CN102548583B - 包含胰岛素连接物缀合物的前药 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含胰岛素连接物缀合物D-L的前药或其药用盐，其中D表示胰岛素部分；和-L为由式(I)表示的非生物活性连接物部分-L1，其中虚线表示与所述胰岛素的氨基中的一个连接形成酰胺键的连接位。本发明还涉及含有所述前药的药物组合物和它们作为药物治疗可通过胰岛素治疗的疾病或障碍的用途。

Description

包含胰岛素连接物缀合物的前药
技术领域
本发明涉及前药、包含所述前药的药物组合物和它们作为药物治疗或预防可用胰岛素治疗的疾病或障碍的用途。
背景技术
胰岛素疗法的特征在于由于治疗窗(therapeutic window)狭窄导致对将胰岛素药物释放保持在非常严格的水平的高需求，并且高胰岛素血症的不良反应可能会潜在地威胁生命。已经可商购具有满足糖尿病群体的特殊需求的不同作用分布的多种胰岛素制剂。快速作用胰岛素类似物在正要进食前给药，以在摄食后控制血糖的峰值，而长效胰岛素类似物典型地每日给药一次或者两次以提供稳定的基础胰岛素水平。
因此，明确需要新的长效胰岛素制剂，其在给药之间的整个期间内持续释放胰岛素。
WO-A 2006/003014描述了能够释放胰岛素的水凝胶，与标准每日基础胰岛素注射相比，所述水凝胶具有降低给药频率的可能性。然而，胰岛素以极快的速率释放而不能保证严格的促胰岛素控制达延长2天的时期。事实上，胰岛素以约30小时的半衰期释放，这表示必须至少每30小时给药前药以使得稳态的峰/谷比低于2。
制备胰岛素的可逆聚合物前药缀合物的概念经Shechter等人探究且在科学论文和和专利申请(例如(European Journal of Pharmaceutics andBiopharmaceutics 2008(70)，19-28和WO-A 2004/089280)中有述。胰岛素经芴基-连接物与40kDa PEG聚合物缀合。所述间隔分子的水解以约30小时的半衰期释放胰岛素，这表示必须至少每30小时给药前药以使得稳态的峰/谷比低于2。
已经就降低胰岛素给药频率作了其它尝试。Journal of Controlled Release，2005(104)，447-460描述了通过以下方式生产一周给予一次的胰岛素：首先，永久性地PEG化所述胰岛素分子，随后将所述PEG化的胰岛素微包囊在PLGA微粒中。在该情况下，通过用高分子量聚合物实体进行的永久修饰使所述胰岛素经历实质性的结构修饰。这种高分子量修饰的胰岛素可通过减少受体结合而表现出降低的效力，并且由于高浓度的所述高分子量胰岛素在皮下组织中的延时存在也可表现注射位点反应例如脂肪萎缩。此外，所述PEG化胰岛素表现出较低的分布容积，这一点在糖尿病治疗中是特别不利的。
尽管如此，胰岛素的PEG化明显用于保护所述肽在PLGA聚合物制剂中不发生衰退。PEG化用于保护肽在降解PLGA制剂中不发生酰化的作用由D.H.Na et al.，AAPS PharmSciTech 2003，4(4)Article 72针对奥曲肽(octreotide)得到证明。
蛋白质的PLGA包囊已被证明造成聚合物酯与肽或蛋白质的氨基发生反应。将所述制剂暴露于中性pH的缓冲溶液后观察到乳酸酰化产物(G.Zhu etal.，Nature Biotechnology 18(2000)52-57；A.J.Domb et al.，Pharm.Res.11(1994)865-868；A.Lucke et al.，Pharm.Res.19(2002)175-181)。
具体就胰岛素而言，聚合物制剂的有害作用已由P.G.Shao et al.，Pharm.Dev.Technol.4(1999)633-642(see also P.G.Shao et al.，Pharm.Dev.Technol.5(2000)1-9)证明。
此外，胰岛素已知容易发生与分子中存在三个二硫桥有关的副反应。例如，胰岛素可通过二硫键断裂而被分成A和B链，或者由于二硫键互换反应可形成二聚体或寡聚体。如果胰岛素分子被以任意方式强迫紧密接触，则这样的二硫键改组(disulfide reshuffling)是特别可能的。胰岛素分子的该内在不稳定性显著阻碍了长效储库(depot)开发的进展，并且妨碍其中胰岛素被以与无定形沉淀物相似的方式(该方式公知会产生由广泛的二硫键交换引起的各种降解产物)包囊的其它聚合物制剂的使用。
因此，仍存在开发长效胰岛素而不降低(通过高分子量实体的永久性连接或通过在其存在于储库期间对分子造成结构性破坏)胰岛素药效学的挑战。
发明内容
因此，本发明的目的是提供至少部分满足上述要求的含胰岛素的前药。
所述目的是通过前药或其药用盐实现的，所述前药包含胰岛素连接物缀合物D-L，其中
D表示胰岛素部分；和
-L为由式(I)表示的非生物活性连接物部分-L1，
其中虚线表示与所述胰岛素的氨基中的一个连接形成酰胺键的连接位；
X为C(R3R3a)；或N(R3)；
R1a、R3a独立地选自H、NH(R2b)、N(R2b)C(O)R4和C1-4烷基；
R1、R2、R2a、R2b、R3、R4独立地选自H和C1-4烷基，
其中L1取代有一个L2-Z并任选被进一步取代，条件是式(I)中标记有星号的氢不被取代基替代，并且其中
L2为单化学键(single chemical bond)或间隔基团(spacer)；和
Z为水凝胶。
现在出人意料地发现，本发明的前药可提供在两次给药之间历时至少2天的期间从皮下储库以结构完整形式释放胰岛素。作为进一步的优点，经释放的胰岛素的结构完整性可由使胰岛素分子的分子间接触最小化的充分水合的聚合物基质提供，并且籍由胰岛素与聚合物基质之间的自断裂前药连接物能够实现持续释放。
因此，可按比目前的长效胰岛素更低的频率给予本发明前药形式的胰岛素。进一步的优点应当为峰-谷比小，这极大地降低了低血糖发作的风险。这可帮助患者降低注射频率，同时能够维持对胰岛素的血浆水平(和随后血糖水平)的最佳控制。
本发明的“胰岛素”是指重组人胰岛素(recombinant human insulin)、甘精胰岛素注射剂(lantus)、甘精胰岛素(insulin glargine)、地特胰岛素(insulin detemir)、谷赖胰岛素(insulin glulisine)、门冬胰岛素(insulin aspart)、赖脯胰岛素(insulinlispro)、与低分子量PEG缀合的胰岛素。低分子量PEG具有小于10kDa的分子量。
将与非生物活性连接物连接的胰岛素称作“胰岛素部分”。
本申请使用的″胰岛素类似物″是指多肽，其具有在形式上可通过删除和/或交换在天然存在的胰岛素上存在的至少一个氨基酸残基和/或加入至少一个氨基酸残基而衍生自天然存在的胰岛素例如人胰岛素的结构的分子结构。所述加入的和/或交换的氨基酸残基可为可编码的氨基酸残基或者其它天然存在的残基或者纯合成的氨基酸残基。
胰岛素类似物可为这样的：其中B链的28位可从天然脯氨酸残基修饰为Asp、Lys或者lie中的一个。在另一方面，B29位的Lys修饰为Pro。此外，A21位的Asn可修饰为Ala、Gln、Glu、Gly、His、lie、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr或者Val，特别是Gly、Ala、Ser或者Thr且优选地Gly。此外，B3位的Asn可修饰为Lys或者Asp。胰岛素类似物的另外的实例为des(B30)人胰岛素；des(B30)人胰岛素类似物；其中PheB1已经删除的胰岛素类似物；其中A-链和/或B-链具有N-末端伸长的胰岛素类似物，以及其中A-链和/或B-链具有C-末端伸长的胰岛素类似物。由此，一个或者两个Arg可加入至B1位。
″desB30胰岛素″、″desB30人胰岛素″意指缺乏B30氨基酸残基的天然胰岛素或者其类似物。类似地，″desB29desB30胰岛素″或者″desB29desB30人胰岛素″是指缺乏B29和B30氨基酸残基的天然胰岛素或者其类似物。
″B1″、″A1″等是指分别在胰岛素B-链的1位(由N-末端开始计算)的氨基酸残基以及在胰岛素A-链的1位(由N-末端开始计算)的氨基酸残基。也可表示出在特定位置的氨基酸残基，例如PheB1，这表示B1位的氨基酸残基为苯丙氨酸残基。
“非生物活性连接物”是指未显示衍生自生物活性剂的药物的药理学作用的连接物。
“保护基”是指在合成过程中临时保护分子的化学官能团，从而在随后的化学反应中获得化学选择性的部分。醇的保护基为例如苯甲基和三苯甲基，胺的保护基为例如叔丁氧基羰基、9-芴基甲基氧基羰基和苯甲基，和硫醇的保护基的实例为2，4，6-三甲氧基苯甲基、苯基硫基甲基、乙酰氨基甲基、(对甲氧基苯基)甲基氧基羰基、叔丁基硫基、三苯基甲基、3-硝基-2-吡啶基硫基、4-甲基三苯甲基。
“经保护的官能团”是指被保护基保护的化学官能团。
“酰化剂”是指结构为R-(C＝O)-的部分，其在酰化反应中提供酰基并任选与离去基团连接，例如酰氯、N-羟基琥珀酰亚胺、五氟苯酚和对硝基苯酚。
“烷基”是指直链或者支链碳链。烷基碳的每个氢可被取代基替代。
“芳基”是指衍生自单环状芳族环、多环状芳族环或稠和芳族环(包括杂环状环)的任意取代基，例如苯基、噻吩基、吲哚基、萘基或吡啶基，所述取代基可任选被进一步取代。
“酰基”是指结构为R-(C＝O)-的化学官能团，其中R为烷基或芳基。
″C1-4烷基″是指具有1-4个碳原子的烷基链，例如如果存在于分子末端的烷基链：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基，或者例如当两个分子部分经烷基连接时，-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-、-C(CH3)2-。C1-4烷基碳的每个氢可被取代基替代。
″C1-6烷基″是指具有1-6个碳原子的烷基链，例如如果存在于分子末端的烷基链：C1-4烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基，或者例如当两个分子部分经烷基连接时，-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-、-C(CH3)2-。C1-6烷基碳的每个氢可被取代基替代。
因此，“C1-18烷基”是指具有1至18个碳原子的烷基链且“C8-18烷基”是指具有8至18个碳原子的烷基链。因此，“C1-50烷基”是指具有1至50个碳原子的烷基链。
“C2-50烯基”是指具有2至50个碳原子的支链或者非支链的烯基链，例如如果存在于分子末端的烯基链：-CH＝CH2、-CH＝CH-CH3、-CH2-CH＝CH2、-CH＝CH-CH2-CH3、-CH＝CH-CH＝CH2，或者例如当两个分子部分经烯基连接时，-CH＝CH-。C2-50烯基碳的每个氢可被进一步限定的取代基替代。因此，术语“烯基”涉及具有至少一个碳碳双键的碳链。优选地，可存在一个或者多个三键。
“C2-50炔基”是指具有2至50个碳原子的支链或者非支链的炔基链，例如如果存在于分子末端的炔基链：-C≡CH、-CH2-C≡CH、CH2-CH2-C≡CH、CH2-C≡C-CH3，或者例如当两个分子部分经炔基连接时，-C≡C-。C2-50炔基碳的每个氢可被进一步限定的取代基替代。因此，术语“炔基”涉及具有至少一个碳碳三键的碳链。优选地，可存在一个或者多个双键。
″C3-7环烷基″或者″C3-7环烷基环″是指具有3至7个碳原子的环状烷基链，其可具有碳碳双键且为至少部分饱和的，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、环庚基。环烷基碳的每个氢可被取代基替代。术语″C3-7环烷基″或者″C3-7环烷基环″也包括桥接二环，如降冰片烷或者降冰片烯。因此，″C3-5环烷基″是指具有3至5个碳原子的环烷基。
因此，“C3-10环烷基”是指具有3至10个碳原子的环状烷基，例如C3-7环烷基；环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基。术语“C3-10环烷基”也包括至少部分饱和的碳单环和二环。
″卤素″是指氟、氯、溴或者碘。通常优选的是卤素为氟或者氯。
″4至7元杂环基″或者″4至7元杂环″是指具有4、5、6或者7个环原子的环，其可含有至多为最大数目的双键(完全饱和、部分饱和或者不饱和的芳族或者非芳族环)，其中至少一个环原子且至多4个环原子被选自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-)、氧和氮(包括＝N(O)-)的杂原子替代且其中所述环经碳或者氮原子连接至所述分子的剩余部分。4至7元杂环的实例为氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、呋喃、噻吩、吡咯、吡咯啉、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、噁唑、噁唑啉、异噁唑、异噁唑啉、噻唑、噻唑啉、异噻唑、异噻唑啉、噻二唑、噻二唑啉、四氢呋喃、四氢噻吩、吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、噻二唑烷、环丁砜、吡喃、二氢吡喃、四氢吡喃、咪唑烷、吡啶、哒嗪、吡嗪、嘧啶、哌嗪、哌啶、吗啉、四唑、三唑、三唑烷、四唑烷、二氮杂环庚烷、氮杂或者高哌嗪。
″9至11元杂二环基″或者″9至11元杂二环″是指具有9至11个环原子的两个环的杂环系统，其中至少一个环原子被两个环共享且所述杂环系统可含有至多为最大数目的双键(完全饱和、部分饱和或者不饱和的芳族或者非芳族环)，其中至少一个环原子且至多6个环原子被选自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-)、氧和氮(包括＝N(O)-)的杂原子替代且其中所述环经碳或者氮原子连接至分子的剩余部分。9至11元杂二环的实例为吲哚、二氢吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并噁唑、苯并异噁唑、苯并噻唑、苯并异噻唑、苯并咪唑、苯并咪唑啉、喹啉、喹唑啉、二氢喹唑啉、喹啉、二氢喹啉、四氢喹啉、十氢喹啉、异喹啉、十氢异喹啉、四氢异喹啉、二氢异喹啉、苯并氮杂嘌呤或者蝶啶。术语“9至11元杂二环”也包括两个环的螺结构，如1，4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷，或者桥接杂环结构，如8-氮杂-二环[3.2.1]辛烷。
在包含式(I)化合物的胰岛素前药含有一个或多个酸性基团或碱性基团的情况下，本发明也包括它们相应的药用或者毒理学可接受的盐，特别是它们的可药用盐。因此，根据本发明，包含式(I)化合物的含有酸性基团的胰岛素前药可作为例如碱金属盐、碱土金属盐或铵盐使用。所述盐更确切的实例包括钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或与氨或有机胺例如乙基胺、乙醇胺、三乙醇胺或氨基酸形成的盐。根据本发明，包含式(I)化合物的含有一个或多个碱性基团(即可被质子化的基团)的胰岛素前药可按它们与无机酸或有机酸的加成盐形式使用。适当酸的实例包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、草酸、乙酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、甲酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富马酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯基丙酸、葡萄糖酸、抗坏血酸、异烟酸、枸橼酸、己二酸和本领域技术人员已知的其它酸。如果包含式(I)化合物的胰岛素前药在分子中同时含有酸性基团和碱性基团，则本发明除上述盐形式外还包括内盐或内铵盐(betaine)(两性离子(zwitterion))。包含式(I)的胰岛素前药的各自盐可通过本领域技术人员已知的惯常方法获得，所述方法为例如在溶剂或分散剂中使这些化合物与有机酸或无机酸或无机碱或有机碱接触，或与其它盐进行阴离子交换或阳离子交换。本发明还包括包含式(I)化合物的胰岛素前药的所有盐，所述盐由于低的生理学相容性不适于直接用在药物中，但可例如用作化学反应的中间体或用于制备药用盐。
为了提高药物例如胰岛素的体内物理化学性质或药代动力学性质，所述药物可与载体缀合。如果所述药物与载体和/或连接物暂时连接，则所述系统通常被称作载体连接的前药。根据IUPAC(如http://www.chem.qmul.ac.uk/ iupac.medchem所示，2009年7月22日可访问)提供的定义，载体连接的前药为以下前药，所述前药含有给定活性物质与暂时载体基团的临时连接物，所述暂时载体基团产生提高的物理化学性质或药代动力学性质并且在体内可被容易地除去(通常通过水解性断裂)。
在所述载体连接的前药中使用的连接物为暂时的，意味着它们在生理条件下(pH 7.4为的水性缓冲液，37℃)为非酶水解性可降解的(non-enzymaticallyhydrolytically degradable)(可断裂的)，半衰期范围为例如1小时-3个月。
适当的载体为聚合物，其可与连接物直接缀合或通过非可断裂间隔基团与连接物缀合。术语“胰岛素水凝胶前药”是指载体为水凝胶的胰岛素的载体连接的前药。术语“水凝胶前药”和“水凝胶-连接的前药”是指与水凝胶暂时连接的生物活性剂的前药，这两个术语可同义使用。
可将“水凝胶”定义为能够吸收大量水的三维、亲水性或两性聚合网状结构。所述网状结构由均聚物或共聚物构成，并且由于存在共价化学交联或物理(离子性、疏水性相互作用、缠结)交联而为不溶性的。所述交联提供网状结构和物理完整性。水凝胶表现出与水的热力学相容性，这使它们在水性介质中溶胀。所述网状结构的链按存在孔隙的方式连接，并且这些孔隙中的大部分的尺寸在1nm至1000nm之间。
药物的“游离形式”是指所述未经修饰的药理学活性形式的药物，例如从聚合物缀合物中释放之后。
术语″药物″、″生物活性分子″、″生物活性部分″、″生物活性剂″、″活性剂″等是指可影响生物有机体任何物理或生物化学性质的任意物质，所述生物有机体包括但不限于病毒、细菌、真菌、植物、动物和人。具体地，本申请使用的生物活性分子包括预期用于在人或其它动物中诊断、治疗、缓解、处置或预防疾病的任意物质，或者提高人或动物身体或心理健康的任意物质。具体地，术语″药物″、″生物活性分子″、″生物活性部分″、″生物活性剂″、″活性剂″等是指胰岛素。
本申请使用的胰岛素的″治疗有效量″是指足以治疗、缓解或部分阻止给定疾病及其并发症临床表现的量。将足以完成该目标的量定义为″治疗有效量″。用于每种目的的有效量依赖于疾病或损害的严重程度以及受试者的体重和一般状态。应当理解的是，可通过以下方式使用常规实验确定合适剂量：构建数值矩阵(matrix of value)并测试所述矩阵中的不同点，该方式在训练有素的医师所掌握的常规技术范围之内。
“稳定的”和“稳定性”是指在所指示的储存时间内，所述水凝胶缀合物保持为缀合物，不会很大程度水解并且表现出可接受的与胰岛素有关的杂质分布。含有小于5％游离形式药物的组合物被认为是稳定的。
术语“药用的”是指经管理机构例如EMEA(欧洲)和/或FDA(美国)和/或任何其它国家管理机构批准，在动物优选人中使用。
″药物组合物″或“组合物”是指一种或多种活性成分和一种或多种惰性成分以及由以下方式直接或间接得到的任意产物：所述成分中的任意两种或多种的组合(combination)、复合(complexation)或聚集(aggregation)；所述成分中的一种或多种的解离，或；所述成分中的一种或多种的其它类型的反应或相互作用。因此，本发明的药物组合物涵盖通过本发明化合物与药用赋形剂(药用载体)混合制备的任意组合物。
“干燥组合物”是指以置于容器中的干燥形式提供的胰岛素水凝胶前药组合物。用于干燥的适当方法为喷雾干燥和冻干(冷冻干燥)。胰岛素水凝胶前药的这种干燥组合物具有最高10％的残余含水量，优选小于5％和更优选小于2％(根据卡尔-费歇尔确定)。优选的干燥方法为冻干。“冻干的组合物”是指先将胰岛素水凝胶聚合物前药组合物冷冻，随后籍由减压使其经历减水(water reduction)。该术语并不排除在将所述组合物填装在最终容器之前在制备过程中发生的额外干燥步骤。
