ES2943720T3 - Compuestos de PTH con bajas relaciones de pico a valle - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de PTH, en la que, después de la administración subcutánea, el perfil farmacocinético del compuesto de PTH muestra una relación de pico a valle de menos de 4 dentro de un intervalo de inyección. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos de PTH con bajas relaciones de pico a valle
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de PTH como se define en la reivindicación 1.
El hipoparatiroidismo es un trastorno endocrino raro del metabolismo del calcio y el fosfato que se produce con mayor frecuencia como resultado del daño o la extirpación de la glándula paratiroides durante la cirugía de la glándula tiroides. El hipoparatiroidismo es inusual entre los trastornos endocrinos debido a que no ha sido tratado, hasta hace poco, mediante el reemplazo con la hormona faltante, la hormona paratiroidea o PTH, por sus siglas en inglés. La terapia convencional para el hipoparatiroidismo implica grandes dosis de vitamina D y suplementos de calcio por vía oral, que, aunque a menudo es eficaz, se asocia con cambios marcados en el Ca2+ sanguíneo que dan como resultado hipercalcemia e hipocalcemia, excreción urinaria excesiva de calcio y nefrocalcinosis.
El calcio es el mineral más abundante en el cuerpo humano y su estrecha regulación es necesaria para muchas funciones biológicas críticas, tales como mineralización ósea, contracción muscular, conducción nerviosa, liberación de hormonas y coagulación de la sangre. Es particularmente importante mantener la concentración de calcio lo más estable posible, debido a la alta sensibilidad de diversos sistemas celulares u órganos, incluyendo el sistema nervioso central, los músculos y las glándulas exo/endocrinas, a pequeñas variaciones en Ca2+. La PTH es un importante regulador de la homeostasis del calcio.
El nivel de PTH inapropiadamente bajo en relación con la concentración sérica de Ca2+, característico del hipoparatiroidismo, conduce a una disminución de la reabsorción tubular renal de Ca2+ y, simultáneamente, a un aumento de la reabsorción tubular renal de fosfato. Por lo tanto, las principales anomalías bioquímicas del hipoparatiroidismo son la hipocalcemia y la hiperfosfatemia. Las características clínicas de la enfermedad incluyen síntomas de hipocalcemia, tal como entumecimiento perioral, parestesias y espasmos musculares del carpo/pedal. El espasmo laríngeo, la tetania y las convulsiones son complicaciones graves y potencialmente mortales. La hiperfosfatemia y un producto elevado de calcio x fosfato contribuyen al depósito ectópico de complejos de fosfato de calcio insolubles en los tejidos blandos, incluyendo los vasos, el cerebro, los riñones y otros órganos.
El tratamiento estándar del hipoparatiroidismo consiste en suplementos orales de calcio y vitamina D. Los objetivos de la terapia son a) mejorar los síntomas de hipocalcemia; b) mantener el calcio sérico en ayunas dentro o ligeramente por debajo del rango normal bajo; c) mantener el fósforo sérico en ayunas dentro del rango normal alto o sólo ligeramente elevado; d) evitar o minimizar la hipercalciuria; e) mantener un producto de fosfato de calcio a niveles muy por debajo del límite superior normal, y f) evitar la calcificación ectópica del riñón (cálculos y nefrocalcinosis) y otros tejidos blandos.
Han surgido varias preocupaciones con respecto al uso prolongado de calcio y vitamina D activa en grandes dosis, particularmente con respecto a la hipercalciuria, cálculos renales, nefrocalcinosis y calcificación ectópica de tejidos blandos. Además, la terapia convencional con calcio y vitamina D activa no alivia los problemas de calidad de vida ni revierte las anomalías en la remodelación ósea características de la enfermedad. En resumen, existe una gran necesidad de tratamientos mejorados para el hipoparatiroidismo.
En 2015, se aprobó Natpara, PTH(1-84), para inyección subcutánea una vez al día como complemento de la vitamina D y el calcio en pacientes con hipoparatiroidismo. Natpara, PTH(1-84), fue aprobada para controlar la hipocalcemia con base en un ensayo fundamental que demostró que el 42% de los participantes tratados con PTH(1-84) lograron niveles normales de calcio en la sangre con dosis reducidas de suplementos de calcio y formas activas de vitamina D, en comparación con el 3 por ciento de los participantes tratados con placebo. Después de un transcurso de tiempo en el que se controló el calcio sérico después de la inyección, el 71 por ciento de los pacientes tratados con PTH(1-84) desarrollaron hipercalcemia en una o más mediciones durante un período de 24 horas. La PTH(1-84) redujo la excreción urinaria de calcio de 2 a 8 horas después de la inyección, pero durante el período de 24 horas, la excreción urinaria de calcio no cambió. De manera similar, la excreción urinaria de fosfato aumentó sólo durante las primeras 8 horas después de la inyección de PTH(1-84).
Si bien esto representa un avance importante en el tratamiento de la enfermedad, Natpara no ha demostrado la capacidad de reducir la incidencia de hipercalcemia (niveles elevados de calcio sérico), hipocalcemia (nivel bajo de calcio sérico) o hipercalciuria (niveles elevados de calcio urinario) en relación con la terapia convencional en pacientes tratados.
Como tal, existe una gran necesidad de terapias mejoradas basadas en PTH para el hipoparatiroidismo.
La PTH(1-34), o teriparatida, fue aprobada por la FDA en 2002 para el tratamiento de la osteoporosis. A pesar de no estar aprobada para esta indicación, históricamente la PTH(1-34) se ha utilizado para el tratamiento del hipoparatiroidismo en pacientes que reciben inyecciones dos o tres veces al día. Para facilitar niveles de PTH más fisiológicos, se han realizado estudios clínicos con PTH(1-34) administrada mediante bomba en comparación con inyecciones dos veces al día. Durante 6 meses, la administración de la bomba produjo niveles de calcio normales y estables con fluctuaciones mínimas y evitó el aumento de los niveles de calcio en suero y orina que son evidentes poco después de la inyección de PTH. La marcada reducción en la excreción urinaria de calcio cuando se administra PTH(1-34) mediante bomba puede indicar que la PTH debe estar continuamente expuesta al túbulo renal para que se realicen los efectos de conservación del calcio renal. La administración mediante bomba de PTH (1-34) logró la normalización simultánea de los marcadores de recambio óseo, calcio sérico y excreción de calcio en orina. Estos resultados se lograron con una dosis diaria más baja de PTH(1-34) y una menor necesidad de suplementos de magnesio en comparación con el régimen de inyección de PTH(1 -34) dos veces al día.
Sin embargo, la terapia con bomba continua es inconveniente y difícil para los pacientes, y es un objeto de la presente invención proporcionar una opción terapéutica más conveniente para proporcionar una exposición continua a la PTH.
La administración en bolo a largo plazo de PTH se asocia con una pérdida progresiva de hueso cortical debido al aumento del metabolismo óseo. En un seguimiento de 6 años de pacientes tratados con PTH(1-84) (Rubin, JCEM 2016), los marcadores de recambio óseo se mantuvieron por encima de los valores previos al tratamiento, alcanzando su punto máximo en los primeros años después del inicio de PTH(1-84) y disminuyendo posteriormente, pero siendo significativamente más altos que los valores de referencia para el año 6. La densidad mineral ósea (BMD, por sus siglas en inglés) por absorciometría dual de rayos X (DXA, por sus siglas en inglés) fue consistente con los efectos específicos de sitio conocidos de la PTH, específicamente, aumentos en la columna lumbar y disminuciones en el radio distal 1/3 (radio i/3). La disminución observada en el radio i/3 es consistente con los efectos conocidos de la PTH intermitente para aumentar la porosidad cortical y la reabsorción endóstica.
Es un objeto de esta invención proporcionar un método de administración intermitente de PTH, con una elevación más baja de los marcadores de recambio óseo que las terapias de PTH actualmente aplicadas. Intermitente significa con intervalos diarios.
En el programa de desarrollo preclínico de Forteo, PTH(1-34) y Natpara, PTH(1-84), se observó un aumento dependiente de la dosis en la tasa de osteosarcoma en ratas tratadas con inyecciones diarias del compuesto de PTH. En el estudio de Natpara, se interrumpió la administración de dosis altas en ratas debido al exceso de muertes en este grupo, principalmente por osteosarcoma metastásico.
Como tal, es un objeto de la presente invención proporcionar una terapia de reemplazo de PTH intermitente que proporcione el control de los síntomas con una dosis administrada más baja. Intermitente significa con intervalos diarios.
En resumen, existe la necesidad de un tratamiento más conveniente y seguro del hipoparatiroidismo con efectos secundarios reducidos.
Por lo tanto, es un objeto de la presente invención superar, al menos parcialmente, las deficiencias descritas anteriormente.
Este objeto se logra con una composición farmacéutica que comprende un compuesto de PTH como se define en la reivindicación 1.
Sorprendentemente, se descubrió que tal compuesto de PTH es capaz de lograr un perfil plasmático estable de PTH que asegura niveles fisiológicos de calcio en suero y orina, o incluso niveles reducidos de calcio en orina comparables a los medidos en sujetos sanos.
Dentro de la presente invención, los términos se utilizan con el siguiente significado.
De la manera que se usa en la presente, el término “ intervalo de inyección” se refiere al tiempo entre dos administraciones consecutivas de la composición farmacéutica de la presente invención.
De la manera que se usa en la presente, el término “estado estacionario” se refiere a un estado logrado después de una multitud de dosis constantes, tal como después de que se hayan administrado 3, 4, 5, 6, 7 o más dosis constantes de un medicamento a un paciente con intervalos de tiempo constantes entre dos administraciones consecutivas, cuyo estado se caracteriza porque los niveles plasmáticos del compuesto de PTH, si el compuesto de PTH no libera PTH, es decir, es un compuesto de PTH estable, o de PTH liberada, si el compuesto de PTH es un compuesto de PTH de liberación controlada, al principio y al final de un intervalo varían en no más de 10%, preferiblemente en no más de 7,5%, incluso más preferiblemente en no más de 5%, aún más preferiblemente en no más de 4%, y lo más preferiblemente en no más de 3%. El término “comienzo de un intervalo” se refiere al punto de tiempo en el que se administra una dosis y el término “final de un intervalo” se refiere al punto de tiempo en el que se administra la siguiente dosis.
De la manera que se usa en la presente, el término “relación de pico a valle” se refiere a la relación entre la concentración plasmática más alta y la concentración plasmática más baja del compuesto de PTH en estado estacionario. Si el compuesto de PTH no libera PTH, es decir, es un compuesto de PTH estable, o libera PTH, si el compuesto de PTH es un compuesto de PTH de liberación controlada, dentro del período de tiempo entre dos administraciones consecutivas a un primate no humano, preferiblemente a un mono cynomolgus. Sin embargo, como existe una buena correlación entre la PTH libre y la PTH total (es decir, la suma de la PTH que aún está contenida en el compuesto de PTH y la PTH liberada), la PTH total proporciona una aproximación suficientemente buena. El período de tiempo entre dos administraciones consecutivas también se denomina “intervalo de inyección”, “intervalo de administración” o “intervalo”.
De la manera que se usa en la presente, el término “compuesto de PTH de liberación controlada” se refiere a cualquier compuesto, conjugado, cristal o mezcla que comprende al menos una molécula de PTH o un resto de PTH, y del cual al menos una molécula de PTH o un resto de PTH se libera con una vida media de liberación de al menos 12 horas.
De la manera que se usa en la presente, los términos “vida media de liberación” y “vida media” se refieren al tiempo requerido en condiciones fisiológicas (es decir, amortiguador acuoso, pH 7,4, 37 °C) hasta que la mitad de toda la PTH o los restos de PTH, respectivamente, están incluidos en un compuesto de PTH de liberación controlada se libera de dicho compuesto de PTH de liberación controlada.
De la manera que se usa en la presente, el término “compuesto de PTH estable” se refiere a cualquier conjugado covalente de al menos un resto de PTH con otro resto, en donde al menos un resto de PTH está conectado a dicho otro resto a través de un enlace estable.
De la manera que se usa en la presente, el término “PTH” se refiere a todos los polipéptidos de PTH, preferiblemente de especies de mamíferos, más preferiblemente de especies humanas y de mamíferos, más preferiblemente de especies humanas y murinas, así como sus variantes, análogos, ortólogos, homólogos y derivados, y fragmentos de los mismos, que se caracterizan por elevar la excreción de fósforo renal y calcio sérico, y disminuir la excreción de calcio renal y fósforo sérico. El término “PTH” también se refiere a todos los polipéptidos relacionados con PTH (PTHrP), tal como el polipéptido de SEQ ID NO: 121, que se unen y activan el receptor común de PTH/PTHrP1. Preferiblemente, el término “PTH” se refiere al polipéptido de PTH de SEQ ID NO: 51, así como a sus variantes, homólogos y derivados que exhiben esencialmente la misma actividad biológica, es decir, aumentan la excreción de fósforo renal y calcio sérico, y disminuyen la excreción de calcio renal y fósforo sérico.
Preferiblemente, el término “PTH” se refiere a las siguientes secuencias polipeptídicas:
SEQ ID NO:1 (PTH 1-84) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED
NVLVESHEKSLGEADKADVNVLTKAKSQ
SEQ ID NO:2 (PTH 1-83) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED
NVLVESHEKSLGEADKADVNVLTKAKS
SEQ ID NO:3 (PTH 1-82) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED
N VLVESHEKSLGE ADRAD VNVLTKAK
SEQ ID NO:4 (PTH 1-81) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED
NVLVESHEKSLGEADKADVNVLTKA
SEQ ID NO:5 (PTH 1-80)
S V SEIQLMHNLGKHLN S MERVE WLRKKL QD VHNE V ALG APL APRD AG S QRPRKKED
NVLVESHEKSLGEADKADVNVLTK
SEQ ID NO:6 (PTH 1-79) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED
NVLVESHEKSLGEADKADVNVLT
SEQ ID NO:7 (PTH 1-78) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED
NVLVESHEKSLGEADKADVNVL
SEQ ID NO:8 (PTH 1-77)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNEVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADVNV
SEQ ID NO:9 (PTH 1-76) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADVN
SEQ ID NO: 10 (PTH 1-75) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADV SEQ ID NO: 11 (PTH 1-74) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKAD
SEQ ID NO:12 (PTH 1-73) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKA
SEQ ID NO: 13 (PTH 1-72) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNEVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADK
SEQ ID NO:14 (PTH 1-71) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVEENFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEAD
SEQ ID NO: 15 (PTH 1-70) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEA
SEQ ID NO:16 (PTH 1-69) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGE
SEQ ID NO: 17 (PTH 1-68) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNEVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLG
SEQ ID NO: 18 (PTH 1-67) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSL
SEQ ID NO: 19 (PTH 1-66) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKS
SEQ ID NO:20 (PTH 1-65) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNEVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEK
SEQ ID NO:21 (PTH 1-64) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNEVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHE SEQ ID NO:22 (PTH 1-63) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESH SEQ ID NO:23 (PTH 1-62) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNEVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVES SEQ ID NO:24 (PTH 1-61) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVE SEQ ID NO:25 (PTH 1-60) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLV SEQ ID NO:26 (PTH 1-59) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVL SEQ ID NO:27 (PTH 1-58) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NV SEQ ID NO:28 (PTH 1-57)
S V SEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQD VHNE VALG APL APRD AG S QRPRKKED N SEQ ID NO:29 (PTH 1-56) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED SEQ ID NO:30 (PTH 1-55)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKE SEQ ID NO:31 (PTH 1-54)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKK SEQ ID NO:32 (PTH 1-53)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRK SEQ ID NO:33 (PTH 1-52)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPR SEQ ID NO:34 (PTH 1-51)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRP SEQ ID NO:35 (PTH 1-50)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQR SEQ ID NO:36 (PTH 1-49)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQ
SEQ ID NO:37 (PTH 1-48) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGS SEQ ID NO:38 (PTH 1-47) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAG SEQ ID NO:39 (PTH 1-46) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDA SEQ ID NO:40 (PTH 1-45) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRD SEQ ID NO:41 (PTH 1-44) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPR SEQ ID NO:42 (PTH 1-43) SVSEIQLMHNLGKBLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAP SEQ ID NO:43 (PTH 1-42) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLA SEQ ID NO:44 (PTH 1-41) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPL SEQ ID NO:45 (PTH 1-40) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAP SEQ ID NO:46 (PTH 1-39) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGA SEQ ID NO:47 (PTH 1-38) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALG SEQ ID NO:48 (PTH 1-37) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVAL SEQ ID NO:49 (PTH 1-36) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVA SEQ ID NO:50 (PTH 1-35) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFV SEQ ID NO:51 (PTH 1-34)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF SEQ ID NO:52 (PTH 1-33)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHN SEQ ID NO:53 (PTH 1-32)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH SEQ ID NO:54 (PTH 1-31)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDV SEQ ID NO:55 (PTH 1-30)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQD SEQ ID NO:56 (PTH 1-29)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQ SEQ ID NO:57 (PTH 1-28)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKL SEQ ID NO:58 (PTH 1-27)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKK
SEQ ID NO:59 (PTH 1-26)
SVSEIQLMHNLGKBLNSMERVEWLRK SEQ ID NO:60 (PTH 1-25)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLR SEQ ID NO:61 (PTH 1-84 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADVNVLTKAKSQ; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:62 (PTH 1-83 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADVNVLTKAKS; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:63 (PTH 1-82 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADVNVLTKAK; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:64 (PTH 1-81 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADVNVLTKA; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:65 (PTH 1-80 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADVNVLTK; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:66 (PTH 1-79 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADVNVLT; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:67 (PTH 1-78 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADVNVL; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:68 (PTH 1-77 amidada) SVSEIQLMHNLGKBLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADVNV; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:69 (PTH 1-76 amidada) SVSEIQLMHNLGKBLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADVN; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:70 (PTH 1-75 amidada) SVSEIQLMHNLGKBLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADV; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:71 (PTH 1-74 amidada) SVSEIQLMHNLGKBLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKAD; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:72 (PTH 1-73 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKA; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:73 (PTH 1-72 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADK; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:74 (PTH 1-71 amidada) SVSEIQLMHNLGKBLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEAD; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:75 (PTH 1-70 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEA; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:76 (PTH 1-69 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGE; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:77 (PTH 1-68 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLG; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:78 (PTH 1-67 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSL; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:79 (PTH 1-66 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKS; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:80 (PTH 1-65 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEK; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:81 (PTH 1-64 amidada) SVSEIQLMHNLGKBLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHE; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:82 (PTH 1-63 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESH; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:83 (PTH 1-62 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVES; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:84 (PTH 1-61 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVE; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:85 (PTH 1-60 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLV; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:86 (PTH 1-59 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVL; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:87 (PTH 1-58 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NV; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:88 (PTH 1-57 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED N; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:89 (PTH 1-56 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED ; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:90 (PTH 1-55 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKE; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:91 (PTH 1-54 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKK; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:92 (PTH 1-53 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRK; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:93 (PTH 1-52 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPR; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:94 (PTH 1-51 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRP; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:95 (PTH 1-50 amidada) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQR; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:96 (PTH 1-49 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQ; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:97 (PTH 1-48 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGS; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:98 (PTH 1-47 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAG; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:99 (PTH 1-46 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDA; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:100 (PTH 1-45 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRD; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:101 (PTH 1-44 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPR; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:102 (PTH 1-43 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAP; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:103 (PTH 1-42 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLA; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:104 (PTH 1-41 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPL; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:105 (PTH 1-40 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAP; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:106 (PTH 1-39 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGA; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:107 (PTH 1-38 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALG; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:108 (PTH 1-37 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVAL; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:109 (PTH 1-36 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVA; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:110 (PTH 1-35 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFV; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:111 (PTH 1-34 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:112 (PTH 1-33 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHN; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:113 (PTH 1-32 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:114 (PTH 1-31 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDV; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:115 (PTH 1-30 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQD; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:116 (PTH 1-29 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQ; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:117 (PTH 1-28 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKL; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:118 (PTH 1-27 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKK; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:119 (PTH 1-26 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRK; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID NO:120 (PTH 1-25 amidada)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLR; en donde el extremo C-terminal está amidado
SEQ ID N0:121 (PTHrP)
A V SEHQLLHDKGK SIQDLRRRFFLHHLIAEIHT AEIRAT SE V SPN SKP SPNTKNHP VRF
GSDDEGRYLTQETNKVETYKEQPLKTPGKKKKGKPGKRKEQEKKKRRTRSAWLDS
GVTGSGLEGDHLSDTSTTSLELDSRRH
Más preferiblemente, el término “PTH” se refiere a la secuencia de SEQ ID NO:47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 y 115. Aún más preferiblemente, el término “PTH” se refiere a la secuencia de SEQ ID NO:50, 51, 52, 110, 111 y 112. En una realización particularmente preferida, el término “PTH” se refiere a la secuencia de SEQ ID NO:51.
