JP2013500951A - インスリンリンカー複合体を含むプロドラッグ - Google Patents
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Abstract
Description
Dは、インスリン部分を表し;そして
−Lは、式(I)
Xは、C(R3R3a);又はN(R3)であり;
R1a、R3aは、H、NH(R2b)、N(R2b)C(O)R4及びC1-4アルキルからなる群より独立して選ばれ;
R1、R2、R2a、R2b、R3、R4は、H及びC1-4アルキルからなる群より独立して選ばれる)
によって表される生物活性のない(non-biologically active)リンカー部分−L1であり、
ここにおいて、L1は、1つのL2−Zで置換され、そして場合によりさらに置換されるが、但し、式(I)中のアスタリスクでマークされた水素は、置換基によって置き換えられず、そしてここにおいて、
L2は、単化学結合又はスペーサーであり;そして
Zは、ヒドロゲルである]
を含むプロドラッグ又はその薬学的に許容しうる塩によって達成される。
R1、R1a、R2、R2a、R2b、R3、R4、L2、Zは、本明細書に記載された意味を有し、そしてL1は場合によりさらに置換されるが、但し、式(Ia)〜(Id)中のアスタリスクでマークされた水素は、置換基によって置き換えられない)によって表される。
R10は、ハロゲン;CN;オキソ(=O);COOR12;OR12;C(O)R12;C(O)N(R12R12a);S(O)2N(R12R12a);S(O)N(R12R12a);S(O)2R12;S(O)R12;N(R12)S(O)2N(R12aR12b);SR12;N(R12R12a);NO2;OC(O)R12;N(R12)C(O)R12a;N(R12)S(O)2R12a;N(R12)S(O)R12a;N(R12)C(O)OR12a;N(R12)C(O)N(R12aR12b);OC(O)N(R12R12a);又はC1-6アルキルであり、ここにおいて、C1-6アルキルは、同一又は異なる1つ又はそれ以上のハロゲンで場合により置換されており;
R11、R11a、R12、R12a、R12bは、H;又はC1-6アルキルからなる群より独立して選ばれ、ここにおいて、C1-6アルキルは、同一又は異なる1つ又はそれ以上のハロゲンで場合により置換されている。
Tは、フェニル;ナフチル;インデニル;インダニル;テトラリニル;C3-10シクロアルキル;4〜7員ヘテロシクリル;又は9〜11員ヘテロビシクリルからなる群より選ばれ、ここにおいてtは、同一又は異なる1つ又はそれ以上のR10で場合により置換されており;
R10は、Z;ハロゲン;CN;オキソ(=O);COOR12;OR12;C(O)R12;C(O)N(R12R12a);S(O)2N(R12R12a);S(O)N(R12R12a);S(O)2R12;S(O)R12;N(R12)S(O)2N(R12aR12b);SR12;N(R12R12a);NO2;OC(O)R12;N(R12)C(O)R12a;N(R12)S(O)2R12a;N(R12)S(O)R12a;N(R12)C(O)OR12a;N(R12)C(O)N(R12
aR12b);OC(O)N(R12R12a);又はC1-6アルキルであり、ここにおいてC1-6アルキルは、同一又は異なる1つ又はそれ以上のハロゲンで場合により置換されており;
R11、R11a、R12、R12a、R12bは、H;Z;又はC1-6アルキルからなる群より独立して選ばれ、ここにおいてC1-6アルキルは、同一又は異なる1つ又はそれ以上のハロゲンで場合により置換されており;
但し、R9、R9a、R9b、R10、R11、R11a、R12、R12a、R12bの1つだけがZである。
mは2〜4の整数である)
の少なくとも1つのスペーサーに結合している。
mは2〜4の整数である)
の少なくとも1つのスペーサーに結合している。
他の点線はHypへの結合を示し、そして
pは、0〜10の整数である)
の少なくとも1つのスペーサーに結合している。
骨格鎖試薬合成の好ましい出発物質は、4−アームPEGテトラアミン又は8−アームPEGオクタアミンであり、PEG試薬は、2000〜10000ダルトン、最も好ましくは2000〜5000Daの範囲の分子量を有する。このようなマルチアームPEG−誘導体に、リシン残基を逐次的にカップリングして超分枝骨格鎖試薬を形成する。リシンは、カップリング工程中に保護基によって部分的に又は完全に保護することができ、そしてまた、最終的な骨格鎖試薬は、保護基を含んでもよいことが理解される。好ましい構成ブロックは、ビス−bocリシンである。別法として、リシン残基の逐次付加の代わりに、樹枝状ポリリシン部分を最初に構成し、その後、4−アームPEGテトラアミン又は8−アームPEGオクタアミンにカップリングさせてもよい。32個のアミノ基を担持する骨格鎖試薬を得ることが望ましく、結果的に、7個のリシンを4−アームPEGの各アームに結合させるか、又は5個のリシンを8−アームPEGの各アームに結合させる。別の実施態様において、マルチアームPEG誘導体は、テトラ−又はオクタカルボキシPEGである。この場合、樹枝状部分は、グルタル又はアスパラギン酸から生成してもよく、そして生成した骨格鎖試薬は、32個のカルボキシ基を担持する。骨格鎖試薬の官能基のすべて又は一部は、塩として、遊離形態で存在するか、又は保護基に結合されてもよいことが理解される。実際的な理由のため、PEG−アーム当たりリシンの骨格鎖試薬の数は、6〜7個、より好ましくは約7個であることが理解される。
(a)マレイミド官能化ヒドロゲルマイクロ粒子を含む水性懸濁液をpH2〜5の緩衝水溶液中、室温から4℃の間の温度でチオール基を担持するインスリン−リンカー試薬を含む溶液と接触させてインスリン−リンカー−ヒドロゲル複合体を生成し;
(b)場合により、工程(a)からのインスリン−リンカー−ヒドロゲル複合体をpH2〜5の緩衝水溶液中、室温から4℃の間の温度で34Da〜500Daのチオール含有化合物により処理する
工程を含む方法である。
(a)チオール官能化ヒドロゲルマイクロ粒子を含む水性懸濁液をpH2〜5の緩衝水溶液中、室温から4℃の間の温度でマレイミド基を担持するインスリン−リンカー試薬を含む溶液と接触させてインスリン−リンカー−ヒドロゲル複合体を生成し;
(b)場合により、工程(a)からのインスリン−リンカー−ヒドロゲル複合体をpH2〜5の緩衝水溶液中、室温から4℃の間の温度で100〜300Daのマレイミド含有化合物により処理する
工程を含む方法である。
(a)式C(A'−X1)4(式中、A'−X1はHyp又はHypの前駆体に結合する前のAを表し、そしてX1は適切な官能基である)の化合物を、
式Hyp'−X2(式中、Hyp'−X2はAに結合する前のHyp又はHypの前駆体を表し、そしてX2はX1と反応する適切な官能基である)の化合物と反応させ;
(b)場合により工程(a)から生成した化合物を1つ又はそれ以上のさらなる工程で反応させて少なくとも4つの官能基を有する式C(A−Hyp)4の化合物を得;
(c)工程(b)から生成した化合物の少なくとも4つの官能基をポリエチレングリオールベースのクロスリンカー前駆体と反応させ、その際、C(A−Hyp)4の反応性官能基の総数と比較してクロスリンカー前駆体の活性なエステル基を化学量論量未満の量で用いてヒドロゲルを得;
(d)工程(c)のヒドロゲル骨格鎖中に残っている未反応の官能基(ヒドロゲル中に含まれる骨格鎖の反応性官能基を表す)を生物活性部分及び一過性プロドラッグリンカーの共有結合性複合体と反応させるか又は最初に未反応の官能基を一過性プロドラッグリンカー、続いて生物活性部分と反応させ;
(e)場合により残っている未反応の官能基にキャップ形成して本発明のプロドラッグを得る
工程を含む。
バルク重合では、骨格鎖試薬及びクロスリンカー試薬をアミン/活性エステル2:1〜1.05:1の比率で混合する。
[式中、
Dは、インスリン部分を表し;そして
L*は、式(IV)、
Xは、C(R3R3a);又はN(R3)であり;
R1a、R3aは、H、NH(R2b)、N(R2b)C(O)R4及びC1-4アルキルからなる群より独立して選ばれ;
R1、R2、R2a、R2b、R3、R4は、H及びC1-4アルキルからなる群より独立して選ばれる)
によって表される生物活性のないリンカー試薬であり、
ここにおいて、L*は1つのL2*で置換されており、そして場合によりさらに置換されるが、但し、式(IV)中のアスタリスクでマークされる水素は、置換基によって置き換えられることはなく、そしてここにおいて、
L2*は、L*に連結したスペーサーであり、そして反応性の生分解性ヒドロゲルに結合するための化学官能基を含む]
である。
(i)緩衝剤:所望の範囲にpHを維持する生理学的に許容しうるバッファ、例えばナトリウムのリン酸塩、炭酸水素塩、コハク酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩及び酢酸塩、硫酸塩、硝酸塩、塩化物、ピルビン酸。また、酸中和剤、例えばMg(OH)2又はZnCO3を用いてもよい。緩衝能力は、pH安定性に最も感受性の状態に合わせて調整してもよい。
(ii)等張性調整剤:注射デポ剤での浸透圧の違いによる細胞損傷から生じることがある疼痛を最小限にするため。例として、グリセリン及びナトリウムクロリドがある。有効濃度は、血清について285〜315mOsmol/kgの推定浸透圧を用いて浸透圧測定によって決定することができる。
(iii)防腐剤及び/又は抗菌剤:反復投与の非経口製剤では、患者が注射時に感染するリスクを最小限にするために十分な濃度で防腐剤を添加する必要があり、そして対応する規制上の要件は確立されている。典型的な防腐剤としては、m−メタクレゾール、フェノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメロソール(thimerosol)、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、安息香酸、クロロクレゾール、及び塩化ベンザルコニウムが含まれる。