“冻干”(冷冻干燥)为脱水过程，特征为使组合物冷冻，然后降低环境压力，并且任选加热以使所述组合物中的冷冻水直接从固相升华为气体。通常，通过凝华收集升华水。
“重建(Reconstitution)”是指加入液体以恢复至组合物的初始形式。
“重建溶液”是指用于在给予至有此需要的患者之前用于重建胰岛素水凝胶前药的干燥组合物的液体。
“容器”是指胰岛素水凝胶前药组合物装在其中并可在重建前一直储存的任意容器。
“缓冲物(Buffer)”或“缓冲剂(buffering agent)”是指将pH维持在所期望范围内的化合物。生理耐受的缓冲物为例如磷酸钠、琥珀酸盐、组氨酸、碳酸氢盐、枸橼酸盐和乙酸盐、硫酸盐、硝酸盐、盐酸盐(chloride)、丙酮酸盐。也可使用抗酸剂(Antacid)例如Mg(OH)2或ZnCO3。可调整缓冲能力以与对pH稳定性最敏感的条件相匹配。
“赋形剂”是指与治疗剂一起给予的化合物，例如缓冲剂、等渗调节剂、防腐剂、稳定剂、抗吸附剂、氧化保护剂或其它助剂。然而，在一些情况下，一种赋形剂可具有双重或三重功能。
″冻干保护剂(lypprotectant)″为当与重要蛋白结合时显著预防或降低所述蛋白经一般干燥时并且尤其是在冻干和随后的储存过程中的化学和/或物理不稳定性的分子。冻干保护剂的实例包括糖例如蔗糖或海藻糖；氨基酸例如精氨酸、甘氨酸、谷氨酸或组氨酸；甲基胺例如甜菜碱；溶致性盐(lyotropic salt)例如硫酸镁；多元醇例如三羟羟基或更高羟基的糖醇，例如甘油(glycerin)、赤藓醇、丙三醇(glycerol)、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇；乙二醇；丙二醇；聚乙二醇；Pluronics；羟基烷基淀粉例如羟基乙基淀粉(HES)和它们的组合。
“表面活性剂”是指降低流体表面张力的润湿剂。
“等渗调节剂”是指使疼痛最小化的化合物，所述疼痛是由注射储库的渗透压差导致的细胞损伤引起的。
术语“稳定剂”是指用于稳定聚合物前药的化合物。通过以下方式实现稳定作用：增强蛋白稳定力、使变性状态脱稳定化或赋形剂与所述蛋白直接结合。
“抗吸附剂”是指用于涂覆或竞争性吸附在组合物容器的内表面的主要为离子性或非-离子性的表面活性剂或其它蛋白或可溶性聚合物。所选择的赋形剂浓度和类型依赖于待避免的作用，但通常在刚高于CMC值的界面形成一单层表面活性剂。
“氧化保护剂”是指抗氧化剂例如抗坏血酸、Ectoine(四氢甲基嘧啶羧酸)、谷胱甘肽、甲硫氨酸、单硫代丙三醇、桑色素(morin)、聚乙烯亚胺(PEI)、棓酸丙酯、维生素E、螯合剂例如枸橼酸、EDTA、六磷酸盐或巯基乙酸。
“抗菌剂”是指杀死或抑制微生物生长和/或摧毁病毒的化学物质，所述微生物为例如细菌、真菌、酵母菌、原生动物。
“将容器密封”是指将所述容器按使其密闭、不允许内外气体交换和保持内容物无菌的方式封闭。
术语“试剂”或“前体”是指在得到本发明前药的组装过程(assemblyprocess)中使用的中间体或起始物质。
术语“化学官能团”是指羧酸及活化衍生物、氨基、马来酰亚胺、巯基和衍生物、磺酸和衍生物、碳酸酯和衍生物、氨基甲酸酯和衍生物、羟基、醛、酮、肼、异氰酸酯、异硫氰酸酯、磷酸和衍生物、膦酸和衍生物、卤代乙酰基、烷基卤化物、丙烯酰基和其它α-β不饱和迈克尔受体、芳基化剂如芳基氟化物、羟基胺、二硫化物如吡啶基二硫化物、乙烯基砜、乙烯基酮、重氮烷、重氮乙酰基化合物、环氧乙烷和氮丙啶。
如果化学官能团与另一种化学官能团偶联，所得的化学结构被称作“连接物”。例如，胺基团与羧基反应得到酰胺连接物。
“反应性官能团”为骨架部分的化学官能团，其与高度支化部分(hyperbranched moiety)连接。
“官能团”为用于“反应性官能团”、“可降解的互连官能团(degradableinterconnected functional group)”或“缀合物官能团”的总称。
“可降解的互连官能团”为包含生物可降解键的连接物，其中所述键的一侧与间隔基团部分连接(间隔基团部分与骨架部分连接)，所述键的另一侧与交联部分连接。术语“可降解的互连官能团”、“生物可降解的互连官能团”、“互连的生物可降解性官能团”和“互连官能团”同义使用。
术语“封端基(blocking group)”或“封端基团(capping group)”同义使用并且是指与反应性官能团不可逆连接并使它们不能与例如化学官能团反应的部分。
术语“保护基”或“保护基”是指与反应性官能团可逆性连接并使它们不能与例如其它化学官能团反应的部分。
术语“可互连的官能团”是指参予自由基聚合反应并且为交联剂或骨架试剂的部分的化学官能团。
术语“可聚合官能团”是指参予连接型聚合反应(ligation-typepolymerization reaction)并且为交联试剂和骨架试剂的部分的化学官能团。
骨架部分可包含间隔基团部分，所述间隔基团部分的一端与所述骨架部分连接，另一侧与交联部分连接。
术语“衍生物”是指适当取代有保护基的化学官能团和/或活化基团的化学官能团或是指相应化学官能团的本领域技术人员已知的活化形式。例如，羧基的活化形式包括但不限于活性酯例如琥珀酰亚氨基酯、苯并三唑基酯(benzotriazyl ester)、硝基苯基酯、五氟苯基酯、氮杂苯并三唑基酯、酰基卤化物、混合或对称酸酐或酰基咪唑。
术语“非酶可断裂的连接物”是指在无酶活性的生理条件下为水解可断裂的连接物。
“非生物活性连接物”是指未显示药物(D-H)的药理学作用(源于生物活性部分)的连接物。
术语“间隔基团”、“间隔基”、“间隔基团分子”和“间隔基团部分”互换使用，并且如果是用于描述本发明水凝胶载体中存在的一部分，其是指适于连接两个部分的任意部分，例如C1-50烷基、C2-50烯基或C2-50炔基，该片段任选被一个或多个选自下面的基团间断：-NH-、-N(C1-4烷基)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)N(C1-4烷基)-、-O-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、4-7元杂环基、苯基或萘基。
术语“终端(terminal)”、“末端(terminus)”或“远端(distal end)”是指官能团或连接物在分子或部分内的位置，其中所述官能团可为化学官能团，所述连接物可为可降解连接物或永久连接物，特征在于位于两个部分之间的连接物的附近或位于两个部分之间的连接物内，或者位于低聚物链或多聚物链(polymeric chain)的端部。
短语“结合形式(in bound form)”或“部分”是指为大分子的部分的亚结构。短语“结合形式”用于通过命名或列举试剂、起始物质或假定的起始物质简化对部分的提及，并且通过“结合形式”是指在试剂或起始物质中存在的例如一个或多个氢基或一个或多个活化基团或保护基不存在于所述部分中。
应当理解的是，包含聚合部分的所有试剂和部分是指已知就分子量、链长度或聚合度或官能团的数目而言表现出变化性的大分子实体。因此，针对骨架试剂、骨架部分、交联试剂和交联物部分所显示的结构仅为代表性实例。
试剂或部分可为直链或支链的。如果所述试剂或部分具有两个终端基团，其被称作直链试剂或基团。如果所述试剂或部分具有多于两个的终端基团，则认为其是支链的或多官能试剂或部分。
术语“聚(乙二醇)基的聚合链”或“PEG基的链”是指低聚-或多聚分子链。
优选地，所述聚(乙二醇)基的聚合链与支化核(branching core)连接，其为直链聚(乙二醇)，所述链的一个末端与支化核连接，另一端与高度支化的树枝状部分连接。应当理解的是，PEG基的链可被任选取代有杂原子和化学官能团的烷基或芳基封端(teminate)或中断(interrupt)。
如果就交联试剂使用术语“聚(乙二醇)基的聚合链”，其是指含有至少20wt％乙二醇部分的交联物部分或链。
优选地，在式(I)中，R2被L2-Z替代。
优选地，在式(I)中，R1被L2-Z替代。
优选地，在式(I)中，X为N(R3)。
优选地，在式(I)中，X为C(R3R3a)，和R3a为N(R2b)C(O)R4。
优选地，在式(I)中，X为C(R3R3a)，和R3a被L2-Z替代。
优选地，X为C(R3R3a)，R3a为N(R2b)-L2-Z。
本发明的优选前药包含胰岛素连接物缀合物D-L，其中式(I)的L1由式(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Id)表示：
其中R1、R1a、R2、R2a、R2b、R3、R4、L2、Z具有本申请所示的含义，并且其中L1任选被进一步取代，条件是式(Ia)-(Id)中标记有星号的氢不被取代基替代。
优选地，L1不被进一步取代(除必备取代基L2-Z之外)。
优选地，所述胰岛素部分通过氮NαA1或通过胰岛素部分的赖氨酸侧链的氮与L1连接。
优选地，所述胰岛素部分为重组人胰岛素。
如例如式(Ia)-(Id)中所示，一个氢被基团L2-Z替代。
大体上，L2可在式(I)中除被标记星号的氢替代的位置之外的任意位置与L1连接。优选地，由R1、R1a、R2、R2a、R2b、R3、R3a、R4直接给出的氢之一或C1-4烷基的氢或其它基团的氢被L2-Z替代。
此外，L1可任选被进一步取代。大体上，只要断裂原理未受影响则可使用任意取代基。然而，优选的是L1未被进一步取代。
优选地，一个或多个其它任选取代基独立地选自卤素；CN；COOR9；OR9；C(O)R9；C(O)N(R9R9a)；S(O)2N(R9R9a)；S(O)N(R9R9a)；S(O)2R9；S(O)R9；N(R9)S(O)2N(R9aR9b)；SR9；N(R9R9a)；NO2；OC(O)R9；N(R9)C(O)R9a；N(R9)S(O)2R9a；N(R9)S(O)R9a；N(R9)C(O)OR9a；N(R9)C(O)N(R9aR9b)；OC(O)N(R9R9a)；T；C1-50烷基；C2-50烯基；或C2-50炔基，其中T；C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选取代有一个或多个相同或不同的R10，并且其中C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选被一个或多个选自以下的基团中断：T，-C(O)O-；-O-；-C(O)-；-C(O)N(R11)-；-S(O)2N(R11)-；-S(O)N(R11)-；-S(O)2-；-S(O)-；-N(R11)S(O)2N(R11a)-；-S-；-N(R11)-；-OC(O)R11；-N(R11)C(O)-；-N(R11)S(O)2-；-N(R11)S(O)-；-N(R11)C(O)O-；-N(R11)C(O)N(R11a)-；and-OC(O)N(R11R11a)；
R9、R9a、R9b独立地选自H；T；和C1-50烷基；C2-50烯基；或C2-50炔基，其中T；C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选取代有一个或多个相同或不同的R10，并且其中C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选被一个或多个选自以下的基团中断：T、-C(O)O-；-O-；-C(O)-；-C(O)N(R11)-；-S(O)2N(R11)-；-S(O)N(R11)-；-S(O)2-；-S(O)-；-N(R11)S(O)2N(R11a)-；-S-；-N(R11)-；-OC(O)R11；-N(R11)C(O)-；-N(R11)S(O)2-；-N(R11)S(O)-；-N(R11)C(O)O-；-N(R11)C(O)N(R11a)-；和-OC(O)N(R11R11a)；
T选自：苯基；萘基；茚基；茚满基；四氢萘基；C3-10环烷基；4-7元杂环基；或9-11元杂二环基，其中T任选取代有一个或多个相同或不同的R10；
R10为卤素；CN；氧代(＝O)；COOR12；OR12；C(O)R12；C(O)N(R12R12a)；S(O)2N(R12R12a)；S(O)N(R12R12a)；S(O)2R12；S(O)R12；N(R12)S(O)2N(R12aR12b)；SR12；N(R12R12a)；NO2；OC(O)R12；N(R12)C(O)R12a；N(R12)S(O)2R12a；N(R12)S(O)R12a；N(R12)C(O)OR12a；N(R12)C(O)N(R12aR12b)；OC(O)N(R12R12a)；或C1-6烷基，其中C1-6烷基任选取代有一个或多个相同或不同的卤素；
R11、R11a、R12、R12a、R12b独立地选自H；或C1-6烷基，其中C1-6烷基任选取代有一个或多个相同或不同的卤素。
术语“中断”是指在两个碳之间或在碳链末端在碳和氢之间插入一个基团。
L2为单化学键或间隔基团。在L2为间隔基团的情况下，其优选被定义为上面定义的一个或多个任选取代基，条件是L2取代有Z。
因此，当L2不是单化学键时，L2-Z为COOR9；OR9；C(O)R9；C(O)N(R9R9a)；S(O)2N(R9R9a)；S(O)N(R9R9a)；S(O)2R9；S(O)R9；N(R9)S(O)2N(R9aR9b)；SR9；N(R9R9a)；OC(O)R9；N(R9)C(O)R9a；N(R9)S(O)2R9a；N(R9)S(O)R9a；N(R9)C(O)OR9a；N(R9)C(O)N(R9aR9b)；OC(O)N(R9R9a)；T；C1-50烷基；C2-50烯基；或C2-50炔基，其中T；C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选取代有一个或多个相同或不同的R10，其中C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选被一个或多个选自以下的基团中断：-T-、-C(O)O-；-O-；-C(O)-；-C(O)N(R11)-；-S(O)2N(R11)-；-S(O)N(R11)-；-S(O)2-；-S(O)-；-N(R11)S(O)2N(R11a)-；-S-；-N(R11)-；-OC(O)R11；-N(R11)C(O)-；-N(R11)S(O)2-；-N(R11)S(O)-；-N(R11)C(O)O-；-N(R11)C(O)N(R11a)-；和-OC(O)N(R11R11a)；
R9、R9a、R9b独立地选自：H；Z；T；和C1-50烷基；C2-50烯基；或C2-50炔基，其中T；C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选取代有一个或多个相同或不同的R10，其中C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选被一个或多个选自以下的基团中断：T、-C(O)O-；-O-；-C(O)-；-C(O)N(R11)-；-S(O)2N(R11)-；-S(O)N(R11)-；-S(O)2-；-S(O)-；-N(R11)S(O)2N(R11a)-；-S-；-N(R11)-；-OC(O)R11；-N(R11)C(O)-；-N(R11)S(O)2-；-N(R11)S(O)-；-N(R11)C(O)O-；-N(R11)C(O)N(R11a)-；和-OC(O)N(R11R11a)；
T选自苯基；萘基；茚基；茚满基；四氢萘基；C3-10环烷基；4-7元杂环基；或9-11元杂二环基，其中t任选取代有一个或多个相同或不同的R10；
R10为Z；卤素；CN；氧代(＝O)；COOR12；OR12；C(O)R12；C(O)N(R12R12a)；S(O)2N(R12R12a)；S(O)N(R12R12a)；S(O)2R12；S(O)R12；N(R12)S(O)2N(R12aR12b)；SR12；N(R12R12a)；NO2；OC(O)R12；N(R12)C(O)R12a；N(R12)S(O)2R12a；N(R12)S(O)R12a；N(R12)C(O)OR12a；N(R12)C(O)N(R12aR12b)；OC(O)N(R12R12a)；or C1-6烷基，其中C1-6烷基任选取代有一个或多个相同或不同的卤素；
R11、R11a、R12、R12a、R12b独立地选自：H；Z；或C1-6烷基，其中C1-6烷基任选取代有一个或多个相同或不同的卤素；
条件是R9、R9a、R9b、R10、R11、R11a、R12、R12a、R12b中仅一个为Z。
更优选地，L2为C1-20烷基链，其任选被一个或多个独立选自以下的基团中断：-O-；和C(O)N(R3aa)；任选取代有一个或多个独立选自以下的基团OH；和C(O)N(R3aaR3aaa)；并且其中R3aa、R3aaa独立地选自H；和C1-4烷基。
优选地，L2具有14g/mol-750g/mol范围内的分子量。
优选地，L2通过选自以下的终端基团与Z连接：
在L2具有所述终端基团的情况下，进一步优选的是L2具有14g/mol-500g/mol范围内的分子量(所述终端基团不算在内)。
优选地，连接物和水凝胶Z之间形成的共价连接为永久性键。
优选地，所述水凝胶Z为生物可降解的聚乙二醇(PEG)基的水不溶性水凝胶。本申请的术语“PEG基的”应被理解为，以水凝胶的总重量计，PEG链在所述水凝胶中的质量比率为至少10wt％，优选至少25％。剩余部分可由其它间隔基团和/或低聚物或多聚物例如低-或多赖氨酸构成。
此外，术语“水不溶性”是指来自所述水凝胶的可溶胀性三维交联分子网状结构。如果将水凝胶悬浮在大量过剩的水中或生理学渗透压浓度的水性缓冲液中其可吸收大量水，例如以重量/重量计吸收高至10-倍的水(所述水凝胶因此为可溶胀性的)，并且除去过量水后保持凝胶的物理稳定性和形状。所述形状可为任意几何形状，并且应当理解的是，这样的单独水凝胶对象被认为是组成组分的单一分子，其中每种组分与每种其它组分通过化学键彼此连接。
根据本发明，所述水凝胶可由通过水解可降解键互连的骨架部分构成。
优选地，L2与骨架部分连接。
优选地，所述骨架部分具有范围为1kDa至20kDa，更优选1kDa至15kDa和甚至更优选1kDa至10kDa的分子量。所述骨架部分也优选为PEG基的(包含一个或多个PEG链)。
在本发明携带药物-连接物缀合物的水凝胶中，骨架部分的特征为多个官能团(包括互连的生物可降解的官能团)和水凝胶-连接的药物-连接物缀合物和任选的封端基团。这意味着骨架部分的特征为多个水凝胶-连接的药物-连接物缀合物；官能团，包括生物可降解的互连官能团；和任选的封端基团。优选地，互连的生物可降解官能团和药物-连接物缀合物和封端基团的总和为16-128，优选20-100，更优选24-80和最优选30-60。
优选地，骨架部分中互连官能团和水凝胶-连接的药物-连接物缀合物和封端基团的总和被从支化核延伸的PEG基的聚合链数目均分。例如，如果互连官能团和水凝胶-连接的药物-连接物缀合物和封端基团有32个，则从所述核延伸出的四条PEG基的聚合链中的每一条提供八个基团，优选籍由与每条PEG基的聚合链的末端连接的树枝状部分。可选择地，从所述核延伸出的八条PEG基的聚合链中的每一条提供四个基团，或者十六条PEG基的聚合链中的每一条提供两个基团。如果从支化核延伸出的PEG基的聚合链数目不允许平均分配，优选的是使每条PEG基的聚合链的互连官能团和水凝胶-连接的药物-连接物缀合物和封端基团的总和的平均数目的偏差保持最小。
在本发明所述载体连接的前药中，期望的是在骨架部分已释放显著量之前(＜10％)已发生几乎所有药物释放(＞90％)。这可通过调整本发明载体连接的前药的半衰期对水凝胶的降解动力学来实现。
优先地，骨架部分的特征在于具有支化核，从该核开始延伸出至少三条PEG基的聚合链。因此，在本发明的优选方面中，所述骨架试剂包含支化核，从所述核开始延伸出至少三条PEG基的聚合链。所述支化核可由结合形式的多元-或低元醇构成，优选季戊四醇、三季戊四醇、三羟甲基丙烷(hexaglycerine)、蔗糖、山梨糖醇、果糖、甘露糖醇、葡萄糖、纤维素、直链淀粉，淀粉、羟基烷基淀粉、聚乙烯醇、葡聚糖、透明质酸(hyualuronan)，或者所述支化核可由结合形式的多元-或低元胺(例如鸟氨酸、二氨基丁酸、三赖氨酸、四赖氨酸、五赖氨酸、六赖氨酸、七赖氨酸、八赖氨酸、九赖氨酸、十赖氨酸、十一赖氨酸、十二赖氨酸、十三赖氨酸、十四赖氨酸、十五赖氨酸或低聚赖氨酸)、聚乙烯亚胺、聚乙烯胺构成。