De la manera que se usa en la presente, el término “variante de polipéptido de PTH” se refiere a un polipéptido de la misma especie que difiere de un polipéptido de PTHrP o PTH de referencia. Preferiblemente, tal referencia es una secuencia polipeptídica de PTH y tiene la secuencia de SEQ ID NO:51. Generalmente, las diferencias están limitadas, de modo que la secuencia de aminoácidos de la referencia y la variante son muy similares en general y, en muchas regiones, son idénticas. Preferiblemente, las variantes del polipéptido PTH son idénticas al menos en un 70%, 80%, 90% o 95% a un polipéptido de PTHrP o PTH de referencia, preferiblemente al polipéptido de PTH de SEQ ID NO:51. Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, 95% “idéntica” a una secuencia de aminoác idos de consulta, se entiende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido en cuestión es idéntica a la secuencia de consulta, excepto que la secuencia de polipéptido en cuestión puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de consulta. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones amino terminal (N-terminal) o carboxi terminal (C-terminal) de la secuencia de aminoácidos de referencia, o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. La secuencia de consulta puede ser una secuencia de aminoácidos completa de la secuencia de referencia o cualquier fragmento especificado como se describe en la presente. Preferiblemente, la secuencia de consulta es la secuencia de SEQ ID NO:51.
Dichas variantes de polipéptidos de PTH pueden ser variantes de origen natural, tal como variantes alélicas de origen natural codificadas por una de varias formas alternativas de PTH o PTHrP que ocupan un locus dado en un cromosoma o un organismo, o isoformas codificadas por variantes de corte y empalme de origen natural que se originan a partir de una transcripción primaria única. Alternativamente, una variante del polipéptido de PTH puede ser una variante que no se sabe que se produce de forma natural y que se puede producir mediante técnicas de mutagénesis conocidas en el arte.
En la técnica es bien conocido que se pueden delecionar uno o más aminoácidos del extremo N-terminal o C-terminal de un polipéptido bioactivo sin pérdida sustancial de la función biológica. Dichas deleciones N- y/o C-terminales también están abarcadas por el término variante polipeptídica de PTH.
Los expertos en la técnica también reconocen que algunas secuencias de aminoácidos de los polipéptidos PTH o PTHrP pueden variar sin un efecto significativo de la estructura o función del polipéptido. Dichos mutantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones seleccionadas de acuerdo con reglas generales conocidas en la técnica para que tengan poco efecto sobre la actividad. Por ejemplo, se proporciona orientación sobre cómo realizar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas en Bowie et al. (1990), Science 247:1306-1310, que se incorpora en su totalidad en la presente a modo de referencia, en donde los autores indican que existen dos enfoques principales para estudiar la tolerancia al cambio de la secuencia de aminoácidos.
El término polipéptido de PTH también abarca todos los polipéptidos de PTH y PTHrP codificados por análogos, ortólogos y/u homólogos de especies de PTH y PTHrP. Un experto en la técnica también reconoce que PTHrP y los análogos de PTHrP se unen para activar el receptor común de PTH/PTHrP1, por lo que el término polipéptido de PTH también abarca todos los análogos de PTHrP. De la manera que se usa en la presente, el término “análogo de PTH” se refiere a PTH y PTHrP de organismos diferentes y no relacionados que realizan las mismas funciones en cada organismo, pero que no se originaron a partir de una estructura ancestral que los ancestros de los organismos tenían en común. En cambio, la PTH y PTHrP análogas surgieron por separado y luego evolucionaron para realizar funciones iguales o similares. En otras palabras, los polipéptidos PTH y PTHrP análogos son polipéptidos con secuencias de aminoácidos bastante diferentes, pero que realizan la misma actividad biológica, específicamente, aumentar la excreción de fósforo renal y calcio sérico, y disminuir la excreción de calcio renal y fósforo sérico.
De la manera que se usa en la presente, el término “ortólogo de PTH” se refiere a PTH y PTHrP dentro de dos es pecies diferentes cuyas secuencias están relacionadas entre sí a través de una PTH o PTHrP homóloga común en una especie ancestral, pero que han evolucionado para volverse diferentes entre sí.
De la manera que se usa en la presente, el término “homólogo de PTH” se refiere a PTH y PTHrP de diferentes organismos que realizan las mismas funciones en cada organismo y que se originan a partir de una estructura ancestral que los ancestros de los organismos tenían en común. En otras palabras, los polipéptidos de PTH homólogos son polipéptidos con secuencias de aminoácidos bastante similares que realizan la misma actividad biológica, específicamente, aumentar la excreción de fósforo renal y calcio sérico, y disminuir la excreción de calcio renal y fósforo sérico. Preferiblemente, los homólogos de polipéptidos de PTH pueden definirse como polipéptidos que exhiben al menos un 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de identidad con un polipéptido de PTH o PTHrP de referencia, preferiblemente el polipéptido de PTH de SEQ ID NO :51.
Por lo tanto, un polipéptido de PTH de acuerdo con la invención puede ser, por ejemplo: (i) uno en el que al menos uno de los residuos de aminoácidos está sustituido con un residuo de aminoácido conservado o no conservado, preferiblemente un residuo de aminoácido conservado, y tal residuo de aminoácido sustituido puede o no estar codificado por el código genético; y/o (ii) uno en el que al menos uno de los residuos de aminoácidos incluye un grupo sustituyente; y/o (iii) uno en el que el polipéptido de PTH se fusiona con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol); y/o (iv) uno en el que se fusionan aminoácidos adicionales al polipéptido de PTH, tal como un polipéptido de región de fusión IgG Fc, una secuencia líder o secretora, una secuencia que se emplea para la purificación de la forma anterior del polipéptido, o una secuencia preproteica.
De la manera que se usa en la presente, el término “fragmento de polipéptido de PTH” se refiere a cualquier polipéptido que comprende un segmento contiguo de una parte de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de PTH o PTHrP, preferiblemente el polipéptido de SEQ ID NO:51.
Más específicamente, un fragmento de polipéptido de PTH comprende al menos 6, tal como al menos 8, al menos 10 o al menos 17 aminoácidos consecutivos de un polipéptido de PTH o PTHrP, más preferiblemente del polipéptido de SEQ ID NO:51. Un fragmento de polipéptido de PTH también puede describirse como subgéneros de polipéptidos de PTH o PTHrP que comprenden al menos 6 aminoácidos, en los que “al menos 6” se define como cualquier número entero entre 6 y el número entero que representa el aminoácido C-terminal de un polipéptido de PTH o PTHrP, preferiblemente del polipéptido de SEQ ID NO:51. Además se incluyen especies de PTH o fragmentos polipeptídicos de PTHrP de al menos 6 aminoácidos de longitud, como se describió anteriormente, que se especifican adicionalmente en términos de sus posiciones N-terminal y C-terminal. El término “fragmento de polipéptido PTH” también abarca como especies individuales todos los fragmentos de polipéptido de PTH o PTHrP, de al menos 6 aminoácidos de longitud, como se describió anteriormente, que pueden especificarse particularmente por una posición N-terminal y C-terminal. Es decir, cada combinación de una posición N-terminal y C-terminal que podría ocupar un fragmento de al menos 6 residuos de aminoácidos contiguos de longitud, en cualquier secuencia de aminoácidos dada de un polipéptido de PTH o PTHrP, preferiblemente el polipéptido de PTH de SEQ ID NO:51, se incluye en la presente invención.
El término “PTH” también incluye conjugados de poli(aminoácido) que tienen una secuencia como la descrita anteriormente, pero que tienen una cadena principal que comprende enlaces amida y no amida, tal como enlaces éster, como, por ejemplo, depsipéptidos. Los depsipéptidos son cadenas de residuos de aminoácidos en los que la cadena principal comprende enlaces amida (péptido) y éster. En consecuencia, el término “cadena lateral”, tal como se usa en la presente, se refiere al resto unido al carbono alfa de un resto de aminoácido, si el resto de aminoácido está conectado a través de enlaces de amina, tal como en los polipéptidos, o a cualquier átomo de carbono que contenga un resto unido a la cadena principal de un poli(aminoácido) conjugado, tal como, por ejemplo, en el caso de los depsipéptidos. Preferiblemente, el término “PTH” se refiere a polipéptidos que tienen una cadena principal formada a través de enlaces amida (péptido).
Como el término PTH incluye las variantes, análogos, ortólogos, homólogos, derivados y fragmentos de PTH y PTHrP descritos anteriormente, todas las referencias a posiciones específicas dentro de una secuencia de referencia también incluyen las posiciones equivalentes en las variantes, análogos, ortólogos, homólogos, derivados y fragmentos de un resto de PTH o PTHrP, incluso si no se menciona específicamente.
De la manera que se usa en la presente, el término “micela” significa un agregado de moléculas anfifílicas dispersas en un coloide líquido. En una solución acuosa, una micela típica forma un agregado con el resto hidrófilo de las moléculas de tensoactivo mirando hacia el disolvente circundante y el resto hidrófobo de la molécula de tensioactivo mirando hacia dentro, también denominada “micela de fase normal”. Las “micelas inversas” tienen el resto hidrófilo mirando hacia adentro y el resto hidrófobo mirando hacia el disolvente circundante.
De la manera que se usa en la presente, el término “liposoma” se refiere a una vesícula, preferiblemente una vesícula esférica, que tiene al menos una bicapa lipídica. Preferiblemente, los liposomas comprenden fosfolípidos, incluso más preferiblemente fosfatidilcolina. El término “ liposoma” se refiere a diversas estructuras y tamaños, tales como, por ejemplo, a las vesículas de liposomas multilamelares (MLV, por sus siglas en inglés) que tienen más de una bicapa lipídica concéntrica con un diámetro promedio de 100 a 1000 nm, vesículas pequeñas de liposomas unilamelares (SUV, por sus siglas en inglés) que tienen una bicapa lipídica y un diámetro medio de 25 a 100 nm, vesículas grandes de liposomas unilaminares (LUV, por sus siglas en inglés) que tienen una bicapa lipídica y un diámetro promedio de aproximadamente 1000 mm, y vesículas unilaminares gigantes (GUV, por sus siglas en inglés) que tienen una bicapa lipídica y un diámetro promedio de 1 a 100 mm. El término “liposoma” también incluye vesículas elásticas, tales como transferosomas y etosomas, por ejemplo.
De la manera que se usa en la presente, el término “acuasoma” se refiere a nanopartículas esféricas que tienen un diámetro de 60 a 300 nm que comprenden al menos tres capas de estructura autoensamblada, específicamente, un núcleo nanocristalino en fase sólida recubierto con una película oligomérica en la que se adsorben moléculas de fármaco con o sin modificación del fármaco.
De la manera que se usa en la presente, el término “etosoma” se refiere a vesículas lipídicas que comprenden fosfolípidos y etanol y/o isopropanol en una concentración relativamente alta y agua, que tienen un tamaño que oscila entre decenas de nanómetros y micrómetros.
De la manera que se usa en la presente, el término “LeciPlex” se refiere a un sistema vesicular basado en fosfolípidos cargados positivamente que comprende fosfatidilcolina de soya, un agente catiónico y un disolvente biocompatible como PEG 300, PEG 400, éter monoetílico de dietilenglicol, éter de polietilenglicol de alcohol tetrahidrofurfurílico, o 2-pirrolidona o N-metil-2-pirrolidona.
De la manera que se usa en la presente, el término “niosoma” se refiere a vesículas unilaminares o multilaminares que comprenden tensoactivos no iónicos.
De la manera que se usa en la presente, el término “farmacosoma” se refiere a agregados vesiculares, micelares o hexagonales ultrafinos de lípidos unidos covalentemente a restos biológicamente activos.
De la manera que se usa en la presente, el término “proniosoma” se refiere a formulaciones secas de un vehículo recubierto con tensoactivo que al rehidratarse y agitarse suavemente proporciona niosomas.
De la manera que se usa en la presente, el término “polimerosoma” se refiere a una vesícula esférica artificial que comprende una membrana formada a partir de copolímeros de bloques sintéticos anfifílicos y puede comprender opcionalmente una solución acuosa en su núcleo. Un polimerosoma tiene un diámetro en el rango de 50 nm a 5 mm y mayor. El término también incluye sintosomas, que son polimerosomas diseñados para comprender canales que permiten que ciertas sustancias químicas pasen a través de la membrana hacia dentro o fuera de la vesícula.
De la manera que se usa en la presente, el término “esfingosoma” se refiere a una vesícula bicapa concéntrica en la que un volumen acuoso está completamente encerrado por una bicapa lipídica membranosa compuesta principalmente de esfingolípido natural o sintético.
De la manera que se usa en la presente, el término “transferosoma” se refiere a vesículas lipídicas ultraflexibles que comprenden un núcleo acuoso que se forman a partir de una mezcla de lípidos polares comunes y activados por bordes adecuados que facilitan la formación de bicapas altamente curvadas que hacen que el transferosoma sea altamente deformable.
De la manera que se usa en la presente, el término “ufasoma” se refiere a una vesícula que comprende ácidos grasos insaturados.
Como se usa en el presente documento, el término “polipéptido” se refiere a un péptido que comprende hasta 50 monómeros de aminoácidos.
De la manera que se usa en la presente, el término “proteína” se refiere a un péptido de más de 50 residuos de aminoácidos. Preferiblemente, una proteína comprende como máximo 20000 residuos de aminoácidos, como máximo 15000 residuos de aminoácidos, como máximo 10000 residuos de aminoácidos, como máximo 5000 residuos de aminoácidos, como máximo 4000 residuos de aminoácidos, como máximo 3000 residuos de aminoácidos, como máximo 2000 residuos de aminoácidos, como máximo 1000 residuos de aminoácidos.
De la manera que se usa en la presente, el término “condiciones fisiológicas” se refiere a un amortiguador acuoso a pH 7,4, 37 °C.
De la manera que se usa en la presente, el término “composición farmacéutica” se refiere a una composición que contiene uno o más ingredientes activos, tal como, por ejemplo, al menos un compuesto de PTH de liberación controlada y uno o más excipientes, así como cualquier producto que sea resultado, directa o indirectamente, de la combinación, complejación o agregación de dos o más de los ingredientes de la composición, o de la disociación de uno o más de los ingredientes, o de otros tipos de reacciones o interacciones de uno o más de los ingredientes. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención abarcan cualquier composición preparada mezclando uno o más compuestos de PTH de liberación controlada y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
De la manera que se usa en la presente, el término “composición líquida” se refiere a una mezcla que comprende un compuesto de PTH soluble en agua, preferiblemente un compuesto de PTH de liberación controlada soluble en agua, y uno o más disolventes, tal como agua.
El término “composición en suspensión” se refiere a una mezcla que comprende un compuesto de PTH insoluble en agua, preferiblemente un compuesto de PTH de liberación controlada insoluble en agua, y uno o más disolventes, tal como agua.
De la manera que se usa en la presente, el término “composición seca” significa que una composición farmacéutica se proporciona en forma seca. Los métodos adecuados para el secado son el secado por pulverización y secado por congelación, es decir, liofilización. Dicha composición seca de profármaco tiene un contenido de agua residual de un máximo de 10%, preferiblemente menos de 5% y más preferiblemente menos de %, determinado según Karl Fischer. Preferiblemente, la composición farmacéutica de la presente invención se seca mediante liofilización.
El término “fármaco”, de la manera que se usa en la presente, se refiere a una sustancia, tal como la PTH, utilizada en el tratamiento, cura, prevención o diagnóstico de una enfermedad, o utilizada para mejorar el bienestar físico o mental. Si un fármaco se conjuga con otro resto, el resto del producto resultante que se originó a partir del fármaco se denomina “resto biológicamente activo”.
De la manera que se usa en la presente, el término “profármaco” se refiere a un conjugado en el que un resto biológicamente activo está conectado de forma reversible y covalente a un grupo protector especializado a través de un resto enlazador reversible, también denominado “resto enlazador de profármaco reversible”, que comprende un enlace reversible con el resto biológicamente activo y en donde el grupo protector especializado altera o elimina propiedades indeseables en la molécula original. Esto también incluye la mejora de las propiedades deseables del fármaco y la supresión de las propiedades indeseables. El grupo protector no tóxico especializado se denomina “portador”. Un profármaco libera el resto biológicamente activo unido de forma reversible y covalente en forma de su fármaco correspondiente. En otras palabras, un profármaco es un conjugado que comprende un resto biológicamente activo que se conjuga de forma covalente y reversible con un resto portador a través de un resto enlazador de profármaco reversible, cuya conjugación covalente y reversible del portador al resto enlazador de profármaco reversible es directamente o a través de un espaciador. Dicho conjugado libera el resto biológicamente activo anteriormente conjugado en forma de un fármaco libre.
De la manera que se usa en la presente, el término “resto enlazador de profármaco reversible” es un resto espaciador que conecta un resto biológicamente activo, tal como un resto de PTH, a un resto portador, ya sea directamente o a través de un resto separador adicional y en donde el enlace entre el resto enlazador de profármaco reversible y el resto biológicamente activo es reversible. Preferiblemente, el enlace entre el resto portador y el resto enlazador de profármaco reversible es estable.
Un “enlace biodegradable” o un “enlace reversible” es un enlace que es hidrolíticamente degradable, es decir, escindible, en ausencia de enzimas en condiciones fisiológicas (amortiguador acuoso a pH 7,4, 37 °C) con una vida media en el rango de una hora a tres meses, preferiblemente de una hora a dos meses, aún más preferiblemente de una hora a un mes, aún más preferiblemente de una hora a tres semanas, lo más preferiblemente de una hora a dos semanas. Por consiguiente, un “enlace estable” es un enlace que tiene una vida media en condiciones fisiológicas (amortiguador acuoso a pH 7,4, 37 °C) de más de tres meses.
De la manera que se usa en la presente, el término “enlazador de profármaco sin trazas” significa un enlazador de profármaco reversible, es decir, un resto enlazador que conecta de forma reversible y covalente el resto biológicamente activo con el portador, que libera el fármaco en su forma libre tras la escisión. De la manera que se usa en la presente, el término “forma libre” de un fármaco significa el fármaco en su forma farmacológicamente activa no modificada.
De la manera que se usa en la presente, el término “excipiente” se refiere a un diluyente, adyuvante o vehículo con el que se administra el agente terapéutico, tal como un fármaco o profármaco. Dicho excipiente farmacéutico puede ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, incluyendo, pero sin limitarse a, aceite de cacahuete, aceite de soya, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un excipiente preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía oral. La solución salina y la dextrosa acuosa son los excipientes preferidos cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol se emplean preferiblemente como excipientes líquidos para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, trehalosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición farmacéutica, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, agentes amortiguadores de pH, como, por ejemplo, acetato, succinato, tris, carbonato, fosfato, HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico), MES (ácido 2-(A-morfolino)etanosulfónico), o puede contener detergentes, como Tween, poloxámeros, poloxaminas, CHAPS, Igepal, o aminoácidos como, por ejemplo, glicina, lisina o histidina. Estas composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición farmacéutica se puede formular como un supositorio, con aglutinantes tradicionales y excipientes, tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir excipientes estándar, tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco o resto biológicamente activo, junto con una cantidad adecuada de excipiente para proporcionar la forma de administración adecuada al paciente. La formulación debe adaptarse al modo de administración.