(iv)安定剤:安定化は、タンパク質安定化力を強化することによって、変性したステーター(stater)の不安定化によって、又は賦形剤をタンパク質に直接結合することによって達成される。安定剤は、アミノ酸、例えばアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、リシン、プロリン、糖、例えばグルコース、スクロース、トレハロース、ポリオール、例えばグリセロール、マンニトール、ソルビトール、塩、例えばリン酸カリウム、硫酸ナトリウム、キレート剤、例えばEDTA、六リン酸エステル、リガンド、例えば二価金属イオン(亜鉛、カルシウム、など)、他の塩又は有機分子、例えばフェノール系誘導体であってもよい。さらに、オリゴマー又はポリマー、例えばシクロデキストリン、デキストラン、デンドリマー、PEG又はPVP又はプロタミン又はHSAを用いてもよい。
(v)抗吸着剤:主にイオン性若しくは非イオン性界面活性剤又は他のタンパク質又は可溶性のポリマーを用いて組成物又は組成物の容器の内面にコーティングする又は競合的に吸着させる。例えば、ポロキサマー(プルロニック(Pluronic)F−68)、PEGドデシルエーテル(ブリッジ(Brij)35)、ポリソルベート20及び80、デキストラン、ポリエチレングリコール、PEG−ポリヒスチジン、BSA及びHSA並びにゼラチン。賦形剤の濃度及びタイプの選択は、回避すべき効果により左右されるが、典型的にCMC値のすぐ上では界面に界面活性剤の単層が形成される。
(vii)酸化防止剤:抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、エクトイン、メチオニン、グルタチオン、モノチオグリセロール、モリン、ポリエチレンイミン(PEI)、没食子酸プロピル、ビタミンE、キレート剤、例えばクエン酸、EDTA、六リン酸エステル、チオグリコール酸
(viii)増粘剤(viscosifiers)又は粘度増強剤(viscosity enhancers):バイアル及び注射器中で粒子の沈降を遅らせ、そして粒子の混合及び再懸濁を促進するため、そして注射がより容易な(すなわち、注射器のプランジャーにおける力が弱い)懸濁液を作るために用いられる。適切な増粘剤又は粘度増強剤は、例えば、カルボポール(Carbopol)940、カルボポールウルトレッツ(Ultrez)10のようなカルボマー増粘剤、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(ヒプロメロース、HPMC)又はジエチルアミノエチルセルロース(DEAE又はDEAE−C)のようなセルロース誘導体、コロイド状ケイ酸マグネシウム(Veegum)又はケイ酸ナトリウム、ヒドロキシアパタイトゲル、リン酸三カルシウムゲル、キサンタン、サチアガム(Satia gum)UTC30のようなカラゲナン、脂肪族ポリ(ヒドロキシ酸)、例えばポリ(D,L −又はL−乳酸)(PLA)及びポリグリコール酸(PGA)並びにそれらのコポリマー(PLGA)、D,L−ラクチド、グリコリド及びカプロラクトンのターポリマー、ポロキサマー、ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)−ポリ(オキシエチレン)(例えばプルロニック(登録商標))のトリブロックを構成するための親水性ポリ(オキシエチレン)ブロック及び疎水性ポリ(オキシプロピレン)ブロック、ポリエチルエステルコポリマー、例えばポリエチレングリコールテレフタレート/ポリブチレンテレフタレートコポリマー、ショ糖酢酸イソ酪酸エステル(SAIB)、デキストラン又はその誘導体、デキストラン及びPEGの組み合わせ、ポリジメチルシロキサン、コラーゲン、キトサン、ポリビニルアルコール(PVA)及び誘導体、ポリアルキルイミド、ポリ(アクリルアミド−コ−ジアリルジメチルアンモニウム(DADMA))、ポリビニルピロリドン(PVP)、グリコサミノグリカン(GAG)、例えばデルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナン、疎水性Aブロック、例えばポリ乳酸(PLA)又はポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(PLGA)及び親水性Bブロック、例えばポリエチレングリコール(PEG)又はポリビニルピロリドンで構成されたABAトリブロック又はABブロックコポリマーである。前記のポロキサマーと同様にこのようなブロックコポリマーは、逆熱ゲル化(reverse thermal gelation)挙動(投与を容易にするため室温で流体状態、そして注射後に体温でゾル−ゲル転移温度より上のゲル状態)を示すことがある。
(ix)拡散(spreading)又は拡散剤(diffusing agent):限定されるわけではないが、結合組織の細胞間隙に見出されるヒアルロン酸、多糖類のような組織間隙(intrastitial space)中の細胞外マトリックス成分の加水分解を通して結合組織の透過性を改良する。ヒアルロニダーゼのような拡散剤は、一時的に、細胞外マトリックスの粘度を低下させ、そして注射された薬物の拡散を促進する。
(x)他の補助剤:例えば湿潤剤、粘度調整剤、抗生物質、ヒアルロニダーゼ。酸及び塩基、例えば塩酸及び水酸化ナトリウムは、製造中のpH調整に必要な補助剤である。
・本発明の組成物を再構成溶液と接触させる
工程を含む前記方法である。
(i)インスリン−ヒドロゲルプロドラッグを1つ又はそれ以上の賦形剤と混合し、
(ii)単回又は反復投与に相当する量を適切な容器に移し、
(iii)前記容器中の組成物を乾燥し、そして
(iv)容器を密閉すること
によって製造される。
(ii)メグリチニド、例えば、レパグリニドなど、
(iii)グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)及びその模倣剤、グルコース−インスリン分泌性ペプチド(GIP)及びその模倣剤、エキセンジン及びその模倣剤、及びジペプチルプロテアーゼ阻害剤(Dipeptyl Protease Inhibitors)(DPPIV)、
(iv)ビグアニド、例えば、メトホルミンなど、
(v)チアゾリジンジオン、例えば、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、イサグリタゾン(isaglitazone)(MCC−555として知られる)、2−[2−[(2R)−4−ヘキシル−3,4−ジヒドロ−3−オキソ−2H−1,4−ベンゾオキサジン−2−イル]エトキシ]−ベンゼン酢酸、及び同様のものなど
(vi)GW2570、及び同様のもの、
(vii)レチノイド−X受容体(RXR)モジュレーター、例えば、ターグレチン、9−cis−レチノイン酸、及び同様のものなど、
(viii)他のインスリン抵抗性改善剤(insulin sensitizing agents)、例えば、INS−1、PTP−1B阻害剤、GSK3阻害剤、グリコーゲンホスホリラーゼa阻害剤、フルクトース−1,6−ビスホスファターゼ阻害剤、及び同様のものなど;
(ix)通常のインスリン、又は速効型、中間型及び持続型インスリン、を含むインスリン、吸入用インスリン並びにインスリン類似体、例えば天然アミノ酸配列においてマイナーな違いを有するインスリン分子
(x)L−783281、TE−17411、及び同様のものを含むが、それらに限定されるわけではないインスリンの小分子模倣剤、
(xi)Na−グルコース共輸送体阻害剤、例えばT−1095、T−1095A、フロリゼン(phlorizen)、及び同様のもの;
(xii)プラムリンチド、及び同様のものを含むがそれらに限定されるわけではないアミリン作動剤、
(xiii)グルカゴン拮抗剤、例えばAY−279955、及び同様のもの。
glucose metabolism)、耐糖能異常(impaired glucose tolerance)の状態、空腹時血漿グルコース異常(impaired fasting plasma glucose)の状態、肥満、勃起障害、皮膚及び結合組織障害、足潰瘍及び潰瘍性大腸炎、内皮機能不全及び血管コンプライアンス障害(impaired vascular compliance)からなる群より選ばれる疾患及び障害の予防、進行の遅延又は治療に用いてもよい。
物質及び方法
組換え型のヒトインスリンは、Biocon Ltd., Bangalore, Indiaから入手した。アミノ4−アームPEG 5kDaは、JenKem Technology, Beijing, P. R. Chinaから入手した。N−(3−マレイミドプロピル)−21−アミノ−4,7,10,13,16,19−ヘキサオキサ−ヘンエイコサン酸NHSエステル(Mal−PEG6−NHS)は、Celares GmbH, Berlin, Germanyから入手した。
Fmoc脱保護:Fmoc保護基除去については、樹脂は、ピペリジン/DBU/DMF2/2/96(v/v/v)(2回、それぞれ10分)で撹拌し、そしてDMF(10回)で洗浄した。
固定化Fmoc−Aib−OHのFmoc脱保護は、樹脂をDMF/ピペリジン4/1(v/v)中、50℃で20分間(2回)撹拌することによって達成した。
合成が完了したら、樹脂をDCMで洗浄し、真空で乾燥し、そしてDCM/HFIP6/4(v/v)を用いて30分間で2回処理した。溶出液を合わせ、揮発性物質を窒素流れ下で除去し、そして生成した粗生成物をRP−HPLCによって精製した。生成物を含むHPLC画分を合わせ、そして凍結乾燥した。TFA塩として得たアミン含有生成物を、イオン交換樹脂(Discovery DSC-SAX, Supelco, USA)を用いて対応するHCl塩に転換した。この工程は、残留TFAが、例えばその後のカップリング反応を妨げることが
RP−HPLCは、Waters 600 HPLCシステム及びWaters 2487吸光度検出器に接続された100×20mm又は100×40mmC18 ReproSil-Pur 300 ODS-3 5μカラム(Dr.