优选地，所述支化核延伸出三至十六条，更优选四至八条PEG基的聚合链。优选地的支化核可包括季戊四醇、鸟氨酸、二氨基丁酸、三赖氨酸、四赖氨酸、五赖氨酸、六赖氨酸、七赖氨酸或低聚赖氨酸、低分子量PEI、三羟甲基丙烷、三季戊四醇结合形式。优选地，所述支化核延伸出三至十六条，更优选四至八条PEG基的聚合链。优选地，PEG基的聚合链为直链聚(乙二醇)，所述链的一端与支化核连接，另一端与高度支化的树枝状部分连接。应当理解的是，PEG基的聚合链可被任选取代有杂原子和化学官能团的烷基或芳基封端或中断。
优选地，PEG基的聚合链为经适当取代的聚乙二醇衍生物(PEG基的)。
对应于从骨架部分中含有的支化核延伸出的PEG基的聚合链的优选结构为多臂(multi-arm)PEG衍生物，如例如美国JenKem Technology产品列表(通过2009年7月28日从www.jenkemusa.com下载获得)中所详述、4臂-PEG衍生物(季戊四醇核)、8臂-PEG衍生物(三羟甲基丙烷核)和8臂-PEG衍生物(三季戊四醇核)。最优选的为4臂PEG胺(季戊四醇核)和4臂PEG羧基(季戊四醇核)、8臂PEG胺(三羟甲基丙烷核)、8臂PEG羧基(三羟甲基丙烷核)、8臂PEG胺(三季戊四醇核)和8臂PEG羧基(三季戊四醇核)。针对骨架部分中所述多臂PEG-衍生物的优选分子量为1kDa至20kDa，更优选为1kDa至15kDa，甚至更优选为1kDa至10kDa。
应当理解的是，上面提及到的多臂分子的终端胺基团以结合形式存在于骨架部分中，从而为骨架部分提供额外的互连官能团和反应性官能团。
优选的是，骨架部分中互连官能团和反应性官能团的总和被从所述支化核延伸的PEG基的聚合链数目均分。如果从所述支化核延伸出的PEG基的聚合链的数目不允许平均分配，优选的是使每条PEG基的聚合链中互连官能团和反应性官能团的总和的平均数目偏差保持最小。
更优选地，骨架部分中互连官能团和反应性官能团的总和被从支化核延伸出的PEG基的聚合链数目均分。例如，如果互连官能团和反应性官能团有32个，则从所述核延伸出的四条PEG基的聚合链中的每一条提供八个基团，优选籍由树枝状部分与每条PEG基的聚合链的末端相连。可选择地，从所述核延伸出的八条PEG基的聚合链的每一条提供四个基团，或者十六条PEG基的聚合链的每一条提供两个基团。
树枝状部分可提供所述额外官能团。优选地，每个树枝状部分具有范围为0.4kDa至4kDa的分子量，更优选为0.4kDa至2kDa。优选地，每个树枝状部分具有至少3个分支和至少4个反应性官能团，至多63个分支和64个反应性官能团，优选至少7个分支和至少8个反应性官能团，并且至多31个分支和32个反应性官能团。
所述树枝状部分的实例包括结合形式的三赖氨酸、四赖氨酸、五赖氨酸、六赖氨酸、七赖氨酸、八赖氨酸、九赖氨酸、十赖氨酸、十一赖氨酸、十二赖氨酸、十三赖氨酸、十四赖氨酸、十五赖氨酸、十六赖氨酸，十七赖氨酸、十八赖氨酸、十九赖氨酸。所述优选的树枝状部分的实例包括结合形式的三赖氨酸、四赖氨酸、五赖氨酸、六赖氨酸、七赖氨酸，最优选为结合形式的三赖氨酸、五赖氨酸或七赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸。
最优选地，本发明的水凝胶载体的特征在于所述骨架部分具有式C(A-Hyp)4的季碳，其中每个A独立地为聚(乙二醇)基的聚合链，其终端通过永久共价键与所述季碳连接，PEG基的聚合链的远端与树枝状部分Hyp共价连接，每个树枝状部分Hyp具有至少四个表示互连官能团和反应性官能团的官能团。
优选地，每个A独立地选自式-(CH2)n1(OCH2CH2)nX-，其中n1为1或2；n为5-50的整数；和X为与A和Hyp共价连接的化学官能团。
优选地，A和Hyp通过酰胺连接键共价连接。
优选地，树枝状部分Hyp为高度支化多肽。优选地，所述高度支化的多肽包括结合形式的赖氨酸。优选地，每个树枝状部分Hyp具有范围为0.4kDa至4kDa的分子量。应当理解的是，骨架部分C(A-Hyp)4可包括相同或不同的树枝状部分Hyp，并且每个Hyp可独立选择。每个部分Hyp包括5-32个赖氨酸，优选至少7个赖氨酸，即每个部分Hyp由5-32个结合形式的赖氨酸构成，优选至少7个结合形式的赖氨酸。最优选地，Hyp由七赖氨酸基构成。
骨架试剂的可聚合官能团(更具体地为Hyp)与聚乙二醇基的交联试剂的可聚合官能团的反应得到永久性酰胺键。
优选地，C(A-Hyp)4具有范围为1kDa至20kDa的分子量，更优选1kDa至15kDa，和甚至更优选1kDa至10kDa。
一种优选的骨架部分如下所示，虚线表示与交联物部分互连的生物可降解的连接键，n为5-50的整数：
本发明水凝胶的生物可降解性是通过引入水解可降解键实现的。
术语“水解可降解的”、“生物可降解的”或“水解可断裂的”、“自动可断裂的(auto-cleavable)”或“自断裂(self-cleavage)”、“自身可断裂的(self-cleavable)”、“暂时的(transient)”或“临时的(temporary)”在本发明的上下文中是指在生理条件(pH 7.4的水性缓冲液，37℃)下非酶水解可降解性的键和连接键，其半衰期为一小时至三个月，所述键和连接键包括但不限于乌头键(aconityl)、缩醛键(acetal)、酰胺键(amide)、羧酸酐键(carboxylic anhydride)、酯键(ester)、亚胺键(imine)、腙键(hydrazone)、马来酰胺酸酰胺键(maleamic acid amide)、原酸酯键(ortho ester)、磷酰胺键(phosphamide)、磷酰酯键(phosphoester)、磷酰基甲硅烷基酯键(phosphosilyl ester)、甲硅烷基酯键(silyl ester)、磺酸酯键(sulfonic ester)、芳族氨基甲酸酯键(aromatic carbamate)、它们的组合等。
如果在本发明的水凝胶中作为可降解的互连官能团存在，优选的生物可降解的连接键为羧酸酯键、碳酸酯键、磷酰酯键和磺酸酯键，最优选的为羧酸酯键或碳酸酯键。
永久性连接键在生理条件(pH 7.4的水性缓冲液，37℃)下为非酶水解可降解的，半衰期为六个月或更长，所述键为例如酰胺键。
为了向本发明的水凝胶载体中引入水解可断裂的键，骨架部分可籍由生物可降解的键彼此直接连接。
在一个实施方案中，生物可降解的水凝胶载体的骨架部分可直接连接在一起，即无交联物部分。所述生物可降解的水凝胶的两个骨架部分的高度支化的树枝状部分可通过互连官能团直接连接，所述互连官能团将两个高度支化的树枝状部分连接在一起。可选择地，两个不同骨架部分的两个高度支化的树枝状部分可通过两个间隔基团部分互连，所述间隔基团部分与骨架部分连接，另一侧与被互连官能团分开的交联部分连接。
可选择地，骨架部分可通过交联物部分连接在一起，每个交联物部分被至少两个水解可降解键封端。除了终端可降解键，所述交联物部分可含有其它生物可降解的键。因此，与骨架部分连接的交联物部分的每一端包含水解可降解的键，并且额外的生物可降解的键可任选存在于交联物部分中。
优选地，生物可降解的水凝胶载体由通过水解可降解键互连的骨架部分构成，并且所述骨架部分通过交联物部分连接在一起。
所述生物可降解的水凝胶可含有一种或多种不同类型的交联物部分，优选含有一种。所述交联物部分可为直链或支链分子并优选为直链分子。在本发明优选的实施方案中，所述交联物部分与骨架部分通过至少两个生物可降解的键连接。
优选地，交联物部分具有范围为60Da至5kDa的分子量，更优选为0.5kDa至4kDa，甚至更优选为1kDa至4kDa，甚至更优选为1kDa至3kDa。在一个实施方案中，交联物部分包括聚合物。
除了低聚或多聚交联部分，可使用低分子量交联部分，特别是当亲水性高分子量骨架部分用于形成本发明的生物可降解的水凝胶时。
优选地，聚(乙二醇)基的交联物部分为烃链，其含有乙二醇单元，并任选含有其它化学官能团，其中每个聚(乙二醇)基的交联物部分含有至少m个乙二醇单元，其中m为范围为3-100的整数，优选10-70。优选地，聚(乙二醇)基的交联物部分具有范围为0.5kDa至5kDa的分子量。
如果就交联物部分或与支化核连接的PEG基的聚合链使用时，术语“PEG基的”是指包含至少20wt％乙二醇部分的交联物部分或PEG基的聚合链。
在一个实施方案中，构成聚合交联物部分的单体通过生物可降解的键连接。所述聚合交联物部分可含有高至100个生物可降解的键或更多，依赖于交联物部分的分子量和单体单元的分子量。所述交联物部分的实例为基于聚(乳酸)或聚(羟乙酸)的聚合物。应当理解的是，所述聚(乳酸)或聚(羟乙酸)链可被烷基或芳基封端或中断，所述烷基或芳基可任选取代有杂原子和化学官能团。
优选地，所述交联物部分为PEG基的，优选仅由一个PEG基的分子链表示。优选地，聚(乙二醇)基的交联物部分为烃链，其含有乙二醇单元，并任选含有其它化学官能团，其中每个聚(乙二醇)基的交联物部分含有至少m个乙二醇单元，其中m为范围为3-100的整数，优选10-70。优选地，聚(乙二醇)基的交联物部分具有范围为0.5kDa至5kDa的分子量。
在本发明的优选实施方案中，所述交联物部分包括PEG，所述交联物部分通过酯键与骨架部分提供的两个α，ω-脂肪族二羧酸间隔基团对称连接，所述骨架部分通过永久性酰胺键与高度支化的树枝状部分连接。
与骨架部分连接的间隔基团部分的二羧酸的另一侧与包括3-12个碳原子，最优选5-8个碳原子的交联部分连接，并且一个或多个碳原子可被取代。优选的取代基为烷基、羟基或酰胺基或取代的氨基。脂肪族二羧酸的一个或多个亚甲基可任选被O或NH或烷基-取代的N取代。优选的烷基为具有1-6个碳原子的直链或支链烷基。
优选地，在高度支化的树枝状部分和与骨架部分连接的间隔基团部分(另一侧与交联部分连接)之间具有永久性酰胺键。
一种优选的交联物部分如下所示；虚线表示与骨架部分互连的生物可降解的连接键：
其中n为5-50的整数。
优选地，所述水凝胶载体由通过水解可降解键互连的骨架部分构成。
更优选地，所述骨架部分包含下式的支化核：
其中虚线表示与骨架部分的剩余部分连接。
更优选地，所述骨架部分包含下式的结构：
其中n为5-50的整数，虚线表示与骨架部分的剩余部分连接。
优选地，骨架部分包含高度支化部分Hyp。
更优选地，骨架部分包含下式的高度支化部分Hyp：
其中虚线表示与分子的其余部分连接，标记有星号的碳原子表示S-构型。
优选地，所述骨架部分与下式的至少一种间隔基团连接：
其中虚线之一表示与高度支化部分Hyp连接，另一条虚线表示与分子的其余部分连接；和
其中m为2-4的整数。
优选地，所述骨架部分通过具有以下结构的交联物部分连接在一起
其中
Q为3-100的整数，优选5-50。
在本发明的水凝胶前药中，骨架部分和交联物部分之间的生物可降解键的水解率受与PEG-酯羧基相邻的连接原子的数目和类型影响或决定。例如，通过从琥珀酸、己二酸或戊二酸中选择形成PEG酯可改变本发明生物可降解的水凝胶载体的降解半衰期。
优选地，L2通过硫代琥珀酰亚胺基与Z连接，L2随后通过间隔基团例如低聚乙二醇链与水凝胶的骨架部分连接。优选地，该间隔基团链与骨架部分的连接键为永久性键，优选酰胺键。
本发明水凝胶的生物可降解能力是通过引入水解可降解键实现的。
对于互连官能团，术语“水解可降解的”在本发明的上下文中是指在生理条件(pH 7.4的水性缓冲液，37℃)下为非酶水解可降解的连接键，其半衰期为一小时至三个月，所述连接键包括但不限于乌头键、缩醛键、羧酸酐键、酯键、亚胺键、腙键、马来酰胺酸酰胺键、原酸酯键、磷酰胺键、磷酰酯键、磷酰基甲硅烷基酯键、甲硅烷基酯键(silyl ester)、磺酸酯键、芳族氨基甲酸酯键、它们的组合等。优选的生物可降解性连接键为羧酸酯键、碳酸酯键、磷酰酯键键和磺酸酯键，最优选的为羧酸酯键或碳酸酯键。应当理解的是，对于体外研究，加速条件例如pH 9，37℃，水性缓冲液可用于实际目的。
永久性连接键在生理条件(pH 7.4的水性缓冲液，37℃)下为非酶水解可降解的，半衰期为六个月或更长，所述连接键为例如酰胺键。
本发明生物可降解的水凝胶载体的降解为多步反应，其中大量可降解性键断裂得到水溶性或水不溶性降解产物。然而，水不溶性降解产物可进一步含有可降解性键，从而使它们可被断裂得到水溶性降解产物。这些水溶性降解产物可含有一个或多个骨架部分。应当理解的是，释放的骨架部分可例如永久性地与间隔基团或封端基团或连接物基团或亲和基团和/或前药连接物降解产物缀合，并且应当理解的是，水溶性降解产物也可含有可降解键。
支化核的结构、PEG基的聚合链的结构、高度支化的树枝状部分的结构和与高度支化的树枝状部分连接的部分的结构可从本发明涉及水凝胶载体章节中提供的相应描述推断出来。应当理解的是，降解物的结构依赖于经历降解的本发明水凝胶的类型。
在本发明的水凝胶完全降解后，可测量溶液中骨架部分的总量，并且在降解过程中，可将可溶性骨架降解产物部分与本发明不溶性水凝胶分离开，并且在不受从本发明水凝胶释放的其它可溶性降解产物干扰的情况下对所述可溶性骨架降解产物部分进行量化。可通过沉降或离心将本发明的水凝胶目标物与生理渗透压浓度的缓冲液的过量水分离开。可通过以下方式进行离心，所述方式为上清液提供至少10体积％的溶胀的本发明水凝胶。在所述沉降或离心步骤后，可溶性水凝胶降解产物保留在水性上清液中，并且可通过使所述上清液的等分液经历适当的分离和/或分析方法检测含有一个或多个骨架部分的水溶性降解产物。
优选地，可通过用0.45μm滤器过滤将水溶性降解产物与水不溶性降解产物分离，之后可在流过物(flow-through)中找到水溶性降解产物。也可通过离心和过滤步骤的结合将水溶性降解产物与水不溶性降解产物分开。
例如，所述骨架部分可携带在其它降解产物不表现UV吸收的波长表现出UV吸收的基团。这样的选择性UV-吸收基团例如酰胺键可为骨架部分的结构组件，或者可籍由芳族环系例如吲哚基通过与骨架的反应性官能团连接而引入到所述骨架中。
在本发明所述水凝胶-连接的胰岛素前药中，期望的是在已释放显著量骨架降解产物之前(＜10％)就已释放几乎所有胰岛素(＞90％)。这可通过调整水凝胶-连接的胰岛素前药的半衰期对水凝胶降解动力学来实现。
优选的是具有式(IIa)或(IIb)结构的胰岛素前药
其中Nε-胰岛素是指通过一个赖氨酸侧链连接的胰岛素；或
优选地，(IIa)或(IIb)中的水凝胶为生物可降解的聚乙二醇(PEG)基的水不溶性水凝胶。
优选地，(IIa)或(IIb)中的水凝胶由通过水解可降解键互连的骨架部分构成。
更优选地，所述骨架部分含有下式的支化核：
其中虚线表示与骨架部分的剩余部分连接。
更优选地，所述骨架部分含有下式的结构：
其中n为5-50的整数，虚线表示与分子的其余部分连接。
优选地，骨架部分含有高度支化部分Hyp。
更优选地，所述骨架部分含有下式的高度支化部分Hyp：
其中虚线表示与分子的其余部分连接，并且标记有星号的碳原子表示S-构型。
优选地，所述骨架部分与下式的至少一个间隔基团连接：
其中所述虚线之一表示与高度支化部分Hyp连接，另一条虚线表示与分子的其余部分连接；和
其中m为2-4的整数。
优选地，所述骨架部分与下式的至少一个间隔基团连接：
其中标记有星号的虚线表示水凝胶与硫代琥珀酰亚胺基团的N之间的键，
其中另一条虚线表示与Hyp连接，和
其中p为0-10的整数。
优选地，骨架部分通过具有以下结构的交联物部分连接在一起
其中
q为3-100的整数；
骨架部分与交联物部分之间的生物可降解键的水解率由与PEG-酯羧基相邻的连接原子的数目和类型确定。例如，通过从琥珀酸、己二酸或戊二酸中选择形成PEG酯可改变交联剂的降解半衰期。
可通过本领域已知的便利方法从本发明的水凝胶开始制备本发明的水凝胶-连接的胰岛素前药。本领域技术人员清楚的是存在数种路线。例如，与生物活性部分共价连接的上述前药连接物可与部分或整体而言具有或已具有活性部分的本发明水凝胶的反应性官能团反应。
在优选的制备方法中，所述水凝胶是通过化学连接反应生成的。所述水凝胶可由具有互补官能性的两个大分子离析物(macromolecular educt)形成，所述两个大分子离析物经历例如缩合或加成反应。这些起始物质之一为具有至少两个相同官能团的交联试剂，另一个起始物质为同多官能(homomultifunctional)骨架试剂。交联试剂中存在的适当官能团包括终端氨基、羧酸性基团及衍生物基团、马来酰亚胺基团和其它α，β不饱和迈克尔受体如乙烯基砜基团、巯基、羟基。骨架试剂中存在的适当官能团包括但不限于氨基、羧酸性基团及衍生物基团、马来酰亚胺基团和其它α，β不饱和迈克尔受体如乙烯基砜基团、巯基、羟基。
如果就骨架反应性官能团使用亚化学计量的交联试剂反应性官能团，则所得的水凝胶为游离的反应性官能团与骨架结构连接的反应性水凝胶。
任选地，所述前药连接物可先与胰岛素缀合，所得胰岛素-前药连接物缀合物然后可与水凝胶的反应性官能团反应。可选择地，前药连接物的一个官能团活化后，连接物-水凝胶缀合物可在第二个步骤中与胰岛素接触，并且在胰岛素与水凝胶-结合的前药连接物缀合后，可过滤除去过量胰岛素。
制备本发明前药的优选方法如下所示：
用于骨架试剂合成的优选起始物质为4-臂PEG四胺或8-臂PEG八胺，其中PEG试剂具有2000-10000道尔顿的分子量，最优选为2000-5000Da。赖氨酸残基连续与所述多臂PEG-衍生物偶联，从而形成高度支化的骨架试剂。应当理解的是，所述赖氨酸在偶联步骤过程中可受保护基完全或部分保护，并且最终的骨架试剂也可含有保护基。优选的构造单元为二保护的赖氨酸。可选择地，与连续加入赖氨酸不同的是，可先组装树枝状聚-赖氨酸部分，随后与4-臂PEG四胺或8-臂PEG八胺偶联。期望的是获得具有32个氨基的骨架试剂，结果会有七个赖氨酸与4-臂PEG的每个臂连接，或者会有五个赖氨酸与8-臂PEG的每个臂连接。在另一个实施方案中，所述多臂PEG衍生物为四-或八羧基PEG。在这种情况下，所述树枝状部分可由戊二酸或天冬氨酸生成，并且所得骨架试剂具有32羧基。应当理解的是，骨架试剂的所有官能团或一部分官能团可按游离形式存在，其为盐或与保护基缀合。应当理解的是，由于实际原因，骨架试剂的每条PEG-臂的赖氨酸数目在六至七个之间，更优选为约七个。
优选的骨架试剂如下所示：
交联试剂的合成从分子量范围为0.2-5kDa，更优选0.6-2kDa的直链PEG开始，用二羧酸(最优选为己二酸或戊二酸)的半酯对其进行酯化。用于半酯形成的优选保护基为苄型基团。所得的双二羧酸PEG半酯转化成更具反应性的羧基化合物例如酰氯或活性酯例如五氟苯基酯或N-羟基琥珀酰亚胺酯，最优选为N-羟基琥珀酰亚胺酯，其优选的结构如下所示。
可选择地，可在偶联剂例如DCC或HOBt或PyBOP存在下活化所述双二羧酸PEG半酯。
在可选择地实施方案中，所述骨架试剂具有羧基，并且从含酯的氨基-终端的PEG-链中选择相应的交联试剂。
可使用反相乳液聚合使骨架试剂和交联试剂聚合，从而形成本发明的水凝胶。对骨架和交联剂官能团之间的期望化学计量进行选择后，将骨架和交联剂溶解在DMSO中，采用具有经适当选择的HLB值的乳化剂(优选ArlacelP135)，使用机械搅拌器并控制搅拌速度以形成反相乳液。通过加入合适的碱引发聚合，优选通过N，N，N‘，N‘-四甲基乙二胺引发聚合。搅拌适当长的时间后，通过加入水和酸例如乙酸淬灭反应。收集珠子，洗涤并通过机械筛分(mechanical sieving)根据粒径进行分级。任选地，可在该阶段除去保护基。
此外，本发明的所述水凝胶可用具有不同于水凝胶所提供的反应性官能团的间隔基团进行官能化。例如，可通过合适的杂二官能间隔基团例如Mal-PEG6-NHS与水凝胶偶联而向水凝胶中引入马来酰亚胺反应性官能团。所述经官能化的水凝胶可进一步与在连接物部分上具有反应性巯基的胰岛素-连接物试剂缀合，从而形成本发明的水凝胶-连接的胰岛素前药。
在胰岛素-连接物缀合物与官能化的含马来酰亚胺基的水凝胶装载后，将剩余的官能团用合适的阻断剂例如巯基乙醇封端，从而防止不期望的副反应。
在本发明的优选实施方案中，在室温至4℃，更优选在室温，在pH 2-5，优选pH 2.5-4.5，更优选pH 3.0-4.0的缓冲水溶液中，具有与连接物部分连接的游离巯基的胰岛素-连接物缀合物与马来酰亚胺-官能化的水凝胶反应。随后，在室温至4℃，更优选在室温，在pH 2-5，优选pH 2.5-4.0，更优选pH 2.5-3.5的缓冲水溶液中，用巯基乙醇处理所得的相应胰岛素-连接物-水凝胶缀合物。