De la manera que se usa en la presente, el término “reactivo” significa un compuesto químico que comprende al menos un grupo funcional para reaccionar con el grupo funcional de otro compuesto químico o fármaco. Se entiende que un fármaco que comprende un grupo funcional (tal como una amina primaria o secundaria o un grupo funcional hidroxilo) también es un reactivo.
De la manera que se usa en la presente, el término “resto” significa una parte de una molécula, que carece de uno o más átomos en comparación con el reactivo correspondiente. Si, por ejemplo, un reactivo de fórmula “H-X-H” reacciona con otro reactivo y pasa a formar parte del producto de reacción, el resto correspondiente del producto de reacción tiene la estructura “H-X-” o “-X-”, mientras que cada “-” indica la unión a otro resto. Por consiguiente, un resto biológicamente activo se libera de un profármaco como un fármaco.
Se entiende que si se proporciona la secuencia o estructura química de un grupo de átomos, cuyo grupo de átomos está unido a dos restos o está interrumpiendo un resto, dicha secuencia o estructura química se puede unir a los dos restos en cualquier orientación, a menos que se indique explícitamente lo contrario. Por ejemplo, un resto “-C(O)N(R1)-” se puede unir a dos restos o interrumpir un resto como “-C(O)N(R1)-” o como “-N(R1)C (O)-”. Del mismo modo, un resto
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puede unirse a dos restos o puede interrumpir un resto como
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De la manera que se usa en la presente, el término “grupo funcional” significa un grupo de átomos que pueden reaccionar con otros grupos de átomos. Los grupos funcionales incluyen, entre otros, los siguientes grupos: ácido carboxílico (-(C=O)OH), amina primaria o secundaria (-NH2, -NH-), maleimida, tiol (-SH), ácido sulfónico (-(O=S=O)OH), carbonato, carbamato (-O(C=O)N<), hidroxilo (-OH), aldehído (-(C=O)H), cetona (-(C=O)-), hidrazina (>N-N<), isocianato, isotiocianato, ácido fosfórico (-O(P=O)OHOH), ácido fosfónico (-O(P=O)OHH), haloacetilo, haluro de alquilo, acriloilo, fluoruro de arilo, hidroxilamina, disulfuro, sulfonamidas,
ácido sulfúrico, vinilsulfona, vinilcetona, diazoalcano, oxirano y aziridina.
En caso de que el compuesto de PTH, preferiblemente el compuesto de PTH de liberación controlada, de la presente invención comprenda uno o más grupos ácidos o básicos, la invención también comprende sus correspondientes sales farmacéutica o toxicológicamente aceptables, en particular sus sales farmacéuticamente utilizables. Por lo tanto, el compuesto de PTH, preferiblemente el compuesto de PTH de liberación controlada, de la presente invención que comprende grupos ácidos puede usarse de acuerdo con la invención, por ejemplo, como sales de metales alcalinos, sales de metales alcalinotérreos o como sales de amonio. Ejemplos más precisos de tales sales incluyen sales de sodio, sales de potasio, sales de calcio, sales de magnesio o sales con amoníaco o aminas orgánicas, tales como, por ejemplo, etilamina, etanolamina,trietanolamina o aminoácidos. El compuesto de PTH, preferiblemente el compuesto de PTH de liberación controlada, de la presente invención que comprende uno o más grupos básicos, es decir, grupos que pueden protonarse, pueden estar presentes y pueden usarse de acuerdo con la invención en forma de sus sales de adición con ácidos inorgánicos u orgánicos. Los ejemplos de ácidos adecuados incluyen cloruro de hidrógeno, bromuro de hidrogeno, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido metanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácidos naftalendisulfónicos, ácido oxálico, ácido acético, ácido tartárico, ácido láctico, ácido salicílico, ácido benzoico, ácido fórmico, ácido propiónico, ácido piválico, ácido dietilacético, ácido malónico, ácido succínico, ácido pimélico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido málico, ácido sulfamínico, ácido fenilpropiónico, ácido glucónico, ácido ascórbico, ácido isonicotínico, ácido cítrico, ácido adípico, y otros ácidos conocidos por el experto en la técnica. Los expertos en la técnica conocen métodos adicionales para convertir el grupo básico en un catión, como la alquilación de un grupo amina que da como resultado un grupo amonio con carga positiva y un contraión apropiado de la sal. Si el compuesto de PTH, preferiblemente el compuesto de PTH de liberación controlada, de la presente invención comprende simultáneamente grupos ácidos y básicos, la invención también incluye, además de las formas de sal mencionadas, sales internas o betaínas (zwitteriones). Las sales respectivas se pueden obtener mediante métodos habituales que son conocidos por los expertos en la materia, como, por ejemplo, poniendo en contacto estos compuestos con un ácido o base orgánico o inorgánico en un disolvente o dispersante, o mediante intercambio de aniones o intercambio de cationes con otras sales. La presente invención también incluye todas las sales de los compuestos de la presente invención que, debido a la baja compatibilidad fisiológica, no son directamente adecuadas para su uso en productos farmacéuticos, pero que pueden usarse, por ejemplo, como productos intermedios para reacciones químicas o para la preparación de sales farmacéuticamente aceptables.
El término “farmacéuticamente aceptable” se refiere a una sustancia que causa daño cuando se administra a un paciente y preferiblemente significa que está aprobada por una agencia reguladora, tal como la EMA (Europa) y/o la FDA ( E e . UU.) y/o cualquier otra agencia reguladora nacional para uso en animales, preferiblemente para uso en humanos.
De la manera que se usa en la presente, el término “aproximadamente” en combinación con un valor numérico se usa para indicar un rango que va desde e incluyendo el valor numérico más y menos no más de 10% de dicho valor numérico, más preferiblemente no más de 8% de dicho valor numérico, incluso más preferiblemente no más de 5% de dicho valor numérico, y lo más preferiblemente no más de 2% de dicho valor numérico. Por ejemplo, la frase “aproximadamente 200” se usa para referirse a un rango de 200 /- 10%, es decir, en un rango de 180 a 220; preferiblemente 200 /- 8%, es decir, en un rango de 184 a 216; incluso más preferiblemente en un rango de 200 /-5%, es decir, de 190 a 210; y lo más preferiblemente 200 /-2%, es decir, en un rango de 196 a 204. Se entiende que un porcentaje dado como “aproximadamente 20%” no significa “20% /- 10%”, es decir, en el rango de 10 a 30%, pero “aproximadamente 20%” significa que está en un rango de 18 a 22%, es decir, más y menos 10% del valor numérico que es 20.
De la manera que se usa en la presente, el término “polímero” significa una molécula que comprende unidades estructurales repetitivas, es decir, los monómeros, unidos por enlaces químicos de forma lineal, circular, ramificada, reticulada o dendrímera, o una combinación de los mismos, que pueden ser de origen sintético, biológico o una combinación de ambos. Se entiende que un polímero también puede comprender uno o más grupos y/o restos químicos, tal como, por ejemplo, uno o más grupos funcionales. Preferiblemente, un polímero soluble tiene un peso molecular de al menos 0,5 kDa, por ejemplo, un peso molecular de al menos 1 kDa, un peso molecular de al menos 2 kDa, un peso molecular de al menos 3 kDa o un peso molecular de al menos 5 kDa. Si el polímero es soluble, es preferible que tenga un peso molecular de como máximo 1000 kDa, como máximo 750 kDa, como máximo 500 kDa, como máximo 300 kDa, como máximo 200 kDa, como máximo 100 kDa. Se entiende que para polímeros insolubles, tales como hidrogeles, no se pueden proporcionar rangos significativos de pesos moleculares. También se entiende que una proteína es un polímero en el que los aminoácidos son las unidades estructurales que se repiten, aunque las cadenas laterales de cada aminoácido puedan ser diferentes. De la manera que se usa en la presente, el término “polimérico” significa un reactivo o un resto que comprende uno o más polímeros o restos poliméricos. Un reactivo o resto polimérico también puede comprender opcionalmente uno o más restos, que se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en
• alquilo de C1-50, alquenilo C2-50, alquinilo de C2-50, cicloalquilo C3-10, heterociclilo de 3 a 10 miembros, heterobiciclilo de 8 a 11 miembros, fenilo, naftilo, indenilo, indanilo y tetralinilo; y
• enlaces seleccionados del grupo que comprende
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en donde
las líneas punteadas indican la unión a lo que queda del resto o reactivo, y
-R y -Ra se seleccionan independientemente entre sí del grupo que consiste -H, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo y hexilo.
El experto en la materia entiende que los productos de polimerización obtenidos de una reacción de polimerización no tienen todos el mismo peso molecular, sino que presentan una distribución de pesos moleculares. Por consiguiente, los rangos de pesos moleculares, los pesos moleculares, los rangos de números de monómeros en un polímero y los números de monómeros en un polímero, tal como se usan en la presente, se refieren al peso molecular promedio en número y al promedio en número de monómeros, es decir, a la media aritmética del peso molecular del polímero o resto polimérico, y la media aritmética del número de monómeros del polímero o resto polimérico.
Por consiguiente, en un resto polimérico que comprende “x” unidades de monómero, cualquier número entero dado para “x” corresponde por lo tanto a la media aritmética del número de monómeros. Cualquier rango de números enteros dado para “x” proporciona el rango de números enteros en el que se encuentra la media aritmética de los números de monómeros. Un número entero para “x” dado como “aproximadamente x” significa que la media aritmética del número de monómeros se encuentra en un rango de números enteros de x /- 10%, preferiblemente x /- 8%, más preferiblemente x /- 5%. y lo más preferiblemente x /- 2%.
De la manera que se usa en la presente, el término “peso molecular promedio en número” significa la media aritmética ordinaria de los pesos moleculares de los polímeros individuales.
De la manera que se usa en la presente, el término “soluble en agua” con referencia a un portador significa que cuando dicho portador es parte del compuesto de PTH, preferiblemente el compuesto de PTH de liberación controlada, de la presente invención al menos 1 g del compuesto de PTH, preferiblemente, el compuesto de PTH de liberación controlada, que comprende dicho portador soluble en agua, se puede disolver en un litro de agua a 20 °C para formar una solución homogénea. Por consiguiente, el término “insoluble en agua” con referencia a un portador significa que cuando dicho portador es parte de un compuesto de PTH, preferiblemente un compuesto de PTH de liberación controlada, de la presente invención, menos de 1 g del compuesto de PTH, preferiblemente un compuesto de PTH de liberación controlada, que comprende dicho portador insoluble en agua, se puede disolver en un litro de agua a 20 °C para formar una solución homogénea.
De la manera que se usa en la presente, el término “soluble en agua” con referencia al compuesto de PTH significa que al menos 1 g del compuesto de PTH se puede disolver en un litro de agua a 20 °C para formar una solución homogénea. Por consiguiente, el término “insoluble en agua” con referencia al compuesto de PTH significa que se puede disolver menos de 1 g del compuesto de PTH en un litro de agua a 20 °C para formar una solución homogénea.
De la manera que se usa en la presente, el término “hidrogel” significa una red polimérica hi drófila o anfifílica compuesta de homopolímeros o copolímeros, que es insoluble debido a la presencia de reticulaciones químicas covalentes. Las reticulaciones proporcionan la estructura de la red y la integridad física.
De la manera que se usa en la presente, el término “termogelificación” significa un compuesto que es un líquido o una solución de baja viscosidad que tiene una viscosidad de menos de 500 cps a 25 °C a una velocidad de cizallamiento de aproximadamente 0,1/segundo a baja temperatura, cuya baja temperatura oscila entre aproximadamente 0 °C y aproximadamente 10 °C, pero que es un compuesto de mayor viscosidad de menos de 10000 cps a 25 °C a una velocidad de cizallamiento de aproximadamente 0,1/segundo a una temperatura superior, cuya temperatura superior oscila entre aproximadamente 30 °C y aproximadamente 40 °C, tal como aproximadamente 37 °C.
De la manera que se usa en la presente, el término “basado en PEG” en relación con un resto o reactivo significa que dicho resto o reactivo comprende PEG. Preferiblemente, un resto o reactivo basado en PEG comprende al menos 10% (p/p) de PEG, tal como al menos 20% (p/p) de PEG, tal como al menos 30% (p/p) de PEG, tal como al menos 40% (p/p) de PEG, tal como al menos el 50% (p/p), tal como al menos 60 (p/p) PEG, tal como al menos 70% (p/p) de PEG, tal como al menos 80% (p/p) de PEG, tal como al menos 90% (p/p) de PEG, tal como por lo menos el 95%. El porcentaje en peso restante del resto o reactivo basado en PEG son otros restos seleccionados preferiblemente de los siguientes restos y enlaces:
• alquilo de C1-50, alquenilo C2-50, alquinilo de C2-50, cicloalquilo C3-10, heterociclilo de 3 a 10 miembros, heterobiciclilo de 8 a 11 miembros, fenilo, naftilo, indenilo, indanilo y tetralinilo; y
• enlaces seleccionados del grupo que comprende
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en donde
las líneas punteadas indican la unión a lo que queda del resto o reactivo, y
-R y -Ra se seleccionan independientemente entre sí del grupo que consiste -H, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo y hexilo. De la manera que se usa en la presente, el término “basado en PEG que comprende al menos un X% de PEG” en relación con un resto o reactivo significa que dicho resto o reactivo comprende al menos un X% (p/p) de unidades de etilenglicol (-CH2CH2O-), en donde las unidades de etilenglicol pueden estar dispuestas en bloques, de forma alternada o pueden estar distribuidas aleatoriamente dentro del resto o reactivo, y preferiblemente todas las unidades de etilenglicol de dicho resto o reactivo están presentes en un bloque; el porcentaje en peso restante del resto o reactivo basado en PEG son otros restos seleccionados preferiblemente entre los siguientes restos y enlaces:
• alquilo de C1-50, alquenilo C2-50, alquinilo de C2-50, cicloalquilo C3-10, heterociclilo de 3 a 10 miembros, heterobiciclilo de 8 a 11 miembros, fenilo, naftilo, indenilo, indanilo y tetralinilo; y
• enlaces seleccionados del grupo que comprende
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en donde
las líneas punteadas indican la unión a lo que queda del resto o reactivo, y
-R y -Ra se seleccionan independientemente entre sí del grupo que consiste -H, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo y hexilo. El término “basado en ácido hialurónico que comprende al menos un X% de ácido hialurónico” se usa en consecuencia. De la manera que se usa en la presente, el término “resto espaciador” significa cualquier resto que conecta otros dos restos. Preferiblemente, un resto espaciador se selecciona del grupo que consiste en -T-, alquilo de C1-50, alquenilo de C2 50 y alquinilo de C2-50; en donde -T-, alquilo de C1-50, alquenilo de C2-50 y alquinilo de C2-50 están opcionalmente sustituidos con uno o más -Ry2, que son iguales o diferentes, y en donde el alquilo de C1-50, alquenilo de C2-50 y alquinilo de C2-50 están opcionalmente interrumpidos por uno o más grupos seleccionados del grupo que consiste en -T-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(Ry3)-, -S(O)2N(Ry3)-, -S(O)N(Ry3)-, -S(O)2-, -S(O)-, -N(Ry3)S(O)2N(Ry3a)-, -S-, -N(Ry3)-, -OC(ORy3)(Ry3a)-, -N(Ry3)C(O)N(Ry3a)-, y -OC(O)N(Ry3)-;
cada T se selecciona independientemente del grupo que consiste en fenilo, naftilo, indenilo, indanilo, tetralinilo, cicloalquilo C3-10, heterociclilo de 3 a 10 miembros, carbopoliciclilo de 8 a 30 miembros, y heteropoliciclilo de 8 a 30 miembros; en donde cada T está opcionalmente sustituido de forma independiente con uno o más -Ry2, que son iguales o diferentes;
cada -Ry2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en halógeno, -CN, oxo (=O), -COORy5, -ORy5, -C(O)Ry5, -C(O)N(Ry5Ry5a), -S(O)2N(Ry5Ry5a), -S(O)N(Ry5Ry5a), -S(O)2Ry5, -S(O)Ry5, -N(Ry5)S(O)2N(Ry5aRy5b), -SRy5, -N(Ry5Ry5a), -NO2, -OC(O)Ry5, -N(Ry5)C(O)Ry5a, -N(Ry5)S(O)2Ry5a, -N(Ry5)S(O)Ry5a, -N(Ry5)C(O)ORy5a, -N(Ry5)C(O)N(Ry5aRy5b), -OC(O)N(Ry5Ry5a), y alquilo de C1-6; en donde el alquilo de C1-6 está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, que son iguales o diferentes; y
cada - Ry3, - Ry3a, -Ry4, -Ry4a, -Ry5, -Ry5a y -Ry5b se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H y alquilo de C1-6, en donde el alquilo de C1-6 está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, que son iguales o diferentes.
De la manera que se usa en la presente, el término “sustituido” significa que uno o más átomos de -H de una molécula o fracción se reemplazan por un átomo o un grupo de átomos diferentes, que se denominan “sustituyente”.
Preferiblemente, uno o más sustituyentes opcionales adicionales se seleccionan independientemente entre sí del grupo que consiste en halógeno, -CN, -COORx1, -ORx1, -C(O)Rx1, -C(O)N(Rx1Rx1a), -S(O)2N(Rx1Rx1a), -S(O)N(Rx1Rx1a), -S(O)2Rx1, -S(O)Rx1, -N(Rx1)S(O)2N(Rx1aRx1b), -SRx1, -N(Rx1Rx1a), -NO2, -OC(O)Rx1, -N(Rx1)C(O)Rx1a, -N(Rx1)S(O)2Rx1a, -N(Rx1)S(O)Rx1a, -N(Rx1)C(O)ORx1a, -N(Rx1)C(O)N(Rx1aRx1b), -OC(O)N(Rx1Rx1a), -T0, alquilo de C1-50, alquenilo de C2-50, y alquinilo de C2-50; en donde -T0, alquilo de C1-50, alquenilo de C2-50 y alquinilo de C2-50 están opcionalmente sustituidos con uno o más -Rx2, que son iguales o diferentes, y en donde el alquilo de C1-50, alquenilo de C2-50 y alquinilo de C2-50 están opcionalmente interrumpidos por uno o más grupos seleccionados del grupo que consiste en -T0-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(Rx3)-, -S(O)2N(Rx3)-, -S(O)N(Rx3)-, -S(O)2-, -S(O)-, -N(Rx3)S(O)2N(Rx3a)-, -S-, -N(Rx3)-, -OC(ORx3)(Rx3a)-, -N(Rx3)C(O)N(Rx3a)-, y -OC(O)N(Rx3)-;
-Rx1, -Rx1a, -Rx1b se seleccionan independientemente entre sí del grupo que consiste en -H, -T0, alquilo de C1-50, alquenilo de C2-50 y alquinilo de C2-50; en donde -T0, alquilo de C1-50, alquenilo de C2-50 y alquinilo de C2-50 están opcionalmente sustituidos con uno o más -Rx2, que son iguales o diferentes, y en donde el alquilo de C1-50, alquenilo de C2-50 y alquinilo de C2-50 están opcionalmente interrumpidos por uno o más grupos seleccionados del grupo que consiste en -T0-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(Rx3)-, -S(O)2N(Rx3)-, -S(O)N(Rx3)-; -S(O)2-, -S(O)-, -N(Rx3)S(O)2N(Rx3a)-, -S-, -N(Rx3)-, -OC(ORx3)(Rx3a)-, -N(Rx3)C(O)N(Rx3a)-, y -OC(O)N(Rx3)-;
cada T0 se selecciona independientemente del grupo que consiste en fenilo, naftilo, indenilo, indanilo, tetralinilo, cicloalquilo de C3-10, heterociclilo de 3 a 10 miembros, y heterociclilo de 8 a 11 miembros; en donde cada T0 está independientemente sustituido opcionalmente con uno o más -Rx2, que son iguales o diferentes;
cada -Rx2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en halógeno, -CN, oxo (=O), -COORx4, -ORx4, -C(O)Rx4, -C(O)N(Rx4Rx4a), -S(O)2N(Rx4Rx4a), -S(O)N(Rx4Rx4a), -S(O)2Rx4, -S(O)Rx4, -N(Rx4)S(O)2N(Rx4aRx4b), -SRx4, -N(Rx4Rx4a), -NO2, -OC(O)Rx4, -N(Rx4)C(O)Rx4a, -N(Rx4)S(O)2Rx4a, -N(Rx4)S(O)Rx4a, -N(Rx4)C(O)ORx4a, -N(Rx4)C(O)N(Rx4aRx4b), -OC(O)N(Rx4Rx4a), y alquilo de C1-6; en donde el alquilo de C1-6 está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, que son iguales o diferentes;
cada -Rx3, -Rx3a, -Rx4, -Rx4a, -Rx4b se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H y alquilo de C1-6, en donde el alquilo de C1-6 está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, que son iguales o diferentes.
