, s výhodou menší než 2000 daltonů a dokonce méně než 1000 daltonů. V jednom určitém provedení vynálezu má konjugát PEGinzulín složku PEG, která má jednu z následujících průměrných molekulových hmotností: 200, 300, 400, 500, 600, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000 nebo 5000. Polyethylenglykoly s vyššími molekulovými hmotnostmi mohou být v jistých případech méně výhodné, kvůli potenciální ztrátě aktivity inzulínové molekuly nebo u plicních aplikací kvůli snížené účinnosti při procházení plícemi (příklad 8).

Zatímco polyethylenglykoly s nižší molekulovou hmotností mohou být výhodné pro zvýšení biologické dostupnosti, polyethylenglykolové řetězce s vysokou molekulovou hmotností, např. s průměrnou molekulovou hmotností 5000, 10 000, 15 000, 20 000, 25 000, 30 000 nebo 40 000 daltonů nebo vyšší, třebaže bylo zjištěno, že snižují biologickou dostupnost přírodního inzulínu, mohou být výhodné pro zvýšení poločasu, zvláště v případě injekčně podávaných přípravků. Tedy u konjugátu PEGinzulín se složkou PEG o vysoké molekulové hmotnosti může významné vylepšení farmakokinetických parametrů, např. oblast pod křivkou (AUC), více než vykompenzovat jeho sníženou aktivitu.

Pokud se jedná o počet podjednotek, PEGy vhodné pro použití v předloženém vynálezu, budou v typickém případě obsahovat takové množství (OCH2CH2) podjednotek, které spadá do jednoho nebo více z následujících rozsahů: 2 až 900 podjednotek, od 4 do 200 podjednotek, od 4 do 170 podjednotek, od 4 do 140 podjednotek, od 4 do 100 podjednotek, od 10 do 100 podjednotek, od 4 do 70 podjednotek, od 4 do 45 podjednotek a od 4 do 25 podjednotek.

Konjugát PEG-inzulín, který je předmětem tohoto vynálezu, může být monosubstituovaný (tj. má tedy PEG připojen na jedno reaktivní místo v inzulínu), disubstituovaný (tj. má složky PEG připojeny na dvě reaktivní místa), trisubstituovaný nebo dokonce mít připojení polymeru na více než třech místech inzulínové molekuly.

Monosubstituovaný, disubstituovaný a trisubstituovaný inzulín jsou zde také označovány jako PEG monomer, dimer, respektive trimer. Mnohočetně substituovaný inzulín (což znamená inzulín, který má složky PEG kovalentně připojeny na 2 nebo více míst své molekuly) bude v typickém případě, nikoli však nezbytně, mít na všech reaktivních místech připojeny stejné složky PEG. Jsou tedy uvažovány i takové prostředky PEG-inzulín, které mají k inzulínu připojeny více než jeden typ složky PEG. Výhodné prostředky, připravené podle předloženého vynálezu, jsou ty, které obsahují především monomerní a/nebo dimerní inzulínové konjugáty. Bylo překvapivě zjištěno, že prostředky PEG-inzulín, které nejsou místně specifické (tj. obsahující směs více druhů PEG-inzulínů, které mají PEG kovalentně připojený na více než jedno reaktivní místo), mají vzhledem k přírodnímu inzulínu vylepšené farmakokinetické a farmakodynamické vlastnosti, zvláště v případě podávání do plic (příklad 11).

Pokud se týká místa PEG-substituce, molekula inzulínu má několik míst vhodných pro pegylaci, přičemž nejvýhodnější, nikoli však nezbytná, jsou místa aminoskupin. Specifické aminové skupiny v inzulínu, vhodné pro pegylaci, zahrnují dva N-konce, GlyA1 a PheB1 a rovněž LysB29. Tato místa na molekule inzulínu jsou zde také označována jednoduše jako A1, B1, respektive B29. Elektrfilně aktivované polyethylenglykoly, vhodné použitelné pro připojení k reaktivním aminoskupinám v molekule inzulínu, zahrnují mPEG2-ALD, mPEG-sukcinimidylpropionát, mPEGsukcinimidylbutanoát, mPEG-CM-HBA-NHA, mPEG-benzotriazoíkarbonát, mPEGacetaldehyddiethylacetal a podobně (Shearwater Corporation, Huntsville, Alabama).

Prostředek, který je předmětem tohoto vynálezu, může v jednom provedení obsahovat převážně (více než 90 %) monosubstituovaného inzulínu, např. mono-A1 inzulín, mono-B1 inzulín nebo mono-B29 inzulín. Takové prostředky mohou obsahovat: i) mono-A1 inzulín, ii) směs mono-A1 inzulínu a mono-B1 inzulínu, nebo iii) směs monoA1 inzulínu, mono-B1 inzulínu a mono-B29 inzulínu. V jiném případě může prostředek, připravený podle tohoto vynálezu, obsahovat převážně disubstituovaný inzulín, např. diA1,B1-inzulín, di-A1,B29-inzulín, di-B1,B29-inzulín nebo jakoukoli z jejich různých kombinací.

V jiném případě může prostředek podle tohoto vynálezu obsahovat směs různých konjugátů PEG-inzulínu (tj. PEG připojený k jakémukoli k kombinace možných připojovacích míst). Použijeme-li jako příklad aminová místa v inzulínu, prostředek podle tohoto vynálezu může obsahovat jakýkoli jeden nebo více z následujících konjugátů PEG-inzulín: monoA1-PEG inzulín, mono-B1-inzulín, mono-B-29 inzulín, di17

A1 ,B1-inzulín, di-A1 ,B29-inzulín, di-B1 ,B29-inzulín nebo tri-A1,B-1,B29-inzulín.

V jednom provedení jsou výhodné prostředky obsahující převážně monomery a dimery.

Reprezentativní prostředky mohou obsahovat směsi konjugátů PEG-inzulín, obsahující alespoň 75 % spojeného monomeru a dimeru, alespoň 80 % spojeného monomeru a dimeru nebo alespoň 85 až 90 % spojeného monomeru a dimeru (např. příklady 5 a 6).

Místo PheB1 je zvláště výhodné pro chemické modifikování připojením PEG. Prostředek obsahující konjugát PEG-inzulín, vhodný pro použití v předloženém vynálezu, může být také konkrétně charakterizován v jednom provedení jako prostředek, v němž je alespoň 70 % B-1 míst v inzulínu kovalentně spojeno s PEG, bez ohledu na celkový počet druhů PEG-inzulínu v prostředku (např. tabulka 3A, příklad 5). Mezi alternativní provedení patří ta, ve kterých alespoň 75 % B-1 míst v inzulínu je kovalentně spojeno s PEG, nebo ve kterých alespoň 80 % B-1 míst v inzulínu je kovalentně spojeno s PEG, nebo ve kterých alespoň 90 % B-1 míst v inzulínu je kovalentně spojeno s PEG.

Přihlašovatelé vynálezu překvapivě zjistili, že náhodné směsi PEG-inzulínu (připravené spíše náhodnou, než místně řízenou pegylací), když jsou aplikovány do plic, mají za následek zvýšené hladiny inzulínu v krvi, které jsou udržovány po dobu alespoň 6 hodin, v typickém případě spíše alespoň po dobu 8 hodin nebo déle po podání. Takové směsi jsou výhodné nikoli pouze pro jejich prospěšné farmakokinetické a farmakodynamické vlastnosti, ale protože jejich syntéza je mnohem jednodušší (nevyžadují mnoho syntetických kroků, nevyžadují použití protektivních skupin, nevyžadují mnoho purifikačních kroků, atd.) než odpovídající místně specifický přístup k syntéze.

Alternativní místa v molekule přírodního inzulínu, která mohou být chemicky modifikována kovalentním připojením PEG, zahrnují 2 C-konce, Arg22B, His10B, His5A, Glu4A, Glu17A, Glu13B a Glu21B.

Vedle přírodního inzulínu mohou být použity nepřírodní inzulíny, které mají jednu nebo více aminokyselinových substitucí, inzercí nebo delecí, takže pro chemickou modifikaci připojením jedné nebo více složek PEG se stanou dostupná další místa. Toto provedení vynálezu je zvláště užitečné pro vnesení dalších, podle přání upravených pegylačních míst do molekuly inzulínu, například pro vytvoření PEGinzulínu, který má zvýšenou odolnost proti enzymatické degradaci. Takový přístup poskytuje větší možnosti při navrhování optimalizovaného inzulínového konjugátu, který má požadovanou rovnováhu mezi aktivitou, stabilitou, rozpustností a farmakologickými vlastnostmi. Třebaže mohou být provedeny mutace, tj. místně specifická mutageneze, na jakémkoli počtu míst uvnitř inzulínové molekuly, výhodná je inzulínová varianta, ve které jakákoli z prvních čtyř aminokyselin B-řetězce je nahrazena cysteinovým zbytkem. Tyto cysteinové zbytky mohou potom reagovat s aktivovaným polyethylenglykolem, který je specifický pro reakci s thiolovými skupinami, např. polymer N-maleinimidylu nebo jiný derivát, jak je popsáno v patentu US č. 5 739 208 a v mezinárodní patentové publikaci č. WO 01/62 827. Mezi příklady polyethylenglykolů selektivních pro thioly, použitelné v tomto zvláštním provedení vynálezu, patří mPEG-derivát rozvětveného maleinimidu (mPEG(MAL)₂), mPEG2-derivát rozvětveného maleinimidu (mPEG2(MAL)₂), mPEG- maleinimid (mPEG-MAL) a mPEG maleinimid (mPEG2-MAL) (Shearwater Corporation). Struktury těchto aktivovaných polyethylenglykolů jsou následující: mPEG-CONHCH[CH₂CONH(CH₂CH₂O)₂CH₂CH₂-MAL, mPEG2-lysin-NHCH[CH₂CONH(CH₂C H₂O)₂CH₂CH₂-MAL]_2i mPEG-MAL, respektive mPEG2-lysin-NHCH₂CH₂NHC(O) ch₂ch₂mal.

Pokud je potřeba zvýšit biologickou aktivitu konjugátu PEG-inzulín, jehož biologická aktivita je poněkud snížena následkem pegylace, mohou být použity další mutace v sekvenci přirozeného inzulínu. Jednou takovou mutací je mutace z Thr8 na His8. Další mutace mohou být nalezeny například v Diabetes Care, 13 (9), (1990), jehož obsah je zde odkazem zahrnut.

Polyethylenglykdly použitelné v předloženém vynálezu mohou vykazovat rozmanité struktury: lineární, vidlicovitě rozštěpené, rozvětvené, činkovité a podobně. V typickém případě je PEG aktivován aktivační skupinou vhodnou pro připojení požadovaného místa nebo míst na inzulínovou molekulu. Aktivovaný PEG bude na konci obsahovat reaktivní skupinu pro reakci s i pro reakci s inzulínem. Zde používaný termín „spojovník“ je míněn tak, že zahrnuje aktivační skupinu pro reakci s inzulínem, umístěnou na konci PEG, a může dále zahrnovat další (v typickém případě inertní) atomy, umístěné mezi polyethylenglykolovou částí polymeru a aktivační skupinou na konci a používá se pro usnadnění přípravy aktivovaného PEG. Spojovníky mohou obsahovat jakýkoli počet atomů, avšak výhodné jsou spojovníky obsahující methylenové skupiny umístěné mezi kostrou PEG a koncovou aktivační skupinou, např. jako v mPEG-sukcinimidylpropionátu a mPEG-butanoátu. Ukázky aktivovaných derivátů PEG a způsoby konjugace těchto činidel k lékům jako je inzulín, jsou v oboru známy a dále jsou popsány v Zalipsky, S., a kol., „Použití frakcionovaných polyethylenglykolů pro • · ·· ·· • Ci · · · · • · · · 0 modifikaci pólypeptidů“ v Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992), a v Advanced Drug Reviews, 16: 157-182 (1995).

V jednom zvláštním provedení vynálezu chybí v polyethylenglykolové části jedna nebo více lipofilních skupin, které významně modifikují vlastnost polymeru nebo konjugátu PEG-inzulín rozpouštět se ve vodě. Tedy polymer nebo neinzulínová část konjugátu, který je předmětem tohoto vynálezu, může obsahovat skupinu atomů, které jsou považovány za více lipofilní než hydrofilní (např. uhlíkový řetězec, který má od 2 do 12 uhlíkových atomů), avšak pokud přítomnost takové skupiny nebo skupin není schopna významně změnit hydrofilní podstatu polymeru nebo konjugátu, potom taková složka může být obsažena v konjugátech předloženého vynálezu. Tedy inzulínový konjugát předloženého vynálezu je charakterizován jako hydrofilní, spíše než lipofilní nebo amfifilní. V typickém případě polymerová část inzulínového konjugátu, před svým připojením k inzulínu, ať již obsahuje takovou lipofilní skupinu či nikoli, bude vykazovat vysoký koeficient hydrofilně/lipofilní rovnováhy (HLB). Číslo HLB je založeno na hmotnostním procentu každého typu skupiny (hydrofilní nebo lipofilní) v molekule; tyto hodnoty obyčejně spadají do oblasti 1 až 40. Polymer vhodný pro použití v konjugátech předloženého vynálezu je jako celek charakterizován jako hydrofilní, bez ohledu na přítomnost jednoho nebo více lipofilních substituentů. V jednom provedení vynálezu je polymerová část konjugátu PEG-inzulín charakterizována číslem HLB větším než 25 a výhodněji větším než 30, nebo ještě výhodněji větším než 35. V určitých provedeních vynálezu, kde může být taková lipofilní součást přítomna, s výhodou není umístěna na konci polyethylenglykolového řetězce.

Mezi rozvětvené polyethylenglykoly, vhodné pro použití v konjugátech předloženého vynálezu, patří takové, které jsou popsány v mezinárodní patentové publikaci č. WO 01/21 469, jejíž obsah je sem ve své úplnosti zahrnut odkazem. Obecně řečeno, rozvětvené polyethylenglykoly mohou být představovány obecným vzorcem R(PEG-OH)_n, kde R představuje centrální „jádro“ molekuly a _n představuje počet ramen. Rozvětvené polyethylenglykoly mají centrální jádro, ze kterého vyčnívají 2 nebo více „PEG“ ramen. V rozvětvené konfiguraci, jádro rozvětveného polymeru obsahuje jedno reaktivní místo pro připojení k inzulínu. Rozvětvené polyethylenglykoly, vhodné pro použití v konjugátech předloženého vynálezu, budou v typickém případě obsahovat méně než 4 PEG ramena a s výhodou budou obsahovat méně než 3 PEG ramena. Rozvětvené polyethylenglykoly poskytují výhodu v tom, že mají jedno reaktivní místo, spojené s větším, kompaktnějším polymerovým útvarem než v případě jejich lineárních PEG partnerů. Jeden zvláštní typ rozvětveného polyethylenglykolu může být reprezentován obecným vzorcem (MeO-PEG-)_pR-X, kde p se rovná 2 nebo 3, R je centrální jaderná struktura, jako je lysin nebo glycerol, která má k sobě připojena 2 až 3 PEG ramena a X představuje jakoukoli vhodnou funkční skupinu, která je nebo která může být aktivována pro připojení k inzulínu. Jeden zvláště výhodný typ rozvětveného polyethylenglykolu je mPEG2-NHS (Shearwater Corporation, Alabama), který má strukturu mPEG2-lysin-sukcinimid.

V ještě jiné rozvětvené struktuře má připojený PEG reaktivní skupinu pro vazbu na protein umístěnou na podélné kostře polyethylenglykolu, místo na konci PEG řetězců, jak bylo uvedeno v předešlém případě. Reaktivní skupiny pro vazbu na inzulín, které vyčnívající z kostry polyethylenglykolu, mohou být stejné nebo se mohou vzájemně lišit. Připojené struktury PEG mohou být užitečné, ale jsou méně výhodné, zvláště u prostředků pro inhalaci.

Alternativně polyethylenglykolová část konjugátu PEG-inzulín může obsahovat vidlicovitou strukturu, která má rozvětvenou složku na jednom konci polymerového řetězce a dvě volné reaktivní skupiny (nebo jakýkoli násobek dvou), vázané na rozvětvenou složku, které slouží pro připojení inzulínu. Příklady polyethylenglykolů s vidlicovitou strukturou jsou popsány v mezinárodní patentové publikaci č. WO 99/45 964, jejíž obsah je sem ve své úplnosti zahrnut odkazem. Vidlicovitě rozvětvený polyethylenglykol může volitelně obsahovat alkylovou nebo „R“ skupinu na opačném konci polymerového řetězce. Přesněji řečeno, konjugát PEG-inzulín s vidlicovitě rozvětveným polyethylenglykolem podle tohoto vynálezu má obecný vzorec: R-PEG-L(Y-inzulín)_n, kde R je alkyl, L je hydrolyticky stabilní špička pobočného řetězce a Y je vazebná skupina, která uskutečňuje chemickou vazbu vidlicovitě rozvětveného polymeru k inzulínu a n je násobek dvou. L může představovat jednu „základní“ skupinu, jako je ,,-CH-„, nebo může obsahovat delší řetězec atomů. Mezi příklady skupin L patří lysin, glycerol, pentaerythritol nebo sorbitol. V typickém případě je specifickým atomem v rozvětvené složce uhlík.