在本发明另一个优选的实施方案中，在室温至4℃，更优选在室温，在pH 2-5，优选pH 2-5，优选pH 2.5-4.5，更优选pH 3.0-4.0的缓冲水溶液中，具有与连接物部分连接的马来酰亚胺基团的胰岛素-连接物缀合物与巯基-官能化的水凝胶反应。随后，在室温至4℃，更优选在室温，在pH 2-5，优选pH 2.5-4.0，更优选pH 2.5-3.5的缓冲水溶液中，用含有马来酰亚胺基团的低分子量化合物，优选100-300Da的含马来酰亚胺的化合物例如N-乙基-马来酰亚胺处理所得相应胰岛素-连接物-水凝胶缀合物。
本发明另一个方面为方法，包括以下步骤：
(a)在室温至4℃和在pH 2-5的缓冲水溶液中，使含有马来酰亚胺-官能化的水凝胶微粒的水性混悬液与含有具有巯基基团的胰岛素-连接物试剂的溶液接触，得到胰岛素-连接物-水凝胶缀合物；
(b)任选地，在室温至4℃和在pH 2-5缓冲水溶液中，用34Da至500Da的含巯基的化合物处理步骤(a)的胰岛素-连接物-水凝胶缀合物。
本发明另一个方面为方法，包括以下步骤：
(a)在室温至4℃和在pH 2-5的缓冲水溶液中，使含有巯基-官能化的水凝胶微粒的水性混悬液与含有具有马来酰亚胺基团的胰岛素-连接物试剂的溶液接触，得到胰岛素-连接物-水凝胶缀合物；
(b)任选地，在室温至4℃和在pH 2-5的缓冲水溶液中，用100-300Da的含马来酰亚胺的化合物处理步骤(a)的胰岛素-连接物-水凝胶缀合物。
制备本发明前药的特别优选的方法包括以下步骤：
(a)式C(A’-X1)4化合物(其中A’-X1表示与Hyp或Hyp前体连接之前的A，X1为合适的官能团)与式Hyp’-X2化合物(其中Hyp’-X2表示与A连接之前的Hyp或Hyp的前体，X2为与X1反应的合适官能团)反应；
(b)任选地，步骤(a)所得的化合物分一个或多个额外步骤反应得到具有至少四个官能团的式C(A-Hyp)4化合物；
(c)步骤(b)所得的化合物的至少四个官能团与聚乙二醇基的交联剂前体反应，其中交联剂前体的活性酯基团相比于C(A-Hyp)4的总反应性官能团数目按亚化学计量使用，从而得到水凝胶；
(d)步骤(c)水凝胶骨架中的剩余未反应官能团(代表了水凝胶中所含的骨架的反应性官能团)与生物活性部分和暂时的前药连接物的共价缀合物反应，或者未反应的官能团先与暂时的前药连接物反应，随后与生物活性部分反应；
(e)任选地，对剩余的未反应的官能团进行封端，得到本发明的前药。
具体地，用于本发明胰岛素前药的水凝胶如下合成：
对于本体聚合(bulk polymerization)，将骨架试剂和交联试剂按胺/活性酯比例2∶1-1.05∶1混合。
将骨架试剂和交联试剂都溶解在DMSO中，得到浓度为5-50g/100mL，优选7.5-20g/100ml，最优选为10-20g/100ml的溶液。
为了引起聚合，将2-10％(体积)N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TMEDA)加至含有交联试剂和骨架试剂的DMSO溶液中，将混合物震摇1-20秒并使其静置。混合物在小于1分钟内固化。
优选通过机械方法例如搅拌、压碎(crushing)、切压(cutting pressing)或研磨(milling)对本发明的所述水凝胶进行粉碎，并任选进行筛分。
对于乳液聚合，所述反应混合物由分散相和连续相构成。
对于分散相，将骨架试剂和交联试剂按胺/活性酯比例2∶1-1.05∶1混合，并溶解在DMSO中，得到浓度为5-50g/100mL，优选7.5-20g/100ml和最优选10-20g/100ml的溶液。
连续相为不与DMSO混溶的任意的非碱性非质子性溶剂，并且显示出低于10Pa*s的粘度。优选地，所述溶剂不与DMSO混溶，为非碱性非质子性的，显示出低于2Pa*s的粘度并且为无毒的。更优选地，所述溶剂为具有5-10个碳原子的饱和直链或支链烃。最优选地，所述溶剂为正庚烷。
为了形成分散相于连续相中的乳液，在加入分散相前向连续相中加入乳化剂。乳化剂的量为2-50mg/mL分散相，更优选为5-20mg/mL分散相，最优选为10mg/mL分散相。
所述乳化剂具有3-8的HLB-值。优选地，所述乳化剂为山梨糖醇与脂肪酸的三酯或为聚(羟基脂肪酸)-聚(乙二醇)缀合物。更优选地，所述乳化剂为聚(羟基-脂肪酸)-聚乙二醇缀合物，其中直链聚(乙二醇)的分子量范围为0.5kDa至5kDa，所述链各端的聚(羟基-脂肪酸)单元的分子量范围为0.5kDa至3kDa。最优选地，所述乳化剂为聚(乙二醇)二多羟基硬脂酸酯即CithrolDPHS(Cithrol DPHS，former Arlacel P135，Croda International Plc)。
分散相的微滴是通过用轴流叶轮搅拌生成的，所述轴流叶轮与搅拌器例如Isojet，Intermig，Propeller(EKATO Rühr-und Mischtechnik GmbH，Germany)的几何形状类似，最优选与直径为反应器直径的50-90％的Isojet类似。优选地，在加入分散相前开始搅拌。搅拌速度设定为0.6-1.7m/s。室温加入分散相，分散相的浓度为总反应体积的2％-70％，优选5-50％，更优选10-40％，和最优选20-35％。将分散相、乳化剂和连续相的混合物搅拌5-60分钟，然后加入碱以引起聚合。
向分散相和连续相的混合物中加入5-10当量(就所形成的每个酰胺键而言)的碱。所述碱为非质子性、非亲核性的，并且可溶在分散相中。优选地，所述碱为非质子性、非亲核性的、在分散相和DMSO中都充分可溶。更优选地，所述碱为非质子性、非亲核性、在分散相和DMSO中都充分可溶、胺碱和无毒的。最优选地，所述碱为N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TMEDA)。碱存在下的搅拌持续1-16小时。
在搅拌过程中，分散相的微滴硬化并变成本发明的交联水凝胶珠子，收集所述珠子并在具有75μm和32μm台面(deck)的震动性连续筛分机上根据大小进行分级，得到本发明的水凝胶微粒。
本发明另一个方面为式(IIIa)和(IIIb)的胰岛素-连接物缀合物：
其中Nε-胰岛素是指通过一个赖氨酸侧链连接的胰岛素；和
本发明另一个方面为胰岛素-连接物试剂D-L*，
其中
D表示胰岛素部分；和
L*为式(IV)表示的非生物活性连接物试剂，
其中虚线表示与所述胰岛素的氨基中的一个连接形成酰胺键的连接位；
X为C(R3R3a)；或N(R3)；
R1a、R3a独立地选自H，NH(R2b)，N(R2b)C(O)R4和C1-4烷基；
R1、R2、R2a、R2b、R3、R4独立地选自H和C1-4烷基，
其中L*取代有一个L2*并任选被进一步取代，条件是式(IV)中标记有星号的氢不被取代基替代，并且其中
L2*为与L*连接的间隔基团并且含有预期用于与反应性生物可降解的水凝胶缀合的化学官能团；
优选地，式(IV)中的R2被L2*替代。
优选地，式(IV)中的R1被L2*替代。
优选地，式(IV)中的X为N(R3)。
更优选地，式(IV)中的X为C(R3R3a)，和R3a为N(R2b)C(O)R4。
更优选地，式(IV)中的X为C(R3R3a)，和R3a被L2*替代。
甚至更优选地，式(IV)中的X为C(R3R3a)，R3a为N(R2b)-L2*。
优选地，式(IV)中的L*不被进一步取代。
优选地，式(IV)中的L2*含有巯基。
优选地，式(IV)中的L2*含有马来酰亚胺基团。
用于本发明前药的水凝胶可按微粒形式通过制备方法获得。在本发明优选的实施方案中，所述反应性水凝胶为成型的制品例如网或支架。最优选地，所述水凝胶按微粒珠子形式形成，可籍由标准注射器作为皮下注射或肌内注射给予所述微粒珠子。所述软珠子可具有1-500微米的直径。
优选地，如果悬浮在等渗水性配制用缓冲液中，所述微粒具有10-100微米的直径，最优选20-100微米的直径，最优选25-80微米的直径。
优选地，可通过用内径小于0.6mm的注射针头注射给予所述微粒，优选用内径小于0.3mm的注射针头，更优选用内径小于0.225mm的注射针头，甚至更优选用内径小于0.175mm的注射针头，和最优选用内径小于0.16mm的注射针头。
应当理解的是，术语“可通过注射给予”、“可注射的”或“可注射性”是指因素的组合，所述因素为例如向含有本发明生物可降解的水凝胶(在液体中在特定温度溶胀至特定浓度(w/v))的注射器的柱塞施加一定的力、与所述注射器的出口相连的给定内径的注射针头和从注射器中通过注射针头挤出一定体积的本发明生物可降解的水凝胶所需的时间。
为了提供可注射性，在室温和历时10秒，通过施加小于50牛顿的力将在水中溶胀至浓度为至少5％(w/v)并装在持有直径为4.7mm的柱塞的注射器中的1mL本发明胰岛素前药挤出。
优选地，在水中溶胀至浓度为约10％(w/v)的本发明胰岛素前药实现了可注射性。
此外，提供一步方法，从而用含有经保护的巯基或其它官能团的酰化剂选择性酰化在胰岛素及其类似物的B-链中发现的单一游离ε-氨基。对于重组人胰岛素、甘精胰岛素和门冬胰岛素，酰化位点为LysB29的ε-氨基，在赖脯胰岛素情况下，酰化位点为LysB28的ε-氨基，和在谷赖胰岛素情况下，酰化位点为LysB3的ε-氨基。应当理解的是，该方法并不限于前述胰岛素和胰岛素类似物，也可用于其它胰岛素类似物，只要它们含有ε-氨基，本领域技术人员能够识别适于酰化的相应赖氨酸残基。
因此，本发明另一个方面为用含有一个或多个经保护的官能团的酰化剂对具有一个或多个游离α-氨基和游离ε-氨基的胰岛素或胰岛素类似物的ε-氨基进行酰化的方法，所述方法包括在极性溶剂中和在pH 8.0至低于9.0，使胰岛素或胰岛素类似物与含有一个或多个经保护的官能团的可溶酰化剂反应。应当理解的是，仅使用在前述条件下稳定的保护基。
通过以下方式进行所述反应：在pH范围为约8.00至低于9.0，优选8.0-8.9，更优选8.3-8.7，在极性溶剂例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、DMSO、DMF、NMP、二甲基乙酰胺、乙腈的水性混合物中，使含有一个或多个经保护的官能团的酰化剂例如连接物试剂与胰岛素或胰岛素类似物的ε-氨基反应。
本发明另一个方面为胰岛素化合物(insulin compound)，特征在于具有与胰岛素或胰岛素类似物的ε-氮相连的酰基，其中所述酰基具有一个或多个经保护的官能团。
本发明另一个方面为药物组合物，其包含本发明的前药或其药用盐和药用赋形剂。在下面段落中进一步描述所述药物组合物。
所述胰岛素-水凝胶前药的组合物可作为混悬液组合物或者作为干燥组合物来提供。优选地，所述胰岛素-水凝胶前药的药物组合物为干燥组合物。干燥的适当方法为例如，喷雾干燥和低压冻干(冷冻干燥)。优选地，所述胰岛素-水凝胶前药的药物组合物经低压冻干进行干燥。
优选地，所述胰岛素水凝胶前药在组合物中足量给药以在一次施用中提供至少三天的治疗有效量的胰岛素。更优选地，胰岛素水凝胶前药的一次施用在一周内是足量的。
本发明的胰岛素-水凝胶前药的药物组合物含有一种或者多种赋形剂。
在肠胃外组合物中使用的赋形剂可分为如下几类：缓冲剂、等渗调节剂、防腐剂、稳定剂、抗吸附剂、氧化保护剂、增粘剂/粘度增强剂，或者其它辅助剂。在一些情况下，这些成分可具有双重或者三重功能。本发明的胰岛素-水凝胶前药的组合物含有一种或者多种赋形剂，其选自：
(i)缓冲剂：维持pH在理想范围内的生理耐受缓冲剂，诸如磷酸钠、碳酸氢钠、琥珀酸钠、组氨酸钠、枸橼酸钠和乙酸钠、硫酸钠、硝酸钠、氯化钠、丙酮酸钠。也可使用抗酸剂诸如Mg(OH)2或者ZnCO3。可调节缓冲能力以符合对pH稳定性最敏感的条件。
(ii)等渗调节剂：最小化可由细胞损伤导致的疼痛的化合物，所述细胞损伤由于在注射储库的渗透压差异所导致。实例为甘油和氯化钠。有效浓度可通过使用对于血清为285-315mOsmol/kg的假定重量克分子渗透压浓度进行渗透压力测定法来确定。
(iii)防腐剂和/或抗菌剂：多剂量肠胃外制剂需要加入以最小化患者在注射后变为受感染的风险的足量浓度的防腐剂，且已经建立了相应的法规需要量。典型的防腐剂包括间甲酚、苯酚、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、氯丁醇、苯甲醇、苯基硝酸汞、硫柳汞、山梨酸、山梨酸钾、苯甲酸、氯甲酚和苯扎氯铵。
(iv)稳定剂：稳定作用通过加强蛋白质稳定力、变性状态的去稳定化或者赋形剂与蛋白质的直接结合来实现。稳定剂可为氨基酸诸如丙氨酸、精氨酸、门冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸，糖类诸如葡萄糖、蔗糖、海藻糖，多元醇诸如甘油、甘露醇、山梨醇，盐类诸如磷酸钾、硫酸钠，螯合剂诸如EDTA、六磷酸盐，配体诸如二价金属离子(锌离子、钙离子等)，其它盐类或者有机分子诸如苯酚衍生物。此外，可使用寡聚体或者聚合物诸如环糊精、右旋糖酐、树状聚体、PEG或者PVP或者鱼精蛋白或者HAS。
(v)抗吸附剂：用于与组合物或者组合物容器的内表面竞争性包衣或者吸附的主要离子型或者非离子型表面活性剂或者其它蛋白质或者可溶聚合物。例如泊洛沙姆(Pluronic F-68)、PEG十二烷基醚(Brij 35)、聚山梨酸酯20和80、右旋糖酐、聚乙二醇、PEG-聚组氨酸、BSA和HAS和明胶。赋形剂的选择浓度和类型取决于应避免的作用，但典型地在恰好高于CMC值在界面处形成单层的表面活性剂。
(vi)冻干保护剂和/或冷冻保护剂：在冷冻干燥或者喷雾干燥过程中，赋形剂可抵消由氢键断裂和水除去引起的不稳定作用。对于该目的，可使用糖类和多元醇，但相应的正性作用也已经在表面活性剂、氨基酸、非水溶剂和其它肽中观察到。海藻糖特别有效地降低潮湿引起的聚集且也增强了可能通过将蛋白疏水基暴露于水引起的热稳定性。也可使用甘露醇和蔗糖作为单独的冻干保护剂/冷冻保护剂或者彼此联用，其中高比例的甘露醇∶蔗糖已知为增强冷冻干燥饼的物理稳定性。甘露醇也可与海藻糖组合。海藻糖也可与山梨醇或者作为单独保护剂使用的山梨醇组合。也可使用淀粉或者淀粉衍生物。
(vii)氧化保护剂：抗氧化剂诸如抗坏血酸、四氢甲基嘧啶羧酸、蛋氨酸、谷胱甘肽、单硫代甘油、桑色素、聚乙烯亚胺(PEI)、没食子酸丙酯、维生素E，螯合剂诸如枸橼酸、EDTA、六磷酸盐(盐)、巯基乙酸。
(viii)增粘剂或者粘度增强剂：使用颗粒在小瓶和注射器中的延缓沉降以促进颗粒的混合和重新混悬并且使得所述混悬液易于注射(即施加于注射器活塞的力小)。适当的增粘剂或者粘度增强剂为例如，卡波姆增粘剂如卡波泊尔940、卡波泊尔Ultrez 10，纤维素衍生物如羟基丙基甲基纤维素(羟丙甲纤维素、HPMC)或者二乙基氨基乙基纤维素(DEAE或者DEAE-C)，胶状硅酸镁(Veegum)或者硅酸钠，羟基磷灰石凝胶、磷酸三钙凝胶，黄色素，角叉藻聚糖如Satia树胶UTC 30，脂族聚(羟基酸)诸如聚(D，L-或者L-乳酸)(PLA)和聚(羟乙酸)(PGA)以及它们的共聚物(PLGA)，D，L-丙交酯、乙交酯和己内酯的三聚物，泊洛沙姆，亲水聚(氧乙烯)嵌段和疏水聚(氧丙烯)嵌段以制成聚(氧乙烯)-聚(氧丙烯)-聚(氧乙烯)的三嵌段(例如)，聚醚酯共聚物诸如聚对苯二甲酸乙二醇酯/聚对苯二甲酸丁二醇共聚物，乙酸-异丁酸蔗糖酯(SAIB)，右旋糖酐或者其衍生物，右旋糖酐和PEG的组合，聚二甲基硅氧烷、胶原、壳聚糖，聚乙烯醇(PVA)和衍生物，聚烷基酰亚胺，聚(丙烯酰胺-共-二烯丙基二甲基铵(DADMA))，聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，葡萄糖胺聚糖(GAGs)诸如硫酸皮肤素、硫酸软骨素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素，透明质烷，由疏水A-嵌段(诸如聚丙交酯(PLA)或者聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA))和亲水B-嵌段(诸如聚乙二醇(PEG)或者聚乙烯基吡咯烷酮)构成的ABA三嵌段或者AB嵌段共聚物。所述嵌段共聚物以及上面提及的泊洛沙姆可显示相反的热量胶凝作用行为(在室温为流体状态以便于给药且在注射后在高于溶胶-凝胶转换温度在体温为凝胶状态)。
(ix)铺展剂或者分散剂：通过在细胞间隔的细胞外基质中的组分(诸如但不限于透明质酸，其为存在于结缔组织的细胞间隙中的多糖)的水解来修饰结缔组织的渗透性。铺展剂诸如但不限于玻璃酸酶，其暂时降低细胞外基质的粘度且促进注射药物的分散。
(x)其它辅助剂：诸如湿润剂、粘度修饰剂、抗生素、玻璃酸酶。酸和碱诸如盐酸和氢氧化钠为对于在制造过程中pH调节所必需的辅助剂。
优选地，胰岛素-水凝胶前药的组合物含有一种或者多于一种增粘剂和/或粘度调节剂。
术语″赋形剂″优选地是指与治疗药物一起给药的稀释剂、辅料或者媒介物。所述药物赋形剂可为无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或者合成来源的油，包括但不限于花生油、大豆油、矿物油、麻油等。当药物组合物口服给药时，水为优选的赋形剂。当药物组合物静脉内给药时，盐水和葡萄糖水溶液为优选的赋形剂。盐水溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液优选地用作可注射溶液的液体赋形剂。适当的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述组合物也可含有少量的润湿剂或者乳化剂或者pH缓冲剂。这些组合物可采用溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、持续释放制剂等形式。所述组合物可用传统粘合剂和赋形剂诸如甘油三酯配制为栓剂。口服制剂可包含标准赋形剂诸如药学级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适当的药物赋形剂的实例在E.W. Martin的″Remington′s Pharmaceutical Sciences″中有述。所述组合物将含有治疗有效量的治疗药物(优选地为纯化形式)以及适当量的赋形剂以提供对患者适当给药的形式。该制剂适合给药模式。
在一般实施方案中，无论是干燥形式还是混悬液或者是其它形式的本发明的药物组合物可作为单一或者多剂量组合物来提供。
在本发明的一个实施方案中，胰岛素-水凝胶前药的干燥组合物作为单一剂量来提供，这表示提供其的容器中含有一个药物剂量。
因此在本发明的另一方面，所述组合物作为单一剂量组合物来提供。
优选地，混悬液组合物为多剂量组合物，这表示其含有多于一个治疗剂量。优选地，多剂量组合物含有至少2个剂量。胰岛素-水凝胶的所述多剂量组合物可用于有此需要的不同患者或者意在一个患者中使用，其中在施用第一剂量后储存剩余剂量，直到需要所述剩余剂量。
在本发明的另一方面，所述组合物包含在容器中。优选地所述容器为双室注射器。特别地在双室注射器的第一室中提供本发明的干燥组合物且在双室注射器的第二室中提供重建溶液。
在对有此需要的患者施用胰岛素-水凝胶前药的干燥组合物之前，重建所述干燥组合物。可在容器中进行重建，在所述容器中胰岛素-水凝胶前药的干燥组合物可在诸如小瓶、注射器、双室注射器、安瓿和药筒中提供。通过将预定量的重建溶液加入至所述干燥组合物中完成重建。重建溶液为无菌液体，诸如水或者缓冲液，其可进一步含有添加剂，诸如防腐剂和/或抗菌剂。如果胰岛素-水凝胶前药组合物作为单一剂量提供时，则所述重建溶液可含有一种或者多种防腐剂和/或抗菌剂。优选地，所述重建溶液为无菌水。如果胰岛素-水凝胶前药的组合物为多剂量组合物，则优选的是所述重建溶液含有一种或者多种防腐剂和/或抗菌剂，例如苯甲醇和甲酚。
本发明的另一方面涉及给药重建的胰岛素水凝胶前药组合物的方法。所述胰岛素水凝胶前药组合物可通过包括皮内、皮下、肌内、静脉内、骨内和腹膜内的注射或者输注的方法来给药。
另一方面为制备重建的组合物的方法，所述组合物包含治疗有效量的胰岛素水凝胶前药以及任选一种或者多种药用赋形剂，其中所述胰岛素与水凝胶暂时连接，所述方法包括以下步骤：
·使本发明组合物与重建溶液接触。