Más preferiblemente, uno o más sustituyentes opcionales adicionales se seleccionan independientemente entre sí del grupo que consiste en halógeno, -CN, -COORx1, -ORx1, -C(O)Rx1, -C(O)N(Rx1Rx1a), -S(O)2N(Rx1Rx1a), -S(O)N(Rx1Rx1a), -S(O)2Rx1, -S(O)Rx1, -N(Rx1)S(O)2N(Rx1aRx1b), -SRx1, -N(Rx1Rx1a), -NO2, -OC(O)Rx1, -N(Rx1)C(O)Rx1a, -N(Rx1)S(O)2Rx1a, -N(Rx1)S(O)Rx1a, -N(Rx1)C(O)ORx1a, -N(Rx1)C(O)N(Rx1aRx1b), -OC(O)N(Rx1Rx1a), -T0,alquilo de C1-10, alquenilo de C2-10 y alquinilo de C2-10; en donde -T0, alquilo de C1-10, alquenilo de C2-10 y alquinilo de C2-10 están opcionalmente sustituidos con uno o más -Rx2, que son iguales o diferentes, y en donde el alquilo C1-10, alquenilo de C2-10 y alquinilo de C2-10 están opcionalmente interrumpidos por uno o más grupos seleccionados del grupo que consiste en -T0-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(Rx3)-, -S(O)2N(Rx3)-, -S(O)N(Rx3)-, -S(O)2-, -S(O)-, -N(Rx3)S(O)2N(Rx3a)-, -S-, -N(Rx3)-, -OC(ORx3)(Rx3a)-, -N(Rx3)C(O)N(Rx3a)-, y -OC(O)N(Rx3)-;
cada -Rx1, -Rx1a, -Rx1b, -Rx3, -Rx3a se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, halógeno, alquilo de C1-6, alquenilo de C2-6 y alquinilo de C2-6;
cada T0 se selecciona independientemente del grupo que consiste en fenilo, naftilo, indenilo, indanilo, tetralinilo, cicloalquilo de C3-10, heterociclilo de 3 a 10 miembros, y heterociclilo de 8 a 11 miembros; en donde cada T0 está independientemente sustituido opcionalmente con uno o más -Rx2, que son iguales o diferentes;
cada -Rx2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en halógeno, -CN, oxo (=O), -COORx4, -ORx4, -C(O)Rx4, -C(O)N(Rx4Rx4a), -S(O)2N(Rx4Rx4a), -S(O)N(Rx4Rx4a), -S(O)2Rx4, -S(O)Rx4, -N(Rx4)S(O)2N(Rx4aRx4b), -SRx4, -N(Rx4Rx4a), -NO2, -OC(O)Rx4, -N(Rx4)C(O)Rx4a, -N(Rx4)S(O)2Rx4a, -N(Rx4)S(O)Rx4a, -N(Rx4)C(O)ORx4a, -N(Rx4)C(O)N(Rx4aRx4b), -OC(O)N(Rx4Rx4a), y alquilo de C1-6; en donde el alquilo de C1-6 está opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, que son iguales o diferentes;
cada -Rx4, -Rx4a, -Rx4b se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, halógeno, alquilo de C1-6, alquenilo de C2-6 y alquinilo de C2-6;
Incluso más preferiblemente, uno o más sustituyentes opcionales adicionales se seleccionan independientemente entre sí del grupo que consiste en halógeno, -CN, -COORx1, -ORx1, -C(O)Rx1, -C(O)N(Rx1Rx1a), -S(O)2N(Rx1Rx1a), -S(O)N(Rx1Rx1a), -S(O)2Rx1, -S(O)Rx1, -N(Rx1)S(O)2N(Rx1aRx1b), -SRx1, -N(Rx1Rx1a), -NO2, -OC(O)Rx1, -N(Rx1)C(O)Rx1a, -N(Rx1)S(O)2Rx1a, -N(Rx1)S(O)Rx1a, -N(Rx1)C(O)ORx1a, -N(Rx1)C(O)N(Rx1aRx1b), -OC(O)N(Rx1Rx1a), -T0,alquilo de C1-6, alquenilo de C2-6 y alquinilo de C2-6; en donde -T0, alquilo de C1-6, alquenilo de C2-6 y alquinilo de C2-6 están opcionalmente sustituidos con uno o más -RRx2, que son iguales o diferentes, y en donde el alquilo C1-6, alquenilo de C2-6 y alquinilo de C2-6 están opcionalmente interrumpidos por uno o más grupos seleccionados del grupo que consiste en -T0-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(Rx3)-, -S(O)2N(Rx3)-, -S(O)N(Rx3)-, -S(O)2-, -S(O)-, -N(Rx3)S(O)2N(Rx3a)-, -S-, -N(Rx3)-, -OC(ORx3)(Rx3a)-, -N(Rx3)C(O)N(Rx3a)-, y -OC(O)N(Rx3)-;
cada -Rx1, -Rx1a, -Rx1b, -Rx2, -Rx3, -Rx3a se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, halógeno, alquilo de C1-6, alquenilo de C2-6 y alquinilo de C2-6;
cada T0 se selecciona independientemente del grupo que consiste en fenilo, naftilo, indenilo, indanilo, tetralinilo, cicloalquilo de C3-10, heterociclilo de 3 a 10 miembros, y heterociclilo de 8 a 11 miembros; en donde cada T0 está independientemente sustituido opcionalmente con uno o más -Rx2, que son iguales o diferentes.
Preferiblemente, un máximo de 6 átomos -H de una molécula opcionalmente sustituida se reemplazan independientemente por un sustituyente, 5 átomos -H se reemplazan independientemente por un sustituyente, 4 átomos -H se reemplazan independientemente por un sustituyente, 3 átomos -H se reemplazan independientemente por un sustituyente, 2 átomos -H se reemplazan independientemente por un sustituyente, o 1 átomo -H se reemplaza por un sustituyente.
El término “interrumpido” significa que un resto se inserta entre dos átomos de carbono o, si la inserción es en uno de los extremos del resto, entre un carbono o heteroátomo y un átomo de hidrógeno, preferiblemente entre un átomo de carbono y un átomo de hidrógeno.
De la manera que se usa en la presente, el término “alquilo C1-4” solo o en combinación significa un resto alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. Si está presente al final de una molécula, los ejemplos de alquilo C1-4 de cadena lineal o ramificada son metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo y terc-butilo. Cuando dos restos de una molécula están ligados por el alquilo de C1-4, los ejemplos de tales grupos alquilo de C1-4 son -CH2-, -CH2- CH2-, -CH(CH3)-, -CH2-CH2-CH2-, - c H ( C 2H 5 ) - , -C(CH3)2-. Cada hidrógeno de un carbono de alquilo C1-4 puede estar opcionalmente reemplazado por un sustituyente como se definió anteriormente. Opcionalmente, un alquilo C1-4 puede estar interrumpido por uno o más restos como se define a continuación.
De la manera que se usa en la presente, el término “alquilo C1-6” solo o en combinación significa un resto alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 6 átomos de carbono. Si están presentes al final de una molécula, los ejemplos de grupos alquilo C1-6 de cadena lineal y ramificados son metilo,
etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo, 2-metilbutilo, 2,2-dimetilpropil, n-hexilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 2,2-dimetilbutilo, 2,3-dimetilbutilo y 3,3-dimetilpropilo. Cuando dos restos de una molécula están ligados por el grupo alquilo de C1-6, los ejemplos de tales grupos alquilo de C1-6 son -CH2-, -CH2-CH2-, -CH(CH3)-, -CH2-CH2-CH2-, -CH(C2H5)- y -C(CH3)2-. Cada átomo de hidrógeno de un carbono C1-6 puede estar opcionalmente reemplazado por un sustituyente como se definió anteriormente. Opcionalmente, un alquilo C1-6 puede estar interrumpido por uno o más restos como se define a continuación.
Por consiguiente, “alquilo C1-10”, “alquilo C1-20” o “alquilo C1-50” significa una cadena de alquilo que tiene de 1 a 10, de 1 a 20 o de 1 a 50 átomos de carbono, respectivamente, en donde cada átomo de hidrógeno del carbono C1-10, C1-20 o C1-50 puede estar opcionalmente reemplazado por un sustituyente como se definió anteriormente. Opcionalmente, un alquilo C1-10 o C1-50 puede estar interrumpido por uno o más restos como se define a continuación.
De la manera que se usa en la presente, el término “alquenilo de C2-6” solo o en combinación significa un resto hidrocarbonado de cadena lineal o ramificada que comprende al menos un enlace doble carbono-carbono que tiene de 2 a 6 átomos de carbono. Si está presente al final de una molécula, los ejemplos son -CH=CH2, -CH=CH-CH3, -CH2-CH=CH2, -CH=CHCH2-CH3 y -CH=CH-CH=CH2. Cuando dos restos de una molécula están ligados por el grupo alquenilo de C2-6, entonces un ejemplo de dicho alquenilo de C2-6 es -CH=CH-. Cada átomo de hidrógeno de un resto alquenilo de C2-6 puede estar opcionalmente reemplazado por un sustituyente como se definió anteriormente. Opcionalmente, un alquenilo de C2-6 puede estar interrumpido por uno o más restos como se define a continuación.
Por consiguiente, el término “alquenilo de C2-10”, “alquenilo de C2-20” o “alquenilo de C2-50” solo o en combinación significa un resto de hidrocarburo de cadena lineal o ramificada que comprende al menos un enlace doble carbono-carbono que tiene de 2 a 10, 2 a 20, o 2 a 50 átomos de carbono. Cada átomo de hidrógeno de un grupo alquenilo de C2-10, alquenilo de C2-20 o alquenilo de C2-50 puede estar opcionalmente reemplazado por un sustituyente como se definió anteriormente. Opcionalmente, un alquenilo de C2-10, alquenilo de C2-20 o alquenilo de C2-50 puede estar interrumpido por uno o más restos como se define a continuación.
De la manera que se usa en la presente, el término “alquinilo de C2-6” solo o en combinación significa un resto hidrocarbonado de cadena lineal o ramificada que comprende al menos un enlace triple carbono-carbono que tiene de 2 a 6 átomos de carbono. Si está presente al final de una molécula, los ejemplos son -C=CH, -CH2-CECH, CH2-CH2-CECH y CH2-C≡C-CH3. Cuando dos restos de una molécula están unidos por el grupo alquinilo, entonces un ejemplo es -C=C-. Cada átomo de hidrógeno de un grupo alquinilo de C2-6 puede estar opcionalmente reemplazado por un sustituyente como se definió anteriormente. Opcionalmente, puede haber uno o más enlaces dobles. Opcionalmente, un alquinilo de C2-6 puede estar interrumpido por uno o más restos como se define a continuación.
Por consiguiente, de la manera que se usa en la presente, el término “alquinilo de C2-10”, “alquinilo de C2-20” y “alquinilo de C2-50” solos o en combinación significan un resto de hidrocarburo de cadena lineal o ramificada que comprende al menos un enlace triple carbono-carbono que tienen de 2 a 10, de 2 a 20 o de 2 a 50 átomos de carbono, respectivamente. Cada átomo de hidrógeno de un grupo alquinilo de C2-10, alquinilo de C2-20 o alquinilo de C2-50 puede estar opcionalmente reemplazado por un sustituyente como se definió anteriormente. Opcionalmente, puede haber uno o más enlaces dobles. Opcionalmente, un alquinilo de C2-10, alquinilo de C2-20 o alquinilo de C2-50 puede estar interrumpido por uno o más restos como se define a continuación.
Como se mencionó anteriormente, un alquilo de C1-4, alquilo de C1-6, alquilo de C1-10, alquilo de C1-20, alquilo de C1-50, alquenilo de C2-6, alquenilo C2-10, alquenilo de C2-20, alquenilo C2-50, alquinilo de C2-6, alquinilo de C2-10, alquenilo de C2-20 o alquinilo C2-50 pueden estar opcionalmente interrumpidos por uno o más restos que se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en
Figure imgf000021_0001
en donde
las líneas punteadas indican la unión a lo que queda del resto o reactivo; y
-R y -Ra se seleccionan independientemente entre sí del grupo que consiste -H, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo y hexilo.
De la manera que se usa en la presente, el término “cicloalquilo de C3-10” significa una cadena de alquilo cíclica que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, que puede ser saturada o insaturada, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo, ciclooctilo, ciclononilo o ciclodecilo. Cada átomo de hidrógeno de un carbono de cicloalquilo de C3-10 puede reemplazarse por un sustituyente como se definió anteriormente. El término “cicloalquilo de C3-10” también incluye biciclos puenteados, como norbornano o norborneno.
El término “carbopoliciclilo de 8 a 30 miembros” o “carbopoliciclo de 8 a 30 miembros” significa un resto cíclico de dos o más anillos con 8 a 30 átomos en el anillo, en donde dos anillos vecinos comparten al menos un átomo en el anillo y que puede contener hasta el número máximo de dobles enlaces (anillo aromático o no aromático que está total, parcialmente o no saturado). Preferiblemente, un carbopoliciclilo de 8 a 30 miembros significa un resto cíclico de dos, tres, cuatro o cinco anillos, más preferiblemente de dos, tres o cuatro anillos.
De la manera que se usa en la presente, el término “heterociclilo de 3 a 10 miembros” o “heterociclo de 3 a 10 miembros” significa un anillo con 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 átomos en el anillo que puede contener hasta al número máximo de enlaces dobles (anillo aromático o no aromático que está total, parcialmente o no saturado), en donde al menos un átomo del anillo y hasta 4 átomos del anillo se reemplazan por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en azufre (incluyendo -S(O)-, -S(O)2-), oxígeno y nitrógeno (incluyendo =N(O)-), y en donde el anillo está unido al resto de la molécula a través de un átomo de carbono o nitrógeno. Los ejemplos de heterociclos de 3 a 10 miembros incluyen, entre otros, aziridina, oxirano, tiirano, azirina, oxireno, tiirano, azetidina, oxetano, tietano, furano, tiofeno, pirrolo, pirrolina, imidazol, imidazolina, pirazol, pirazolina, oxazol, oxazolina, isoxazol, isoxazolina, tiazol, tiazolina, isotiazol, isotiazolina, tiadiazol, tiadiazolina, tetrahidrofurano, tetrahidrotiofeno, pirrolidina, imidazolidina, pirazolidina, oxazolidina, isoxazolidina, tiazolidina, isotiazolidina, tiadiazolidina, sulfolano, pirano, dihidropirano, tetrahidropirano, imidazolidina, piridina, piridazina, pirazina, pirimidina, piperazina, piperidina, morfolina, tetrazol, triazol, triazolidina, tetrazolidina, diazepano, azepina y homopiperazina. Cada átomo de hidrógeno de un grupo heterociclilo de 3 a 10 miembros o heterocíclico de 3 a 10 miembros puede ser reemplazado por un sustituyente como se define a continuación.
De la manera que se usa en la presente, el término “heterobiciclilo de 8 a 11 miembros” o “heterobiciclo de 8 a 11 miembros” significa un resto heterocíclico de dos anillos con 8 a 11 átomos en el anillo, en donde al menos un átomo del anillo es compartido por ambos anillos y que puede contener hasta el número máximo de enlaces dobles (anillo aromático o no aromático que está total, parcialmente o no saturado), en donde al menos un átomo del anillo y hasta 6 átomos del anillo se reemplazan por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en azufre (que incluye -S(O)-, -S(O)2-), oxígeno y nitrógeno (que incluye =N(O)-), y en donde el anillo está unido al resto de la molécula a través de un átomo de carbono o nitrógeno. Los ejemplos de un heterobiciclo de 8 a 11 miembros son indol, indolina, benzofurano, benzotiofeno, benzoxazol,
benzisoxazol, benzotiazol, benzisotiazol, benzimidazol, bencimidazolina, quinolina, quinazolina, dihidroquinazolina, quinolina, dihidroquinolina, tetrahidroquinolina, decahidroquinolina, isoquinolina, decahidroisoquinolina, tetrahidroisoquinolina, dihidroisoquinolina, benzazepina, purina y pteridina. El término heterociclo de 8 a 11 miembros también incluye estructuras espiro de dos anillos, como 1,4-dioxa-8-azaspiro[4.5]decano, o heterociclos puenteados, como 8-aza-biciclo[3.2.1]octano. Cada átomo de hidrógeno de un carbono de heterobiciclilo de 8 a 11 miembros o de heterobiciclo de 8 a 11 miembros puede reemplazarse por un sustituyente como se define a continuación.
De manera similar, el término "heteropoliciclilo de 8 a 30 miembros" o "heteropoliciclo de 8 a 30 miembros" significa un resto heterocíclico de más de dos anillos con 8 a 30 átomos en el anillo, preferiblemente de tres, cuatro o cinco anillos, en donde dos anillos vecinos comparten al menos un átomo en el anillo y que puede contener hasta el número máximo de enlaces dobles (anillo aromático o no aromático total, parcialmente o no saturado), en donde al menos un átomo del anillo y hasta 10 átomos del anillo se reemplazan por un heteroátomo seleccionado del grupo de azufre (que incluye -S(O)-, -S(O)2-), oxígeno y nitrógeno (incluyendo =N(O)-), y en donde el anillo está unido al resto de una molécula a través de un átomo de carbono o nitrógeno.
Se entiende la frase “el par Rx/Ry se une con el átomo al que están unidos para formar un cicloalquilo C3-10 o un heterociclilo de 3 a 10 miembros” en relación con un resto de la estructura
Figure imgf000022_0001
significa que Rx y Ry forman la siguiente estructura:
Figure imgf000022_0002
en donde R es cicloalquilo C3-10 o heterociclilo de 3 a 10 miembros.
También se entiende la frase “el par Rx/Ry se une con los átomos a los que están unidos para formar un anillo A” en relación con un resto de la estructura
Figure imgf000023_0001
significa que Rx y Ry forman la siguiente estructura:
Figure imgf000023_0002
De la manera que se usa en la presente, “halógeno” significa flúor, cloro, bromo o yodo. Generalmente se prefiere que el halógeno sea fluoro o cloro.
En general, el término “comprender” o “que comprende” también abarca “consistir” o “que consiste en”.
Preferentemente, el compuesto de PTH comprende una molécula de PTH o un resto de PTH que tiene la secuencia de SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114 o SEQ ID NO:115. Más preferiblemente, la molécula de PTH o el resto de PTH tiene la secuencia de SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111 o SEQ ID NO:112. En una realización, la molécula de PTH o el resto de PTH tiene la secuencia de SEQ ID NO:50.
En otra realización, la molécula de PTH o el resto de PTH tiene la secuencia de SEQ ID NO:52.
En otra realización, la molécula de PTH o el resto de PTH tiene la secuencia de SEQ ID NO:110.
En otra realización, la molécula de PTH o el resto de PTH tiene la secuencia de SEQ ID NO:111.
En otra realización, la molécula de PTH o el resto de PTH tiene la secuencia de SEQ ID NO:112.
Lo más preferiblemente, la molécula de PTH o el resto de PTH tiene la secuencia de SEQ ID NO:51.
La administración del compuesto de PTH es por vía subcutánea.