V jednom speciálním provedení vynálezu je vazba vidlicovitě rozvětveného polyethylenglykolu k molekule inzulínu (Y) hydrolyticky stabilní. Ve výhodném provedení je n rovno 2. Mezi vhodné Y složky, před konjugací s reaktivním místem na inzulínu, patří mimo jiné aktivní estery, aktivní uhličitany, aldehydy, isokyanáty, isothiokyanáty, epoxidy, alkoholy, maleinimidy, vinylsulfonáty, hydraziny, dithiopyridiny a jodacetamidy. Výběr vhodné aktivní skupiny bude záviset na zamýšleném místě připojení na molekulu inzulínu a může být snadno proveden osobou se zkušenostmi v oboru. Odpovídající Y skupina ve výsledném konjugátu PEG-inzulín je ta, která vznikne reakcí aktivované skupiny vidlicovitě rozvětveného polymeru s vhodným reaktivním místem na inzulínu. Specifický druh takové výsledné vazby bude zřejmý osobě se zkušenostmi v oboru. Například pokud reaktivní vidlicovitě rozvětvený polyethylenglykol obsahuje aktivovaný ester, jako je sukcinimidový nebo maleinimidový ester, spojení přes aminové místo na inzulínu bude mít za následek vytvoření odpovídající amidové vazby. Tyto speciální vidlicovitě rozvětvené polymery jsou zvláště atraktivní, vzhledem k tomu že poskytují konjugáty, které mají molární poměr inzulínu k PEG 2:1 nebo vyšší. U takových konjugátů je méně pravděpodobné, že by blokovaly místo na inzulínovém receptoru, zatímco stále umožňují flexibilitu při navrhování jak chránit inzulín proti enzymatické degradaci, např. enzymy, které degradují inzulín.

V podobném provedení konjugát inzulínu, obsahující vidlicovitě rozvětvený polyethylenglykol, je představován obecným vzorcem: R-[PEG-L(Y-inzulín)₂]_n. V tomto případě R představuje centrální strukturu, která má ksobě připojen alespoň jeden konjugát PEG-di-inzulín. Z tohoto hlediska jsou pro vynález výhodné ty vidlicovitě rozvětvené polymery, u kterých je n vybráno ze skupiny sestávající z 1, 2, 3, 4, 5 a 6. Demonstrační centrální R struktury mohou být také odvozeny z lysinu, glycerolu pentaerythritolu nebo sorbitolu.

V alternativním provedení může být chemická vazba mezi inzulínem a koncem větve polymeru v jakékoli ze zde uvedených reprezentativních struktur degradovatelná (tj. hydrolyticky nestabilní). Alternativně může být v kostře polymeru obsažena jedna nebo více degradovatelných vazeb, aby bylo umožněna in vivo tvorba konjugátu PEGinzulín, který má menší polyethylenglykolový řetězec, než původně podaný konjugát. Takové volitelné rysy polymerového konjugátu mohou poskytnout další kontrolu nad požadovanými konečnými farmakologickými vlastnostmi konjugátu po podání. Například velký a relativně inertní konjugát (tj. takový, který má k sobě připojený jeden nebo více vysokomolekulárních PEG řetězců, např. jeden nebo více PEG řetězců o molekulové hmotnosti vyšší než 10 000, přičemž konjugát v podstatě nevykazuje žádnou biologickou aktivitu) může být podán buď do plic nebo do krevního oběhu, zde je hydrolyzován a vytvořen tak biologicky aktivní konjugát, který obsahuje část původně přítomného PEG řetězce. Tímto způsobem mohou být ještě účinněji upravovány vlastnosti konjugátu PEG-inzulín. Například absorbce počátečního polymerového • ·· 9» · ···· • · · · · · · ·· · ···· • · · ··· ··« ···· ·· ·· ··· ·· · konjugátu může být pomalá za počátečních podmínek podávání, což může být s výhodou, ale nikoli nezbytně inhalace. Po in vivo rozštěpení biologicky degradovatelné vazby je potom uvolněn buď volný inzulín (záleží na poloze degradovatelné vazby) nebo inzulín nesoucí na sobě malý polyethylenový přívěsek, které jsou potom snadněji absorbovány plícemi a/nebo rozváděny krví.

V jednom provedení vynálezu je intaktní konjugát polymeru minimálně po podání degradován, takže hydrolýza štěpitelné vazby účinně reguluje nízkou rychlost uvolňování aktivního inzulínu do krevního oběhu, což je opakem k enzymatické degradaci inzulínu před jeho uvolněním do systémového oběhu.

Mezi vhodné fyziologicky štěpitelné vazby patří mimo jiné ester, uhličitanový ester, karbamát, síran, fosfát, acyloxyalkylový ether, acetal a ketal. Takové konjugáty by měly obsahovat fyziologicky štěpitelnou vazbu, která je stabilní během skladování a při podávání. Například konjugát PEG-štěpitelná vazba-inzulín by si měl udržovat svoji celistvost při výrobě koncového farmaceutického prostředku, během rozpouštění ve vhodném dopravujícím nosiči, pokud je používán, a po podání bez ohledu na cestu.

Zejména jak je obecně popsáno výše, konjugáty PEG-inzulín, které obsahují biologicky degradovatelné vazby a jsou výhodné v předloženém vynálezu, jsou představovány následujícími strukturami: PEG1-W-PEG2 (kde PEG1 a PEG2 mohou být stejné nebo odlišné) nebo PEG-W-inzulín, kde W představuje slabou, biologicky degradovatelnou vazbu. Tyto konjugáty obsahují polyethylenglykolová ramena, která jsou odstranitelná in vivo (tj. štěpitelná). Tyto speciálně modifikovatelné inzulíny jsou po extrakci v typickém případě v podstatě biologicky neaktivní, pokud jsou intaktní, což je způsobeno buď velikostí intaktní polyethylenglykolové části v molekule, nebo kvůli sférické blokádě aktivních míst na inzulínové molekule polyethylenglykolovým řetězcem. Takové konjugáty jsou však za fyziologických podmínek štěpeny, čímž je uvolňován inzulín nebo biologicky aktivní konjugát PEG-inzulín, který je schopen absorbce do systémového oběhu, např. z plic. V první demonstrační struktuře může část PEG1 mít jakoukoli z řady různých struktur, které zde byly probírány, a v typickém případě bude mít molekulovou hmotnost alespoň 10 000, takže konjugát nebude po podání rychle absorbován. Je výhodné, když PEG2 část molekuly má molekulovou hmotnost menší než 5000 daltonů, výhodněji menší než 2000 daltonů a ještě výhodněji menší než 1000 daltonů. Pokud se týká druhé demonstrační struktury, PEG-W-inzulínu, polyethylenglykolová část bude obecně mít molekulovou hmotnost alespoň 10 000 daltonů nebo více.

• · ·» Φ*

0 0 0 0 0 00 000 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0

0000 0 0 «0 00·

V ještě jiném specifickém provedení předloženého vynálezu má konjugát PEGinzulín činkovitou strukturu, ve které dvě inzulínové složky jsou vzájemně spojeny pomocí centrálního PEG. Přesněji řečeno, takové konjugáty mohou být reprezentovány strukturou inzulín-Y-PEG-Z-inzulín, kde Y a Z jsou hydrolyticky stabilní vazebné skupiny, spojující inzulín s PEG složkou. Ve specifickém provedení, Z je aktivovaný sulfonát, který je vhodný pro reakci s thiolovými skupinami na inzulínu (např. cysteiny). Alternativně mohou Y a Z být jakákoli skupina vhodná pro vytvoření kovalentní vazby s inzulínem. Další příklady poskytuje patent US č. 5 400 461, jehož obsah je sem ve své úplnosti zahrnut odkazem.

Další demonstrační mono- a di-funkční polyethylenglykoly, které mají buď lineární nebo rozvětvené struktury, vhodné pro přípravu konjugátů podle předloženého vynálezu, mohou být zakoupeny od Shearwater Corporation (Alabama). Demonstrační struktury jsou popsány v katalogu firmy Shearwater z roku 2001, nazvaném „Polyethylenglykol a jeho deriváty pro biomedicínské aplikace“, jehož obsah je sem ve své úplnosti zahrnut odkazem.

B. Příprava

Reakční podmínky pro připojení PEG k inzulínu se budou měnit v závislosti na určitém použitém derivátu PEG, místě připojení k inzulínu a na určitém typu reaktivní skupiny (tj. lysin oproti cysteinu), na požadovaném stupni pegylace a podobně, a mohou být snadno určeny osobou se zkušenostmi v oboru.

Jak je podrobněji na příkladech uvedeno dále, syntéza konjugátů podle předloženého vynálezu může být místně specifická (příklady 1, 2 a 4) nebo může být náhodná (příklad 3).

Vhodnými skupinami, kterými je PEG aktivován pro reakci s aminoskupinami na inzulínu (např. GlyA1, PheB1, Lys29B) jsou tresylát, aldehyd, epoxid, karbonylimidazol, aktivní uhličitany (např. uhličitan sukcinimidylu), acetal a aktivní estery, jako je N-hydroxysukcinimid (NHS) a polyethylenglykoly derivované NHS. Z těchto uvedených látek jsou nejreaktivnější PEG-karboxymethyl-NHS, norleucin-NHS a uhličitan -sukcinimidylu. Mezi další reaktivní PEG, vhodné pro připojení k inzulínu patří PEG-sukcinimidylsukcinát a PEG-sukcinimidylpropionát. Aktivní estery polyethylenglykolů, vhodné pro použití v předloženém vynálezu, např. které obsahují jednu složku kyseliny propanové nebo butanové, jsou popsány v patentu US č. 5 672 662, jehož obsah je sem ve své úplnosti zahrnut odkazem. Specifické aktivní estery používané pro přípravu ·· ·· » · * « • ·· konjugátů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, zahrnují mPEG-sukcinimidylpropionát a mPEG-sukcinimidylbutanoát (příklady 1 až 4).

Optimalizované reakční podmínky pro specifické konjugáty mohou být snadno určeny, typicky pomocí rutinních experimentů, osobou se zkušenostmi v oboru.

Mezi reaktivní skupiny vhodné pro aktivování PEG polymeru k připojení na thiolovou skupinu na inzulínu patří vinylsulfony, iodacetamid, maleinimid a dithioorthopyridin. Mezi zvláště výhodná reakční činidla patří PEG-vinylsulfony a PEG-maleinimid. Další ukázky vinylsulfonů, vhodné pro použití v předloženém vynálezu, jsou popsány v patentu US č. 5 739 208, jehož obsah je sem ve své úplnosti zahrnut odkazem.

V některých případech obsahují prostředky podle tohoto vynálezu selektivně pegylovaný inzulín, tj. výsledné konjugáty jsou v podstatě homogenní, pokud se týká pozice a stupně pegylace. Tedy výsledkem místně selektivní nebo místně cílené pegylace aminokyselinové skupiny je takový konjugát inzulínu, ve kterém mají k sobě připojenu PEG složku především zamýšlené cílové pozice, např. PheB1. V závislosti na zamýšleném místě pegylace může být při syntéze nezbytné použít strategii protektivních skupin, aby se zabránilo pegylaci na jiných než zamýšlených reaktivních místech v molekule inzulínu, např. použití protektivní skupiny jako je t-BOC(tercbutoxykarbonyl) nebo di-BOC(di-butoxykarbonyl). Mezi jiné vhodné skupiny, používané pro ochranu aminoskupin, patří karboxybenzoxy-skupina (CBZ), tritylové deriváty jako je tritylová skupina (Tr), dimethoxytritylová skupina (DMTr) a podobně. Také se mohou pro chránění aminoskupin ukázat jako užitečné i jiné protektivní skupiny, jako jsou cyklická diacylová skupina nebo nitrofenylsulfenylová skupina (Nps). Příklad místně cílené syntézy prostředku 5K-PEG-inzulín je uveden v příkladech 1 a 2.

Použití těchto místně cílených chemických syntetických postupů pro přípravu inzulínových konjugátů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, umožní získat prostředky s vysokým stupněm substituce na určitém reaktivním místě molekuly inzulínu. Tyto prostředky mohou být potom, pokud je to vyžadováno, dále purifikovány, aby byly získány prostředky obsahující v postatě čisté monofunkční nebo difunkční PEG-inzulíny.

Termín v podstatě čistý PEG-inzulínový prostředek označuje takový prostředek, který obsahuje konjugát PEG-inzulín v čistotě alespoň 90 %, s výhodou v čistotě alespoň 95 %, zjišťováno pomocí jakékoli z následujících analytických metod. Z tohoto hlediska čistota označuje obsah PEG-inzulínu. Tedy u konjugátu PEG-inzulín, který je • · · 0 0 00 0 * · ·** · · · 9 9 9 9 • · ··· 9 9 9 9 · 0000 ·· · · · 0 9 · • 9 99 99 999 99 0 čistý alespoň z 90 %, tvoří alespoň 90 % hmotnosti druhy konjugátu PEG-inzulínu, zatímco zbylých 10 % představují nečistoty, jiné než konjugát PEG-inzulín. Konjugáty PEG-inzulín, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou v typickém případě purifikovány za použití jednoho nebo více purifikačních postupů, jako je iontová výměnná chromatografie, chromatog rafie podle velikosti molekul, afinitní chromatografie, chromatografie založená na hydrofobní interakci a chromatografie na reversní fázi. Všeobecná homogenita výsledného PEG-inzulínu (počet přítomných forem PEG-inzulínu) může být zhodnocena pomocí jedné nebo více dále uvedených metod: chromatografie, elektroforéza, hmotnostní spektrometrie a zvláště MALDI-MS a NMR spektroskopie. Zvláště užitečnou metodou pro identifikaci míst, kde došlo k modifikaci inzulínu je RP-HPLC mapování peptidů, spojené s testem USP totožnosti pro inzulín pomocí endoproteinázy Glu-C (příklad 6).

C. Charakteristiky konjugátů PEG-inzulínu

Podle jednoho hlediska jsou podle předloženého vynálezu poskytovány prostředky obsahující konjugát PEG-inzulín, které jsou vhodné pro plicní podávání. Jak může být vidět z in vivo údajů získaných v příkladech 7 až 11, konjugáty PEG-inzulín, které jsou předmětem tohoto vynálezu, když jsou podány do plic vykazují oproti přírodnímu inzulínu vylepšené farmakokinetické a farmakodynamické vlastnosti. Bylo ukázáno, že inzulín může být modifikován polyethylenglykoly, které mají molekulovou hmotnost až 5000K - 10 000 K nebo větší a stále si podržují aktivitu. Aktivita demonstračního konjugátu PEG-inzulínu, 5K-PEG-inzulínu, je předvedena v příkladu 7. Dále je možno ze zde uvedených příkladů vidět, demonstrační konjugáty PEG-inzulín, které mají řetězce PEG s průměrnými molekulovými hmotnostmi v rozsahu od 750 daltonů do 2000 daltonů, do 5000 daltonů, když jsou podány jak intravenózně, tak do plic, jsou biologicky aktivní, když jsou podány do plic, tak nejsou v plících podstatně zadržovány, jak je doloženo detekovatelnými hladinami inzulínu, a jsou účinné pro podstatné snížení hladiny glukózy (příklady 7 až 11), které je v určitých případech časově významně delší, než je pozorováno u přírodního inzulínu. Kromě toho jsou zde poskytnuty konjugáty PEG-inzulín, které když jsou podány do plic, vykazují rychlý nástup účinku (během 1 hodiny po podání). Souhrn farmakokinetických a farmakodynamických parametrů demonstračních prostředků obsahujících PEG-inzulín, které jsou předmětem tohoto vynálezu, je podáno v tabulce 13.

Obecně je možno říci, že prostředky obsahující PEG-inzulín, které jsou předmětem tohoto vynálezu, budou mít jednu nebo více z následujících charakteristik.

Konjugáty PEG-inzulín, které jsou předmětem tohoto vynálezu, udržují alespoň měřitelný stupeň specifické aktivity. Tj., konjugát PEG-inzulín podle vynálezu bude vykazovat někde mezi 2 % až 100 % nebo více specifické aktivity přírodního inzulínu. V jednom výhodném provedení vynálezu bude mít konjugát PEG-inzulín alespoň 10 % nebo více biologické aktivity nemodifikovaného, přírodního inzulínu a je v podstatě neimunogenní. Bude výhodné, když biologická aktivita konjugátu připraveného podle vynálezu bude v rozmezí od 5 % do alespoň 20 % nebo více biologické aktivity přírodního inzulínu. Biologická aktivita konjugátu připraveného podle vynálezu může být charakterizována nepřímo, např. sledováním hladiny glukózy v krvi a hladiny inzulínu, aby byly zjištěny odpovídající farmakokinetické a farmakodynamické údaje nebo pomocí RIA (radioimunologický test).