另一方面为重建的组合物，其包含治疗有效量的胰岛素水凝胶前药以及任选一种或者多种药用赋形剂，其中所述胰岛素与通过上面方法得到的水凝胶暂时连接。
本发明的另一方面为制造胰岛素-水凝胶前药的干燥组合物的方法。在一个实施方案中，所述混悬液组合物通过如下制备：
(i)使胰岛素-水凝胶前药与一种或者多种赋形剂混合，
(ii)转移相当于单一或者多剂量的量的组合物于适当的容器中，
(iii)在所述容器中干燥组合物，且
(iv)密封容器。
适当的容器为小瓶、注射器、双室注射器、安瓿和药筒。
另一方面为套盒(kit of parts)。当给药装置仅为皮下注射器时，所述试剂盒可包含注射器、注射针头以及与注射器一起使用的包含干燥胰岛素-水凝胶前药组合物的容器和包含重建溶液的第二容器。在更优选的实施方案中，所述注射装置不为简单的皮下注射器，且由此含有重建的胰岛素-水凝胶前药的分开的容器适于与注射装置接合以使得在使用时在容器中的液体组合物在流体中与注射装置的出口流体连接。给药装置的实例包括但不限于皮下注射器和笔式注射装置。特别优选的注射装置为笔式注射器，在该情况下所述容器为药筒，优选地为可更换的药筒。
优选的套盒包括注射针头以及含有本发明组合物和任选进一步含有重建溶液的容器，所述容器适于与注射针头一起使用。优选地，所述容器为双室注射器。
在另一方面，本发明提供了与笔式注射器装置一起使用的含有如上所述的胰岛素-水凝胶前药的组合物的药筒。所述药筒可含有单一剂量或者多剂量的胰岛素。
在本发明的一个实施方案中，胰岛素-水凝胶前药的混悬液组合物不仅包含胰岛素-水凝胶前药以及一种或者多种赋形剂，而且还含有游离形式或者作为前药的其它生物活性剂。优选地，所述另外的一种或者多种生物活性剂为前药，更优选地为水凝胶前药。所述生物活性剂包括但不限于以下各类的化合物：
(i)磺脲类，例如氯磺丙脲、妥拉磺脲、甲苯磺丁脲、格列本脲、格列吡嗪、格列美脲等，
(ii)氯茴苯酸类，例如瑞格列奈，
(iii)高血糖素样肽-1(GLP-1)及其模拟物、葡萄糖促胰岛素肽(GIP)及其模拟物、艾塞那肽及其模拟物以及二肽基蛋白酶抑制剂(DPPIV)，
(iv)双胍，例如二甲双胍，
(v)噻唑烷二酮类，例如罗格列酮、吡格列酮、曲格列酮、伊沙列酮(称为MCC-555)、2-[2-[(2R)-4-己基-3，4-二氢-3-氧代-2H-1，4-苯并噁嗪-2-基]乙氧基]-苯乙酸等
(vi)GW2570等，
(vii)类视黄素X受体(RXR)调节剂，例如塔革雷汀、9-顺式视黄酸等，
(viii)其它胰岛素致敏剂，例如INS-1、PTP-1B抑制剂、GSK3抑制剂、糖原磷酸化酶a抑制剂、果糖-1，6-二磷酸酶抑制剂等，
(ix)胰岛素，包括常规或者短效、中效和长效胰岛素，吸入性胰岛素和胰岛素类似物，诸如在天然氨基酸序列中具有微小差异的胰岛素分子，
(x)胰岛素的小分子模拟物，包括但不限于L-783281、TE-17411等，
(xi)Na-葡萄糖协同转运蛋白抑制剂，诸如T-1095、T-1095A、根皮苷等，
(xii)支链淀粉激动剂，包括但不限于普兰林肽等，
(xiii)高血糖素拮抗剂诸如AY-279955等。
除了抗糖尿病药之外，生物活性化合物可为减肥药诸如奥利司他、胰脂酶抑制药，其预防脂肪的分解和吸收；或者西布曲明(一种食欲抑制剂)以及脑中5-羟色胺、去甲肾上腺素和多巴胺的重吸收抑制剂、增加脂肪动员的生长因子(例如生长激素、IGF-1、生长激素释放因子)、胃泌酸调节素和胃饥饿素调节剂。其它可能的生物活性减肥药包括但不限于通过肾上腺素能机制起作用的食欲抑制剂诸如苄非他明、芬美曲秦、芬特明、安非拉酮、马吲哚、西布曲明、苯丙醇胺或者麻黄碱；通过5-羟色胺能机制起作用的食欲抑制剂诸如喹哌嗪、氟西汀、舍曲林、芬氟拉明或者右芬氟拉明；通过多巴胺机制起作用的食欲抑制剂例如阿扑吗啡；通过组胺能机制起作用的食欲抑制剂(例如组胺模拟物、H3受体调节剂)；能量消耗强化剂诸如β-3肾上腺素能激动剂和解偶联蛋白机能刺激剂；瘦蛋白和瘦蛋白模拟物(例如美曲普汀)；神经肽Y拮抗剂；黑皮质素-1、3和4受体调节剂；胆囊收缩素激动剂；高血糖素样肽-1(GLP-1)模拟物和类似物(例如艾塞那肽)；雄激素(例如脱氢表雄酮和衍生物诸如本胆烷二酮)、睾酮、促蛋白合成甾类(例如氧雄龙)和甾体激素；促生长激素神经肽受体拮抗剂；细胞因子药物诸如睫状节神经细胞营养因子；淀粉酶抑制剂；肠抑素激动剂/模拟物；阿立新/下视丘泌素拮抗剂；尿皮质醇拮抗剂；铃蟾肽激动剂；蛋白激酶A调节剂；促皮质激素释放因子模拟物；可卡因-和安非他命调节的转录子模拟物；降钙素基因相关肽模拟物；以及脂肪酸合酶抑制剂。
在可选择的实施方案中，本发明的胰岛素-水凝胶前药组合物与第二生物活性化合物按以下方式组合，所述方式为先向有此需要的患者给予胰岛素-水凝胶前药，然后给予第二化合物。可选择地，在已将另一种化合物给予有此需要的患者后将胰岛素-水凝胶组合物给予相同的患者。
本发明另一个方面为本发明的前药或本发明的药物组合物，其用作药物。
本发明另一个方面为本发明的前药或本发明的药物组合物，其用在治疗或预防可通过胰岛素治疗的疾病或障碍的方法中。
所述疾病或障碍为例如高血糖症(hyperglycemia)、亚糖尿病(pre-diabete)、葡萄糖耐量降低(impaired glucose tolerance)、I型糖尿病、II型糖尿病、X综合征(syndrome X)、肥胖症(obesity)、高血压(hypertension)。
需要用本发明描述的长效胰岛素组合物治疗的患者具有发展并存病(comorbidity)的高风险。因此，本发明长效胰岛素与适当生物活性化合物的组合可用于例如预防选自以下的疾病和障碍、延迟选自以下的疾病和障碍的进展或治疗选自以下的疾病和障碍：高血压(包括但不限于单纯收缩期高血压(isolated systolic hypertension)和家族性脂质异常高血压(familial dyslipidemichypertension))、充血性心力衰竭(congestive heart failure)、左心室肥大(leftventricular hypertrophy)、外周动脉疾病(peripheral arterial disease)、糖尿病性视网膜病(diabetic retinopathy)、黄斑变性(macular degeneration)、白内障(cataract)、糖尿病性肾病变(diabetic nephropathy)、肾小球硬化症(glomerulosclerosis)、慢性肾衰竭(chronic renal failure)、糖尿病性神经病变(diabetic neuropathy)、X综合征、经前期综合征(premenstrual syndrome)、冠心病(coronary heart disease)、心绞痛(angina pectoris)、血栓形成(thrombosis)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、心肌梗塞(myocardial infarction)、短暂性脑缺血发作(transient ischemic attacks)、中风(stroke)、血管再狭窄(vascular restenosis)、高血糖症、高胰岛素血症、高脂血症(hyperlipidemia)、高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia)、胰岛素抵抗(insulin resistance)、葡萄糖代谢受损(impaired glucose metabolism)、葡萄糖耐量降低的病症、禁食血浆葡萄糖受损的病症(conditions ofimpaired fastingplasma glucose)、肥胖症、勃起机能障碍(erectile dysfunction)、皮肤和结缔组织障碍、足溃疡(foot ulceration)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、内皮功能障碍(endothelial dysfunction)和血管顺应性受损(impaired vascular compliance)。
预防选自上述的疾病和障碍、延迟选自上述的疾病和障碍的进展或治疗选自上述的疾病和障碍可通过本发明的长效胰岛素组合物与至少一种生物活性化合物的组合来实现，所述生物活性化合物选自治疗所述病症所使用的药物类别，包括AT1-受体拮抗剂；血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂；肾素抑制剂；3肾上腺素能受体阻断剂；α肾上腺素能受体阻断剂；钙通道阻断剂；醛固酮合酶抑制剂；醛固酮受体拮抗剂；中性肽链内切酶(NEP)抑制剂；双血管紧张素转换酶/中性内肽酶(ACE/NEP)抑制剂；内皮素受体拮抗剂；利尿药；他汀类(statins)；硝酸酯类(nitrates)；抗凝血剂(anti clotting agent)；利钠肽；洋地黄类化合物(digitalis compound)；PPAR调节剂。
在所述生物活性剂；前药(特别是水凝胶前药)含有一个或多个酸性或碱性基团的情况下，本发明还包括它们相应的药学或毒理学可接受的盐，特别是它们的药用盐。因此，含有酸性基团的所述前药可根据本发明用作例如碱金属盐、碱土金属盐或铵盐。所述盐的更确切实例包括钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或与氨或有机胺例如乙基胺、乙醇胺、三乙醇胺或氨基酸形成的盐。可存在含有一个或多个碱性基团(即可被质子化的基团)的前药并可根据本发明按它们与无机酸或有机酸形成的加成盐形式使用。合适酸的实例包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸s、草酸、乙酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、甲酸、丙酸、特戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富马酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯基丙酸、葡萄糖酸、抗坏血酸、异烟酸、枸橼酸、己二酸和本领域技术人员已知的其它酸。如果所述前药在分子内同时含有酸性和碱性基团，则本发明除上述盐形式外还包括内盐或内铵盐(两性离子)。可通过本领域熟练技术人员已知的惯常方法获得各自盐，例如通过在溶剂或分散剂中使这些化合物与有机酸/碱或无机酸/碱接触，或通过与其它盐进行阴离子交换或阳离子交换。本发明还包括所述前药的所有盐，由于低生理性相容性，所述盐不适于直接用在药物中，但可用作例如化学反应的中间体或用于制备药用盐。
术语“药用的”是指经管理机构例如EMEA(欧洲)和/或FDA(US)和/或任意其它国家管理机构批准在动物，优选人中使用。
本发明另一个方面为在需要治疗一种或多种病症的哺乳动物患者优选人中进行治疗、控制、延迟或预防的方法，所述方法包括向所述患者给予治疗有效量的本发明的前药或本发明的药物组合物或其药用盐。
附图说明
图1a：胰岛素-连接物缀合物12a的UPLC色谱图
图1b：胰岛素-连接物缀合物12b的UPLC色谱图
图2显示历时2周的时间在对健康大鼠给予单一皮下剂量的含有6mg胰岛素的测试物品11a后，动物1-10的平均血浆胰岛素浓度(误差棒表示为±由所有10只动物得到的标准偏差，t0值选用给药前的3天)。
图3：历时13天的时间在对健康大鼠给予单一皮下剂量的含有3mg胰岛素的测试物品11da后，动物1-8的平均血浆胰岛素浓度(误差棒表示为±由所有8只动物得到的标准偏差，t0值选用给药前的1天)。
图4：在对糖尿病大鼠(n＝7)给予单一皮下剂量的含有6.4mg胰岛素的测试物品11da后，血浆胰岛素浓度(灰色方块)和血糖水平(黑色圆)(误差棒表示为±由所有7只动物得到的标准偏差，t0值选用给药前的4天)。
图5：在给药后的首24小时的时间内，在对健康大鼠给予单一皮下剂量的8mg/kg测试物品11db后的平均血浆胰岛素水平(爆发分析(burst analysis))。8只大鼠分为两组并且用于药物代谢动力学的血样在两组之间交替采用。两组均未观察到爆发作用(误差棒表示为±由每组所有动物得到的标准偏差，t0值选用给药前的1天)。
图6：在对糖尿病大鼠(n＝8)给予每周一次共3次皮下剂量的8mg/kg的测试物品11da后，四周时间内的血浆胰岛素浓度(灰色方块)和血糖水平(黑色圆)(误差棒表示为±由所有8只动物得到的标准偏差，t0值选用给药前的3天)。
图7：历时13天的时间，在对健康大鼠给予单一皮下注射的配制于测试物品11dc中的12mg/kg胰岛素后动物1-8(分别对于0.3、1h、2和4h值的动物1-4和动物5-8)的平均血浆胰岛素浓度(误差棒表示为+/-由所有8只动物得到的标准偏差，t0值选用给药前的4天)。
图8：胰岛素-连接物-水凝胶11a的胰岛素释放和水凝胶降解的重叠。胰岛素-连接物-水凝胶在pH 7.4和37℃孵育后胰岛素在胰岛素-连接物-水凝胶中的含量(三角形)和骨架部分释放(圆形)的量针对孵育时间进行绘图。
图9显示绘制力与流速(使用30G注射针头)的图。数据点：黑色方块＝乙二醇；黑色三角形＝水；黑色点＝水凝胶胰岛素前药。
具体实施方式
实施例
材料和方法
重组体人胰岛素由Biocon Ltd.，Bangalore，India获得。
氨基4-臂PEG 5kDa由JenKem Technology，Beijing，P.R.China获得。
N-(3-马来酰亚氨基丙基)-21-氨基-4，7，10，13，16，19-六氧杂-二十一碳烷酸NHS酯(Mal-PEG6-NHS)由Celares GmbH，Berlin，Germany获得。
2-氯三苯甲基氯树脂、HATU、N-环己基-碳二亚胺-N′-甲基聚苯乙烯和氨基酸由Merck Biosciences GmbH，Schwalbach/Ts，Germany获得，除非另作说明。Fmoc(NMe)-Asp(OtBu)-OH由Bachem AG，Bubendorf，Switzerland获得。S-三苯甲基-6-巯基己酸购自Polypeptide，Strasbourg，France。所用的氨基酸为L构型，除非另作说明。
所有其它化学试剂由Sigma-ALDRICH Chemie GmbH，Taufkirchen，Germany获得。
固相合成在2-氯三苯甲基氯(TCP)树脂上进行，其中载量为1.3mmol/g。配备有聚丙烯玻璃料的注射器用作为反应容器。
将第一氨基酸载入至树脂根据厂商说明书来进行。
Fmoc脱保护：
为了脱除Fmoc保护基团，将所述树脂与2/2/96(v/v/v)的哌啶/DBU/DMF一起搅动(两次，每次10分钟)并用DMF洗涤(十次)。
Fmoc-Aib-载入的树脂的Fmoc脱保护：
固定的Fmoc-Aib-OH的Fmoc脱保护通过将树脂在4/1(v/v)的DMF/哌啶中在50℃搅拌20分钟(2次)来实现。
2-氯三苯甲基氯树脂的断裂方案：
完成合成后，将树脂用DCM洗涤，真空干燥并用6/4(v/v)的DCM/HFIP处理两次达30分钟。合并洗脱物，将挥发物在氮气流下除去并将所得的粗产物经RP-HPLC纯化。将含有产物的HPLC馏分合并并低压冻干。
使用离子交换树脂(Discovery DSC-SAX，Supelco，USA)将作为TFA盐得到的含有胺的产物转化为相应的盐酸盐。该步骤在如下情况下进行：预期残留的TFA干扰例如随后的偶联反应。
RP-HPLC纯化：
RP-HPLC在与Waters 600HPLC系统和Waters 2487吸光度检测器连接的100x20mm或者100x40mm C18ReproSil-Pur 300ODS-35μ柱(Dr.Maisch，Ammerbuch，Germany)上完成。使用溶液A(0.1％TFA于H2O中)和溶液B(0.1％TFA于乙腈中)的线性梯度。将含有产物的HPLC馏分低压冻干。
快速色谱法：
快速色谱法纯化在来自Biotage AB，Sweden的Isolera One系统上进行，使用Biotage KP-Sil硅胶柱并且使用正庚烷和乙酸乙酯作为洗脱剂。将产物在254nm检测。
对于水凝胶珠子，配备有聚丙烯玻璃料的注射器用作反应容器或者用于洗涤步骤。
分析方法
分析性超高效LC(UPLC)在与来自Thermo Scientific的LTQ OrbitrapDiscovery质谱仪偶联的配备有Waters BEH300C18柱(2.1x50mm，1.7μm粒度)的Waters Acquity系统上进行。
由于PEG起始物质的多分散性，PEG产物的MS显示一系列(CH2CH2O)n部分。为了更易于解释，仅一个单一代表性m/z信号在实施例中给出。胰岛素缀合物的MS报道有代表性同位素且指作四质子加合物[M+4H]4+。
除非另作说明，尺寸排阻色谱(SEC)使用配备有Superdex200 5/150 GL柱(Amersham Bioscience/GE Healthcare)的Amersham Bioscience AEKTAbasic系统进行，所述柱配备有0.45μm入口滤器。20mM磷酸钠、140mM NaCl，pH7.4用作流动相。
实施例1
骨架试剂1g的合成
骨架试剂1g由氨基4-臂PEG50001a根据下述方案合成：
为了合成化合物1b，将氨基4-臂PEG50001a(MW约5200g/mol，5.20g，1.00mmol，盐酸盐)在20mL DMSO(无水)中溶解。加入Boc-Lys(Boc)-OH(2.17g，6.25mmol)在5mL DMSO(无水)中的溶液、EDC HCl(1.15g，6.00mmol)、HOBt·H2O(0.96g，6.25mmol)和可力丁(5.20mL，40mmol)。将反应混合物在RT搅拌30分钟。
将反应混合物用1200mL二氯甲烷稀释并用600mL 0.1N H2SO4(2x)、盐水(1x)、0.1M NaOH(2x)和1/1(v/v)的盐水/水(4x)洗涤。将水层再次用500mL DCM萃取。将有机相经Na2SO4干燥，滤过并蒸发得到6.3g粗产物1b，其为无色油状物。将化合物1b经RP-HPLC纯化。
收率3.85g(59％)无色玻璃状产物1b。
MS：m/z 1294.4＝[M+5H]5+(计算值＝1294.6)。
化合物1c通过将3.40g化合物1b(0.521mmol)在5mL甲醇和9mL 4NHCl于二噁烷中的溶液中的溶液在RT搅拌15分钟来得到。将挥发物真空除去。产物无需进一步纯化即可在下一步中使用。
MS：m/z 1151.9＝[M+5H]5+(计算值＝1152.0)。
为了合成化合物1d，将3.26g化合物1c(0.54mmol)在15mL DMSO(无水)中溶解。加入2.99g Boc-Lys(Boc)-OH(8.64mmol)在15mL DMSO(无水)中的溶液、1.55g EDC HCl(8.1mmol)、1.24g HOBt·H2O(8.1mmol)和5.62mL可力丁(43mmol)。将反应混合物在RT搅拌30分钟。
将反应混合物用800mL DCM稀释并用400mL 0.1N H2SO4(2x)、盐水(1x)、0.1M NaOH(2x)和1/1(v/v)的盐水/水(4x)洗涤。将水层再次用800mLDCM萃取。将有机相用Na2SO4干燥，滤过并蒸发得到玻璃状粗产物。
将产物在DCM中溶解并用冷的(-18℃)乙醚沉淀。该操作重复两次并将沉淀物真空干燥。
收率：4.01g(89％)无色玻璃状产物1d，其无需进一步纯化即可在下一步中使用。
MS：m/z 1405.4＝[M+6H]6+(计算值＝1405.4)。
化合物1e通过将化合物1d(3.96g，0.47mmol)在7mL甲醇和20mL 4NHCl于二噁烷中的溶液中的溶液在RT搅拌15分钟来得到。将挥发物真空除去。产物无需进一步纯化即可在下一步中使用。
MS：m/z 969.6＝[M+7H]7+(计算值＝969.7)。
为了合成化合物1f，将化合物1e(3.55g，0.48mmol)在20mL DMSO(无水)中溶解。加入Boc-Lys(Boc)-OH(5.32g，15.4mmol)在18.8mL DMSO(无水)中的溶液、EDC HCl(2.76g，14.4mmol)、HOBt·H2O(2.20g，14.4mmol)和10.0mL可力丁(76.8mmol)。将反应混合物在RT搅拌60分钟。