El período de tiempo entre dos administraciones consecutivas, preferiblemente entre dos administraciones subcutáneas consecutivas, es decir, el intervalo de administración es de 24 horas.
La relación pico a valle medida en cada intervalo de administración es de menos de 4, preferiblemente menos de 3,8, más preferiblemente menos de 3.6, incluso más preferiblemente menos de 3,4, incluso más preferiblemente menos de 3,2, incluso más preferiblemente menos de 3, incluso más preferiblemente menos de 2,8, incluso más preferiblemente menos de 2,6, incluso más preferiblemente menos de 2,4, incluso más preferiblemente menos de 2,2, y lo más preferiblemente menos de 2.
La administración subcutánea es mediante inyección subcutánea. Preferiblemente, dicha inyección subcutánea se realiza con un dispositivo tipo pluma.
El compuesto de PTH es un compuesto de PTH de liberación controlada.
El compuesto de PTH de liberación controlada es soluble en agua.
El compuesto de PTH de liberación controlada soluble en agua de fórmula (IIf-i) cae dentro del alcance de la fórmula (Ia) o (Ib) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000024_0001
en donde
- D es un resto de PTH;
- L1- es un resto enlazador de profármaco reversible conectado al resto de PTH -D a través de un grupo funcional de PTH; -L2- es un enlace químico simple o un resto espaciador;
- Z es un resto portador soluble en agua;
x es un número entero seleccionado del grupo que consiste en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16; y y es un número entero seleccionado del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4 y 5.
Se entiende que los compuestos de fórmula (Ia) y (Ib) son profármacos de PTH, más específicamente profármacos de PTH solubles en agua.
Preferiblemente, -D tiene la secuencia de SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114 o SEQ ID NO:115. Más preferiblemente, -D tiene la secuencia de SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111 o SEQ ID NO:112.
En una realización, -D tiene la secuencia de SEQ ID NO:50.
En otra realización -D tiene la secuencia de SEQ ID NO:52.
En otra realización -D tiene la secuencia de SEQ ID NO:110.
En otra realización -D tiene la secuencia de SEQ ID NO:111.
En otra realización -D tiene la secuencia de SEQ ID NO:112.
Más preferiblemente, -D tiene la secuencia de SEQ ID NO:51.
El resto -L1- está conjugado con un grupo funcional de la cadena lateral de un residuo de aminoácido de -D, con el grupo funcional de amina N-terminal de -D, o con un átomo de nitrógeno en la cadena polipeptídica principal de -D. La unión al extremo N-terminal puede ser directamente a través del grupo funcional amina correspondiente.
Preferiblemente, el residuo de aminoácido de PTH al que se conjuga -L1- comprende un grupo funcional de amina primaria.
Si el resto -L1- se conjuga con un grupo funcional de la cadena lateral de un residuo de aminoácido de PTH, dicho residuo de aminoácido se selecciona del grupo que consiste en residuos de aminoácidos proteinogénicos y residuos de aminoácidos no proteinogénicos.
En una realización, -L1- se conjuga con un grupo funcional de la cadena lateral de un residuo de aminoácido no proteinogénico de PTH. Se entiende que dicho aminoácido no proteinogénico no se encuentra en la secuencia de PTH nativa o fragmentos de la misma, y que sólo puede estar presente en variantes y derivados de PTH.
En otra realización, -L1- se conjuga con un grupo funcional de la cadena lateral de un residuo de aminoácido proteinogénico de PTH. Preferiblemente, dicho aminoácido se selecciona del grupo que consiste en histidina, lisina, triptófano y arginina.
En una realización -L1- se conjuga con un grupo funcional de la cadena lateral de una histidina de PTH.
En otra realización, -L1- se conjuga con un grupo funcional de la cadena lateral de una lisina de PTH.
En otra realización, -L1- se conjuga con un grupo funcional de la cadena lateral de un triptófano de PTH.
En otra realización -L1- se conjuga con un grupo funcional de la cadena lateral de una arginina de PTH.
Se entiende que no todos los restos de PTH pueden comprender todos estos residuos de aminoácidos.
Preferiblemente, -L1- se conjuga directamente con el grupo funcional amino N-terminal de la PTH. -L1- está conectada a -D a través de un enlace amida.
El resto -L1- es un enlazador de profármaco reversible a partir del cual el fármaco, es decir, PTH, se libera en su forma libre, es decir,
es un enlazador de profármacos sin trazas.
- L1- se describe en términos más amplios en WO 2009/095479 A2.
El resto -L1- es de la fórmula (Nb-iii):
Figure imgf000025_0001
en donde
la línea punteada indica la unión a un nitrógeno de -D que es un resto de PTH mediante la formación de un enlace amida; y
en donde -L- está sustituido con -L2-Z, siempre que el hidrógeno marcado con el asterisco en la fórmula (Nb-iii) no sea reemplazado por -L2-Z.
- L1- de la fórmula (Nb-iii) está sustituido con un resto -L2-Z.
El resto -L1- de la fórmula (IIb-iii) no se sustituye adicionalmente.
El resto -L1- es de la fórmula (Nb-iii'):
Figure imgf000025_0002
en donde
la línea punteada indica la unión a un nitrógeno de -D que es un resto de PTH mediante la formación de un enlace amida; la línea punteada marcada con un asterisco indica la unión de -L2-Z.
En los profármacos de la presente invención, -L2- es un resto espaciador.
De la manera que se usa en la presente, el término “ longitud de la cadena” con respecto al resto -L2- se refiere al número de átomos de -L2- presentes en la conexión más corta entre -L1- y -Z.
-L2- es de la fórmula (i)
Figure imgf000025_0003
en donde
la línea punteada marcada con un asterisco indica la unión a -L1
la línea punteada sin marcar indica la unión a -Z;
n es 6.
El resto -L1-L2- es
Figure imgf000026_0001
en donde
la línea punteada sin marcar indica la unión a un nitrógeno de -D que es un resto de PTH mediante la formación de un enlace amida; y
la línea punteada marcada con un asterisco indica la unión a -Z.
El compuesto de PTH de liberación controlada de la presente invención tiene la fórmula (Ia) con x = 1.
El portador -Z comprende poli(etilenglicol).
En una realización preferida, -Z tiene un peso molecular de aproximadamente 40 kDa.
- Z es un polímero basado en PEG ramificado. -Z es un polímero basado en PEG ramificado que tiene un punto de ramificación.
El punto de ramificación es -CH<.
Dicho resto ramificado -Z tiene un peso molecular de aproximadamente 40 kDa.
- Z comprende un resto
Figure imgf000026_0002
- Z comprende un enlace amida.
- Z es un resto de la fórmula (b)
Figure imgf000026_0003
en donde
la línea punteada indica la unión a -L2-; y
m y p son, independientemente uno del otro, un número entero en el rango de 400 a 500.
Preferiblemente, m y p de la fórmula (b) son el mismo número entero.
Lo más preferiblemente, m y p de la fórmula (b) son aproximadamente 450.
El profármaco de PTH de la presente invención tiene la fórmula (IIf-i):
Figure imgf000027_0001
en donde
la línea punteada sin marcar indica la unión a un nitrógeno de -D que es un resto de PTH mediante la formación de un enlace amida; y
la línea punteada marcada con un asterisco indica la unión a un resto
Figure imgf000027_0002
en donde
m y p son independientemente un número entero en el rango de 400 a 500.
Preferiblemente, -D se une al profármaco de PTH de la fórmula (IIf-i) a través del grupo funcional amino N-terminal del resto de PTH.
En una realización preferida, la actividad residual de la PTH de liberación controlada en forma de profármaco de PTH es menos de 10%, más preferiblemente menos de 1%, incluso más preferiblemente menos de 0,1%, incluso más preferiblemente menos de 0,01%, incluso más preferiblemente menos de 0,001%, y lo más preferiblemente menos de 0,0001%.
De la manera que se usa en la presente, el término “actividad residual” se refiere a la actividad exhibida por el profármaco de PTH con el resto de PTH unido a un portador en relación con la actividad exhibida por la correspondiente PTH libre. En este contexto, el término “actividad” se refiere a la unión a un dominio de activación del receptor PTH/PTHrP1 que da como resultado la activación de la adenilato ciclasa para generar AMPc, la fosfolipasa C para generar calcio intracelular, o la expresión osteoblástica de RANKL (que se une a RANK (activador del receptor de factor nuclear kB) en los osteoclastos. Se entiende que medir la actividad residual del profármaco de PTH de la presente invención lleva tiempo durante el cual se puede liberar una cierta cantidad de PTH del profármaco de PTH de la presente invención y que dicha PTH liberada distorsionará los resultados medidos para el profármaco de PTH. Por lo tanto, es una práctica aceptada probar la actividad residual de un profármaco con un conjugado en el que el resto del fármaco, en este caso PTH, está unido de forma irreversible, es decir, de forma estable, a un portador, que se parece lo más posible a la estructura del profármaco de PTH para el cual se medirá la actividad residual.
Preferiblemente, la composición farmacéutica de la presente invención tiene un pH en el rango de pH 3 y pH 8. Más preferiblemente, la composición farmacéutica tiene un pH en el rango de pH 4 a pH 6. Lo más preferiblemente, la composición farmacéutica tiene un pH en el rango de pH 4 a pH 5.
En una realización, la composición farmacéutica de la presente invención es una formulación líquida.
En otra realización, la composición farmacéutica de la presente invención es una formulación seca que se reconstituye antes de la administración a un paciente.
Tal composición farmacéutica líquida, seca o reconstituida comprende al menos un excipiente. Los excipientes utilizados en formulaciones parenterales pueden clasificarse como, por ejemplo, agentes amortiguadores, modificadores de isotonicidad, conservantes, estabilizadores, agentes antiadsorción, agentes de protección contra la oxidación, viscosificadores/agentes potenciadores de la viscosidad, u otros agentes auxiliares. Sin embargo, en algunos casos, un excipiente puede tener funciones dobles o triples. Preferiblemente, al menos un excipiente comprendido en la composición farmacéutica de la presente invención se selecciona del grupo que consiste en
(i) Agentes amortiguadores: amortiguadores fisiológicamente tolerados para mantener el pH en un rango deseado, tal como el fosfato de sodio, bicarbonato, succinato, histidina, citrato y acetato, sulfato, nitrato, cloruro, piruvato; también pueden usarse antiácidos, tales como Mg(OH)2 o ZnCOs;
(ii) Modificadores de isotonicidad: para minimizar el dolor que puede provocar el daño celular debido a las diferencias de presión osmótica en el depósito de inyección; la glicerina y el cloruro de sodio son ejemplos; las concentraciones eficaces pueden determinarse por osmometría utilizando una osmolalidad supuesta de 285-315 mOsmol/kg para el suero;
(iii) Conservantes y/o antimicrobianos: las formulaciones parenterales multidosis requieren la adición de conservantes en una concentración suficiente para minimizar el riesgo de que los pacientes se infecten tras la inyección y se han establecido los requisitos reglamentarios correspondientes; los conservantes típicos incluyen m-cresol, fenol, metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno, butilparabeno, clorobutanol, alcohol bencílico, nitrato fenilmercúrico, timerosol, ácido sórbico, sorbato de potasio, ácido benzoico, clorocresol y cloruro de benzalconio;
(iv) Estabilizadores: La estabilización se logra mediante el fortalecimiento de las fuerzas estabilizadoras de la proteína, mediante la desestabilización del estado desnaturalizado o mediante la unión directa de los excipientes a la proteína; los estabilizadores pueden ser aminoácidos, tales como alanina, arginina, ácido aspártico, glicina, histidina, lisina, prolina; azúcares, tales como la glucosa, sacarosa, trehalosa; polioles, tales como glicerol, manitol, sorbitol; sales, tales como fosfato de potasio, sulfato de sodio; agentes quelantes, tales como EDTA, hexafosfato; ligandos, tales como iones de metales divalentes (zinc, calcio, etc.); otras sales o moléculas orgánicas, tales como derivados fenólicos; además, se pueden utilizar oligómeros o polímeros, tales como ciclodextrinas, dextrano, dendrímeros, PEG o PVP o protamina o HSA;
(v) Agentes antiadsorción: Se utilizan principalmente tensoactivos iónicos o no iónicos u otras proteínas o polímeros solubles para recubrir o adsorberse de forma competitiva en la superficie interna del recipiente de la formulación; por ejemplo, poloxámero (Pluronic F-68), PEG dodecil éter (Brij 35), polisorbato 20 y 80, dextrano, polietilenglicol, PEG-polihistidina, BSA y HSA y gelatinas; la concentración elegida y el tipo de excipiente dependen del efecto a evitar, pero normalmente se forma una monocapa de tensoactivo en la interfase justo por encima del valor de CMC;
(vi) Agentes de protección contra la oxidación: antioxidantes, tales como ácido ascórbico, ectoína, metionina, glutatión, monotioglicerol, morina, polietilenimina (PEI), galato de propilo, y vitamina E; también se pueden usar agentes quelantes, tales como el ácido cítrico, EDTA, hexafosfato y ácido tioglicólico;
(vii) Viscosificantes o potenciadores de la viscosidad: en caso de una suspensión retardan el asentamiento de las partículas en el vial y la jeringa y se utilizan para facilitar la mezcla y la resuspensión de las partículas, y para que la suspensión sea más fácil de inyectar (es decir, requiere poca fuerza en el émbolo de la jeringa); viscosificantes o potenciadores de la viscosidad adecuados son, por ejemplo, viscosificantes de carbómero, como Carbopol 940, Carbopol Ultrez 10, derivados de celulosa, como hidroxipropilmetilcelulosa (hipromelosa, HPMC) o dietilaminoetilcelulosa (DEAE o DEAE-C), silicato de magnesio coloidal (Veegum) o silicato de sodio, gel de hidroxiapatita, gel de fosfato tricálcico, xantanas, carrageninas, como goma Satia UTC 30, poli(hidroxiácidos) alifáticos, tales como poli(ácido D,L- o L-láctico) (PLA, por sus siglas en inglés) y poli(ácido glicólico) (PGA, por sus siglas en inglés) y sus copolímeros (PLGA), terpolímeros de D,L-lactida, glicolida y caprolactona, poloxámeros, bloques de poli(oxietileno) hidrófilos y bloques de poli(oxipropileno) hidrófobos para formar un tribloque de poli(oxietileno)-poli(oxipropileno)-poli(oxietileno) (por ejemplo, Pluronic®), copolímero de polieteréster, tal como un copolímero de tereftalato de polietilenglicol/tereftalato de polibutileno, isobutirato de acetato de sacarosa (SAIB, por sus siglas en inglés), dextrano o derivados de los mismos, combinaciones de dextranos y PEG, polidimetilsiloxano, colágeno, quitosano, alcohol polivinílico (PVA, por sus siglas en inglés) y derivados, polialquilimidas, poli(acrilamida-co-dialildimetilamonio (DADMA)), polivinilpirrolidona (PVP), glicosaminoglicanos (GAG), tal como el sulfato de dermatán, sulfato de condroitina, sulfato de queratán, heparina, sulfato de heparán, hialuronano, copolímeros de tribloque ABA o bloque AB compuesto por bloques A hidrófobos, tales como poliláctido (PLA) o poli(láctido-co-glicólido) (PLGA), y bloques B hidrófilos, tales como polietilenglicol (PEG) o polivinilpirrolidona; dichos copolímeros de bloque, así como los poloxámeros mencionados anteriormente, pueden exhibir un comportamiento de gelificación térmica inversa (estado fluido a temperatura ambiente para facilitar la administración y estado de gel por encima de la temperatura de transición sol-gel a temperatura corporal después de la inyección);
(viii) Agente esparcidor o difusor: modifica la permeabilidad del tejido conjuntivo a través de la hidrólisis de componentes de la matriz extracelular en el espacio intrasticial, tal como, pero sin limitarse a, ácido hialurónico, un polisacárido que se encuentra en el espacio intercelular del tejido conectivo; un agente de difusión, tal como, pero sin limitarse a, hialuronidasa disminuye temporalmente la viscosidad de la matriz extracelular y promueve la difusión de los fármacos inyectados; y
(ix) Otros agentes auxiliares: tales como agentes humectantes, modificadores de la viscosidad, antibióticos, hialuronidasa; ácidos y bases, tales como el ácido clorhídrico y el hidróxido de sodio, son agentes auxiliares necesarios para el ajuste del pH durante la fabricación.
Ejemplos
Materiales y métodos
La PTH(1-34) protegida con cadena lateral (SEQ ID NO:51) sobre resina TCP que tiene el extremo N-terminal protegido con Boc y la cadena lateral de Lys26 protegida con ivDde (sintetizada mediante la estrategia Fmoc) se obtuvo de proveedores de síntesis de péptidos personalizados.
La PTH(1-34) protegida con cadena lateral sobre resina TCP que tiene el extremo N-terminal protegido con Fmoc (sintetizada mediante la estrategia Fmoc) se obtuvo de proveedores de síntesis de péptidos personalizados.
Maleimida de PEG 2x20 kDa, Sunbright GL2-400MA se adquirió de NOF Europe N.V., Grobbendonk, Bélgica. El ácido S-tritil-6-mercaptohexanoico se adquirió de Polypeptide, Estrasburgo, Francia. HATU se obtuvo de Merck Biosciences GmbH, Schwalbach/Ts, Alemania. Fmoc-N-Me-Asp(OBn)-OH se obtuvo de Peptide International Inc., Louisville, KY, EE. UU. Fmoc-Aib-OH se adquirió de Iris Biotech GmbH, Marktredwitz, Alemania. Todos los demás productos químicos y reactivos se compraron de Sigma Aldrich GmbH, Taufkirchen, Alemania, a menos que se mencione un proveedor diferente.
El compuesto 11a (ejemplos 11-15) se sintetizó siguiendo el procedimiento descrito en la patente WO29095479A2, ejemplo 1.
Se utilizaron jeringas equipadas con fritas de polietileno (MultiSynTech GmbH, Witten, Alemania) como recipientes de reacción o para los pasos de lavado de las resinas peptídicas.
Procedimiento general para la eliminación del grupo protector ivDde de PTH protegida con cadena lateral sobre resina: La resina se hinchó previamente en DMF durante 30 min y el disolvente se desechó. El grupo ivDde se eliminó incubando la resina con DMF/hidrato de hidrazina 4/1 (v/v, 2,5 mL/g de resina) durante 8 x 15 min. Para cada paso se usó una nueva solución de DMF/hidrato de hidrazina. Por último, la resina se lavó con DMF (10 x), DCM (10 x) y se secó al vacío.
Procedimiento general para la eliminación del grupo protector Fmoc de la PTH protegida sobre resina: La resina se hinchó previamente en DMF durante 30 min y el disolvente se desechó. El grupo Fmoc se eliminó incubando la resina con DMF/piperidina/DBU 96/2/2 (v/v/v, 2,5 mL/g de resina) durante 3 x 10 min. Para cada paso se usó una nueva solución h de DMF/piperidina/DBU. Por último, la resina se lavó con DMF (10 x), DCM (10 x) y se secó al vacío.
Purificación por RP-HPLC:
Para la RP-HPLC preparativa se utilizó un controlador Waters 600 y un detector de absorbancia dual 2487, equipado con las siguientes columnas: Waters XBridge™ BEH300 Prep C185 pm, 150 x 10 mm, caudal 6 mL/min, o Waters XBridge™ BEH300 Prep C18 10 pm, 150 x 30 mm, caudal 40 mL/min. Se usaron gradientes lineales del sistema disolvente A (agua que contiene 0,1% de TFA v/v) y el sistema solvente B (acetonitrilo que contiene 0,1% de TFA v/v). Las fracciones de HPLC que contenían el producto se agruparon y liofilizaron si no se indica lo contrario.
Cromatografía flash:
Las purificaciones por cromatografía flash se realizaron en un sistema Isolera One de Biotage AB, Suecia, usando cartuchos de sílice Biotage KP-Sil y n-heptano y acetato de etilo como eluyentes. Los productos se detectaron a 254 nm.