Při uvažování koncentrací inzulínu v séru, které následují po podání konjugátu PEG-inzulín např. do plic, zde popsané konjugáty typicky dosáhnou vrcholu (tj. dosáhnou Cmax nebo nejvyšší bod na koncentrační křivce) v době od 2 do 8 hodin po podání dávky, a typičtěji dosáhnou nejvyšší bod na koncentrační křivce v době od 3 do 6 hodin po podání dávky nebo podobně. Kromě toho chemicky modifikované inzulíny, připravené podle vynálezu, a zvláště zde poskytnuté přípravky s prodlouženou dobou účinku, jsou účinné pro zajištění jak měřitelného snížení úrovně glukózy, tak udržení koncentrací inzulínu po delší časové období než přírodní inzulín. Přesněji řečeno, když je konjugát PEG-inzulín podán do plic, bude vyvolávat zvýšené hladiny inzulínu (zvýšené nad základní úroveň) po dobu alespoň 6 hodin a s výhodou po dobu alespoň 8 hodin po podání. Je výhodné, když konjugát PEG-inzulín podaný do plic vyvolá zvýšenou hladinu inzulínu v krvi po prodlouženou dobu alespoň 9 hodin, 10 hodin, 12 hodin nebo alespoň 14 hodin po podání, přičemž nad základní úroveň zvýšené hladiny inzulínového konjugátu jsou detekovatelné v krevním oběhu po tuto prodlouženou dobu po podání dávky. Demonstrační prostředky, vykazující tyto vlastnosti jsou podány v příkladech.

Jak bylo popsáno dříve, inzulínový konjugát, který je předmětem tohoto vynálezu, je účinný pro snížení hladiny glukózy v krvi. Když se nyní obrátíme ke schopnosti prostředků, které jsou předmětem tohoto vynálezu, snižovat hladinu glukózy v krvi, když je podán konjugát PEG-inzulín, např. do plic, je účinný při snižování hladiny glukózy v krvi pod základní hladinu po dobu alespoň 6 hodin po podání. Zejména je prostředek PEG-inzulín, připravený podle tohoto vynálezu, účinný při snižování hladiny glukózy v krvi pod základní hladinu po dobu alespoň 8 hodin, s výhodou po dobu • · · · · ·· ··· ·· · alespoň 10 hodin, nebo ještě výhodněji po dobu alespoň 12 hodin nebo více po jeho podání.

Kromě toho, přípravky PEG-inzulín, které jsou předmětem tohoto vynálezu, vykazuje oproti přírodnímu inzulínu vylepšenou absolutní pulmonární biologickou dostupnost. Přesněji řečeno, přípravek PEG-inzulín, poskytnutý v tomto vynálezu, vykazuje absolutní pulmonární biologickou dostupnost alespoň 1,2krát vyšší, než je biologická dostupnost přírodního inzulínu, s výhodou alespoň 1,5krát vyšší, než je biologická dostupnost přírodního inzulínu, ještě výhodněji alespoň 2x nebo ještě výhodněji alespoň 2,5x nebo 3x vyšší, než je biologická dostupnost přírodního inzulínu, (demonstrační příklady jsou uvedeny v tabulce 13).

III. Přípravky

Prostředky obsahující konjugát PEG-inzulín, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být podávány pohodlným způsobem, nebo v terapeutických/farmaceutických prostředcích, obsahujících další excipienty, rozpouštědla, stabilizátory atd., v závislosti na určitém způsobu podávání a podobě dávky. Tyto konjugáty mohou být podávány jak parenterálně, tak neparenterálně. Mezi specifické způsoby podávání jsou zahrnuty orální, rektální, bukální, lokální, nazální, oftalmický, podkožní, intramuskulámí, intravenózní, transdermální a pulmonární. Nejvýhodnějšími způsoby podávání jsou parenterální a pulmonární.

Farmaceutické přípravky, určené pro podávání savcům a především pro člověka, budou v typickém případě obsahovat alespoň jeden konjugát PEG-inzulín, který je předmětem tohoto vynálezu, spolu s jedním nebo více farmaceuticky přijatelným nosičem či nosiči, které jsou rovněž podrobněji popsány dále, zvláště v případě prostředků, zaměřených na plíce. Přípravky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, např. pro parenterální podávání, jsou nejčastěji tekuté roztoky nebo suspenze, zatímco inhalovatelné přípravky pro pulmonární podávání jsou obecně tekutiny nebo prášky, přičemž přípravkům ve formě prášků je obecně dávána přednost. Mezi další, avšak méně výhodné prostředky, obsahující chemicky modifikované inzulíny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, patří sirupy, krémy, masti, tablety a podobně.

Přípravky a odpovídající dávky inzulínu se budou měnit se stupněm biologické aktivity použitého inzulínu. Množství injekčně podávaného inzulínu je měřeno v USP inzulínových jednotkách a v USP jednotkách lidského inzulínu (U); jedna jednotka inzulínu se rovná množství inzulínu, potřebnému pro snížení koncentrace glukózy v krvi u hladovějícího králíka na hodnotu 450 mg/litr (2,5 mM). Typické koncentrace

·· · • 0 0

0 0 0

0 · 0000 0 0 0 inzulínových přípravků pro injekční podávání bývají v rozmezí 30 až 10 jednotek/ml, což je přibližně 3,6 mg inzulínu na mililitr. Množství inzulínu, potřebné pro dosažení požadovaného fyziologického účinku u pacienta, se bude měnit nejen podle detailních vlastností pacienta a jeho nemoci (např. zda se jedná o diabetes typu I nebo II), ale i podle koncentrace a typu použitého inzulínu. Například dávkové rozsahy běžného inzulínu (rychle působící inzulín) jsou v rozmezí od 2 do 0,3 U inzulínu na kilogram tělesné hmotnosti pacienta za den. Prostředky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou z jednoho hlediska účinné pro to, aby bylo u pacientů, kteří prodělávají léčebný půst, dosaženo koncentrace glukózy v krvi mezi 900 a 1400 mg/litr a po jídle hodnoty nižší než 2500 mg glukózy na litr. Přesné dávky mohou být určovány osobou se zkušenostmi v oboru a se znalostmi farmakodynamiky a farmakokinetiky použitého inzulínového konjugátu pro určitý způsob jeho podávání, a mohou být snadno upraveny podle periodického kontrolování koncentrace glukózy v krvi.

Individuální dávky (dávkování pro inhalační aplikování) pro inhalovatelné přípravky, obsahující konjugát inzulínu, jsou obyčejně v rozmezí od 0,5 mg do 15 mg inzulínového konjugátu, a celková požadovaná dávka je dosažena pomocí 1 až 10 vdechnutí, a s výhodou je dosažena pomocí 1 až 4 vdechnutí. V průměru bude celková dávka konjugátu PEG-inzulín, podaná pomocí inhalace při jednom podávání, v rozsahu od 10 U do 400 U, přičemž každá jednotlivá dávka nebo dávková jednotka (odpovídající jednomu vdechnutí) obsahuje od 5 U do 400 U.

A. Inhalovatelné přípravky obsahující chemicky modifikovatelný inzulín

Jak bylo uvedeno výše, jedním z preferovaných způsobů podání inzulínových konjugátů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, je inhalování plícemi. Určité složky přípravku, charakteristiky a podávači zařízení budou nyní popsány podrobněji.

Množství inzulínového konjugátu v přípravu bude takové, které je nezbytné pro dodání terapeuticky účinného množství inzulínu v dávkové jednotce, aby bylo dosaženo alespoň jednoho z terapeutických účinků přírodního inzulínu, tj. schopnosti regulovat hladiny glukózy v krvi směrem k normálním hodnotám. V praxi bude toto množství široce varírovat v závislosti na druhu inzulínového konjugátu, jeho aktivitě, vážnosti diabetického stavu, populaci ze které pacient pochází, stabilitě přípravku a podobně. Obecně bude konjugát PEG-inzulín tvořit od 1 % do 99 % hmotnosti prostředku, obyčejně od 2 % do 95 % hmotnosti prostředku a ještě běžněji od 5 % do 85 % hmotnosti prostředku, a bude to také záviset na relativních množstvích excipientů a přísad, obsažených v prostředku. Přesněji řečeno, prostředek bude v typickém případě

alespoň jedno z následujících procentuálních množství konjugátu PEG-inzulín: 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % nebo více. Bude výhodné, když práškové prostředky budou obsahovat alespoň 60 %, např. od 60 do 100 % hmotnosti konjugátu PEG-inzulín. Je nutno mít na vědomí, že v přípravku může být obsaženo více než jeden druh zde popsaného inzulínu, a že použití termínu „činidlo“ nebo „inzulín“ v žádném případě nevylučuje použití dvou nebo více inzulínů nebo kombinace inzulínu s jiným aktivním činidlem (například demonstrační přípravek PEG-inzulín může také obsahovat přírodní inzulín).

A.1. Excipienty

Prostředky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, budou ve většině případů obsahovat jeden nebo více excipientů. Přednost je dávána uhlohydrátovým excipientům, buď samotným nebo v kombinaci s jinými druhy excipientů nebo přísad. Příklady uhlohydrátů vhodných pro použití v prostředcích, které jsou předmětem tohoto vynálezu, zahrnují cukry, derivované cukry jako jsou alditoly, aldonové kyseliny, esterifikované cukry a cukerné polymery. Příklady uhlohydrátových excipientů, které jsou vhodný pro použití v prostředcích, které jsou předmětem tohoto vynálezu, zahrnují například monosacharidy jako je fruktóza, maltóza, galaktóza, glukóza, D-manóza, sorbóza a podobně; disacharidy jako jsou laktóza, sacharóza, trehalóza, celobióza a podobně; polysacharidy jako jsou rafinóza, malezitóza, maltodextriny, dextrany, škroby a podobně; a alditoly jako jsou manit, xylit, malcit, laktit, xylit sorbitol (glucitol), pyranosyl sorbitol, myoinositol a podobně. Výhodné jsou neredukující cukry, cukry které, když jsou kombinovány s inzulínovým konjugátem, mohou vytvářet v podstatě suchou amorfní nebo sklovitou fázi a cukry vykazující relativně vysokou Tgs (např. Tgs vyšší než 40 °C, s výhodou vyšší než 50 °C, výhodněji vyšší než 60 °C, a ještě výhodněji vyšší než 70 °C, a nejvýhodněji takové, které vykazují Tgs vyšší než 80 °C nebo vyšší).

Mezi další excipienty patří aminokyseliny, peptidy a zvláště oligomery obsahující 2 až 9 aminokyselin, výhodněji oligomery obsahující 2 až 5 aminokyselin, a polypeptidy, přičemž všechny jmenované typy sloučenin mohou být homopolymery nebo heteropolymery. Demonstrační aminokyseliny zahrnují glycin (gly), alanin (ala), valin (val), leucin (leu), isoleucin (ile), methionin (met), prolin (pro), fenylalanin (phe), tryptofan (try), serin (ser), treonin (thr), cystein (cys), tyrozin (tyr), asparagin (asp), kyselinu glutamovou (glu), lyzin (lys), arginin (arg), histidin (his), norleucin (nor) a jejich modifikované formy. Zvláště výhodnou aminokyselinou je leucin.

• 9 • 9 • 9 9 • 9 • 99 9 9999 • 9 9 9 • 9 99 9

Excipienty výhodnými pro použití v inhalovatelných prostředcích jsou dipeptidy a tripeptidy obsahující dva nebo více leucylových zbytků, jak je popsáno v mezinárodní patentové přihlášce Inhalačních terapeutických systémů PCT/US00/09 785, která je ve své úplnosti zahrnuta odkazem do předkládané přihlášky.

Výhodné jsou také dipeptidy a tripeptidy, které vykazují teplotu přechodu do sklovitého stavu vyšší než 40 °C, výhodněji vyšší než 50 °C, ještě výhodněji vyšší než 60 °C, a nejvýhodněji vyšší než 70 °C.

Třebaže méně výhodné pro svoji omezenou rozpustnost ve vodě, dalšími peptidy, které zvyšují stabilitu a zlepšují charakteristiky aerosolu a jsou vhodné pro použití v předloženém vynálezu, jsou tetramery a pentamery obsahující jakoukoli kombinaci výše popsaných aminokyselin. Výhodnější bude, když tetramery a pentamery budou obsahovat dva nebo více leucinových zbytků. Leucinové zbytky mohou zaujímat uvnitř peptidu jakoukoli pozici, zatímco zbývající (tj. jiné než leucin) aminokyselinové pozice jsou obsazeny jakoukoli výše popsanou aminokyselinou za předpokladu, že výsledný tetramer nebo pentamer má rozpustnost ve vodě alespoň 1 mg/ml. Je výhodné, když v tetrameru nebo pentameru aminokyseliny jiné než leucin jsou aminokyseliny hydrofilní, jako je např. lyzin, čímž je zvýšena rozpustnost peptidu ve vodě.

Polyaminokyseliny, a zvláště takové, které obsahují jakékoli zde popsané aminokyseliny, jsou také vhodné pro použití jako stabilizátory. Výhodné jsou polyaminokyseliny jako je polylyzin, kyselina a polyglutamová a poly(lys, ala).

Mezi další excipienty a přísady, vhodné pro použití v předkládaných prostředcích a metodách, patří mimo jiné proteiny, nebiologické polymery a biologické polymery, které mohou být přítomny samostatně nebo v kombinaci. Vhodnými excipienty jsou ty, které jsou uvedeny v mezinárodních patentových přihláškách Inhalačních terapeutických systémů č. WO 96/32 096 a 98/16 205. Výhodné jsou excipienty, které mají teploty přechodu do sklovitého stavu (Tg) vyšší než 35 °C, s výhodou vyšší než 40 °C, výhodněji vyšší než 45 °C, a nejvýhodněji vyšší než 55 °C.

Mezi příklady proteinových excipientů jsou zahrnuty albuminy, jako je lidský serumalbumin (HSA), rekombinantní lidský albumin (rHA), želatina, kasein, hemoglobin a podobně. Prostředky mohou také obsahovat pufr nebo činidlo upravující pH, což je obyčejně ale nikoli nezbytně, sůl připravená z organické kyseliny nebo zásady. Jako příklady pufrů je možno uvést organické soli kyselin, jako jsou kyselina a citrónová, kyselina askorbová, kyselina glukonová, kyselina uhličitá, kyselina vinná, kyselina • ·· · · · . · · · *· *·*····· ....

³¹ ·..· .:. ·..· :

jantarová, kyselina octová nebo kyselina ftalová. Mezi jiné vhodné pufry patří hydrochlorid Tris-hydroxymethylaminu, borát, fosfát glycerolu a fosfát. Vhodné jsou také aminokyseliny jako je glycin.

Prostředky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou také obsahovat další polymerní excipienty a složky, např. polyvinylpyrrolidony, deriváty celulóz, jako jsou hydroxymethylcelulóza, hydroxyethylcelulóza a hydroxypropylmethylcelulóza, Ficolly (polymerní cukr), hydroxyethylový derivát škrobu (HES), dextráty (např. cyklodextriny, jako jsou 2-hydroxypropyl-P-cyklodextrin a sulfobutylether-£-cyklodextrin), polyethylenglykoly a pektin.

Prostředky mohou dále obsahovat činidla dodávající chuť, činidla maskující chuť, anorganické soli (např. chlorid sodný), antimikrobiální činidla (např. chlorid benzalkonia), sladidla, antioxidanty, antistatická činidla, povrchově aktivní látky (např. polysorbáty, jako jsou „TWEEN 20“ a „TWEEN 80“ a činidla F68 a F88 dostupná od firmy BASF), estery sorbitanů, lipidy (např. fosfolipidy jako jsou lecitin a jiné fosfatidylcholiny, fosfatidylethanolaminy, tyto s výhodou nikoli ve formě liposomů), mastné kyseliny a estery mastných kyselin, steroidy (např. cholesterol) a chelatační činidla (např. EDTA, zinek a jiné takové vhodné kationty). Použití určitých disubstituovaných fosfatidylcholinů pro přípravu perforovaných mikrostruktur (tj. dutých, porézních mikrokuliček) je popsáno podrobněji dále. Další farmaceutické excipienty a/nebo přísady, které jsou vhodné pro použití v prostředcích podle předloženého vynálezu jsou vyjmenovány v „Renmington: The Science & Practice of Pharmacy“, 19. vydání, Williams & Williams, (1995) a v „Physician's Desk Reference“, 52. vydání, Medical Economics, Montvale, NJ (1998).

V jednom provedení nemusí prostředek, připravený podle předloženého vynálezu, obsahovat zesilovače pronikání, které mohou způsobovat podráždění a jsou toxické ve vysokých dávkách, často nezbytných pro vyvolání podstatného zvýšení absorbce. Specifické zesilovače, které mohou chybět v prostředcích předloženého vynálezu, jsou detergentům podobné zesilovače, jako jsou deoxycholát, laureth-9, DDCP, glykocholát a fusidáty. Avšak určité zesilovače, jako jsou ty, které chrání inzulín před enzymatickou degradací, např. inhibitory proteázy a peptidázy, jako jsou alfa-1 antipeptidáza, captropril, thiorphan a inhibitory HIV proteázy, mohou být v určitých provedeních vynálezu obsažený v přípravcích PEG-inzulín, které jsou předmětem tohoto vynálezu. V ještě dalším provedení vynálezu nemusí být v konjugátech PEG32 • · • a ·· ·» • a · · a · • ·· · · • · · a · a • · · · · • ••a aa aa aa a * a aaa • aaaa aaa aa a aaa inzulín, připravených podle předloženého vynálezu, přítomny liposomy, lipidové základní hmoty a obalovací činidla.