Maisch, Ammerbuch, Germany)において実施した。
溶液A(H2O中の0.1%TFA)及び溶液B(アセトニトリル中の0.1%TFA)の線形勾配を用いた。生成物を含むHPLC画分を凍結乾燥した。
フラッシュクロマトグラフィ精製は、Biotage KP-Silシリカカートリッジ並びに溶離液としてn−ヘプタン及び酢酸エチルを用いてBiotage AB, SwedenからのIsolera Oneシステムにおいて実施した。生成物は254nmで検出した。
分析用超高性能(analytical ultra-performance)LC(UPLC)は、Thermo ScientificからのLTQ Orbitrap Discovery質量分析器につながれた、Waters BEH300 C18カラム(2.1×50mm,粒径1.7μm)を備えたWaters Acquityシステムにおいて実施した。
化合物1bをRP−HPLCによって精製した。
収量3.85g(59%)無色のガラス状生成物1b
MS:m/z 1294.4=[M+5H]5+(計算値=1294.6)
MS:m/z 1151.9=[M+5H]5+(計算値=1152.0)
収量:4.01g(89%)無色のガラス状生成物1d、これをさらに精製することなく次の工程に用いた。
MS:m/z 1405.4=[M+6H]6+(計算値=1405.4)
MS:m/z 969.6=[M+7H]7+(計算値=969.7)
生成物をDCM中に溶解し、そして冷却した(−18℃)ジエチルエーテルを用いて沈殿させた。この工程を2回繰り返し、そして沈殿を真空で乾燥した。
収量4.72g(82%)無色のガラス状生成物1f、これをさらに精製することなく次の工程に用いた。
MS:m/z 1505.3=[M+8H]8+(計算値=1505.4)
収量3.91g(100%)、ガラス状生成物骨格鎖試薬1g
MS:m/z 977.2=[M+9H]9+(計算値=977.4)
化合物1bを合成するため、iPrOH(無水)250mL中の4−アーム−PEG5000テトラアミン(1a)(50.0g,10.0mmol)の懸濁液にboc−Lys(boc)−OSu(26.6g,60.0mmol)及びDIEA(20.9mL,120mmol)を45℃で加え、そして混合物を30分間撹拌した。
収量:65.6g(74%)塊の多い白色固形物として1b
MS:m/z 937.4=[M+7H]7+(計算値=937.6)
収量:38.9g(86%)白色粉末として1c
MS:m/z 960.1=[M+6H]6+(計算値=960.2)
収量:21.0g(80%)白色固形物として1d
MS:m/z 1405.4=[M+6H]6+(計算値=1405.4)
収量:13.2g(96%)白色粉末として1e
MS:m/z 679.1=[M+10H]10+(計算値=679.1)
収量:12.8g、MW(90%)淡黄色の塊の多い固形物として1f
MS:m/z 1505.3=[M+8H]8+(計算値=1505.4)
収量:11.5g(89%)淡黄色フレークとして
MS:m/z 1104.9=[M+8H]8+(計算値=1104.9)
クロスリンカー試薬2dの合成
クロスリンカー試薬2dは、アジピン酸モノベンジルエステル(English, Arthur R. et al., Journal of Medicinal Chemistry, 1990, 33(1), 344-347)及びPEG2000から以下のスキームに従って製造した:
MS:m/z 813.1=[M+3H]3+(計算値=813.3)
収量:12.3g(定量的)黄色がかった油として2c
生成物をさらに精製することなく次の工程に用いた。
MS:m/z 753.1=[M+3H]3+(計算値=753.2)
収量: 8.73g(85%)無色の固形物としてクロスリンカー試薬2d
MS:m/z 817.8=[M+3H]3+(計算値=817.9g/mol)
遊離アミノ基を含むヒドロゲルビーズ(3)及び(3a)の製造
DMSO14mL中の1g 275mg及び2d 866mgの溶液をヘプタン60mL中の Arlacel P135(Croda International Plc)100mgの溶液に加えた。慣用の金属撹拌機を用いて700rpmで混合物を25℃で10分間撹拌して懸濁液を形成した。N,N,N',N'−テトラメチルエチレンジアミン1.0mLを加えて重合を実施した。2時間後、撹拌機の速度を400rpmに下げ、そして混合物をさらに16時間撹拌した。酢酸1.5mLを加え、それから10分後、水50mLを加えた。5分後、撹拌機を停止し、そして水相を排出した。
ビーズサイズ分別のため、水−ヒドロゲル懸濁液を75、50、40、32及び20μmメッシュのスチール篩上で湿式篩にかけた(wet-sieved)。32、40及び50μmの篩上に残ったビーズ画分を貯め、そして水で3回、エタノールで10回洗浄し、そして0.1mbarで16時間乾燥して白色粉末として3を得た。
3aは、1g 1200mg、2d 3840mg、DMSO28.6ml、Arlacel P135 425mg、ヘプタン100mL及びTMEDA4.3mlを使用することを除いて、3について記載されたように製造した。処理のため、酢酸6.6mlを加え、それから10分後、水50mL及び飽和塩化ナトリウム水溶液50mLを加えた。
ヒドロゲルのアミノ基含量は、Gude, M., J. Ryf, et al. (2002) Letters in Peptide
Science 9(4): 203-206によって記載されたように、ヒドロゲル上の遊離アミノ基へのfmocアミノ酸の結合、そしてその後のfmoc測定によって決定した。
3及び3aのアミノ基含量は0.11〜0.16mmol/gであると決定された。
4−メトキシトリチルクロリド(3g,9.71mmol)をDCM(20mL)中に溶解し、そしてDCM(20mL)中のエチレンジアミン(6.5mL,97.1mmol)の溶液を滴加した。2時間後、溶液をジエチルエーテル(300mL)中に注ぎ、そしてブライン/0.1 M NaOH溶液30/1(v/v)で3回(それぞれ50ml)、そしてブライン(50mL)で1回洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥し、そして揮発性物質を減圧下で除去してMmt−保護された中間体(3.18g,9.56mmol)を得た。
Mmt−保護された中間体(3.18g,9.56mmol)を無水DCM(30mL)中に溶解した。6−(トリチルメルカプト)−ヘキサン酸(4.48g,11.47mmol)、PyBOP(5.67g,11.47mmol)及びDIEA(5.0mL,28.68mmol)を加え、そして混合物を室温で30分間撹拌した。溶液をジエチルエーテル(250mL)で希釈し、そしてブライン/0.1M NaOH溶液30/1(v/v)で3回(それぞれ50mL)、そしてブライン(50mL)で1回洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥し、そして揮発性物質を減圧下で除去した。5aをフラッシュクロマトグラフィによって精製した。
収量:5.69g(8.09mmol)
MS:m/z 705.4=[M+H]+(計算値=705.0)
無水THF(50mL)中の5a(3.19g,4.53mmol)の溶液にBH3・THF(1m溶液,8.5mL,8.5mmol)を加え、そして溶液を室温で16時間撹拌した。さらにBH3・THF(1M溶液,14mL,14mmol)を加え、室温で16時間撹拌した。メタノール(8.5mL)を添加して反応をクエンチし、N,N−ジメチル−エチレンジアミン(3mL,27.2mmol)を加え、そして溶液を還流に加熱し、そして3時間撹拌した。混合物を室温で酢酸エチル(300mL)により希釈し、飽和Na2CO3水溶液(2×100mL)、そして飽和NaHCO3水溶液(2×100mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥し、そして揮発性物質を減圧で蒸発させて粗アミン中間体(3.22g)を得た。
MS:m/z 791.4=[M+H]+,519.3=[M−Mmt+H]+(計算値=791.1)
収量:2.52g(3.19mmol)
MS:m/z 519.3=[M+H]+(MW計算値=518.8g/mol)
5b(780mg,0.98mmol,純度約65%)及びNaCNBH3(128mg,1.97mmol)を無水メタノール(13mL)中に溶解した。DCM(2mL)中の2,4−ジメトキシベンズアルデヒド(195mg,1.17mmol)の溶液を加え、そして混合物を室温で2時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、そして粗生成物をDCM中に溶解し、そして飽和NaCO3溶液で洗浄した。水相をDCMで3回抽出し、そして合わせた有機相をブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥し、そして減圧下で濃縮した。溶離液としてDCM及びMeOHを用いて5cをフラッシュクロマトグラフィによって精製した。