Cromatografía de intercambio de iones:
La cromatografía de intercambio de iones (IEX, por sus siglas en inglés) se realizó utilizando un sistema Amersham Bioscience AEKTAbasic equipado con una columna de intercambio de cationes MacroCap SP (Amersham Bioscience/GE Healthcare). Como fases móviles se utilizaron ácido acético 17 mM pH 4,5 (disolvente A) y ácido acético 17 mM, NaCl 1 M, pH 4,5 (disolvente B).
Cromatografía de exclusión por tamaño:
La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) se llevó a cabo utilizando un sistema Amersham Bioscience AEKTAbasic equipado con columnas de desalinización HiPrep 26/10 (Amersham Bioscience/GE Healthcare). Como fase móvil se utilizó ácido acético al 0,1% (v/v).
Métodos analíticos
La cromatografía líquida de ultra alta resolución analítica (UPLC)-MS se llevó a cabo en un sistema Waters Acquity equipado con una columna Waters BEH300 C18 (2,1 x 50 mm, tamaño de partícula de 1,7 pm, flujo: 0,25 mL/min; disolvente A: agua que contiene 0,04% de TFA (v/v), disolvente B: acetonitrilo que contiene 0,05 % de TFA (v/v) acoplado a un espectrómetro de masas LTQ Orbitrap Discovery de Thermo Scientific o acoplado a un instrumento Waters Micromass ZQ.
Cuantificación de las concentraciones de PTH(1-34) total en plasma:
Las concentraciones de PTH(1-34) total en plasma se determinaron mediante la cuantificación de un péptido característico cercano al extremo N-terminal (secuencia: IQLMHNLGK) y un péptido característico C-terminal (secuencia: LQDVHNF) después de la precipitación de proteínas plasmáticas, seguida de digestión secuencial con Endoproteinasa Lys-C (origen: Lysobacter enzymogenes) y Endoproteinasa Glu-C (origen: Staphylococcus aureus V8) del sobrenadante. Posteriormente se llevó a cabo un análisis por cromatografía líquida de fase inversa y detección por espectrometría de masas (RP-HPLC-MS, por sus siglas en inglés).
Se prepararon estándares de calibración del conjugado de PTH(1-34) en heparina en blanco o plasma EDTA en rangos de concentración de 1 a 1000 ng/mL eq. de PTH(1-34) (dilución con plasma de rata) y de 1 a 1000 ng/mL eq. de PTH( 1­ 34) (dilución con plasma de mono).
Estas soluciones se utilizaron para la generación de una curva de calibración. Para el control de calidad, se prepararon consecuentemente tres muestras independientes de las soluciones estándar de calibración. Concentraciones en el extremo inferior (3-5 veces la concentración del LLOQ respectivo), el rango medio (0,05-0,1 veces la concentración del ULOQ respectivo) y el extremo superior (0,5-0,8 veces la concentración del ULOQ respectivo).
Los volúmenes de preparación de la muestra se pueden modificar en función la respuesta de la señal objetivo después de la preparación de la muestra. El procedimiento de procesamiento de la precipitación de proteínas se describe en la presente para el análisis de muestras de plasma originadas en especies de ratas. La precipitación de proteínas se llevó a cabo primero mediante la adición de 100 pL de solución estándar interna (625 ng/mL de conjugado deuterado) y posteriormente mediante la adición de 400 pL de acetonitrilo a 50 pL de la muestra de plasma. Se transfirieron 2 veces 150 pL del sobrenadante a una nueva placa de pozos y se evaporaron hasta sequedad (bajo una corriente suave de nitrógeno a 50 °C). Se utilizaron 50 pL de disolvente de reconstitución (amortiguador 50 mM Tris 0,5 mM CaCl2, ajustado a pH 8,0) para disolver el residuo. La digestión proteolítica se llevó a cabo como se indica a continuación:
Se disolvieron 20 pg de Lys-C (número de pedido 125-05061, Wako Chemicals GmbH, Neuss, Alemania) en 80 pL de ácido acético 10 mM. Se añadieron 3 pL de la solución Lys-C a cada cavidad y las muestras se incubaron durante 15 horas a 37 °C. Posteriormente, se disolvieron 10 pg de Glu-C (número de pedido V1651, Promega GmbH, Mannheim, Alemania) en 25 pL de agua, se añadieron 1,5 pL de la solución de Glu-C a cada cavidad y se continuó la incubación durante 1,5 horas a 37 °C. Después de la incubación, las muestras se acidificaron con 2 pL de agua/ácido fórmico 4:6 (v/v) y se inyectaron 10 pL en el sistema UPLC-MS.
La cromatografía se realizó en una columna analítica Waters Acquity BEH300 C18 (tamaño de partícula de 1,7 pm; dimensiones de la columna 50 x 2,1 mm). Se utilizó agua (grado u P l C ) que contenía 0,1% de ácido fórmico (v/v) como fase móvil A y acetonitrilo (grado UPLC) con 0,1% de ácido fórmico como fase móvil B.
El análisis de masas se realizó en un sistema AB Sciex 6500+ QT rap en modo de monitoreo de reacción múltiple (MRM), monitoreando la transición m/z 352,0 a 462,1 (péptido característico IQLMHNLGK), 355,4 a 467,1 (péptido característico IQLMHNLGK, estándar interno), 436,9 a 631,4 (péptido característico LQDVHNF), y 441,9 a 631,4 (péptido característico LQDVHNF, estándar interno).
Cuantificación de las concentraciones de PEG en plasma:
Las concentraciones de PEG total en plasma se determinaron mediante la cuantificación de la parte polimérica de los conjugados de PTH(1-34) después de la precipitación de la proteína plasmática y la digestión enzimática del sobrenadante. A continuación, se realizaron análisis por cromatografía de exclusión por tamaño y detección por espectrometría de masas (SEC-MS, por sus siglas en inglés).
Se prepararon estándares de calibración del conjugado de PTH(1-34) en plasma de mono en blanco heparinizado en rangos de concentración de 50 a 4500 ng/mL de equivalentes de PEG.
Estas soluciones se utilizaron para la generación de una curva de calibración cuadrática. Las curvas de calibración se pesaron 1/x. Para el control de calidad, se prepararon consecuentemente tres muestras independientes de las soluciones estándar de calibración. Concentraciones en el extremo inferior (2-4 veces la concentración del LLOQ), el rango medio (0,1-0,2 veces la concentración del ULOQ) y el extremo superior (0,8 veces la concentración del ULOQ). La precipitación de proteínas se llevó a cabo mediante la adición de 200 pL de metanol preenfriado (5-10 °C) a 100 pL de la muestra de plasma. Se transfirieron 180 pL del sobrenadante a una nueva placa de pozos y se evaporaron hasta sequedad (bajo una corriente suave de nitrógeno a 45 °C). Se utilizaron 50 pL de disolvente de reconstitución (amortiguador 50 mM Tris 0,5 mM CaCl2, ajustado a pH 8,0) para disolver el residuo. La digestión proteolítica se llevó a cabo como se indica a continuación: Se disolvieron 20 pg de Lys-C (número de pedido 125-05061, Wako Chemicals GmbH, Neuss, Alemania) en 80 pL de ácido acético 10 mM. Se añadieron 3 pL de la solución Lys-C a cada cavidad y las muestras se incubaron durante 15 horas a 37 °C. Posteriormente, se disolvieron 10 pg de Glu-C (número de pedido V1651, Promega GmbH, Mannheim, Alemania) en 25 j L de agua, se añadieron 1,5 |jL de la solución de Glu-C a cada cavidad y se continuó la incubación durante 1,5 horas a 37 °C. Después de la incubación, las muestras se acidificaron con 2 j L de agua/ácido fórmico 4:6 (v/v) y se inyectaron 5 mL en el sistema SEC-MS.
El análisis SEC-MS se llevó a cabo utilizando un Agilent 1290 UPLC acoplado a un espectrómetro de masas Agilent 6460 TripleQuad a través de una sonda ESI. La adquisición de un ion precursor distinto del polímero se logró aplicando fragmentación en la fuente de alto voltaje (200-300 V) en la interfaz MS. La cromatografía se realizó en una columna analítica TOSOH TSK Gel SuperAW3000 (tamaño de partícula de 4,0 jm ; dimensiones de la columna 150 x 6,0 mm) a un caudal de 0,50 mL/min (T = 65 °C). Se utilizó agua (grado UPLC) que contenía 0,1% de ácido fórmico (v/v) como fase móvil A y acetonitrilo (grado UPLC) con 0,1% de ácido fórmico como fase móvil B. La configuración cromatográfica para el análisis de muestras comprende una elución isocrática de 50% B durante 8 minutos.
El análisis de masas se realizó en modo de monitoreo de reacción única (SRM), monitoreando la transición m/z 133,1 a 45,1.
Cuantificación de las concentraciones de PTH libre en plasma:
Las concentraciones de PTH libre en plasma acidificado se determinaron como la suma del péptido de PTH (1 -34) y el péptido de PTH (1-33) después de la precipitación de proteínas en plasma, seguido de extracción en fase sólida. Posteriormente, se realizó el análisis mediante separación por cromatografía líquida y detección por espectrometría de masas (LC-MS).
Se prepararon estándares de calibración de PTH(1-34) y PTH(1-33) en plasma de rata con EDTA acidificado en blanco en concentraciones en el rango de 5,00 a 500 pg/mL en plasma acidificado para cada analito. El rango de concentración correspondiente es de 7,00 a 700 pg/mL para ambos analitos en plasma puro, ya que el plasma se acidifica como relación de volumen de plasma: amortiguador de citrato 0,5 M pH 4 = 1: 0.4 v/v.
Se utilizaron soluciones estándar para la generación de una curva de calibración. Para el control de calidad, se prepararon tres muestras independientes de las soluciones estándar de calibración a 15,0, 150 y 400 pg/mL en plasma acidificado.
La precipitación de proteínas se llevó a cabo mediante la adición de 150 j L de acetonitrilo frío a 150 j L de la muestra de plasma después de la adición de 50,0 j L de solución estándar interna fría, seguido de centrifugación. El sobrenadante se decantó en un tubo de polipropileno nuevo y se añadieron 900 j L de agua fría. Después de otro paso de centrifugación, los tubos se mantuvieron en agua con hielo hasta que se cargaron en la columna s Pe .
Extracción en fase sólida: las columnas de elución de HLB j se acondicionaron con 200 j L de metanol seguido de 200 j L de agua. Las columnas se cargaron 3 veces con 420 j L de las muestras diluidas aplicando presión positiva. Las columnas SPE se lavaron con 200 j L de metanol:agua 5:95 v/v. Las muestras se eluyeron con 40,0 j L de disolvente de elución SPE (aceonitrilo:agua:ácido trifluoroáctico 60:40:1 v/v/v), seguido de 40,0 j L de agua. El disolvente de elución se dejó reposar sobre las columnas durante 2 minutos, después de lo cual se aplicó una presión muy suave para la elución.
La separación entre los metabolitos y los compuestos endógenos que interfieren se logró mediante LC-MS utilizando una columna Xselect CSH C18 (2,1 x 100 mm, 2,5 jm ) a 50 °C, y usando ácido fórmico al 0,2% y sulfóxido de dimetilo al 0,5% en agua como fase móvil A, sulfóxido de dimetilo al 0,5% en acetonitrilo:metanol (75:25, v/v) como fase móvil B, y operando a un gradiente con un caudal de 0,500 mL/min.
Se usó un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo 6500 equipado con una fuente de pulverización de iones turbo para la detección en modo de iones positivos. Para PTH(1-34), pTh (1-33) y PTH(1-33) (Leu-d10)3, la cuantificación se realizó contando 5 veces la misma transición SRM.
La cuantificación se basa en el monitoreo de reacción múltiple (MRM) de las transiciones de m/z: 687,3-787,3 para PTH(1-34)
662.8- 757,9 para PTH(1-33)
692,3-793,3 para PTH(1-34) (Leu-d10)a
667.8- 763,9 para PTH(1-33) (Leu-d10)a
Se utilizó una curva de calibración lineal con un factor de ponderación de 1/x2 para ambos analitos.
Las concentraciones de PTH libre se determinaron en plasma acidificado, como medio para estabilizar los analitos. El plasma acidificado se preparó diluyendo plasma de rata con EDTA 1,4 veces (en el caso de muestras en blanco, cero, de calibración y de control de calidad) o sangre entera de rata (en el caso de muestras de estudio) 1,2 veces. Suponiendo que aproximadamente el 50% (v/v) de la sangre entera sea plasma, las concentraciones plasmáticas puras son aproximadamente 1,4 veces más altas que las concentraciones notificadas en plasma acidificado. Las concentraciones de PTH libre se calculan como la suma de PTH libre (1-34) y PTH libre (1-33) en equivalentes de PTH (1-34).
Debido a la naturaleza reversible de la unión de -L1- a -D, las mediciones de la actividad del receptor de PTH se realizaron utilizando análogos estables de los profármacos de PTH de la presente invención, es decir, se fabricaron utilizando estructuras similares a las de los profármacos de PTH de la presente invención que, en lugar de una unión reversible de -Z a -D, tienen una unión estable.
Esto era necesario debido a que los profármacos de PTH de la presente invención liberarían PTH en el transcurso del experimento y dicha PTH liberada habría influido en el resultado.
Ejemplo 1
Síntesis del reactivo enlazador 1f
El reactivo enlazador 1f se sintetizó de acuerdo con el siguiente esquema:
Figure imgf000032_0001
A una solución de N-metil-N-Boc-etilendiamina (2 g, 11,48 mmol) y NaCNBH3 (819 mg, 12,63 mmol) en MeOH (20 mL) se le añadió 2,4,6-trimetoxibenzaldehído (2,08 g, 10,61 mmol) en porciones. La mezcla se agitó a TA durante 90 min, se acidificó con HCl 3 M (4 mL) y se agitó por oscilación 15 min más. La mezcla de reacción se añadió a una solución saturada de NaHCO3 (200 mL) y se extrajo 5 x con DCM. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y los disolventes se evaporaron al vacío. La N-metil-N-Boc-N'-Tmobetilendiamina 1a resultante se secó a alto vacío y se usó en el siguiente paso de reacción sin purificación adicional.
Rendimiento: 3,76 g (11,48 mmol, 89% de pureza, 1a: producto protegido con Tmob doble = 8:1)
MS: m/z 355,22 = [M+H]+, (masa monoisotópica calculada = 354,21).
A una solución de 1a (2 g, 5,65 mmol) en DCM (24 mL) COMU (4,84 g, 11,3 mmol), se le añadieron N-Fmoc-N-MeAsp(OBn)-OH (2,08 g, 4,52 mmol) y 2,4,6-colidina (2,65 mL, 20,34 mmol). La mezcla de reacción se agitó por oscilación durante 3 h a TA, se diluyó con d Cm (250 mL) y se lavó 3 x con H2SO40,1 M (100 mL) y 3 x con salmuera (100 mL). Las fases acuosas se volvieron a extraer con DCM (100 mL). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el residuo se concentró a un volumen de 24 mL. 1b se purificó mediante cromatografía flash.
Rendimiento: 5,31 g (148%, 6,66 mmol)
MS: m/z 796,38 = [M+H]+, (masa monoisotópica calculada = 795,37).
A una solución de 1b (5,31 g, máx. 4,52 mmol ref. a N-Fmoc-N-Me-Asp(OBn)-OH) en THF (60 ml) se le añadió DBU (1,8 ml, 3 % v/v). La solución se agitó por oscilación durante 12 min a TA, se diluyó con DCM (400 mL) y se lavó 3 veces con H2SO40,1 M (150 mL) y 3 veces con salmuera (150 mL). Las fases acuosas se volvieron a extraer con DCM (100 mL). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se filtraron. 1c se aisló tras la evaporación del disolvente y se usó en la siguiente reacción sin purificación adicional.
MS: m/z 574,31 = [M+H]+, (masa monoisotópica calculada = 573,30).
1c (5,31 g, 4,52 mmol, crudo) se disolvió en acetonitrilo (26 mL) y COMU (3,87 g, 9,04 mmol), se le añadieron ácido 6-tritilmercaptohexanoico (2,12 g, 5,42 mmol) y 2,4,6-colidina (2,35 mL, 18,08 mmol). La mezcla de reacción se agitó por oscilación durante 4 h a TA, se diluyó con DCM (400 mL) y se lavó 3 x con H2SO40,1 M (100 mL) y 3 x con salmuera (100 mL). Las fases acuosas se volvieron a extraer con DCM (100 mL). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se aisló 1d tras evaporar el disolvente. El producto 1d se purificó mediante cromatografía flash.
Rendimiento: 2,63 g (62%, 94% de pureza)
MS: m/z 856,41 = [M+H]+, (masa monoisotópica calculada = 855,41).
A una solución de 1d (2,63 g, 2,78 mmol) en i-PrOH (33 mL) y H2O (11 mL) se le añadió LiOH (267 mg, 11,12 mmol) y la mezcla de reacción se agitó por oscilación durante 70 min a TA. La mezcla se diluyó con DCM (200 mL) y se lavó 3 x con H2SO40,1 M (50 mL) y 3 veces con salmuera (50 mL). Las fases acuosas se volvieron a extraer con DCM (100 mL). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se aisló 1 e tras evaporar el disolvente. 1 e se purificó mediante cromatografía flash.
Rendimiento: 2,1 g (88%)
MS: m/z 878,4 = [M+Na]+, (masa monoisotópica calculada = 837,40).
A una solución de 1e (170 mg, 0,198 mmol) en DCM anhidro (4 mL) se le añadieron DCC (123 mg, 0,59 mmol) y una cantidad catalítica de DMAP. Después de 5 min, se añadió N-hidroxi-succinimida (114 mg, 0,99 mmol) y la mezcla de reacción se agitó por oscilación a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla de reacción se filtró, el disolvente se eliminó al vacío y el residuo se recolectó en 90% de acetonitrilo más 0,1% de TFA (3,4 mL). La mezcla bruta se purificó mediante RP-HPLC. Las fracciones del producto se neutralizaron con amortiguador de fosfato 0,5 M pH 7,4 y se concentraron. La fase acuosa restante se extrajo con DCM y 1f se aisló tras la evaporación del disolvente.
Rendimiento: 154 mg (81%)
MS: m/z 953,4 = [M+H]+, (masa monoisotópica calculada = 952,43).
Ejemplo 2
Síntesis del reactivo enlazador 2g
Figure imgf000034_0001
Se disolvió cloruro de 4-metoxitrifenilmetilo (3,00 g, 9,71 mmol) en DCM (20 mL) y se añadió gota a gota con agitación por oscilación a una solución de etilendiamina 2a (6,5 mL, 97,3 mmol) en DCM (20 mL). La mezcla de reacción se agitó por oscilación durante 2 h a TA, después de lo cual se diluyó con éter dietílico (300 mL), se lavó 3 x con salmuera/NaOH 0,1 M 30/1 (v/v) y una vez con salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y 2b se aisló tras la evaporación del disolvente.
Rendimiento: 3,18 g (98%)
El intermedio 2b protegido con Mmt (3,18 g, 9,56 mmol) se disolvió en DCM (30 mL). Se añadieron ácido 6-(tritiltio)-hexanoico (4,48 g, 11,5 mmol), PyBOP (5,67 g, 10,9 mmol) y DIPEA (5,0 mL, 28,6 mmol) y la mezcla se agitó por oscilación durante 30 min a TA. La solución se diluyó con éter dietílico (250 mL), se lavó 3 x con salmuera/NaOH 0,1 M 30/1 (v/v) y una vez con salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y el disolvente se eliminó al vacío. 2c se purificó mediante cromatografía flash.
Rendimiento: 5,69 g (85%)
MS: m/z 705,4 = [M+H]+, (masa monoisotópica calculada = 704,34)
El compuesto 2c (3,19 g, 4,53 mmol) se disolvió en THF anhidro (50 mL), se le añadió solución de BH3 THF 1 M en THF (8,5 mL, 8,5 mmol) y la mezcla se agitó por oscilación durante 16 h a TA. Se añadió más solución de BH3 THF 1 M en THF (14 mL, 14,0 mmol) y la mezcla se agitó por oscilación durante 16 h más a TA. Se añadieron metanol (8,5 mL) y N,N'-dimetil-etilendiamina (3,00 mL, 27,9 mmol) y la mezcla se calentó a reflujo durante 3 h. La mezcla se dejó enfriar y se le añadió acetato de etilo (300 mL). La solución se lavó 2 veces con Na2CO3 acuoso y 2 veces con NaHCO3 acuoso. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y el disolvente se eliminó al vacío para obtener 2d.