Obecně budou farmaceutické prostředky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, obsahovat excipient tvořící od 1 % do 99 % jejich hmotnosti, s výhodou od 5 % do 98 % jejich hmotnosti, výhodněji od 15 % do 95 % jejich hmotnosti. Ještě výhodněji, prostředky sušené pomocí rozprašování, budou obsahovat excipient tvořící od 0 % do 50 % jejich hmotnosti, výhodněji od 0 % do 40 % jejich hmotnosti. Obecně je v konečném farmaceutickém prostředku požadována vysoká koncentrace inzulínu. V typickém případě je optimální množství excipientů a/nebo přísady určováno pokusně, tj. pomocí přípravy prostředků obsahujících různá množství excipientů (sahající od nízkého po vysoký obsah), testování chemické a fyzikální stability konjugátu PEGinzulín, MMAD a rozptylovací schopnosti farmaceutických prostředků, a potom další zkoušení rozsahu, ve kterém je dosaženo optimálního aerosolového provedení s žádnými významnými nepříznivými účinky na stabilitu inzulínu.

A.2. Příprava suchých prášků

Suché práškové přípravky předloženého vynálezu, obsahující konjugát PEGinzulín, mohou být připraveny pomocí jakéhokoli z množství sušících postupů, přednostně pomocí sušení rozprašováním. Sušení přípravků pomocí rozprašování je provedeno například tak, jak je obecně popsáno v „Spray Drying Handbook“, 5. vydání, K. Masters, John Wiley & Sons, lne., NY, NY (1991), a v Platz, R. a kol., mezinárodní patentové publikace č. WO 97/41 833 (1997) a WO 96/32 149 (1996), jejichž obsah je odkazem zahrnut do této publikace.

Roztoky konjugátů PEG-inzulín jsou sušeny pomocí rozprašování v běžné rozprašovací sušárně, jako jsou dostupné od komerčních dodavatelů, jako jsou Niro A/S (Dánsko), Buchi (Švýcarsko) a podobně, kdy výsledkem je dispergovatelný, suchý prášek. Optimální podmínky pro sušení roztoků konjugátů PEG-inzulín pomocí rozprašování se budou měnit v závislosti na složkách přípravku, a jsou obecně určovány pokusně. Plyn, který je používán k sušení pomocí rozprašování, je v typickém případě vzduch, třebaže vhodnými jsou také inertní plyny jako dusík a argon. Kromě toho, teplota jak vstupujícího, tak vystupujícího plynu, používaného pro sušení rozprášeného materiálu, je taková, že nezpůsobuje degradaci konjugátu PEG-inzulín v rozprášeném materiálu. Tyto teploty jsou obyčejně určovány pokusně, třebaže obecně platí, že vstupní teplota bude v rozmezí od 50 °C do 200 °C, zatímco výstupní teplota bude v rozmezí od 30 °C do 150 °C. Mezi výhodné parametry patří rozprašovací tlaky v ··· 4 4 4· ··· • ·· 44 4 4444

444 4 4 44 44444 ·· ··· ··· ••44 44 ·4· · 4 · rozmezí od 1,42 kg/m² do 10,63 kg/m², výhodnější jsou od 2,13 až 2,83 kg/m² do 7,09 kg/m². V typickém případě bude použitý rozprašovací tlak mít jednu z následujících hodnot (kg/m²): 1,42, 2,13, 2,83, 3,53, 4,25, 4,96, 5,67, 6,38, 7,09, 7,80, 8,50 nebo vyšší.

Inhalovatelné prostředky PEG-inzulín, které mají zde popsané charakteristiky, mohou být produkovány také sušením určitých složek přípravků, jehož výsledkem je vytvoření prášku s děrovanou mikrostrukturou, jak je popsáno vWO 99/16 419, jejíž celý obsah je odkazem zahrnut do této přihlášky. Prášky s děrovanou mikrostrukturou obsahují v typickém případě pomocí rozprášení vysušené, duté mikrokuličky, které mají relativně tenkou pórovitou stěnu, vymezující velký vnitřní prázdný prostor. Prášky s děrovanou mikrostrukturou mohou být rozptýleny ve vybraných médiích (jako je nevodné a/nebo fluorované činidlo), aby byly před sušením zabezpečeny stabilizované disperze. Použití děrovaných (nebo pórovitých) mikrostrukturou nebo mikročástic významně snižuje přitažlivé síly mezi částicemi, čímž snižuje smykové síly a zvyšuje tekutost a rozptylovací schopnost výsledných prášků, a snižuje degradaci způsobovanou shlukováním, sedimentací nebo rozvrstvováním jejich stabilizovaných disperzních stavů.

Jinou možností je, že prostředky PEG-inzulín pro pulmonární podání mohou obsahovat aerodynamicky lehké částice, jak je popsáno v patentu US č. 6 136 295.

Práškové přípravky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být také připraveny pomocí lyofilizace, sušením ve vakuu, rozprášením a vymražením, zpracováním tekutiny v nadkritickém stavu (např. jak je popsáno v Hanna, a kol., patent US č. 6 063 138), vysušením vzduchem nebo jinými formami sušení odpařováním.

Pomocí ještě jiného přístupu mohou být suché prášky připraveny shlukováním složek prášku, proséváním materiálů, aby byly získány shluky, zakulacením, aby byly získány shluky více kulovitého tvaru a tříděním podle velikosti, aby byly získány produkty jednotné velikosti, jak je popsáno např. v Ahlneck, C. a kol., mezinárodní PCT publikace č. WO95/09 616, 1985, která je sem odkazem zahrnuta.

Suché prášky mohou být také připraveny tak, že jednotlivé složky přípravku v suché práškové formě jsou zpracovány mícháním, rozemletím, proséváním nebo mletím v proudovém mlýnu.

Prostředky připravované ve formě suchého prášku jsou s výhodou udržovány v suchých podmínkách (tj. v relativně nízké vlhkosti) jak v průběhu výroby, tak i zpracování a uložení. Bez ohledu na použitý způsob sušení, výsledkem postupu budou ··· ·· · ··*· ·· ··· · · · · · ···· ··· ··· ··· • ·· · · ·· «·· ·· · inhalovatelné, dobře se rozptylující částice, obsahující chemicky modifikovatelný inzulín, který zde byl popsán.

A.3. Význačné rysy přípravků typu suchého prášku

Prášky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou dále charakterizovány několika rysy, z nichž nejdůležitější je jeden nebo více z dále uvedených: (i) stálá schopnost vysokého rozptylu, dokonce i po skladování, (ii) malé aerodynamické velikosti částic (MMAD), (iii) vylepšené hodnoty, pokud se týká jemnosti dávkovaných částic, tj. prášky, které obsahují vysoké procento částic o velikosti menší než 3,3 mikrometry MMAD, z nichž všechny přispívají k vylepšené schopnosti prášku pronikat do tkání dolního respiračního traktu (tj. do plicních sklípků), pro dodání přípravku do systémového oběhu. Tyto fyzikální charakteristiky inhalovatelných prášků, které jsou předmětem tohoto vynálezu, které budou popsány podrobněji dále, jsou důležité pro maximalizování účinnosti dopravení aerosolu takovýchto suchých prášků hluboko do plic.

Suché prášky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou složeny z částic ve formě aerosolu, které jsou účinné při pronikání do plic. Částice předloženého vynálezu mají většinový střední průměr (MMD) menší než 20 až 30 pm, nebo menší než 20 pm, nebo menší než 10 pm, s výhodou menší než 7,5 pm, ještě výhodněji menší než 4 pm, a ještě menší než 3,5 pm, a obvykle mají průměr v rozsahu 0,1 až 5 pm. Výhodné prášky jsou složeny z částic, které mají MMD z rozsahu od 0,2 do 4,0 pm. V některých případech bude prášek obsahovat také nedýchatelné nosičové částice, jako je laktóza, přičemž nedýchatelné částice mají průměr obvykle větší než 40 pm.

Prášky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou dále charakterizovány tím, že rozložení velikostí aerosolových částic má většinový střední aerodynamický průměr (MMAD) menší než 10 pm, s výhodou je MMAD menší než 5 pm, výhodněji je MMAD menší než 4,0 pm, ještě výhodněji je MMAD menší než 3,5 pm, a nejvýhodněji je MMAD menší než 3 pm. Charakteristické většinové střední aerodynamické průměry prášků budou v rozsahu od 0,1 do 10 pm, s výhodou od 0,2 do 5,0 pm MMAD, ještě výhodněji od 1,0 do 4,0 pm MMAD a ještě výhodněji od 1,5 do 3,0 pm. Malých aerodynamických průměrů může být obecně dosaženo kombinováním podmínek optimalizovaného sušení rozprašováním a výběru a koncentrace excipientů.

Prášky PEG-inzulín předloženého vynálezu mohou být dále charakterizovány svými specifickými hmotnostmi. Práškový prostředek pro inhalování bude obecně • 9 vykazovat specifickou hmotnost od 0,1 do 10 g/krychlový centimetr, s výhodou od 0,1 do 2 g/krychlový centimetr, a výhodněji od 0,15 do 1,5 g/krychlový centimetr.

Prášky budou obecně mít obsah vlhkosti nižší než 20 % hmotnosti, obvykle nižší než 10 % hmotnosti, a s výhodou nižší než 5 % hmotnosti. Výhodné jsou prášky, připravené podle předloženého vynálezu, mající takový obsah vlhkosti, který je nižší než jeden nebo více z následujících hmotnostních procent: 15 %, 10 %, 7 %, 5 % nebo 3 %. Pevné látky s tak nízkým obsahem vlhkost mají tendenci vykazovat větší stabilitu při balení a skladování.

Dále, zde popsané stabilizátory a metody sušení rozprašováním jsou účinné pro přípravu přípravků PEG-inzulín, které mají vysokou schopnost rozptylování. Pro práškové přípravky je hodnota emitované dávky (ED) běžně vyšší než 30 %, a obvykle vyšší než 40 %. Je výhodnější, když je ED prášků předloženého vynálezu vyšší než 50 % a je často vyšší než 60 %.

Zde popsané prostředky mají také dobrou stabilitu, pokud se týká jak stability chemické, tak fyzikální, tj. vytváření aerosolu v průběhu času. Obecně, pokud se týká chemické stability, konjugát PEG-inzulín, obsažený v přípravku, se nebude v průběhu sušení rozprašováním rozkládat ve větším rozsahu něž 15 %. To znamená, že prášek bude obsahovat alespoň 85 % intaktního konjugátu PEG-inzulín, s výhodou alespoň 90 až 95 % intaktního konjugátu PEG-inzulín, a ještě výhodněji bude obsahovat alespoň 97 % nebo více intaktního konjugátu PEG-inzulín. Je výhodné, když výsledkem postupu sušení rozprašováním budou prášky, které obsahují méně než 10 % všech proteinových agregátů, to znamená, že více než 90 % hmotnosti chemicky modifikovaného inzulínu se vyskytuje ve formě monomeru.

Pokud se týká vytváření aerosolu, prostředky předloženého vynálezu jsou obecně charakteristické tím, že po tříměsíčním skladování za podmínek okolí, poklesne emitovaná dávka ne více než o 20 %, s výhodou ne více než o 15 %, a ještě výhodněji ne více než o 10 %.

A.4. Podávání prostředku

Zde popsané přípravky mohou být podávány pomocí jakéhokoli vhodného inhalátoru suchých prášků (DPI), tj. inhalačního zařízení, které využívá pacientem vdechovaný vzduch jako nosič pro přenos léku ve formě suchého prášku do plic. Přednost mají inhalační zařízení pro suché prášky Inhale Therapeutic System's, které jsou popsány v Patton, J. S., a kol., patent US č. 5 458 135, 17. říjen 1995; Smith, A.

E., a kol., patent US č. 5 740 794, 21. duben 1998; a v Smith, A. E., a kol., patent US č.

785 049, 28 červenec 1998, které jsou zde odkazem zahrnuty. Pokud je používáno zařízení tohoto typu, lék ve formě prášku je obsažen v nádobce, která má děrované víčko nebo jiný přístup na svém povrchu, s výhodou se jedná o měkké průhledné balení nebo nádržku, přičemž nádobka může obsahovat jednu dávkovou jednotku nebo mnoho dávkových jednotek. Mnohé metody, které jsou vhodné pro plnění velkých počtů nádobek (tj. jednotkových dávkových balení) odměřenými dávkami suchých práškových léků jsou popsány např. v Parks, D. J., a kol., mezinárodní patentová publikace WO 97/41 031, 6. listopadu 1997, která je sem zahrnuta odkazem.

Mezi jiná zařízení rozptylující suchý prášek pro pulmonární použití patří ta, která jsou popsána v Newell, R. E., a kol., evropský patent č. EP 129 985, 7. září 1988; v Hodson, P. D., evropský patent č. EP 472 598, 3. července 1996; vCocozza, S., a kol., evropský patent č. EP 467 172, 6. května 1994, a v Lloyd, L. J. a kol., patent US č. 5 522 385, 4. dubna 1996, které jsou sem zahrnuty odkazem.

Pro podávání suchých prášků PEG-inzulín jsou také vhodná inhalační zařízení, jako je Astra-Draco „TURBUHALER“. Tento typ zařízení je podrobně popsán v Virtanen, R., patent US č. 4 668 218, 26. května 1987; ve Wetterlin, K., a kol., patent US č. 4 805 811, 21. února 1989, z nichž všechny jsou sem odkazem zahrnuty. Mezi jiná vhodná zařízení patří inhalátory suchých prášků jako jsou Rotahaler® (Glaxo), Discus® (Glaxo), inhalátor Spiros™ (Důra Pharmaceutics) a Spinhaler® (Fisons). Vhodná jsou také zařízení, která využívají pístu pro vyvolání proudu vzduchu, který pak buď strhává práškový lék, odnáší lék ze sítka při průchodu sítkem, nebo se míchá ve směšovací komůrce s práškovým lékem a posléze přenáší prášek pacientovi skrz náústek zařízení, jak je popsáno v Mulhauser, P., a kol., patent US č. 5 388 572, 30. září 1997, který je zde odkazem zahrnut.

Inhalovatelný prostředek PEG-inzulín může být také podáván pomocí tlakového, odměrného inhalátoru (MDI), např. Ventolin® odměrný inhalátor, obsahující roztok nebo suspenzi léku v farmaceuticky inertní pohonné tekutině, např. chlorovaný či fluorovaný uhlovodík, jak je popsáno vLaube, a kol., patent US č. 5 320 094, 14. červen 1994, a v Rubsamen, R. M., a kol., patent US č. 5 672 581 (1994), přičemž oba jsou sem zahrnuty odkazem.

Jiná možnost je, že zde popsané PEG-inzulíny mohou být rozpuštěny nebo suspendovány v rozpouštědle, např. ve vodě nebo ve fyziologickém roztoku a podávány pomocí rozprášení. Mezi rozprašovače pro podávání roztoku v aerosolové formě patří AERx™ (Aradigm), Ultravent® (Mallinkrodt), Pari LC Plus™ nebo Pari LC

Star™ (Pari GmbH, Německo), De Vilbiss Pulmo-Aide a Acorn II® (Marquest Medical Products).

Jak bylo výše popsáno, zde uvedené konjugáty PEG-inzulín mohou být také podávány parenterálně pomocí intravenózní injekce, nebo méně výhodně pomocí intramuskulární nebo subkutánní injekce. Přesné složení takovýchto přípravků může být snadno určeno osobou se zkušenostmi v oboru. Mezi vhodné typy prostředků pro parenterální podávání patří roztoky připravené pro injekce, suché prášky připravené pro spojení před použitím s rozpouštědlem, suspenze připravené pro injekci, suché nerozpustné prostředky pro spojení před použitím s nosičem, emulze a tekuté koncentráty pro ředění před podáním. Například injekčně podávaný roztok prostředku PEG-inzulín, který je předmětem tohoto vynálezu, může zahrnovat prostředek rozpuštěný ve vodném nosiči, jako je vodný roztok chloridu sodného, Ringerův roztok, roztok dextrózy pro injekci, Ringerův roztok s laktátem a podobně, a může obsahovat jeden nebo více farmaceuticky přijatelných, slučitelných excipientů nebo přísad, jak bylo popsáno výše.

IV: Užitečnost

Prostředky předloženého vynálezu jsou užitečné, když jsou podávány jakoukoli vhodnou cestou, výhodné je, když jsou podávány pomocí inhalace nebo injekčně, v terapeuticky účinných množstvích savčímu jedinci, pro léčení diabetes melitus, a zvláště diabetů typu I a typu II.

Všechny články, knihy, patenty a jiné publikace zde uvedené jsou odkazem zahrnuty ve své úplnosti.

Následující příklady slouží pro ilustraci a žádným způsobem nejsou míněny jako omezení rámce předloženého vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 - zde je vynesena rychlost enzymatického štěpení ukázkového konjugátu PEG-inzulín („750-2 PEG inzulín“) proti nemodifikované inzulínové kontrole, jak je podrobně popsáno v příkladu 6.