将反应混合物用800mL DCM稀释并用400mL 0.1N H2SO4(2x)、盐水(1x)、0.1M NaOH(2x)和1/1(v/v)的盐水/水(4x)洗涤。将水层再次用800mLDCM萃取。将有机相经Na2SO4干燥，滤过并蒸发得到粗产物1f，其为无色油状物。
将产物在DCM中溶解并用冷的(-18℃)乙醚沉淀。该步骤重复两次并将沉淀物真空干燥。
收率4.72g(82％)无色玻璃状产物1f，其无需进一步纯化即可在下一步中使用。
MS：m/z 1505.3＝[M+8H]8+(计算值＝1505.4)。
骨架试剂1g通过将化合物1f(MW约12035g/mol，4.72g，0,39mmol)在20mL甲醇和40mL 4N HCl于二噁烷中的溶液中的溶液在RT搅拌30分钟来得到。将挥发物真空除去。
收率3.91g(100％)，玻璃状产物骨架试剂1g。
MS：m/z 977.2＝[M+9H]9+(计算值＝977.4)。
1g的可替换合成途径
为了合成化合物1b，在45℃向4-臂-PEG5000四胺(1a)(50.0g，10.0mmol)在250mL iPrOH(无水)中的混悬液中加入boc-Lys(boc)-OSu(26.6g，60.0mmol)和DIEA(20.9mL，120mmol)并将混合物搅拌30分钟。
随后，加入正丙基胺(2.48mL，30.0mmol)。5分钟后，将溶液用1000mLMTBE稀释并在-20℃保存过夜(不搅拌)。将约500mL上清液倾出并弃去。加入300mL冷的MTBE并且在振摇1分钟后，将产物通过滤过经玻璃滤器收集并用500mL冷的MTBE洗涤。将产物真空干燥16小时。
收率：65.6g(74％)1b，其为白色块状固体。
MS：m/z 937.4＝[M+7H]7+(计算值＝937.6)。
化合物1c通过将来自前述步骤的化合物1b(48.8g，7.44mmol)在156mL2-丙醇中在40℃搅拌来得到。在搅拌下在1-2分钟内加入196mL 2-丙醇和78.3mL乙酰基氯的混合物。将溶液在40℃搅拌30分钟并冷却至-30℃且保持过夜(不搅拌)。加入100mL冷的MTBE，将混悬液振摇1分钟并在-30℃冷却1小时。将产物通过滤过经玻璃滤器收集并用200mL冷的MTBE洗涤。将产物真空干燥16小时。
收率：38.9g(86％)1c，其为白色粉末状物。
MS：m/z 960.1＝[M+6H]6+(计算值＝960.2)。
为了合成化合物1d，在45℃向来自前述步骤的1c(19.0g，3.14mmol)在80ml 2-丙醇中的混悬液中加入boc-Lys(boc)-OSu(16.7g，37.7mmol)和DIEA(13.1mL，75.4mmol)，并将混合物在45℃搅拌30分钟。随后，加入正丙基胺(1.56mL，18.9mmol)。5分钟后，将溶液用600mL冷的MTBE沉淀并离心(3000min-1，1分钟)。将沉淀物真空干燥1小时并在400mL THF中溶解。加入200mL乙醚并将产物冷却至-30℃且保持16小时(不搅拌)。将混悬液经玻璃滤器滤过并用300mL冷的MTBE洗涤。将产物真空干燥16小时。
收率：21.0g(80％)1d，其为白色固体。
MS：m/z 1405.4＝[M+6H]6+(计算值＝1405.4)。
化合物1e通过将来自前述步骤的化合物1d(15.6g，1.86mmol)溶解在3N HCl于甲醇(81mL，243mmol)中的溶液中并在40℃搅拌90分钟来得到。加入200mL MeOH和700mL iPrOH并将混合物在-30℃保存2小时。为了完成结晶，加入100mL MTBE并将混悬液在-30℃保存过夜。加入250mL冷的MTBE，将混悬液振摇1分钟并经玻璃滤器滤过并用100mL冷的MTBE洗涤。将产物真空干燥。
收率：13.2g(96％)1e，其为白色粉末状物。
MS：m/z 679.1＝[M+10H]10+(计算值＝679.1)。
为了合成化合物1f，在45℃向来自前述步骤的1e(8.22g，1.12mmol)在165ml 2-丙醇中的混悬液中加入boc-Lys(boc)-OSu(11.9g，26.8mmol)和DIEA(9.34mL，53.6mmol)并将混合物搅拌30分钟。随后，加入正丙基胺(1.47mL，17.9mmol)。5分钟后，将溶液冷却至-18℃且保持2小时，然后加入165mL冷的MTBE，将混悬液振摇1分钟并经玻璃滤器滤过。随后，将滤饼用4x 200mL冷的MTBE/iPrOH(4∶1)和1x 200mL冷的MTBE洗涤。将产物真空干燥16小时。
收率：12.8g，MW(90％)1f，其为淡黄色块状固体。
MS：m/z 1505.3＝[M+8H]8+(计算值＝1505.4)。
骨架试剂1g通过将4枝PEG5kDa(-LysLys2Lys4(boc)8)4(1f)(15.5g，1.29mmol)在30mL MeOH中溶解并冷却至0℃来得到。3分钟内加入4NHCl在二噁烷(120mL，480mmol，冷却至0℃)中的溶液并移去冰浴。20分钟后，15分钟内加入3N HCl在甲醇(200mL，600mmol，冷却至0℃)中的溶液，并将溶液在室温搅拌10分钟。将产物溶液用480mL冷的MTBE沉淀并在3000rpm离心1分钟。将沉淀物真空干燥1小时并再次在90mL MeOH中溶解，用240mL冷的MTBE沉淀并将混悬液在3000rpm离心1分钟。将产物1g真空干燥。
收率：11.5g(89％)，其为淡黄色薄片。
MS：m/z 1104.9＝[M+8H]8+(计算值＝1104.9)。
实施例2
交联试剂2d的合成
交联试剂2d由己二酸一苄酯(English，Arthur R.et al.，Journal ofMedicinal Chemistry，1990，33(1)，344-347)和PEG2000根据下述方案来制备：
将PEG 2000(2a)(11.0g，5.5mmol)和己二酸苄酯半酯(4.8g，20.6mmol)在二氯甲烷(90.0mL)中的溶液冷却至0℃。加入二环己基碳二亚胺(4.47g，21.7mmol)，接着加入催化量的DMAP(5mg)并将溶液搅拌且使其达到室温且保持过夜(12小时)。将烧瓶在+4℃保存5小时。将固体滤过并通过真空蒸馏将溶剂完全除去。将残留物在1000mL 1/1(v/v)的乙醚/乙酸乙酯中溶解并在RT保存2小时，同时形成少量的薄片状固体。将固体通过滤过经填料除去。将溶液在密闭烧瓶中在-30℃冰箱中保存12小时直到结晶完成。将晶状产物经玻璃料滤过并用冷的乙醚(-30℃)洗涤。将滤饼真空干燥。收率：11.6g(86％)2b，其为无色固体。产物无需进一步纯化即可在下一步中使用。
MS：m/z 813.1＝[M+3H]3+(计算值＝813.3)。
在500mL玻璃高压釜中，将PEG2000-二-己二酸-二-苄酯2b(13.3g，5.5mmol)在乙酸乙酯(180mL)中溶解并加入10％钯/炭(0.4g)。将溶液在6巴、40℃氢化直到氢气消耗已经停止(5-12小时)。将催化剂通过滤过经填料除去并将溶剂真空蒸发。收率：12.3g(定量)2c，其为浅黄色油状物。产物无需进一步纯化即可在下一步中使用。
MS：m/z 753.1＝[M+3H]3+(计算值＝753.2)。
将PEG2000-二-己二酸半酯2c(9.43g，4.18mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(1.92g，16.7mmol)和二环己基碳二亚胺(3.44g，16.7mmol)在75mL DCM(无水)中的溶液在室温搅拌过夜。将反应混合物冷却至0℃并将沉淀物滤出。蒸发DCM并将残留物由THF重结晶。
收率：8.73g(85％)交联试剂2d，其为无色固体。
MS：m/z 817.8＝[M+3H]3+(计算值＝817.9g/mol)。
实施例3
含有游离氨基的水凝胶珠子(3)和(3a)的制备
将275mg 1g和866mg 2d在14mL DMSO中的溶液加入至100mgArlacel P135(Croda International Plc)在60mL庚烷中的溶液中。将混合物在700rpm在25℃用常用金属搅拌器搅拌10分钟以形成混悬液。加入1.0mLN，N，N’，N’-四甲基-乙二胺以实现聚合。2小时后，搅拌器速度降低至400rpm并将混合物搅拌额外的16小时。加入1.5mL乙酸然后在10分钟后，加入50mL水。5分钟后，停止搅拌器并将水相排出。
对于珠子大小分级，将水-水凝胶混悬液在75、50、40、32和20μm目钢筛上进行湿筛。汇集保留在32、40和50μm筛上的珠子级分并用水洗涤3次，用乙醇洗涤10次并在0.1毫巴干燥16小时，得到3，其为白色粉末状物。
3a如3所述制备，除了使用1200mg 1g、3840mg 2d、28.6ml DMSO、425mgArlacel P135、100mL庚烷和4.3ml TMEDA之外。对于后处理，加入6.6ml乙酸然后在10分钟后，加入50mL水和50mL饱和氯化钠水溶液。
水凝胶的氨基含量通过如下确定：将fmoc-氨基酸与水凝胶上的游离氨基结合且随后确定fmoc，如Gude，M.，J.Ryf，et al.(2002)Letters in Peptide Science 9(4)：203-206所述。
3和3a的氨基含量确定为0.11至0.16mmol/g。
实施例4
马来酰亚胺官能化水凝胶珠子(4)、(4a)和(4aa)的制备以及马来酰亚胺取代的确定
Mal-PEG6-NHS
将600mg Mal-PEG6-NHS(1.0mmol)在4.5mL 2/1(v/v)的乙腈/水中的溶液加入至200mg干燥水凝胶珠子3中。加入500μL磷酸钠缓冲液(pH 7.4，0.5M)并将混悬液在室温振摇30分钟。将珠子4分别用2/1(v/v)的乙腈/水、甲醇和1/1/0.001(v/v/v/)的乙腈/水/TFA洗涤五次。
4a如上所述合成，除了使用3a代替3。
可替换地，水凝胶珠子3a预先用99/1(v/v)的DMSO/DIEA洗涤，用DMSO洗涤并与Mal-PEG6-NHS(2.0当量，相对于水凝胶上的氨基的理论量而言)在DMSO中的溶液孵育45分钟。珠子4aa用DMSO洗涤两次并用pH 3.0琥珀酸盐(20mM，1mM EDTA，0.01％Tween-20)洗涤三次。将样品在RT在pH 6.0磷酸钠(50mM，50mM乙醇胺，0.01％Tween-20)中孵育1小时并用pH 3.0琥珀酸钠(20mM，1mM EDTA，0.01％Tween-20)洗涤五次。
为了确定马来酰亚胺含量，将水凝胶珠子4、4a或者4aa的等分样分别低压冻干并称重。将水凝胶珠子4、4a或者4aa的另外的等分样分别与过量的巯基乙醇(于50mM磷酸钠缓冲液中，30分钟在RT)反应，并且巯基乙醇的消耗通过Ellman测试(Ellman，G.L. et al.，Biochem.Pharmacol.，1961，7，88-95)进行检测。马来酰亚胺含量确定为0.11至0.13mmol/g干燥水凝胶。
实施例5
连接物试剂5d的合成
连接物试剂5d根据下述方案合成：
连接物试剂中间体5a的合成：
将4-甲氧基三苯甲基氯(3g，9.71mmol)在DCM(20mL)中溶解并逐滴加入至乙二胺(6.5mL，97.1mmol)在DCM(20mL)中的溶液中。2小时后，将溶液倒入乙醚(300mL)中并用30/1(v/v)的盐水/0.1m NaOH溶液(各自50ml)洗涤三次且用盐水(50mL)洗涤一次。将有机相经Na2SO4干燥并将挥发物减压除去得到Mmt-保护的中间体(3.18g，9.56mmol)。
将Mmt-保护的中间体(3.18g，9.56mmol)在无水DCM(30mL)中溶解。加入6-(三苯甲基巯基)-己酸(4.48g，11.47mmol)、PyBOP(5.67g，11.47mmol)和DIEA(5.0mL，28.68mmol)并将混合物在RT振摇30分钟。将溶液用乙醚(250mL)稀释并用30/1(v/v)的盐水/0.1m NaOH溶液(各自50ml)洗涤三次且用盐水(50mL)洗涤一次。将有机相经Na2SO4干燥并将挥发物减压除去。将5a经快速色谱法纯化。
收率：5.69g(8.09mmol)。
MS：m/z 705.4＝[M+H]+(计算值＝705.0)。
连接物试剂中间体5b的合成：
向5a(3.19g，4.53mmol)在无水THF(50mL)中的溶液中加入BH3·THF(1M溶液，8.5mL，8.5mmol)并将溶液在RT搅拌16小时。加入另外的BH3·THF(1M溶液，14mL，14mmol)并在RT搅拌16小时。将反应混合物通过加入甲醇(8.5mL)进行淬灭，加入N，N-二甲基-乙二胺(3mL，27.2mmol)并将溶液加热至回流并搅拌三小时。将混合物在RT用乙酸乙酯(300mL)稀释，用饱和Na2CO3水溶液(2x100mL)和饱和NaHCO3水溶液(2x100mL)洗涤。将有机相经Na2SO4干燥并将挥发物减压蒸发得到粗的胺中间体(3.22g)。
将胺中间体在DCM(5mL)中溶解，加入Boc2O(2.97g，13.69mmol)在DCM(5mL)中的溶液和DIEA(3.95mL，22.65mmol)并将混合物在RT振摇30分钟。将混合物经快速色谱法纯化得到粗的Boc-和Mmt-保护的中间体(3g)。
MS：m/z 791.4＝[M+H]+，519.3＝[M-Mmt+H]+(计算值＝791.1)。
将0.4M盐酸水溶液(48mL)加入至Boc-和Mmt-保护的中间体在乙腈(45mL)中的溶液中。将混合物用乙腈(10mL)稀释并在RT搅拌一小时。随后，通过加入5M NaOH溶液将反应混合物的pH值调节为5.5，将乙腈减压除去并将水溶液用DCM(4x100mL)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥并将挥发物减压除去。粗的5b无需进一步纯化即可使用。
收率：2.52g(3.19mmol)。
MS：m/z 519.3＝[M+H]+(MW计算值＝518.8g/mol)。
连接物试剂中间体5c的合成：
将5b(780mg，0.98mmol，～65％纯度)和NaCNBH3(128mg，1.97mmol)在无水甲醇(13mL)中溶解。加入2，4-二甲氧基苯甲醛(195mg，1.17mmol)在DCM(2mL)中的溶液，并将混合物在RT搅拌2小时。将溶剂减压蒸发，并将粗产物在DCM中溶解并用饱和NaCO3溶液洗涤。将水相用DCM萃取三次，并将合并的有机相用盐水洗涤，经MgSO4干燥并减压浓缩。将5c经快速色谱法纯化(使用DCM和MeOH作为洗脱剂)。
收率：343mg(0.512mmol)。
MS：m/z 669.37＝[M+H]+，(计算值＝669.95)。
连接物试剂5d的合成：
将Fmoc-Aib-载入的TCP树脂(980mg，～0.9mmol)用DMF/哌啶脱保护，用DMF(5次)和DCM(6次)洗涤并真空干燥。将树脂用氯甲酸对硝基苯酯(364mg，1.81mmol)和可力丁(398μL，3.0mmol)在无水THF(6mL)中的溶液处理并振摇30分钟。将试剂溶液通过滤过除去并将树脂用THF(5次)洗涤，之后加入胺5c(490mg，0.7mmol)和DIEA(1.23mL，7.1mmol)在无水THF(6mL)中的溶液。在RT振摇18小时后，将试剂溶液通过滤过除去并将树脂用DCM(5次)洗涤。将连接物试剂从树脂上断裂并经RP-HPLC纯化。通过加入饱和NaHCO3水溶液使产物馏分回到pH 6并减压浓缩。将所得的淤浆在饱和NaCl水溶液和DCM之间分配，并将水层用DCM萃取。将合并的有机馏分浓缩干燥得到连接物试剂5d。
收率：230mg，(0.29mmol)。
MS m/z 798.41＝[M+H]+，(计算值＝798.1)。
实施例6
连接物试剂6c的合成：
连接物试剂6c根据下述方案合成：
胺6a的合成：
将三苯基甲硫醇(11.90g，43.08mmol)在DMSO(40mL)中混悬。加入DBU(7.41mL，49.55mmol)和6-溴己基酞酰亚胺(13.32g，42.94mmol)，并使混合物反应约15分钟。将反应混合物在乙酸乙酯(700mL)和0.1M HCl(200mL)之间分配。将水相用乙酸乙酯(3x 50mL)萃取，并将合并的有机馏分用饱和NaHCO3(80mL)和盐水(80mL)洗涤，经MgSO4干燥，滤过并浓缩。将粗的黄色油状物由正庚烷/乙酸乙酯重结晶。得到中间体6-(S-三苯甲基-)巯基己基酞酰亚胺，其为白色固体(13.3g，26.4mmol，62％)。
将6-(S-三苯甲基-)巯基己基酞酰亚胺(14.27g，28.2mmol)在乙醇(250mL)中混悬。加入肼水合物(3.45mL，70.5mmol)，并将混合物加热至回流且保持2小时。将混合物滤过并将滤液真空浓缩。将氯仿(180mL)加入至残留的油状物中并将所得的混悬液在室温搅拌1.5小时。将混合物滤过，并将滤液用水(60mL)和盐水(60mL)萃取，经MgSO4干燥并浓缩得到粗6-(三苯甲基巯基)-己基胺(10.10g，26.87mmol，95％)。
MS：m/z 376.22＝[M+H]+，(计算值＝376.20)。
将DIEA(1.41mL，8.11mmol)和氯甲酸正丁酯(908μL，7.14mmol，于1mL THF中)加入至冷的(0℃)6-(三苯甲基巯基)-己基胺(2.44g，6.49mmol)在THF(50mL)中的溶液中。30分钟后加入LiAlH4(1M于THF中，9.74mL，9.47mmol)，并将混合物加热至回流且保持90分钟。加入水、3.75M NaOH水溶液以及水导致形成沉淀物，将其经滤过从混合物中除去。将滤液真空浓缩得到6a。
收率：2.41g(6.20mmol)。
MS：m/z 390.22＝[M+H]+，(计算值＝390.22)。
连接物试剂中间体6b的合成：
向6a(2.1g，5.31mmol)的溶液中加入2-溴乙基酞酰亚胺(1.96g，7.7mmol)和K2CO3(1.09g，7.9mmol)并将混合物加热至回流且保持6小时。滤过并浓缩后，将粗的混合物在乙酸乙酯和饱和NaHCO3水溶液之间分配。将粗的中间体(2-(N-甲基-N-(6-三苯甲基巯基己基-)氨基-)乙基)酞酰亚胺经快速色谱法纯化。
收率：1.23g(2.18mmol)。
MS：m/z：563.27＝[M+H]+，(计算值＝563.27)。
向(2-(N-甲基-N-(6-三苯甲基巯基己基-)氨基-)乙基)酞酰亚胺(672mg，1.19mmol)在乙醇(12mL)中的溶液中加入肼一水合物(208μL，4.17mmol)，并将混合物加热至回流且保持1小时。将反应混合物滤过，浓缩并将N-(2-氨基乙基-)-N-甲基-N-(6-三苯甲基巯基己基-)胺经RP-HPLC纯化。
收率：624mg(0.944mmol)。
MS：m/z 433.27＝[M+H]+，(计算值＝433.26)。
向N-(2-氨基乙基-)-N-甲基-N-(6-三苯甲基巯基己基-)胺(151mg，0.229mmol)和NaCNBH3(30mg，0.463mmol)在无水MeOH(6mL)中的溶液中加入2，4-二甲氧基苯甲醛在无水CH2Cl2(0.6μL)中的溶液。在RT搅拌1小时后，将反应混合物浓缩，重新在2mL的1/9(v/v)水/乙腈中溶解并将6b经RP-HPLC纯化。
收率：177mg(0.219mmol)。
MS：m/z 583.33＝[M+H]+，(计算值＝583.33)。
连接物试剂6c的合成：
连接物试剂6c由Fmoc-Aib-载入的树脂(704mg，～0.6mmol)如5d所述制备，除了使用胺6b(作为TFA盐，430mg，0.53mmol)代替5c。
收率：285mg，(0.330mmol)。
MS：m/z 712.37＝[M+H]+，(计算值＝712.37)。
实施例7
连接物试剂7f的合成
连接物试剂7f根据下述方案合成：
向冷的(0℃)N-甲基-N-boc-乙二胺(0.5mL，2.79mmol)和NaCNBH3(140mg，2.23mmol)在MeOH(10mL)和乙酸(0.5mL)中的溶液中加入2，4，6-三甲氧基苯甲醛(0.547mg，2.79mmol)在EtOH(10mL)中的溶液。将混合物在RT搅拌2小时，用2M HCl(1mL)酸化并用饱和Na2CO3水溶液(50mL)中和。蒸发所有挥发物，将所得的含水淤浆用DCM萃取并将有机馏分浓缩得到N-甲基-N-boc-N’-tmob-乙二胺(7a)，其为粗油状物，将其经RP-HPLC纯化。