収量:343mg(0.512mmol)
MS:m/z 669.37=[M+H]+,(計算値=669.95)
Fmoc−Aib−装填されたTCP樹脂(980mg,約0.9mmol)をDMF/ピペリジンで脱保護し、DMF(5回)及びDCM(6回)で洗浄し、そして真空で乾燥した。樹脂を、無水THF(6mL)中のp−ニトロフェニルクロロホルメート(364mg,1.81mmol)及びコリジン(398μL,3.0mmol)の溶液で処理し、そして30分間振盪した。試薬溶液を濾過によって除去し、そして樹脂をTHF(5回)で洗浄した後、無水THF(6mL)中のアミン5c(490mg,0.7mmol)及びDIEA(1.23mL,7.1mmol)の溶液を加えた。室温で18時間振盪した後、試薬溶液を濾過によって除去し、そして樹脂をDCM(5回)で洗浄した。リンカー試薬を樹脂から切断し、そしてRP−HPLCによって精製した。飽和水性NaHCO3の添加によって生成物画分をpH6にし、そして減圧下で濃縮した。生成したスラリーは、飽和水性NaClとDCMの間で分配し、そして水層をDCMで抽出した。合わせた有機画分を濃縮して乾燥状態にしてリンカー試薬5dを得た。
収量:230mg(0.29mmol)
MSm/z 798.41=[M+H]+,(計算値=798.1)
トリフェニルメタンチオール(11.90g,43.08mmol)をDMSO(40mL)中に懸濁した。DBU(7.41mL,49.55mmol)及び6−ブロモヘキシルフタルイミド(13.32g,42.94mmol)を加え、そして混合物を約15分間反応するにまかせた。反応混合物を酢酸エチル(700mL)と0.1M HCl(200mL)との間で分配した。水相を酢酸エチル(3×50mL)で抽出し、そして合わせた有機画分を飽和NaHCO3(80mL)及びブライン(80mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過し、そして濃縮した。粗黄色油をn−ヘプタン/酢酸エチルから再結晶させた。中間体6−(S−トリチル−)メルカプトヘキシルフタルイミドを白色固形物(13.3g,26.4mmol,62%)として得た。
MS:m/z 376.22=[M+H]+,(計算値=376.20)
収量:2.41g(6.20mmol)
MS:m/z 390.22=[M+H]+,(計算値=390.22)
6a(2.1g,5.31mmol)の溶液に2−ブロモエチルフタルイミド(1.96g,7.7mmol)及びK2CO3(1.09g,7.9mmol)を加え、そして混合物を還流に6時間加熱した。濾過して濃縮した後、粗混合物を酢酸エチルと飽和水性NaHCO3との間で分配した。粗中間体(2−(N−メチル−N−(6−トリチルメルカプトヘキシル−)アミノ)エチル)フタルイミドをフラッシュクロマトグラフィによって精製した。
収量:1.23g(2.18mmol)
MS:m/z:563.27=[M+H]+,(計算値=563.27)
収量:624mg(0.944mmol)
MS:m/z 433.27=[M+H]+,(計算値=433.26)
収量:177mg(0.219mmol)
MS:m/z 583.33=[M+H]+,(計算値=583.33)
5cの代わりにアミン6b(TFA塩として,430mg,0.53mmol)を使用すること除いて、5dについて記載されたように、Fmoc−Aib−装填された樹脂(704mg,約0.6mmol)からリンカー試薬6cを製造した。
収量:285mg(0.330mmol)
MS:m/z712.37=[M+H]+,(計算値=712.37)
リンカー試薬7fの合成
リンカー試薬7fは、以下のスキームに従って合成した:
収量:593mg(1.52mmol)
MS:m/z 377.35=[M+Na]+,(計算値=377.14)
収量:285mg(TFA塩として0.436mmol)
MS:m/z 562.54=[M+Na]+,(計算値=562.67)
収量:1.4g(94%)
MS:m/z 934.7=[M+Na]+,(計算値=934.5)
収量:780mg(60%)
MS:m/z 878.8=[M+Na]+,(計算値=878.40)
収量:154mg(0.161mmol)
MS:m/z 953.4=[M+H]+,(計算値=953.43)
MS:m/z 355.22=[M+H]+,(計算値=354.21)
収量:5.31g(148%,6.66mmol)
MS:m/z 796.38=[M+H]+,(計算値=795.37)
MS:m/z 574.31=[M+H]+,(計算値=573.30)
収量:2.63g(62%,純度94%)
MS:m/z 856.41=[M+H]+,(計算値=855.41)
収量:2.1g(88%)
MS:m/z 878.4=[M+Na]+,(計算値=878.40)
MS:m/z 953.4=[M+H]+,(計算値=953.43)
凍結乾燥した8aを、HFIP/TFA/水/トリエチルシラン90/10/2/2(v/v/v/v)(2mL/100mgの8a)の混合物を用いて室温で45分間処理した。反応混合物を水で希釈し、そしてすべての揮発性物質を窒素流れ下で除去した。NαA1結合インスリン−リンカー複合体8bをRP−HPLCによって精製した。
8b:
収量:リンカー5d 62mg(0.078mmol)から139mg(0.023mmol)
MS:m/z 1524.45=[M+4H]4+(計算値=1524.75)
NαA1結合インスリン−リンカー複合体8cは、5dの代わりに6c(72mg,0.101mmol)を使用したことを除いて8bについて記載されたように合成した。
8c:
収量:237mg(0.039mmol)
MS:m/z 1528.23=[M+4H]4+(計算値=1528.28)
NαB1−インスリン−リンカー複合体9の合成
収量:5mg(0.00075mmol)
MS:m/z 1660.27=[M+4H]4+(計算値=1660.43)
凍結乾燥された保護されたインスリン−リンカー複合体を、HFIP/TFA/水/TES 90/10/2/2(v/v/v/v)1mLを用いて室温で45分間処理した。反応混合物を水0.5mLで希釈し、そしてすべての揮発性物質を窒素流れ下で除去した。NaB1−結合インスリン−リンカー複合体9をRP−HPLCによって精製した。
収量:4mg(0.0007mmol)
MS:m/z 1524.46=[M+4H]4+(計算値=1524.75)
NεB29−インスリンリンカー複合体10の合成
収量:172mg(0.025mmol)
MS:m/z 1662.27=[M+4H]4+(計算値=1662.48)
保護基の除去は、HFIP/TFA/TES/水90/10/2/2(v/v/v/v)6mLを用いて、凍結乾燥された生成物画分を室温で1時間処理することによって実施した。NεB29−結合インスリン−リンカー複合体10をRP HPLCによって精製した。
収量:143mg(0.023mmol)
MS:m/z 1531.46=[M+4H]4+(計算値=1531.71)
インスリン−リンカー−ヒドロゲル11aをアセトニトリル/水/TFA 1/1/0.001(v/v/v)で10回洗浄し、そして4℃で保存した。
インスリン含量は、pH12の還元条件下におけるインスリン−リンカー−ヒドロゲルのアリコートの全加水分解並びにその後のRP−HPLCによるインスリンA鎖及びインスリンB鎖の定量によって決定した。
インスリン175mg/インスリン−リンカー−ヒドロゲルのg
10mM酢酸ナトリウムバッファpH5,135mM塩化ナトリウム中の11a懸濁液中のインスリン量:11a懸濁液1ml当たりインスリン12mg
11b、11c、及び11dは、8bの代わりに、それぞれ8c、9及び10を使用したことを除いて上記のように製造した。
pH2.5 HCl、0.01%Tween−20中のマレイミド官能化ヒドロゲル4aの懸濁液(5.0mL,119μmolマレイミド基)を、フィルターを備えた注射器に充填した。pH2.5のHCl 8.0mL、0.01%Tween−20中のインスリン−リンカー−チオール10(166mg,24.4μmol)の溶液を加え、そして懸濁を室温で5分間定温放置した。コハク酸ナトリウムバッファ(3.9mL,pH4.0,150mM;1mM EDTA,0.01%Tween−20)を加えてpH3.6を得、そしてサンプルを室温で90分間定温放置した。チオールの消費をエルマン試験によってモニターした。ヒドロゲルをコハク酸ナトリウムバッファ(pH3.0,50mM;1mM EDTA,0.01%Tween−20)で10回、そして200mMアセチルシステインを含むコハク酸ナトリウムバッファ(pH3.0,50mM;1mM EDTA,0.01%Tween−20)で3回洗浄した。最後に、ヒドロゲルを、アセチルシステイン含有バッファ中に懸濁し、そして室温で1時間定温放置した。