Obr. 2 - zde jsou vyneseny průměrné koncentrace inzulínu v séru po intravenosním podání ukázkových prostředků, obsahujících pegylovaný (5K PEG inzulín) oproti nepegylovanému inzulínu (podrobnosti jsou podány v příkladu 7).

Obr. 3 - zde jsou vyneseny koncentrace glukózy v krvi po intravenosním podání ukázkových prostředků obsahujících pegylovaný (5K PEG inzulín) oproti nepegylovanému inzulínu (podrobnosti jsou podány v příkladu 7).

Obr. 4 - zde jsou vyneseny průměrné koncentrace inzulínu v séru po intratracheálním vkapání pegylovaného (150 pg/živočicha, 5K PEG inzulín) proti nepegylovanému lidskému inzulínu (40 pg/živočicha) u krysích samců (příklad 8).

Obr. 5 - zde jsou vyneseny průměrné koncentrace glukózy v krvi po intratracheálním vkapání pegylovaného (150 pg/živočicha, 5K PEG inzulín) proti nepegylovanému lidskému inzulínu (40 pg/živočicha) u krysích samců (příklad 8).

Obr. 6 - zde jsou vyneseny průměrné koncentrace inzulínu v séru po intratracheálním vkapání pegylovaného (750-1 PEG inzulín) proti nepegylovanému lidskému inzulínu u krysích samců (příklad 9).

Obr. 7 - zde jsou vyneseny průměrné koncentrace glukózy v krvi po intratracheálním vkapání pegylovaného (750-1 PEG inzulín) proti nepegylovanému lidskému inzulínu u krysích samců (příklad 9).

Obr. 8 - zde jsou vyneseny průměrné koncentrace inzulínu v séru po intratracheálním vkapání pegylovaného (750-1 PEG inzulín, 80 a 160 pg/živočicha) proti nepegylovanému lidskému inzulínu (80 pg/živočicha) u krysích samců (příklad 10).

Obr. 9 - zde jsou vyneseny průměrné koncentrace glukózy v krvi po intratracheálním vkapání pegylovaného (750-1 PEG inzulín, 80 a 160 pg/živočicha) proti nepegylovanému lidskému inzulínu (80 pg/živočicha) u krysích samců (příklad 10).

Obr. 10 - zde jsou vyneseny průměrné koncentrace inzulínu v séru po intratracheálním vkapání pegylovaného (750-2 PEG inzulín, 80 pg/živočicha) proti nepegylovanému lidskému inzulínu (80 pg/živočicha) u krysích samců (příklad 11).

Obr. 11 - zde jsou vyneseny průměrné koncentrace glukózy v krvi po intratracheálním vkapání pegylovaného (750-1 PEG inzulín, 80 pg/živočicha) proti nepegylovanému lidskému inzulínu (80 pg/živočicha) u krysích samců (příklad 11).

Obr. 12 - zde jsou vyneseny průměrné koncentrace glukózy v krvi po intratracheálním vkapání pegylovaného (2K PEG inzulín, 300 pg/živočicha, 600 pg/živočicha, 900 pg/živočicha a 1200 pg/živočicha) proti nepegylovanému lidskému inzulínu (80 pg/živočicha) u krysích samců (příklad 12).

Obr. 13 - zde jsou vyneseny průměrné koncentrace inzulínu v séru po intravenosním podání ukázkového prostředku, obsahujícího pegylovaný (2K PEG inzulín) oproti nepegylovanému inzulínu (podrobnosti jsou podány v příkladu 13).

• · · • · · · · • · · · · · · • · · · · · · · • · · β · · • · ♦ · « · · • · · · · · ···· ·· ·· ···

Obr. 14 - zde jsou vyneseny koncentrace glukózy v krvi po intravenosním podání ukázkového prostředku, obsahujícího pegylovaný (2K PEG inzulín) oproti nepegylovanému inzulínu (podrobnosti jsou podány v příkladu 13).

Příklady provedení vynálezu

Materiál a metody

Polyethylenglykolové reagencie byly získány od Shearwater Corporation (Huntsville, Alabama).

Lidský inzulín byl získán od Diosynth, lne.

Příklad 1: Syntéza di-N^aA1,N^EB29-t-Boc-inzulínu

Prostředek skládající se primárně z mono-pegylovaného inzulínu byl připraven místně specifickým způsobem, jak je uvedeno v příkladech 1 a 2, za použití demonstračního lineárního polyethylenglykolu o molekulové hmotnosti 5000 daltonů.

Inzulín chráněný na dvou místech byl poprvé připraven následujícím způsobem. 602 mg lidského inzulínu (0,103 mmol) bylo rozpuštěno v 3,0 ml bezvodého dimethylsulfoxidu (DMSO), obsahujícího 166 pl triethylaminu. K roztoku inzulínu bylo přidáno 50 Dl di-terc-butyldikarbonátu (0,215 mmol). Po 60 minutách stání při teplotě místnosti byl reakční roztok nalit do 240 ml acetonu a vzápětí byly přidány 3 kapky 6 M HCI, čímž bylo iniciováno vločkování. Precipitát byl izolován pomocí filtrace a sušen ve vakuu. Reakční produkt byl čištěn preparativní HPLC za použití sloupce Waters 25x100 mm C18 (průměrná velikost částic 15 pm; velikost póru 10 nm). Jako eluční roztoky byly použity směsi acetonitrilu a 0,1% TFA v deionizované vodě, při rychlosti průtoku 3,0 ml/minutu. Produkt byl odebírán, destilován, aby byl odstraněn acetonitril a poté lyofilizován. Výtěžek byl 164,8 mg (26,7 %, molekulová hmotnost ~6000 daltonů zjišťováno metodou MALDI).

Příklad 2: Syntéza monopegylovaného konjugátu mPEG-5K-SPA-PheB1-inzulín N -methoxypoly(ethylenglykol)5K-inzulín (mPEG-5K-SPA-PheB1 -inzulín)

150 mg (~0,025 mmol) čerstvé purifikovaného di-N^aA1,N^EB29-t-boc-inzulínu z příkladu 1 bylo rozpuštěno ve 4 ml bezvodého DMSO, obsahujícího 95 pl triethylaminu. K roztoku inzulínu bylo přidáno 169 mg (0,032 mmol) mPEG-SPA-5000 (mPEG-sukcinimidylpropionát, mPEG-O-CH2CH2C(O)O-sukcinimid, molekulová hmotnost 5000). Po inkubaci přes noc (29 hodin) při teplotě místnosti byl výsledný mPEG-derivát inzulínu zředěn ve 100 ml deionizované vody, dialyzován proti deionizované vodě po dobu 4 hodin a poté lyofilizován. Lyofilizovaný produkt byl opět rozpuštěn ve 4 ml bezvodé TFA a udržován pod atmosférou N₂ při teplotě 0 °C po dobu

1,5 hodiny, aby byly odstraněny chránící skupiny Boc. mPEG-inzulín s odstraněnými chránícími skupinami byl rozpuštěn v 50 ml deionizované vody a dialyzován proti 0,1% NH4HCO3 a deionizované vodě přes noc. Po lyofilizací produktu byl získán bílý prášek. Výtěžek byl 117,6 mg (41,6%, molekulová hmotnost ~11 311,6 daltonů - zjišťováno metodou MALDI).

Procento monokonjugovaného inzulínu, na základě údajů hmotové spektrografie, bylo přibližně 90 %, což potvrzuje místně specifickou podstatu tohoto syntetického přístupu. Další charakteristické údaje jsou poskytnuty v příkladu 5. Obsah inzulínu ve výsledném produktu byl 51,3 %. Pro snadnější odkazování zde bude N -methoxy(polyethylenglykol)5K-propionamidinzulín neboli mPEG-5K-SPA-PheB1inzulín označován jako „5K PEG inzulín“.

Příklad 3: Syntéza konjugátu mPEG-2K-SPA-inzulín

Následující postup byl použit pro přípravu inzulínu pegylovaného nespecifickým způsobem (tj. náhodně), za použití demonstračního lineárního polyethylenglykolu, který má molekulovou hmotnost přibližně 2000 daltonů. 0,1012 g inzulínu (molekulová hmotnost 5826 daltonů, 0,01737 mmol) bylo rozpuštěno v 0,5 ml bezvodého DMSO a působeno na něj 50 pl triethylaminu (0.3587 mmol, 20násobný molární přebytek). K výše uvedené reakci bylo přidáno 52 mg m-SPA-2000 (mPEG-sukcinimidylpropionát, Shearwater Corporation, molekulová hmotnost ~2000 daltonů, 0,02605 mmol, 1,5násobný molární přebytek). Směs byla mícháno po dobu 17 hodin při teplotě místnosti pod dusíkovou atmosférou. Reakční směs byla potom rozpuštěna v 0,1% TFA do celkového objemu 5,5 ml a purifikována HPLC na reverzní fázi za použití sloupce C-18 a jako eluční činidlo byla použita směs acetonitril/O,1 % TFA). HPLC na reverzní fázi byla zjištěna směs jak monopegylovaný (jeden připojený PEG), tak dipegylovaný (dva připojené PEG) produkt; prostředek o tomto složení je zde označován jako „2K PEG inzulín“.

Výtěžek: 68 mg

Obsah inzulínu (zjišťováno pomocí RP-HPLC): 50,5 mg

Příklad 3; Syntéza konjugátu mPEG-750 Da-SPA-inzulín

Prostředek obsahující převážně inzulín pegylovaný na místě B1, byl připraven místně specifickým způsobem za použití demonstračního modifikovaného polyethylenglykolů, tj. lineárního polyethylenglykolů o molekulové hmotnosti 750 daltonů, který má na konci sukcinimidylpropionátovou skupinu, vhodnou pro kovalentní připojení inzulínu.

4A. Syntéza di-N^A1,N^B29-t-Boc-inzulínu

Inzulín chráněný na dvou místech byl připraven následujícím způsobem. 602 mg lidského inzulínu (0,103 mmol) bylo rozpuštěno v 3,0 ml bezvodého dimethylsulfoxidu (DMSO), obsahujícího 166 pl triethylaminu. K roztoku inzulínu bylo přidáno 50 μΙ diterc-butyldikarbonátu (0,215 mmol). Po 60 minutách stání při teplotě místnosti byl reakční roztok nalit do 240 ml acetonu a vzápětí byly přidány 3 kapky 6 M HCl, čímž bylo iniciováno vločkování. Precipitát byl izolován pomocí filtrace a sušen ve vakuu. Reakční produkt byl čištěn preparativní HPLC za použití sloupce Waters 25x100 mm C18 (průměrná velikost částic 15 pm; velikost póru 10 nm). Jako eluční roztoky byly použity směsi acetonitrilu a 0,1% TFA v deionizované vodě, při rychlosti průtoku 3,0 ml/minutu. Produkt byl odebírán, destilován, aby byl odstraněn acetonitril a poté lyofilizován. Výtěžek byl 164,8 mg (26,7 %, molekulová hmotnost -6000 daltonů zjišťováno metodou MALDI).

4B. Syntéza konjugátu mPEG-750 Da-SPA-PheB1-inzulín

63,4 mg (-0,1056 mmol) čerstvé purifikovaného di-N^A1,N^B29-t-boc-inzulínu z příkladu 4A bylo rozpuštěno v 0,5 ml DMSO, obsahujícího 200 pl triethylaminu. K roztoku inzulínu bylo přidáno 33 mg (0,03173 mmol, molekulová hmotnost mSPA750 je 1040 daltonů) mPEG-SPA-750 (mPEG-sukcinimidylpropionát, mPEG-0-CH2CH2C(O)O-sukcinimid, molekulová hmotnost PEG 750). Po inkubaci přes noc (29 hodin) při teplotě místnosti bylo k reakční směsi přidáno 300 pl TFA a výsledný mPEGderivát inzulínu vysrážen v 100 ml ethyletheru a sušen ve vakuu. Výtěžek byl 28,5 mg, obsah inzulínu byl 21,3 mg - zjišťováno pomocí HPLC na reverzní fázi (33,6 %), molekulová hmotnost -6639,3 daltonů - zjišťováno metodou MALDI. Pro jednoduchost je zde tento prostředek označován jako „750 PEG inzulín“.

U tohoto materiálu byly provedeny dvě rozdílné syntézy, u obou byla použita výše uvedená technologie syntézy, s jednou výjimkou: jedna syntéza byla provedena za molárního poměru mPEG-SPA-750 k inzulínu 7:1, zatímco druhá byla provedena za molárního poměru mPEG-SPA-750 k inzulínu 3:1. Složení produktů, pocházejících

0 z těchto dvou druhů přípravy, jsou zde označovány jako „750-1 PEG inzulín“ (molární poměr PEG k inzulínu byl 7:1) a „750-2 PEG inzulín“ (molární poměr PEG k inzulínu byl 3:1).

Příklad 5: Charakterizace demonstračních prostředků PEG-inzulín

Výše popsané prostředky obsahující konjugát pegylovaného inzulínu, byly dále charakterizovány různými analytickými technikami.

Hmotová spektrometrie byla použita pro stanovení relativních množství mono-, di- a trikonjugovaného inzulínu (také označováno jako monomer PEG-inzulínu, dimer PEG-inzulínu a trimer PEG-inzulínu) přítomného v každém z prostředků, stanovení je založeno na relativní ploše píků. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.

Tabulka 1: Relativní množství mono-, di- a tri-konjugovaného inzulínu, zjištěné na základě hmotové spektrometrie

prostředek PEG-inzulín	% monokonjugátu	% dikonjugátu	% trikonjugátu
5K PEG-inzulín	91	4	nestanoveno
750-1 PEG-inzulín	46	39	15
750-2 PEG-inzulín	60	32	8
2K PEG-inzulín	51	45	nestanoveno

Chromatografie na základě velikosti částic (SEC) byla provedena u výše popsaných prostředků 750-1, 750-2 a 2K PEG-inzulín za použití Shodex SEC sloupců (číslo dílu KW-802.5), sestavených do sérií na systému Waters 2690 HPLC. Pohyblivá fáze obsahovala 22 % ledové kyseliny octové a 33 % acetonitrilu (objem) ve vodě. Chromatografický údaj byl použit jako alternativní přístup pro určení relativních množství mono-, di- a trikonjugovaného inzulínu v každém z těchto prostředků. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2 dále. Jak je možno vidět při porovnání údajů v tabulce 1 a tabulce 2, dvě různé metody poskytují výsledky, které jsou vzájemně velmi podobné, pokud se týká relativních množství jednotlivých typů konjugátů v prostředcích.

Tabulka 2: Relativní množství mono-, di- a tri-konjugovaného inzulínu, zjištěné na základě HP-SEC

Typ inzulínu	% monokonjugátu	% dikonjugátu	% trikonjugátu	% jiné
PEG 750-1	48	47	5	0
PEG 750-2	66	26	7	2
PEG 2000	40	51	nestanoveno	9

Další studie byly provedeny pro určení zastoupení konjugátů s různým umístěním spojení inzulínu a polyethylenglykolu v každém ze tří ukázkových prostředků, tj. rozsahu substituce na každém ze tří možných připojovacích míst, A-1Gly, B-1Phe nebo B-29 Lys. Dithiothreitol (DTT, Sigma) byl použit pro redukování disulfidových vazeb ve vzorcích inzulínu, a tím bylo přerušeno kovalentní spojení mezi inzulínovými řetězci A a B.

Pro provedení redukčních reakcí byly vzorky každého druhu konjugátu PEGinzulínu rozpuštěny v 8 M močovině obsahující 0,4 M kyselý uhličitan amonný na koncentraci odpovídající 0,2 mg inzulínu/ml. DTT byl rozpuštěn ve vodě (7 mg/ml) a připraven tak vodný roztok DTT. Jedna část roztoku DTT byla potom přidána k 5 částem každého z inzulínových roztoků, a redukční reakce probíhala při teplotě 50 °C po dobu 15 minut. Prostředky obsahující redukovaný inzulín byly alkylovány jodacetamidem (Sigma). Šest částí roztoku PEG-inzulín reagovalo s 1 částí 100 mM jodacetamidu, poté byla provedena chromatografie a enzymatické štěpení. Reakční produkty pak byly analyzovány pomocí HPLC. Procento konjugace buď s inzulínovým řetězcem A nebo s řetězcem B bylo stanoveno na základě množství inzulínových řetězců A nebo B, které je eluováno později než u kontroly (zpoždění je připisováno konjugaci s polyethylenglykolem). Tyto opožděně se eluující píky tedy u kontrol chyběly. Relativní plochy píků byly použity jako údaj o procentu konjugace polyethylenglykolu buď s inzulínovým řetězcem A nebo B.

Při dalším zkoumání relativního množství PEG připojeného k B-29 Lys oproti B1Phe, redukované a alkylované A a B řetězce prostředků 750-1 a 750-2 PEG-inzulín, pocházející zvýše popsaných DTT redukčních reakcí, byly dále štěpeny pomocí

0 * · ♦ · · ··· • · · · · 0 0 0 0 0 0 ··· · · 0 0 0 0 0 ♦ • 0 0 0 0 0000 0000 ··· 000 000

0·0· 00 00 0Χ 00 ♦ enzymu endoproteinázy Glu-C (Sigma), v čistotě pro sekvenování. Byl připraven roztok kyselého uhličitanu amonného, obsahující enzym v koncentraci 0,125 pg/μΙ. Před přidáním roztoku enzymu byla koncentrace inzulínu v každé z redukčních reakčních směsí 0,05 pg/μΙ v 8 M močovině, obsahující 0,4 M kyselý uhličitan amonný. Jeden díl roztoku enzymu byl potom přidán ke 40 dílům roztoku inzulínu. Štěpení enzymem endoproteinázou Glu-C dává vznik inzulínovým peptidovým fragmentům A1-A4, A5A17, A18-A21, B1-B13, B14-B21 a B22-B30.