收率：593mg(1.52mmol)
MS：m/z 377.35＝[M+Na]+，(计算值＝377.14)。
将N-Fmoc-N-Me-Asp(OtBu)-OH(225mg，0.529mmol)在DMF(3mL)中溶解并加入7a(300mg，0.847mmol)、HATU(201mg，0.529mmol)和可力丁(0.48mL，3.70mmol)。将混合物在RT搅拌2小时得到7b。对于fmoc脱保护，加入哌啶(0.22mL，2.16mmol)并继续搅拌1小时。加入乙酸(1mL)，并将7c经RP-HLPC纯化。
收率：285mg(0.436mmol，其为TFA盐)
MS：m/z 562.54＝[M+Na]+，(计算值＝562.67)。
将6-三苯甲基巯基己酸(0.847g，2.17mmol)在无水DMF(7mL)中溶解。加入HATU(0.825g，2.17mmol)、可力丁(0.8mL，6.1mmol)和7c(0.78g，1.44mmol)。将反应混合物在RT搅拌60分钟，用AcOH(1mL)酸化并经RP-HPLC纯化。将产物馏分用饱和NaHCO3水溶液中和并浓缩。将残留的水相用DCM萃取并在蒸发溶剂后分离7d。
收率：1.4g(94％)
MS：m/z 934.7＝[M+Na]+，(计算值＝934.5)。
向7d(1.40mg，1.53mmol)在MeOH(12mL)和H2O(2mL)中的溶液中加入LiOH(250mg，10.4mmol)并将反应混合物在70℃搅拌14小时。将混合物用AcOH(0.8mL)酸化并将7e经RP-HPLC纯化。将产物馏分用饱和NaHCO3水溶液中和并浓缩。将水相用DCM萃取并在蒸发溶剂后分离7e。
收率：780mg(60％)
MS：m/z 878.8＝[M+Na]+，(计算值＝878.40)。
向7e(170mg，0.198mmol)在无水DCM(4mL)中的溶液中加入DCC(123mg，0.59mmol)和N-羟基-琥珀酰亚胺(114mg，0.99mmol)，并将反应混合物在RT搅拌1小时。将混合物滤过，并将滤液用0.5mL AcOH酸化并将7f经RP-HPLC纯化。将产物馏分用饱和NaHCO3水溶液中和并浓缩。将残留的水相用DCM萃取并在蒸发溶剂后分离7f。
收率：154mg(0.161mmol)
MS：m/z 953.4＝[M+H]+，(计算值＝953.43)。
可替换地，连接物试剂7f根据下述方法合成：
可替换的反应方案：
向N-甲基-N-boc-乙二胺(2g，11.48mmol)和NaCNBH3(819mg，12.63mmol)在MeOH(20mL)中的溶液中分批加入2，4，6-三甲氧基苯甲醛(2.08mg，10.61mmol)。将混合物在RT搅拌90分钟，用3M HCl(4mL)酸化并再搅拌15分钟。将反应混合物加入至饱和NaHCO3溶液(200mL)中并用CH2Cl2萃取五次。将合并的有机相经Na2SO4干燥并将溶剂真空蒸发。将所得的N-甲基-N-boc-N’-tmob-乙二胺(7a)在高真空完全干燥并且无需进一步纯化即可在下一反应步骤中使用。
收率：3.76g(11.48mmol，89％纯度，7a：两个Tmob保护的产物＝8∶1)
MS：m/z 355.22＝[M+H]+，(计算值＝354.21)。
向7a(2g，5.65mmol)在CH2Cl2(24ml)中的溶液中加入COMU(4.84g，11.3mmol)、N-Fmoc-N-Me-Asp(OBn)-OH(2.08g，4.52mmol)和可力丁(2.65mL，20.34mmol)。将反应混合物在RT搅拌3小时，用CH2Cl2(250mL)稀释并用0.1M H2SO4(100ml)洗涤三次并用盐水(100ml)洗涤三次。将水相再次用CH2Cl2(100ml)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，滤过并将残留物浓缩为24mL的体积。使用快速色谱法纯化7g。
收率：5.31g(148％，6.66mmol)
MS：m/z 796.38＝[M+H]+，(计算值＝795.37)。
向7g[5.31g，最大4.51mmol，N-Fmoc-N-Me-Asp(OBn)-OH]在THF(60mL)中的溶液中加入DBU(1.8mL，3％v/v)。将溶液在RT搅拌12分钟，用CH2Cl2(400ml)稀释并用0.1M H2SO4(150ml)洗涤三次并用盐水(150ml)洗涤三次。将水相再次用CH2Cl2(100ml)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥并滤过。蒸发溶剂后分离7h并且无需进一步纯化即可在下一步反应中使用。
MS：m/z 574.31＝[M+H]+，(计算值＝573.30)。
将7h(5.31g，4.51mmol，粗品)在乙腈(26mL)中溶解并加入COMU(3.87g，9.04mmol)、6-三苯甲基巯基己酸(2.12g，5.42mmol)和可力丁(2.35mL，18.08mmol)。将反应混合物在RT搅拌4小时，用CH2Cl2(400ml)稀释并用0.1M H2SO4(100ml)洗涤三次并用盐水(100ml)洗涤三次。将水相再次用CH2Cl2(100ml)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，滤过并在蒸发溶剂后分离7i。使用快速色谱法纯化产物7i。
收率：2.63g(62％，94％纯度)
MS：m/z 856.41＝[M+H]+，(计算值＝855.41)。
向7i(2.63g，2.78mmol)在i-PrOH(33mL)和H2O(11mL)中的溶液中加入LiOH(267mg，11.12mmol)并将反应混合物在RT搅拌70分钟。将混合物用CH2Cl2(200ml)稀释并用0.1M H2SO4(50ml)洗涤三次并用盐水(50ml)洗涤三次。将水相再次用CH2Cl2(100ml)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，滤过并在蒸发溶剂后分离7e。使用快速色谱法纯化7j。
收率：2.1g(88％)
MS：m/z 878.4＝[M+Na]+，(计算值＝878.40)。
向7e(170mg，0.198mmol)在无水DCM(4mL)中的溶液中加入DCC(123mg，0.59mmol)和催化量的DMAP。5分钟后，加入N-羟基-琥珀酰亚胺(114mg，0.99mmol)并将反应混合物在RT搅拌1小时。将反应混合物滤过，将溶剂真空除去并将残留物在90％乙腈和0.1％TFA(3.4ml)中吸收。将粗的混合物经RP-HPLC纯化。将产物馏分用0.5M pH 7.4磷酸盐缓冲液中和并浓缩。将残留的水相用DCM萃取并在蒸发溶剂后分离7f。
收率：154mg(81％)
MS：m/z 953.4＝[M+H]+，(计算值＝953.43)。
实施例8
NαA1-胰岛素-连接物缀合物8b和8c的合成
受保护的胰岛素连接物缀合物8a的合成
将连接物试剂5d在DCM(20mg/mL)中溶解并用N-环己基-碳二亚胺-N′-甲基聚苯乙烯-树脂(1.9mmol/g，10当量)活化1小时。将活化的连接物试剂溶液加入至胰岛素(1.2当量)和DIEA(3.5当量)在DMSO(100mg胰岛素/mL)中的溶液中，并将混合物在RT振摇45分钟。将溶液用乙酸酸化，将DCM减压蒸发，并将NαA1-缀合物保护的胰岛素-连接物缀合物8a经RP-HPLC纯化。
将低压冻干的8a用HFIP/TFA/水/三乙基甲硅烷的90/10/2/2(v/v/v/v)混合物(2mL/100mg的8a)在RT处理45分钟。将反应混合物用水稀释，并将所有挥发物在氮气流下除去。将NαA1-结合的胰岛素-连接物缀合物8b经RP-HPLC纯化。
8b：
收率：由62mg(0.078mmol)连接物5d得到139mg(0.023mmol)
MS：m/z 1524.45＝[M+4H]4+(计算值＝1524.75)。
NαA1-结合的胰岛素-连接物缀合物8c如8b所述合成，除了使用6c(72mg，0.101mmol)代替5d之外。
8c：
收率：237mg(0.039mmol)
MS：m/z 1528.23＝[M+4H]4+(计算值＝1528.28)。
实施例9
NαB1-胰岛素-连接物缀合物9的合成
双重保护的Nα-boc-GlyA1-Nε-boc-LysB29-胰岛素如前所述(J.Markussen，J.F.C.Wiberg，L.J.Biol.Chem.1991，266，18814-18818)制备。
将连接物试剂5d(0.04mmol)在DCM(0.5mL)中溶解并用N-环己基-碳二亚胺-N′-甲基聚苯乙烯树脂(0.205mmol)在RT活化2小时。将所得的活化的连接物试剂溶液加入至二-boc-保护的胰岛素(24mg，0.004mmol)和DIEA(5μL，0.0229mmol)的溶液中并在RT振摇1小时。将反应混合物用100μL乙酸酸化并将受保护的胰岛素-连接物缀合物经RP-HPLC纯化。
收率：5mg(0.00075mmol)。
MS：m/z 1660.27＝[M+4H]4+(计算值＝1660.43)。
将低压冻干的受保护的胰岛素-连接物缀合物用1mL 90/10/2/2(v/v/v/v)的HFIP/TFA/水/TES在RT处理45分钟。将反应混合物用0.5mL水稀释并将所有的挥发物在氮气流下除去。将NαB1-结合的胰岛素-连接物缀合物9经RP-HPLC纯化。
收率：4mg(0.0007mmol)
MS：m/z 1524.46＝[M+4H]4+(计算值＝1524.75)。
实施例10
NεB29-胰岛素连接物缀合物10的合成
将胰岛素(644mg，0.111mmol)在6.5mL DMSO中溶解。加入3mL冷的(4℃)0.5M硼酸钠缓冲液(pH 8.5)和7f(70mg，0.073mmol)在2.5mL DMSO中的溶液并将混合物在RT搅拌5分钟。加入400μL AcOH并将受保护的胰岛素缀合物经RP HPLC纯化。
收率：172mg(0.025mmol)
MS：m/z 1662.27＝[M+4H]4+(计算值＝1662.48)。
保护基团的除去通过将低压冻干的产物馏分用6mL 90/10/2/2(v/v/v/v)的HFIP/TFA/TES/水在RT处理1小时来完成。将NεB29-结合的胰岛素-连接物缀合物10经RP HPLC纯化。
收率：143mg(0.023mmol)
MS：m/z 1531.46＝[M+4H]4+(计算值＝1531.71)。
实施例11
胰岛素-连接物-水凝胶11a、11b、11c、11d、11da、11db和11dc的制备
将干燥的马来酰亚胺官能化水凝胶4(82mg，10.3μmol马来酰亚氨基)填充至配备有滤器玻璃料的注射器中。加入胰岛素-连接物-硫醇8b(27.8mg，4.6μmol)在1.0mL乙腈/水/TFA 1/1/0.001(v/v/v)中的溶液并将混悬液在RT孵育5分钟。加入乙酸盐缓冲液(0.4mL，pH 4.8，1.0M)并将样品在RT孵育1小时。硫醇的消耗经Ellman测试监测。将水凝胶用1/0.43/0.001(v/v/v)的乙腈/水/TFA洗涤10次并用1/1/0.2/0.25(v/v/v/v)的1.0M肌氨酸pH 7.4/乙腈/0.5M磷酸盐缓冲液pH 7.4/水洗涤两次。最后，将水凝胶在肌氨酸溶液中混悬并在RT孵育2小时。
将胰岛素-连接物-水凝胶11a用1/1/0.001(v/v/v)的乙腈/水/TFA洗涤10次并在4℃保存。
胰岛素含量通过将胰岛素-连接物-水凝胶的等分样在还原条件下在pH12的全部水解且随后经RP-HPLC的胰岛素A-链和胰岛素B-链定量来确定。
11a的胰岛素载入量：175mg胰岛素/g胰岛素-连接物-水凝胶
11a在10mM乙酸钠缓冲液pH 5、135mM氯化钠中的混悬液中的胰岛素的量：12mg胰岛素/1ml 11a混悬液。
11b、11c和11d如上所述制备，除了分别使用8c、9和10代替8b。
11da如上所述制备，除了使用10和4a代替8b和4。
11db如下制备：将马来酰亚胺官能化的水凝胶4a在pH 2.5HCl，0.01％Tween-20(5.0mL，119μmol马来酰亚氨基)中的混悬液填充至配备有滤器的注射器中。加入胰岛素-连接物-硫醇10(166mg，24.4μmol)在8.0mL HCl pH2.5，0.01％Tween-20中的溶液并将混悬液在RT孵育5分钟。加入琥珀酸钠缓冲液(3.9mL，pH 4.0，150mM；1mM EDTA，0.01％Tween-20)以得到pH 3.6并将样品在RT孵育90分钟。硫醇的消耗经Ellman测试监测。将水凝胶用琥珀酸钠缓冲液(pH 3.0，50mM；1mM EDTA，0.01％Tween-20)洗涤10次并用含有200mM乙酰基半胱氨酸的琥珀酸钠缓冲液(pH 3.0，50mM；1mM EDTA，0.01％Tween-20)洗涤3次。最后，将水凝胶在含有乙酰基半胱氨酸的缓冲液中混悬并在RT孵育1小时。
将胰岛素-连接物-水凝胶11db用琥珀酸盐缓冲液(pH 3.0，50mM；1mMEDTA，0.01％Tween-20)洗涤10次并用乙酸钠缓冲液(pH 5.0，10mM；130mM NaCl，0.01％Tween-20)洗涤8次。
11db的胰岛素载入量：6.12mg胰岛素/mL胰岛素-连接物-水凝胶混悬液。
11dc如下制备：将马来酰亚胺官能化的水凝胶4a在pH 2.5HCl，0.01％Tween-20(58.3mL，958μmol马来酰亚氨基)中的混悬液加入至固相合成反应器中。将胰岛素-连接物-硫醇10(117mL，460μmol)在2.5HCl，0.01％Tween-20中的溶液加入至4a。将混悬液在RT孵育5分钟。加入琥珀酸盐缓冲液(4.8mL，pH 4.0，150mM；1mM EDTA，0.01％Tween-20)以得到pH 3.6并将混悬液在RT孵育90分钟。
硫醇的消耗经Ellman测试进行监测。将水凝胶用琥珀酸盐缓冲液(pH 3.0，50mM；1mM EDTA，0.01％Tween-20)洗涤10次并用含有10mM巯基乙醇的琥珀酸盐缓冲液(pH 3.0，50mM；1mM EDTA，0.01％Tween-20)洗涤2次。最后，将水凝胶在含有巯基乙醇的缓冲液中混悬并在RT孵育3小时。
将胰岛素-连接物-水凝胶11dc用琥珀酸盐缓冲液(pH 3.0，50mM；1mMEDTA，0.01％Tween-20)洗涤10次并用琥珀酸盐/Tris缓冲液(pH 5.0，10mM；85g/L海藻糖，0.01％Tween-20)洗涤6次。
11dc的胰岛素载入量：18.7mg胰岛素/mL胰岛素-连接物-水凝胶混悬液。
可替换地，可使用马来酰亚胺衍生的水凝胶微粒4aa代替4a。
实施例12
体外释放动力学
分别将胰岛素-连接物-水凝胶11a、11b、11c和11d(含有约1mg胰岛素的胰岛素-连接物-水凝胶)在2ml 60mM磷酸钠，3mM EDTA，0.01％Tween-20，pH 7.4中混悬，并在37℃孵育。将混悬液在时间间隔离心并将上清液经RP-HPLC(215nm)和ESI-MS分析。将与释放的胰岛素相关的UV-信号进行整合且针对孵育时间进行绘图。
应用曲线拟合软件来评估释放的相应的半衰期。
分别针对11a、11b、11c和11d进行确定16天、10天、30天和14天的体外半衰期。
可替换地，将胰岛素-连接物-水凝胶11db转移至配备有滤器的注射器中，于6ml 60mM磷酸钠、3mM EDTA、0.01％Tween-20、pH 7.4中混悬，并在37℃孵育。在确定的时间点，交换上清液并将释放的胰岛素经RP-HPLC在215nm定量。将释放的胰岛素的量针对孵育时间进行绘图。应用曲线拟合软件且针对11db确定体外半衰期为15天。
可替换地，将胰岛素-连接物-水凝胶11db填充在色谱柱上并置于温度控制培养箱(37℃)中。将磷酸钠(pH 7.4，60mM；3mM EDTA，0.01％Tween-20)泵送通过柱(恒定流速为0.25mL/h(额定))并且在培养箱外进行收集。在确定的时间点，将溶液经RP-HPLC在215nm分析。将释放的胰岛素的量针对孵育时间进行绘图。应用曲线拟合软件且针对11db确定体外半衰期为13天。
实施例13
胰岛素的LysB29-连接物缀合物(12a)和赖脯胰岛素的LysB28-连接物缀合物(12b)的合成：
胰岛素的LysB29-连接物缀合物(12a)的合成
将1.2g(0.206mmol，0.85当量)胰岛素在RT在DMSO中溶解。30分钟后，将溶液冷却至0℃，同时历时4.40分钟的时间加入硼酸盐缓冲液(0.5M，pH 8.5，21.6ml)。溶液的温度保持在25和28℃之间。历时3分钟的时间、非时间变化地加入228mg(0.239mmol，1当量)7f在40ml DMSO中的溶液。移去冰浴并将反应混合物在RT搅拌5分钟。将反应混合物通过加入70mLMeCN/H2O(1∶1，0.1％TFA)和400μl AcOH进行淬灭。将12a经RP HPLC(溶剂A：含有0.1％TFA的H2O，溶剂B：含有0.1％TFA的MeCN，梯度：30-80％B，历时14分钟，流速：40ml/min)纯化。
UPLC分析(RP HPLC纯化前)的区域选择性：0.70％与胰岛素的GlyA1连接的7f以及76.2％与胰岛素的LysB29连接的7f(参见图1a)。
收率：862mg (TFA-盐，60％)。
MS[M+H]1/4 +＝1662.25g/mol((MW+H)1/4计算值＝1662.35g/mol)。
赖脯胰岛素的LysB28-连接物缀合物(12b)的合成
将0.347g(0.059mmol，0.85当量)赖脯胰岛素在RT在6ml DMSO中溶解。30分钟后，将溶液冷却至0℃，同时历时1.40分钟的时间加入硼酸盐缓冲液(0.5M，pH 8.5，5.64ml)。溶液的温度保持在25和30℃之间。历时2分钟的时间、非时间变化地加入67mg(0.070mmol，1当量)7f在8ml DMSO中的溶液。移去冰浴并将反应混合物在RT搅拌5分钟。将反应混合物通过加入20mL MeCN/H2O(1∶1，0.1％TFA)和1ml AcOH进行淬灭。将12b经RPHPLC(溶剂A：含有0.1％TFA的H2O，溶剂B：含有0.1％TFA的MeCN，梯度：30-80％B，历时14分钟，流速：40ml/min)纯化。
UPLC分析(RP HPLC纯化前)的区域选择性：1.3％的产物为与赖脯胰岛素的GlyA1连接的7f，76.7％的产物为与赖脯胰岛素的LysB28连接的7f(参见图1b)。
收率：305mg(TFA-盐，72％)。
MS[M+H]1/4 +＝1662.25g/mol((MW+H)1/4计算值＝1662.35g/mol)。
实施例14
大鼠的药物代谢动力学研究
11a的药物代谢动力学通过在将单一剂量皮下施用至大鼠后测量血浆胰岛素浓度来确定。
由10只雄性Wistar大鼠(200-250g)构成的一组用于研究历时14天的血浆胰岛素水平。各只动物接受含有6mg胰岛素(12mg胰岛素/ml)的500μL的11a在乙酸盐缓冲液pH 5中的混悬液的单一皮下注射。在每只动物和每个时间点舌下抽取200μL血液以获得100μL肝素锂血浆。在施用前以及在注射后4小时和1、2、3、4、7、9、11和14天后收集样品。血液抽取后，血浆样品在15分钟内冷冻且在-80℃保存直到测定。
血浆胰岛素浓度使用超灵敏胰岛素ELISA试剂盒(Mercodia)按照制造商的程序来测量。测量前将血浆样品在ELISA缓冲液(1∶5和1∶10，校准器0)中稀释。胰岛素浓度由校正曲线计算，所述校正曲线通过一式两份测量胰岛素标准品且使用线性回归拟合数值来产生。胰岛素浓度定义为两个独立稀释系列的平均值，所述独立稀释系列通过各自的稀释因子来校正且针对时间来绘图。对于各个时间点的平均血浆胰岛素浓度通过计算所有使用的动物的平均值来获得，如在图2中显示。
观察到历时14天的胰岛素无爆发且持续释放。
实施例15：
大鼠的药物代谢动力学研究
11da的药物代谢动力学通过在健康大鼠中历时13天测量血浆胰岛素浓度来确定。