インスリン−リンカー−ヒドロゲル11dbをコハク酸バッファ(pH3.0,50mM;1mM EDTA,0.01%Tween−20)で10回、そして酢酸ナトリウムバッファ(pH5.0,10mM;130mM NaCl,0.01%Tween−20)で8回洗浄した。
11dbのインスリン装填量:インスリン−リンカー−ヒドロゲル懸濁液のmL当たりインスリン6.12mg
pH2.5 HCl、0.01%Tween−20(58.3mL,958μmolマレイミド基)中のマレイミド官能化ヒドロゲル4aの懸濁液を固相合成反応器に加えた。2.5HCl、0.01%Tween−20中のインスリン−リンカー−チオール10(117mL,460μmol)の溶液を4aに加えた。懸濁液を室温で5分間定温放置した。コハク酸バッファ(4.8mL,pH4.0,150mM;1mM EDTA,0.01%Tween−20)を加えてpH3.6を得、そして懸濁液を室温で90分間定温放置した。
チオールの消費をエルマン試験によってモニターした。ヒドロゲルを、コハク酸バッファ(pH3.0,50mM;1mM EDTA,0.01%Tween−20)で10回、そして10mMメルカプトエタノールを含むコハク酸バッファ(pH3.0,50mM;1mM EDTA,0.01%Tween−20)で2回洗浄した。最後に、ヒドロゲルをメルカプトエタノール含有バッファ中に懸濁し、そして室温で3時間定温放置した。インスリン−リンカー−ヒドロゲル11dcをコハク酸塩バッファ(pH3.0,50mM;1mM EDTA,0.01%Tween−20)で10回、そしてコハク酸/トリスバッファ(pH5.0,10mM;85g/Lトレハロース,0.01%Tween−20)で6回洗浄した。
11dcのインスリン装填量:インスリン−リンカー−ヒドロゲル懸濁液のmL当たりインスリン18.7mg
別法として、4aの代わりにマレイミド誘導化ヒドロゲルマイクロ粒子4aaを用いることができる。
インビトロ放出速度論
インスリン−リンカー−ヒドロゲル11a、11b、11c及び11d(インスリン約1mgを含むインスリン−リンカー−ヒドロゲル)を、それぞれ、2mlの60mMリン酸ナトリウム、3mM EDTA、0.01%Tween−20、pH7.4中に懸濁し、そして37℃で定温放置した。時間間隔をとって懸濁液を遠心分離し、そして上澄みを215nmのRP−HPLC及びESI−MSによって分析した。遊離インスリンに関連するUV−シグナルを積分し、そして定温放置時間に対してプロットした。曲線適合ソフトウェアを適用して対応する放出の半減期を評価した。16d、10d、30d及び14dのインビトロ半減期を、それぞれ、11a、11b、11c及び11dについて決定した。
別法として、インスリン−リンカー−ヒドロゲル11dbを、フィルターを備えた注射器に移し、6mlの60mMリン酸ナトリウム、3mM EDTA、0.01%Tween−20、pH7.4中で懸濁し、そして37℃で定温放置した。所定の時点で、上澄みを交換し、そして遊離されたインスリンを215nmのRP−HPLCによって定量化した。放出されたインスリンの量を、定温放置時間に対してプロットした。曲線適合ソフトウェアを適用し、そして11dbについては、インビトロ半減期が15日と決定された。
別法として、インスリン−リンカー−ヒドロゲル11dbをクロマトグラフィカラムに充填し、そして温度制御された恒温器(37℃)中に置いた。リン酸ナトリウム(pH7.4,60mM;3mM EDTA,0.01%Tween−20)を、0.25mL/時(公称)の一定流量でカラムを通してポンピングし、そして恒温器の外側で集めた。所定の時点で、溶液を215nmでRP−HPLCによって分析した。放出されたインスリンの量を定温放置時間に対してプロットした。曲線適合ソフトウェアを適用し、そして11dbについては、インビトロ半減期が13日と決定された。
インスリンのLysB29−リンカー複合体(12a)及びインスリンリスプロのLysB28−リンカー複合体(12b)の合成:
インスリンのLysB29−リンカー複合体(12a)の合成
UPLC分析(RP HPLC精製前)による位置選択性:0.70%の7fがインスリンのGlyA1に結合し、そして76.2%の7fがインスリンのLysB29に結合した(図1a参照)。
収量:862mg(TFA塩,60%)
MS[M+H]1/4 +=1662.25g/mol((MW+H)1/4計算値=1662.35g/mol)
UPLC分析(RP HPLC精製前)による位置選択性:生成物の1.3%は、インスリンリスプロのGlyA1に結合した7fであり、生成物の76.7%は、インスリンリスプロのLysB28に結合した7fであった(図1b参照)。
収量:305mg(TFA塩,72%)
MS[M+H]1/4 +=1662.25g/mol((MW+H)1/4計算値=1662.35g/mol)
ラットにおける薬物動態研究
ラットに一回量を皮下適用した後、血漿インスリン濃度を測定することによって11aの薬物動態を決定した。
10匹の雄ウィスターラット(200〜250g)からなる一群を用いて14日間にわたる血漿インスリン値を研究した。各動物にインスリン6mg(インスリン12mg/ml)を含む酢酸バッファpH5中の11a懸濁液500μLを単回皮下注射した。動物及び時点毎に血液200μLを舌下から採血してLi−ヘパリン血漿100μLを得た。適用前、並びに注射後の4時間、1、2、3、4、7、9、11及び14日後にサンプルを採取した。採血後、15分以内に血漿サンプルを凍結し、そして検定するまで−80℃で保存した。超高感度インスリンELISAキット(Mercodia)を用いて製造者のプロトコールに従って血漿インスリン濃度を測定した。
測定前に血漿サンプルをELISAバッファ(キャリブレータ0で1:5及び1:10)中に希釈した。インスリン標準を二通りに測定し、そして線形回帰を用いて値を適合させることによって得た検量線からインスリン濃度を算出した。インスリン濃度は、それぞれの希釈係数によって修正され、時間に対してプロットされた2つの独立した希釈系列からの平均として定義された。各時点の平均血漿インスリン濃度は、図2に示すように用いたすべての動物の平均を算出することによって得た。
14日にわたってインスリンのバーストのない持続的放出が観察された。
健常なラットにおいて13日間にわたって血漿インスリン濃度を測定することによって11daの薬物動態を決定した。8匹のウィスターラット(体重約250g)にインスリン3mg(約12mg/kg)を含む酢酸バッファpH5中の試験品目11da500μLを単回皮下注射した。動物及び時点毎に血液200μLを尾静脈から採血してLi−ヘパリン血漿約100μLを得た。試験品目投与の1日前並びに4時間、1日、2日、3日、6日、7日、8日、10日及び13日後にサンプルを採取した。血漿サンプルを凍結し、そして検定するまで−80℃で保存した。ヒトインスリン超高感度ELISAキット(DRG Instruments GmbH, Germany)を用いて製造者の説明に従って血漿サンプルのインスリン含量を測定した。ブランク(キャリブレータ0)は、検量線に含まれており、そしてサンプル値から差し引かれており、そして3次元の多項式を用いて検量線を適合させた。分析前に血漿サンプルをかき混ぜ、そして反応管中で希釈した(キャリブレータ0で1:5及び1:10)。分析のため、マイクロタイタープレートリーダー(Tecan Ultra)を用いて参照波長補正なしで450nmのODを測定した。研究したすべての動物について13日目までの血漿インスリン含量の結果を図3に示す。
インスリン3mgを含む11d500μLの単回皮下注射後、平均血漿インスリン値は、1日目に最大約500pmまで上昇した。予想通り、血漿インスリン濃度は、その後2週間のうちに連続的に低下した。本研究の第1週内の血漿インスリン値のピーク対トラフ比は、約1.7であった。
ラットにおける薬物動態及び薬力学研究
糖尿病スプレーグドーリー(Sprague-Dawley)(SD)ラットを用いた探索的薬物動態学的/薬力学的研究において血漿インスリン濃度及び血糖低下効果を分析することによって放出されたインスリンの量及び生物活性(bioactivity)を研究した。この目的のため、ストレプトゾトシン(STZ)を用いて8匹のラットに糖尿病を誘発させ、そして血糖値が0日目において350mg/dLより上のすべての動物を本研究に含めた。8匹のSDラットのうちの7匹は、糖尿病になり、そしてインスリン6.4mgを含む酢酸バッファpH5中の試験品目11da500μLを単回皮下注射した。動物及び時点毎に血液200μLを尾静脈から採血してLi−ヘパリン血漿約100μLを得た。試験品目投与の4日前、並びに2時間、1日、2日、3日、6日、7日、8日、10日及び13日後にサンプルを採取した。血漿サンプルを凍結し、そして検定するまで−80℃で保存した。注射前に3回並びに試験品目投与の2時間、1日、2日、3日、6日、7日、8日、10日、13日、15日、17日、20日、22日及び24日後に、AccuChek Comfort器具を用いて尾静脈から血糖を測定した。ヒトインスリンELISAキット(DRG Instruments GmbH, Germany)を用いて製造者の説明に従って血漿サンプルのインスリン含量を測定した。検量線にはブランク(キャリブレータ0)が含まれており、サンプル値から差し引き、そして3次元の多項式を用いて検量線を適合させた。分析前に血漿サンプルをかき混ぜ、そして反応管(キャリブレータ0で1:5及び1:10)中で希釈した。分析のため、マイクロタイタープレートリーダー(Tecan Ultra)を用いて参照波長の補正なしに450nmのODを測定した。図4に示すように血漿インスリン値を2週間にわたって、そして血糖値を3週間にわたってモニターした。