Fragmenty vznikající enzymatickým štěpením jak A, tak B řetězců 750-1 a 750-2 PEG-inzulínu, které jsou obsaženy ve zkoumaných prostředcích, byly analyzovány pomocí HPLC, aby se stanovilo všeobecné rozložení připojovacích míst pro polyethylenglykol na inzulínu pro každý z těchto prostředků. Procento plochy píku, zmenšující se relativně vzhledem ke kontrole, poskytuje odhad množství fragmentu konjugovaného s polyethylenglykolem, protože je tento fragment eluován na chromatogramu jinde.

Tabulka 3A: Rozložení míst připojení u demonstračních přípravků PEG-inzulín

Typ inzulínu	% konjugovaných míst A1	% konjugovaných míst B-1	% konjugovaných míst B-29
PEG 750-1	30	95	21
PEG 750-2	11	95	15
PEG 2000	63	85*

* nejde o údaje po štěpení, jedná se pouze o snížený výtěžek

Čísla v tabulce 3a jsou založena na možnosti, že každé místo může být stoprocentně konjugováno. Například každý monokonjugovaný druh má tři možné konfigurace (mono-A1, mono-B1, mono-B29) a každý dikonjugovaný druh má tři možné konfigurace (di-A1, B-1; di-A-1 ,B-29; a di-B-1, B29). Při pohledu na údaje v tabulce 3A, např. pro 750-1, ze všech možných druhů přítomných v prostředku, 95 % konjugátů PEG-inzulín má polyethylenglykol kovalentně připojený na místě B-1.

Tabulka 3B: Různé možné druhy konjugátů

Typy

mono-konjugát

di-konjugát

tri-konjugát

HMWP

Druhy#	1	2	3	4	5	6	7	8
místo připojení	A-1	B-1	B-29	(A-1 + B-29)	(A-1 + B-29)	(B-1 + B-29)	(A-1 + B-1 + B-29)	konjugované dimery inzulínu

Příklad 6: Srovnání rychlosti enzymatického štěpení 750-2 PEG-inzulínu ve srovnání s inzulínem nemodifikovaným

Rychlost enzymatického štěpení 750-2 PEG-inzulínu chymotrypsinem byla porovnávána s rychlostí enzymatického štěpení inzulínu.

Prostředky obsahující kontrolní inzulín a PEG 750 inzulín-2 byly připraveny v koncentraci 1 mg/ml ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátovým pufrem pH 7,8. Chymotrypsin byl připraven v koncentraci 1 mg/ml v roztoku 1 M HCI. Jeden díl roztoku enzymu byl přidán k 20 dílům roztoku inzulínu. Přibližně každou hodinu byly odebírány malé vzorky směsného roztoku.

Byla vyvinuta metoda RP-HPLC (HPLC na reverzní fázi), při které byl použit sloupec C-18 s mobilní fází obsahující chloristan sodný, kyselinu fosforečnou a acetonitril. Gradient acetonitrilu byl použit pro eluování směsi druhů pegylovaného inzulínu jako skupiny slabě rozdělených plků, detekovaných při vlnové délce 214 nm. Skupina plků byla ručně spojena dohromady označeny jako PEG-inzulín. Jak štěpení pokračovalo, byl do grafu vynášen úbytek inzulínu a PEG-inzulínu (obr. 1). Byl stanoven jejich poločas v přítomnosti chymotrypsinu.

Doba vyžadovaná pro enzymatické rozštěpení poloviny koncentrace hlavní složky prostředku 750-2 PEG-inzulín byl pětkrát delší, než u nemodifikovaného inzulínu. Tedy jinak řečeno, štěpení poloviny koncentrace ukázkového pegylovaného inzulínu trvalo pětkrát déle, než u inzulínu běžného. Výsledky ukazují schopnost konjugátů PEG-inzulín přetrvávat delší dobu v plicních sklípcích, pro jeho zvýšenou odolnost k proteolytickému štěpení oproti nemodifikovanému inzulínu.

Příklad 7: Vyhodnocování koncentrací glukózy a inzulínu v séru po intravenózním podání 5K PEG-inzulín u krys (P-2001-015)

Tato studie byla provedena pro zjištění, zda aktivita inzulínu v prostředku obsahujícím 5K PEG-inzulín byla zachována po chemické modifikaci ukázkovým 5K polyethylenglykolovým řetězcem a pro zjištění dávky a křivek glukózové odpovědi u těchto prostředků po intravenózním podání.

·· Φ· • · · · * ♦· • · « • · · ···· ··

• · ····

Samci krys kmene Sprague Dawley s předem zavedenými kanylami (krční/stehenní žíla [JVC/FVC]), kteří měli vstupní otvor, zavedený pod kůži, vyveden na zátylku, byly dodány firmou Hilltop Lav Animals lne. (P.O. Box 183, Scottdale, PA 15 683). Krční kanyly byly pro udržení průchodnosti naplněny roztokem polyvinylpyrrolidonu (PVP - molekulová hmotnost 40 000) farmaceutické čistoty, fyziologickým roztokem a sodnou solí heparinu. Zátka tvořená nylonovým vláknem byla v den pokusu vyjmuta a nahrazena kanylou Monoject blunt 23Gx1 (WVR #53 498-484). Testovací systém obsahoval jednoho náhodně vybraného samce pro skupinu placebo, dva náhodně vybrané samce pro skupinu nepegylovaého inzulínu a čtyři náhodně vybrané samce pro skupinu pegylovaého inzulínu. Zdrojem pegylovaého inzulínu pro tuto studii byl 5K PEG-inzulín z příkladu 2. Dávky byly podávány intravenózně.

Počet/pohlaví zvířat

l.den: 1M/skupinu pro skupinu 1 s placebem 2M/skupinu pro skupinu 2 4M/skupinu pro skupiny 3 až 5

Zvířata byla hladověna po dobu 12 až 18 hodin před započetím studie. Lidský inzulín (Diosynth) byl před použitím uložen při teplotě -20 °C. 5K PEG-inzulín (příklad 2) byl před použitím uložen při teplotě -20 °C. Pro podání byly připraveny dva různé roztoky:

Roztoky pro intravenózní podávání nepegylovaný lidský inzulín (1,0/mg/ml zásobního roztoku): 1,0 ml PBS byl přidán k 1,0 mg prášku inzulínu.

5K PEG inzulín: (1,0/mg/ml lidského inzulínu - koncentrace je založena na množství inzulínu, nikoli na množství konjugátu): 6,0 ml PBS byl přidán k 11,7 mg prášku 5K PEG inzulínu.

U zvířat byla provedena anestézie pomocí inhalace isofluranu. Intravenózní dávky (300 μΙ/zvíře) byly podány skrz FVC a potom byl katétr podvázán, aby se zabránilo křížové kontaminaci krevními zbytky. Všechny vzorky krve byly odebírány z JVC. Skupině 1 byl podán fosforečnanem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) ve formě 300 pl intravenózní dávky. Nepegylovaný lidský inzulín byl podán skupině 2 ve formě intravenózní dávky 20 pg/zvíře. Přípravek obsahující pegylovaný lidský inzulín byl podán skupině 3 ve formě intravenózní dávky 20 pg/zvíře, skupině 4 ve formě • · · • 4 ··· • 4 • · 4 • 4444 intravenózní dávky 40 pg/zvíře a skupině 5 ve formě intravenózní dávky 30 pg/zvíře. Vzorky krve (-500 pl) byly odebírány z JVC před podáním dávky (2 až 0,25 hodiny před podáním dávky), 10, 15, 30, 60, 120 a 180 minut po podání dávky. Malé množství krve bylo naneseno na glukózový testovací proužek pro určení hladiny glukózy v krvi pomocí testovacího přístroje na glukosu Glucometer Elitě monitor (Bayer Corp., Elkart, IN). Zbytek vzorku byl umístěn do zkumavek pro oddělení séra a ty byly centrifugovány, aby došlo k rozdělení krve. Sérum bylo potom slito do oddělené zkumavky a analyzováno pomocí radioaktivního imunologického testu (RIA). Průměry a standardní odchylky (SD) byly spočítány pomocí Microsoft® Excel 2000.

Tabulka 4: Souhrn pokusů in-vivo

V následující tabulce jsou uvedeny skutečné podané dávky a skutečný počet zvířat, použitých ve skupině. Studie byla provedena během 1 dne.

číslo skupiny	prostředek	způsob podávání	celková denní dávka inzulínu (pg/zvíře)	počet zvířat/pohlaví
1	placebo	i.v.	0	1M
2	inzulín bez PEG	i.v.	20	2M
3	PEG-inzulín	i.v.	20	4M
4	PEG-inzulín	i.v.	40	4M
5	PEG-inzulín	i.v.	30	4M

Výsledky ukazují, že prostředek obsahující 5K PEG-inzulín vykazuje biologickou aktivitu, tj. molekuly inzulínu zůstávají aktivní po modifikování pomocí polyethylenglykolu, jak je možno vidět z jeho schopnosti snižovat hladinu glukózy v krvi. Průměrné koncentrace inzulínu v séru, následující po intravenózním podání pegylovaného inzulínu byly závislé na velikosti dávky; také bylo pozorováno snižování hladiny glukózy v krvi závislé na velikosti podané dávky. Výsledky jsou souhrnně uvedeny na obrázcích 2 a 3. Na obr. 2 jsou vyneseny průměrné koncentrace inzulínu v séru, následující po intravenózním podání ukázkových prostředků, obsahujících

99 φ 99 9 * · · · · 999 9 99

99 99 9 9999 ·· · · · 9 9 99 9 9999

·..· .:. ·..· :

pegylovaný oproti nepegylovanému inzulínu; na obr. 3 jsou vyneseny koncentrace glukózy v krvi, následující po intravenózním podání výše uvedených prostředků.

Příklad 8: Podávání 5K PEG-inzulínu do plic (P-2001-017)

Ukázkový pegylovaný inzulín, 5K PEG-inzulín, byl podáván krysám intratracheálně, aby bylo zjištěno (i) zda se jeho aktivita zachová po podání do plic, a (ii) jeho vliv, pokud je nějaký, na koncentrace inzulínu v séru a glukózy v krvi, pokud je podán přímo do plic.

Zásobní roztoky nepegylovaný inzulín: 1,0 ml PBS byl přidán k 1,0 mg prášku inzulínu, čímž byl připraven zásobní roztok 1 mg/ml. Zásobní roztok inzulínu (kontrola) byl připraven v den započetí studie.

5K PEG inzulín: 4,0 ml PBS byly přidány k 7,8 mg prášku 5K PEG inzulínu, čímž byl připraven zásobní roztok 1 mg/ml (na základě množství inzulínu).

Dávkovači roztoky

Inzulín 40 μΙ/zvíře: V průběhu 2 hodin dávkování bylo přidáno 667 pl zásobního roztoku inzulínu do 4,33 ml PBS.

Inzulín B-1 150 pg/zvíře: V průběhu 2 hodin dávkování bylo přidáno 2,5 ml zásobního roztoku 5K PEG inzulínu do 2,5 ml PBS.

Intratracheální vkapávání

Zvířatům byla provedena lehká anestézie pomocí inhalace 3,0 až 5,0% Isofluranu (Abbott Laboratories) smíšeného s kyslíkem po dobu přibližně 5 minut v plexisklové komůrce. Podání bylo provedeno vsunutím sondy pro podávání žaludeční výživy (Popper & Sons lne.,; 18x3 W2-1/4 mm, New Hyde Park, NY 11 040), zabudované v1ml stříkačce, ústním otvorem krysy do průdušnice, právě nad hlavní výběžek. V průběhu zavádění sondy pro podávání žaludeční výživy do průdušnice byl vhodný postup zasouvání detekován tak, že byla pomocí balónku na sondě sledována drsnost, způsobovaná chrupavčitými kroužky pod povrchem hrtanu. Dávky byly touto metodou podány do plic a potom byla sonda odstraněna.

Pro tuto studii bylo použito čtrnáct (N=7/skupinu) krysích samců, hladověných určitou dobu před testem (Hilltop Lab Animals, Scottdale, PA (300 až 350 g)) s zavedenými katétry do krční žíly (JVC). Nepegylovaný lidský inzulín byl podán skupině 1 ve formě intratracheální dávky 40 pg/300 pl. Přípravek obsahující pegylovaný lidský inzulín byl podán skupině 2 ve formě intratracheální dávky 150 pg/300 pl. Vzorky • 9 ·· *· ·» • 9 9 9 • 99

9 9

9999 99

krve (-500 μΙ) byly odebírány před dávkou (2 až 0,25 hodiny před podáním dávky), 15, 30, 60, 120, 240, 360, 480 a 720 minut po podání dávky. Malé množství krve bylo naneseno na glukózový testovací proužek pro určení hladiny glukózy v krvi pomocí testovacího přístroje na glukózu Glucometer Elitě monitor (Bayer Corp., Elkart, IN). Zbytek vzorku byl umístěn do zkumavek pro oddělení séra a analyzováno pomocí radioaktivního imunologického testu (RIA). Průměry a standardní odchylky (SD) byly spočítány pomocí Microsoft® Excel 2000. Dvě až tři zvířata ze studie vypadla kvůli ucpanému katétru.

Tabulka 5: Souhrn in-vivo pokusů na krysách

V následující tabulce jsou uvedeny skutečné podané dávky a skutečný počet zvířat, použitých ve skupině.

číslo skupiny	typ inzulínu	způsob podávání	počet zvířat/pohlaví	celková denní dávka inzulínu (pg/zvíře)	počet dnů, kdy byly podávány dávky
1	inzulín	I.T.	7M	40	1
2	5K PEG-inzulín	I.T.	7M	150	1

Tabulka 6: Velikosti in vivo dávek

číslo skupiny	typ inzulínu	celková denní dávka inzulínu (pg/zvíře)	objem dávky (μΙ)	koncentrace podávaného roztoku (pg/ml)
1	inzulín	40	300	133,33
2	5K PEG-inzulín	150	300	500

Průměrné koncentrace inzulínu v séru a průměrné koncentrace inzulínu a 5K PEG inzulínu v krvi po intratracheálním podání byly vyneseny a jsou uvedeny na obr. 4, respektive obr. 5. Výsledky ukazují, že prostředky obsahující pegylovaný inzulín, které jsou předmětem tohoto vynálezu, vykazují aktivitu po podání a zůstávají přítomny v plících. Farmakokinetické údaje dále ukazují, že pegylovaný inzulín nejen prochází plícemi do krevního oběhu, ale také si přitom podržuje svoji aktivitu, jak je zřejmé z detekovatelných hladin inzulínu, odpovídajících neendogennímu inzulínu. Na základě ·< 9 · · • 9 9 9

9 9999 • 99

9 • · · · · · ·· • ·· · · · ·····« · · ··*··· ···· ·· ·· ··· hladin inzulínu v krvi, pozorovaných přibližně během 1 hodiny po intratracheálním podání se zdá, že pegylovaný inzulín není v podstatném rozsahu zadržován v plících a prochází krátce po podání přes plíce do krevního oběhu. Výsledky dále naznačují, že pegylovaný inzulín, když je podán do plic, je účinný při snižování hladiny glukózy v krvi. Avšak v předvedeném pokuse se zdá být pegylovaný inzulín při podávaných dávkách méně účinný při snižování hladiny glukózy v krvi než inzulín nepegylovaný. Jak farmakokinetická, tak farmakodynamická křivka odpovědi při intratracheálně podaný pegylovaný inzulín poněkud napodobuje nepegylovaný inzulín, třebaže na základě profilů uvedených v obrázku 4, se PEG-inzulín zdá působit déle než nepegylovaný inzulín. Další optimalizace dávkových množství a určitých polyethylenglykolových modifikátorů může být snadno dosažena osobou se zkušenostmi v oboru na základě zde uvedeného poučení a na základě požadovaného dávkování, zamýšlené populaci pacientů, léčených stavů a podobně, pro jednotlivé chemicky modifikované inzulínové produkty.

Příklad 9: Podávání 750-1 PEG-inzulínu do plic (P-2001-025)

Ukázkový pegylovaný inzulín, 750-1-PEG-inzulín, byl intratracheálně podáván krysám. Studie byla provedena částečně pro zkoumání účinků inzulínového prostředku s inzulínem kovalentně připojeným k jednomu nebo více polyethylenglykolovým řetězcům, které mají průměrnou molekulovou hmotnost 1000 daltonů nebo méně, a je podáván do plic.

Tato in vivo studie na krysách byla provedena v podstatě tak, jak je popsáno výše v příkladu 8. Přesný dávkový režim a podané dávky jsou souhrnně uvedeny dále v tabulkách.