Rendimiento: 3,22 g (103%)
MS: m/z 691,4 = [M+H]+, (masa monoisotópica calculada = 690,36)
Dicarbonato de di-terc-butilo (2,32 g, 10,6 mmol) y DIPEA (3,09 mL, 17,7 mmol) se disolvieron en DCM (5 mL) y se añadieron a una solución de 2d (2,45 g, 3,55 mmol) en DCM (5 mL). La mezcla se agitó por oscilación durante 30 min a TA. La solución se concentró al vacío y se purificó mediante cromatografía flash para obtener el producto 2e.
Rendimiento: 2,09 g (74%)
MS: m/z 791,4 = [M+H]+, (masa monoisotópica calculada = 790,42)
El compuesto 2e (5,01 g, 6,34 mmol) se disolvió en acetonitrilo (80 mL). Se añadió HCl acuoso 0,4 M (80 mL) seguido de acetonitrilo (20 mL) y la mezcla se agitó por oscilación durante 1 h a TA. El pH se ajustó a pH 5,5 mediante la adición de NaOH 5 M acuoso. El disolvente orgánico se eliminó al vacío y la solución acuosa restante se extrajo 4 x con DCM. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y el disolvente se eliminó al vacío para obtener el producto 2f.
Rendimiento: 4,77 g (95%)
MS: m/z 519,3 = [M+H]+, (masa monoisotópica calculada = 518,30)
El compuesto 2f (5,27 g, 6,65 mmol) se disolvió en DCM (30 mL) y se añadió a una solución de cloroformiato de pnitrofenilo (2,01 g, 9,98 mmol) en Dc M (25 mL). Se añadió 2,4,6-trimetilpiridina (4,38 mL, 33,3 mmol) y la solución se agitó por oscilación durante 45 min a TA. La solución se concentró al vacío y se purificó mediante cromatografía flash para obtener el producto 2g.
Rendimiento: 4,04 g (89%)
MS: m/z 706,32 = [M+Na]+, (masa monoisotópica calculada = 683,30).
Ejemplo 3
Síntesis del conjugado 3 de S1 PTH(1-34) permanente
Figure imgf000035_0001
La PTH(1-34) protegida con cadena lateral sobre resina TCP que tiene el extremo N-terminal protegido con Fmoc se desprotegió con Fmoc de acuerdo con el procedimiento que se proporciona en Materiales y métodos. Se añadió una solución de ácido 6-tritilmercaptohexanoico (62,5 mg, 160 pmol), PyBOP (80,1 mg, 154 pmol) y DIPEA (53 pL, 306 mmol) en DMF (2 mL) a 0,21 g (51 pmol) de la resina. La suspensión se agitó durante 80 min a TA. La resina se lavó 10 x con DMF, 10 x con DCM y se secó al vacío. La escisión del péptido de la resina y la eliminación de los grupos protectores se consiguió añadiendo 10 mL de cóctel de escisión 100/3/3/2/1 (v/p/v/v/v) TFA/DTT/TES/agua/tioanisol y agitando la suspensión durante 1 h a TA. El producto sin tratar 3 se precipitó en éter dietílico enfriado previamente (-18 °C). El precipitado se disolvió en ACN/agua y se purificó mediante RP-HPLC. Las fracciones del producto se liofilizaron.
Rendimiento: 36 mg (14%), 3*8 TFA
MS: m/z 1062,31 = [M+4H]4+, (masa monoisotópica calculada para [M+4H]4+ = 1062,30).
Ejemplo 4
Síntesis del conjugado 4 de K26 PTH(1-34) permanente
Figure imgf000036_0001
La PTH(1-34) protegida con cadena lateral sobre resina TCP que tiene el extremo N-terminal protegido con Boc y cadena lateral de Lys26 protegida con ivDde se desprotegió con ivDde de acuerdo con el procedimiento descrito en Materiales y métodos. Se añadió una solución de ácido 6-tritilmercaptohexanoico (107 mg, 273 pmol), PyBOP (141 mg, 273 pmol) y DIPEA (95 mL, 545 pmol) en DMF (3 mL) a 0,80 g (90,9 pmol) de la resina. La suspensión se agitó durante 1 h a TA. La resina se lavó 10 x con DMF, 10 x con DCM y se secó al vacío. La escisión del péptido de la resina y la eliminación de los grupos protectores se consiguió añadiendo 6 mL de cóctel de escisión 100/3/3/2/1 (v/p/v/v/v) TFA/DTT/TES/agua/tioanisol y agitando la suspensión durante 1 h a TA. El producto sin tratar 4 se precipitó en éter dietílico enfriado previamente (-18 °C). El precipitado se disolvió en ACN/agua y se purificó mediante RP-HPLC. Las fracciones del producto se liofilizaron. Rendimiento: 40 mg (8%), 4*8 TFA
MS: m/z 1062,30 = [M+4H]4+, (masa monoisotópica calculada para [M+4H]4+ = 1062,30).
Ejemplo 5
Síntesis del conjugado de S1 PTH(1-34) transitorio
Figure imgf000036_0002
La PTH(1-34) protegida con cadena lateral sobre resina TCP que tiene el extremo N-terminal protegido con Fmoc se desprotegió con Fmoc de acuerdo con el procedimiento que se proporciona en Materiales y métodos. Se añadió una solución de Fmoc-Aib-OH (79 mg, 244 pmol), PyBOP (127 mg, 244 pmol) y DIPEA (64 pL, 365 pmol) en DMF (1,5 mL) a 0,60 g (61 pmol) de la resina. La suspensión se agitó durante 16 h a t A. La resina se lavó 10 veces con DMF y se desprotegió con Fmoc como se describió anteriormente. Se añadió a la resina una solución de 2g (167 mg, 244 pmol) y DIPEA (64 pL, 365 pmol) en DMF (1,5 mL). La suspensión se agitó durante 24 h a TA. La resina se lavó 10 x con DMF, 10 x con DCM y se secó al vacío. La escisión del péptido de la resina y la eliminación de los grupos protectores se consiguió añadiendo 7 mL de cóctel de escisión 100/3/3/2/1 (v/p/v/v/v) TFA/DTT/TES/agua/tioanisol y agitando la suspensión durante 1 h a TA. El producto sin tratar 5 se precipitó en éter dietílico enfriado previamente (-18 °C). El precipitado se disolvió en ACN/agua y se purificó mediante RP-HPLC. Las fracciones del producto se liofilizaron.
Rendimiento: 78 mg (24%), 5*9 TFA
MS: m/z 1101,59 = [M+4H]4+, (masa monoisotópica calculada para [M+4H]4+ = 1101,57).
Ejemplo 6
Síntesis del conjugado 6 de S1 PTH(1-34) transitorio
Figure imgf000036_0003
La PTH(1-34) protegida con cadena lateral sobre resina TCP que tiene el extremo N-terminal protegido con Fmoc se desprotegió con Fmoc de acuerdo con el procedimiento que se proporciona en Materiales y métodos. Se añadió una solución de Fmoc-Ala-OH (32 mg, 102 pmol), PyBOP (53 mg, 102 pmol) y DIPEA (27 pL, 152 pmol) en DMF (3 mL) a 0,25 g (25 pmol) de la resina. La suspensión se agitó durante 1 h a Ta . La resina se lavó 10 x con DMF, 10 x con DCM y se secó al vacío. La desprotección con Fmoc se llevó a cabo como se describió anteriormente. Se añadió a la resina una solución de 2g (69 mg, 102 pmol) y DIPEA (27 pL, 152 pmol) en DMF (3 mL). La suspensión se agitó durante 1.5 h a TA. La resina se lavó 10 x con DMF, 10 x con DCM y se secó al vacío. La escisión del péptido de la resina y la eliminación de los grupos protectores se consiguió añadiendo 3 mL de cóctel de escisión 100/3/3/2/1 (v/p/v/v/v) TFA/DTT/TES/agua/tioanisol y agitando la suspensión durante 1 h a TA. El producto sin tratar 6 se precipitó en éter dietílico enfriado previamente (-18 °C). El precipitado se disolvió en ACN/agua y se purificó mediante RP-HPLC. Las fracciones del producto se liofilizaron.
Rendimiento: 25 mg (18%), 6*9 TFA
MS: m/z 1098,75 = [M+4H]4+, (masa monoisotópica calculada para [M+4H]4+ = 1098,07).
Ejemplo 7
Síntesis del conjugado 7 de S1 PTH(1-34) transitorio
Figure imgf000037_0001
La PTH(1-34) protegida con cadena lateral sobre resina TCP que tiene el extremo N-terminal protegido con Fmoc se desprotegió con Fmoc de acuerdo con el procedimiento que se proporciona en Materiales y métodos. Se añadió una solución de Fmoc-Ser(Trt)-OH (117 mg, 205 pmol), PyBOP (108 mg, 207 pmol) y DIPEA (53 pL, 305 pmol) en DMF (2 mL) a 0,50 g (51 pmol) de la resina. La suspensión se agitó durante 1 h a TA. La resina se lavó 10 x con DMF, 10 x con DCM y se secó al vacío. La desprotección con Fmoc se llevó a cabo como se describió anteriormente. Se añadió a la resina una solución de 2g (144 mg, 211 pmol) y DIPEA (53 pL, 305 pmol) en DMF (1,8 mL). La suspensión se agitó durante 7 h a TA. La resina se lavó 10 x con DMF, 10 x con d Cm y se secó al vacío. La escisión del péptido de la resina y la eliminación de los grupos protectores se consiguió añadiendo 6 mL de cóctel de escisión 100/3/3/2/1 (v/p/v/v/v) TFA/DTT/TES/agua/tioanisol y agitando la suspensión durante 1 h a TA. El producto sin tratar 7 se precipitó en éter dietílico enfriado previamente (-18 °C). El precipitado se disolvió en ACN/agua y se purificó mediante RP-HPLC. Las fracciones del producto se liofilizaron.
Rendimiento: 54 mg (20%), 7*9 TFA
MS: m/z 1102,08 = [M+4H]4+, (masa monoisotópica calculada para [M+4H]4+ = 1102,07).
Ejemplo 8
Síntesis del conjugado 8 de S1 PTH(1-34) transitorio
Figure imgf000037_0002
La PTH(1-34) protegida con cadena lateral sobre resina TCP que tiene el extremo N-terminal protegido con Fmoc se desprotegió con Fmoc de acuerdo con el procedimiento que se proporciona en Materiales y métodos. Se añadió una solución de Fmoc-Leu-OH (36 mg, 102 pmol), PyBOP (53 mg, 102 pmol) y DIPEA (27 pL, 152 pmol) en DMF (3 mL) a 0,25 g (25 pmol) de la resina. La suspensión se agitó durante 1 h a TA. La resina se lavó 10 x con DMF, 10 x con DCM y se secó al vacío. La desprotección con Fmoc se llevó a cabo como se describió anteriormente. Se añadió a la resina una solución de 2g (69 mg, 102 jm ol) y DIPEA (27 |j L, 152 jmol) en DMF (3 mL). La suspensión se agitó durante 1.5 h a TA. La resina se lavó 10 x con DMF, 10 x con DCM y se secó al vacío. La escisión del péptido de la resina y la eliminación de los grupos protectores se consiguió añadiendo 3 mL de cóctel de escisión 100/3/3/2/1 (v/p/v/v/v) TFA/DTT/TES/agua/tioanisol y agitando la suspensión durante 1 h a TA. El producto sin tratar 8 se precipitó en éter dietílico enfriado previamente (-18 °C). El precipitado se disolvió en ACN/agua y se purificó mediante RP-HPLC. Las fracciones del producto se liofilizaron.
Rendimiento: 31 mg (22%), 8*9 TFA
MS: m/z 1109,32 = [M+4H]4+, (masa monoisotópica calculada para [M+4H]4+ = 1108,58).
Ejemplo 9
Síntesis del conjugado 9 de S1 PTH(1-34) transitorio
Figure imgf000038_0001
La PTH(1-34) protegida con cadena lateral sobre resina TCP que tiene el extremo N-terminal protegido con Fmoc se desprotegió con Fmoc de acuerdo con el procedimiento que se proporciona en Materiales y métodos. Se añadió una solución de 1e (182 mg, 213 jmol), PyBOP (111 mg, 213 jm ol) y DIPEA (93 j L, 532 jm ol) en DMF (5 mL) a 2,00 g (107 jm ol) de la resina. La suspensión se agitó durante 16 h a TA. La resina se lavó 10 x con DMF, 10 x con DCM y se secó al vacío. La escisión del péptido de la resina y la eliminación de los grupos protectores se consiguió añadiendo 20 mL de cóctel de escisión 100/3/3/2/1 (v/p/v/v/v) TFA/DTT/TES/agua/tioanisol y agitando la suspensión durante 1 h a TA. El producto sin tratar 9 se precipitó en éter dietílico enfriado previamente (-18 °C). El precipitado se disolvió en ACN/agua y se purificó mediante RP-HPLC. Las fracciones del producto se liofilizaron.
Rendimiento: 47 mg (8%), 9*9 TFA
MS: m/z 1108,58 = [M+4H]4+, (masa monoisotópica calculada para [M+4H]4+ = 1108,57).
Ejemplo 10
Síntesis del conjugado 10 de K26 PTH(1-34) transitorio
Figure imgf000039_0001
La PTH(1-34) protegida con cadena lateral sobre resina TCP que tiene el extremo N-terminal protegido con Boc y cadena lateral de Lys26 protegida con ivDde se desprotegió con ivDde de acuerdo con el procedimiento descrito en Materiales y métodos. Se añadió una solución de 1f (867 mg, 910 pmol) y DIPEA (0,24 mL, 1,36 mmol) en DMF (5 mL) a 1,91 g (227 pmol) de la resina. La suspensión se agitó durante 1 h a TA. La resina se lavó 10 x con DMF, 10 x con DCM y se secó al vacío. La escisión del péptido de la resina y la eliminación de los grupos protectores se consiguió añadiendo 20 mL de cóctel de escisión 100/3/3/2/1 (v/p/v/v/v) TFA/DTT/TES/agua/tioanisol y agitando la suspensión durante 1 h a TA. El producto sin tratar 10 se precipitó en éter dietílico enfriado previamente (-18 °C). El precipitado se disolvió en ACN/agua y se purificó mediante RP-HPLc . Las fracciones del producto se liofilizaron.
Rendimiento: 92 mg (7%), 10*9 TFA
MS: m/z 1108,58 = [M+4H]4+, (masa monoisotópica calculada para [M+4H]4+ = 1108,57).
Ejemplo 11
Síntesis del conjugado 11b de S1 PEG transitorio de bajo peso molecular
Figure imgf000039_0002
Figure imgf000040_0001
Se añadieron 0,15 mL de amortiguador de NaH2PO40,5 M (pH 7,4) a 0,5 mL de una solución de 20 mg/mL de tiol 5 (10 mg, 1,84 pmol) en acetonitrilo/agua 1/1 (v/v) que contenía 0,1% de TFA (v/v). La solución se incubó a TA durante 10 min, después de lo cual se añadieron 238 pL de una solución de 10 mg/mL de maleimida 11a (2,4 mg, 2,21 pmol) en 1/1 (v/v) de acetonitrilo/agua que contenía 0,1% de TFA (v/v). La solución se incubó durante 20 min a TA. Se añadieron 10 pL de TFA y la mezcla se purificó mediante RP-HPLC. Las fracciones del producto se liofilizaron para obtener 11 b.
Rendimiento: 3,1 mg (26%), 11 b*9 TFA
MS: m/z 1097,00 = [M+4h ]4+, (masa monoisotópica calculada para [M+5H]5+ = 1096,99).
Ejemplo 12
Síntesis del conjugado 12 de S1 PEG transitorio de bajo peso molecular
Figure imgf000041_0001
El conjugado 12 se sintetizó como se describió para 11b utilizando tiol 6 (10 mg, 1,85 pmol) y maleimida 11a (2,4 mg, 2,21 pmol).
Rendimiento: 10 mg (83%), 12*9 TFA
MS: m/z 1094,20 = [M+4H]4+, (masa monoisotópica calculada para [M+4H]4+ = 1094,19).
Ejemplo 13
Síntesis del conjugado 13 de S1 PEG transitorio de bajo peso molecular
Figure imgf000041_0002
El conjugado 13 se sintetizó como se describió para 11b utilizando tiol 7 (10 mg, 1,84 pmol) y maleimida 11a (2,4 mg, 2,21 pmol).
Rendimiento: 8 mg (67%), 13*9 TFA
MS: m/z 1097,40 = [M+5H]5+, (masa monoisotópica calculada para [M+5H]5+ = 1097,39).
Ejemplo 14
Síntesis del conjugado 14 de S1 PEG transitorio de bajo peso molecular
Figure imgf000042_0001
El conjugado 14 se sintetizó como se describió para 11b utilizando tiol 8 (10 mg, 1,83 pmol) y maleimida 11a (2,4 mg, 2,21 pmol).
Rendimiento: 4 mg (33%), 14*9 TFA
MS: m/z 1378,01 = [M+4H]4+, (masa monoisotópica calculada para [M+4H]4+ = 1378,00).
Ejemplo 15
Síntesis del conjugado 15 de K26 PEG transitorio de bajo peso molecular
Figure imgf000042_0002
El conjugado 15 se sintetizó como se describió para 11b utilizando tiol 10 (5.2 mg, 0,95 pmol) y maleimida 11a (1,23 mg, 1,14 pmol).
Rendimiento: 2.1 mg (33%), 15*9 TFA
MS: m/z 1102,60 = [M+5h ]5+, (masa monoisotópica calculada para [M+5H]5+ = 1102,59).
Ejemplo 16
Síntesis del conjugado 16 de S1 PEG 2x20 kDa permanente
Figure imgf000043_0001
772 pL de una solución que contiene tiol 3 (19,4 mg/mL, 15 mg, 3,54 pmol) y se añadieron 2,5 mg/mL de Boc-L-Met en 1/1 (v/v) de acetonitrilo/agua con 0,1% de TFA (v/v) a 1,87 mL de una solución que contenía maleimida de PEG 2x20 kDa (Sunbright GL2-400MA, 187 mg, 4,32 pmol) y 2,5 mg/mL de Boc-L-Met en agua que contenía 0,1% de TFA (v/v). Se añadió amortiguador NaH2PO4 0,5 M (0,66 mL, pH 7,0) y la mezcla se agitó por oscilación durante 30 min a TA. Se añadieron 10 pL de una solución de 270 mg/mL de 2-mercaptoetanol en agua. La mezcla se agitó por oscilación durante 5 min a TA y se añadieron 0,33 mL de HCl 1 M. El conjugado 16 se purificó mediante IEX seguido de RP-HPLC usando un gradiente lineal del sistema disolvente A (agua que contenía 0,1 % de AcOH v/v) y sistema disolvente B (acetonitrilo que contiene 0,1% de AcOH v/v). Las fracciones que contenían producto se liofilizaron.
Rendimiento: 97 mg (2,01 mmol, 57%) conjugado 16*8 AcOH
Ejemplo 17
Síntesis del conjugado 17 de K26 PEG 2x20 kDa permanente
Figure imgf000043_0002
El conjugado 17 se preparó como se describió para 16 mediante la reacción de tiol 4 (15 mg, 3,53 pmol) y maleimida de PEG 2x20 kDa (Sunbright GL2-400MA, 187 mg, 4,32 pmol).