インスリンヒドロゲル11daの単回皮下注射後、血糖値は10日間にわたって効果的に低下し、低血糖に関するなんらかの症状もなく100mg/dL以下の値であった。動物当たりインスリン6.4mgのより高い用量のため、最大血漿インスリン濃度は、1日目に約800pMであり、そして2週間のうちに約300pMまで連続的に低下した。同時に血糖値は、10日後に上昇を始め、そして3週間後に投薬前の値に到達した。
ラットにおける24時間にわたる薬物動態研究(バースト研究)
インスリンがインスリン−リンカー−ヒドロゲルからバーストなしに放出されることを立証するため、健常なラットにおいて24時間にわたって血漿インスリン濃度をモニターした。8匹のスプレーグドーリーラット(体重200〜250g)を2つの群に分け、そして体重1kg当たり酢酸バッファpH5中の試験品目11db2mLを単回皮下注射した。試験品目は、各動物が体重1kg当たりインスリン8mgを受けるように4mg/mlのインスリンの濃度を有した。動物及び時点毎に血液200μLを尾静脈から採血してLi−ヘパリン血漿約100μLを得た。群Aサンプルは、投薬前並びに試験品目適用の5分、30分、2時間、4時間及び8時間後、そして群Bについては、投薬前並びに試験品目投与の15分、1時間、3時間、6時間及び24時間後に採取した。血漿サンプルを凍結し、そして検定するまで−80℃で保存した。ヒトインスリン超高感度ELISAキット(DRG Instruments GmbH, Germany)を用いて製造者の説明に従って血漿サンプルのインスリン含量を測定した。検量線にはブランク(キャリブレータ0)が含まれており、サンプル値から差し引き、そして3次元の多項式を用いて検量線を適合させた。分析前に血漿サンプルをかき混ぜ、そして反応管(キャリブレータ0で1:5及び1:10)中で希釈した。分析のため、マイクロタイタープレートリーダー(Tecan Ultra)を用いて参照波長の補正なしに450nmのODを測定した。結果を図5に示し、そしてインスリンがなんらバーストなしに放出されることを明白に示している。
ラットにおける薬物動態及び薬力学反復投与研究
糖尿病ラットにおいて4週間にわたって血漿インスリン濃度及び血糖値を測定することによって11daを毎週3回投与した後の薬物動態及び薬力学を決定した。
平均体重239gの8匹のスプレーグドーリーラットを用いた。ストレプトゾトシン(STZ)で糖尿病を誘発させ、そして0日目(試験品目注射日)に血糖値が350mg/dLより上のすべての動物を本研究に含めた。STZ処置を受けた8匹の動物のうち8匹が糖尿病になり、そして体重1kg当たり酢酸バッファpH5中の試験品目11da2mLを0、7及び14日目に毎週3回皮下注射した。4mg/mlの試験品目インスリン濃度では、適用された用量は、体重1kg当たりインスリン8mgであった。動物及び時点毎に200μLの血液を尾静脈から採血してLi−ヘパリン血漿約100μLを得た。試験品目投与の3日前、そして28日後までサンプルを採取した。血漿サンプルを凍結し、そして検定するまで−80℃で保存した。注射前に3回、そして注射後30日までAccuChek Comfort器具を用いて尾静脈から血糖を測定した。ヒトインスリンELISAキット(DRG Instruments GmbH, Germany)を用いて製造者の説明に従って血漿サンプルのインスリン含量を測定した。検量線にはブランク(キャリブレータ0)が含まれており、サンプル値から差し引き、そして3次元の多項式を用いて検量線を適合させた。分析前に血漿サンプルをかき混ぜ、そして反応管(キャリブレータ0で1:5及び1:10)中で希釈した。分析のため、マイクロタイタープレートリーダー(Tecan Ultra)を用いて参照波長の補正なしに450nmのODを測定した。血漿インスリン値及び血糖値を4週間にわたってモニターし、そして両方を図6に示す。
曲線の形状は、3回目の注射後に血糖値を約100mg/dLの値まで着実に低下させ、それは約1週間低いままであったことにより放出されたインスリンが生物活性であることを示している。同時に、最大インスリン濃度は、1回目の後に200pMから始まり、そして2回目の投薬後に300pM、3回目の投薬後に400pMまで着実に上昇し、そして、その後、2週間のうちに100pM以下の値に再び低下した。
ラットにおける薬物動態研究
健常なラットにおいて13日間にわたって血漿インスリン濃度を測定することによって11dcの薬物動態を決定した。
8匹のウィスターラット(体重約230g)にインスリン3mg(12mg/kgの用量)を含む、コハク酸バッファpH5(10mMコハク酸/トリス,85g/lトレハロース,0.01%Tween]20,pH5.0)中の2ml/kgの試験品目11dcを単回皮下注射した。動物及び時点毎に血液200μLを尾静脈から採血してLi−ヘパリン血漿約100μLを得た。試験品目投与の4日前、そして0.3時間(4匹の動物)、1時間(4匹の動物)、2時間(4匹の動物)、4時間(4匹の動物)、1日、2日、3日、6日、8日、10日及び13日後にサンプルを採取した。血漿サンプルを凍結し、そして検定するまで−80℃で保存した。ヒトインスリン超高感度ELISAキット(DRG Instruments GmbH, Germany)を用いて製造者の説明に従って血漿サンプルのインスリン含量を測定した。検量線にはブランク(キャリブレータ0)が含まれており、サンプル値から差し引き、そして3次元の多項式を用いて検量線を適合させた。分析前に血漿サンプルをかき混ぜ、そして反応管(キャリブレータ0で1:5及び1:10)中で希釈した。分析のため、マイクロタイタープレートリーダー(Tecan Ultra)を用いて参照波長の補正なしに450nmのODを測定した。研究したすべての動物についての13日目までの血漿インスリン含量の結果を図7に示す。
12mg/kgの11dcを単回皮下注射した後、平均血漿インスリン値は、1日目に最大約500pMまで上昇した。予想通り、血漿インスリン濃度は、その後、2週間のうちに連続的に低下した。最初の週のうち、血漿インスリンのピーク対トラフ比は、約1.4であった。
pH7.4でのリアルタイムインスリン放出及びヒドロゲル分解
pH5.0の酢酸バッファ(10mM,130mM NaCl,0.01%(w/v)トゥイーン−20)中のインスリン−リンカーヒドロゲル11a(730μL,インスリン3.19mgを含む)を、pH7.4の放出バッファ(60mMリン酸ナトリウム,3mM EDTA,0.01%(w/v)Tween−20)で3回洗浄したサンプル調合管中に充填し、そして1.00mLまで満たした。懸濁液のアリコート(0.5mL,インスリン1.59mg)をクロマトグラフィカラム中に充填し、そして温度制御された恒温器(37℃)中に置いた。放出バッファ(pH7.4)を0.25mL/時(公称)の一定流量でカラムを通してポンピングし、そして恒温器の外側で集めた。所定の時点で溶液をRP−HPLC(215nm)によって分析した。放出されたインスリンの量を定温放置時間に対してプロットし、そして曲線適合ソフトウェアを適用して対応する放出半減期を推定した。インスリン放出については、半減期が9.4日と決定された。
37℃で39日の定温放置後、ヒドロゲル懸濁液をサンプル調合管に移し、pH7.4の放出バッファを用いて残留ヒドロゲルをカラムから洗浄し、そしてサンプルを1.00mLまで満たした。2つのアリコート(それぞれ300μL)を滅菌サンプル調合管に移し、1.5mLまで満たし、そして37℃で定温放置した。時間間隔をおいてサンプルを採取し、そしてサイズ排除クロマトグラフィによって分析した。1つ又はそれ以上の骨格鎖部分(反応性官能基に対応する)を含むヒドロゲル放出された水溶性分解生成物に相当するUV−シグナルを積分し、そして定温放置時間に対してプロットした、図8参照。
インスリン−リンカー−ヒドロゲルプロドラッグの注射可能性