Tabulka 7

číslo skupiny	typ inzulínu	způsob podávání	počet zvířat/pohíaví	celková denní dávka inzulínu (pg/zvíře)	počet dnů, kdy byly podávány dávky
1	inzulín	I.T.	2M	80	1
2	750-1 PEG-inzulín	I.T.	4M	100	1

3	750-1 PEG-inzulín	I.T.	4M	300	1
4	750-1 PEG-inzulín	I.T.	4M	500	1

Tabulka 8

číslo skupiny	typ inzulínu	celková denní dávka inzulínu (pg/zvíře)	objem dávky (Pl)	koncentrace podávaného roztoku (pg/ml)
1	inzulín	80	300	266,67
2	750-1 PEG-inzulín	100	300	333,33
3	750-1 PEG-inzulín	300	300	1000,00
4	750-1 PEG-inzulín	500	300	1666,67

Koncentrace v séru a koncentrace v krvi u inzulínu a 750-1 PEG inzulínu po intratracheálním podání krysám byly vyneseny a jsou uvedeny na obr. 6, respektive obr.

7. Při pohledu na vynesení průměrných koncentrací inzulínu v séru na obr. 6 je zřejmé, že nativní nebo nepegylovaný inzulín dosáhly své maximální koncentrace v séru přibližně po 15 minutách, zatímco prostředky obsahující pegylovaný inzulín dosáhly maximální koncentrace v séru v 6 hodinách (100 pg/zvíře) a 8 hodinách (300 pg/zvíře), což ukazuje schopnost dlouhodobého působení těchto prostředků, když jsou podány do plic pomocí inhalace. Jak je možno vidět na obr. 6, nemodifikovaný inzulín se navrátil na úroveň základní linie přibližně po 6 hodinách po podání, zatímco hladiny pegylovaného inzulínu byly v této době významně nad úrovní základní linie (3 až 7krát a vícekrát vyšší, než hodnota základní linie). Kromě toho, intratracheální podání pegylovaného inzulínu má za následek trvalé hladiny systémového inzulínu, které se nevrátily k základní linii ještě ani po 12 hodinách po podání. Ve skutečnosti byly hladiny

inzulínu pro pegylovaný inzulín více než 3krát vyšší než je hodnota základní linie (tj. hodnota pro nemodifikovaný inzulín) jak v 8 hodinách, tak ve 12 hodinách. Diagram těchto výsledků je uveden na obr. 6.

V souhrnu je možno říci, že při podání do plic, způsobuje 750-1 PEG-inzulín ve srovnání s nemodifikovaným inzulínem zvýšené systémové hladiny inzulínu. Kromě toho, systémové hladiny inzulínu pro skupinu pegylovaného inzulínu byly po 12 hodinách stále významně nad hodnotou základní linie. Jinak řečeno, zvýšené hladiny inzulínu vytrvaly u skupiny pegylovaného inzulínu alespoň dvakrát tak dlouho, než u inzulínu nemodifikovaného. Tento údaj je dalším potvrzením, že pegylovaný inzulín prochází skrz plíce, je biologicky aktivní a poskytuje, ve srovnání s nemodifikovaným inzulínem, prodloužené systémové hladiny inzulínu.

Diagram průměrných koncentrací glukózy v krvi, následujících po intratracheálním podání nepegylovaného inzulínu, ve srovnání s 750-1 pegylovaným inzulínem, je uveden na obr. 7. U skupiny pegylovaného inzulínu hladiny glukózy v krvi výborně korelují s hladinami inzulínu v séru (totiž při zvýšené hladině inzulínu v séru je také pozorováno odpovídající snížení glukózy v krvi). Při pohledu na obr. 7 je možno vidět, že prostředky obsahující pegylovaný inzulín, které jsou předmětem tohoto vynálezu, pokud jsou podány orálně do plic, vykazují spíše rychlý nástup působení, který je srovnatelný s přírodním inzulínem, než zpožděný nástup působení, typický pro mnoho přípravků s trvalým uvolňováním. Potlačení glukózy totiž nastává krátce po podání. Dále, zatímco přírodní nebo nepegylovaný inzulín dosahují svého maximálního snížení glukózy asi po dvou hodinách, doba, kdy nastane maximální snížení glukózy u pegylovaného inzulínu, byla prodloužena alespoň na 4 hodiny, 6 hodin, respektive 8 hodin, pro dávky 500 pg, 100 pg, respektive 300 pg. Tedy doba, kdy je dosaženo maximálního snížení glukózy v krvi, byla pro pegylovaný inzulín podaný do plic, ve srovnání s inzulínem nepegylovaným, prodloužena 2 až 4krát. Všeobecně bylo potlačení hladiny glukózy v krvi u 750-1 PEG-inzulínu, ve srovnání s nemodifikovaným inzulínem, významně zvýšeno po dobu 12 hodin. Po osmi hodinách se hladiny glukózy v krvi v podstatě vrátily k normálu pro nemodifikovaný inzulín, zatímco hladiny glukózy v krvi pro skupinu PEG inzulínu byly 1,3 až 3krát nižší, než pro nemodifikovaný inzulín. Hladiny glukózy se pro skupinu pegylovaného inzulínu nevrátily na úroveň základní linie ani po 12 hodinách, což dále poukazuje na prodloužené potlačování hladiny glukózy v krvi u prostředků obsahujících chemicky derivovaný inzulín, které jsou předmětem tohoto vynálezu.

0 · «0 0 0000 00 000 0 0 00 0 0000

0000 ·· 00 0 « 0 00 0

Příklad 10: Podávání 750-1 PEG-inzulínu do plic (P-2002-001)

Ve studii podobné výše uvedenému příkladu 9, byl 750-1-PEG inzulín podáván intratracheálně krysám v dávkách nižších, než byly použity v příkladu 9.

Tato in vivo intratracheální studie na krysách byla provedena v podstatě tak, jak bylo výše popsáno v příkladu 8. Přesný dávkový režim a velikost podávaných dávek jsou souhrnně uvedeny v tabulkách níže.

Tabulka 9

číslo skupiny	typ inzulínu	způsob podávání	počet zvířat/pohlaví	celková denní dávka inzulínu (pg/zvíře)	počet dnů, kdy byly podávány dávky
1	inzulín	i.t.	5M	80	1
2	750-1 PEG-inzulín	i.t	5M	80	1
3	750-1 PEG-inzulín	i.t.	5M	300	1

Tabulka 10

číslo skupiny	typ inzulínu	celková denní dávka inzulínu (pg/zvíře)	objem dávky (Ml)	koncentrace podávaného roztoku (pg/ml)
1	inzulín	80	300	266,7
2	750-1 PEG-inzulín-1	80	300	266,7
3	750-1 PEG-inzulín-1	160	300	533,3

Pro nemodifikovaný inzulín a 750-1 PEG inzulín byly po intratracheálním podání krysám vyneseny koncentrace v séru a průměrné koncentrace v krvi a výsledky jsou uvedeny na obr. 8, respektive obr. 9. Při pohledu na diagram průměrných koncentrací inzulínu v séru na obr 8 je zřejmé, že nativní nebo nepegylovaný inzulín dosáhly své maximální koncentrace v séru přibližně po 15 minutách, zatímco prostředky obsahující pegylovaný inzulín dosáhly maximální koncentrace v séru po 2 hodinách (80 pg/zvíře) a 6 hodinách (160 pg/zvíře). Totiž doba, kdy jsou dosaženy maximální hladiny inzulínu v séru, byla u pegylaci modifikovaného inzulínu prodloužena 8 až 24krát oproti přírodnímu nebo nepegylovanému inzulínu, když je podán do systémového oběhu plícemi. Jak je možno vidět na obr. 8, nemodifikovaný inzulín poklesl na základní hladinu přibližně 12 hodin po podání, zatímco hladiny pro skupinu pegylovaného inzulínu byly ve stejném okamžiku, tj. 12 hodin po podání, v rozmezí od 2,5 do 3,5násobku hodnoty základní hladiny. Hladiny inzulínu u skupiny pegylovaného inzulínu nepoklesly na základní hodnotu dříve než za 25 hodin, což znamená, že u skupiny pegylovaného inzulínu trval, ve srovnání s nemodifikovaným inzulínem, pokles na základní hladinu dvakrát déle. Hladiny systémového inzulínu byly u skupiny pegylovaného inzulínu vzhledem k inzulínu nemodifikovanému, pokud se týká doby trvání, asi dvojnásobně dlouhé (25 hodin oproti 12 hodinám). V časovém bodě asi 6 hodin, hladiny inzulínu u dvou skupin pegylovaného inzulínu zhruba odpovídaly podaným dávkám (tzn. koncentrace inzulínu byly u skupiny, která obdržela 160 pg/zvíře, přibližně dvakrát vyšší než u skupiny, která obdržela 80 pg/zvíře).

Vynesení průměrných koncentrací glukózy v krvi po intratracheálním podání nepegylovaného inzulínu oproti 750-1 PEG inzulínu je uvedeno na obrázku 9. Dvacet pět hodin po podání se snížené hladiny glukózy u obou skupin pegylovaného inzulínu, na rozdíl od inzulínu nemodifikovaného, stále ještě nenavrátily na základní úroveň. Podobně jako u výsledků v příkladu 9, souhrnné profily pro pegylovaný inzulín ukazují na prodlouženou dobu snížení hladiny glukózy v krvi, tato doba byla prodloužena přes 25 hodin. V časovém bodě asi 8 hodin se hladiny glukózy téměř navrátily na úroveň odpovídající nemodifikovanému inzulínu, zatímco hladiny glukózy pro skupinu PEGinzulínu byly asi 1,5krát nižší než u nemodifikovaného inzulínu. Tyto výsledky dále ukazují, že nemodifikovaný inzulín s jednou nebo více polyethylenglykolovými složkami vykazuje dobrou biologickou přístupnost plícemi a časově prodloužené hladiny inzulínu v systému a rovněž časově prodloužené potlačení úrovně hladiny glukózy

Příklad 11: Podávání 750-2 PEG-inzulínu do plic (P-2002-003)

Ukázkový prostředek, obsahující pegylovaný inzulín 750-2-PEG-inzulín byl podáván krysám intratracheálně. Tato studie byla provedena kvůli dalšímu zkoumání účinku různých dávek pegylovaného oproti nepegylovanému inzulínu, když jsou podány • · • · ·> · · • · · · • · ·· · · přímo do plic. Zvířata obdržela dávku 80 pg inzulínu/zvíře jak v případě pegylované, tak v případě nepegylované formy inzulínu. In vivo studie na krysách byla provedena v podstatě tak, jak je popsáno výše v příkladu 8. Přesný dávkový režim a podávané dávky jsou souhrnně uvedeny v následujících tabulkách.

0· *

Tabulka 11

číslo skupiny	typ inzulínu	způsob podávání	počet zvířat/pohlaví	celková denní dávka inzulínu (□g/zvíře)	počet dnů, kdy byly podávány dávky
1	inzulín	IT	7M	80	1
2	750PEG-2 inzulín	IT	7M	80	1

Tabulka 12

číslo skupiny	typ inzulínu	celková denní dávka inzulínu (□g/zvíře)	objem dávky (□O	koncentrace podávaného roztoku (□g/ml)
1	inzulín	80	300	266,7
2	750PEG-2 inzulín	80	300	266,7

Vynesení průměrných koncentrací inzulínu v séru po intratracheálním vkapávání jak nepegylovaného inzulínu, tak 750-1 PEG inzulínu v dávce 80 pg/zvíře je ukázáno na obr. 10. Vynesení průměrných koncentrací glukózy v krvi po intratracheálním vkapávání jak nepegylovaného inzulínu, tak 750-1 PEG inzulínu v dávce 80 pg/zvíře je ukázáno na obr. 11. Byly získány výsledky podobné výsledkům v příkladech 9 a 10.

Farmakokinetické parametry získané z příkladů 10 a 11 jsou uspořádány v následující tabulce. Biologická dostupnost je absolutní biologická dostupnost (tj. ve srovnání s inzulínem podávaným intravenózně).

Tabulka 13: Průměrné farmakokinetické hodnoty inzulínu v séru fc · · · · · ► · · · fcfc • fcfc fcfc • · fcfcfc ·

příklad	typ inzulínu	způsob podání	dávka pg/zvíře	''MAX pU/ml	Τμαχ min	AUC pU*min/m I	absolutní BA
9 (P-2001- 25)	inzulín	IT	80	56	15	12878
9	750-1 PEG	IT	100	64	368	27954
9	750-1 PEG	IT	300	160	188	50691
9	750-1 PEG	IT	500	3474	184	255881
10 (P- 2001-001)	inzulín	IT	80	132	15	28167
10	750-1 PEG	IT	80	56	210	36818
10	750-1 PEG	IT	160	117	78	60713
IV Ref. 2001-001	inzulín	IT	20	3057	5	44388
IV Ref.	750-2 PEG	IT	20	2638	7	63190
IV Ref.	750-2 PEG	IT	30	3510	5	62746
11 (P- 2001-003)	inzulín	IT	80	89	24	22203	12,5
11	750-2 PEG	IT	80	164	73	57639	32 22*

údaj, který se významně od souboru odlišuje, nebyl odstraněn

9 ·· 9 9 · · 9 • · β ·· · 9 9 9 9 »9 99» β 9 99 99999

9999 99 99 999 99 9 ** vzhledem k intravenózní dávce 20 pg/zvíře. Po odstranění významně se odlišujícího údaje byla hodnota 22 % *** vzhledem k intravenózní dávce 30 pg/zvíře. Po odstranění významně se odlišujícího údaje se hodnota nezměnila.

Absolutní biologická dostupnost byla vypočtena následujícím způsobem:

(AUC) (dávkám) (AUCivins) (dávka)

Příklad 12: Podávání 2K PEG-inzulínu do plic (P-2002-010)

Jiný ukázkový příklad prostředku obsahujícího pegylovaný inzulín, 2K PEGinzulín, byl podáván krysám intratracheálně. 2K PEG-inzulín použitý pro tuto studii byl připraven postupem popsaným v příkladu 3. Zvířatům byla podána dávka 80 pg inzulínu na zvíře v případě nepegylované formy inzulínu. Zvířatům byla podána dávka 300 pg inzulínu na zvíře, 600 pg inzulínu na zvíře, 900 pg inzulínu na zvíře a 1200 pg inzulínu na zvíře v případě 2K PEG-inzulínu. In vivo studie na krysách byla provedena v podstatě tak, jak je popsáno výše v příkladu 8. Přesný dávkový režim a podávané dávky jsou souhrnně uvedeny v následujících tabulkách.

Tabulka 14

číslo skupiny	typ inzulínu	způsob podávání	počet zvířat/pohlaví	celková denní dávka inzulínu (pg/zvíře)	počet dnů,kdy byly podávány dávky
1	inzulín	i.t.	3	80	1
2	PEG2K-1 inzulín	i.t.	3	600	1
3	PEG2K-1 inzulín	i.t.	3	80	1
4	PEG2K-1 inzulín	i.t	3	160	1

·

9

9 9

99 9 9

5	PEG2K-1 inzulín	i.t.	3	300	1
6	PEG2K-1 inzulín	i.t.	3	900	1
7	PEG2K-1 inzulín	i.t.	3	1200	1

Tabulka 15

číslo skupiny	typ inzulínu	celková denní dávka inzulínu (pg/zvíře)	objem dávky (μΙ)	koncentrace podávaného roztoku (mg/ml)
1	inzulín	80	300	0,267
2	PEG2K-1 inzulín	600	300	2,0
3	PEG2K-1 inzulín	80	300	0,267
4	PEG2K-1 inzulín	160	300	0,533
5	PEG2K-1 inzulín	300	300	1,0
6	PEG2K-1 inzulín	900	300	3,0
7	PEG2K-1 inzulín	1200	300	4,0

Vynesení průměrných koncentrací glukózy v krvi po intratracheálním podání je ukázáno na obr. 12. Byla pozorována dobrá odpověď na velikost dávek prostředků obsahujících pegylovaný inzulín podávaných do plic (tj. vyšší dávky 2K PEG inzulínu vyvolávaly větší snížení koncentrace glukózy v krvi). Přestože časový okamžik, ve ·· 0 · · · 0 0 0 · • ·0 00 0 0000 •0 0«0 0 0 00 0 0000 00 000 000

0000 ·0 000 00 * kterém bylo na křivce dosaženo největšího potlačení koncentrace glukózy v krvi, se zdá být dosažen asi ve třech hodinách jak v případě prostředků obsahujících pegylovaný inzulín, tak v případě prostředků obsahujících nepegylovaný inzulín, profily pro pegylovaný a nepegylovaný inzulín se významně lišily, pokud se týká doby trvání potlačení glukózy v krvi. Zvláště v období šesti hodin po podání dávky byly v případě třech vyšších dávek 2K pegylovaného inzulínu (600 pg, 900 pg a 1200 pg na zvíře) hladiny glukózy v krvi potlačeny na významně nižší úroveň, než v případě inzulínu nepegylovaného. Tyto výsledky jsou další ukázkou, že prodlouženého systémového účinku je možno dosáhnout podáváním pegylovaného inzulínu do plic.