8只Wistar大鼠(约250g体重)接受含有3mg胰岛素(约12mg/kg)于乙酸盐缓冲液pH 5中的500μL测试物品11da的单一皮下注射。在每只动物和每个时间点由尾静脉抽取200μL血液以获得约100L肝素锂血浆。在测试物品给药前1天以及给药后4小时、1天、2天、3天、6天、7天、8天、10天和13天收集样品。血浆样品冷冻且在-80℃保存直到测定。血浆样品的胰岛素含量使用人胰岛素超灵敏ELISA试剂盒(DRG Instruments GmbH，Germany)按照制造商的程序来测量。空白数值(校准器0)包含在校正曲线中且从样品数值中扣除，并且校正曲线使用三次多项方程式来拟合。分析前，将血浆样品涡旋且在反应管(1∶5和1∶10，校准器0)中稀释。针对分析，450nm处的OD用微量滴定板读取器(Tecan Ultra)在无参照波长校正的情况下测量。对于待研究的所有动物的直到第13天的血浆胰岛素含量结果在图3中显示。
在含有3mg胰岛素的500μL 11d的单一皮下注射后，第一天的平均血浆胰岛素水平升至最大约500pM。如所预期的，血浆胰岛素浓度随后在两周内持续降低。在研究的第一周内的血浆胰岛素水平的峰/谷比为约1.7。
实施例16：
大鼠的药物代谢动力学和药效动力学研究
释放的胰岛素的量和生物活性通过在研究性药物代谢动力学/药效学研究中使用糖尿病性Sprague-Dawley(SD)大鼠分析血浆胰岛素浓度和血糖降低作用来研究。
针对该目的，在8只大鼠中使用链唑霉素(STZ)诱导糖尿病且将在第0天具有高于350mg/dL的血糖水平的所有动物包括在该研究中。8只SD大鼠中的7只变为具有糖尿病且接受含有6.4mg胰岛素于乙酸盐缓冲液pH 5中的500μL测试物品11da的单一皮下注射。在每只动物和每个时间点由尾静脉抽取200μL血液以获得约100μL肝素锂血浆。在测试物品给药前4天以及给药后2小时、1天、2天、3天、6天、7天、8天、10天和13天收集样品。血浆样品冷冻且在-80℃保存直到测定。在注射前以及测试物品给药后2小时、1天、2天、3天、6天、7天、8天、10天、13天、15天、17天、20天、22天和24天使用AccuChek Comfort装置由尾静脉测量血糖3次。血浆样品的胰岛素含量使用人胰岛素ELISA试剂盒(DRG Instruments GmbH，Germany)按照制造商的程序来测量。空白数值(校准器0)包含在校正曲线中且从样品数值中扣除，并且校正曲线使用三次多项方程式来拟合。分析前，将血浆样品涡旋且在反应管(1∶5和1∶10，校准器0)中稀释。针对分析，450nm处的OD用微量滴定板读取器(Tecan Ultra)在无参照波长校正的情况下测量。历时2周监测血浆胰岛素水平且历时3周监测血糖水平，如在图4中显示。
在胰岛素水凝胶11da的单一皮下注射后，历时10天的血糖水平有效地降低，具有低于100mg/dL的值，且无低血糖的任何症状。由于每只动物6.4mg胰岛素的较高剂量，在第1天的最大血浆胰岛素浓度为约800pM且在2周内持续降低至约300pM。同时，在10天后血糖值开始上升且在3周后达到给药前水平。
实施例17：
在大鼠中历时24小时的药物代谢动力学研究(爆发研究)
为了证实胰岛素由胰岛素-连接物-水凝胶释放而无爆发，在健康大鼠中历时24小时监测血浆胰岛素浓度。
将8只Sprague-Dawley大鼠(200-250g体重)分为两组且每千克体重接受于乙酸盐缓冲液pH 5中的2mL测试物品11db的单一皮下注射。所述测试物品具有4mg/mL的胰岛素浓度，以使得每只动物每千克体重接受8mg胰岛素。在每只动物和每个时间点由尾静脉抽取200μL血液以获得约100μL肝素锂血浆。在给药前以及施用测试物品后5分钟、30分钟、2小时、4小时和8小时收集组A样品，且在给药前以及测试物品给药后15分钟、1小时、3小时、6小时和24小时收集组B样品。血浆样品冷冻且在-80℃保存直到测定。血浆样品的胰岛素含量使用人胰岛素超灵敏ELISA试剂盒(DRGInstruments GmbH，Germany)按照制造商的程序来测量。空白数值(校准器0)包含在校正曲线中且从样品数值中扣除，并且校正曲线使用三次多项方程式来拟合。分析前，将血浆样品涡旋且在反应管(1∶5和1∶10，校准器0)中稀释。针对分析，450nm处的OD用微量滴定板读取器(Tecan Ultra)在无参照波长校正的情况下测量。结果在图5中显示且清楚地表明胰岛素释放而无任何爆发。
实施例18：
在大鼠中的药物代谢动力学和药效动力学多剂量研究
在11da的三个每周一次给药后的药物代谢动力学和药效动力学通过在糖尿病大鼠中历时4周测量血浆胰岛素浓度和血糖水平来确定。
使用具有239g的平均体重的8只Sprague-Dawley大鼠。使用链唑霉素(STZ)诱导糖尿病且在第0天(测试物品注射日)具有高于350mg/dL的血糖水平的所有动物包括在该研究中。接受STZ处理的8只动物中的8只变为具有糖尿病且每千克体重接受于乙酸盐缓冲液pH 5中的2mL测试物品11da的在第0、7和14天的三个每周一次的皮下注射。在测试物品胰岛素浓度为4mg/mL的情况下，施用的剂量为每千克体重8mg胰岛素。在每只动物和每个时间点由尾静脉抽取200μL血液以获得约100μL肝素锂血浆。在测试物品给药前3天以及测试物品给药后至多28天收集样品。血浆样品冷冻且在-80℃保存直到测定。在注射前以及在注射后至多30天使用AccuChekComfort装置由尾静脉测量血糖3次。血浆样品的胰岛素含量使用人胰岛素ELISA试剂盒(DRG Instruments GmbH，Germany)按照制造商的程序来测量。空白数值(校准器0)包含在校正曲线中且从样品数值中扣除，并且校正曲线使用三次多项方程式来拟合。分析前，将血浆样品涡旋且在反应管(1∶5和1∶10，校准器0)中稀释。针对分析，450nm处的OD用微量滴定板读取器(Tecan Ultra)在无参照波长校正的情况下测量。历时4周监测血浆胰岛素水平和血糖水平并且均在图6中显示。
曲线的形状表明释放的胰岛素具有在第三次注射后稳定地降低血糖水平至约100mg/dL的值且维持该低水平约一周的生物活性。同时，最大胰岛素浓度稳定地由第一次给药后的200pM和第二次给药后的300pM增加至第三次给药后的400pM且随后在2周内再次降低至低于100pM的值。
实施例19：
大鼠中的药物代谢动力学研究
11dc的药物代谢动力学通过在健康大鼠中历时13天测量血浆胰岛素浓度来确定。
8只Wistar大鼠(约230g体重)接受含有3mg胰岛素(12mg/kg剂量)的于琥珀酸盐缓冲液pH 5(10mM琥珀酸盐/Tris，85g/l海藻糖，0.01％Tween-20，pH 5.0)中的2ml/kg测试物品11dc的单一皮下注射。在每只动物和每个时间点由尾静脉抽取200μL血液以获得约100μL肝素锂血浆。在测试物品给药前4天以及给药后0.3小时(4只动物)、1小时(4只动物)、2小时(4只动物)、4小时(4只动物)、1天、2天、3天、6天、8天、10天和13天收集样品。血浆样品冷冻且在-80℃保存直到测定。血浆样品的胰岛素含量使用人胰岛素超灵敏ELISA试剂盒(DRG Instruments GmbH，Germany)按照制造商的程序来测量。空白数值(校准器0)包含在校正曲线中且由样品数值扣除，并且校正曲线使用三次多项方程式来拟合。分析前，将血浆样品涡旋且在反应管(1∶5和1∶10，校准器0)中稀释。针对分析，450nm处的OD用微量滴定板读取器(Tecan Ultra)在无参照波长校正的情况下测量。对于所有待研究的动物的直至第13天的血浆胰岛素含量的结果在图7中显示。
在12mg/kg 11dc的单一皮下注射后，在第1天平均血浆胰岛素水平升至约500pM的最大值。如所预期的，血浆胰岛素浓度随后在2周内持续地降低。在第一周内血浆胰岛素的峰/谷比为约1.4。
实施例20
pH 7.4的实时胰岛素释放和水凝胶降解
将胰岛素-连接物水凝胶11a在pH 5.0乙酸盐缓冲液(10mM，130mMNaCl，0.01％(w/v)tween-20)中的混悬液(730μL，含有3.19mg胰岛素)填充至样品配制管中，用pH 7.4释放缓冲液(60mM磷酸钠，3mM EDTA，0.01％(w/v)Tween-20)洗涤三次并填充至1.00mL。将混悬液的等分样(0.5mL，1.59mg胰岛素)填充在色谱柱中且置于温度控制培养箱(37℃)中。将释放缓冲液(pH 7.4)泵送通过柱(恒定流速为0.25mL/h(额定))并且在培养箱外收集。在确定的时间点，将溶液经RP-HPLC(215nm)分析。将释放的胰岛素的量针对孵育时间进行绘图，且应用曲线拟合软件以评估相应的释放半衰期。针对胰岛素释放的半衰期确定为9.4天。
在37℃孵育39天后，将水凝胶混悬液转移至样品配制管中，使用pH 7.4的释放缓冲液将残留的水凝胶由柱洗出并且样品至多填充1.00mL。将两个等分溶液(各300μL)转移至无菌样品配制管中，至多填充1.5mL，且在37℃孵育。在一定时间间隔采集样品并且通过尺寸排阻色谱分析。将相应于水凝胶释放的包含一种或者多种骨架部分(对应于反应性官能团)的水溶性降解产物的UV-信号进行整合并且针对孵育时间进行绘图，参见图8。
实施例21
胰岛素-连接物-水凝胶前药的可注射性
使用5mL胰岛素-连接物-水凝胶前药11dc(32-75μm的珠子大小分布，18mg胰岛素/ml)在pH 5.0琥珀酸/Tris(10mM，40g/L甘露醇；10g/L海藻糖二水合物；0.05％TWEEN-20)中的混悬液。将胰岛素-连接物-水凝胶前药混悬液经20G注射针头填充至1mL注射器(长度为57mm)中。将20G注射针头用30G注射针头替换且置于注射器台座(Aqua Computer GmbH&Co.KG)上，并且以172mm/min(等于50μL/s)的活塞速度开始测量(力测试架：Multitest1-d，数据记录软件：EvaluatEmperor Lite，版本1.16-015，测力计：BFG 200N(均为Mecmesin Ltd.，UK))。在下表中显示的具有增加活塞速度的试验使用新的胰岛素-连接物-水凝胶前药样品来进行。相应地使用水和乙二醇进行该试验。对于所有试验，使用相同的30G注射针头。使用30G注射针头的力/流动在图9中显示。
缩写：
AcOH    乙酸
AcOEt   乙酸乙酯
Aib     2-氨基异丁酸
Bn      苄基
Boc     叔丁基氧基羰基
COMU    (1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉代-碳
        鎓六氟磷酸盐
DBU     1，3-二氮杂二环[5.4.0]十一碳烯
DCC     N，N，-二环己基碳二亚胺
DCM     二氯甲烷
DIEA    二异丙基乙基胺
DMAP    二甲基氨基-吡啶
DMF     N，N-二甲基甲酰胺
Dmob    2，4-二甲氧基苄基
DMSO    二甲基亚砜
EDC     1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
EDTA    乙二胺四乙酸
eq      化学计量当量
ESI-MS  电喷雾电离质谱法
EtOH    乙醇
Fmoc    9-芴基甲氧基羰基
HATU    O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HFIP    六氟异丙醇
HPLC    高效液相色谱
HOBt    N-羟基苯并三唑
iPrOH   2-丙醇
LCMS    质谱-液相色谱联用
Mal     3-马来酰亚氨基丙基
Mal-PEG6-NHS N-(3-马来酰亚氨基丙基)-21-氨基-4，7，10，13，16，19-六氧杂-
             二十一碳烷酸NHS酯
Me      甲基
MeCN    腈
MeOH    甲醇
Mmt     4-甲氧基三苯甲基
MS      质谱
MTBE    甲基叔丁醚
MW      分子量
n.d.    未确定的
NHS     N-羟基琥珀酰亚胺
OD      光密度
OBu     丁基氧基
OtBu    叔丁基氧基
PEG     聚(乙二醇)
Phth    苯二甲酸-
PyBOP   苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基-鏻六氟磷酸盐
RP-HPLC 反相高效液相色谱
rpm     每分钟转数
RT      室温
SEC     尺寸排阻色谱
Su      琥珀酰亚氨基
TCP    2-氯三苯甲基氯树脂
TES    三乙基甲硅烷
TFA    三氟乙酸
THF    四氢呋喃
TMEDA  N，N，N′N′-四甲基乙二胺
Tmob   2，4，6-三甲氧基苄基
Trt    三苯基甲基，三苯甲基
UPLC   超高效液相色谱
UV     紫外
VIS    可见

Claims (33)

1.前药或其药用盐，其包含胰岛素连接物缀合物D-L，其中
D表示胰岛素部分；和
-L为由式(I)表示的非生物活性连接物部分-L1，
其中虚线表示与所述胰岛素的氨基中的一个连接形成酰胺键的连接位；
X为C(R3R3a)；或N(R3)；
R1a、R3a独立地选自H、NH(R2b)、N(R2b)C(O)R4和C1-4烷基；
R1、R2、R2a、R2b、R3、R4独立地选自H和C1-4烷基，
其中L1取代有一个L2-Z并任选被进一步取代，条件是在式(I)中标记有星号的氢不被取代基替代，并且其中
L2为单化学键或L2为C1-20烷基链，其任选被一个或多个独立选自以下的基团中断：-O-；和C(O)N(R3aa)；任选取代有一个或多个独立选自以下的基团OH；和C(O)N(R3aaR3aaa)；并且其中R3aa、R3aaa独立地选自H；和C1-4烷基；和
其中L2通过选自以下的终端基团与Z连接：
和
Z为水凝胶；
其中所述水凝胶Z为生物可降解的聚(乙二醇)(PEG)基的水不溶性水凝胶；
其中所述水凝胶由通过水解可降解键互连的骨架部分构成；和
其中所述骨架部分具有式C(A-Hyp)4的季碳，
其中每个A独立地选自式-(CH2)n1(OCH2CH2)nX-，其中n1为1或2；n为5-50的整数；和
X为与A和Hyp共价连接的化学官能团；
Hyp为高度支化多肽，其由5-32个结合形式的赖氨酸构成，且其中Hyp选自相同或不同的树枝状部分Hyp；
其中所述骨架部分具有的分子量范围为1kDa至20kDa；
其中骨架部分通过交联物部分连接在一起，每个交联物部分被水解可降解键中的至少两个封端；其中所述交联物部分为一个PEG基的分子链，含有至少m个乙二醇单元，其中m为范围为3-100的整数；所述交联物部分通过酯键与骨架部分提供的两个α,ω-脂肪族二羧酸间隔基团对称连接，所述骨架部分通过永久性酰胺键与高度支化的树枝状部分连接；且其中所述交联物部分具有的分子量范围为0.5kDa至5kDa。
2.权利要求1的前药，其中在式(I)中R2被L2-Z替代。
3.权利要求1的前药，其中在式(I)中R1被L2-Z替代。
4.权利要求1-3中任一项的前药，其中在式(I)中X为N(R3)。
5.权利要求1-3中任一项的前药，其中在式(I)中X为C(R3R3a)，和R3a为N(R2b)C(O)R4。
6.权利要求1的前药，其中X为C(R3R3a)，和R3a被L2-Z替代。
7.权利要求1的前药，其中X为C(R3R3a)，R3a为N(R2b)-L2-Z。
8.权利要求1的前药，其中L1不被进一步取代。
9.权利要求1的前药，其中所述胰岛素部分通过氮NαA1与L1连接。
10.权利要求1的前药，其中胰岛素为重组人胰岛素。
11.权利要求10的前药，其中所述重组人胰岛素通过所述胰岛素部分的赖氨酸侧链的氮与L1连接。
12.权利要求1的前药，其中L2与骨架部分连接。
13.权利要求1的前药，其中L2通过具有以下结构的终端基团与Z连接，
其中虚线表示分别与L2和Z连接。
14.权利要求1的前药，其具有式(IIa)
其中Nε-胰岛素是指通过一个赖氨酸侧链连接的胰岛素。
15.权利要求1的前药，其具有式(IIb)
16.权利要求1的前药，其中所述骨架部分包含下式的支化核:
其中虚线表示与骨架部分的剩余部分连接。
17.权利要求1的前药，其中所述骨架部分包含下式的结构:
其中n为5-50的整数，虚线表示与分子的其余部分连接。
18.权利要求1的前药，其中所述骨架部分包含下式的高度支化部分Hyp:
其中，虚线表示与分子的其余部分连接，并且标记有星号的碳原子表示S-构型。
19.权利要求1的前药，其中所述骨架部分与下式的至少一个间隔基团连接:
其中虚线之一表示与高度支化部分Hyp连接，另一条虚线表示与分子的其余部分连接；和
其中m为2-4的整数。
20.权利要求1的前药，其中所述骨架部分与下式的至少一个间隔基团连接:
其中标记有星号的虚线表示水凝胶与权利要求1的硫代琥珀酰亚胺基的N之间的键，
其中，另一条虚线表示与Hyp连接，和
其中p为0-10的整数。
21.权利要求1的前药，其中骨架部分通过含有以下结构的交联物部分连接在一起
其中
q为3-100的整数。
22.权利要求1的前药，其为微粒形式。
23.权利要求22的前药，其中所述微粒具有20-100微米之间的直径。
24.胰岛素-连接物缀合物，其具有(IIIa)
其中Nε-胰岛素是指通过一个赖氨酸侧链连接的胰岛素。
25.胰岛素-连接物缀合物，其具有式(IIIb)
26.药物组合物，其包含权利要求1-23中任一项的前药或其药用盐和药用赋形剂。
27.权利要求26的药物组合物，其中所述药物组合物为干燥的。
28.权利要求26-27中任一项的组合物，其为单剂量组合物。
29.权利要求26-27中任一项的组合物，其为多剂量组合物。
30.套盒，其包括注射针头和含有重建溶液的容器，以及权利要求27的干燥组合物。
31.权利要求30的套盒，其中所述容器为双室注射器，并且所述双室注射器的两个室中的一个装有所述干燥组合物，所述双室注射器的另一个室装有重建溶液。
32.制备权利要求1-23中任一项的前药的方法，包括以下步骤：
(a)在室温至4℃和在pH2-5的缓冲水溶液中，使含有马来酰亚胺-官能化的水凝胶微粒的水性混悬液与含有胰岛素-连接物试剂的溶液接触，得到胰岛素-连接物-水凝胶缀合物；
(b)任选地，在室温至4℃和在pH2-5的缓冲水溶液中，用34Da至500Da的含巯基的化合物处理步骤(a)的胰岛素-连接物-水凝胶缀合物；
其中所述胰岛素-连接物试剂为D-L*，其中
D表示胰岛素部分；和
L*为由式(IV)表示的非生物活性连接物试剂，
其中虚线表示与所述胰岛素的氨基中的一个连接形成酰胺键的连接位；
X为C(R3R3a)；或N(R3)；
R1a、R3a独立地选自H、NH(R2b)、N(R2b)C(O)R4和C1-4烷基；
R1、R2、R2a、R2b、R3、R4独立地选自H和C1-4烷基,
其中L*取代有一个L2*并任选被进一步取代，条件是式(IV)中标记有星号的氢不被取代基替代，并且其中
L2*为与L*连接的间隔基团并且含有巯基，所述间隔基团为C1-50烷基，该片段任选被一个或多个选自下面的基团间断：-O-、-C(O)NH-或-C(O)N(C1-4烷基)-。
33.制备权利要求1-23中任一项的前药的方法，包括以下步骤：
(a)在室温至4℃和在pH2-5的缓冲水溶液中，使含有巯基-官能化的水凝胶微粒的水性混悬液与含有胰岛素-连接物试剂的溶液接触，得到胰岛素-连接物-水凝胶缀合物；
(b)任选地，在室温至4℃和在pH2-5的缓冲水溶液中，用100-300Da的含马来酰亚胺的化合物处理步骤(a)的胰岛素-连接物-水凝胶缀合物；
其中所述胰岛素-连接物试剂为D-L*，其中
D表示胰岛素部分；和
L*为由式(IV)表示的非生物活性连接物试剂，
其中虚线表示与所述胰岛素的氨基中的一个连接形成酰胺键的连接位；
X为C(R3R3a)；或N(R3)；
R1a、R3a独立地选自H、NH(R2b)、N(R2b)C(O)R4和C1-4烷基；
R1、R2、R2a、R2b、R3、R4独立地选自H和C1-4烷基,
其中L*取代有一个L2*并任选被进一步取代，条件是式(IV)中标记有星号的氢不被取代基替代，并且其中
L2*为与L*连接的间隔基团并且含有马来酰亚胺基，所述间隔基团为C1-50烷基，该片段任选被一个或多个选自下面的基团间断：-O-、-C(O)NH-或-C(O)N(C1-4烷基)-。
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