pH5.0のコハク酸/トリス(10mM,40g/Lマンニトール;10g/Lトレハロース二水和物;0.05%Tween−20)中のインスリン−リンカー−ヒドロゲルプロドラッグ11dc(32−75mからのビーズサイズ分布、インスリン18mg/ml)5mLを用いた。20Gの注射針を介してインスリン−リンカー−ヒドロゲルプロドラッグ懸濁液を1mLの注射器(長さ57mm)に充填した。20Gの注射針を30Gの注射針と交換し、そして注射器台(Aqua Computer GmbH&Co. KG)に設置し、そして172mm/分(50μL/秒に等しい)のピストン速度で測定を開始した(押込試験台(Force test stand):Multitest 1-d,データ記録ソフトウェア:EvaluatEmperor Lite, Version 1.16-015、Forge Gauge:BFG 200 N(すべてMecmesin Ltd., UK)。下の表に示したピストン速度を高める実験は、新しいインスリン−リンカー−ヒドロゲルプロドラッグサンプルを用いて実施した。水及びエチレングリコールを用いた実験を、それに応じて実施した。すべての実験で、同じ30Gの注射針を用いた。30Gの注射針を用いた力対流量を図9に示す。
AcOH 酢酸
AcOEt 酢酸エチル
Aib 2−アミノイソ酪酸
Bn ベンジル
Boc t−ブチルオキシカルボニル
COMU (1−シアノ−2−エトキシ−2−オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ−モルホリノ−カルベニウムヘキサフルオロホスフェート
DBU 1,3−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデセン
DCC N,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド
DCM ジクロロメタン
DIEA ジイソプロピルエチルアミン
DMAP ジメチルアミノピリジン
DMF N,N−ジメチルホルムアミド
Dmob 2,4−ジメトキシベンジル
DMSO ジメチルスルホキシド
EDC 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
EDTA エチレンジアミン四酢酸
eq 化学量論的当量
ESI−MS エレクトロスプレーイオン化質量分析
EtOH エタノール
Fmoc 9−フルオレニルメトキシカルボニル
HATU O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N',N'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HFIP ヘキサフルオロイソプロパノール
HPLC 高性能液体クロマトグラフィ
HOBt N−ヒドロキシベンゾトリアゾール
iPrOH 2−プロパノール
LCMS 質量分析連動液体クロマトグラフィ
Mal 3−マレイミドプロピル
Mal−PEG6−NHS N−(3−マレイミドプロピル)−21−アミノ−4,7,10,13,16,19−ヘキサオキサ−ヘンエイコサン酸NHSエステル
Me メチル
MeCN アセトニトリル
MeOH メタノール
Mmt 4−メトキシトリチル
MS 質量スペクトル/質量分析
MTBE メチルtert.−ブチルエーテル
MW 分子量
n.d. 未検出
NHS N−ヒドロキシスクシンイミド
OD 光学濃度
OBu ブチルオキシ
OtBu tert.−ブチルオキシ
PEG ポリ(エチレングリコール)
Phth フタル−
PyBOP ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
RP−HPLC 逆相高性能液体クロマトグラフィ
rpm 1分当たりの回数
RT 室温
SEC サイズ排除クロマトグラフィ
Su スクシンイミジル
TCP 2−クロロトリチルクロリド樹脂
TES トリエチルシラン
TFA トリフルオロ酢酸
THF テトラヒドロフラン
TMEDA N,N,N',N'−テトラメチルエチレンジアミン
Tmob 2,4,6−トリメトキシベンジル
Trt トリフェニルメチル、トリチル
UPLC 超高性能液体クロマトグラフィ
UV 紫外線
VIS ビジュアル(visual)
Claims (71)
- インスリンリンカー複合体D−L[式中、
Dは、インスリン部分を表し;そして
−Lは、式(I)
Xは、C(R3R3a);又はN(R3)であり;
R1a、R3aは、H、NH(R2b)、N(R2b)C(O)R4及びC1-4アルキルからなる群より独立して選ばれ;
R1、R2、R2a、R2b、R3、R4は、H及びC1-4アルキルからなる群より独立して選ばれる)
によって表される生物活性のないリンカー部分−L1であり、
ここにおいて、L1は、1つのL2−Zで置換され、そして場合によりさらに置換されるが、但し、式(I)中のアスタリスクでマークされた水素は、置換基によって置き換えられず、そしてここにおいて、
L2は、単化学結合又はスペーサーであり;そして
Zは、ヒドロゲルである]
を含むプロドラッグ又はその薬学的に許容しうる塩。 - 式(I)において、R2がL2−Zによって置き換えられる、請求項1に記載のプロドラッグ。
- 式(I)において、R1がL2−Zによって置き換えられる、請求項1に記載のプロドラッグ。
- 式(I)において、XがN(R3)である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のプロドラッグ。
- 式(I)において、XがC(R3R3a)であり、そしてR3aがN(R2b)C(O)R4である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のプロドラッグ。
- XがC(R3R3a)であり、そしてR3aがL2−Zによって置き換えられる、請求項1に記載のプロドラッグ。
- XがC(R3R3a)であり、R3aがN(R2b)−L2−Zである、請求項1に記載のプロドラッグ。
- L1がさらに置換されない、請求項1〜7のいずれか1項に記載のプロドラッグ。
- インスリン部分が窒素NαA1を通してL1に結合された、請求項1〜8のいずれか1項に記載のプロドラッグ。
- インスリンが組換え型のヒトインスリンである、請求項1〜9のいずれか1項に記載のプロドラッグ。
- 組換え型のヒトインスリンがインスリン部分のリシン側鎖の窒素を通してL1に結合された、請求項10に記載のプロドラッグ。
- ヒドロゲルZが生分解性ポリ(エチレングリコール)(PEG)ベースの水不溶性ヒドロゲルである、請求項1〜11のいずれか1項に記載のプロドラッグ。
- ヒドロゲルが、加水分解により分解可能な結合によって相互連結された骨格鎖部分で構成される、請求項1〜12のいずれか1項に記載のプロドラッグ。
- 骨格鎖部分が1kDaから20kDaまでの範囲の分子量を有する、請求項13に記載のプロドラッグ。
- 骨格鎖部分がクロスリンカー部分を通して一緒に連結され、各クロスリンカー部分が加水分解により分解可能な結合の少なくとも2つによって終了する、請求項13又は14に記載のプロドラッグ。
- クロスリンカー部分が0.5kDaから5kDaまでの範囲の分子量を有する、請求項15に記載のプロドラッグ。
- L2が骨格鎖部分に連結される、請求項13〜16のいずれか1項に記載のプロドラッグ。
- ヒドロゲルが生分解性ポリエチレングリコール(PEG)ベースの水不溶性ヒドロゲルである、請求項19又は20に記載のプロドラッグ。
- ヒドロゲルが加水分解により分解可能な結合によって相互連結された骨格鎖部分で構成される、請求項19〜21のいずれか1項に記載のプロドラッグ。
- 骨格鎖部分が超分枝部分Hypを含む、請求項13〜24のいずれか1項に記載のプロドラッグ。
- マイクロ粒子の形態の請求項1〜29のいずれか1項に記載のプロドラッグ。
- マイクロ粒子が20〜100マイクロメートルの直径を有する、請求項30に記載のプロドラッグ。
- マイクロ粒子が内径0.6mmより小さな注射針による注射によって投与することができる請求項30に記載のプロドラッグ。
- マイクロ粒子が内径0.3mmより小さな注射針による注射によって投与することができる請求項30に記載のプロドラッグ。
- マイクロ粒子が内径0.2mmより小さな注射針による注射によって投与することができる請求項30に記載のプロドラッグ。
- 請求項1〜34のいずれか1項に記載のプロドラッグ又はその薬学的に許容しうる塩を薬学的に許容しうる賦形剤と共に含む薬学的組成物。
- 薬学的組成物が乾燥している、請求項37に記載の薬学的組成物。
- 薬学的組成物が凍結乾燥によって乾燥される、請求項38に記載の薬学的組成物。
- インスリンヒドロゲルプロドラッグが、1回の適用で少なくとも3日間、治療有効量のインスリンを提供するように組成物で十分に投与される、請求項37〜39のいずれか1項に記載の組成物。
- 単回投与組成物である、請求項37〜40のいずれ1項に記載の組成物。
- 反復投与組成物である、請求項37〜40のいずれか1項に記載の組成物。