Rendimiento: 80 mg (1,79 pmol, 51%) conjugado 17*8 AcOH
Ejemplo 18
Síntesis del conjugado 18 de S1 PEG 2x20 kDa transitorio
Figure imgf000043_0003
El conjugado 18 se preparó como se describió para 16 mediante la reacción de tiol 5 (37 mg, 8,40 pmol) y maleimida de PEG 2x20 kDa (Sunbright GL2-400MA, 445 mg, 9,24 pmol). La reacción se extinguió mediante la adición de 50 pL de TFA sin adición previa de 2-mercaptoetanol. El conjugado 18 se purificó mediante IEX seguido de SEC para desalación. Las fracciones que contenían producto se liofilizaron.
Rendimiento: 161 mg (3,33 mmol, 40%) conjugado 18 *9 AcOH
Ejemplo 19
Síntesis del conjugado 19 de S1 PEG 2x20 kDa transitorio
Figure imgf000044_0001
El conjugado 19 se preparó como se describió para 16 mediante la reacción de tiol 7 (27 mg, 6,14 pmol) y maleimida de PEG 2x20 kDa (Sunbright GL2-400MA, 325 mg, 7,50 pmol).
Rendimiento: 249 mg (5,16 pmol, 84%) conjugado 19 *9 AcOH
Ejemplo 20
Síntesis del conjugado 20 de S1 PEG 2x20 kDa transitorio
Figure imgf000044_0002
El conjugado 20 se preparó como se describió para 16 mediante la reacción de tiol 9 (38 mg, 8,59 pmol) y maleimida de PEG 2x20 kDa (Sunbright GL2-400MA, 455 mg, 9,45 pmol). La reacción se extinguió mediante la adición de 50 pL de TFA sin adición previa de 2-mercaptoetanol. El conjugado 20 se purificó mediante IEX seguido de SEC para desalación. Las fracciones que contenían producto se liofilizaron.
Rendimiento: 194 mg (4,01 pmol, 47%) conjugado 20 *9 AcOH
Ejemplo 21
Síntesis del conjugado 21 de K26 PEG 2x20 kDa transitorio
Figure imgf000045_0001
El conjugado 21 se preparó como se describió para 16 mediante la reacción de tiol 10 (34 mg, 7,58 pmol) y maleimida de PEG 2x20 kDa (Sunbright GL2-400MA, 401 mg, 9,26 pmol).
Rendimiento: 256 mg (5,30 pmol, 70%) conjugado 21 *9 AcOH
Ejemplo 22
Ciné t i c a d e l i b e r a c i ón i n vitro d e c o n j u g a d o s t r a n s i t o r i o s d e P E G d e b a j o p e s o m o l e c u l a r
Los conjugados 11b, 12, 13, 14 y 15 se disolvieron en amortiguador de fosfato de pH 7,4 (NaH2PO460 mM, EDTA 3 mM, Tween-20 al 0,01%, ajustado a pH 7,4 con NaOH) que contenía 0,05 mg/mL de pentafluorofenol como estándar interno a una concentración de aproximadamente 1 mg de conjugado/mL. Las soluciones se esterilizaron mediante filtración y se incubaron a 37 °C. En los puntos de tiempo, se retiraron alícuotas y se analizaron mediante RP-HPLC y ESI-MS. La fracción de PTH liberada en un momento determinado se calculó a partir de la relación de las áreas de los picos UV de la PTH liberada y del conjugado de PEG. El % de PTH liberada se representó gráficamente frente al tiempo de incubación. Se aplicó un software de ajuste de curvas para calcular los correspondientes tiempos medios de liberación.
Resultados:
Se obtuvo un tiempo de vida media de liberación de 3,2 d para el conjugado 11 b.
Se obtuvo un tiempo de vida media de liberación de 8,7 d para el conjugado 12.
Se obtuvo un tiempo de vida media de liberación de 10,8 d para el conjugado 13.
Se obtuvo un tiempo de vida media de liberación de 25,3 d para el conjugado 14.
Se obtuvo un tiempo de vida media de liberación de 6,9 d para el conjugado 15.
E j e m p l o 23
C i n é t i c a d e l i b e r a c i ó n in vitro d e c o n j u g a d o s t r a n s i t o r i o s d e P E G 2 x 2 0 k D a
Los conjugados 18, 19, 20 y 21 se disolvieron en amortiguador de fosfato de pH 7,4 (NaH2PO460 mM, EDTA 3 mM, Tween-20 al 0,01%, ajustado a pH 7,4 con NaOH) que contenía 0,08 mg/mL de pentafluorofenol como estándar interno a una concentración de aproximadamente 5 mg de conjugado/mL. Las soluciones se esterilizaron mediante filtración y se incubaron a 37 °C. En los puntos de tiempo, se retiraron alícuotas y se analizaron mediante RP-HPLC. La fracción de PTH liberada en un momento determinado se calculó a partir de la relación de las áreas de los picos UV de la PTH liberada y del conjugado de PEG. El % de PTH liberada se representó gráficamente frente al tiempo de incubación. Se aplicó un software de ajuste de curvas para calcular los correspondientes tiempos medios de liberación.
Resultados:
Se obtuvo un tiempo de vida media de liberación de 2,8 d para el conjugado 18.
Se obtuvo un tiempo de vida media de liberación de 13,4 d para el conjugado 19.
Se obtuvo un tiempo de vida media de liberación de 1,3 d para el conjugado 20
Se obtuvo un tiempo de vida media de liberación de 7,1 d para el conjugado 21
Ejemplo 24
Actividad del receptor de PTH de los conjugados 16 y 17 de PEG 2x20 kDa permanentes en un ensayo basado en células
La actividad de PTH residual de los conjugados 16 y 17 permanentemente PEGilados se cuantificó midiendo la producción de cAMP de las células HEK293 que sobreexpresan el receptor de PTH/PTHrP1 (Hohenstein A, Hebell M, Zikry H, El Ghazaly M, Mueller F, Rohde, J. Development and validation of a novel cell-based assay for potency determination of human parathyroid hormone (PTH), Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis September 2014, 98: 345-350). Se utilizó PTH(1-34) del NIBSC (National Institute for Biological Standards and Control, Reino Unido) como el estándar de referencia.
Resultados:
Se encontró una actividad receptora del 0,12% en relación con la referencia de PTH(1-34) para el conjugado 16
Se encontró una actividad receptora del 0,11% en relación con la referencia de PTH(1-34) para el conjugado 17
Los resultados indican una disminución efectiva de la actividad del receptor en los conjugados 16 y 17 de PEG 2x20 kDa permanentes. Se puede concluir que los conjugados similares con PTH unida transitoriamente a Ser1 o Lys26 (como, por ejemplo, 18 y 21) son profármacos de PTH adecuados que proporcionan una actividad receptora residual baja. El análisis directo de conjugados transitorios en el ensayo celular no es posible debido a la escisión del enlazador en las condiciones del ensayo. La PTH liberada influiría en el resultado del ensayo.
Ejemplo 25
Estudio farmacocinético de conjugados 16 y 17 de PEG 2x20 kDa permanentes en ratas
Las ratas Wistar macho (6 semanas, 230-260 g) recibieron una sola administración intravenosa (2 grupos, n = 3 animales cada uno) o una sola administración subcutánea (2 grupos, n = 3 animales cada uno) de 16 o 17 en dosis de 29 pg/rata PTHeq y 31 mg/rata PTHeq, respectivamente. Se recolectaron muestras de sangre hasta 168 h después de la dosis y se generó plasma. Las concentraciones en plasma de PTH(1-34) se determinaron mediante la cuantificación del péptido característico N-terminal (secuencia: IQLMHNLGK) y el péptido característico C-terminal (secuencia: LQDVHNF) tras la digestión con LysC y GluC, tal y como se describe en Materiales y métodos.
Resultados: Las administraciones de dosis fueron bien toleradas sin signos visibles de malestar durante la administración y después de la administración. No se observaron reacciones en el sitio de administración en ningún momento a lo largo del estudio. Después de la inyección intravenosa de 16 y 17, se observó el tmáx de PTH(1-34) total a los 15 min (punto de tiempo más temprano analizado), seguido de una disminución lenta en el contenido de PTH(1-34) total con una vida media de aproximadamente 13 h y 11 h, respectivamente. Después de la inyección subcutánea, la concentración total de PTH(1-34) alcanzó su punto máximo en un tmáx de 24 h tanto para 16 como para 17, seguido de una disminución lenta en el contenido total de PTH(1-34) con tiempos de vida media de aproximadamente 1,5 días para ambos conjugados. La biodisponibilidad fue de aproximadamente 40% y 60%, respectivamente. Se obtuvieron curvas PK similares para el péptido característico N-terminal y C-terminal hasta 168 h después de la dosis, lo que indica la presencia de PTH(1-34) intacta en el conjugado.
La farmacocinética de larga duración favorable y la estabilidad de la PTH en los conjugados indican la idoneidad de los compuestos del modelo de PEG 2x20 kDa permanente como profármacos de PTH de liberación lenta después de la inyección subcutánea. Se puede concluir que los conjugados similares con PTH unida transitoriamente a Ser1 (como, por ejemplo, 18) o Lys26 son profármacos de PTH adecuados que proporcionan niveles duraderos de PTH bioactiva liberada.
Ejemplo 26
Estudio farmacocinético del conjugado 19 de S1 PEG 2x20 kDa transitorio en monos cynomolgus
Los monos cynomolgus macho sin haber sido sometidos a experimentación anterior (2-4 años, 3,7-5,4 kg) recibieron una sola administración subcutánea (n = 3 animales) de 19 a una dosis de 70 pg/kg PTHeq. Se recolectaron muestras de sangre hasta 504 h después de la dosis y se generó plasma. Las concentraciones totales en plasma de PTH(1-34) se determinaron mediante la cuantificación del péptido característico N-terminal (secuencia: IQLMHNLGK) y el péptido característico C-terminal (secuencia: LQDVHNF) tras la digestión con LysC y GluC, tal y como se describe en Materiales y métodos. Las concentraciones de PEG se determinaron usando el método descrito en Materiales y métodos.
Resultados: Las administraciones de dosis fueron bien toleradas sin signos visibles de incomodidad durante la administración. Un animal mostró signos visibles de incomodidad 72 h después de la dosis, pero se recuperó en los días posteriores. No se observaron reacciones en el sitio de administración en ningún momento a lo largo del estudio. La concentración total de PTH(1-34) alcanzó su pico en un tmáx de 24 h, seguido de una disminución lenta en el contenido total de PTH(1-34) con una vida media de aproximadamente 2,5 d para el péptido característico N-terminal y 0,9 d para el péptido característico C-terminal. La concentración de PEG alcanzó su pico en tmáx de 24 h, seguida de una disminución lenta en la concentración de PEG con una vida media de 3,5 d.
Se puede concluir que el conjugado 19 es un profármaco adecuado para el suministro sostenido de PTH.
Ejemplo 27
Estudio farmacocinético del conjugado 18 de S1 PEG 2x20 kDa transitorio en monos cynomolgus
Los monos cynomolgus sin haber sido sometidos a experimentación anterior (2-3 años, 2,5-4 kg) recibieron una administración subcutánea diaria (n = 2 animales - 1 macho/1 hembra) de 18 a niveles de dosis de 0,2, 0,5 y 1 pg/kg PTHeq durante 28 días. Se recolectaron muestras de sangre hasta 28 días (en los días 1, 13 y 27, las muestras se recolectaron antes de la dosis, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h y 24 h después de la dosis) y se generó plasma. Las concentraciones en plasma de PTH(1-34) se determinaron mediante la cuantificación del péptido característico N-terminal (secuencia: IQLMHNLGK) y el péptido característico C-terminal (secuencia: LQDVHNF) tras la digestión con LysC y GluC, tal y como se describe en Materiales y métodos.
Resultados: Todas las administraciones de dosis se realizaron sin incidentes. No se observaron reacciones en el sitio de administración en ningún momento a lo largo del estudio. Se observó linealidad de dosis en los tres grupos. Se observó acumulación de dosis desde el día 1 en comparación con el día 13 y el día 27. Las concentraciones totales de PTH(1-34) se cuantificaron mediante el péptido característico N-terminal (secuencia: IQLMHNLGK) en estado estacionario (durante el día 27).
Se observó una relación baja de pico a valle de PTH total (1-34) para todos los grupos de dosis por debajo de 3 después de la aplicación subcutánea diaria en estado estacionario en monos cynomolgus. Dado que las concentraciones de péptido libre en el estado estacionario se correlacionan con la concentración total de PTH(1-34), la relación pico a valle para el péptido libre está por debajo de 4 en monos cynomolgus.
Ejemplo 28
Estudio farmacocinético del conjugado 18 de S1 PEG 2x20 kDa transitorio en monos cynomolgus
Los monos cynomolgus sin haber sido sometidos a experimentación anterior (2-3,5 años, 2-5 kg) (3-5 machos/3-5 hembras) recibieron administraciones subcutáneas diarias de 18 a niveles de dosis de 0,2, 0,5 y 1,5 pg de PTH/kg. Se recolectaron muestras de sangre en el Día 1: antes de la dosis, 4 h, 8 h, 12 h, 18 h y 24 h después de la dosis, en el Día 8: antes de la dosis, en el Día 14: antes de la dosis, 8 h y 12 h, y en el Día 28: 3 h, 6 h, 8 h, 12 h, 18 h, 24 h, 72 h, 168 h y 336 h) y se generó plasma. Las concentraciones en plasma de PTH totales se determinaron mediante la cuantificación del péptido característico N-terminal (secuencia: IQLMHNLGK) tras la digestión con LysC y GluC, tal y como se presentó anteriormente en Materiales y métodos.
Resultados: La exposición sistémica expresada como Cmáx y AUC aumentó de forma aproximadamente proporcional a la dosis. La exposición sistémica de PTH total expresada como AUC se acumuló aproximadamente 3 veces desde el Día 1 hasta el Día 28.
Se observó una relación media baja de pico a valle de PTH total para todos los grupos de dosis de 1,5 después de la administración subcutánea diaria en monos cynomolgus en el Día 28 (estado estacionario observado desde el Día 8). Esta relación media baja de pico a valle de PTH total también se puede traducir a PTH libre.
Ejemplo 29
Estudio farmacocinético del conjugado 18 de S1 PEG 2x20 kDa transitorio en ratas Sprague-Dawley
Las ratas Sprague-Dawley Crl:CD(SD) (inicio de la dosificación a las 8 semanas de edad) recibieron administraciones subcutáneas diarias de 18 a niveles de dosis de 10, 30 y 60 mg de PTH/kg durante 28 días. Un grupo de TK que contenía 9 machos y 9 hembras por grupo de dosis se dividió en 3 subgrupos con 3 ratas por subgrupo. Se recolectaron muestras de sangre hasta 28 días con 3 ratas por sexo, por punto de tiempo de muestreo. Las muestras se recolectaron el Día 1: antes de la dosis, 4 h, 8 h, 12 h, 18 h y 24 h después de la dosis, y el Día 28: 3 h, 6 h, 8 h, 12 h, 18 h, 24 h y 336 h, y se generó plasma. Las concentraciones en plasma de PTH total se determinaron mediante la cuantificación del péptido característico N-terminal (secuencia: IQLMHNLGK) tras la digestión con LysC y GluC, tal y como se presentó anteriormente en Materiales y métodos.
Las concentraciones en plasma de PTH libre se determinaron mediante cuantificación como la suma de PTH(1-34) y PTH(1-33) mediante LC-Ms /MS como se presentó anteriormente en Materiales y métodos.
Resultados: La exposición sistémica de PTH total y PTH libre expresada como media de Cmáx y AUC aumentó de manera aproximadamente proporcional a la dosis. Exposición sistémica de PTH total expresada como AUC media acumulada 3­ 6 veces desde el día 1 hasta el día 28 y PTH libre expresada como AUC media acumulada 2-3 veces desde el día 1 hasta el día 28. La exposición sistémica de PTH total en la rata hembra fue aproximadamente 2 veces mayor que en los machos. La exposición sistémica de PTH libre fue ligeramente mayor en la rata hembra que en los machos.
Se observó una relación media baja de pico a valle de PTH total para todos los grupos de dosis de 1,2 después de la administración subcutánea diaria en ratas Sprague-Dawley en el Día 28 (estado estacionario observado desde el Día 8). Se observó una relación media baja de pico a valle de p Th libre en el rango de 1,5 a 2,4 después de la administración subcutánea diaria en ratas Sprague-Dawley el día 28.
Abreviaturas:
CAN acetonitrilo
AcOH ácido acético
Aib ácido 2-aminoisobutírico
BMD densidad mineral ósea
Bn bencilo
Boc terc-butiloxicarbonilo
COMU hexafluorofosfato de (1-ciano-2-etoxi-2-oxoetilidenaminooxi)dimetilamino-morfolino-carbenio cAMP monofosfato de adenosina cíclico
d día
DBU 1.3- diazabiciclo[5.4.0]undeceno
DCC N,N'-diciclohexilcarbodiimida
DCM diclorometano
DIPEA N,N-diisopropiletilamina
DMAP dimetilamino-piridina
DMF N,N-dimetilformamida
DMSO dimetilsulfóxido
DTT ditiotreitol
EDTA ácido etilenodiaminotetracético
eq equivalente estequiométrico
ESI-MS ionización por electroaspersión y espectrometría de masas
Et etilo
Fmoc 9-fluorenilmetiloxicarbonilo
Glu-C endoproteinasa Glu-C
h hora
HATU hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
HPLC cromatografía líquida de alta resolución
ivDde 4.4- dimetil-2,6-dioxociclohex-1-ilideno)-3-metilbutilo
LC cromatografía líquida
LTQ cuadrupolo de trampa lineal
Lys-C endoproteinasa Lys-C
LLOQ límite inferior de cuantificación
Mal 3-maleimidopropilo
Me metilo
MeOH metanol
min minutos
Mmt monometoxitritilo
MS espectro de masas / espectrometría de masas
m/z relación masa-carga
OtBu terc-butiloxi
PEG polietilenglicol
pH potentia Hydrogenii
PK farmacocinética
Pr propilo
PTH hormona paratiroidea
PyBOP hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonio Q-TOF tiempo de vuelo cuadrupolo
RP-HPLC cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa
TA temperatura ambiente
SIM monitoreo de un sólo ion
SEC cromatografía de exclusión por tamaño
sc subcutáneo
t1/2 vida media
TCP cloruro de tritilo poliestirol
TES trietilsilano
TFA ácido trifluoroacético
THF tetrahidrofurano
Tmob 2,4,6-trimetoxibencilo
Trt trifenilmetilo, tritilo
ULOQ límite superior de cuantificación
UPLC cromatografía líquida de ultra alta resolución
UV ultravioleta
ZQ cuadrupolo único

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de PTH, en donde, después de la administración subcutánea a un primate no humano, el perfil farmacocinético del compuesto de PTH muestra una relación pico a valle menor que 4 en plasma dentro de un intervalo de inyección en estado estacionario, en donde el período de tiempo entre dos administraciones es de 24 horas y
en donde el compuesto de PTH es de fórmula (IIf-i):
Figure imgf000050_0001
en donde
la línea punteada sin marcar indica la unión a un nitrógeno de -D que es un resto de PTH mediante la formación de un enlace amida; y
la línea punteada marcada con un asterisco indica la unión a un resto
Figure imgf000050_0002
en donde
m y p son independientemente un número entero en el rango de 400 a 500.
2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde -D tiene la secuencia de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120 o SEQ ID NO:121.
3. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 o 2, en donde -D tiene la secuencia de SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114 o SEQ ID NO:115.
4. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde -D tiene la secuencia de SEQ ID NO:51.
5. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde -D está unido al compuesto de PTH de fórmula (IIf-i) a través del grupo funcional amino N-terminal del resto de PTH.
6. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la administración subcutánea es mediante inyección subcutánea.
7. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la administración subcutánea se realiza con un dispositivo tipo pluma.
8. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la relación pico a valle es menor que 3.
9. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la relación pico a valle es menor que 2.6.
10. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la relación pico a valle es menor que 2.4.
11. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la relación pico a valle es menor que 2.2.
12. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la relación pico a valle es menor que 2.
13. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el primate no humano es un mono cynomolgus.
14. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la composición farmacéutica tiene un pH en el rango de pH 3 a pH 8.
15. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la composición farmacéutica tiene un pH en el rango de pH 4 a pH 5.
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