Příklad 13: Hodnocení koncentrací glukózy a inzulínu v séru po intravenózním podání 2K PEG-inzulínu u krys (P-2002-009)

Tato studie byla provedena kvůli dalšímu zkoumání aktivity inzulínu v ukázkovém prostředku, obsahujícím 2K PEG inzulín, a pro zjišťování intravenózní (i.v.) dávky pegylovaného lidského inzulínu (PEG2K-1), účinné pro snížení koncentrace glukózy v krvi na hodnotu 300 až 400 mg/litr.

Postup byl proveden podobně jak je uvedeno v protokolu popsaném v příkladu 7, za použití prostředků, skupin zvířat a dávek, které jsou souhrnně uvedeny v níže uvedených tabulkách.

Tabulka 16

číslo skupiny	typ inzulínu	způsob podávání	počet zvířat/pohlaví	celková denní dávka inzulínu (pg/zvíře)	počet dnů, kdy byly podávány dávky
1	inzulín	i.v.	2M	20	1
2	PEG2K-1 inzulín	i.v.	2M	20	1
3	PEG2K-1 inzulín	i.v.	2M	30	1
4	PEG2K-1 inzulín	i.v.	2M	40	1

• 44 «4 4 4444 · 4 4 4 4 44 44444

4444 44 44 444 44 4

5	PEG2K-1 inzulín	i.v.	2M	80	1
6	PEG2K-1 inzulín	i.v.	2M	160	1

Tabulka 17

číslo skupiny	kontrola/testovaný přípravek	celková denní dávka inzulínu (pg/zvíře)	objem dávky (Pl)	koncentrace podávaného roztoku (pg/ml)
1	inzulín	20	300	67
2	PEG2K-1 inzulín	20	300	67
3	PEG2K-1 inzulín	30	300	100
4	PEG2K-1 inzulín	40	300	133
5	PEG2K-1 inzulín	80	300	267
6	PEG2K-1 inzulín	160	300	533

Průměrné koncentrace inzulínu v séru po intravenózním podání pegylovaného inzulínu a 5K PEG inzulínu v dávkách 20 pg/zvíře (nepegylovaný inzulín) a 20, 30 a 40 pg/zvíře (2K PEG inzulín) jsou uvedeny na obr. 13. Graf průměrných koncentrací glukózy v krvi po intravenózním podání nepegylovaného inzulínu a 2K PEG inzulínu v dávkách popsaných výše, je uveden na obrázku 14.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Inzulínový prostředek pro použití v plících, vyznačující se tím, že obsahuje konjugát inzulínu kovalentně vázaný k jedné nebo více molekulám hydrofilního polymeru, který se nevyskytuje v přírodě.

2. Inzulínový prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že konjugát neobsahuje lipofilní složku.

3. Inzulínový prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že hydrofilní polymer, který se nevyskytuje v přírodě, je polyalkenglykol.

4. Inzulínový prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že hydrofilní polymer, který se nevyskytuje v přírodě, je polyethylenglykol.

5. Inzulínový prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že hydrofilní polymer, který se nevyskytuje v přírodě, je polyethylenglykol.

6. Prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že vykazuje absolutní biologickou dostupnost v plících, která je větší než u přirozeného inzulínu.

7. Prostředek podle nároku 6, vyznačující se tím, že vykazuje absolutní biologickou dostupnost v plících, která je alespoň dvakrát větší než u přirozeného inzulínu.

Prostředek podle nároku

8, vyznačující se biologickou dostupnost vyšší než 15 %.

Prostředek podle nároku 4, vyznačující se biologickou dostupnost vyšší než 30 %.

tím, že vykazuje absolutní tím, že vykazuje absolutní

9 9 9 9

999 99 9

9 9 9 9 9 • 9 9 99999

9 99 9

99 9 9 9

9 9 9 9 9

999999 99

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 • 99 9 9

9 99 90

9 0

0 0 9

10. Prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, plic, vykazuje Tmax alespoň 3krát vyšší než přírodní inzulín.

že když je podán do • ·· · · · · • · ··· · · · · • · · • ·· · · ···· ·· ·· ··· ·« ·

11. Prostředek podle nároku 10, vyznačující se tím, že když je podán do plic, vykazuje Tmax alespoň 5krát vyšší než přírodní Inzulín.

12. Prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že polyethylenglykol je na konci chráněn čepičkou.

13. Prostředek podle nároku 12, vyznačující se tím, že polyethylenglykol je na konci chráněn čepičkou s alkoxylovou skupinou.

14. Prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že polyethylenglykol je vybrán ze skupiny zahrnující lineární polyethylenglykol, větvený polyethylenglykol, vidlicovitě rozštěpený polyethylenglykol a činkovitý polyethylenglykol.

15. Prostředek podle nároku 14, v y z n a č u j I c I se tím, že polyethylenglykol obsahuje biologicky degradovatelnou vazbu.

16. Prostředek podle nároku 14, vyznačující se tím, že polyethylenglykol obsahuje řadu podjednotek (OCH₂CH₂), vybraných ze skupiny zahrnující od 2 do 300 podjednotek, od 4 do 200 podjednotek a od 10 do 100 podjednotek.

17. Prostředek podle nároku 14, vyznačující se tím, že polyethylenglykol má průměrnou nominální molekulovou hmotnost od 200 do 10 000 daltonů.

18. Prostředek podle nároku 14, vyznačující se tím, že polyethylenglykol je lineární.

19. Prostředek podle nároku 17, vyznačující se tím, že polyethylenglykol má průměrnou nominální molekulovou hmotnost od 200 do 5000 daltonů.

20. Prostředek podle nároku 17, vyznačující se tím, že polyethylenglykol má průměrnou nominální molekulovou hmotnost od 200 do 2000 daltonů.

21. Prostředek podle nároku 17, vyznačující se tím, že polyethylenglykol má průměrnou nominální molekulovou hmotnost od 200 do 1000 daltonů.

•· ·t ·· • · · · · · ♦ · · · · • ·· · · · · · · · • · · · · · · * 9 9 9999 fiQ ···♦·· 999

Uv ···· ·· «· ··· ·· ·

22. Prostředek podle nároku 4, v y z n a č u j í c í se tím, že inzulín je přírodní inzulín.

23. Prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že konjugát má čistotu vyšší než 90 %.

24. Prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že inzulín je kovalentně vázán k polyethylenglykolu na jednom nebo více svých míst, obsahujících aminoskupinu.

25. Prostředek podle nároku 24, v y z n a č u j í c í se tím, že alespoň 75 % míst B-1Phe na inzulínu je kovalentně vázaných k polyethylenglykolu.

26. Prostředek podle nároku 25, v y z n a č u j í c í se tím, že alespoň 90 % míst B-1Phe na inzulínu je kovalentně vázaných k polyethylenglykolu.

27. Prostředek podle nároku 24, v y z n a č u j í c í se tím, že obsahuje směs monomerního a dimerního konjugátu inzulínu.

28. Prostředek podle nároku 27, v y z n a č u j í c í se tím, že dále obsahuje trimerní konjugát inzulínu.

29. Prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že inzulín je kovalentně vázán k polyethylenglykolu prostřednictvím složky umístěné na konci polyethylenglykolu.

30. Prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že polyethylenglykol před svojí vazbou na inzulín obsahuje na jednom konci aktivovanou vazebnou složku, vhodnou pro kovalentní vazbu k inzulínu.

31. Prostředek podle nároku 30, v y z n a č u j í c í se tím, že aktivovaná vazebná složka je vhodná pro vazbu s reaktivními aminoskupinami inzulínu.

··

Φ φ

32. Prostředek podle nároku 31, vy z η a č u j ί c ί se tím, že aktivovaná vazebná složka obsahuje reaktivní funkční skupinu vybranou ze skupiny zahrnující aktivní estery N-hydroxysukcinimidu, aktivní uhličitany, aldehydy a acetaly.

33. Prostředek podle nároku 29, vyznačující se tím, že inzulín je kovalentně vázán k polyethylenglykolu prostřednictvím amidové vazby.

34. Prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že je ve formě aerosolu.

35. Prostředek podle nároku 4, v y z n a č u j í c í se t í m, že je ve formě roztoku nebo v suché formě.

36. Prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že dále obsahuje farmaceuticky přijatelný excipient.

37. Prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že je ve formě vysušené pomocí rozprášení.

38. Způsob podání inzulínu savčímu jedinci, kterému je zapotřebí jej dodat, vyznačující se t í m, že zahrnuje:

převedení inzulínového prostředku podle nároku 4 do formy aerosolu podání aerosolové formy inzulínového prostředku jedinci pomocí inhalace, jeho uložení v plících a absorbování z plic uvedeného jedince.

39. Způsob pro poskytnutí v podstatě neimunogenního inzulínového prostředku pro podání do plic jedince, kterému je zapotřebí jej dodat, zahrnující:

kovalentní připojení inzulínu k jedné nebo více molekulám hydrofilního polymeru, který se nevyskytuje v přírodě, čímž vznikne prostředek, obsahující konjugát inzulín-hydrofilní polymer, a podání uvedeného prostředku do plic jedince, kterému je zapotřebí jej dodat, pomocí inhalace, přičemž výsledkem tohoto způsobu podání je, že inzulín prochází plícemi a vstupuje do krevního oběhu.

Μ ··

Φ Φ

ΦΦΦΦ

Φ ♦ ·

40. Způsob podle nároku 39, vyznačující se tím který se nevyskytuje v přírodě, je polyethylenglykol.

že hydrofilní polymer,

41. Způsob pro poskytnutí inzulínového prostředku s prodlouženou dobou účinku, který je podáván do plic jedince, kterému je zapotřebí jej dodat, zahrnující:

kovalentní připojení inzulínu k jedné nebo více molekulám hydrofilního polymeru, který se nevyskytuje v přírodě, čímž vznikne prostředek, obsahující konjugát inzulín-hydrofilní polymer, a podání uvedeného prostředku do plic jedince, kterému je zapotřebí jej dodat, pomocí inhalace, přičemž výsledkem tohoto způsobu podání je (i) inzulín prochází plícemi a vstupuje do krevního oběhu, (ii) zvýšená hladina inzulínu v krvi se udrží po dobu alespoň 8 hodin po podání.

42. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, že hydrofilní polymer, který se nevyskytuje v přírodě, je polyethylenglykol.

43. Způsob podle nároku 42, vyznačující se tím, že hydrofilní polymer, který se nevyskytuje v přírodě, je polyethylenglykol.

44. Způsob podle nároku 43, vyznačující se tím, že zvýšená hladina inzulínu v krvi se udrží po dobu alespoň 10 hodin po podání.

45. Způsob podle nároku 43, vyznačující se tím, že zvýšená hladina inzulínu v krvi se udrží po dobu alespoň 12 hodin po podání.

46. Způsob podle nároku 43, vyznačující se tím, že dalším výsledkem podání je to, že hladina glukózy v krvi je snížena po dobu alespoň 10 hodin po podání.

47. Způsob podle nároku 46, vyznačující se tím, že dalším výsledkem podání je to, že hladina glukózy v krvi je snížena po dobu alespoň 12 hodin po podání.

♦ 0 00

Μ

0 0 0 ♦ 0 0 0

0 0 00000

0 0 0

48. Způsob poclle nároku 43, vy z n a č u j Ic I se 11 m, že krok podání prostředku zahrnuje podání prostředku ve formě aerosolu.

49. Způsob podle nároku 43, vyznačující se tím, že obsahuje převedení prostředku do formy aerosolu před podáním.

50. Způsob podle nároku 43, v y z n a č u j í c í se t í m, že vazebný krok obsahuje kovalentní připojení inzulínu k polyethylenglykolů místně specifickým způsobem.

51. Způsob podle nároku 43, vyznačující se tím, že vazebný krok obsahuje kovalentní připojení inzulínu k polyethylenglykolů náhodným způsobem.

52. Způsob podle nároku 43, v y z n a č u j i c i se t i m, že konjugát, když je podán do plic, je charakterizován absolutní plicní biologickou dostupností, která je vyšší než u přírodního inzulínu.

53. Způsob podle nároku 43, vy z n a č u j i c i se t i m, že vazebný krok obsahuje kovalentní připojení inzulínu k jedné nebo více molekulám polyethylenglykolů, které jsou na konci chráněny čepičkou.

54. Způsob podle nároku 43, vy z n a č u j i c i se t i m, že vazebný krok obsahuje kovalentní připojení inzulínu k jedné nebo více molekulám polyethylenglykolů, vybraného ze skupiny zahrnující lineární, větvený, vidlicovitě rozvětvený a činkovitý polyethylenglykol.

55. Způsob podle nároku 43, v y z n a č u j i c i se t i m, že konjugát neobsahuje lipofilní složku.

56. Způsob podle nároku 43, vy z n a č u j ic i se t i m, že prostředek neobsahuje lipofilní složku.

57. Způsob podle nároku 43, v y z n a č u j i c i se t i m, že vazebný krok obsahuje kovalentní připojení inzulínu k jedné nebo více molekulám polyethylenglykolů, který obsahuje biologicky degradovatelnou vazbu.

58. Způsob podle nároku 43, v y z n a č u j í c í se tím, že polyethylenglykol obsahuje řadu podjednotek (OCH2CH2), vybraných ze skupiny zahrnující od 2 do 300 podjednotek, od 4 do 200 podjednotek a od 10 do 100 podjednotek.

59. Způsob podle nároku 43, v y z n a č u j í c í se tím, že polyethylenglykol má průměrnou nominální molekulovou hmotnost od 200 do 10 000 daltonů.

60. Způsob podle nároku 43, v y z n a č u j í c í se tím, že polyethylenglykol má průměrnou nominální molekulovou hmotnost od 200 do 5000 daltonů.

61. Způsob podle nároku 43, v y z n a č u j í c í se tím, že polyethylenglykol má průměrnou nominální molekulovou hmotnost od 200 do 2000 daltonů.

62. Způsob podle nároku 43, vyznačující se tím, že polyethylenglykol má průměrnou nominální molekulovou hmotnost od 200 do 1000 daltonů.

63. Způsob podle nároku 43, v y z n a č u j í c í se tím, že připojení zahrnuje vazbu polyethylenglykolu k inzulínu na jednom nebo více jeho reaktivních míst, obsahujících aminoskupinu.

64. Způsob podle nároku 63, v y z n a č u j í c í se tím, že polyethylenglykol připojen k inzulínu na jednom nebo více jeho místech, obsahujících aminoskupinu, prostřednictvím vazby vybrané ze skupiny zahrnující amid, uretan a methylenaminovou skupinu.

65. Způsob podle nároku 63, v y z n a č u j í c í se tím, že připojení zahrnuje reakci polyethylenglykolu s reaktivní skupinou, vybranou ze skupiny zahrnující aktivní estery N-hydroxysukcinimidu, aktivní uhličitany, aldehydy a acetaly s jednou nebo více reaktivními aminovými místy na inzulínu.

66. Způsob podle nároku 43, v y z n a č u j í c í se tím, že výsledkem spojení je prostředek, kde alespoň 75 % míst B-1Phe na inzulínu je kovalentně vázaných k polyethylenglykolu.

·· ·» • · • ·· ·· ·· · • · · • ···· • ·

67. Způsob podle nároku 43, v y z n a č u j í c í se tím, že výsledkem spojení je prostředek, kde alespoň 90 % míst B-1Phe na inzulínu je kovalentně vázaných k polyethylenglykolu.

68. Způsob podle nároku 43, v y z n a č u j í c í se tím, že výsledkem spojení je prostředek obsahující směs monomerního a dimerního konjugátu inzulínu.

69. Způsob podle nároku 68, v y z n a č u j í c í se t í m, že výsledkem spojení je prostředek dále obsahující trimerní konjugát inzulínu.

70. Způsob podle nároku 43, vy z n a č u j í c í se t í m, že polyethylenglykol před svojí vazbou na inzulín obsahuje na jednom konci aktivovanou vazebnou složku, vhodnou pro kovalentní vazbu k inzulínu.

71. Způsob podle nároku 43, vyznačující se tím, že aktivovaná vazebná složka obsahuje reaktivní funkční skupinu vybranou ze skupiny zahrnující aktivní estery N-hydroxysukcinimidu, aktivní uhličitany, aldehydy a acetaly.

72. Způsob podle nároku 70, v y z n a č u j í c í se t í m, že vazebná složka má délku od 2 do 20 atomů.

73. Způsob podle nároku 43, v y z n a č u j í c í se t í m, že krok podání zahrnuje podání prostředku pomocí inhalátoru suchého prášku.

74. Způsob podle nároku 43, v y z n a č u j í c í se t í m, že krok podání zahrnuje podání prostředku pomocí inhalátoru odměřujícího inhalovanou dávku.

75. Způsob podle nároku 43, v y z n a č u j í c í se t í m, že krok podání zahrnuje podání prostředku pomocí rozprašovače.

76. Způsob podle nároku 43, vyznačující se tím, že prostředek dále obsahuje farmaceuticky přijatelný excipient.

i

99 99

77. Způsob podle nároku 43, vyznačující se tím, že výsledkem podání prostředku, obsahujícího konjugát, je dosažení během jedné hodiny po podání takové úrovně inzulínu v séru, která alespoň dvojnásobně převyšuje základní úroveň.