- 1つ又はそれ以上のさらなる生物活性物質を、その遊離形態で;プロドラッグとして、特にヒドロゲルプロドラッグとしてのいずれかで含み;そして1つ又はそれ以上のさらなる生物活性物質が、クロルプロパミド、トラザミド、トルブタミド、グリブリド、グリピジド、グリメピリドなどのようなスルホニル尿素;レパグリニドなどのようなメグリチニド;グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)及びその模倣剤、グルコース−インスリン分泌性ペプチド(GIP)及びその模倣剤、エキセンジン及びその模倣剤、及びジペプチルプロテアーゼ阻害剤(DPPIV);メトホルミンなどのようなビグアニド;ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、イサグリタゾン(MCC−555として知られる)、2−[2−[(2R)−4−ヘキシル−3,4−ジヒドロ−3−オキソ−2H−1,4−ベンゾオキサジン−2−イル]エトキシ]−ベンゼン酢酸などのようなチアゾリジンジオン;GW2570など;ターグレチン、9−cis−レチノイン酸などのようなレチノイド−X受容体(RXR)モジュレーター;INS−1、PTP−1B阻害剤、GSK3阻害剤、グリコーゲンホスホリラーゼa阻害剤、フルクトース−1,6−ビスホスファターゼ阻害剤などのような他のインスリン抵抗性改善剤;通常のインスリン、又は速効型、中間型及び持続型インスリン、吸入用インスリン、及び天然アミノ酸配列においてマイナーな違いを有するインスリン分子のようなインスリン類似体を含むインスリン類;L−783281、TE−17411などを含むがそれらに限定されないインスリンの小分子模倣剤;T−1095、T−1095A、フロリゼンなどのようなNa−グルコース共輸送体阻害剤;プラムリンチドなどを含むがそれらに限定されないアミリン作動剤;AY−279955などのようなグルカゴン拮抗剤;オルリスタットのような抗肥満剤;膵リパーゼ阻害剤;シブトラミン;ノルエピネフリン及びドーパミン;成長ホルモン、IGF−1、成長ホルモン放出因子;オキシントモジュリン及びグレリンモジュレーター;ベンズフェタミン、フェンメトラジン、フェンテルミン、ジエチルプロピオン、マジンドール、シブトラミン、フェニルプロパノールアミン又はエフェドリンのような食欲抑制剤;キパジン、フルオキセチン、セルトラリン、フェンフルラミン、又はデクスフェンフルラミンのような食欲抑制剤;アポモルヒネのような食欲抑制剤;ヒスタミン模倣剤、H3受容体モジュレーターのような食欲抑制剤;ベータ−3アドレナリン作動剤及び脱共役タンパク質機能の刺激剤のようなエネルギー消費の促進剤;レプチン及びレプチン模倣剤(例えばメトレレプチン);ニューロペプチドY拮抗剤;メラノコルチン−1、3及び4受容体モジュレーター;コレシストキニン作動剤;グルカゴン様ペプチド−1模倣剤及びエキセンジンのような類似体;デヒドロエピアンドロステロンのようなアンドロゲン及びエチオコランジオンのような誘導体;テストステロン;オキサンドロロンのようなアナボリックステロイド、及びステロイドホルモン;ガラニン受容体拮抗剤;毛様体神経栄養因子のようなサイトカイン剤;アミラーゼ阻害剤;からなる群より選ばれる、請求項37〜42のいずれか1項に記載の組成物。
- 請求項37〜43に記載の薬学的組成物を含む容器。
- 容器がデュアルチャンバー型注射器である、請求項44に記載の容器。
- 請求項37及び40〜43のいずれか1項に記載の薬学的組成物を含む懸濁剤。
- 請求項38又は39に記載の乾燥薬学的組成物を、再構成溶液を加えることによって再構成する工程を含む、請求項46に記載の懸濁剤の製造方法。
- 注射針、並びに注射針と共に使用するための再構成溶液及び請求項38又は39に記載の乾燥組成物を含む容器を含むパーツのキット。
- 容器がデュアルチャンバー型注射器であり、そしてデュアルチャンバー型注射器の二チャンバーの一方が乾燥薬学的組成物を含み、そして該デュアルチャンバー型注射器の第2のチャンバーが再構成溶液を含む、請求項48に記載のパーツのキット。
- 薬剤として使用するための請求項1〜34のいずれか1項に記載のプロドラッグ又は請求項37〜43のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
- インスリンによって治療することができる疾患又は障害の治療又は予防方法に使用するための請求項1〜34のいずれか1項に記載のプロドラッグ又は請求項37〜43のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
- インスリンのε−アミノ基、又は1つ又はそれ以上の遊離α−アミノ基及び遊離ε−アミノ基を有するインスリン類似体のε−アミノ基を1つ又はそれ以上の保護された官能基を含むアシル化剤でアシル化する方法であって、極性溶媒中8.0から9.0より下のpHでインスリン又はインスリン類似体を1つ又はそれ以上の保護された官能基を含む可溶性アシル化剤と反応させることを含む、上記方法。
- pHが8.0から8.9である請求項52に記載の方法。
- インスリン又はインスリン類似体のε−窒素に連結されたアシル基を有し、ここで当該アシル基が1つ又はそれ以上の保護された官能基を有することを特徴とするインスリン化合物。
- インスリン−リンカー試薬D−L*[式中、
Dは、インスリン部分を表し;そして
L*は、式(IV)
Xは、C(R3R3a);又はN(R3)であり;
R1a、R3aは、H、NH(R2b)、N(R2b)C(O)R4及びC1-4アルキルからなる群より独立して選ばれ;
R1、R2 R2a、R2b、R3、R4は、H及びC1-4アルキルからなる群より独立して選ばれる)
によって表される生物活性のないリンカー試薬であり、
ここにおいて、L*は1つのL2*で置換され、そして場合によりさらに置換されるが、但し、式(IV)中のアスタリスクでマークされる水素は、置換基によって置き換えられることはなく、そしてここにおいて、
L2*は、L*に連結したスペーサーであり、そして反応性の生分解性ヒドロゲルに複合するための化学官能基を含む]。 - 式(IV)において、R2がL2*によって置き換えられる、請求項55に記載のインスリン−リンカー試薬。
- 式(IV)において、R1がL2*によって置き換えられる、請求項56に記載のインスリン−リンカー試薬。
- 式(IV)において、XがN(R3)である、請求項55〜57のいずれか1項に記載のインスリン−リンカー試薬。
- 式(IV)において、XがC(R3R3a)であり、そしてR3aがN(R2b)C(O)R4である、請求項55〜57のいずれか1項に記載のインスリン−リンカー試薬。
- XがC(R3R3a)であり、そしてR3aがL2*によって置き換えられる、請求項55に記載のインスリン−リンカー試薬。
- XがC(R3R3a)であり、R3aがN(R2b)−L2*である、請求項55に記載のインスリン−リンカー試薬。
- L*がさらに置換されない、請求項55〜61のいずれか1項に記載のインスリン−リンカー試薬。
- L2*がチオール基を含む、請求項55〜62のいずれか1項に記載のインスリン−リンカー試薬。
- L2*がマレイミド基を含む、請求項55〜62のいずれか1項に記載のインスリン−リンカー試薬。
- (a)マレイミド官能化ヒドロゲルマイクロ粒子を含む水性懸濁液をpH2〜5の緩衝水溶液中、室温から4℃の間の温度で請求項63のインスリン−リンカー試薬を含む溶液と接触させてインスリン−リンカー−ヒドロゲル複合体を生じさせる工程;
(b)場合により、工程(a)からのインスリン−リンカー−ヒドロゲル複合体をpH2〜5の緩衝水溶液中、室温から4℃の間の温度で34Da〜500Daのチオール含有化合物で処理する工程;
を含む、請求項1〜34及び55、51のいずれか1項に記載のプロドラッグの製造方法。 - (a)チオール官能化ヒドロゲルマイクロ粒子を含む水性懸濁液をpH2〜5の緩衝水溶液中、室温から4℃の間の温度で請求項64のインスリン−リンカー試薬を含む溶液と接触させてインスリン−リンカー−ヒドロゲル複合体を生じさせる工程;
(b)場合により、工程(a)からのインスリン−リンカー−ヒドロゲル複合体をpH2〜5の緩衝水溶液中、室温から4℃の間の温度で100〜300Daのマレイミド含有化合物で処理する工程;
を含む、請求項1〜34及び55、51のいずれか1項に記載のプロドラッグの製造方法。 - (a)請求項30に記載のプロドラッグをマイクロ粒子の形態に調製する工程;
(b)マイクロ粒子を篩別する工程;
(c)プロドラッグビーズ径25〜80μmの画分を選別する工程;
(d)工程(c)のビーズ画分を注射に適した緩衝水溶液中に懸濁する工程;
を含む、注射針で注射可能なプロドラッグの調製方法。 - 請求項67に記載の方法から入手可能な注射針で注射可能なプロドラッグ。
- 内径300μm未満の注射針を通して注射可能な請求項68に記載のプロドラッグ。
- 内径225μm未満の注射針を通して注射可能な請求項68に記載のプロドラッグ。
- 内径175μm未満の注射針を通して注射可能な請求項68に記載のプロドラッグ。
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